Diseño de un Medio de Cultivo Alternativo para la Cepa

Diseño de un Medio de Cultivo Alternativo para la Cepa Láctica BAL-C Productora de

una Sustancia Tipo Bacteriocina (STB) Inhibitoria de Listeria monocytogenes

Paula Andrea Brantes Arteaga

Valdivia – Chile

2011

Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Ciencias de los Alimentos

PROFESOR PATROCINANTE:

_______________________________________

Marcia Costa Lobo

Ingeniero Civil Químico

Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos

PROFESORES INFORMANTES:

_______________________________________

Renate Schöbitz Twele

Tecnólogo Medico, M. Sc en Microbiología de los Alimentos

Institución de Ciencia y Tecnología de los Alimentos

_______________________________________

María Adela Martínez Sanguinetti

Bioquímico, Master en Nutrición y Dietética

Instituto de Farmacia

Esta Tesis fue financiada y forma parte del proyecto FONDEF 1153 titulado “Desarrollo de biocontroladores de Listeria monocytogenes para su incorporación al procesamiento industrial del salmon”. De acuerdo a lo informado por el honorable consejo universitario sobre derechos intelectuales, los resultados de esta tesis se encuentran encriptados para no interferir y alterar procesos de obtención de patentes y otros derechos.

AGRADECIMIENTO

En primer lugar quiero agradecer a Dios, ya que gracias a su gran guía espiritual durante todos

mis años de universidad y de vida ha sido mi mejor compañía, cuya fe en él logro que termine

este largo camino que en muchas oportunidades pensé dejar inconcluso.

También quiero agradecer a mi familia, especialmente en estos momentos dedico todo este

trabajo a mi abuelita Ema que ahora está en un lugar viviendo de una forma muy especial

recordando los tiempos de antaño cuando era joven, también agradezco a mis padres y

hermanos Carlos y María Fernanda. A mis sobrinitas que llegaron a alegrar nuestras vidas

También quiero agradecer de forma muy pero muy especial a mi mejor amiga, la cual conocí

durante mis a años de universidad Carito, gracias por su infinita amistad, preocupación y

gracias por esa pequeñita que es tu hija Javiera que nos alegro la vida y a tu esposo Javier. Son

una muy linda familia.

Gracias a mis amigos que conocí en el ICYTAL Alexandra, Sandy, Susana, Luchito y a todos

que por motivos de espacio y tiempo no puedo nombrar.

También a mis compañeros de laboratorio mientras desarrollo la parte practica de mi tesis sobre

todo a Deysi quien en estos momentos se debe encontrar devuelta en Colombia.

i

INDICE DE MATERIAS

Capítulo Página

RESUMEN 1

SUMMARY 3

1 INTRODUCCION 5

2 REVISION BIBLIOGRAFICA 6

2.1 Bacterias acido lácticas 6

2.2 Bioconservantes en alimentos 7

2.3 Bacteriocinas de las BAL 8

2.3.1 Clasificación de las Bacteriocinas 8

2.3.2 Mecanismo de acción de las bacteriocinas 10

2.3.3 Aplicación de STB en alimentos 10

2.4 Listeria monocytogenes 10

2.5 Cultivo de microorganismos 11

2.5.1 Medio de cultivo 11

2.5.2 Nutrición microbiana 15

2.5.2.1 Macronutrientes 16

2.5.2.1.1 Nitrógeno 16

2.5.2.1.2 Carbono 17

2.5.3 Micronutrientes 17

2.5.4 Factores de crecimiento 17

3. MATERIAL Y METODO 19

3.1 Cepas bacterianas utilizadas 19

3.1.1 Cepa acido láctica (BAL-C) productora de la sustancia tipo

bacteriocina 19

ii

3.1.2 Cepa de Listeria monocytogenes 19

3.2 Medios de cultivo 19

3.3 Agua de levadura 20

3.4 Fuentes de carbono 21

3.5 Fuentes proteicas 21

3.5.1 Preparación de las soluciones proteicas 21

3.5.2 Determinación del contenido proteico 23

3.6 Producción de la Bacteriocina en los medios modificados 23

3.7 Prueba de actividad antimicrobiana de la STB 24

3.7.1 Técnica de gota sobre césped 24

3.7.1.1 Preparación del césped 24

3.7.2 Determinación de actividad inhibitoria 25

3.8 Producción de la sustancia tipo bacteriocina a nivel de

matraces

26

3.9 Prueba a nivel de mini fermentador 26

3.10 Análisis estadístico 28

4. PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS 29

4.1 Modificación en la formulación original del caldo MRS 29

4.2 Cultivo batch en mini fermentador 33

4.2.1 Consumo de glucosa durante el cultivo por parte de la BAL-C 36

5 CONCLUSION 37

6 BIBLIOGRAFIA 38

ANEXOS 41

iii

INDICE DE CUADROS

Cuadro Página

1 Composición medio de cultivo, MRS, utilizado para la cepa

BAL-C

20

2 Concentraciones proteicas para los diferentes medios 22

iv

INDICE DE FIGURAS

Figura Página

1 Medios de cultivo, testigo MRS y y formulados con

constituyentes de reemplazo

23

2 Esquema de propagación de cepa láctica BAL-C 23

3 Preparación del césped con Listeria monocytogenes 24

4 Esquema diluciones y gota sobre césped 25

5 Crecimiento de la cepa BAL-C y producción de la STB a nivel

de matraces

26

6 Cultivo de la cepa BAL-C con el medio modificado en mini

fermentador artesanal

27

7 Efecto del reemplazo del extracto de levadura en el medio MRS

por agua de levadura (AL) en distintas concentraciones

29

8 Efecto de la modificación de la fuente de carbohidrato del

medio original

30

9 Efecto de la modificación fuentes proteicas en el medio: F7

HL:HP=!%:6%; F8: 0,5%:3%; F9: 0,25:1,5

32

10 Curva de crecimiento y curva de de NaOH 33

11 Crecimiento de la BAL-C y actividad inhibitoria de la STB 34

12 Consumo de la fuente de carbohidrato y gasto de NaOH 4 N 36

v

INDICE DE ANEXOS

Anexo Página

1 Modificación del extracto de levadura por agua de levadura 42

2 Modificación fuente de carbono de medio MRS 43

3 Modificación fuentes de nitrógenos del medio 44

4 Medio alternativo utilizado para la prueba de mini fermentador 45

5 Determinación de proteínas de acuerdo al método de LOWRY

et al. (1951)

46

6 Curva de calibración para determinación proteica de acuerdo a

método propuesto por LOWRY et al. (1951)

48

7 Resultados 49

7.1 Resultados expresados en UA/mL para agua de levadura. 49

7.2 Resultados expresados en UA/mL para nuevos carbohidratos. 49

7.3 Resultados expresados en UA/mL para nuevas fuentes

proteicas

49

8 Análisis estadístico utilizando la prueba de Friedman 51

8.1 Resultados prueba de Friedman para datos no paramétricos

reemplazo de extracto de levadura por agua de levadura

51


reemplazo de la fuente de carbohidratos por una mezcla de

sacarosa y melaza

51


reemplazo de la fuente de proteínas por una mezcla de dos

proteínas, una de origen animal y otra de origen vegetal

51

9 Resultados cultivo batch en mini fermentador

52

10 Resultados de proteínas solubles presentes y de consumo de

glucosa por parte de la BAL-C

53

1

RESUMEN

En esta investigación se diseñó un medio de cultivo para la bacteria acido láctica, cepa

BAL-C, aislada de salmón ahumado en frío, la cual produce una sustancia tipo

bacteriocina (STB) que inhibe al microorganismo patógeno Listeria monocytogenes.

La cepa BAL-C se desarrolla y libera la STB creciendo en el medio de cultivo MRS

(Man, Rogosa y Sharpe), medio de cultivo que corresponde a un medio comercial, para

obtener un medio más económico que el actual se reemplazaron las fuentes de:

carbono y de micronutrientes y se mide su efectividad para el desarrollo de la bacteria

acido láctica BAL-C y la producción de sustancia tipo bacteriocina. Para obtener un

medio alternativo y económico se realizaron pruebas con los medios modificados a

nivel de matraces, realizando los reemplazos en forma parcial sobre el medio testigo

MRS, para luego realizar una prueba final, utilizando para esto último los mejores

resultados obtenidos en los reemplazos parciales. Como parámetro se mide el índice

de actividad inhibitoria de la sustancia tipo bacteriocina producida por la cepa BAL-C

frente a Listeria monocytogenes.

Se puede mencionar que para el reemplazo del extracto de levaduras, se probaron tres

niveles de agua de levadura siendo los resultados con 10% de agua de levadura muy

superiores incluso al testigo (MRS).

Para el reemplazo de la fuente de carbono, se probaron tres fórmulas (F4 con 40 g/L

de melaza, F5 con 20 g/L melaza y 10 g/L de sacarosa y F6 con 10 g/L de melaza y 10

g/L de sacarosa) siendo los resultados para F5 muy superiores incluso al testigo

(MRS).

Para el reemplazo de la fuente de nitrógeno, se probaron tres formulas (F7 con 1% de

extracto de lupino y 6% de extracto de harina de pescado; F8 con 0,5% de extracto de

lupino y 3% de extracto de harina de pescado y F9 con 0,25% de extracto de lupino y

1,5% de extracto de harina de pescado). Los resultados con F9 son los más óptimos

entre los medios alternativos, pero muy inferiores en los niveles de actividad inhibitoria

con respecto al testigo MRS.

2

A nivel de mini-fermentador con el medio modificado con 10% de agua de levadura; 20

g/L de melaza y 10 g/L de sacarosa; 1,5% de extracto de harina de pescado y 0,25%

de extracto de harina lupino, se obtuvo niveles de actividad de STB de 12800 UA/mL y

109 UFC/mL.

De los resultados obtenidos a nivel de mini fermentador se puede concluir que la cepa

BAL-C es capaz de crecer y de producir la sustancia tipo bacteriocina (STB) la cual al

medir su actividad inhibitoria frente a L. monocytogenes presenta buenos niveles

inhibitorios por lo cual el medio alternativo es factible ya que cumple con el objetivo.

3

SUMMARY

In this research is designed a new culture medium for the lactic acid bacteria LAB-C

isolated from cold smoked salmon that produces a bacteriocin like substance (BLS) that

inhibits Listeria monocytogenes.

The LAB-C develops and releases the BLS growing in the MRS medium, who was

replaced: protein source, carbon and micronutients sources. That is how it was first

worked at Erlenmeyer flask making parcial replacements in the MRS and spot on lawn

techniques were used how index the inhibitory activity of BLS.

For the replacement of yeast extract, were tested three levels of water yeast with the

results being 10% water yeast well above even the witness (MRS).

To replace the source of carbon, were tested three formulas (F4 with 40 g/l molasses,

F5 with 20 g/l molasses and 10 g/l sucrose and F6 with 10 g/l molasses and 10 g/l

sucrose) to F5 being the results far superior even to witness (MRS).

