Dissertação de Mestrado - repositorio.ufrn.br · O microrganismo foi cultivado em meio formulado com 4% de melaço de cana, o ... 3.4 Utilização de resíduos agroindustriais na

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE-UFRN

CENTRO DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

Dissertação de Mestrado

Produção de surfactina por Bacillus subtilis UFPEDA 438

utilizando melaço de cana como substrato

Patrícia Maria Rocha

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino Dos Santos

Coorientadora: Profa. Dr

a. Gorete Ribeiro de Macedo

NATAL/RN

FEVEREIRO/2017

Patrícia Maria Rocha

Produção de surfactina por Bacillus subtilis UFPEDA 438 utilizando melaço de

cana como substrato

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Engenharia Química da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, como

parte dos requisitos necessários para

obtenção do título de Mestre em

Engenharia Química, sob a orientação do

Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos e

coorientação da Profa. Dr

a. Gorete

Ribeiro de Macedo.

NATAL/RN

FEVEREIRO/2017

Catalogação de Publicação na Fonte.

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN / Sistema de Bibliotecas - SISBI

Biblioteca Setorial Especializada em Engenharia Química - CT

Rocha, Patrícia Maria.

Produção de surfactina por Bacillus subtilis UFPEDA 438 utilizando melaço de

cana como substrato/ Patrícia Maria Rocha. - Natal, 2017.

114f.: il.

Orientador: Everaldo Silvino dos Santos.

Coorientador: Gorete Ribeiro de Macedo.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro

de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-graduação

em Engenharia Química.

1. Resíduos sólidos industriais - Dissertação. 2. Biossurfactantes - Dissertação. 3.

Surfactina - Dissertação. 4. Melaço - Cana de açúcar - Dissertação. 5. Bacillus subtilis

- Dissertação. I. Santos, Everaldo Silvino dos. II. Macedo, Gorete Ribeiro de. III.

Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSEQ CDU 628.54(043.3)

ROCHA, Patrícia Maria – Produção de surfactina por Bacillus subtilis UFPEDA 438

utilizando melaço de cana como substrato. Programa de Pós-Graduação em Engenharia

Química. Área de Concentração: Engenharia Química, Linha de pesquisa: Processos

químicos, catalíticos e biotecnológicos, 2017, Natal/RN, Brasil.

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos



RESUMO: Os biossurfactantes têm atraído grande interesse tanto da comunidade científica

como da indústria, nos últimos anos, por oferecerem várias vantagens em relação aos

surfactantes sintéticos, incluindo a possibilidade de produção a partir de recursos renováveis

através de fermentação. Dentre as diferentes classes de biossurfactantes, os lipopeptídeos

destacam-se por seu potencial antibiótico, especialmente a surfactina. As características

vantajosas da surfactina impulsionaram o desenvolvimento de pesquisas em escala de

laboratório voltadas para recuperação avançada de óleo, biorremediação, inibição da

formação de coágulos, formação de canais iônicos em membrana, entre outros temas.

Contudo, assim como demais biossurfactantes, as aplicações comerciais da surfactina

esbarram no seu alto custo de produção. Isto pode ser atribuído à utilização de nutrientes

caros e deficiências nas operações de recuperação e purificação. Para superar estes gargalos,

resíduos agroindustriais têm sido utilizados com uma alternativa de substrato de baixo custo

para a produção de biossurfactantes. O presente trabalho visa avaliar a produção de surfactina

por Bacillus subtilis UFPEDA 438 utilizando como fonte de carbono o melaço de cana,

subproduto proveniente da indústria açucareira, como forma de redução dos custos da

produção. O microrganismo foi cultivado em meio formulado com 4% de melaço de cana, o

qual foi submetido à fermentação submersa em incubador rotativo (shaker). Investigou-se a

influência da temperatura, agitação e razão de aeração na síntese do biossurfactante. Amostras

foram coletadas em intervalos regulares durante o cultivo até 72 horas de fermentação para

acompanhamento da concentração de substrato, concentração celular, concentração de

surfactina e pH. Dentre os resultados encontrados, na melhor condição de cultivo (200 rpm,

36 ºC e razão de aeração de 0,4) foram obtidos 199,45 ± 0,13 mg/L de surfactina em 24 h,

fator de conversão de substrato em produto (YP/S) de 0,022 g/g e produtividade em produto

(PP) de 8,19 mg/L.h em 24 h. Em todos os ensaios o pH se mostrou estável, variando na faixa

de 6,2 a 6,7, e observou-se quantidade expressiva de açúcar residual ao final da fermentação.

A Concentração Micelar Crítica (CMC) do biossurfactante produzido na melhor condição de

cultivo foi de 20,73 mg/L, mostrando sua eficácia como um bom agente de superfície.

Apresentou um índice de emulsificação (E24) para querosene, após 24 h, de 62,0% e

capacidade de formar emulsões de elevada estabilidade, atingindo valores em torno de 1,5 U.

Palavras-chave: Biossurfactante, surfactina, melaço de cana.

ROCHA, Patrícia Maria – Produção de surfactina por Bacillus subtilis UFPEDA 438

utilizando melaço de cana como substrato. Programa de Pós-Graduação em Engenharia

Química. Área de Concentração: Engenharia Química, Linha de pesquisa: Processos

químicos, catalíticos e biotecnológicos, 2017, Natal/RN, Brasil.

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos



ABSTRACT

The biosurfactants are drawing attention of both academy and industry by showing

advantages mainly when compared to the chemical surfactants since they can be produced

using renewable resources by fermentation. Among the different classes of biosurfactants

lipopeptides outstand by their antibiotic activities, mainly the biosurfactant known as

surfactin. Due to its properties it has been used in many fields such as bioremediation,

biology, medicine and so on. However, as the others biosurfactants the production cost still is

the bottleneck. Then the use of lower cost substrate can be one strategy in order to reduce the

production costs. In this study the surfactin was produced by Bacillus subtilis UFPEDA 438

using sugarcane molasse as substrate in order to reduce costs. The microoganism was

cultivated in rotatory shaker using a medium containing 4% surgacane molasse. The influence

of temperature, agitation as well as the aeration ratio in the surfactin production was

investigated. The samples were taken during cultivation until 72 h in order to record the

substrate and cells concentration, the concentration of surfactin produced and medium pH.

The results showed that for the best cultivation condition (200 rpm, 36 ºC and 0.4 aeration

ratio) the concentration of surfactin was 199.45 ± 0.13 mg/L reached after 24 h, the substrate

to product yield (YP/S) was 0.022 g/g and product productivity (PP) was 8.19 mg/L.h after 24

h. The pH was stable during all cultivation experiments ranging from 6.2 to 6.7 also a large

residual content of substrate was observed. The Critical Micellar Concentration (CMC) of the

produced biosurfactant at the best cultivation condition was 20.73 mg/L, thus showing good

efficiency as surface agent. Also, it showed an emulsification index after 24 h (E24) of 62.0%

for kerosene and capacity of forming emulsion of high stability reaching values of

approximately 1.5U.

Keyword: Biosurfactant, surfactin, sugarcane molasses.

“Em um lugar escuro nos encontramos,

e um pouco mais de conhecimento

ilumina nosso caminho."

Mestre Yoda

A Deus,

aos meus pais,

Francisco e Socorro,

ao meu amado noivo,

Renato,

e aos meus queridos irmãos,

Paulo e Izabel.

Dedico

AGRADECIMENTOS

A Deus minha eterna gratidão, por ter me dado força, sabedoria e coragem para

enfrentar os obstáculos encontrados durante a minha jornada.

Aos meus pais, Francisco e Socorro, que sempre foram fonte de inspiração para mim.

A eles, o meu incomensurável agradecimento pelo carinho e dedicação presente em todos os

momentos da minha vida.

Ao meu noivo, Renato, por todo carinho, cumplicidade, paciência, palavras de

encorajamento, por estar sempre ao meu lado nos momentos difíceis e sempre compartilhar

comigo o sonho de alcançar este título.

Aos meus irmãos Paulo e Izabel, pelo apoio e companheirismo.

Ao meu orientador Prof. Dr. Everaldo Silvino, não só por ter me dado a oportunidade

de trabalhar junto à sua equipe, como também por toda orientação, confiança e dedicação no

desenvolvimento deste trabalho.

À minha coorientadora, Profª. Drª Gorete Ribeiro, pela sua colaboração e

contribuições tão valiosas que enriquecem a pesquisa.

Aos bolsistas Lucas, Aline e Estefani, meu reconhecimento pela colaboração e ajuda

nos experimentos.

A todos os meus amigos do Laboratório de Engenharia Bioquímica que contribuíram

na realização deste trabalho, em especial a Ana Laura, Cleitiane, Ana Carmen, Millena,

Sérgio, Carlos e Emilianny, meu agradecimento pelo apoio, amizade e momentos de

descontração.

Ao técnico do Laboratório de Engenharia Bioquímica, Dr. Francisco Canindé, por ser

sempre prestativo e por sempre me auxiliar em minhas dúvidas no laboratório.

Aos amigos Tássia, Edilene, Igor e Heloísa, por sempre me oferecerem um ombro

amigo e não me deixaram desanimar ou desistir. Muito obrigada pelo carinho, força, amparo e

companhia.

As queridas amigas do Laboratório de Engenharia de Alimentos, Ana Luiza, Francisca

e Kátia, por toda amizade, força, conselhos e por estar sempre à disposição nos momentos de

necessidade.

A Profª. Drª Roberta Targino, por ter acompanhado durante muitos anos da minha

jornada acadêmica desde a graduação, com quem eu cresci como pessoa e como profissional.

Seus ensinamentos estarão sempre no meu coração.

Aos membros da banca: Prof. Dr. Everaldo Silvino, Profª. Drª Gorete Ribeiro, Dr.

Francisco Canindé, Dr. Ana Carmen dos Santos, Profª. Drª Luciana Rocha pela gentil

colaboração na avaliação deste trabalho.

Aos funcionários da secretária do PPGEQ, Mazinha e Medeiros, pela paciência e

competência na realização dos problemas burocráticos.

A UFRN por conceder toda a estrutura e apoio necessário para a concretização do

presente trabalho.

A CAPES, por viabilizar esta pesquisa, através da concessão da bolsa de estudos.

SUMÁRIO

1. Introdução ............................................................................................................................. 16

2. Objetivos ............................................................................................................................... 20

2.1 Objetivo geral ................................................................................................................. 20

2.2 Objetivos específicos ...................................................................................................... 20

3. Revisão Bibliográfica ........................................................................................................... 22

3.1 Surfactantes .................................................................................................................... 22

3.2 Biossurfactantes .............................................................................................................. 25

3.2.1 Classificação dos biossurfactantes........................................................................... 25

3.2.3 Características e aplicações dos Biossurfactantes ................................................... 30

3.3 Produção de biossurfactante a partir de Bacillus subtilis ............................................... 30

3.3.1 Surfactina ................................................................................................................. 32

3.3.1.1 Parâmetros que influenciam a produção de surfactina ..................................... 37

3.3.1.2 Aplicações da surfactina ................................................................................... 38

3.4 Utilização de resíduos agroindustriais na produção de surfactina .................................. 41

3.5 Melaço de cana ............................................................................................................... 44

4. Metodologia Experimental ................................................................................................... 47

4.1 Microrganismo ............................................................................................................... 48

4.2 Obtenção do melaço de cana .......................................................................................... 48

4.3 Preparo do inóculo .......................................................................................................... 48

4.4 Procedimento para cultivo .............................................................................................. 49

4.5 Extração de surfactina .................................................................................................... 50

4.6 Métodos analíticos .......................................................................................................... 52

4.6.1 Determinação da concentração celular .................................................................... 52

4.6.2 Determinação da concentração de substrato ............................................................ 52

4.6.3 Determinação do pH ................................................................................................ 53

4.6.4 Determinação da concentração de lipopeptídeos..................................................... 53

4.7 Determinação da Concentração Micelar Crítica (CMC) ................................................ 54

4.8 Determinação do Índice de Emulsificação (E24) ............................................................ 55

4.9 Atividade Emulsificante ................................................................................................. 55

4.10 Obtenção dos Parâmetros Cinéticos ............................................................................. 56

4.10.1 Velocidades instantâneas ....................................................................................... 56

4.10.2 Determinação da Produtividade............................................................................. 56

4.10.2.1 Produtividade em biomassa (PX) .................................................................... 56

4.10.2.2 Produtividade em produto (Pp) ....................................................................... 57

4.10.3 Cálculo das velocidades específicas ...................................................................... 57

4.10.4 Determinação da fase exponencial de crescimento celular ................................... 58

4.10.5 Fatores de conversão ............................................................................................. 58

4.10.6 Determinação dos Parâmetros do Modelo de Luedeking-Piret ............................. 59

5. Resultados e Discussão ......................................................................................................... 61

5.1 Cultivo de Bacillus subtilis UFPEDA 438 em diferentes condições.............................. 61

5.1.1 Determinação da Concentração de Iturina............................................................... 80

5.2 Índice de Emulsificação (E24) ......................................................................................... 82

5.3 Avaliação da atividade Emulsificante ............................................................................ 83

5.4 Determinação da Concentração Micelar Crítica (CMC) ................................................ 84

6. Conclusões ............................................................................................................................ 88

Referências Bibliográficas ........................................................................................................ 90

APÊNDICE I .......................................................................................................................... 113

APÊNDICE II ......................................................................................................................... 114

LISTA DE FIGURAS

Figura 3.1 – Estrutura química de um monômero de surfactante. ............................................ 22

Figura 3.2 – Tensão superficial, tensão interfacial e solubilidade em função da concentração

de surfactante ............................................................................................................................ 24

Figura 3.3 – Estruturas química de alguns biossurfactantes. .................................................... 29

Figura 3.4 – Lipopeptídeos produzidos por Bacillus subtilis: (A) surfactina; (B) iturina A; (C)

bacilomicina L. ......................................................................................................................... 32

Figura 3.5 – Primeira estrutura da família das surfactinas ....................................................... 33

