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Infecção por arbovírus e doença crônica neurodegenerativa: influências do ambiente e

envelhecimento na progressão da doença

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO

Período: 01/08/2014 a 01/08/2015

( ) PARCIAL

( x ) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Infecção por arbovírus e doença crônica neurodegenerativa: influências do ambiente e envelhecimento na progressão da doença

Nome do Orientador: CRISTOVAM WANDERLEY PICANÇO DINIZ

Titulação do Orientador: Doutor

Faculdade: Medicina

Unidade: Instituto de Ciências Biológicas

Laboratório: Laboratório de Investigações em Neurodegeneração e Infecção.

Título do Plano de Trabalho: Cinética da infecção pelo arbovírus Oropouche em modelo murino:

a resposta do hospedeiro adulto.

Nome do Bolsista: Danilo Marinho Pereira

Tipo de Bolsa : ( x ) PIBIC/CNPq

( ) PIBIC/UFPA

( ) PIBIC/INTERIOR

( ) PIBIC/FAPESPA

( ) PRODOUTOR

( ) PARD - renovação

( ) PIBIC/PIAD

( ) PIBIC/AF-CNPq

( ) PIBIC/AF-UFPA

( ) PIBITI

( ) PADRC




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INTRODUÇÃO

As infecções são um grande problema nas agendas de saúde mundiais tanto em países

desenvolvidos quanto em países subdesenvolvidos. As doenças infecciosas são a

segunda maior causa de mortes no mundo e a contínua evolução de doenças

emergentes e re-emergentes, particularmente em países em desenvolvimento, irá

aumentar o impacto global dessas doenças no século atual (Fauci. 2001). Exemplo da

grande escala desse problema no Brasil é o caso das infecções por vírus da dengue,

que quantifica mais de 53.000 casos por ano no país (Fauci. 2001) e por vírus

Oropouche, a segunda maior causa de arboviroses na Amazônia, com mais de 350.000

casos já registrados (Vasconcelos et al. 2009).

As doenças do envelhecimento também se tornaram uma preocupação importante dos

Sistemas Nacionais de Saúde em todos os lugares no mundo moderno, devido ao

aumento da expectativa de vida. A Organização Mundial da Saúde (OMS) indica

projeções estatísticas com aumento na porcentagem de idosos (com mais de 65 anos

de idade) na população, devido à transição demográfica no Brasil, passando de 7,3%

em 1991 para 15% em 2025. O novo século já começou com a população mais velha

crescendo no Brasil a uma taxa duas vezes superior à do conjunto da população.

Neste contexto, vale colocarmos que o declínio cognitivo ou demência é uma doença

típica do envelhecimento, afentando o sistema nervoso central, onde 50% dos idosos

de 80 anos ou mais de idade. O documento “Saúde do Idoso”, do Ministério da Saúde

do Brasil estima que o número de pacientes com demência no país hoje é cerca de 450-

600 mil, com 15.000 a 20.000 mortes devido à doença de Alzheimer a cada ano. O

mesmo documento informa que as estatísticas do Sistema Único de Saúde (SUS) têm

mostrado 115.000 hospitalizações devido à demência em um único ano (1996).

Não é difícil, a partir desses números, prever que as doenças infecciosas e doenças

neurodegenerativas crônicas em idosos, agindo em conjunto, serão a preocupação

central na saúde pública no novo século.

JUSTIFICATIVA

Na Região Amazônica, onde há anos ocorre o manejo inadequado de

ecossistemas naturais, arboviroses emergentes e re-emergentes têm se tornado um

problema dominante nos assuntos que concerne à saúde pública regional e nacional

(Vasconcelos et al. 2001). Há no total 187 diferentes espécies de arbovírus, com mais

de 10.000 cepas isoladas em humanos, insetos hematófagos, além de vertebrados




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silvestres, tendo como resultado do manejo inadequado dos ecossistemas naturais na

região amazônica brasileira a manifestação de arboviroses emergentes e re-

emergentes.