To replace the source of nitrogen, were tested three formulas (F7 with lupin extract 1%

and 6% fishmeal extract; F8 with lupin extract 0.5% and 3% fishmeal extract and F9

with lupin extract of 0.25% and 1.5% fishmeal extract). The results with F9 are the best

but well below the witness MRS.

At mini-fermenter with the medium changed with 10% water yeast, 20 g/l molasses and

10 g/l of sucrose, 1.5% extract of fishmeal and 0.25% lupin flour extract was obtained

inhibitory activity levels 12800 UA/mL and 109 CFU / mL

4

1 INTRODUCCION

La creciente demanda por productos mínimamente procesados y tratados con

químicos, además de la inserción de Chile en un contexto de economía mundial, y en

un creciente desafío para la obtención de productos con valor agregado y altos

estándares de calidad han logrado posicionar a la industria salmonera chilena como el

segundo país exportador de salmones a nivel mundial. Esta industria procesa y

mantiene sus productos a temperaturas de refrigeración, siendo este rango el óptimo

para el desarrollo de microorganismos del tipo psicótrofos como el patógeno Listeria

monocytogenes, cuya presencia debe ser evitada tanto en plantas de procesos como

en los productos a consumir. Debido a que los productos elaborados por la industria

corresponden a alimentos que serán consumidos sin previa cocción o tratamientos

térmicos cuyas temperaturas y tiempos no son los suficientes para inhibir y destruir a

microorganismos de variados grados de patogenicidad, resulta de vital importancia

desarrollar tecnologías dirigidas a preservar dichos alimentos hasta su consumo final.

Continuando con la premisa anterior, se han utilizado diversos sanitizantes y

preservantes de origen químico, los cuales si bien son efectivos, no presentan una

buena acogida dentro del mercado al cual son destinados dichos productos, por lo cual

se han desarrollado estudios probando la efectividad de la utilización de bacterias

ácido lácticas (BAL) que dado su metabolismo fermentativo, provocan cambios

organolépticos favorables, además de la liberación de sustancias, tales como: tipo

bacteriocina (STB), las que conducen al aumento de la vida útil de los alimentos en los

cuales son utilizados.

Por otra parte, se debe señalar que además de nisina, que es la sustancia tipo

bacteriocina más conocida y comercializada, se están estudiando otras sustancia tipo

bacteriocina que presentan un mayor efecto antilisterial. Es así como, a nivel de

laboratorio se han estudiado condiciones de crecimiento, de la bacteria acido lactica

BAL-C, que libera una sustancia tipo bacteriocina contra L. monocytogenes en caldo

MRS, sin embargo una producción de la STB a nivel industrial se requiere formular un

5

medio de cultivo económico y que permita que la cepa BAL-C crezca y produzca la

STB.

Siendo la hipótesis de trabajo, la siguiente:

Hipótesis

Si la cepa BAL-C crece y produce una sustancia tipo bacteriocina en el medio de

cultivo MRS entonces también crecerá y producirá una sustancia tipo bacteriocina en el

medio de cultivo alternativo generado por el reemplazo de las fuentes de carbono y

micronutrientes en la composición original del medio MRS.

Objetivo general

Diseñar un medio de cultivo económico y alternativo al medio original, MRS,

reemplazando las fuentes de carbono, nitrógeno y micronutrientes, para cultivar y

producir una sustancia tipo bacteriocina inhibitoria de Listeria monocytogenes para la

cepa BAL-C.

Objetivos específicos

Es así como, se plantearon los siguientes objetivos específicos:

Formular y reemplazar en la proporción adecuada el extracto de levadura como

componente del caldo MRS por agua de levadura.

Seleccionar la fuente de carbono (melaza, o combinación de melaza y sacarosa),

para formular y reemplazar la fuente de carbono habitual (glucosa) del medio de

cultivo, caldo MRS.

Formular y reemplazar las fuentes proteicas de origen animal y vegetal del caldo

MRS correspondientes a extracto de carne y proteosa peptona por extracto de harina

de pescado y extracto de harina de lupino, respectivamente.

Comprobar el crecimiento de la cepa láctica y la producción de la sustancia tipo

bacteriocina a nivel de un cultivo batch, en matraces, y a nivel de fermentador,

utilizando el medio de cultivo alternativo diseñado.

6

2 REVISION BIBLIOGRAFICA

2.1 Bacterias acido lácticas

Las bacterias ácido lácticas representan un grupo heterogéneo de bacterias del tipo

Gram positivas, las que difieren morfológicamente entre sí, encontrándose tanto

aquellas con forma bacilar como cocoides. Son microorganismos no esporulados,

anaerobios facultativos, carecen de citocromo y catalasa; y fisiológicamente, se

pueden caracterizar como: bacterias que no tienen movilidad y no reducen el nitrito

como característica bioquímica. Presentan necesidades nutritivas complejas, debido a

su metabolismo de tipo homofermentativo, donde los carbohidratos, además de

proporcionar la fuente de energía para sus requerimientos, son transformados en acido

láctico (SCHLEGEL, 1997).

En la actualidad las bacterias acido lácticas se encuentran agrupadas en cuatro

géneros, tradicionalmente conocidos como: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus y

Streptococcus, pero también comprende microorganismos de los géneros:

Aerococcus, Alloiococcus, Carnobacterium, Dosilogranulum, Enterococcus,

Globicatella, Lactococcus, Lactosphaera, Oenococcus, Tetragenococcus, Vagococcus

y Weisella (CINTAS et al., 2001)

Según YING et al., (2007) las bacterias acido lácticas (BAL) fueron introducidas en los

alimentos fermentados hace miles de años para lograr un aumento en la vida útil de

éstos, produciendo cambios en su textura y sabor mientras producen y liberan

metabolitos inhibitorios, como ácidos orgánicos, peróxido de hidrógeno, diacetilo y

sustancias tipo bacteriocinas, entre otros.

Según CRIADO et al., (2006), las BAL contribuyen a preservar una buena calidad

higiénica de los alimentos, mediante mecanismos de competencia por el sustrato y la

producción de metabolitos con actividad inhibitoria, entre los cuales se encuentran las

sustancias tipo bacteriocinas STB, que son péptidos antimicrobianos de síntesis

ribosomal.

7

El espectro de acción antimicrobiana de algunas de las bacteriocinas generadas por

las bacterias acido lácticas es amplio e incluye microorganismos patógenos y/o

alterantes de los alimentos, entre ellas Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus

y Clostridium botulinium. Coincidentemente YANAGIDA et al., (2006) mencionan que

tienen un efecto antagonista frente a Bacillus subtilis y esporas de Clostridium

perfringes.

La presencia de las BAL se encuentra condicionada a la presencia de una fuente de

carbohidratos solubles y productos de degradación de proteínas, y de vitaminas; otra

característica del hábitat de estos microorganismos es que deben presentar una baja

tensión de oxígeno. Algunos de los alimentos donde se pueden desarrollar

favorablemente son leche y productos lácteos, productos cárneos y vegetales

fermentados, así como también en frutas y hortalizas frescas (STILES, 1996). Otros

géneros se encuentran con mayor frecuencia en el tracto gastrointestinal y urogenital

de la especie humana y de algunos animales (CINTAS et al., 2001).

El género Enterococcus, taxonómicamente agrupa a las especies Streptococcus

faecalis y Streptococcus faecium, además de aquellos microorganismos que crecen en

un rango de temperatura que abarca desde los 10ºC hasta los 45ºC, se desarrollan en

una concentración de hasta el 6,5% de cloruro de sodio y en un rango de pH de 4,6

hasta un valor cercano a 10 (CRIADO et al., 2006).

Dentro del género Enterococus se encuentran los grupos E. faecium, E. avium, E.

gallinarum, E. cecorrum. Algunas especies, como E. faecalis, forman líneas

independientes y no se incluyen en ninguno de las grupos previos (CINTAS et al.,

2001).

2.2 Bioconservantes en alimentos

Las bacterias ácido lácticas (BAL), además de producir cambios organolépticos

favorables son capaces de generar un efecto antagonista frente a patógenos al

competir por la fuente de nutrientes y producir metabolitos, tales como: acido láctico,

peróxido de hidrógeno, dióxido de carbono, diacetilo, reutenina y sustancia tipo

bacteriocina (YING et al., 2007).

Las bacteriocinas, por otra parte, presentan características que favorecen su empleo

como bioconservantes tales como las mencionadas a continuación:

8

Ser producidas por bacterias clasificadas como GRAS (Generally Recognized as

Safe), como las del género Carnobacterium, Lactobacillus entre otras.

Son degradadas por enzimas proteolíticas a nivel del tracto gastrointestinal

No son activas biológicamente frente a células eucarióticas.

Presentan un amplio espectro y elevada actividad antimicrobiana frente a

microorganismos patógenos y alterantes de alimentos, además de actuar de forma

sinérgica con otros sistemas de conservación.

La mayoría de estos microorganismos resisten tratamientos de conservación como:

la pasteurización, la liofilización y la acidificación (YING et al., 2007).

2.3 Bacteriocinas de las BAL

Las bacteriocinas se pueden definir como péptidos antimicrobianos, de síntesis

ribosomal, producidos por bacterias Gram positivas o negativas, además de ser

producidos por bacterias pueden ser generadas por plantas, animales u hongos.

Algunas cualidades que presentan en común son: su pequeño peso molecular, su

naturaleza anfipática o, en algunos casos hidrofóbica y su capacidad para interaccionar

con la membrana plasmática de las células sensibles (CRIADO et al., 2006).

Las bacteriocinas son peptidos, estables al calentamiento y, con características

antimicrobianas específicas. En general, las bacteriocinas producidas por las bacterias

Gram positivas, tales como las BAL se diferencian de aquellas STB producidas por

las Gram negativas presentando un amplio espectro antimicrobiano que afecta incluso

a géneros taxonómicos no relacionados (TAGG et al., 1976; JACK et al., 1995; NESS

et al., 2007). El extenso conocimiento sobre muchas de las bacteriocinas provenientes

de las BAL, junto con el estatus de GRAS, del cual gozan las bacterias productoras,

son cualidades a favor para su empleo como conservantes biológicos para proteger los

alimentos procesados (MUÑOZ, 2006).

Por otra parte, las bacteriocinas son consideradas como biopreservantes y son

degradas en el tracto gastrointestinal (YING et al., 2007). Según lo señalado por

BORQUEZ (2000) exhiben una acción bactericida o bacteriostática contra algunas

especies bacterianas.

9

2.3.1 Clasificación de las bacteriocinas. A pesar de la heterogeneidad de su tamaño

molecular, las bacteriocinas producidas por las bacterias Gram positivas, presentan un

peso molecular, que en algunos casos es menor a los 6 kDa, y varían en su espectro

de acción antimicrobiana, propiedades bioquímicas, espectro de acción y organización

genéticas.

Las bacteriocinas producidas por las bacterias lácticas presentan una serie de

características comunes que permiten agruparlas en tres clases principales (ZENDO et

al., 2005).

