GENÔMICA FUNCIONAL E METAGENÔMICA

Discentes:Dayane Andrade dos Reis Fernanda M. de Oliveira Henriette G. Moranza

Docentes: Prof.Dr.Jesus A. Ferro Prof. Dr. Marcos Tulio

GENÔMICA

A genômica é a ciência que estuda o genoma dos organismos a partir do seu sequenciamento completo, com o objetivo de entender a sua estrutura, organização e função.

• Genômica Estrutural: determina a sequência de nucleotídeos de um genoma. Estuda a organização e estrutura dos genes, refere-se aos dados do sequenciamento de DNA;

• Genômica Funcional: Genômica funcional é um campo da biologia molecular que descreve a função de genes e proteínas. Basicamente, a função de um gene é determinada quando são identificados os seus respectivos produtos gênicos.

GENÔMICA FUNCIONAL

Transcriptômica Proteômica

Metabolômica

RNAi

Knockouts

TRANSCRIPTÔMICA

•Transcriptoma ou Transcritoma refere-se ao conjunto completo de transcritos (RNAs mensageiros, RNAs ribossômicos, RNAs transportadores e os microRNAs) de um dado organismo, órgão, tecido ou linhagem celular.

Para estudar o transcriptoma os pesquisadores utilizam métodos de análise em grande escala como: SAGE (analise serial da expressão gênica); Microarrays (microarranjos de cDNA); RNAseq.

SAGE

SAGE (analise serial da expressão gênica) é uma técnica para quantificar em larga escala a expressão de genes de uma dada população de RNAs mensageiros. Esta técnica gera etiquetas (tags) de cDNA que são ligadas e seqüenciadas para, em seguida, serem analisadas e anotadas.

MICROARRAYS

A técnica de analise em larga escala conhecida como microarrays ou chips de DNA, permite uma visão global na busca de padrões de expressão gênica em amostras biológicas;

Por meio da determinação da expressão de milhares de genes simultaneamente, esta tecnologia permite a comparação entre comportamentos moleculares de diversos tipos de linhagens e tecidos diferentes;

RNA SEQ RNA-Seq envolve seqüenciamento de cDNAs (DNA

complementar), obtidos a partir da ação da enzima transcriptase reversa sobre RNAs mensageiros, utilizando tecnologias de seqüenciamento com alto rendimento;

Permite: medição dos níveis de transcritos e determinar a estrutura funcional dos genes;

Permite a quantificação dos níveis de expressão gênica, mesmo em transcritos que possuem níveis mais baixos de expressão devido a sua alta sensibilidade;

Útil para descobrir novas transcrições, identificação de mutações, indels, splicing alternativos;

RNA DE INTERFERÊNCIA

É uma maneira relativamente simples e rápida de inativar o gene e assim compreender as funções destes;

Esse método explora o mecanismo natural usado em várias plantas, animais, fungos e protozoários para se proteger contra certos vírus e elementos transponíveis;

Introduz uma molécula dupla fita de RNA, cuja sequência de aminoácidos combina com a parte do gene a ser inativado em uma célula ou organismo;

Depois que o RNA é processados ele hibridiza com o mRNA produzido pelo gene alvo e o direciona para degradação.

KNOCKOUT

O nocaute  ou inativação de um gene é uma técnica genética que consiste em bloquear a expressão de um gene específico num organismo, substituindo o gene original em seu locus por uma versão modificada do mesmo, à qual se extraiu um ou vários exões para gerar uma versão não funcional, incapaz de produzir a proteína que codificava o gene original.

O objetivo desta técnica é deduzir a atividade de um gene ou o papel biológico deste, com base em um fenótipo mutante.

PROTEÔMICA

O termo proteômica foi introduzido em 1995 para descrever todas as proteínas que são expressas em um genoma (Anderson et al., 1996; Wilkins et al., 1996);

Atualmente, proteômica é descrita como um método direto para identificar, quantificar e estudar as modificações pós-traducionais das proteínas em uma célula, tecido ou mesmo organismos.

Não é uma característica fixa se altera com o desenvolvimento do tecido ou

sob as condições em que o indivíduo se encontra;

Fundamenta-se em princípios bioquímicos, biofísicos e de bioinformática para quantificar e identificar as proteínas expressas;

TÉCNICAS APLICADAS AO ESTUDO DA PROTEÔMICA

2 técnicas utilizadas para análise:

Eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2DE)

Separação, detecção e quantificação de proteínas

Espectrometria de massa Identificação das proteínas através da

bioinformática

ELETROFORESE BIDIMENSIONAL (2DE) Introduzida na década de 70

A 2DE combina duas técnicas de separação:

a primeira separação (primeira dimensão) Focalização isoelétrica (IEF)

a segunda dimensão (2DE) Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-

PAGE)

No IEF, as proteínas são separadas por alta tensão em um gradiente de pH imobilizado em um gel de acrilamida até alcançarem a posição estacionária, onde a carga total é zero (pI).

Na 2DE, as proteínas são separadas pelo peso molecular, também através de uma tensão, em gel de poliacrilamida.

Após a coloração do gel, observa-se um perfil bidimensional de pontos (“spots”), sendo que em cada ponto há múltiplas cópias de uma proteína. A imagem deste perfil é posteriormente analisada através da bioinformática.