Figura 3.6 – Representação da cadeia lateral ácido graxo da surfactina para n, iso e anteiso

(A1-A7 = Aminoácidos). ........................................................................................................... 33

Figura 3.7 – Estrutura do principal homólogo da surfactina (iso-C15). Isoformas: (A)

Surfactina A, (B) Surfactina B e (C) Surfactina C. .................................................................. 35

Figura 3.8 – Melaço de cana. .................................................................................................... 44

Figura 4.1 – Fluxograma para metodologia experimental. ....................................................47

Figura 4.2 – Colônias da bactéria Bacillus subtilis UFPEDA 438 em tubo inclinado. ........... 48

Figura 4.3 – Procedimento de extração da surfactina.. ............................................................. 51

Figura 4.4 – Tensiômetro K100 utilizado para determinação da CMC................................... 54

Figura 5.1 – Curvas de crescimento celular, consumo de substrato, produção de surfactina e

pH em função do tempo para o ensaio A (100 rpm, 30 ºC e razão de aeração 0,4)..................62

Figura 5.2 – Velocidades específicas de consumo de substrato (µs), crescimento celular (µx) e

formação de produto (µp) em função do tempo para o ensaio A (100 rpm, 30 ºC e razão de

aeração 0,4). .............................................................................................................................. 63


pH em função do tempo para o ensaio B (100 rpm, 30 ºC e razão de aeração 0,6). ................ 65


formação de produto (µp) em função do tempo para o ensaio B (100 rpm, 30 ºC e razão de

aeração 0,6). .............................................................................................................................. 66


pH em função do tempo para o ensaio C (200 rpm, 36 ºC e razão de aeração 0,4). ................ 67


formação de produto (µp) em função do tempo para o ensaio C (200 rpm, 36 ºC e razão de

aeração 0,4). .............................................................................................................................. 68


pH em função do tempo para o ensaio D (200 rpm, 36 ºC e razão de aeração 0,6). ................ 69


formação de produto (µp) em função do tempo para o ensaio D (200 rpm, 36 ºC e razão de

aeração 0,6). .............................................................................................................................. 70


pH em função do tempo nas condições de 150 rpm, 33 ºC e razão de aeração de 0,5: (A)

Ensaio E1; (B) Ensaio E2. ......................................................................................................... 71

Figura 5.10 – Velocidades específicas de consumo de substrato (µs), crescimento celular (µx)

e formação de produto (µp) em função do tempo nas condições de 150 rpm, 33 ºC e razão de

aeração de 0,5: (A) Ensaio E1; (B) Ensaio E2. .......................................................................... 73

Figura 5.11 – Concentração de surfactina em função do tempo de cultivo de B. subtilis

UFPEDA 438. ........................................................................................................................... 76

Figura 5.12 – Capacidade de emulsificação do biossurfactante produzido por B. subtilis

UFPEDA 438 para as amostras do ensaio C (200 rpm, 36 ºC e razão de aeração 0,4): (A) 24 h

de cultivo; (B) 48 h de cultivo. ................................................................................................. 83

Figura 5.13 – Atividade emulsificante (U) da surfactina produzida por B. subtilis UFPEDA

438 para as amostras do ensaio C (200 rpm, 36 ºC e razão de aeração 0,4) nos tempos de 24 e

48 h de cultivo. ......................................................................................................................... 84

Figura 5.14 – Concentração Micelar Crítica (CMC) do biossurfactante produzido por B.

subtilis UFPEDA 438 no ensaio C (200 rpm, 36 ºC e razão de aeração 0,4). .......................... 85

LISTA DE TABELAS

Tabela 3.1 – Exemplos de surfactantes comerciais e classificação quanto à porção hidrofílica.

.................................................................................................................................................. 23

Tabela 3.2 – Principais classes de biossurfactantes e microrganismos produtores. ................. 26

Tabela 3.3 – Aplicações e potencialidades de uso de surfactina em segmentos industriais..... 41

Tabela 4.1 – Ensaios realizados em diferentes condições, utilizando B. subtilis UFPEDA 438

em meio contendo melaço de cana...........................................................................................49

Tabela 5.1 – Parâmetros cinéticos obtidos por ajuste linear..................................................... 64

Tabela 5.2 – Parâmetros cinéticos dos ensaios de produção de surfactina por B. subtilis

UFPEDA 438. ........................................................................................................................... 77

Tabela 5.3 – Produção de surfactina relatada na literatura ......................................................80

Tabela 5.4 – Concentração de Iturina produzida por B. subtilis UFPEDA

438.............................................................................................................................................81

Tabela 5.5 – Índice de Emulsificação (E24) obtido em querosene, realizado a partir de

sobrenadante de cultura produzido por B. subtilis UFPEDA 438 para as amostras do ensaio C

(200 rpm, 36 ºC e razão de aeração 0,4) nos tempos de 24 e 48 h de cultivo... ....................... 82

LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS

ART: açúcares redutores totais

CMC: Concentração Micelar Crítica

DNS: Ácido 3,5-dinitrosalicílico

E24: Índice de Emulsificação após 24 horas

MEOR: Microbial Enhanced Oil Recovery

PCA: Plate Count Agar

Pmáx: concentração máxima de surfactina

PP: produtividade em produto

PX: produtividade em biomassa

SR: porcentagem de substrato residual ao final da fermentação

TPmáx: tempo em que ocorreu a concentração máxima de surfactina

TXmáx: tempo em que ocorreu a concentração máxima de biomassa

UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Vf: Volume do frasco

Vm: Volume do meio

Xmáx: concentração máxima de biomassa

YP/S: conversão de substrato em produto

YP/X: conversão de células em produto

YX/S: conversão de substrato em células

ΔS: variação da concentração do substrato ao final da fermentação

Capítulo 1

Introdução

16

1. Introdução

Patrícia Maria Rocha Fevereiro/2017

1. Introdução

Surfactantes são moléculas anfifílicas, constituídas de uma porção hidrofóbica e outra

hidrofílica, o que lhes confere a propriedade de interagir na interface entre fluidos de

diferentes polaridades como, por exemplo, água e óleo. O emprego destes compostos

promove a redução das tensões interfacial e superficial, e também pode aumentar a

solubilidade e mobilidade de compostos hidrofóbicos ou orgânicos insolúveis em soluções

aquosas (Ying, 2006; Singh et al., 2007).

Em 2015, o mercado mundial dos surfactantes atingiu cerca de 30,65 bilhões de dólares e

estima-se que a demanda mundial de surfactantes deverá atingir 39,69 bilhões de dólares até o

ano de 2021 (Acmite, 2016). A maior parte dos surfactantes disponíveis comercialmente é

sintetizado a partir de derivados do petróleo. Entretanto, a crescente preocupação ambiental

entre os consumidores atrelada as novas legislações de controle do meio ambiente, tem levado

à procura por surfactantes naturais como alternativa aos produtos existentes (Nitschke &

Pastore, 2002).

Os biossurfactantes também são substâncias com caráter anfipático assim como os

surfactantes sintéticos, porém, sintetizados por microrganismos como bactérias, leveduras e

fungos filamentosos em diferentes fontes de carbono (Migliorelli, 2003). Dentre os

biossurfactantes mais efetivos estão os lipopeptídeos produzidos por bactérias do gênero

Bacillus, especialmente a surfactina, produzida por Bacillus subtilis (Barros et al., 2007). A

surfactina, um dos mais conhecidos biossurfactantes, possui várias aplicações farmacêuticas

como atividade anticoagulante, antitumoral, antimicrobiana e antiviral (Costa, 2005; Stein,

2005). Esses bioprodutos oferecem diversas vantagens em relação aos surfactantes sintéticos,

incluindo a possibilidade de produção a partir de recursos renováveis através de fermentação

(Marchant & Banat, 2012b; Reis et al., 2013). Além disso, eles têm diversas vantagens

favoráveis, como a melhor biodegradabilidade, baixa toxicidade, e bom desempenho sob

condições extremas de salinidade, temperatura ou pH (Lotfabad et al., 2009; Mulligan, 2009;

Lima et al., 2011; Marchant & Banat, 2012a).

Em comparação com os surfactantes produzidos quimicamente, a produção industrial de

biossurfactantes ainda é limitada devido aos altos custos de produção associados a métodos

ineficientes de recuperação do produto e ao uso de substratos caros (Tuleva et al., 2009).

Entretanto, o problema econômico da produção de biossurfactantes pode ser

significativamente reduzido por meio do uso de substratos alternativos, ricos em carboidratos

17

1. Introdução


e/ou lipídeos para o crescimento de microrganismos e biossíntese desses bioprodutos como,

por exemplo, subprodutos provenientes da agroindústria (Gallert & Winter, 2002; Makkar &

Cameotra, 2002; Mukherjee & Das, 2005).

Além de ocasionar problemas de ordem ambiental, os resíduos representam perdas de

matéria-prima e energia, exigindo investimentos significativos em tratamentos destes

efluentes para controlar a poluição. Sendo assim, o aproveitamento destes subprodutos é uma

alternativa para a redução das perdas, além de contribuir para a valorização econômica dos

mesmos (Gallert & Winter, 2002; Bezerra, 2012).

Nesse contexto, os resíduos industriais têm despertado grande interesse dos pesquisadores

como alternativa para o fornecimento de substratos de baixo custo para a produção de

biossurfactantes, uma vez que a escolha do substrato pode representar uma redução de até

30% do custo total do processo (Maneerat, 2005a). Uma variedade de matérias-primas

baratas, dentre elas, resíduos de destilaria (Dubey & Juwarkar, 2001), soro de queijo (Dubey

& Juwarkar, 2001; Nitschke & Pastore, 2006) melaço de cana (Cordeiro, 2006; Bezerra, 2006;

Nitschke & Pastore, 2006; Al-Bahry et al., 2013) e manipueira (Nitschke & Pastore, 2006;

Barros et al., 2008; Costa et al., 2009; Bezerra, 2012) têm sido descritas como substrato para

a produção de biossurfactantes.

O Grupo de Pesquisas de Engenharia de Bioprocessos da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte (UFRN) vêm desenvolvendo estudos sobre a utilização de microrganismos

produtores de biossurfactantes desde o ano de 2003 (Lobato, 2003; Silva, 2004; Bezerra,

2006; Oliveira, 2010; Bezerra, 2012; Araújo, 2016). Dentre os estudos realizados, vale

destacar a produção de biossurfactantes por Pseudomonas aeruginosa utilizando substratos

alternativos como manipueira e melaço de cana (Bezerra, 2006; Oliveira, 2010; Bezerra,

2012) e sua aplicação como adjuvante na hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos

(Araújo, 2016), no entanto, ainda não foram realizados estudos sobre a produção e aplicação

de biossurfactante a partir de Bacillus subtilis.

Diante do exposto, o objetivo deste estudo foi avaliar a produção de biossurfactante por

isolados de Bacillus subtilis UFPEDA 438 utilizando como substrato o melaço, tendo em

vista que este substrato é uma fonte de nutriente abundante e renovável, sendo muitas vezes

descartado. Os ensaios foram realizados em diversas condições de cultivo, a fim de avaliar a

melhor condição para obtenção de uma maior quantidade e qualidade de surfactina.

Dessa forma, o presente trabalho encontra-se dividido em sete capítulos, iniciando

pela presente seção, Introdução. No capítulo 2 são apresentados os Objetivos propostos,

seguido do capítulo 3, onde será apresentada a Revisão Bibliográfica relacionada às

18

1. Introdução


características e aplicações de biossurfactantes, com ênfase na surfactina produzida por

Bacillus subtilis, bem como características do substrato estudado. O capítulo 4, descreve a

Metodologia Experimental empregada ao longo da pesquisa, ao passo que os resultados são

apresentados e discutidos no capítulo 5 seguinte, Resultados e Discussão. O capítulo 6

aponta as principais Conclusões do estudo, o qual é finalizado pelo capítulo 7 onde são

apresentadas as Referências Bibliográficas, fonte de consulta para o desenvolvimento do

trabalho de pesquisa.

Capítulo 2

Objetivos

20

2. Objetivos


2. Objetivos

2.1 Objetivo geral

Estudar a síntese de surfactina por Bacillus subtilis UFPEDA 438 empregando o

melaço de cana como substrato.

2.2 Objetivos específicos

Estudar a influência da temperatura, agitação e razão de aeração na produção de

surfactina por Bacillus subtilis;

Avaliar a cinética de crescimento e síntese de surfactina;

Recuperar a surfactina e iturina a partir do caldo de fermentação e determinar sua

concentração;

Estimar os parâmetros cinéticos (μx,YX/S, YP/X ,YP/S, Px e PP);

Determinar a Concentração Micela Crítica;

Analisar o índice de emulsificação e atividade emulsificante do biossurfactante

produzido.

Capítulo 3

Revisão Bibliográfica

22

3. Revisão Bibliográfica



Neste capítulo é elaborada uma revisão da literatura baseada na temática deste trabalho,

apresenta assuntos com relação às características e aplicações de biossurfactantes, incluindo a

surfactina produzida por Bacillus subtilis. Além disso, foram abordadas temáticas sobre

parâmetros que influenciam a produção de surfactina e características do substrato utilizado

no presente estudo.

3.1 Surfactantes

Os surfactantes são compostos anfifílicos, orgânicos ou organometálicos, que

apresentam em sua estrutura grupos hidrofóbicos (apolar) e hidrofílicos (polar), conforme

representado na Figura 3.1. Essas características permitem diversas alterações nos sistemas

heterogêneos, pois constituem substâncias de adsorção que alteram as condições

prevalecentes em interfaces (Ron & Rosenberg, 2001; Singh et al., 2007). A “cauda”

geralmente é composta por uma ou duas cadeias carbônicas hidrofóbicas (alifáticas, linear ou

ramificada; grupos aromáticos ou policíclicos). A “cabeça”, de acordo com a sua carga,

permite classificar os surfactantes em: não-iônicos, iônicos e zwitteriônicos ou anfóteros

(Zana, 2005; Hamme et al., 2006).

Figura 3.1 – Estrutura química de um monômero de surfactante.

Fonte: Química dos tensoativos (2016).