Clase l (lantibióticos): Engloba bacteriocinas de pequeño peso molecular (menor a 5

kDa), son termoestables y contienen aminoácidos inusuales y modificados

postraduccionalmente, como la deshidroalanina, la lantoína y la β-metil-lantionina.

Según su estructura esta clase se divide en dos tipos:

- Tipo A: Péptidos formadores de poros y catiónicos cuyo prototipo es la nisina.

- Tipo B: Péptidos globulares inmunológicamente activos que actúa como

inhibidores de enzimas.

Clase ll: Comprende bacteriocinas de pequeño tamaño molecular (menos de 10 kDa),

termoestables, no presentan aminoácidos modificados y actúan a nivel de membrana

citoplasmática. Esta clase se subdivide a su vez en cuatro subclases:

- Subclase lla: Denominada como familia de la pediocina, comprende

bacteriocinas con una fuerte acción antilisterial se encuentra constituida por

varios géneros pertenecientes a las bacterias lácticas, como: Lactobacillus,

Carnobacterium, Leuconostoc, Pediococcus y también incluye al género

Enterococcus (ENNAHAR et al., 2000), citado por ZENDO et al., 2005; CINTAS

et al., 2001; GRAVENSEN et al., 2002.

- Subclase llb: Comprende a aquellas bacteriocinas que requieren la combinación

de dos péptidos para ejercer su actividad antimicrobiana en forma total y

efectiva (CINTAS et al., 2001).

- Subclase llc: Compuesta por bacteriocinas secretadas mediante la Ruta

General de Secreción GSP [General Secretory Pathway] (CINTAS et al., 2001).

10

- Subclase lld: Agrupa a aquellos péptidos de la clase ll, que no se encuentran

incluidos en ninguno de los grupos anteriores (CINTAS et al., 2001).

Clase lll: Constituida por bacteriocinas de alto peso molecular (mayor a 30 kDa),

también son termolábiles, pero se inactivan con tratamientos térmicos a temperaturas

entre 60ºC y 100ºC durante un periodo de tiempo de 10 a 15 min. La mayoría de estas

sustancias son producidas por especies del género Lactobacillus (ZENDO et al., 2005).

2.3.2 Mecanismo de acción de las bacteriocinas. Se ha estudiado la interacción de

las bacteriocinas provenientes de las BAL con la membrana citoplasmática de la célula

sensible mediante uniones electroestáticas entre el extremo C-Terminal de la

bacteriocinas que posee carga positiva, y los lípidos de la membrana que se

encuentran cargados negativamente, observándose que la nisina, por ejemplo,

requiere de un mínimo potencial de membrana para poder insertarse en la membrana y

así ejercer su acción. Por otra parte, existen otras bacteriocinas, que no requieren de

un determinado nivel energético para su inserción en la membrana y posteriormente

poder formar poros. En el caso de las enterocinas, éstas ejercen su función inhibitoria

formando poros que permiten la permeabilidad de la membrana y favorecen la salida

de K+, Na+ y otros compuestos de bajo peso molecular, disipando con esto su potencial

de membrana y haciendo así a la célula inviable (CRIADO et al., 2006).

2.3.3 Aplicación de STB en alimentos. El uso de las BAL y/o sus bacteriocinas para

el uso como biopreservantes en alimentos es un área de gran interés. Las

características que debe cumplir una bacteriocina para su uso en alimentos son: ser

estable frente a procesos térmicos, estable durante el almacenamiento del alimento,

efectiva a bajas concentraciones, ser parte activa de la molécula de origen proteico, ser

degradada por enzimas digestivas, no afectar negativamente las características

sensoriales del alimento y ser de costo razonable (SCHÖBITZ, 2006).

2.4 Listeria monocytogenes

Corresponde a un bacilo corto, Gram positivo, catalasa positiva, móvil debido a la

presencia de flagelos, anaerobio facultativo y no esporulado. Presenta un amplio rango

de temperatura para su crecimiento que va desde los 0ºC hasta los 45ºC,

encontrándose la temperatura óptima de crecimiento entre los 30ºC y 37ºC; es capaz

de crecer con una concentración igual o inferior a 10% de NaCl y puede iniciar su

11

crecimiento a partir de un valor de pH de 4,4 logrando desarrollarse hasta un valor de

pH de 9,2. Con respecto a la disponibilidad de agua para su crecimiento (aw), se ha

determinado que en productos cárneos presenta un límite de crecimiento a un valor de

0,93 (CLIVE, 2002).

Listeria se ha aislado de diversos ambientes, tales como: suelo, agua, múltiple fuentes

animales y vegetales, pienso y agua residuales; además L. monocytogenes forma

parte de la microbiota intestinal del 1 al 10% de la población.

Se distinguen claramente seis especies dentro del género Listeria, las cuales

corresponden a: L. monocytogenes, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri y L. gray.

Siendo Listeria monocytogenes la principal causante de enfermedades en humanos

(CLIVE, 2002).

La listeriosis ha surgido como una de las principales enfermedades transmitidas por los

alimentos a fines del siglo XX. A pesar de que su incidencia es baja, es de indudable

importancia en lo que se refiere a salud pública debido a los graves síntomas que se le

asocian (meningitis, septicemia y aborto), alta mortalidad de sus infecciones (alrededor

de un 20 a un 30%), el largo periodo de incubación, el elevado riesgo que representa

para niños de corta edad, en especial en neonatos, mujeres embarazadas, ancianos y

personas inmunocomprometidas (BLACKBURN y MAcCLURE, 2002).

2.5 Cultivo de microorganismos

Se han desarrollado varias técnicas para el cultivo de microorganismos. El cultivo batch

y el cultivo por lote alimentado, han sido parte del arte de la fermentación desde la

antigüedad y aún son usados en la mayoría de las fermentaciones industriales.

Mientras que las técnicas de cultivo continuo son relativamente nuevas y han

demostrado un gran valor como herramientas para estudios de laboratorio (BROWN,

1990) citado por BORQUEZ (2000).

2.5.1 Medios de cultivo. Son una mezcla equilibrada de nutrientes (fuente de carbono,

nitrógeno y azufre, y factores de crecimiento) que en concentraciones adecuadas y

condiciones físicas óptimas permiten un buen crecimiento de los microorganismos

(CAMACHO, 2005).

12

Debido a que los microorganismos requieren de condiciones nutricionales donde se

deben encontrar presentes macronutrientes, además de vitaminas y suplementos o los

denominados factores de crecimiento, cuando el medio donde se desarrollará el

microorganismo se encuentra establecido y con sus concentraciones y composición

química conocida, se trata de un medio de cultivo definido, existiendo también los

denominados medios complejos, que están constituidos por una gran variedad de

componentes (SCHLEGEL, 1997; BROCK, 1998).

CAMACHO (2005) señala que los medios pueden ser de dos tipos: definidos o bien

complejos en función de que se conozca o no la composición química de los nutrientes

que la componen. Además, los cultivos pueden clasificarse, también, en selectivos

(medio que sólo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos mientras

inhibe el desarrollo de otros), diferenciales (medio que permite revelar características

fisiológicas de los microorganismo) y los medios enriquecidos (medio que tiene un gran

exceso de nutrientes y que se utiliza para microorganismos que tienen grandes

exigencias nutricionales). Siendo la efectividad de un medio de cultivo dependiente de

muchos factores: el tipo de microorganismo, los requerimientos nutricionales, las

interacciones de cada componente en el medio, las condiciones ambientales

(temperatura, humedad y atmosfera) y la presencia de factores tóxicos que puedan

inhibir el crecimiento bacteriano.

Para algunos microorganismos exigentes, para los cuales aun no se conocen bien sus

requerimientos nutricionales, se utilizan en su medio de cultivo: extracto de levadura,

autolisiado de levadura, peptona o extracto de carne. Pero debido a su alto costo por la

presencia de los mencionados componentes se reemplaza: melaza, lactosuero, agua

de maíz, extracto de soya que corresponden a productos de desecho en industrias

procesadoras, siendo por lo tanto más económicos (SCHLEGEL, 1997). Por otra parte,

BROCK (1998) señala que un medio complejo es aquel que se encuentra compuesto

por sustancias digeridas, no definidas químicamente, tales como: extracto de carne y

levadura.

El medio de cultivo MRS fue desarrollado por Man, Rogosa y Sharpe (1960) como un

medio de enriquecimiento, cultivo y aislamiento de Lactobacillus y otras bacterias

ácidos lácticos desde diferentes tipos de muestras, tanto clínicas como provenientes de

alimentos (NILSSON et al., 2002 y LEAL-SANCHEZ et al., 2002). Sobre sus

13

constituyentes se puede decir que la fuente de carbono, nitrógeno y otros se encuentra

en la presencia de glucosa, peptona y extracto de carne, los cuales son elementos

necesarios para el crecimiento bacteriano. El magnesio, el manganeso, polisorbato y

acetato son los cofactores presentes en el medio, mientras que el citrato de amonio es

un inhibidor de flora Gram negativa.

Como es sabido algunos de los componentes del medio de cultivo MRS son: el

extracto de carne el cual constituye una solución acuosa de péptidos, aminoácidos,

fracciones de ácidos nucleicos, ácidos orgánicos, minerales, vitaminas, sales y otros

nutrientes. Probablemente durante mucho tiempo fue utilizado como fuente de carbono

y nitrógeno. El extracto de carne se obtiene de carne de vaca, la cual es tratada a altas

temperaturas durante un periodo de tiempo, obteniéndose un extracto acuoso que

normalmente es un suplemento con digestos de proteínas para incrementar el

contenido de nitrógeno amino mejorando el desarrollo bacteriano. El extracto de carne

concentrado es rico en carbohidratos y fosfatos con lo cual puede interaccionar y sufrir

reacciones de Maillard conduciendo a un oscurecimiento del producto como

consecuencia de la aparición de compuestos pardos. Su contenido en tiamina es bajo y

tiene una alta proporción de ácidos orgánicos lo que le hace que sea una adecuada

fuente de carbono para algunos microorganismos. Su alto contenido de fosfatos le

permite actuar como buffer regulando los valores de pH (CAMACHO, 2005).

Con respecto al extracto de levadura, se puede decir que consiste en una solución

concentrada de hidrolizado proteico de células, Saccharomyces cereviciae, producido

por una reacción autolítica de dichas células. Siendo una buena fuente de

aminoácidos, carbohidratos y vitaminas especialmente del complejo B y tiene un bajo

contenido de sales. Los principales carbohidratos presentes son: glucógeno y trehalosa

aunque por hidrólisis enzimática durante el proceso éstos pueden fraccionarse en

moléculas de glucosa. Dependiendo del origen del extracto de levadura el crecimiento

bacteriano se ve influenciado (CAMACHO, 2005).

Acerca de las peptonas se puede decir que corresponden a proteínas parcialmente

digeridas. Una amplia variedad de fuentes de proteínas que pueden ser utilizadas para

obtención de hidrolizados proteicos o peptonas incluyendo proteínas animales (carne,

pescado, albúmina de huevo, gelatina y caseína), de origen vegetal (soya, algodón,

papa, trigo, entre otros) (CAMACHO 2005).