Algumas limitações: proteínas muito ácidas (pH menor que 3,5) ou

básicas (pH maior que 9) proteínas de baixa abundância proteínas hidrofóbicas

No geral, a 2DE é um método de separação eficiente, pois todas as proteínas da amostra são separadas simultaneamente, fornecendo informações úteis: pI, massa molecular, expressão, abundância relativa e

modificações pós-traducionais

IDENTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS

Uma das técnicas mais utilizadas para a identificação das proteínas é a análise do “fingerprinting” da massa precisa de um número de peptídios derivados da mesma proteína

METABOLÔMICA

Se refere ao conjunto de todos os metabólitos que são produzidos e/ou modificados por um organismo.

Compreende uma grande variedade de compostos químicos de baixa massa molecular (<1000 Da), que apresentam propriedades químicas diversas;

De espécies iônicas a carboidratos hidrofílicos, álcoois e cetonas voláteis, aminoácidos e ácidos orgânicos, lipídeos hidrofóbicos e produtos naturais complexos.

Os níveis dos metabólitos representam uma informação integrativa da função molecular, definindo assim o fenótipo de uma célula ou tecido, em resposta a alterações ambientais ou genéticas.

A identificação desses níveis é um complemento fundamental na determinação da função gênica

DESAFIOS

Diferencialmente dos RNAs e proteínas, é muito difícil estabelecer ligação direta entre genes e metabólitos;

Análise é mais complexa;

Como um metabólito pode participar de diversas vias metabólicas e os intermediários metabólicos apresentam vida muito curta, a interpretação dos dados metabolômicos é dificultosa.

ANÁLISE DO METABOLOMA

Envolve a determinação dos níveis ou concentrações de compostos químicos de baixa massa molecular e que estejam presentes dentro e/ou fora das células.

Do ponto de vista analítico, há basicamente duas abordagens principais para a análise do metaboloma: Análise Direcionada: determinação de um grupo de

metabólitos pré-definidos, ignorando outros que sejam detectados durante a análise;

Perfil Metabólico: conjunto de todos os metabólitos ou produto derivado e que sejam detectáveis durante a análise, acompanhando por uma estimativa de quantidade (absoluta ou relativa).

PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS

Passo 1: Interrupção rápida do metabolismo (quenching) por alterações na temperatura ou pH.

Passo 2: Separação da biomassa celular do meio de cultura;

Passo 3: Concentração das amostras, por extração seletiva ou evaporação a vácuo de solventes

ANÁLISE DOS METABÓLITOS

Métodos mais usados para detecção e análise:

Espectrometria de massa Alta sensibilidade e praticidade, possibilidade

de se confirmar identidade de componentes e identificação de compostos desconhecidos

Ressonância Magnética Nuclear Util na caracterização estrutural de compostos

desconhecidos. Mais caro

METAGENÔMICA

DEFINIÇÃO

Metagenômica: é a análise genômica das comunidades de microrganismos de um determinado ambiente por técnicas independentes de cultivo;

Metagenoma: é o genoma coletivo da microbiota total, encontrada em um determinado habitat.

APLICAÇÕES

Saúde humana

APLICAÇÕES

Bioenergia

APLICAÇÕES

Agricultura

APLICAÇÕES

Biorremediação

APLICAÇÕES

Metabolismo animal

PROJETOS METAGENÔMICOS

Identificar genes funcionais e/ou novas vias metabólicas;

Estimar a diversidade microbiana; permitindo o estudo dos genomas em uma comunidade como um todo;

Compreender a dinâmica da população de uma comunidade inteira.

DESAFIOS DE AMOSTRAGEM

• Amostras devem representar a população → Quantas amostras são necessárias? Curvas de raridade para estimar fração de espécies sequenciadas. (Abundância x Complexidade).

• Presença de populações dominantes afeta análises → representação maior e maior chance de montar contigs.

• Quanto mais metadados forem coletados mais detalhadas serão as inferências das condições ambientais. Ex.: dados geográficos, bioquímicos, data de coleta, métodos de extração do DNA.

Métodos tradicionais: Genes marcadores (16S rRNA, recA) Sequenciamento (Sanger, pirosequenciamento) Técnicas de fingerprint (T-RFLP, DGGE)

Metagênomica: Melhor representação da composição taxonômica Aspectos funcionais

Necessidade de se obter grande número de sequências

Novas plataformas de sequenciamento: 454 (Roche), SOLiD (Applied Biosystems),

Genome Analyzer (Illumina) Obtenção de sequências em larga-escala Favorece estudos metagenômicos

PROJETOS ATUAIS

Terragenome

“We know more about the movement of celestial bodies than about the soil underfoot.” -Leonardo da Vinci

PROJETOS ATUAIS

Global Ocean Sampling (GOS)

Fonte: http://camera.calit2.net/about/gos.shtm

ESTUDO DE CASO

Genoma da Apis mellifera já sequenciado – GenBank;

Análise em larga escala da expressão gênica em diferentes fases do ciclo de vida da abelha;

Identificação dos genes envolvidos no: Desenvolvimento de castas Ativação dos ovários em rainhas e operárias Ciclo funcional das glândulas hipofaríngeas Determinação do sexo nas fases iniciais da

embriogênese

2 estratégias no projeto:  1) Identificação de genes candidatos no genoma da

abelha a partir do conhecimento prévio da função destes genes em outros organismos, especialmente os atributos do Gene Ontology registrados no Flybase

2)  Busca e análise de novos genes através de microarrays, por estratégias de hibridização subtrativa e pela construção de uma biblioteca de cDNA das fases embrionárias.A expressão diferencial destes genes foi avaliada e candidatos de interesse foram investigados com mais detalhe por RT-PCR quantitativa e silenciamento por RNAi. O conjunto das informações geradas foi submetido a análises de redes gênicas para revelar possíveis conexões e a organização em redes funcionais.

OBRIGADA!