Devido a sua estrutura os surfactantes podem reduzir a tensão superficial e interfacial

e formar microemulsões permitindo que os hidrocarbonetos possam se solubilizar em água ou

23



que a água possa se solubilizar em hidrocarbonetos (Ron & Rosenberg, 2001). Tais

propriedades possibilitam uma ampla gama de aplicações industriais envolvendo detergência,

emulsificação, lubrificação, capacidade espumante, capacidade de molhabilidade,

solubilização e dispersão de fases. A Tabela 3.1 apresenta alguns surfactantes comerciais.

Tabela 3.1 – Exemplos de surfactantes comerciais e classificação quanto à porção hidrofílica.

Tipo Agente tensoativo

Catiônico Brometo de cetiltrimetil amônio (CTAB)

Brometo de dodeciltrimetil amônio (DTAB)

Cloreto de cetilpiridino (CICP)

Aniônico Dodecil sulfato de sódio (SDS)

Dihexadecil fosfato (DHF)

Bis(2-etilhexil) sulfosuccinato sódico (Aerosol OT)

Não iônico Polioxietileno (9-10) p-tercotil fenol (Triton X-100)

Polioxietileno (23) dodecanol (brij 35)

Polisorbatos (Incluindo Tween)

Zwitteriônico 3-(dodecildimetil amônio) propano 1-sulfato (SB-12)

4-(dodecildimetil amônio) butirato (DAB)

Fonte: Maniasso, (2001); Hamme et al., (2006).

A tensão superficial é a força de atração existente entre as moléculas dos líquidos,

sendo definida como a medida da energia livre da superfície pela unidade de área, necessária

para trazer uma molécula do interior do líquido para superfície (Mulligan, 2004; Pirôllo,

2006). Quando a concentração de surfactante no meio aquoso aumenta, há diminuição da

tensão superficial ocorrendo formação de micelas, que são moléculas anfipáticas agregadas

com as porções hidrofílicas posicionadas para a parte externa da molécula e as porções

hidrofóbicas para a parte interna (Cortis & Ghezzehei, 2007). As micelas são espécies

termodinamicamente estáveis no equilíbrio químico quando os surfactantes estão livres em

solução (Zana, 2005).

Devido à presença de surfactantes, uma menor energia é requerida para trazer uma

molécula até a superfície e a tensão superficial é reduzida (Daltin, 2011). De acordo com

Mulligan (2004), um bom surfactante pode reduzir a tensão superficial da água de 72 para

35mN/m. De modo análogo, a presença de surfactante pode reduzir a energia entre dois

líquidos imiscíveis, denominada tensão interfacial. Por isso, a eficácia de um surfactante

24



costuma ser determinada por sua capacidade de reduzir a tensão superficial ou a tensão

interfacial dos sistemas (Cara, 2009).

A Concentração Micelar Crítica (CMC) corresponde à concentração mínima de

surfactante necessária para atingir os valores mais baixos de tensão superficial e interfacial, a

partir da qual se inicia a formação de micelas. Quando a CMC é atingida, várias micelas são

formadas (Van-Hamme et al., 2006). A Figura 3.2 representa a formação de micelas de

surfactantes.

Figura 3.2 – Tensão superficial, tensão interfacial e solubilidade em função da concentração

de surfactante. Fonte: Mulligan, (2005) adaptado por Cara, (2009).

Surfactantes eficientes apresentam baixa concentração micelar, ou seja, menos

surfactante é requerido para reduzir a tensão superficial. Na prática a CMC é também a

concentração máxima dos monômeros de surfactante em água, a qual é influenciada pelo pH,

temperatura e força iônica (Mulligan, 2004; Daltin, 2011). Estas características tornam os

surfactantes compostos químicos amplamente comercializados e utilizados em produtos como

detergentes, petroquímicos, cosméticos, tintas, cerâmica, alimentos, tratamento de couros e

têxteis, formulações farmacêuticas, óleos lubrificantes, entre outros (Daltin, 2011).

O maior mercado para os surfactantes é a indústria petrolífera, onde são amplamente

utilizados para recuperação terciária do petróleo (MEOR - Microbial Enhanced Oil

Recovery), como na remoção e mobilização de resíduos de óleo e biorremediação (Ron &

25



Rosenberg, 2001). No entanto, esses compostos não são biodegradáveis podendo ser tóxicos

para os ecossistemas (Daltin, 2011).

3.2 Biossurfactantes

Os compostos de origem microbiana, denominados biossurfactantes, são produzidos

por microrganismos, especialmente bactérias, que exibem propriedades surfactantes com alta

capacidade emulsificante e redução da tensão superficial (Soo et al., 2004). Esses compostos

foram descobertos no fim da década de 60 através de estudos que demostraram a capacidade

de alguns microrganismos em sintetizá-los (Arima et al., 1968; Kakinuma et al., 1969).

Atualmente, sabe-se que esses compostos com propriedades tensoativas são

sintetizados por uma série de organismos vivos, desde plantas (saponinas), microrganismos

(glicolipídeos) e também pelo organismo humano (sais bilares), sendo utilizados para

atividades intra e extracelulares como a emulsificação de nutrientes, transporte de materiais

através das membranas celulares, com finalidades fisiológicas, e no reconhecimento celular

(Maneerat, 2005b). Em geral, os biossurfactantes permitem que os microrganismos cresçam

em substratos hidrofóbicos, através da diminuição da tensão superficial, disponibilizando-os

para o seu metabolismo (Strelec, 2006). Sua produção também está associada à interação das

células com superfícies sólidas e aos fatores de virulência (Nitschke et al., 2008).

Os biossurfactantes podem ser obtidos por procedimentos relativamente simples como,

por exemplo, processos fermentativos, utilizando substratos renováveis e de baixo custo

incluindo açúcares, óleos, alcanos, resíduos industriais e agrícolas (Acioly, 2009). Além

disso, a possibilidade de variação de inúmeros parâmetros como tempo de cultivo, velocidade

de agitação, pH do meio e nutrientes adicionados, permite a obtenção de compostos com

características estruturais e propriedades físicas distintas, o que os tornam comparáveis ou

superiores aos surfactantes sintéticos em termos de eficiência, embora os custos de produção

ainda não permitam uma competitividade com seus similares petroquímicos (Canet et al.,

2002).

3.2.1 Classificação dos biossurfactantes

Os biossurfactantes são comumente classificados de acordo com a sua natureza

bioquímica ou pela origem microbiana. Eles compreendem uma vasta gama de estruturas

26



químicas e são divididos em cinco grupos: glicolipídeos, lipoproteínas, fosfolipídeos, lipídeos

neutros, ácidos graxos e biossurfactantes poliméricos (Banat et al. 2000). A Tabela 3.2 ilustra

as principais classes de biossurfactantes e microrganismos produtores.

Tabela 3.2 – Principais classes de biossurfactantes e microrganismos produtores.

Tipo de surfactante Microrganismo

Glicolipídeos

ramnolipídeos

soforolipídeos

trehalolipídeos

Pseudomonas aeruginosa

Torulopsis bombicola

T. apícola

Rhodococcus erythropolis

Mycobacterium sp.

Lipopeptídeos e lipoproteína

Peptídeo-lipídeo

Viscosina

Serravetina

Subtilisina

Surfactina

Gramicidina

Polimixina

Bacillus licheniformis

Pseudomonas fluorescens

Serratia marcescens

Bacillus subtilis

Bacillus subtilis

Bacillus brevis

Bacillus polymyxa

Ácidos graxos, lipídeos neutros e fosfolipídeos

Ácidos graxos

Lipídios neutros

Fosfolipídeos

Corynebacterium lepus

Nocardia erythoropolis

Thiobacillus thiooxidans

Surfactantes poliméricos

Emulsan

Biodispersan

Liposan

Carboidrato-lipídeo-proteína

Manana-lipídeo-proteína

Acinetobacter calcoaceticus


Candida lipolytica

Pseudomonas fluorescens

Candida tropicalis

Surfactantes particulados

vesículas

células


Várias bactérias

Fonte: Desai & Banat (1997).

27



Glicolipídeos: É o grupo de surfactantes microbianos mais estudado, geralmente formados

por carboidratos associados a uma longa cadeia de ácidos alifáticos ou hidroxi-alifáticos. O

carboidrato envolvido pode ser glicose, manose, galactose, ácido galacturônico ou raminose

(Holmberg, 2001; Marchant & Banat, 2012a). Estas moléculas se encontram envolvidas na

captação de hidrocarbonetos de baixo peso molecular por microrganismos. Dentre os

glicolipídeos mais importantes estão os ramnolipídeos, trealolipídeos e soforolipídeos

(Marchant & Banat, 2012a).

Lipopeptídeos e Lipoproteínas: São compostos cíclicos resultantes da condensação entre um

ácido graxo e um oligopeptídeo. Entre as muitas classes de biossurfactantes, lipopeptídeos são

particularmente interessantes por causa de suas altas atividades superficiais e potencial

antibiótico, apresentando alta eficiência como tensoativo (Ahimou et al., 2000). Entre estes

compostos estão incluídos a surfactina, gramicidinas e polimixinas que são produzidos por

bactérias do gênero Bacillus (Muthusamy et al., 2008).

Ácidos Graxos, Lipídeos Neutros e Fosfolipídeos: Várias bactérias e leveduras, que

utilizam n- alcanos como fonte de carbono, produzem surfactantes que apresentam em sua

estrutura, ácidos graxos e fosfolipídeos (Muthusamy et al., 2008). Os fosfolípideos são

formados por uma molécula de glicerol unida a dois ácidos graxos, através de ligações éster, e

a um grupamento fosfato que pode apresentar diferentes substituintes (Zajic & Seffens, 1984).

Os principais tipos de fosfolipídeos são: fosfatidiliositol, fosfatildiglicerol e ácido fosfatídico.

Surfactantes Poliméricos: De um modo geral, estes polissacarídeos apresentam algumas

proteínas ou ácidos carboxílicos em sua composição química (Fathabad, 2010). Essa classe de

biossurfactantes apresenta alta afinidade por interfaces óleo/água, facilitando a formação de

emulsões estáveis, fazendo com que mesmo em baixas concentrações sejam alcançados

elevados índices de emulsificações (Borges, 2011). Os biossurfactantes poliméricos mais

estudados são o emulsan, liposan, alasan, lipomanan e outros complexos proteína-

polissacarídeo. A cepa Acinetobacter calcoaceticus RAG -1 sintetiza emulsan, que é um

poderoso emulsificante extracelular composto por uma cadeia de ácidos graxos ligados a um

extenso esqueleto heteropolissacarídico e apresenta elevado massa molecular. Este é um dos

poucos surfactantes microbianos produzidos em maior escala (Chamanrokh et al., 2008). O

28



liposan é um emulsificante extracelular, sintetizado por Candida lipolytica sendo composto

por 83% de carboidrato e 17% de proteína (Gautam & Tyagi, 2005).

Surfactantes Particulados: São vesículas extracelulares que apresentam hidrofobicidade e

estão envolvidos na captação de alcanos para célula microbiana. Vesículas de Acinetobacter

sp. linhagem HO1-N com um diâmetro de 20 a 50 nm e densidade de 1,158 g/cm3 são

compostos de proteínas, fosfolipídeos e lipopolissacarídeos (Gautam & Tyagi, 2005). Outras

espécies são Cyanobacteria e alguns patógenos como Staphylococcus aureus e Serratia sp.

(Muthusamy et al., 2008).

A Figura 3.3 apresenta algumas estruturas químicas de biossurfactantes citados

anteriormente.

29



Figura 3.3 – Estruturas química de alguns biossurfactantes.

Fonte: Nitschke & Pastore, (2002).

30



3.2.3 Características e aplicações dos Biossurfactantes

Apesar da diversidade de composição química e propriedades, algumas características

são comuns à maioria dos biossurfactantes, e muitas dessas características possuem diversas

vantagens em relação aos surfactantes sintéticos como (Nitschke & Pastore, 2002; Mulligan,

2005):

- Atividade superficial e interfacial: os biossurfactantes são mais eficientes e mais efetivos

do que os surfactantes convencionais (detergentes aniônicos sulfatados), pois reduzem mais a

tensão superficial a menores concentrações. A CMC dos biossurfactantes varia entre 1-2000

mg/L, enquanto que a tensão interfacial (óleo/água) e superficial ficam em torno de 1 e 30

mN/m, respectivamente (Mulligan, 2004);

- Tolerância à temperatura, pH e força iônica: apresentam elevada estabilidade térmica e

de pH mesmo em valores extremos, o que permite uma aplicação mais abrangente já que

podem ser usados em condições mais drásticas. O lipopeptídeo de B. subtilis LB5 é estável a

temperaturas em torno de 100 °C por até 120 h e pH entre 5 e 12. Este composto também se

mostrou estável a concentrações de 20% de NaCl, enquanto que uma concentração salina de

2-3% é suficiente para inativar surfactantes sintéticos (Nitschke & Pastore, 2006);

- Baixa toxicidade: os biossurfactantes comprovadamente não causam danos aos seres vivos,

além disso, a sua baixa toxicidade permite o seu emprego sem restrições em alimentos,

cosméticos e produtos farmacêuticos (Singh & Cameotra, 2004);

- Biodegradabilidade: os biossurfactantes são facilmente degradáveis na água e no solo, ao

contrário dos surfactantes químicos, o que os torna adequados para aplicações como

biorremediação e tratamento de resíduos (Mulligan, 2004).

3.3 Produção de biossurfactante a partir de Bacillus subtilis

Bacillus subtilis é uma espécie de bactéria Gram-positiva, esporulante, não patogênica

e não colonizadora de tecidos, que pode ser comumente encontrada no solo e na vegetação

(Stein, 2005). É um microrganismo aeróbico facultativo, podendo crescer anaerobicamente na

31



presença de nitratos. Apresenta crescimento intenso com formação de 2,3-butanodiol,

acetoína e CO2, em meios compostos por glicose e na presença de oxigênio. Entretanto, em

condição de anaerobiose o seu crescimento é bem reduzido (Claus & Berkeley, 1984). Na

presença de sacarose pode formar polissacarídeos extracelulares, como levana e dextrana. Em

meios, contendo arabinose, xilose e manitol, ocorre a produção de ácidos orgânicos. Esta

bactéria também é capaz de degradar macromoléculas como amido, pectina e caseína. A

composição do meio de cultura também pode induzir a formação de pigmentos, bem como a

síntese de polipeptídeos com ação antimicrobiana (Claus & Berkeley, 1984).