As poucas informações disponíveis sobre esses arbovírus estão limitadas a

métodos de isolamento e capacidade de infectar animais de laboratório. Porém, a real

capacidade de grande parte desses arbovírus de causarem doença em humanos

permanece desconhecida, com exceção de 32 desses arbovírus que possuem sua

capacidade patogênica descrita. Quatro desses vírus (Dengue, Febre Amarela,

Oropouche, Mayaro) são muito importantes em termos de saúde pública, já que são

responsáveis por induzir doenças severas em humanos e, portanto possuem grande

impacto econômico e social (Vasconcelos et al. 2001).

Oropouche é um vírus da família Bunyaviridae, gênero Orthounyavirirus

(Pinheiro et al. 1994) que em humanos se manifesta principalmente por episódios febris

agudos, caracterizados por febre, dor de cabeça, calafrios, vertigem, dor muscular,

artralgia e fotofobia (Pinheiro et al. 1981). Um estudo in vivo feito em animal mostrou

letalidade de 85% nos animais que receberam inoculação subcutanea de OROV, sendo

que os sintomas aparentes foram imobilidade, tremor e apatia (Santos et al. 2012). O

mesmo estudo demonstrou alterações no SNC, com ativação microglial no córtex

cerebral e ativação astrocitária no cérebro e na medula espinhal. Rodrigues et al. (2011),

utilizando hamster como modelo experimental, observaram 55% de prevalência de

sintomas tais como redução da ingestão de água e comida e pelo eriçado, além de

sintomas mais severos e menos frequentes como letargia, imobilidade, aumento de

temperatura, tremor, perda de peso, paralisia e morte. Os achados histopatológicos

desse estudo sugerem alterações no SNC, com meningocefalite e inflitrado

mononuclear no parênquima, além de alterações no fígado - com infiltrado inflamatório

abundante-, porém sem alterações em pulmão, rins e baço. Apesar dessas descrições,

são poucos os estudos que envolvem modelos experimentais e infecção por OROV e

em nenhum avaliou-se o impacto do ambiente enriquecido sobre as consequências da

doença ou relacionou os aspectos do comportamento alterado pela infecção e as

alterações neuropatológicas quantitativas.

Em estudo anterior demonstramos que um dos arbovírus da família

Rhabdoviridae, o arbovírus Piry, foi capaz de induzir encefalite em animals adultos e

que o ambiente enriquecido, onde foram mantidos, estava associado à redução das

alterações neuropatológicas levando a eliminação mais rápida do vírus no sistema

nervoso central, com aumento da atividade de células T (de Sousa et al. 2011).




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O ambiente enriquecido é definido como uma gaiola na qual há a combinação

de uma série de estímulos somatomotores, cognitivos e de interação social

(Rosenzweiget al. 1978). A estimulação de atividade exploratória e motora é induzida

com uma variedade de brinquedos, túneis, correntes, pontes e rodas de correr para

estimular o exercício físico voluntário dos animais tanto quanto sua natural tendência a

explorar objetos novos. Sabe-se também que este tipo de ambiente é capaz de induzir

aumento da citotoxidade de células NK (Banaroya-Milshteinet al. 2004). Além disso

Diniz et al (2012) demonstraram que o ambiente enriquecido é capaz de induzir o

aumento da resposta inflamatória na doença causada por vírus da dengue em um

modelo de infecção exacerbada por inoculação de anticorpo heterólogo e que isso

parece associado ao aumento de linfócitos T imunodisponíveis nos animais do ambiente

enriquecido. Esses resultados sugerem que diferentes patógenos podem ter sua

eliminação favorecida ou dificultada pela mobilização de linfócitos T dependendo da

natureza da resposta imune associada à doença e da estratégia de replicação viral.