14

Para las fermentaciones industriales se utilizan medios de cultivos, los cuales son

formulados con productos de desecho de diversas industrias para así optimizar y bajar

costos de producción. Es el caso de la utilización de melaza, la cual es un subproducto

del proceso de extracción de azúcar desde la remolacha, presentando un bajo costo.

Nutricionalmente la melaza presenta un alto contenido de azúcares, como la sacarosa

que se encuentra presente entre un 40 y 50% del peso total, además posee otros

componentes, como minerales, tiamina, acido fólico y biotina, que se podrían utilizar

como una buena fuente de carbono para microorganismos con metabolismo

fermentativo. Otras fuentes de carbono son: desechos de almidón de maíz y de papa,

lactosuero, n-alcanos, desechos de licor de sulfito, aguas residuales de origen

domestico, desechos de la celulosa y leguminosas ricas en carbohidratos (SHULER y

KARGI, 2002).

Por otra parte, como fuente de nitrógeno alternativo a los utilizados en los medios de

laboratorio se pueden mencionar: extracto de semilla de algodón, licor de maíz, harina

de cacahuate, harina de soya, harina de pescado, entre otras SHULER y KARGI

(2002). Como fuente de proteínas se puede utilizar además harina de pescado y

harina de lupinos, proporcionando los requerimientos necesarios para un óptimo cultivo

de microorganismos, según lo señalado por SERRANO (2004), quien menciona

algunas de las características nutricionales más relevantes de la harina de pescado,

entre las cuales se puede mencionar su alto contenido en aminoácidos esenciales,

además de un alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados de la serie n-3. Es

también una buena fuente de vitaminas del complejo B y acido fosfórico. Por otra parte,

este mismo autor señala las ventajas que presenta la harina de lupino frente a otras

harinas, como la de soya, ya que esta harina presenta un alto contenido de ácido graso

linoleico Las especies cultivadas en Chile del género Lupinus incluyen al lupino dulce

(Lupinus albus), lupino amargo (Lupinus angustifolius) y el lupino amarillo (Lupinus

luteus). Dentro de las variedades de lupinos, los niveles de proteína cruda oscila entre

un 31 – 34%. El contenido de aminoácidos en las harinas de lupino, en general, son

ricas en lisina, pero deficientes en aminoácidos azufrados como la metionina y cistina,

de acuerdo a lo señalado por PETERSON (1997), citado por SERRANO (2004). La

composición de lípidos y proteínas, presentes en el lupino, constituyen la mayor parte

15

de la energía digerible, teniendo la proteína de lupino una mayor digestibilidad frente a

otras proteínas, tanto de origen vegetal como animal.

Para la obtención de crema de levadura, dentro del proceso de elaboración de

levaduras se emplea melaza como principal fuente de carbono. Este ultimo es un

subproducto de la elaboración de azúcar granulada y fuente de sales minerales tales

como: azufre, sodio, potasio y otros, que aportan el nitrógeno y oligoelementos.

Retomando el proceso para la obtención de crema de levadura, luego de recepcionada

la melaza es llevada a un proceso de cocción en el cual se logra que precipiten los

elementos insolubles no aprovechables y además se reduce la carga microbiana. El

proceso de elaboración de levaduras se inicia con la propagación a nivel de matraces

de la cepa Saccharomyces cerevisiae, la cual es inoculada en un medio de melaza

diluida más sales minerales, siendo el inoculo esterilizada para así asegurar la

inocuidad del producto final. Estos caldos son utilizados para inocular los matraces,

donde solo varía el volumen, y luego se pasa a la etapa de propagación de cultivo a

nivel industrial. Una vez finalizada esta etapa se siembra en los fermentadores lo cual

tiene un tiempo de duración aproximada de 24 h. Aquí el proceso es de crecimiento

batch por lote alimentado. Se realiza este procedimiento para obtener cantidades

crecientes de levadura sin aumentar los niveles de producción de alcohol. El mosto

resultante de la esta etapa se separa la levadura de los restos de melaza y nutrientes

no aprovechados por medio de centrifugación. Luego se produce el ingreso de grandes

cantidades de agua para un lavado celular, para obtener lo que se denomina “crema de

levadura”. Una vez lavada la crema se almacena en estanques con sistemas de

agitación y enfriamiento. Esta crema hará las veces de siembra para el inicio de otros

procesos. La crema resultante va a un prensado y secado para levadura seca

instantánea, con un 95% de materia seca o a un filtrado al vacío para elaboración de

levadura fresca con un 70% de materia seca (LEVADURAS COLLICO, 2007).

2.5.2 Nutrición microbiana. Según lo indicado por SCHLEGEL (1997) el crecimiento

microbiano está relacionado con la disponibilidad de agua, en el cual se encuentran

disueltas las sustancias nutritivas que éstos requieren para su crecimiento. Por lo tanto,

la composición celular difiere para diferentes microorganismos y a su vez según la

disponibilidad, como se menciona anteriormente, la célula es capaz de obtener los

nutrientes necesarios desde el medio extracelular y por medio de una membrana

16

semipermeable, la cual además es selectiva para permitir el ingreso de nutrientes y a

su vez evitar la salida de aquellos componentes celulares que le son de utilidad

(SHULER y KARGI, 2002). Continuando con la descripción del proceso, se debe

señalar que la composición celular se basa, para la mayoría de los microorganismos,

en un 80% de agua aproximadamente, mientras que con respecto al peso seco de la

célula el 50% corresponde a proteínas, que para ser incorporadas al interior de estas

requieren del mecanismo de acción de complejos enzimáticos (SHULER y KARGI,

2002). Dentro de los requerimientos nutricionales se encuentran dos grandes grupos

que son: los macronutrientes y los micronutrientes, esto siempre observado desde el

punto de vista de los requerimientos químicos a nivel celular. Finalmente, SHULER y

KARGI (2002).señalan como composición, peso seco, de la célula bacteriana lo

siguiente: contenido de proteínas de 40 – 70%, contenido de ácidos nucleícos 13 –

34% y presencia de lípidos de un 10 a 15%.

2.5.2.1 Macronutrientes. El crecimiento de todos los microorganismos depende de la

disponibilidad de nutrientes. Según esta clasificación los elementos que se encuentran

aquí agrupados deben de encontrarse presentes en la célula en una concentración de

10-4 M SHULER y KARGI (2002). Según BROCK (1998) carbono, oxigeno, hidrógeno y

nitrógeno son los cuatro elementos más relevantes, pero además se debe requerir la

presencia de azufre, fósforo, potasio, sodio, calcio, magnesio e hierro, dentro de este

grupo según lo señala SCHLEGEL (1997) elementos que constituyen el esqueleto de

las moléculas así como, de moléculas orgánicas más pequeñas.

2.5.2.1.1 Nitrógeno. Es uno de los más importantes y requerido en grandes

cantidades, ya que es un componente esencial de las proteínas, ácidos nucleícos y

otros constituyentes celulares, siendo su porcentaje de participación dentro de la célula

entre un 10 a 14%. Algunas de las fuentes tradicionales desde donde se obtiene

nitrógeno es de sales de amonio, tales como: NH4Cl, (NH4)2SO4 y NH4NO3,

principalmente, SHULER y KARGI (2002). Por lo tanto, acceder a un adecuado

suministro de este nutriente, en cualquiera de sus formas, es un requisito para

cualquier forma de vida, incluidos los microorganismos que lo obtienen a partir de

nitrógeno orgánico presente en los aminoácidos (SCHLEGEL, 1997).

Según CAMACHO (2005) quien se refiere a la eficiencia de un medio de cultivo, la cual

se puede ver afectado por varios factores tales como: los extractos utilizados y sus

17

respectivas concentraciones, y la forma requerida para ser utilizada como nutriente de

forma eficiente por la bacteria acido láctica, ya que para el caso de la proteosa peptona

esta se obtiene por una digestión enzimática de cualquier fuente proteica cuya

composición es una mezcla de polipéptidos, oligopéptidos y aminoácidos junto con

otros compuestos solubles los cuales varían según la materia prima utilizada, el tipo de

enzima utilizada y las condiciones de hidrólisis a las cuales se vio afectado. Por todo

ello, la proteína hidrolizada o extractos acuosos de materiales ricos en proteínas suelen

ser los más utilizados en los medios de cultivo, su incorporación proporciona una

fuente fácilmente disponible de nitrógeno y carbono.

2.5.2.1.2 Carbono. Como resultado de estudios acerca de la nutrición de

microorganismos, se ha observado que alrededor del 50% del peso seco de una célula

corresponde a carbono; además se puede decir que la forma de asimilar el carbono

orgánico por parte de las bacterias es utilizarlo como fuente de: aminoácidos, ácidos

grasos, y compuestos aromáticos (BROCK, 1998). Como se menciona anteriormente,

además de ser reducido el porcentaje carbono que formar parte de la masa celular es

también una gran fuente de energía para su actividad celular (RANDOLPH, 1993).

Mientras que en procesos fermentativos, de tipo aerobio, cerca del 50% de la fuente de

carbono es incorporado a la célula y el 50% restante es utilizado como fuente de

energía SHULER y KARGI (2002), lo cual concuerda con lo señalado por

(RANDOLPH, 1993).

Levaduras Collico, 2007 señala como compuestos nitrogenados asimilables, presentes

en la melaza, como: betaína, acido glutámico, y algunos ácidos orgánicos tales como:

láctico, málico, acético y oxálico, mientras que en sus cenizas predomina el potasio y

dentro de las vitaminas el pantotenato de calcio.

2.5.3 Micronutrientes. BROCK (1998),, señala que los micronutrientes a pesar de

requerirse en pequeñas cantidades, tienen una función relevante a nivel celular,

pudiendose mencionar el actuar del manganeso, cuya función es como activador a

nivel enzimático.

Dentro de los micronutrientes señalados por SCHLEGEL (1997) se encuentran

manganeso, molibdeno, zinc, cobre, además de la presencia de metales pesados, que

forman parte de enzimas y que transforman elementos inorgánicos como el amoniaco.

18

La mayoría de los elementos, como ya se ha mencionado solo se requieren en

cantidades trazas, en concentraciones que no superan a 10-4 M SHULER y KARGI

(2002).

2.5.4 Factores de crecimiento. Muchos organismos requieren para su nutrición de

sustancias diferentes a las fuentes de carbono, minerales y energía. Correspondiendo

a estos suplementos a los denominados factores de crecimiento, que son componentes

básicos de las células y los cuales no se pueden sintetizar a partir de precursores más

sencillos. Los factores de crecimiento se pueden agrupar en los siguientes grupos: los

aminoácidos, purinas y pirimidinas además de las vitaminas. Los primeros tres

componentes mencionados forman parte de las proteínas y de los ácidos nucleicos,

mientras que las vitaminas son componentes de coenzimas o grupos proteicos, su

función es enzimática (catalítica) y su utilización es en pequeñas cantidades

(SCHLEGEL, 1997). Por otra parte las vitaminas forman parte de coenzimas, ya que

existen algunos microorganismos incapaces de sintetizar todos los componentes de

sus coenzimas (BROCK, 1998).