Esse microrganismo cresce na faixa de temperatura mesofílica (25-37 °C) e apresenta

colônias com características morfológicas bastante variadas, essa diferenciação ocorre em

decorrência da composição do meio no qual o microrganismo está se desenvolvendo. As

colônias desta espécie apresentam formas redondas ou irregular, com coloração marrom e

opaca (Claus & Berkeley, 1984).

O B. subtilis é uma das 40 espécies de Bacillus mais estudadas na área de

biotecnologia. Dentro da sua vasta maquinaria metabólica pode-se destacar a sua alta

capacidade de produção de lipopeptídeos, que são moléculas anfifílicas com propriedades

biossurfactantes e antimicrobianas, o que torna o B. subtilis uma bactéria de grande

aplicabilidade na biotecnologia industrial e ambiental (Oliveira, 2006).

Entre os lipopeptídeos sintetizados por linhagens de B. subtilis, a maioria pertence à

classe dos lipopeptídeos cíclicos, geralmente formados por anéis de oito membros, sete dos

quais são aminoácidos e o oitavo membro é um ácido graxo de conformação e tamanho de

cadeia variável. Entre os lipopeptídeos cíclicos, encontram-se o grupo das surfactinas e o

grupo das iturinas, que inclui as iturinas A, C, D e E; bacilomicinas D, F e L; e

micosubtilisina (Ahimou et al., 2000). Esses compostos são bastante conhecidos por

apresentarem propriedades antimicrobianas e atividade tensoativa (Valpuesta, 2008).

A iturina A é um biossurfactante não iônico, com propriedades tensoativas e

emulsificantes (Deleu et al., 1999; Ahimou et al., 2000). No entanto, o principal bioproduto

sintetizado por este microrganismo é a surfactina, por ser considerado um dos mais efetivos

biossurfactantes conhecidos (Reis et al., 2004). As estruturas da surfactina, iturina A e

bacilomicina L estão representadas na Figura 3.4.

32



Figura 3.4 – Lipopeptídeos produzidos por Bacillus subtilis: (A) surfactina; (B) iturina A; (C)

bacilomicina L. Fonte: Oliveira (2006).

3.3.1 Surfactina

A Surfactina foi encontrada a primeira vez como um metabólito secundário em caldo

de cultura de B. subtilis no ano de 1968, onde foi observado seu potencial como um inibidor

da coagulação de fibrina (Arima et al., 1968). Posteriormente, Kakinuma et al. (1969)

apresentaram em seu estudo a primeira estrutura da família das surfactinas obtida através de

sobrenadante da cultura desse microrganismo conforme demonstrado na Figura 3.5.

33



Figura 3.5 – Primeira estrutura da família das surfactinas. Fonte: Kakinuma et al. (1969).

Esses bioprodutos são classificados como lipopeptídeos cíclicos, com peso molecular

de aproximadamente 1050 kDa. Sua estrutura consiste em um peptídeo cíclico composto por

sete aminoácidos ligados por uma ligação lactona a uma cadeia de ácido graxo β-hidróxi

(geralmente um ácido 3-hidróxi-13-metil tetradecanóico), sendo que esta cadeia pode variar

de 13 a 15 átomos de carbonos na configuração n, iso e anteiso (Arima et al., 1968; Lang,

2007). A representação das diferentes configurações da cadeia lateral de ácido graxo está

ilustrada na Figura 3.6.

Figura 3.6 – Representação da cadeia lateral ácido graxo da surfactina para n, iso e anteiso

(A1-A7 = Aminoácidos).

A surfactina natural é uma mistura de isoformas que se diferenciam ligeiramente em

suas propriedades físico-químicas devido a variações no tamanho da cadeia, diferenças da

sequência de aminoácidos que compõem o anel e à ligação do seu componente hidroxi-ácido

graxo (Shaligram & Singhal, 2010). Estas variações dependem mais da linhagem e das

condições nutricionais e ambientais em que o biosurfactante foi produzido, do que de

A2 A

4

A3

A1

C

CH2

CH

A5

A6

A7

C O

O

Cadeia lateral de

ácido graxo

Cadeia lateral de ácido graxo: CH

3-(CH

2)

n-CH

2- (n)

(CH3)

2CH-(CH

2)

n-1-CH

2- (iso)

CH3-CH

2-CH(CH

3)-(CH

2)

n-1-CH

2 (anteiso)

O

CH(CH2)

9CHCH

2CO-L-Glu-L-Leu-D-Leu-L-Val-L-Asp-D-Leu-L-Leu

\

/

CH3

CH3

O

34



determinação genética (Kowall et al., 1998; Vater et al., 2002; Hsieh et al., 2004; Barros et

al., 2007).

A crescente descoberta de propriedades interessantes com aplicações nas áreas da

medicina e biotecnologia promoveu o interesse em pesquisa por surfactina e como resultado,

uma grande variedade de isoformas e homólogos deste lipopeptídeos já foram encontrados.

Estima-se que cerca de 20 lipopeptídeos da família das surfactinas já foram relatados

na literatura (Bonmartin et al., 2003). Esses compostos são classificados em: bamilocina A,

esperina, liquenisina, pumilacidina e as surfactinas A, B e C, diferenciando entre si pelos

aminoácidos e a cadeia graxa (Soberón-Chávez, 2011).

Embora outros lipopeptídeos tenham surgido, a surfactina continua sendo o principal

representante e mais conhecido membro desta família (Peypoux et al., 1999). A principal

isoforma, surfactina A, possui em sua porção peptídica sete aminoácidos dispostos numa

sequência quiral LLDLLDL (L-ácido glutâmico, L-leucina, D-leucina, L-valina, L-ácido

aspártico, D-leucina e L-leucina) (Kakinuma et al.,1969). As surfactinas A, B e C (Figura 3.7)

são classificadas de acordo com as diferenças nas suas sequências de aminoácidos, sendo que

a surfactina A possui L-leucina na posição do aminoácido envolvida na formação do anel

lactona com um ácido graxo de C13-C15, enquanto que nas moléculas de surfactina B e

surfactina C, os aminoácidos correspondentes são L-valina e L-isoleucina, respectivamente

(Kowall et al., 1998).

Devido à presença de resíduos de L-Glu e L-Asp, a surfactina apresenta duas cargas

negativas em pH fisiológico, possuindo um pK entre 5,5-6,0, estando em pH 5,5 quase

completamente protonada (Grau et al., 1999).

A estrutura das surfactinas com um grupo carboxila quelante, cadeia lateral de ácidos

graxo com capacidade de formação de micelas e uma conformação flexível do anel lactona

podem explicar as atividades biológicas da surfactina (Vass et al., 2001). Além disso, as

substituições de aminoácidos são responsáveis pelas mudanças significativas em suas

propriedades causadas pela modificação da distribuição polar/apolar e/ou da acessibilidade de

grupos carboxílicos a cátions. Estas modificações acarretam em diferenças na capacidade

hemolítica, quelação de metais, concentração micelar crítica (CMC) e atividade superficial

(Peypoux et al., 1999; Lang, 2007).

35



Figura 3.7 – Estrutura do principal homólogo da surfactina (iso-C15). Isoformas: (A)

Surfactina A, (B) Surfactina B e (C) Surfactina C. Fonte: Barros et al. (2007).

L-Glu

L-Leu

D-Leu

L-Val

L-Asp D-Leu

L-Leu

L-Glu

L-Leu

D-Leu

L-Val

L-Asp D-Leu

L-Val

L-Glu

L-Leu

D-Leu

L-Val

L-Asp D-Leu

L-Ile

A)

B)

C)

36



As surfactinas também são conhecidas por suas excelentes características interfaciais,

em concentrações inferiores a 20 µM, esse bioproduto é capaz de reduzir a tensão superficial

da água (20 ºC) de 72 para 27 mN/m, que é consideravelmente mais baixa do que a tensão de

superficial da maioria dos biossurfactantes encontrados na literatura (Yeh et al., 2005; Wei et

al., 2003; Wei et al., 2004). Possui os menores valores de CMC dentre os biossurfactantes, os

quais se encontram em torno de 0,01 g/L (Deleu et al., 1999; Nitschke et al., 2004; Barros et

al., 2008). Quando são comparadas a outros biosurfactantes (Cooper et al., 1981; Haferburg et

al., 1986) e a alguns surfactantes sintéticos, como dodecil sulfato de sódio (SDS) (CMC de

2,5 g/L) e brometo de dodecil trimetil amônio (DTAB) (CMC de 4,6 g/L ) (Kim et al., 1997),

apresentam maior eficiência. Devido ao fato de possuirem menor valor de CMC, o uso de

uma concentração reduzida (g/L) de surfactina é suficiente para atingir os mesmos efeitos de

redução da tensão superficial e interfacial que seus congêneres químicos (Cooper et al., 1981;

Haferburg et al., 1986; Kim et al., 1997).

A surfactina é bastante estável quando submetida a diversas condições. Os

biossurfactantes produzidos por Bacillus sp são estáveis em concentrações de NaCl de 2 a 3%,

enquanto que essas concentrações são suficientes para afetar as moléculas de surfactantes

convencionais que perdem sua capacidade de redução da tensão superficial (Lin et al., 1990).

Por exemplo, biossurfactantes produzidos pela cepa de Bacillus subtilis C9, apresentam

amplo limite de estabilidade e manutenção de propriedades emulsificantes em diferentes

condições de temperatura (20-100 °C por 1 h), pH (5,0 a 9,5) e concentrações salinas de 15%

(m/v) de NaCl e 10 mM de CaCl2 (Kim et al., 1997).

Outra característica importante é que a acidificação de uma solução contendo

surfactina para pH igual a 2 eleva a tensão superficial para 62 mN/m, que volta para 27 mN/m

com a neutralização, mostrando a dependência das propriedades surfactantes da surfactina

frente ao pH (Cooper et al., 1981). Isto se deve ao fato de que em meio ácido a surfactina

precipita devido a perda de solubilidade causada por protonação. Quando o pH do meio

retorna ao valor original, o surfactante sofre desprotonação tornando-se novamente solúvel

(Cooper et al., 1981; Costa, 2005). Essa característica constitui em uma vantagem adicional,

pois mesmo submetida a condições mais extremas de pH, há manutenção da estrutura química

original.

37



3.3.1.1 Parâmetros que influenciam a produção de surfactina

Os fatores que influenciam a síntese de surfactina por microrganismos do gênero

Bacillus dependem da natureza do substrato, da concentração de íons (nitrogênio, fósforo,

magnésio, ferro e manganês) presentes na composição do meio de cultura (Karanth et al.,

1999) e das condições ambientais (Desai & Banat, 1997).

A adição de nutrientes aos meios de cultivo para produção de surfactina é de grande

relevância para a obtenção de significativas concentrações do produto final. Sais de ferro são

frequentemente mencionados na literatura quanto ao efeito significativo no rendimento de

surfactina e de biomassa para B. subtilis (Wei et al., 2007). Altas concentrações de íon

ferroso, como FeSO4, promovem redução de biomassa, porém o rendimento do

biossurfactante é relevante mesmo nessas condições (Makkar & Cameotra, 2002), sendo

0,719 mmol/L a concentração ótima de FeSO4 para a produção de surfactante por B. subtilis

MTCC 2423. Relatos experimentais revelaram um aumento de dez vezes na produção de

surfactina por B. subtilis quando a concentração de ferro no meio foi aumentada para 4

µmol/L, aumento maior que os atribuídos a cepas geneticamente modificadas (Wei et al.,

2004).

A fonte de carbono empregada, particularmente o tipo de carboidrato, exerce grande

efeito sobre o tipo de lipopeptídeo produzido por B. subtilis, visto que propicia alterações na

composição química da molécula, conduzindo à variação nas suas propriedades físico-

químicas. Por isso, a escolha da matéria-prima deve levar em conta o custo, disponibilidade e

necessidades nutricionais do microrganismo, sobretudo, o tipo de aplicação que se pretende

do biossurfactante a ser produzido (Makkar & Cameotra, 1997; Makkar & Cameotra, 1998).

As condições de crescimento como pH, temperatura, disponibilidade de oxigênio e

agitação também afetam a produção de biossurfactantes, dado o seu efeito sobre o

crescimento e atividades celulares (Chen et al., 2015).

B. subtilis produz tipicamente surfactina em faixa de temperatura de 25 a 37 °C (Sen

& Swaminathan, 1997; Sen & Swaminathan, 2005; Yeh et al., 2005; Abdel-Mawgoud et al.,

2008a). Investigações demonstraram que a temperatura afeta a composição do biotensoativo

gerado. Sen & Swaminathan (2005) descobriram em seu estudo que a temperatura ótima para

a produção de surfactina pela cepa de B. subtilis DSM 3256 era de 37,4 °C. Enquanto que

Banat (1993) e Haddad et al. (2009) mostraram que vários termofílicos Bacillus spp.

38



produziam surfactina em temperaturas superiores a 40 °C, sem qualquer efeito sobre a sua

função de superfície.

O oxigênio dissolvido e eficiência de transferência de massa também podem afetar

criticamente a produção de surfactina por B. subtilis (Yeh et al., 2005; Guez et al., 2008).

Sheppard & Cooper (1990) identificaram a transferência de oxigênio como um dos

parâmetros críticos para a otimização de processos e aumento de escala de produção de

surfactina. Em seu trabalho, Ghribi & Ellouze-Chaabouni (2011) reportaram que quando o

meio foi saturado com 30% de oxigênio dissolvido, a produção de surfactina atingiu 4,92 g/L.