No presente trabalho pretendemos estender esses ensaios a um outro arbovírus

de interesse epidemiológico investigando o curso temporal da infecção experimental

induzida por vírus Oropouche, a segunda mais frequente arbovirose humana no Brasil,

com mais de 350.000 casos somente na Amazônia. Poucos trabalhos tem se dedicado

ao estudo dos aspetos neuropatológicos induzidos pelo vírus Oropouche em modelos

experimentais (Rodrigues e al., 2011) e nenhum desses estudos investiga a mudança

na resposta imune associada ao ambiente enriquecido correlacionando as alterações

comportamentais e a neuropatologia quantitativa utilizando-se de métodos

estereológicos.

OBJETIVOS

Objetivo geral

Induzir encefalite experimental por arbovírus Oropouche em modelo murino mantidos em

ambiente padrão ou enriquecido.

Objetivos Específicos

a) Avaliar as alterações comportamentais associadas à infecção por Oropouche;

b) Avaliar as alterações neuropatológicas quantitativas por meio de métodos

estereológicos;

c) Identificar a sequência temporal da neuroinvasão promovida pelo vírus Oropouche

em modelo murino por imunohistoquímica para os antígenos virais nos tempos de




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sobrevida de 1dpi, 2 dpi, 3 dpi, 4 dpi, 5 dpi, 6 dpi, 7 dpi, 8 dpi, 9 dpi, 10 dpi e 11 dpi (dpi=

dias pós-inoculação).

d) Em definida a cinética temporal do vírus em termos de concentração e tempo de

sobrevida, estabelecer então, uma leitura por imunhistoquímica anti-GFAP e anti-Iba 1

em hipocampo propriamente dito, CA3, com estimativa da população astrocitária e

microglial na região.

MATERIAIS E MÉTODOS:

ANIMAIS

Foram utilizados 115 animals (Mus muscullus) da linhagem BL6/C57 selecionadas ao

nascimento,com idade de 3 meses. Os animals foram fornecidos pelo Instituto Evandro

Chagas e manipulados segundo os "Principles of Laboratory Animal Care" (NIH) nas

instalações do Laboratório de Investigações em Neurodegeneração e Infecção no

Hospital Universitário João de Barros Barreto/Universidade Federal do Pará (LNI-

HUJBB/UFPA). Esses animais foram distribuídos em 11 grupos de 5 animais, sendo 11

grupos de animais de ambiente enriquecido e 11 grupos de animais de ambiente padrão.

DEFINIÇÃO DA CINÉTICA DA INFECÇÃO POR OROPOUCHE

O inóculo infectante foi fornecido pelo Departamento de Arbovirologia do Instituto

Evandro Chagas (IEC/PA), sendo que a infecção por OROV foi induzida por meio de

inoculação intraperitoneal de 50 µl de extrato de cultura infectado com vírus Oropouche.

Os animais utilizados como controle receberam o mesmo volume de solução salina

estéril. As inoculações no grupo piloto foram feitas de formas sucessivas, determinando-

se a concentração em função da mortalidade e tempo de sobrevida adequados para a

manutenção dos animais em 3 meses de alojamento em biotério, nas condições de

ambientes padrão e enriquecido e então realização dos testes comportamentais e

ensaios imunohistoquímicos.

ALOJAMENTO

Os animais foram mantidos em uma gaiola de laboratório para animals, de dimensões

padronizadas (32x39x16,5 cm) e que corresponde a um ambiente empobrecido ou

padrão (AP) limitado a interações sociais entre os animais.

Os animais foram mantidos em uma sala com temperatura ambiente controlada

(23±1oC) sob regime de ciclo claro-escuro de 12 horas. O acesso à água e à

alimentação será sempre livre.

TESTES COMPORTAMENTAIS

Em função da completa ausência de sintomas no grupo piloto, os testes

comportamentais prévios às inoculações foram suspensos e aguardam a chegada do

novo modelo experimental em Hamsters (Mesocricetus auratus) a ser fornecido pela




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Instituto Evandro Chagas. Os ensaios comportamentais a serem utilizados com o novo

modelo são descritos a seguir:

Teste de retirada e estocagem de ração: Será realizado por duas horas por dia. Durante

uma semana antes da inoculação o animal fará treinamento e durante os dias pós-

inoculação. Os animais serão colocados em uma gaiola plástica (32 cm × 39 cm × 16.5

cm) contendo um tubo PVC com 100 g de ração.