19

3 MATERIAL Y METODO

El presente trabajo de investigación se realizó en el Laboratorio de Microbiología del

Instituto de Ciencia y Tecnología de los Alimentos (ICYTAL) y en el Laboratorio de

Bioinsumos del Instituto de Producción y Sanidad Vegetal de la Facultad de Ciencias

Agrarias, Universidad Austral de Chile - Valdivia, entre Agosto de 2007 y Abril de 2008.

3.1 Cepas bacterianas utilizadas

3.1.1 Cepa ácido láctica (BAL-C), productora de la sustancia tipo bacteriocina. La

cepa BAL-C, Enterococcus mundtii ATCC-PTA 9382, la cual fue aislada de músculo de

salmón ahumado en frío, la que se mantuvo congelada a -18±1ºC (freezer Whirlpool,

Chile) en caldo MRS adicionado de glicerol al 1% (como crioprotector) hasta su

utilización.

3.1.2 Cepa de Listeria monocytogenes. Se utilizó como cepa indicadora Listeria

monocytogenes Lm 4/00 aislada por RODRIGUEZ (2002). La cepa se mantuvo

congelada a -18±1ºC (freezer Whirlpool, Chile), en caldo Soya Tripticasa (ST)

adicionado de glicerol al 1% (como crioprotector) hasta su utilización.

3.2 Medios de cultivo

El medio de cultivo testigo o medio de referencia correspondió al caldo MRS condición

en la cual la cepa BAL-C crece y libera la sustancia tipo bacteriocina (STB) en fase

estacionaria. A este medio se le sustituyeron las fuentes de carbono, nitrógeno (fuentes

proteicas) y de micronutrientes, tomando como criterio de efectividad, la actividad de la

STB.

Cada una de las nuevas formulaciones que se probaron fueron ensayadas en

duplicado al igual que las mediciones de actividad inhibitoria de la STB frente a la cepa

de Listeria monocytogenes Lm/400

El CUADRO 1 en el cual se hace referencia a la composición del medio de cultivo

testigo y en el cual se indica la concentración de los componentes que posteriormente

serán modificados:

20

CUADRO 1 Composición medio de cultivo MRS utilizado para la cepa BAL-C

Componentes g/1000 mL

Proteosa peptona 10,0

Extracto de carne 10,0

Glucosa 20,0

Extracto de levadura 5,0

Tween 80 1,0

Citrato de Amonio 2,0

Sulfato de Magnesio 0,1

Sulfato de Manganeso 0,05

Acetato de Sodio 5,0

Aforar a 1L con tampón fosfato de potasio pH 7,0

FUENTE: SCHILLINGER et al., 1993.

3.3 Agua de levadura

Para reemplazar el extracto de levaduras, se utilizó agua de levadura, la que se obtuvo

a partir de crema de levadura (80% ST), proporcionada por la Industria de Levaduras

Collico.

La preparación de la solución de agua de levadura, se realizó mezclando 100 g de

crema de levadura en 1 L de tampón fosfato de potasio pH 7,0 en un frasco de vidrio

transparente, el que luego de ser esterilizado a 121ºC por 15 min se dejó decantar por

un periodo de tiempo de 24 h, posterior a ello el sobrenadante extraído mediante sifón

se denominó como 100% agua de levadura.

21

Las diferentes concentraciones que se probaron a nivel de matraces correspondieron a

las siguientes formulaciones:

100% agua de levadura.

50% agua de levadura y 50% de tampón fosfato de potasio pH 7,0.

10% agua de levadura y 90% de tampón fosfato de potasio pH 7,0.

Detalles del procedimiento en ANEXO 1.

3.4 Fuente de carbono

Se probó reemplazar la dextrosa del MRS por melaza y una mezcla de melaza y

sacarosa, aún cuando éstas no corresponden estrictamente al mismo carbohidrato

utilizado.

Las diferentes concentraciones que se probaron a nivel de matraces correspondió a:

40 g/L de melaza

20 g/L de melaza y 10 g/L de sacarosa.

10 g/L de melaza y 10 g/L de sacarosa.

Se tomó como testigo una solución de dextrosa en cantidad de 20 g/L del MRS.

(ANEXO 2).

3.5 Fuentes proteicas

Se usó extracto de harina de lupino y extracto de harina de pescado, basado en

estudios que demostraron que estas sustancias podían reemplazar a proteosa

peptona y extracto de carne respectivamente, ya que estos dos extractos fueron los

que arrojaron los mejores resultados para un buen crecimiento de las bacterias ácido

láctico y producción de bacteriocinas.

3.5.1 Preparación de las soluciones proteicas. Para obtener extracto de harina de

lupino se preparó una solución madre al 2% de harina de lupino con agua destilada y

se ajustó el pH hasta llegar a un valor de 8,0 utilizando NaOH 2N, después de

homogenizar la solución por 30 min. Se dejó decantar por 15 min, luego de lo cual se

extrajo el sobrenadante y se centrifugó durante 5 min a 3000 rpm, finalmente este

22

último sobrenadante se filtró a través de papel filtro (Whatman 1), denominándose

extracto de lupino a esta solución resultante.

El extracto de harina de pescado se preparó a partir de una solución al 12% de harina

de pescado con tampón fosfato de potasio pH 6,5; la solución, al igual que el extracto

de lupino, fue homogenizada, centrifugada y filtrada, denominándose extracto de

harina de pescado a la solución resultante. Después de preparados ambos extractos,

se prepararon las diferentes soluciones que contenían a ambos extractos en diferentes

proporciones, las que se probaron en duplicado contrastándose con los respectivos

testigos.

Los testigos fueron extracto de carne en una proporción de 10 g/L para la harina de

pescado, mientras que para la harina de lupino fue la proteosa peptona en una

proporción de 10 g/L (ANEXO 3).

CUADRO 2. Concentraciones proteicas para los diferentes medios.

Concentración proteica de origen

animal (%)

Concentración proteica de origen

vegetal (%)

6,0 1,0

3,0 0,5

1,5 0,25

FUENTE: Fórmula propuesta por la tesista.

Se debe señalar que durante las pruebas utilizando las concentraciones proteicas,

tanto de origen animal como vegetal, ninguna de estas sufrió algún proceso de

hidrolizado (de tipo enzimático o químico) como sus testigos presentes en el caldo

MRS, extracto de carne y proteosa peptona.

3.5.2 Determinación del contenido proteico. El contenido de proteínas de cada una

de las muestras de los extractos de origen animal y vegetal, y los remanentes del

ensayo en mini-fermentador, se determinaron mediante el método de Lowry (ANEXOS

5 y 6).

23

FIGURA 1 Medios de cultivo, testigo MRS y formulados con constituyentes de reemplazo.

3.6 Producción de la bacteriocina en los medios modificados. En la FIGURA 2 se

muestra el esquema que se siguió para la propagación de la cepa láctica BAL-C,

siendo el procedimiento similar hasta el segundo repique para cada uno de los caldos

modificados y para el testigo, todos los cuales fueron incubados en un agitador orbital

de mesa a una temperatura de 30ºC, 150 rpm durantes 48 h.

La prueba de actividad, corresponde al criterio de efectividad de los medios; se

realizaron a muestras extraídas a los tiempos 0 h, 24 h y 48 h de cultivo, siendo este

último tiempo denominado como tiempo límite en las pruebas preliminares.

FIGURA 2 Esquema de propagación de la cepa láctica BAL-C.

Cepa BAL-C

50 µL de la dilución

10 mL de caldo MRS

5 mL de caldo MRS

50 mL de caldo modificado y testigo

MRS

100 µL.

de BAL

5 mL

50 uL

24

3.7 Prueba de actividad antimicrobiana de la STB

La prueba de actividad es la técnica de laboratorio que mide la calidad del antagonismo

de la STB frente a Listeria monocytogenes Lm 4/00.

3.7.1 Técnica de gota sobre césped. Para realizar la prueba de antagonismo se

requiere proporcionar las condiciones necesarias para un buen crecimiento para la

cepa Lm 4/00 que servirá como cepa indicadora. Para ello se utiliza un caldo de

cultivo que satisfaga los requerimientos nutricionales, luego se realiza una inoculación

e incubación antes de ser vertido en las placas que contienen el césped; luego de

preparado éste y encontrándose seco se siembran las gotas de la STB para luego,

incubar las placas a dos temperaturas diferentes por dos periodos de tiempo.

3.7.1.1 Preparación del césped. Se dispuso de una placa de Petri que contenía una

delgada capa de agar Soya tripticasa (ST). Sobre esta capa se adicionó 7 mL de agar

semisólido que contenía un cultivo de 18h de la cepa indicadora Listeria

monocytogenes (Lm 4/00) de concentración conocida. En la FIGURA 3 se muestra un

esquema de preparación del césped, aquí observan los medios utilizados. El césped se

preparó en campana de flujo laminar y se dejó secar por 40 min antes de depositar en

su superficie las gotas de sustancia tipo bacteriocina previamente obtenidas.

FIGURA 3 Preparación del césped con Listeria monocytogenes.

Solución stock de Listeria

monocytogenes 1,0 x 10

9 ufc/mL

100 µL

100 µL.

10 mL caldo ST 25º C por 18 h

10 mL buffer fosfato

7 mL de agar semisólido ST

Placa con agar ST 1,0 x 10

4 ufc/mL

700 µL

25

3.7.2 Determinación de actividad inhibitoria. La sustancia tipo bacteriocina es

excretada al medio de cultivo, por tal motivo las determinaciones de actividad se

llevaron a cabo en los diferentes caldos de cultivo, para así observar en cuál de los

medios diseñados la cepa BAL-C crece mejor y excreta al medio la STB. La

determinación de actividad se realizó sobre caldo de cultivo libre de células, para lo

cual las muestras extraídas durante el cultivo fueron centrifugadas a 9000 rpm (4ºC, 15

min), ajustadas a pH 7,0 con NaOH 2 N y microfiltradas a través de poros de 0,22 μm

(Millipore, Millipore Co, Ireland). La STB así tratada es estable a una temperatura de

almacenamiento de -18±1 º C al momento de medir actividad las muestras no se deben

trabajar a temperaturas que superen la temperatura de refrigeración, 4±1º C.

Para cuantificar la actividad antagonista, se efectuaron diluciones seriadas de la STB

utilizando buffer dos sales (buffer fosfato de sodio 0,05M ver). FIGURA 4 muestra el

esquema del protocolo seguido y la forma como se disponen en la superficie del

césped las gotas de bacteriocina.

FIGURA 4 Esquema diluciones y gota sobre césped.

1:1

Control E350

1:2048*

Gota de dilución 1:1

Gota de dilución 1: 2

Gota de dilución 1: 2048 **

** Nota: Como se realizan diluciones seriadas que parten desde 1:1 hasta llegar a 1:2048. Sobre el césped de Listeria se colocan gotas de un volumen de 20 μL cada una.