Yeh et al. (2005) e Fonseca et al. (2007) mostraram que o aumento da concentração de

oxigênio dissolvido por agitação rápida influencia positivamente a produção de surfactina por

B. subtilis. A velocidade de agitação também afetou a produção surfactina, sendo obtidos

melhores rendimentos com velocidades de agitação de 200 rpm e 250 rpm (Yeh et al., 2005).

No entanto, a uma velocidade muito alta de agitação (superior a 350 rpm) a produção de

surfactina foi reduzida pelo acúmulo de espuma (Yeh et al., 2005).

O acúmulo de espuma é outro fator importante que afeta a produção surfactina e seu

efeito está relacionado com a aeração (Shaligram & Singhal, 2010). De acordo com Davis et

al. (1999), o acúmulo de espuma reduz a produção de biomassa e surfactina, encurtando o

período de fermentação.

O pH é outro fator importante na produção de surfactina (Yeh et al., 2005; Shaligram

& Singhal, 2010). Wei & Chu (1998) mostraram que a manutenção de um valor de pH

constante facilitou a produção de grandes quantidades de surfactina. Os efeitos de uma série

de valores de pH (entre 6,0 e 9,0) sobre a produção de surfactina por cepas de B. subtilis BS5

foram avaliadas por Sen & Swaminathan (1997). Os resultados experimentais mostraram que

o valor de pH de 6,75 produziu maior quantidade surfactina. Ainda neste mesmo estudo,

também se avaliou o efeito das condições de cultivo, o qual apresentou melhor produção de

surfactina (1,0 g/L) para temperatura de 37,4 °C, pH de 6,75 e velocidade de agitação de 140

rpm.

3.3.1.2 Aplicações da surfactina

Muitos biossurfactantes apresentam ainda alta atividade antibacteriana, antifúngica e

antiviral. Outros apresentam papel relevante na aplicação à saúde, como agentes antiadesivos

utilizados no tratamento de diversas doenças, além de serem utilizados como agentes

39



terapêuticos e probióticos (Singh & Cameotra, 2004). No caso da surfactina, sua maior

aplicação encontra-se na área médico-farmacêutica. A seguir serão apresentadas diversas

funções biológicas deste biossurfactante, nas quais podem o caracterizar como uma molécula

biologicamente ativa:

a) Atividade anti-inflamatória

A surfactina apresenta características estruturais anfifílicas que são capazes de

interagir com membranas celulares e macromoléculas (Enzimas e lipopolissacarídeos - LPSs)

(Chang et al., 2011). A ação da surfactina inibe o efeito inflamatório, ocasionando uma

interação direta do LPS com células (Seydlova et al., 2008). A Surfactina é responsável pela

inibição da expressão induzida por LPS de mediadores inflamatórios (interleucina β-1 e óxido

nítrico sintase induzível - iNOS) (Seydlova et al., 2008). A Surfactina C é a que apresenta a

melhor atividade anti-inflamatória em comparação com a surfactina A, B ou D. Inibe o óxido

nítrico e suprime a expressão de mRNA de citocinas pró-inflamatórias, que é estimulada por

LPS (Shaligram & Singhal, 2010).

b) Atividade antimicoplasmática, antibacteriana e antiviral

Mycoplasma é responsável pela inflamação respiratória e doenças do trato urogenital.

Os antibióticos não são eficientes no tratamento do Mycoplasma porque eles não penetraram

no citoplasma da membrana. O tratamento poderia ser feito e tratado com a desintegração da

membrana através da surfactina (Vollenbroich et al., 1997). A importante função da surfactina

é devido sua capacidade em formar canais condutores de íons nas membranas bilipídicas

bacterianas, uma ação bastante semelhante aos detergentes (Sheppard et al., 1991). Esta ação

da surfactina, assim como os detergentes, ocasiona a inibição da adenosina cíclica 3, 5-

monofosfato fosfodiesterase. Esta enzima facilita a ação quelante do grupos carboxilo de

ácido glutâmico e resíduos de ácido aspártico de surfactina (Chen & Juang, 2008). A

surfactina apresenta também uma ação anticarcinogênica, onde foi constatada sua atividade

antitumoral contra o carcinoma de Erlinch, devido a sua capacidade de romper a membrana

plasmática atingindo o interior da célula. Assim como atividade antiproliferativa em células

de câncer de ovários, renal, de próstata, de cólon, de mama, de pulmão e melanomas (Perna,

2010; Acioly, 2009).

40



Além disso, atua como um poderoso antiviral contra a ação de vários vírus, como por

exemplo o vírus Herpes simplex (Perna, 2010; Acioly, 2009; Shaligram & Singhal, 2010).

Este lipopeptídeo apresenta uma grande ação antibacteriana em diversas bactérias Gram-

negativas, entretanto, possui baixa atividade em Gram-positivas (Acioly, 2009).

c) Aplicações anti-adesivas

Os biosurfactantes apresentam capacidade anti-adesivas inibindo a formação de

biofilme, impedem o crescimento e o desenvolvimento de bactérias em locais infectados

(Mireles et al., 2001). A surfactina apresenta a capacidade em inibir a formação de biofilmes

por Salmonella typhimurium, Salmonella enterica, Escherichia coli e Proteus mirabilis

(Seydlová et al., 2008).

d) Aplicações ambientais

Do ponto de vista ambiental, a surfactina é utilizada em processos de bioremediação e

recuperação melhorada de petróleo (Mulligan et al., 2005; Acioly, 2009). Estudos reportam

sua aplicação na biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos e alifáticos (Lai et al., 2009;

Perna, 2010 ), bem como sua potencial ação na degradação de pesticida, sua capacidade na

remoção de óleo em areias contaminadas e na biorremediação de solos contaminados com

metais pesados (Perna, 2010). A surfactina produzida pelo Bacillus sp é capaz de auxiliar na

remoção de óleo pesado. A biodegradação do diesel é mais eficiente utilizando a surfactina

quando comparada aos surfactantes sintéticos (Lai et al., 2009).

e) Aplicações para biocontrole

A surfactina apresenta atividade bactericida, sendo responsável pela desestabilização

da membrana fosfolipídica do fitopatógeno alvo, ocasionado a lise celular. O rompimento

celular é uma resposta de grande importância para saber a eficiência contra um espectro

amplo de fitopatógenos. A associação de algumas linhagens de Bacillus com a surfactina

ocasiona uma resistência sistêmica, melhorando desta maneira a proteção contra fitopatógenos

(Cawoy et al., 2014).

41



Sob o ponto de vista industrial, é na indústria petrolífera que se encontra um dos

maiores mercados para a surfactina. Este pode ser utilizado na produção de petróleo ou

incorporado em formulações de óleos lubrificantes, ser utilizado para a remoção ou

mobilização de resíduos de óleos pesado em tanques de estocagem e aplicado na recuperação

melhorada de petróleo (Perna, 2010).

A Tabela 3.3 representa algumas aplicações da surfactina em vários segmentos

industriais e a grande importância do uso desta substância.

Tabela 3.3 – Aplicações e potencialidades de uso de surfactina em segmentos industriais.

Aplicação Referência

Inibição da formação de coágulos de

fibrina

Kikuchi & Hasumi (2002)

Atividade antitumoral Kameda et al. (1974); Kim et al. (2007)

Atividade antiviral Vollenbroich et al. (1997)

Inbição de biofilmes Mireles et al. (2001)

Atividade fungicida contra Magnaporthe

grisea

Tendulkar et al. (2007)

Atividade inseticida Assié et al. (2002)

Degradação de hidrocarbonetos Whang et al. (2008); Whang et al. (2009)

Emulsificação e hidrantante Kanlayavattanakul & Lourith (2009)

3.4 Utilização de resíduos agroindustriais na produção de surfactina

Diversos resíduos agroindustriais têm sido descritos para produção de biossurfactante,

especialmente os resíduos miscíveis em água, como soro de queijo (Dubey & Juwarkar, 2001;

Nitschke & Pastore, 2006), resíduos de batata (Thompson et al., 2001; Noah et al., 2002;

Noah et al., 2005), manipueira (Nitschke & Pastore, 2006; Barros et al., 2008; Costa et al.,

2009; Bezerra, 2012) e melaço de cana (Cordeiro, 2006; Bezerra, 2006; Al-Bahry et al., 2013)

que são fontes de carbono renováveis e de baixo custo.

Barros et al. (2007) descreveram a importância da variedade de resíduos industriais

como matéria-prima para diversos bioprocessos. Segundo os autores, a utilização de resíduos

agroindustriais para produção de biossurfactantes é um dos passos para viabilização e

implantação desses processos em escala industrial, sendo necessário um balanço de nutrientes

para desenvolver condições adequadas para sua produção.

42



A produção mundial de queijo gera cerca de 100 milhões de toneladas de soro de leite

por ano (Panesar et al., 2007), este subproduto possui um potencial poluidor imenso quando

descartado em efluentes sem o devido tratamento, causando sérios problemas ambientais,

afetando as estruturas físicas e químicas do solo, além de ser um risco à vida marinha por

promover o decaimento do oxigênio dissolvido na água (Panesar et al., 2007; Kassa et al.;

2008; Rholfes et al., 2011).

O soro de leite é constituído por elevados níveis de lactose (75% da matéria seca), 12-

14% de proteínas, ácidos orgânicos e vitaminas (Dubey & Juwarkar, 2001; Panesar et al.,

2007). Este bioproduto da indústria de laticínios retém aproximadamente 55% dos nutrientes

do leite e representa em torno de 85 a 90% do volume total de leite processado, mostrando ser

um potencial substrato para processos fermentativos (Davila-Vazquez et al., 2008). Apesar da

sua potencial aplicação para produção de surfactantes, atualmente existem poucos estudos

deste efluente na produção de surfactina. Dentre eles, podemos destacar o estudo apresentado

por Joshi et al., (2008) em que foi produzida surfactina por B. subtilis R1 a partir de soro de

leite, resultados mostraram que sua tensão superficial variou na faixa de 34 a 37 mN/m.

Nitschke et al. (2004) também utilizaram soro de leite como substrato e obtiveram maior

valor de tensão surperficial (43,27 mN/m), comprovando que o soro de leite não é um bom

substrato para a produção de surfactina pelos isolados estudados.

Os efluentes do processamento de batatas também se caracterizam como possíveis

substratos para produção de surfactina, pois possuem em sua composição 80% de água, 17%

de carboidratos, 2% de proteínas, 0,1% de gordura e 0,9% de vitaminas, minerais inorgânicos

e traços de micronutrientes. Fox & Bala (2000) investigaram a produção de surfactina por

linhagem de B. subtilis ATCC21332 com o uso de meio contendo efluentes sólidos do

processamento de batata e obtiveram uma redução da tensão superficial da água de 71,3 para

28,3 mN/m. Noah et al., (2005) estudando o mesmo substrato encontraram produtividade

máxima de 0,9 g/L de surfactina. Enquanto Thompson et al., (2001), realizaram pré-

tratamentos de efluentes do processamento de batata com baixo teor de sólidos, a fim de testar

o seu potencial para aumentar o rendimento de surfactina produzida por B. subtilis. Como

resultado, o rendimento de surfactina a partir do efluente pré-tratado (0,40 g/ L) foi superior

ao produzido a partir do controle de amido de batata purificada (0,24 g / L).

A manipueira é o efluente resultante da industrialização da mandioca, decorrente da

prensagem da mandioca ralada e lavada no processo da obtenção da farinha (Costa et al.,

2009). Esse resíduo possui um elevado teor de matéria orgânica e um glicosídeo chamado

43



linamarina que é facilmente hidrolisado a cianeto, composto tóxico ao metabolismo, sendo na

maioria das vezes descartada in natura nos cursos d’água acarretando em problema ambiental

(Costa et al., 2009; Cordeiro, 2006). Alguns estudos utilizando manipueira com substrato têm

sido realizados: Nitschke & Pastore (2004) utilizaram a manipueira como fonte de carbono

para produção de surfactina por duas linhagens de B. subtilis LB5a e ATCC 21332, a qual

observaram uma redução da tensão superficial de 49,5 para 26,6 e 25,9 mN/m,

respectivamente. E ainda, a concentração bruta obtida do surfactante foi de 3,0 g/L e 2,2 g/L,

respectivamente. Barros et al., (2008) em seu trabalho sobre a produção de biossurfactante

por B. subtilis LB5a obtiveram um rendimento de 2,4 g/L de surfactina e a tensão superficial

do meio foi reduzido de 51 para 27 mN/m. Concluindo que em função da sua composição e

da produtividade, a manipueira foi identificada como sendo um bom substrato para a

produção do biossurfactante.

Okara é um resíduo do processo de fabricação do leite de soja, apresenta uma

composição em massa seca de aproximadamente 25% de proteínas, 13% de carboidratos e 5%

de lipídeos, sendo que a maior parte das proteínas presentes neste resíduo é insolúvel. Apesar

da presença de componentes nutritivos e funcionais e seu potencial para a aplicação em

produtos alimentícios, mais de 90% do okara é destinado a alimentação animal (O’Toole,

1999). Ohno et al. (1995a) relataram a produção de surfactina por uma cepa de B. subtilis

MI113 recombinante utilizando Okara, onde se obteve 2,0 g/kg. Em outro estudo, os mesmos

autores avaliaram a influência da temperatura na produção de surfactina em fermentação

semi-sólida (FES) utilizando a cepa de B. subtilis RB14, onde foi obtida a produção máxima

de surfactina (2,5 g/kg) a 37 °C (Ohno et al.,1995b).

O processo produtivo da surfactina ainda não está bem elucidado para aplicação direta

em escala industrial, sendo os fatores econômicos as principais barreiras (Barros et al. 2007).

Deste modo a utilização de substratos não convencionais é, sem dúvida, uma alternativa

importante para produção de biossurfactante, na busca de uma produção em larga escala.

Com o grande crescimento da indústria sucroalcooleira nas últimas décadas,

intensificaram-se as pesquisas para a utilização dos resíduos dessa indústria como substrato

em bioprocessos. Do processamento da cana-de-açúcar obtêm-se como produtos principais o

açúcar e o álcool, e os principais subprodutos: o melaço, o bagaço e a vinhaça

(Woiciechowski et al., 2013).