Após o teste, toda comida deixada no tubo será pesada e os animais devolvidos para

sua gaiola (Deacon et al. 2001). A diferença entre o peso da comida remanescente no

tubo e a inicial representa a quantidade de ração estocada.

Tarefa exploratória do campo aberto: O aparato consiste em uma caixa de madeira cinza

(30 cm × 30 cm × 40 cm) com o chão dividido em nove quadrantes. O teste ocorrerá

uma vez por semana, uma semana antes da inoculação e durante as semanas pós-

inoculação. O animal será posto no centro do aparato e deixado no campo aberto por 5

min. Um metro acima do aparato será colocado uma vídeocâmera

conectada a um computador e todos os testes serão gravados em vídeo, que

posteriormente serão analisados com auxílio do software Any-Maze (Stöelting). Os

seguintes parâmetros serão analisados: distância total percorrida e tempo de

imobilidade e tempo de permanência no quadrante central do aparato. Após cada

sessão o aparato deve ser limpo com álcool 70% para remover pistas olfatórias.

Labirinto em cruz elevado (LCE): o LCE é constituído por dois braços abertos e dois

fechados (30x5cm) colocados em posições opostas, e uma plataforma central (5x5cm)

(Lister 1987). Os braços fechados possuem paredes de 15 cm de altura, enquanto que

nos braços abertos não há paredes. Os braços e a plataforma central são feitos de

madeira e pintados de tinta preta e elevados a 45 cm o chão. O protocolo usado para

este teste é o mesmo utilizado por Carola et al. (2002). O animal é colocado na

plataforma central do LCE, solto com a face virada para um dos braços abertos

permitindo-se a exploração do ambiente por um período de 5 minutos. O teste é

realizado em dois dias consecutivos, sendo que cada animal realiza uma sessão de

treino por dia. As imagens de cada treino são capturadas por uma câmera de vídeo

instalada a 1 m de altura do LCE e conectada a um computador, com o objetivo de

armazenar os testes para posterior análise. Após cada sessão o LCE é limpo com uma

solução de etanol a 70%. Os seguintes parâmetros comportamentais são analisados:

distância percorrida (m), velocidade média (m/s), tempo de imobilidade (s), número de

entradas nos braços abertos, fechados e na plataforma central, tempo total nos braços

abertos, fechados e na plataforma central e distância percorrida nos braços abertos,

fechados e na plataforma central.

Memória episódica: o teste consiste, basicamente, na exposição de objetos para que as

memórias espaciais e de tempo sejam analisadas. Primeiramente, será realizada a




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adaptação dos animais ao campo aberto (aparato): o hamster será colocado no aparato,

livre de objetos, por 5 minutos para explorar o campo aberto. Adaptação ao objeto: o

animal será exposto a quatro objetos idênticos colocados nos cantos do aparato por 5

minutos, três vezes, com 50 minutos de intervalo de cada vez. Estes objetos não eram

usados nos dias de teste. Todos os objetos são de plástico, com formas, altura e cores

diferentes. Antes de cada animal entrar no aparato, a caixa e os objetos serão limpos

com solução de etanol a 75% para minimizar a distinção olfativa dos animais. O

diagrama ilustrando o teste de memória episódica pode ser visualizado na figura abaixo.

Este teste consiste de três entradas: duas sessões de exposição aos objetos, de 5

minutos de duração com intervalos de 50 minutos entre elas e uma sessão de teste. Na

primeira sessão, quatro objetos idênticos serão apresentados. Na segunda sessão,

mais quatro objetos idênticos, porém diferentes, dos da primeira sessão serão

apresentados. Na sessão de teste, dois objetos da primeira sessão (objetos “antigos”)

e dois objetos da segunda sessão (objetos “recentes”) serão apresentados.

Além disso, um objeto da primeira sessão é deslocado para uma nova posição (objetos

“deslocados”), porém os objetos da segunda sessão permanecem nos lugares originais

(objetos “estacionários”).