* Nota: En las diluciones se toman

volúmenes de 500 μL de la STB, que se encuentra a pH 7,0, sobre 500 μL de buffer dos sales 0,05 M

Césped de L.. monocytogenes

26

Siendo incubadas las placas durante 48 h a una temperatura de 4ºC y luego incubadas

a 25º C por 24 h, para finalmente proceder a la lectura de las placas y asi poder

cuantificar su antagonismo frente a Lm/400.

3.8 Producción de la sustancia tipo bacteriocina a nivel de matraces. Se trabajó a

nivel de matraces (50 mL de caldo en Erlenmeyer de 250 mL) en las pruebas

preliminares, donde se probó individualmente cada uno los componentes que sirvieron

como nuevas fuentes de carbono, nitrógeno y micronutrientes fijando las nuevas

concentraciones y midiendo actividad inhibitoria de la STB, para determinar dicho

parámetro. Cada uno de las nuevas formulaciones se presenta en los ANEXOS 2, 3 y

4, realizando cada experimento en duplicado y midiendo actividad, también en

duplicado. La FIGURA 5 muestra los experimentos realizados a nivel de matraces.

FIGURA 5 Crecimiento de la cepa BAL-C y producción de la STB a nivel de matraces.

3.9 Prueba a nivel de mini-fermentador. Con la fórmula final la cual se indica en

(ANEXO 4) se inoculó al 10% un mini-fermentador (FIGURA 6) artesanal de 1 L con

600 mL de medio, durante 48 h, tomándose muestras a los tiempos: 0 h; 6 h; 12 h; 18

h; 22 h; 26 h, 30 h; 36 h; 42 h y 48 h. El equipo, Incubadora Shaker Marconi MA

410/CF, cuenta con agitación constante, aireación constante (bomba de acuario y filtro

de aire) y temperatura constante mediante un serpentín interior por el que circula agua

27

proveniente de un baño termorregulador a una temperatura de trabajo y optimo para el

desarrollo de la STB de 30°C y un pHímetro; adicionándose en forma manual NaOH

4N y HCl 1N, para mantener constantel éste nivel durante el desarrollo de la prueba.

Las variables controladas fueron las siguientes:

Observación microscópica (tinción Gram) para verificar pureza del cultivo durante el

proceso

Consumo de NaOH requerido para mantener el proceso a pH 7,0

Recuento bacteriano de la cepa BAL-C mediante siembra en superficie sobre agar

MRS.

Actividad inhibitoria de la STB frente a Listeria monocytogenes mediante la técnica

de “Gota sobre césped”.

Determinación de proteínas mediante el método de Lowry

Determinación del consumo de azúcares.

FIGURA 6 Cultivo de la cepa BAL-C con el medio modificado en mini fermentador artesanal.

28

3.10 Análisis estadístico

Para el análisis estadístico de los resultados obtenidos a nivel de matraces se empleó

el programa estadístico SPSS 15,0 y la prueba de Friedman para datos no

paramétricos.

29

4 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS

4.1 Modificación en la formulación original del caldo de cultivo MRS

En la FIGURA 7 se observan los resultados obtenidos al contrastar tres formulaciones

diferentes de agua de levadura frente al testigo caldo MRS (ANEXO 1). Es posible

observar que la formulación que presentó mayor actividad inhibitoria frente a Listeria

monocytogenes es aquella que contenía un 10% de agua de levadura con un valor de

actividad de 51.200 UA/mL a las 24 h y 48 h. Esta prueba, como ya se menciono en

capitulo anterior, se realizó en duplicado y se probó sólo a nivel de matraces.

FIGURA 7 Efecto del reemplazo del extracto de levadura en el medio MRS por agua de

levadura (AL) en distintas concentraciones.

Los resultados obtenidos con agua de levadura de alguna manera se relacionan con lo

que señalan SHULER y KARGI (2002), sobre la conveniencia de utilizar subproductos,

derivados de procesos productivos y de desecho. El agua de levadura se obtuvo a

partir de crema de levadura, producto intermedio del proceso de elaboración de

levaduras de panificación, este le proporcionó al medio sales minerales, vitaminas y

factores de crecimiento en reemplazo del extracto de levadura ingrediente

convencional del medio MRS. Llama la atención que a menores niveles de agua de

30

levadura se observan mejores resultados, lo que puede inferir que excesos pueden ser

inhibitorios de la STB.

En la FIGURA 8 se muestran los resultados obtenidos para la producción de la STB a

partir de la cepa BAL-C utilizando tres formulaciones alternativas en las que se

modificaron la fuente de carbohidrato (glucosa), por una combinación de melaza y

sacarosa, utilizando como control el caldo MRS. Se puede apreciar que de las

diferentes formulaciones probadas (ANEXO 2) la F5 fue la que entregó la mayor

actividad inhibitoria con 102.400 UA/mL,donde UA/mL corresponde a: “Unidades de

actividad per mililitro” valores obtenidos a las 24 h y 48 h. En los resultados obtenidos

pudieran tener incidencia el hecho que la melaza empleada en este estudio al provenir

de remolacha azucarera, aún contiene restos del disacárido sacarosa y de otros

azúcares (LEVADURAS COLLICO, 2007).

Además, en la FIGURA 8 se puede observar que las dos formulaciones que presentan

la combinación melaza – sacarosa, en diferentes concentraciones, favorecen un

ambiente estresado nutricionalmente y a la vez una mayor producción de la STB

debido posiblemente a una menor presencia de monosacáridos.

FIGURA 8 Efecto de la modificación de la fuente de carbohidratos del medio original.

Existen diversos estudios que concuerdan con los resultados obtenidos en la presente

investigación, es así como LEROY et al., (2006) obtuvieron mayor actividad inhibitoria

de una bacteriocina de Lactobacillus amylovorus DCE 471 al usar fuentes de carbono

compuestas por combinaciones de azúcares. Por otra parte, TODOROV y DICKS,

31

(2006), al analizar el efecto de varios componentes del medio en la producción de una

bacteriocina con dos cepas de Lactobacillus plantarum, observaron un aumento al

doble en la actividad al cambiar la glucosa por sacarosa, maltosa o manosa..

También PAYKOV et al., (2008), al modificar la fuente de carbono por sacarosa,

maltosa, fructosa, arabinosa y lactosa, y observar el comportamiento de tres cepas de

Enterococcus, obtuvieron como resultado un aumento en la producción de la STB,

siendo ésta dependiente de la concentración de azucares.

En cambio ZENDO et al., (2005), al modificar la fuente de carbono por sacarosa y otros

azúcares en el medio MRS no obtuvieron diferencias significativas en la producción de

una STB por Enterococcus mundtii QU2, lo cual no es concordante con los resultados

obtenidos en esta investigación.

Por otra parte, PAYKOV et al., (2008), utilizando las mismas tres cepas de

Enterococcus y estudiar el efecto de concentraciones crecientes de diversos azucares,

encontraron que concentraciones superiores a 3% resultaban inhibitorias para la

producción de STB, resultados similares se obtuvieron en la presente investigación, por

cuanto con niveles menores al 2% y superiores al 3% de azúcares disminuye la

producción de STB.

Los resultados al reemplazar las fuentes de nitrógeno por extractos de harina de lupino

y de harina de pescado (FIGURA 9) en diferentes proporciones, muestran que dicho

reemplazo no es tan efectivo como el medio MRS en la producción de la STB con la

cepa BAL-C. Se puede apreciar, por lo tanto, que ninguna de las tres formulaciones

lograron ser mejor que los ingredientes testigos, extracto de carne y proteosa peptona,

del caldo MRS. Es importante señalar que dentro de las formulaciones probadas la que

genera una mayor actividad inhibitoria corresponde a la que presentó las más bajas

concentraciones de los extractos alternativos (harina de lupino y harina de pescado).

Con respecto a los resultados obtenidos en las pruebas a nivel de matraces para

determinar la mejor concentración de proteínas para un medio alternativo SHULER y

KARGI (2002) y SAHM (1993) señalan que, para el normal crecimiento de una bacteria

es necesaria una fuente de nitrógeno para proveerle de los aminoácidos necesarios

para su estructura y otras funcione celulares.

32

FIGURA 9 Efecto de la modificación fuentes proteicas en el medio. F7 HL (Harina de

Lupino):HP (Harina de pescado)= 1%:6%; F8 0,5%:3%; F9 0,25%:1.5%.

Los resultados obtenidos muestran que las fuentes de proteínas utilizadas no fueron

las adecuadas debido, probablemente, a su gran estructura molecular, que produjo que

la cepa BAL-C fuera incapaz de utilizar estas fuentes para sintetizar la STB como si lo

hizo con MRS, medio que dispone de aminoácidos libres y péptidos de estructura más

simple y accesible a la bacteria para sintetizar debidamente la STB.

Es así como, VASQUEZ et al., (2007) estudiaron el efecto del reemplazo de las

fuentes proteicas en los medios MRS, APT y TGE por peptonas de origen marino

obtenidas a partir de vísceras hidrolizadas con diferentes enzimas, y la producción de

STB a partir de BAL, concluyendo que se obtienen mejores resultados con los

extractos hidrolizados.

En otros estudios VASQUEZ y MURADO (2008) al utilizar peptonas provenientes de

pulpo para reemplazarlas en los medios MRS, APT y TGE, obtienen resultados

óptimos en la producción de STB, y al mismo tiempo logran reducir costos de

producción.

PARENTE y RICCARDI (2006), al modificar la fuente de nitrógeno para la producción

de bacteriocinas con Enterococcus faecium DPC 1146 y empleando un hidrolizado de

caseína y triptona, mostraron que éstos resultaron ser pobres fuentes de nitrógeno en

comparación con la proteosa peptona, resultados que concuerdan con los obtenidos en

la presente investigación.

33

Del análisis anterior se puede señalar que el uso de extractos proteicos hidrolizados

debido a la presencia de aminoácidos libres facilita la producción de la STB a partir de

una cepa láctica.

4.2 Cultivo batch en mini-fermentador

Para este cultivo se utilizaron las formulaciones parciales que obtuvieron los mejores

resultados en cada uno de los ensayos en matraces, trabajado con formulación de

agua de levadura que presento altos niveles de actividad inhibitoria, otro componente

fue mezcla de melaza y sacarosa que proporcionaron niveles más altos de actividad

inhibitoria que el medio testigo, para la mezcla de extracto de harina de lupino y

extracto de harina de pescado se utiliza aquella que presento los mejores niveles de

actividad proporcionados entre estas formulaciones, ya que no se lograron obtener

niveles de actividad superiores a las proporcionadas por el medio testigo.

El ANEXO 9 presenta los resultados, relevantes, obtenidos durante este ensayo. No se

efectuaron mediciones de DO a partir de las muestras extraídas a diferentes intervalos

de tiempo debido a que el medio presentaba una elevada turbidez.