44



3.5 Melaço de cana

O melaço de cana é considerado um subproduto da etapa de centrifugação no processo

de fabricação de açúcar, trata-se de um líquido viscoso, de cor escura, não cristalizável

(Figura 3.8).

Figura 3.8 – Melaço de cana. Fonte: Usina Mendonça (2016).

A composição do melaço de cana-de-açúcar é muito variável, pois depende de fatores

agrícolas e industriais. Os principais componentes do melaço são a água, carboidratos,

compostos de origem orgânica como os aminoácidos, ácidos carboxílicos, proteínas,

vitaminas, fenóis e outros (Woiciechowski et al., 2013). De acordo com Olbrich (1963), o

melaço possui composição média de 20% de água, 62% de açúcar, 10% de material

nitrogenado e 8% de constituintes inorgânicos (Tabela 3.4).

Por seu baixo custo, alta disponibilidade e elevado teor de açúcares fermentáveis, esta

matéria-prima vem sendo empregada como substrato para diferentes tipos de fermentação.

Makkar & Cameotra (1997) utilizaram melaço como fonte de carbono, na produção de

surfactina por duas linhagens termofílicas de B. subtilis e obtiveram uma redução da tensão

superficial de 29 e 31 mN/m. Resultados semelhantes foram observados por Joshi et al.,

(2008), o qual obtiveram tensão superficial variando de 29,17 a 30,67 mN/m para cepas de B.

subtilis R1 utilizando substratos com concentrações de melaço que variaram de 1 a 9% (m/v).

Em outro estudo, Abdel-Mawgoud et al. (2008a) otimizaram a produção de surfactina por

cepa de B. subtilis BS5 utilizando um meio mineral suplementado com melaço e NaNO3, em

que determinaram uma produtividade de surfactina de 1,12 g/L. Em uma pesquisa mais

recente, Al-Bahry et al. (2013) também investigaram a produção de biossurfactantes usando

45



melaço de cana como substrato de B. subtilis B20, conseguindo reduzir a tensão da água de 60

mN/m para 25 mN/m, obtendo também resultados satisfatórios.

Tabela 3.4 – Composição média do melaço de cana.

Constituintes (%)

Água 20,0

Constituintes orgânicos

Açúcares: Sacarose

Glicose

Frutose

32,0

14,0

16,0

Materiais nitrogenados, ácidos livres e ligados,

substâncias solúveis

10,0

Constituintes inorgânicos

SiO2 0,5

K2O 3,5

CaO 1,5

MgO 0,1

P2O5 0,2

Fe2O3 0,2

Resíduos de sulfato 1,6

Cloretos 0,4

Fonte: Olbrich (1963).

Capítulo 4

Metodologia Experimental

47

4. Metodologia Experimental



Neste capítulo é apresentado o microrganismo utilizado, seu modo de manutenção e

preservação, preparo do inóculo e procedimento de cultivo, bem como a fonte de carbono

(melaço) empregada no cultivo. Além disso, serão abordados detalhes do processo

fermentativo, métodos analíticos empregados durante os experimentos e cálculo dos

parâmetros cinéticos.

A Figura 4.1 apresenta o fluxograma geral para a metodologia aplicada.

Figura 4.1 – Fluxograma para metodologia experimental.

Extração

Substrato (S)

CMC

Índice de emulsificação (E

24)

Atividade emulsificante

pH

Biomassa (X)

Quantificação da surfactina e iturina

Microrganismo (meio de manutenção)

Preparo do Inóculo

Cultivo

Análises

48



4.1 Microrganismo

Para os ensaios utilizou-se a cepa de Bacillus subtilis UFPEDA 438, cedida pelo

Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de Pernambuco.

A cultura foi mantida em tubos de ensaio de 10 mL, contendo meio sólido inclinado

PCA (Plate Count Agar) e 1% de Ágar-Ágar (Figura 4.2). A renovação das células foi feita

por repique das mesmas no meio e incubação a 30 ºC por 24 h. Após o tempo de incubação a

cepa foi armazenada a 4 °C e seu repique foi realizado a cada 60 dias.

Figura 4.2 – Colônias da bactéria Bacillus subtilis UFPEDA 438 em tubo inclinado.

Fonte: O autor.

4.2 Obtenção do melaço de cana

O melaço de cana foi gentilmente cedido pelo Engenho Vale Verde, localizado no

município de Ceará-Mirim/RN. Esse substrato foi coletado em uma única vez em Outubro de

2015 sendo armazenado em 5 bombonas plásticas estéreis de 2 L, imediatamente após sua

coleta o mesmo foi levado para o Laboratório de Engenharia Bioquímica (LEB) da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), sendo armazenado a -18 ºC.

4.3 Preparo do inóculo

Para preparo do inóculo, utilizou-se Erlenmeyer de 500 mL contendo 250 mL de meio

de cultivo.

Para preparo do meio de cultivo, em uma solução tampão de fosfato a 100,0 mM e pH

7,0, adicionou-se 1,0 g/L de (NH4)2SO4, 0,25 g/L de MgSO4.7H2O, 4% de melaço de cana

(m/v) e 1,0 mL/L de uma solução de estoque de sais (0,01 g/100mL de EDTA, 0,30 g/100mL

49



de MnSO4.H2O, 0,01 g/100mL de FeSO4.7H2O, 0,01 g/100mL de CaCl2, 0,01 g/100mL de

CoCl2.6H2O e 0,01 g/100mL de ZnSO4.7H2O). Esses meios foram previamente corrigidos

para pH 7,0 com solução de NaOH de sódio 2 M a temperatura ambiente, procedendo-se a

esterilização em autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Em seguida, quatro alçadas oriundas

da cultura do meio de manutenção foram transferidas assepticamente para os frascos contendo

o meio de cultura, sendo este colocado em incubador rotativo T-421 (Tecnal, Brasil) por 19 h,

sob agitação orbital de 150 rpm, à temperatura de 30 ºC (Valpuesta, 2008).

4.4 Procedimento para cultivo

Os meios de cultivo foram distribuídos em frascos Erlenmeyers com capacidade de

250 mL, contendo volume variável de meio de cultura (100 mL, 125 mL, 150 mL) de mesma

composição, conforme previamente descrito no item 4.3. O pH do meio de cultivo a ser

fermentado foi ajustado para 7,0 com solução de NaOH 2,0 M e sua esterilização foi realizada

a 121 ºC por 15 minutos. Na câmara de fluxo laminar, estes frascos foram inoculados com

10% (v/v) do inóculo, obtido no item 4.3. Após a inoculação, os frascos foram levados ao

incubador rotativo em diferentes condições.

A Tabela 4.1 mostra os ensaios realizados, onde foi avaliada a influência dos seguintes

fatores: velocidade de agitação, temperatura e razão de aeração. Sendo a razão de aeração

definida como a razão entre o volume de meio de cultivo e o volume de frasco (Vm/Vf).

Tabela 4.1 – Ensaios realizados em diferentes condições, utilizando B. subtilis

UFPEDA 438 em meio contendo melaço de cana.

Ensaios

Temperatura (ºC)

Agitação

(rpm)

Razão de Aeração

(Vm/Vf)

A 30 100 0,4

B 30 100 0,6

C 36 200 0,4

D 36 200 0,6

E 33 150 0,5

50



Vale ressaltar que o ensaio E foi realizado em duplicata para avaliação da

reprodutibilidade dos cultivos.

Em intervalos regulares, a cada 2 horas nas primeiras 12 horas de cultivo, passando a

ser coletada a cada 24 horas até 72 horas de cultivo, amostras foram retiradas e centrifugadas

para acompanhamento de pH, concentração celular, concentração de substrato e quantificação

da surfactina.

4.5 Extração de surfactina

Para determinação da concentração da surfactina é necessária a extração do

biossurfactante. Para tanto, o caldo fermentado contendo células foi transferido para tubos de

centrífuga de 50 mL (Falcon) e colocados em centrífuga 5804 R (Eppendorf, Alemanha)

2.500 rpm, a 4 ºC por 15 minutos para recolhimento do sobrenadante livre de células. Em

seguida, foi recolhida uma alíquota de 40,0 mL do sobrenadante, sendo este ajustado para pH

2,0 com uma solução de HCl 3,0 M. O meio acidificado foi deixado em repouso overnight a 4

ºC para formação do precipitado. Após esse período foi realizada a centrifugação a 2.500 rpm

a 4 ºC por 15 minutos, para recuperação do biossurfactante. O sobrenadante foi descartado e o

precipitado foi ressuspendido em 5,0 mL de água destilada, tendo o seu pH ajustado para 7,0

com NaOH 1,0 M (Arima et al., 1968; Cooper et al., 1981; Kowall et al., 1998).

Posteriormente, adicionou-se mesmo volume (aproximadamente 5,0 mL) de

clorofórmio-metanol (2:1, v/v) no tubo contendo o precipitado, a fim de se realizar uma

extração líquido-líquido (Kim et al., 1997; Queiroga et al., 2003). A solução foi agitada em

vórtex por 1 min, sendo em seguida submetida à centrifugação a 2.500 rpm a 4 ºC por 5

minutos para separação das fases. Após a separação das fases, a fase orgânica foi recolhida

com auxílio de seringa de 10,0 mL e transferida para tubo Falcon de 50,0 mL. Para garantir a

extração eficiente do biossurfactante, o processo de extração foi realizado três vezes. Por fim,

o solvente contendo surfactina foi levado a rotaevapoador Buchi V-850 (Buchi Switzerland,

Suiça) para ser concentrado a uma temperatura de 40 ºC e o bioproduto foi posteriormente

ressuspendido com 5,0 mL de acetonitrila-metanol (1:1, v/v) para quantificação da surfactina

e iturina usando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (item 4.6.4). A Figura 4.3 ilustra o

procedimento realizado para extração de surfactina.

51



Figura 4.3 – Procedimento de extração da surfactina. Fonte: O autor.

Separação das fases

Recolhimento da

fase orgânica

Fase orgânica

transferida

Fase orgânica ao

final da extração da extração

Solvente evaporado

em rotaevaporador

Bioproduto

concentrado

52



4.6 Métodos analíticos

4.6.1 Determinação da concentração celular

O método utilizado para quantificar a concentração celular foi o de massa seca (ou

peso seco). Este método consiste em separar as células do meio, secá-las e pesá-las (Bezerra

2006; Lobato, 2003). Alíquotas das amostras retiradas do incubador rotativo foram

transferidas para microtubos de 2,0 mL e colocadas em centrífuga 5415 D (Eppendorf,

Alemanha) a 13.000 rpm por 15 minutos. Os microtubos vazios foram previamente colocados

em estufa a 70 °C por 24 horas até obter peso constante.

Depois da centrifugação, o sobrenadante foi recolhido para outras análises. Nos tubos

com a massa úmida foram adicionados 2,0 mL de água destilada para a lavagem e retirada de

outros componentes solúveis ainda presentes. Após a segunda lavagem, as amostras foram

colocadas na estufa a 70 °C por 24 horas. Transcorrido este tempo, os microtubos foram

colocados em dessecadores por 5 minutos e pesados. Cada ponto foi realizado em triplicata e

o valor médio obtido considerado para os cálculos. A quantidade de biomassa (g/L), mseca, foi

expressa de acordo com a Equação 1:

(1)

Onde, T1 = massa do microtubo com biomassa e T2 = massa do microtubo vazio.

4.6.2 Determinação da concentração de substrato

Para determinação da concentração de substrato foi utilizado o método do ácido 3,5-

dinitrosalicílico (DNS) baseado no método descrito por Miller (1959). Este método baseia-se

na redução do ácido 3,5-dinitrosalicílico a ácido 3-amino-5- nitrossalicílico, ao mesmo tempo

em que o grupo aldeído do açúcar é oxidado a grupo carboxílico com o desenvolvimento de

coloração avermelhada, medida espectofotometricamente em 540 nm (Zanin et al.,1998).

Em um balão volumétrico de 50,0 mL adicionou-se 1,0 mL da amostra (caldo livre de

células), 0,5 mL de HCl e 6,0 mL de água. A solução foi então aquecida a 70 ºC em banho-

maria por 10 minutos, resfriada com água corrente e neutralizada com solução de NaOH 1,0

53



M, utilizando-se duas gotas de fenolftaleína como indicador. Em seguida, o balão foi

completado com água destilada.

Após a hidrólise, alíquotas de 0,5 mL da amostra hidrolisada foram transferidas para

tubos de ensaio contendo 0,5 mL do reagente DNS. Os tubos de ensaio foram submetidos a

banho-maria em água fervente (100 ºC) por cinco minutos. Depois de resfriados, 4,0 mL de

água destilada foram adicionadas às amostras, seguida de agitação em vórtex. As amostras

tiveram suas absorbâncias medidas utilizando espectofotômetro Genesys 10 UV (Thermo

Scientific, EUA) no comprimento de onda 540 nm contra o branco, onde as análises foram

realizadas em triplicata.

Foi utilizado como branco uma amostra com 0,5 mL de água destilada no lugar de 0,5

mL da amostra hidrolisada. O valor obtido foi multiplicado pelo fator de diluição, neste caso

50. Uma curva de calibração foi construída, correlacionando a concentração de glicose com a

leitura da absorbância.

4.6.3 Determinação do pH

O acompanhamento do potencial Hidrogeniônico (pH) foi verificado ao longo de todo

o cultivo utilizando-se o potenciômetro mPA 210 (Tecnopon, Brasil).

4.6.4 Determinação da concentração de lipopeptídeos

A detecção de lipopeptídeos produzida durante o processo fermentativo foi feita por

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) empregando o Cromatógrafo Accela (Thermo

Scientific, EUA) equipado com coluna Shim-pack CLC-ODS (M)® (Shimadzu Co., Japão) de

fase reversa C18 (250 x 4,5 mm, 100 Å, com partículas de 5 μm). Foi utilizada fase móvel

formulada com 20% de ácido trifluoracético (3,8 mM) e 80% de acetonitrila na vazão de 1,0

mL/min a 30 ºC. A amostra contendo lipopeptídeo foi detectada utilizando-se um detector de

absorção no UV a 205 nm (Wei & Chu, 1998). O volume de injeção foi de 20,0 µL de

amostra e o tempo de análise de 30 minutos, conforme procedimento descrito por Wei & Chu

(1998).