Espera-se que os hamsters explorem por mais tempo os objetos da primeira sessão

(objetos “antigos”) do que os da segunda sessão (objetos “recentes”) com preferência

maior pelos objetos “antigos” e “deslocados”, seguida da preferência por objetos

“antigos” e “estacionários” e finalmente por objetos idênticos “recentes”.

PERFUSÃO E MICROTOMIA

Após os testes comportamentais os animals serão anestesiados com avertina, 0,5ml/5g

de peso corporal, por via intra-peritonial e perfundidos por via intra-cardíaca com

solução salina heparinizada e paraformaldeído 4% utilizando-se uma bomba de infusão.

Após a craniotomia, os cérebros serão seccionados em plano axial na espessura de

70μm em vibrátomo (MICROM, modelo HM 650 V). As secções de cada animal serão

divididas em cinco amostras igualmente representativas de todo o cérebro para posterior

processamento por imuno- ou histoquímica.

IMUNOHISTOQUÍMICA

Os animals serão perfundidos por via intra-cardíaca com solução salina heparinizada

seguida de paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M (pH 7.2–7.4). Séries

alternadas de cortes cerebrais (70 μm de expessura) obtidos com Vibrátomo

(Microtomo) serão imunorreagidos para anti-IBA1 ou anti-GFAP. As secções de cérebro

serão pré-tratadas em ácido bórico (pH 9.0) a 65-70 C por 60 minutos para

recuperação antigênica, lavados em tampão fosfato salina (PBS), imersos por 20

minutos em soro de cabra (Vector Laboratories), e depois serão incubados em anti-IBA1

(WakoChemicals, USA; Anti iba1, Rabbit; diluição 2 μg/ml) ou anti-GFAP (Milipore, USA;




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anti-GFAP, clone GA5, monoclonal antibody; diluição 1:250),diluídos em PBS 0.1 M (pH

7.2 – 7.4) por 3 dias a 4 °C. Depois de lavadas, as secções serão incubadas “overnight”

em solução contendo anticorpo secundário (goatanti-habbit-anti-mouse, 1:250 em PBS,

Vector Laboratories). Para inativação da peroxidase endógena as secções serão

imersas em H2O2 a 3% em PBS, lavadas em PBS e depois transferidas para a solução

de complexo Avidina-Biotina (VECTASTAIN ABC kit; Vector Laboratories) por uma hora.

Os cortes serão lavados novamente antes da incubação em tampão acetato 0.1 M por

3 minutos, e expostos a uma solução de diamidobenzidina em concentração 0.6 mg/ml,

cloreto de amônia e níquel a 2.5 mg/ml e glicose oxidase a 0.1 mg/ml. A confirmação da

especificidade da reação será feita por experimento controle no qual os cortes não serão

expostos ao anticorpo primário.

FOTOMIOGRAFIA E PROCESSAMENTO DE IMAGENS

As fotomicrografias serão obtidas com uma câmera digital acoplada a um microscópio

Zeiss (AxioCamHRc, Zeiss, Jena, Germany). O brilho e o contraste das imagens serão

ajustados através do software Adobe Photoshop 7.0.1 (San Jose, CA, USA).

RESULTADOS INICIAIS EM CAMUNDONGOS

Foram recebidos 115 animais da espécie Mus musculus, linhagem C57BL6, pós-

desmame de 21 dias. Os roedores foram alojados e separados em dois ambientes

diferenciados – ambiente padrão ou ambiente enriquecido – pelo período de três meses,

a fim de que atingissem a idade necessária para início dos testes e infecção. Os animals

foram divididos em números iguais entre os ambientes, para que se obtivesse um “n”

satisfatório de animais para processamento de dados estatísticos. Sendo assim, 55

animais foram alocados no ambiente padrão e outros 55 em ambiente enriquecido (ver

figura abaixo).

(A) Animais submetidos ao ambiente padrão ou empobrecido e (B) animais

submetidos ao ambiente enriquecido.