En la FIGURA 10 es posible observar que la cepa alcanzó un crecimiento de 109

UFC/mL a las 6 h de cultivo; al mismo tiempo en el crecimiento bacteriano ocurre una

acidificación del medio dado su metabolismo fermentativo lo cual queda en evidencia

con el consumo de neutralizante NaOH hasta las 36 h de cultivo.

FIGURA 10 Curva de crecimiento y curva de consumo de NaOH.

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

0 6 12 18 22 26 30 36 42 48

Tiempo (h)

UF

C/m

L

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Co

nsu

mo

NaO

H 4N

UFC/mL

Consumo NaOH

34

Los resultados obtenidos para la actividad de STB a nivel de un minifermentador se

pueden observar en la FIGURA 11. En ella se aprecia que la producción de la STB

depende en gran medida de la fuente de nitrógeno y la disponibilidad de aminoácidos

de ésta, lo cual concuerda con lo observado en la FIGURA 9. Así, es posible observar

que no obstante la formulación seleccionada (agua de levadura, mezcla melaza –

sacarosa y extractos de harinas de lupino y pescado) que presenta una actividad de la

STB de 12.500 UA/mL cuando se trabaja a nivel de minifermentador no evidencia un

efecto sinérgico, ya que se obtiene una actividad inhibitoria frente a Listeria

monocytogenes inferior a la detectada cuando estos son incorporados de forma

individual a nivel de matraces en las formulaciones del medio alternativo.

La FIGURA 11, también permite apreciar que la STB producida por la cepa BAL-C es

un metabolito primario, puesto que la producción de esta sustancia se observa sólo a

partir de la hora 6 cuando se logra el máximo crecimiento y hasta la hora 22, cuando el

cultivo se encuentra en evidente fase exponencial. Posteriormente, a partir de la hora

36 se produce un descenso en el recuento de células viables, con lo cual se inicia la

fase de muerte, con la consecuente liberación de toxinas, proteasas y otras enzimas

líticas, lo que probablemente conduce a la pérdida de actividad de la STB entre las 42

y 48 horas.

También es posible observar el efecto inversamente proporcional entre las variables

crecimiento y producción de STB.

FIGURA 11 Crecimiento de la BAL-C y actividad inhibitoria de la STB.

35

TODOROV y DICKS (2007), obtuvieron resultados similares en los niveles de

actividad, a los de la presente investigación, utilizando leche de soya y melaza en

reemplazo de caldo MRS y la cepa Lactobacillus pentosus ST12BZ.

HASSAN AL-ZAHRANI y SALEH AL-ZAHRANI (2006) estudiaron el efecto de modificar

las cantidades de los componentes del medio MRS dando como resultados cambios

significativos en la producción de la STB, lo cual podría explicar en parte los resultados

obtenidos en el presente trabajo.

PARENTE y RICCARDI (2006), estudiaron el efecto de modificar las fuente de

nitrógeno y carbono por sacarosa y una combinación de melaza-glucosa, para la

producción de acido láctico y bacteriocinas con Enterococcus faecium DPC 1146; sus

resultados concuerdan sólo en parte con los de la presente investigación, al obtener

mayor producción con sacarosa que con la mezcla de melaza-glucosa, pues en la

presente investigación los mejores resultados se obtuvieron con una combinación de

ambos tipos de productos.

VINCENT et al. (1998), señalan que el caldo MRS es el mejor medio de cultivo para

Enterococcus spp. y E. faecium para la producción de la bacteriocinas; estos autores,

adicionando un 0,5 % peso/volumen de glucosa y suprimiendo la presencia de una de

las tres fuentes de nitrógeno presentes en el MRS (extracto de levadura, extracto de

carne y proteosa peptona) no se produce STB y no se presenta crecimiento de la cepa,

como era de esperar.

Los bajos niveles de actividad inhibitoria frente a Listeria monocytogenes en este

estudio se pudieron deber a que:

El cultivo de la cepa BAL–C en un caldo alternativo, donde la fuente de

nitrógeno no presenta aminoácidos y péptidos disponibles conlleva a una baja

en la actividad inhibitoria, mientras que en presencia de una mezcla de glucosa

– melaza condiciona una mejor actividad inhibitoria potenciando la baja

actividad dada por la nueva fuente de nitrógeno.

El volumen utilizado para el cultivo podría haber condicionado la menor

actividad inhibitoria de Listeria moncytogenes al estar expuesta a una mayor

aireación durante la prueba.

36

A la incorporación de un volumen constante de aire, factor que no se estudio a

nivel de matraces.

El control de pH de forma constante.

Todos estos factores que pudieron haber afectado el nivel de estrés en el medio.

4.2.1 Consumo de glucosa durante el cultivo por parte de la BAL-C. Debido a que

la mezcla de melaza y sacarosa usada como fuente de carbono en el minifermentador,

contiene una incierta cantidad de azúcares, se aplicó el Gluco test (GOD-PAP) al

medio y a las muestras extraídas, luego de haber sido tratadas con HCl (20 uL

HClfumante/mL de muestra) y llevadas a ebullición por 10 min, ello para poder determinar

el uso de la fuente de carbono por parte de la BAL C.

La FIGURA 12 muestra la relación entre el consumo de glucosa, él cual corresponde a

una medida indirecta del consumo de los azucares durante el batch, utilizándose

NaOH 4 N para mantener constante el pH, de esta forma podemos observar una

medida cuantitativa del consumo de glucosa a través del tiempo.

FIGURA 12 Consumo de la fuente de carbohidratos y gasto de NaOH 4N

37

37

5. CONCLUSIONES

Para la reemplazo del extracto de levadura del medio MRS por agua de levadura, se

obtuvieron valores de actividad inhibitoria frente a L. monocytogenes 4/00 de 51.200

UA/mL para la fórmula de un 10% de agua de levadura (F3), valor que analizado en

contraste con las otras dos formulaciones y el testigo arrojó un valor promedio de 4,00

(prueba de Friedman), superando al testigo MRS.

Para la modificación de la fuente de carbono se obtuvo que la fórmula F5 (mezcla de

20g/L de melaza y 10g/L de sacarosa) entregó un valor de actividad inhibitoria de

102.400 UA/mL y al contrastar las diferentes fórmulas con respecto al testigo se obtuvo

un valor promedio 3,50, valor que superó al MRS en la prueba de Friedman.

Respecto a la utilización de una mezcla de extractos de harina de pescado y de lupino

para reemplazar el extracto de carne y la proteosa peptona, respectivamente, al medio

original, la formulación que obtuvo mejores resultados fue F9 (1,5% de extracto de

harina de pescado y 0,25% de extracto de harina de lupino), la cual no fue capaz de

superar en los valores de actividad inhibitoria a las fuentes originales utilizadas en el

medio comercial.

Se logró obtener crecimiento y una producción de STB, liberada al medio, por lo se

puede decir que la cepa BAL-C es capaz de producir la STB en un medio alternativo al

MRS.

38

6. BIBLIOGRAFIA

(APHA) AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. 1992. MASHALL, R. T. (ed.) Standard Methods for the examination of dairy products. Washington, D.C. 546 p.

BATT, C.A. 2000. Listeria. En: ROBINSON, R.K.; BATT, C.A. y PATEL, P.D. (eds.) Encyclopedia of Food Microbiology. pp: 1197-1198.

BORQUEZ, P. 2000. Producción Continua y Purificación parcial de la bacteriocina de Carnobacterium piscicola L103, utilizando un fermentador modular. Tesis Lic. Ing. Alimentos. Valdivia. Universidad Austral de Chile, Facultad de Ciencias Agrarias. 82 p.

BROCK, T. MADIGAN, M., MARTINKO, PARKER, J. 1998. Biología de los Microorganismos. 8 ª Edición. Prentice Hall. Madrid. España. 1064pp.

BLACKBURN, C.W. y MAcCLURE, P.J. 2002. Foodborne pathogens: hazard, risk analysis and control. Boca Ratón, CRC. 521p.

CAMACHO, F. 2005. Importancia de la Proteosa Peptona N° 3 en la Producccion de Pigmentos por Streptococccus agalactiae en el medio Granada. Tesis doctoral Universidad de Granada. Granada. España.

CASANOVA, M. 2001. Identificación de las variantes genéticas de -caseína en leche de vacas Holstein – Friesian y Jersey por electroforesis de isoenfoque. Tesis Lic. en Ing. en Alimentos. Valdivia. Universidad Austral de Chile, Facultad de Ciencias Agrarias. 102 p.

CINTAS, L.M., CAUSAUS, M.P., HERRANZ, C., NES, L.F. y HERNANDEZ, P.E., 2001. Review: bacteriocins of lactic acid bacteria. Food science technology. 7(4): 281-305.

CRIADO, R., GUTIERREZ, J., MARTÍN, M., HERRANZ, C., HERNANDEZ, P. y CINTAS, L. 2006. Inmunochemical characterization of temperatura-regulated production of Enterocin L50 (EntL50A and EntL50B), Enterocin P and Enterocin Q by Enteroccoccus faecium L50. Applied and environmental microbiology. 72(12): 7636-7643.

CHEN, H. y HOOVER, D. 2003. Bacteriocins and their food applications. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 2: 82-100.

39

ENNAHAR, S.; SASHIHARA, T.; SONOMOTO, K. y ISHIIZAKI, A. 2000. Cass lla bacteriocins: biosíntesis, structure and activity. FEMS Microbiology Reviews 24: 85-106.

(FAO/OMS) ORGANIZACION DE LAS NACIONES UNIDAS PARA LA AGRICULTURA Y LA ALIMENTACION / ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD. 2004 Evaluacion de riesgos de Listeria monocytogenes en aliemntos listos para el consumo. Resumen interpretativo. Serie sobre Evaluacion de Riesgos Microbiologicos. 54p.

GRAVESEN, A.; JYDEGAARD AXELSE, A.M.; MENDES DA SILVA, J.; HANSEN, T.B y KNOCHEL, S. 2002. Frecuency of Bacteriocins Resistance Development and Associated Fitness Cost in Listeria monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology 68 (2): 756-764.

GRAVESEN, A.; RAMNATH, M.; RECHINGER, B.; ANDERSEN, N.; JANSCH, L.; HÈCHARD. Y.; HASTING, J.W. y KNOCHEL, S. 2002. High-level resistance to class lla bacteriocins is associated with one general mechanism in Listeria monocytogenes. Microbiology 148:2361-2369.

JAY, J. 2000. Microbiología moderna de los Alimentos. Editorial Acribia, S.A. España. 804 p.

LEAL-SANCHEZ, M., JIMENEZ-DIAZ, R., MALDONADO-BARRAGA, A., GARRIDO-FERNANDEZ, A., RUIZ-BARBA, J.L. 2002. Optimization of bacteriocin production by batch fermentation of Lactobacillus plantarum LPCO10. Applied and Enviromental Microbiology. 68(9): 4465 - 4471.

LEROY, F, WINTER, T, NEYSENS, P y de VUYST, L. 2006. Sugar relevant for sourdough fermentation stimulate growth of and bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471. International Journal of Food Microbiology. 112: 102 – 111.