As amostras foram quantificadas através de uma curva de calibração (APÊNDICE I)

com surfactina padrão 95% (Sigma-Aldrich), em faixa de concentração de 0,1 a 1,0 mg/mL

(Wei et al. 2004; Yeh et al., 2005). Também foi realizada a determinação curva de calibração

54



(APÊNDICE II) da iturina sob as mesmas condições descritas anteriormente, utilizando-se

como padrão uma solução de iturina padrão 95% (Sigma-Aldrich), em faixa de concentração

variando de 0,01 a 0,10 mg/mL.

4.7 Determinação da Concentração Micelar Crítica (CMC)

A determinação da Concentração Micelar Crítica (CMC) foi realizada através do

método baseado em tensão superficial, mais precisamente denominado, método de Du Noüy

ou método do anel. Para isso, foram feitas diluições do sobrenadante obtido após a

centrifugação do extrato bruto e medições da tensão surperficial de acordo com metodologia

descrita pela ASTM International (1999). Foi analisada a amostra de caldo em que foi

detectado maior rendimento de surfactina após análise de quantificação realizada por

cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A tensão superficial foi medida em

tensiômetro K100 (KRUSS, Alemanha), pertencente ao Núcleo de Pesquisa e Ensino em

Petróleo e Gás (NUPEG), do Departamento de Engenharia Química da UFRN (Figura 4.4).

Figura 4.4 – Tensiômetro K100 utilizado para determinação da CMC. Fonte: O autor.

55



Para realização dessas análises, as amostras do caldo bruto foram diluídas em água

destilada para diferentes concentrações e a leitura efetuada da diluição menos concentrada

para a mais concentrada. Dessa forma, foi possível construir um gráfico a partir dos valores da

concentração (mg/L) em função da tensão superficial (mN/m), no qual obteve-se duas retas

onde o ponto da intersecção das mesmas correspondeu a CMC do biossurfactante produzido

por B. subtilis. Para cada análise, o anel utilizado foi lavado com água destilada e esterilizado

em bico de Bunsen. As medidas de tensão superficial foram feitas à temperatura ambiente (25

°C) e para cada ponto as análises foram conduzidas em triplicata.

4.8 Determinação do Índice de Emulsificação (E24)

A capacidade do biossurfactante para emulsificar hidrocarbonetos, foi avaliada pelo

índice de emulsificação do sobrenadante do caldo fermentado. Este índice foi determinado de

acordo com o método de Cooper & Goldenberg (1987) com pequenas modificações. Neste

caso, 2,0 mL do caldo livre de células foi adicionado em um tubo contendo 2,0 mL de

querosene comercial. A mistura foi agitada em vórtex por 2 minutos em alta rotação e

permaneceu em repouso por 24 horas. O índice de emulsificação foi obtido pela Equação 2

descrita por Wei et al. (2005). As análises foram realizadas em duplicata.

(2)

Onde, E24 = índice de emulsificação após 24h (%) e Hemulsão = altura da emulsão, Ht =

altura total da solução.

4.9 Atividade Emulsificante

A atividade emulsificante foi determinada segundo metodologia descrita por

Cirigliano & Carman (1984). Para isso, foi colocado em tubo de ensaio 0,5 mL de meio

cultura fermentado livre de células, 0,5 mL de solução de tampão acetato de sódio 0,1 M (pH

3,6) e 0,25 mL de querosene. Em seguida, procedeu-se a agitação em vórtex durante 2

minutos, em alta rotação. A emulsão resultante foi deixada em repouso por 10 minutos e, em

seguida, a absorbância dessa emulsão foi medida em espectrofotômetro a 540 nm. Para

56



determinação da estabilidade da emulsão, a absorbância foi medida a cada 10 minutos, até

completar 60 minutos. No preparo do branco se utilizou 0,5 mL de água destilada no lugar de

0,5 mL do meio de cultura. As análises foram realizadas em duplicata. Define-se uma unidade

de atividade emulsificante como a quantidade de biossurfactante necessária para aumentar a

absorbância da fase aquosa em 1,0 a 540 nm (Cirigliano & Carman, 1984).

4.10 Obtenção dos Parâmetros Cinéticos

Para uma melhor interpretação do processo de produção de surfactina pela cepa

estudada, alguns parâmetros importantes em bioprocessos foram calculados.

4.10.1 Velocidades instantâneas

As velocidades instantâneas de transformação “r” são descritas pelas Equações 3, 4 e

5, as quais definem as velocidades de crescimento do microrganismo (rx), de consumo de

substrato (rs) e formação de produto (rp), respectivamente.

(3)

(4)

(5)

4.10.2 Determinação da Produtividade

4.10.2.1 Produtividade em biomassa (PX)

A produtividade em biomassa (PX) é uma definição especial de velocidade e

representa um parâmetro importante para avaliar o desempenho de um processo fermentativo

(Hiss, 2001). Em termos de equação representa a velocidade média de crescimento referente

ao tempo de cultivo, conforme Equação 6.

57



(6)

Onde: PX = produtividade em biomassa (g/L.h ), Xt = concentração de biomassa seca (g/L) no

tempo t de cultivo, X0 = concentração de biomassa seca (g/L) no início do cultivo e tf = tempo

de cultivo (h).

4.10.2.2 Produtividade em produto (Pp)

A produtividade em produto representa a velocidade média de formação de produto

em relação ao tempo de cultivo, e pode ser calculada pela Equação 7 (Hiss, 2001).

(7)

Onde: Pp = produtividade em produto (mg/L.h), Pt = concentração volumétrica de produto

(mg/L) no tempo t de cultivo, P0 = concentração volumétrica de produto (mg/L) no início do

cultivo e tf = tempo de cultivo (h).

4.10.3 Cálculo das velocidades específicas

As velocidades especificas de crescimento celular (µx), de consumo de substrato (µs) e

de formação do produto (µp), foram calculadas conforme as Equações 8, 9 e 10,

respectivamente.

(8)

(

) (9)

(10)

58



A determinação de μx, μs e μp foi realizada através de implementação das equações,

para determinação das respectivas derivadas, em planilhas conforme método proposto por Le

Duy & Zajic (Hiss, 2001).

4.10.4 Determinação da fase exponencial de crescimento celular

A velocidade máxima de crescimento microbiano (µmáx) foi obtida a partir dos dados

de crescimento celular obtidos durante os ensaios, por linearização da curva de concentração

celular em função do tempo (Hiss, 2001).

4.10.5 Fatores de conversão

Os fatores de conversão também possuem grande importância na análise de processos

fermentativos, pois através destes parâmetros é possível medir o rendimento da fermentação

(Daré, 2008).

O fator de conversão de substrato em produto possibilita a avaliação do cultivo a partir

da quantidade de produto formada em relação à quantidade de açúcares utilizados pelo

microrganismo, segundo Equação 11 (Hiss, 2001).

⁄

(11)

Onde: YP/S = fator de conversão de substrato em produto (mg de produto obtido/ g de açúcar

total consumido), P = concentração de produto (mg/L) no tempo t de cultivo, P0 =

concentração de produto (mg/L) no início do cultivo, S0 = concentração do substrato (g/L) no

início do cultivo e S = concentração do substrato (g/L) no tempo t de cultivo.

O fator de conversão de substrato em células relaciona o crescimento celular, ou seja,

aumento da biomassa, ao substrato consumido para essa finalidade, indicando quanto o

microrganismo está utilizando do substrato para seu crescimento. Esse fator é obtido através

da Equação 12.

⁄

(12)

59



Onde: YX/S = fator de conversão de substrato em células (grama de biomassa seca

obtida por grama de açúcar total consumido), X = concentração de biomassa seca (g/L) no

tempo t de cultivo, X0 = concentração de biomassa seca (g/L) no início do cultivo, S0 =

concentração do substrato (g/L) no início do cultivo e S = concentração do substrato (g/L) no

tempo t de cultivo.

Por fim, o fator de conversão de células em produto que relaciona produto com o

crescimento celular, calculado conforme Equação 13.

⁄

(13)

Onde: YP/X = fator de conversão de células em produto (g de biomassa seca/ mg de produto

obtido), P = concentração de produto (mg/L) no tempo t de cultivo, P0 = concentração de

produto (mg/L) no início do cultivo, X = concentração de biomassa seca (g/L) no tempo t de

cultivo e X0 = concentração de biomassa seca (g/L) no início do cultivo.

4.10.6 Determinação dos Parâmetros do Modelo de Luedeking-Piret

Pode se encontrar na literatura diversos modelos cinéticos que descrevem a formação

de produto com relação ao crescimento celular.

Segundo Luedeking & Piret (1959) a velocidade de formação de produto pode ou não

estar vinculada ao crescimento microbiano. Dessa forma, os parâmetros cinéticos do modelo

de Luedeking & Piret (1959) foram obtidos a partir da Equação 14.

(14)

Onde, α é o parâmetro relativo à formação de produto associada ao crescimento e β é o

parâmetro relativo à formação de produto não associada ao crescimento. As constantes α e β

foram determinadas através do ajuste linear de μp em função de μx. Sendo α o coeficiente

angular e β o coeficiente linear da reta obtida, os mesmos foram determinados com uso do

programa OriginPro v. 8.

Capítulo 5

Resultados e Discussão

61

5. Resultados e Discussão



Neste capítulo são apresentados e discutidos os resultados dos ensaios realizados no

presente estudo. Com o objetivo de avaliar a produção de surfactina foram realizados ensaios

em diferentes condições de cultivo. Os resultados são apresentados nos tópicos a seguir.

5.1 Cultivo de Bacillus subtilis UFPEDA 438 em diferentes condições

Geralmente, os microrganismos respondem de maneiras distintas às diferentes

condições ambientais às quais são submetidos (Tortora et al., 2000). Ensaios com B. subtilis

UFPEDA 438 foram conduzidos em incubador rotativo por 72 h, visando uma comparação

entre diferentes condições de cultivos. Para tanto, variou-se a velocidade de agitação (100,

150 e 200 rpm), temperatura (30, 33 e 36 º C) e razão de aeração (0,4, 0,5 e 0,6). Sendo os

ensaios denominados por A, B, C, D e E, conforme apresentado na Tabela 4.1 descrita em

Metodologia Experimental.

Vale ressaltar que para todos os ensaios foi utilizada a mesma quantidade de inóculo

(10% v/v), sendo este preparado nas mesmas condições de cultivo para todos os ensaios.

Além disso, as concentrações iniciais de substrato foram bem próximas (48,43 a 50,95 g/L).

Ensaio A

Percebe-se, através da Figura 5.1, um aumento de concentração celular atingindo valor

máximo (Xmáx) em 24 h (1,23 ± 0,29 g/L), fator de conversão de substrato em células na fase

exponencial (YX/S) de 1,353 g/g e velocidade específica máxima de crescimento celular (µmáx)

de 0,089/h no intervalo de 4 h. Também se observa que praticamente inexiste a fase “lag”, ou

seja, a fase de adaptação do microrganismo ao meio, que antecede a fase de crescimento

exponencial (fase “log”). Isso pode ser explicado pelo fato de que o microrganismo está

adaptado ao meio.

Neste ensaio a maior concentração de biossurfactante (Pmáx) foi de 63,46 ± 0,29 mg/L

e se deu após 24 h de cultivo, neste momento a produtividade em produto (PP) foi 2,537

mg/L.h e os fatores de conversão de substrato em produto na fase estacionária (YP/S) e células

em produto na fase exponencial (YP/X) foram de 0,013 g/g e 0,007 g/g, respectivamente. Após

62



24 h de cultivo nota-se que a concentração de surfactina cai para 47,03 ± 1,54 mg/L, enquanto

que o crescimento celular e a concentração de substrato permaneceram constantes. Observou-

se que o substrato não foi completamente consumido até o final do cultivo, permanecendo em

torno de 87,22% de açúcar não consumido.


pH em função do tempo para o ensaio A (100 rpm, 30 ºC e razão de aeração 0,4).

A Figura 5.2 ilustra a evolução das velocidades específicas de consumo de substrato

(µs), crescimento celular (µx) e formação de produto (µp) ao longo do tempo. É possível

observar que a velocidade específica de formação de células cai ao longo do tempo. Verifica-

se também uma semelhança entre os perfis de velocidade de consumo de substrato e formação

do produto nas primeiras 12 h de cultivo, indicando que a velocidade de consumo de substrato

está aumentando com a velocidade de síntese de produto.

63




formação de produto (µp) em função do tempo para o ensaio A (100 rpm, 30 ºC e razão de

aeração 0,4).

Vale destacar que neste ensaio a produção de surfactina pelo B. subtilis UFPEDA 438

ocorreu durante as fases exponencial e estacionária de crescimento, dando indícios de que o

metabólito é parcialmente associado ao crescimento nesta condição de cultivo, pois mesmo

após ter cessado o consumo do substrato e a biomassa ter atingido a fase estacionária de

crescimento, a síntese de produto continuou sendo realizada. Além disso, esse ensaio

apresentou valores de constantes cinéticas α e β de 0,020 e 0,002, respectivamente (Tabela

5.1), o que indica que a formação de produto está parcialmente associada ao crescimento.

Comportamento semelhante foi observado por Costa (2005), ao estudar a produção de

biossurfactante por cepa de B. subtilis LB5a utilizando como fonte de carbono a manipueira

na condição de 30 ºC e 150 rpm, onde a produção de surfactina ocorreu predominantemente

nas fases exponencial e estacionária.

64



Tabela 5.1 – Parâmetros cinéticos obtidos por ajuste linear.