A B




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Outros cinco animais foram alocados em ambiente padrão e foram utilizados como

“animais-pilotos”, com a finalidade de serem utilizados para o estabelecimento da

dosagem ideal de vírus Oropouche necessária para que os animals infectados

sobrevivessem em uma janela temporal de onze dias pós-infecção (11 dpi).

O vírus utilizado foi produzido por cultivo no Departamento de Arboviroses do Instituto

Evandro Chagas (PA) e cedido para a experimentação sob a titulação de 108 PFU/mL e

concentração de 75% ECP.

Inicialmente, um animal piloto foi inoculado com 0,2 mL de vírus Oropouche, por via

intraperitoneal. Subsequentemente observou-se o animal piloto diariamente durante 11

dias e nenhum sinal clínico foi observado. Após os 11 dias, dobrou-se a dose para 0,4

mL, a fim de testar possível relação dose-efeito sem sucesso.

Em um segundo animal piloto, tentamos outra via que fora descrita em um artigo

recente, por Rodrigues et al. (2011), de infecção por vírus Oropouche em camundongos

neonatos. Utilizou-se a via intradérmica, com uma inoculação de 0,4 mL da suspensão

contendo vírus Oropouche, sob a mesma titulação e concentrações previamente

referidas. Nenhuma resposta clínico-patológica foi obtida durante os 11 dias de

observação. O aumento da dose resultou igualmente na ausência de sintomas.

Utilizamos um terceiro animal foi submetido a inoculações diárias. No primeiro dia, por

via intradérmica, utilizamos 0,4 mL; no segundo dia, mais 0,4 mL de vírus, e no terceiro

mais 0,4 mL. Nenhuma alteração sintomatológica descrita na literatura foi observada no

animal infectado. Finalmente utilizou-se macerado de cérebros de camundongos

neonatos infectados com o vírus aumentando a titulação viral. Para que se obtivesse o

macerado de encéfalos, foi necessário realizar inoculação intracerebral de 20 µL de

vírus Oropouche mantido em cultivo em 40 babies em amamentação, cedidos pelo

biotério do Instituto Evandro Chagas.

As inoculações foram realizadas sob fluxo laminar, para que se evitasse contaminação

por agentes externos. Após três dias da infecção (3 dpi), os babies infectados

começaram a apresentar sinais característicos da infecção viral como restrição à

amamentação, encurvamento da coluna vertebral e adução das articulações. O objetivo

da inoculação intracerebral foi aumentar a titulação viral e tentar provocar os sinais e

sintomas da doença no animal adulto (ver imagem abaixo).




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Animal nenonato após três dias de infecção (3 dpi)

Os encéfalos foram extraídos por craniotomia sob fluxo laminar, posteriormente foram

submetidos à maceração com diluição de Penicilina Streptomicina (Pen Strep), na

proporção de um encéfalo para cada 0,4 mL de Pen Strep, e colocados sob

centrifugação de 10.000 rpm em 15 minutos. O líquido sobrenadante foi colhido e

submetido ao congelamento imediato de – 80°C.

A partir disso, as amostras colhidas foram inoculadas nos animals pilotos.

Um quarto animal foi submetido a três inoculações de 0,4 mL durante três dias. Onze

dias após a última inoculação (11 dpi) o animal continuou sem apresentar nenhum tipo

de sintomatologia, evidenciando, mais uma vez, a ineficácia da infecção em animais

adultos nessa linhagem de camundongos.

Por conta desses resultados negativos faz-se necessária a mudança do modelo

experimental para a espécie Mesocricetus auratus reconhecidamente sensível à

infecção por Oropouche.

ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES:

Nos próximos meses serão iniciados as atividades de acordo com o cronograma abaixo:

ATIVIDADES Meses

2015 2016

7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6

Segregação de cada um desses grupos em dois outros:

ambiente enriquecido e padrão

x x x x




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Realização dos testes comportamentais (Baseline)

x

Inoculações e ensaios comportamentais x

Estatístitica, Corte e Reação Histoquímica x x

Análise histopatológica x

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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