NILSSON, L., NIELSEN, M., NG, Y y GRAM, L., 2002. Role of acetate in production of an autoinducible Class IIa bateriocin in Carnobacterium piscícola A9b. Applied and Enviromental Microbiology. 68(5): 2251 – 2260.

PEYKOV, D. DIMOV, Sv. RAYKOVA, D. y IVANOVA, P. 2008. Influence of diverse sugars blis production by three different Enterococcus strains. Trakia Journal of science 6: 54 - 59.

PRESCOTT, S.C. y DUNN, C.G. 1952. Microbiología industrial. Madrid: Aguilar. 950 p.

PARENTE, E. y RICCARDI, A. 1999. Production, recovery and purification of bacteriocins from lactic acid bacteria. Applied microbiology biotechnology. 52: 628 – 638.

40

SCHLEGEL, H.G. 1997. Microbiología general. Editorial Omega. Barcelona. 612 p.

SCHILLINGER, U., STILES, M. E. y HOLZPAPFEL, W. H. 1993. Bacteriocin production by C. piscicola LV61. Int. J. Food Microbiol. 20(3): 131 – 147.

SCHÖBITZ, R., BORQUEZ, P. COSTA, M. CIAMPI, L y BRITO, C. 2006. Bacteriocin like substance production by Carnobacterium piscicola in a continuous system with three culture broths. study of antagonism against Listeria monocytogenes on vacuum packaged salmon. Brazilian Journal of Microbiology. 37:52-57.

SCHÖBITZ, R., SUAZO, V. COSTA, M. y CIAMPI, L. 2003. Effects of a bacteriocin-like inhibitory substance from Carnobacterium piscicola against human and salmon isolatesof Listeria monocytogenes. International Journal Food Microbiology. 84: 237-244.

TODOROV, S y DICKS, L. 2006. Medium components effecting bacteriocin production by two strains of Lactobacillus plantarum ST414BZ and ST664BZ isolated from boza. Biologia, Bratislava. 61(3): 269 – 274.

VASQUEZ, J., GONZALEZ, M. y MURADO, M. 2004. Peptones from autohydrolysed fish viscera for nisin and pediocin production. Journal of Biotechnology. 112: 299 – 311.

41

ANEXOS

42

ANEXO 1

Modificación de extracto de levadura por agua de levadura.

Componentes MRS

Modificación por agua de levadura

Proteosa peptona 0,5 g 0,5 g 0,5 g

Extracto de carne 0,5 g 0,5 g 0,5 g

Extracto de levadura

100% agua de levadura

(100% AL)

(F1)

50% agua de levadura y 50 % tampón fosfato.

(50% AL)

(F2)

10% de agua de levadura y 90% de tampón fosfato.

(10% AL)

(F3)

Dextrosa 1,0 g 1,0 g 1,0 g

Polisorbato 80 0,05 g 0,05 g 0,05 g

Citrato de amonio 0,1 g 0,1 g 0,1 g

Acetato de sodio 0,25 g 0,25 g 0,25 g

Sulfato de magnesio (*)

0,05 g 0,05 g 0,05 g

Sulfato de manganeso (*)

Tampón fosfato de potasio pH 7,0. Utilizando un volumen que complete los 50 mL.

(*) La solución de sales de sulfato se encuentra preparada en una sola solución.

43

ANEXO 2

Modificación fuente de carbono de medio MRS.

Componentes MRS

Modificación de carbohidratos

Proteosa peptona 0,5 g 0,5 g 0,5 g

Extracto de carne 0,5 g 0,5 g 0,5 g


0,25 g 0,25 g 0,25 g

Dextrosa 40 g/L de melaza

(F4)

20 g/L de melaza,

10 g/L de sacarosa

(F5)

10 g/L de melaza,

10 g/L de sacarosa

(F6)





0,05 g 0,05 g 0,05 g


Tampón fosfato de potasio pH 7,0. Utilizando un volumen de 50 mL.


44

ANEXO 3

Modificación fuentes de nitrógenos del medio.

Componentes MRS

Modificación de proteínas

Proteosa peptona 1% Extracto de harina de Lupino

(F7)

0,5% Extracto de harina de Lupino

(F8)

0,25% Extracto de harina de Lupino

(F9)

Extracto de carne 6% Extracto de harina de Pescado

(F7)

3% Extracto de harina de Pescado

(F8)

1,5% Extracto de harina de Pescado

(F9)


0,25 g 0,25 g 0,25 g

Dextrosa 1 g 1 g 1 g





0,05 g 0,05 g 0,05 g




45

ANEXO 4

Medio alternativo utilizado para la prueba de mini-fermentador.

Componentes MRS Modificación de carbohidratos

Proteosa peptona - - 0,25% Extracto de harina de Lupino

(F9)

Extracto de carne - - 1,5% Extracto de harina de Pescado

(F9)

Extracto de levadura 10% de agua de

levadura y 90% de tampón fosfato.

(10% AL)

Dextrosa -

20 g/L de melaza,

10 g/L de sacarosa

(F5)

-





0,05 g 0,05 g 0,05 g




46

ANEXO 5

Determinación de proteínas de acuerdo al método de LOWRY et al. (1951)

Principio.

La determinación se basa en el desarrollo de color debido a la reacción de los enlaces

peptídicos de las proteínas y cobre alcalino del reactivo y la reducción del

fosfomolibdato – fosfotungsteno del reactivo Folin – Ciocalteau, por los aminoácidos

aromáticos.

Equipos y materiales.

- espectrofotómetro

- pipetas 0,5 y 1,0 mL

- Jeringa Hamilton 100 mL

- Solución A: Na2 CO3 2% P/V disuelto en NaOH 0,1 N

- Solución B: CuSO4 x 5 H2O al 1% P/V y Tartrato de Na y K al 2% P/V.

- Solución C: mezclar solución A y B en proporción 50:1

- Solución E: reactivo Folin – Ciocalteau 1N.

A una cantidad de k-caseína, se le adiciona solución A y B las cuales reaccionan con

los enlaces peptídicos. Al agregar reactivo Folin–Ciocalteau se desarrolla color azul al

reaccionar con los aminoácidos aromáticos. La intensidad del color se mide en un

espectrofotómetro a 750 nm.

Determinación.

- Se mide 0,6 mL de k caseína diluida en agua (1 mL en 3 mL)

- Se agrega 3 mL de solución C y 0,3 mL de reactivo Folin – Ciocalteau 1N.

- Se deja 30 min a temperatura ambiente.

- Se mide la absorbancia a 750 nm.

Blanco: 0,6 mL de agua.

47

Se expresan los resultados en % de proteína en la muestra original.

Referencia CASANOVA (2001)

48

ANEXO 6

Curva de calibración para determinación proteica de acuerdo a método

propuesto por LOWRY et al. (1951).

Curva estándar.

- Solución patrón: seroalbúmina de bovino (BSA) 2 mg/ml.

- Medir de la solución de BSA 10, 20, 30, 40, 50 y 60 µl (20, 40, 60, 80, 100 y 120 µg

de proteína) en tubos de ensayo, agregar agua hasta completar 0,6 ml.

- Se agrega a cada tubo 3 ml de solución C y se deja a temperatura ambiente 10 min.

- Se agrega 0,3 mL de reactivo Folin – Ciocalteau 1N.

- Se deja 30 min a temperatura ambiente.

- Se mide la absorbancia a 750 nm.

- Se grafica µg de proteína v/s Abs. 750 nm

49

ANEXO 7

ANEXO 7.1 Resultados expresados en UA/mL para agua de levadura

.

Tiempo (h) Ensayo (UA/mL)

Duplicado (UA/mL)

Testigo MRS 0 1.600 1.600

24 3.200 12.800

48 25.600 25.600

100 %agua de levadura 0 1.600 1.600

24 12.800 6.400

48 25.600 25.600

50% agua de levadura y 50% tampón fosfato de potasio pH 7.0

0 1.600 1.600

24 12.500 6.400

48 25.600 25.600

10% agua de levadura y 90% tampón fosfato de potasio pH 7.0

0 12.800 12.800

24 51.200 25.600

48 51.200 51.200

ANEXO 7.2 Resultados expresados en UA/mL para nuevos carbohidratos

.

Tiempo(h) Ensayo (UA/mL)

Duplicado (UA/mL)


24 12.800 12.800

48 51.200 51.200

40 g/L de melaza 0 6.400 6.400

24 25.600 25.600

48 25.600 25.600

20 g/L de melaza y 10 g/L de sacarosa

0 6.400 6.400

24 102.400 51.200

48 102.400 102.400

10 g/L de melaza y 10 g/L de sacarosa

0 6.400 6.400

24 51.200 51.200

48 51.200 51.200

50

ANEXO 7.3 Resultados expresados en UA/mL para nuevas fuentes proteicas.

Tiempo (h) Ensayo (UA/mL)

Duplicado (UA/mL)


24 25.600 12.800

48 25.600 25.600

6% de harina de pescado y 1% de harina de lupino

0 1.600 1.600

24 3.200 3.200

48 6.400 6.400

3% de harina de pescado y 0,5% de harina de lupino

0 3.200 3.200

24 6.400 6.400

48 6.400 3.200

1,5% de harina de pescado y 0,25% de harina de lupino

0 3.200 3.200

24 12.800 6.400

48 12.800 12.800

51

ANEXO 8

Análisis estadístico utilizando la prueba de Friedman

ANEXO 8.1 Resultados prueba de Friedman para datos no paramétricos reemplazo

de extracto de levadura por agua de levadura.

ANEXO 8.2 Resultados prueba de Friedman para datos no paramétricos reemplazo

de la fuente de carbohidratos por una mezcla de sacarosa y melaza.

Rangos

2,00

1,83

3,50

2,67

TESTIGO

F4

F5

F6

Rango

promedio

52

ANEXO 9

Resultados cultivo batch en mini fermentador

Para la cepa láctica BAL-C se obtuvieron los siguientes resultados de la prueba en el mini fermentador.

Tiempo (h) UFC/mL UA/mL Consumo NaOH

0 2,50E+08 800 0

6 4,80E+09 1600 8

12 4,80E+09 3200 10,0

18 4,40E+09 6400 11,5

22 4,90E+09 12800 14,0

26 4,80E+09 12800 14,0

30 4,90E+09 12800 15,0

36 5,00E+09 12800 15,5

42 3,90E+09 1600 15,5

48 2,80E+09 1600 15,5

53

ANEXO 10

Resultados de proteínas solubles presentes y de consumo de glucosa por parte

de la BAL-C

Tiempo (h) Proteínas solubles Consumo de glucosa

0 0,0 2,1

6 7,0 1,9

12 11,0 1,4

18 14,8 1,0

22 18,0 0,9

26 20,0 0,9

30 22,5 0,7

36 25,8 0,8

42 28,8 0,0

48 31,8 0,0

Documents

Diseño de un Medio de Cultivo Alternativo para la Cepa