Ensaio

μmáx (h-1

)*

R2*

α1

β1

A 0,089 0,945 0,020 0,002

B 0,081 0,961 0,000 0,010

C 0,206 0,918 0,000 0,010

D 0,137 0,956 0,001 0,001

E12 0,123 0,986 0,024 0,001

E22 0,103 0,909 0,032 0,001

*Obtido através de ajuste linear de ln (X) em função do tempo;

1Constantes do Modelo de Luedeking-Piret;

2Ensaio E realizado em duplicata.

De acordo com Desai & Banat (1997), o estudo cinético da produção de

biossurfactantes possui muitas variações dentre os sistemas e poucas generalizações podem

ser descritas. Em alguns casos uma maior produção de surfactina é alcançada em condições

limitantes do crescimento, pela limitação de nitrogênio e de cátions multivalentes (Kosaric, et

al., 1987). Quanto à fase onde ocorre a produção de surfactina, alguns autores relatam que

esta ocorre no final da fase exponencial e início da fase estacionária de crescimento (Nakano

et al., 1989 e 1991; Kim et al., 2001). Besson & Michel (1992) afirmaram que em B. subtilis,

a surfactina já é sintetizada, ainda que em pequenas concentrações, na fase logarítmica de

crescimento. Já Cooper et al. (1981) sugeriram que a produção de surfactina estava associada

ao crescimento, enquanto Coutte et al. (2010) observaram que a produção ocorria ao final da

fase exponencial de crescimento. O fato de o produto formado estar ou não associado ao

crescimento celular é dependente de diversos fatores, dentre os quais podem ser destacados a

espécie de microrganismo a ser utilizado e o meio de cultivo em que o mesmo será cultivado

(Debon, 2015).

65



Ensaio B

Na curva de crescimento microbiano do ensaio B (Figura 5.3), é visualizada uma curta

fase de adaptação nas primeiras 2 h de cultivo seguida de um aumento da concentração celular

que atinge o seu valor máximo (Xmáx) em 24 h (1,08 ± 0,08 g/L), com velocidade específica

máxima de crescimento celular (µmáx) de 0,081/h no intervalo de 4 h e fator de conversão de

substrato em células na fase exponencial (YX/S) de 0,080 g/g.

A maior concentração de surfactina (Pmáx) de 57,26 ± 0,20 mg/L foi observada no

período de 48 h de cultivo e o valor de produtividade em produto (PP) foi 1,148 mg/L.h. Para

esse ensaio, foram obtidos valores de fatores de conversão de substrato em produto na fase

estacionária (YP/S) e células em produto na fase exponencial (YP/X) de 0,004 g/g e 0,011 g/g,

respectivamente. No decorrer do cultivo também foi verificado aumento do consumo de

substrato, o qual tem sua concentração praticamente estável a partir de 48 h quando o

microrganismo já se encontra em fase estacionária. Ao final do cultivo de 72 h, tem-se baixo

consumo de fonte de carbono, apresentando também uma elevada porcentagem de açúcar não

consumido (74,10%).


pH em função do tempo para o ensaio B (100 rpm, 30 ºC e razão de aeração 0,6).

66



Observando a curva de crescimento celular e de síntese de biossurfactante nota-se a

existência de pequenas concentrações de produto nas primeiras 12 h, indicando que a

produção de biossurfactante provavelmente se iniciou durante a fase exponencial de

crescimento microbiano. Entretanto, ao analisar a Figura 5.4 percebe-se que nas primeiras 8 h

de cultivo há um declínio da velocidade específica de formação de produto, a qual sofre um

aumento a partir desse ponto. Fornecendo uma hipótese de que essas concentrações iniciais de

biossurfactante podem ser provenientes do inóculo, pois mesmo que o microrganismo venha a

produzir essa concentração, esse valor é muito menor do que quando se observa nas 48 h de

cultivo (aproximadamente 8 vezes menor).


formação de produto (µp) em função do tempo para o ensaio B (100 rpm, 30 ºC e razão de

aeração 0,6).

Através da figura também é possível visualizar o aumento da velocidade específica de

crescimento celular nas primeiras 4 h de cultivo, seguido de um decréscimo até o intervalo de

24 h a partir da qual se torna nula. Nesse intervalo, quando o microrganismo já se encontra na

fase estacionária, a célula passa a consumir substrato para sintetizar o produto.

A máxima velocidade específica de formação de produto ocorre quando as demais

velocidades específicas sofreram uma redução significativa, caracterizando um perfil de

produção não associada ao crescimento, apresentando valores de α e β de 0 e 0,001,

67



respectivamente. Esse comportamento corrobora com o estudo realizado por Nitschke &

Pastore (2004), que estudaram a produção de surfactina a partir de B. subtilis 21332 utilizando

manipueira e verificaram que a formação de produto estava não associada ao crescimento. Em

estudos anteriores Sheppard & Mulligan (1987) relataram que a produção de surfactina por B.

subtilis 21332 ocorria principalmente entre o final da fase exponencial e início da fase

estacionária de crescimento, o que também foi observado neste trabalho.

Ensaio C

No ensaio C (Figura 5.5) é possível visualizar que a concentração celular nas primeiras

6 h de cultivo encontra-se estável, caracterizando a fase “lag”, e atinge sua concentração

máxima (Xmáx) em 10 h (1,42 ± 0,03 g/L) com velocidade específica máxima de crescimento

celular µmáx de 0,206/h no intervalo de 4 h.


pH em função do tempo para o ensaio C (200 rpm, 36 ºC e razão de aeração 0,4).

A curva de produção de surfactina mostra pequenas variações de concentrações nas

primeiras 12 h tendo o seu valor máximo (Pmáx) de 199,45 ± 0,13 mg/L em 24 h, quando o

microrganismo já está na fase estacionária. Após esse período, nota-se uma pequena redução

na sua concentração (187,34 ± 1,05 mg/L) em 48 h, e decréscimo acentuado ao seguir para 72

68



h. O fator de conversão de substrato em produto na fase exponencial (YP/S), fator de

conversão de células em produto na fase exponencial (YP/X) e produtividade em produto (PP)

foi de 0,046 g/g, 0,012 g/g e 8,187 mg/L.h, respectivamente. Nota-se também um leve

decréscimo da curva de substrato a partir de 12 h e baixo consumo de substrato durante o

cultivo, permanecendo 78,00% de substrato residual.

De acordo com a Figura 5.6, a velocidade específica de formação de células está

diminuindo ao longo do cultivo, enquanto que a velocidade do consumo de substrato está

aumentando. Quando a velocidade específica de formação de produto atinge o seu valor

máximo, a velocidade específica de crescimento já é nula e a velocidade específica de

consumo de substrato já sofreu uma redução expressiva, o que caracteriza que a formação de

produto está não associada ao crescimento, com valores de α e β de 0 e 0,001,

respectivamente.


formação de produto (µp) em função do tempo para o ensaio C (200 rpm, 36 ºC e razão de

aeração 0,4).

69



Ensaio D

Na Figura 5.7, verifica-se concentração celular máxima (Xmáx) de 1,48 ± 0,03 g/L em

24 h, apresentando velocidade específica máxima de crescimento celular de µmáx de 0,137/h

em 4 h e fator de conversão de substrato em células na fase exponencial (YX/S) de 0,108 g/g.

A produção do biossurfactante se estendeu até 48 h de experimento, alcançando uma

concentração máxima de 15,35 ± 0,61 mg/L, possuindo fatores de conversão de substrato em

produto na fase estacionária (YP/S), células em produto na fase exponencial (YP/X) e

produtividade em produto (PP) de 0,003 g/g, 0,006 g/g e 0,53 mg/L.h, respectivamente. Não

se observou acentuado consumo de substrato durante o cultivo, tendo 78,58% de substrato

residual ao final do processo.


pH em função do tempo para o ensaio D (200 rpm, 36 ºC e razão de aeração 0,6).

Observa-se na Figura 5.8 que a velocidade específica de formação de células aumenta

até 4 h de cultivo, neste mesmo intervalo também temos o aumento da velocidade específica

de consumo de substrato e formação de produto. Em seguida, a velocidade específica de

consumo de substrato e crescimento celular cai rapidamente com o aumento da velocidade de

formação de produto. Verifica-se também que nas primeiras 24 h de cultivo, a velocidade

70



específica de consumo de substrato acompanha de maneira muito semelhante o andamento da

curva de velocidade de crescimento celular.


formação de produto (µp) em função do tempo para o ensaio D (200 rpm, 36 ºC e razão de

aeração 0,6).

Ao final do cultivo percebe-se que no intervalo de 48 a 72 h de cultivo tem-se um leve

aumento da velocidade específica de consumo de substrato, possivelmente porque a fonte de

carbono não é um fator limitante. Pois a velocidade específica de consumo de substrato ao

longo do tempo tenderia a zero, se todo açúcar estivesse sido consumido.

Para esse ensaio os valores para ambas constantes cinéticas (α e β) foram de 0,001,

caracterizando que a formação de produto está parcialmente associada ao crescimento.

Ensaio E

O ensaio E foi realizado em duplicata, para verificação da reprodutibilidade dos

cultivos, sendo suas duplicatas denominadas de E1 e E2.

A partir da curva de crescimento microbiano (Figura 5.9) verifica-se uma curta fase de

adaptação nas primeiras 2 h de cultivo seguida de um crescente aumento da concentração

celular, a qual atinge seu valor mais elevado (Xmáx) em 12 h para ambos os ensaios E1 e E2

71



(1,48 ± 0,02 g/L e 1,47g/L ± 0,03, respectivamente), com velocidade específica máxima de

crescimento celular µmáx no intervalo de 2h para os ensaios E1 e E2 de 0,123/h e 0,103/h,

respectivamente.


pH em função do tempo nas condições de 150 rpm, 33 ºC e razão de aeração de 0,5: (A)

Ensaio E1; (B) Ensaio E2.

A)

B)

72



Analisando a curva de produção de surfactina percebe-se que sua concentração

culmina em 24 h quando o microrganismo entra na fase estacionária de crescimento celular, e

mantém-se praticamente constante até o período de 48 h. A maior concentração de surfactina

(Pmáx) obtida foi de 76,46 ± 0,43 mg/L e 74,03 ± 1,37 mg/L para os ensaios E1 e E2,

respectivamente. Para o ensaio E1 foram encontrados valores de fatores de conversão de

substrato em produto na fase estacionária (YP/S), células em produto na fase exponencial

(YP/X) e produtividade em produto (PP) de 0,003 g/g, 0,043 g/g e 3,050 mg/L.h,

respectivamente. E para o ensaio E2, os fatores de conversão de substrato em produto na fase

estacionária (YP/S), células em produto na fase exponencial (YP/X) e produtividade em produto

(PP) foram 0,003 g/g, 0,040 g/g e 2,928 mg/L.h, respectivamente.

Nos dois ensaios é observada queda crescente da concentração de substrato nas

primeiras 12 h alcançando concentração praticamente estável a partir de 24 h, quando, neste

momento, já se tem cessado o crescimento celular e o microrganismo se encontra na fase

estacionária. Em 24 h de cultivo o fator de conversão de substrato de células na fase

exponencial (YX/S) para o ensaio E1 e E2 é de 0,062 g/g e 0,072 g/g, respectivamente. Ao final

do cultivo, a porcentagem de substrato residual para o ensaio E1 e E2 foi de 76,31 e 76,86%,

respectivamente.

De modo geral, os dois ensaios apresentaram perfis de velocidade semelhante, com

formação de produto parcialmente associada ao crescimento (Figura 5.10). Cujos valores de

coeficientes α e β para o ensaio E1 foram de 0,024 e 0,001, respectivamente; e para o ensaio

E2 foram de 0,032 e 0,001, respectivamente.

Para ambos os ensaios, a velocidade específica de crescimento celular está diminuindo

ao longo do tempo, a qual atinge valor nulo no tempo de 24 h de cultivo (Figura 5.10).

Também é possível visualizar um aumento da velocidade específica de consumo de substrato

nas primeiras horas cultivo. Além disso, o intervalo de 12 h de cultivo exibe valor máximo de

velocidade específica de formação de produto, quando as demais velocidades já sofreram

redução significativa. Nos dois ensaios também é verificado que houve uma redução da

velocidade específica de formação de produto nas primeiras 4 h de cultivo, seguida de uma

elevação da mesma. O que comprova a hipótese de que, como já citado anteriormente, devem

existir pequenas concentrações iniciais de biossurfactante oriundas do inóculo.

73



Figura 5.10 – Velocidades específicas de consumo de substrato (µs), crescimento celular (µx)

e formação de produto (µp) em função do tempo nas condições de 150 rpm, 33 ºC e razão de

aeração de 0,5: (A) Ensaio E1; (B) Ensaio E2.

A)

B)

74



Sabe-se que o pH é um fator que pode afetar a produção de biossurfactantes. Neste

trabalho, em todas as condições estudadas não foi verificada variação acentuada do pH ao

longo do cultivo, possuindo valores variando na faixa de 6,2 a 6,8.

Segundo Claus & Berkerley (1984), o pH ideal para o crescimento de B. subtilis se

situa na faixa de 5,5 a 8,5. Barros et al. (2008) avaliaram as propriedades emulsificantes e a

estabilidade do biossurfactante produzido por B. subtilis em manipueira e quando

compararam valores de tensão superficial frente à variação do pH, e observaram que os

menores valores, 27,5 e 28,5 dina/cm corresponderam aos pH 6 e 8, respectivamente.

Conforme relato de Makkar & Cameotra (1997), quando o pH do meio se encontra ácido

ocorre um decréscimo substancial da quantidade de biossurfactante produzida por linhagem

de B. subtilis pois nessa condição há precipitação da surfactina, o que contribui para elevação

da tensão superficial. Logo, pode-se deduzir que a variação do pH do meio aqui estudado, não

influenciou negativamente a produção de biossurfactante, visto que todos os ensaios

apresentaram pH próximos da neutralidade.

Segundo Olbrich (1963), o melaço de cana é propício para o desenvolvimento de B.

subtilis, visto que na própria microflora do melaço de cana podem ser encontradas bactérias, a

maioria pertencente a estirpes especialmente resistentes (formadoras de esporos), como B.

subtilis. Além disso, no estudo realizado por Younis et al., (2010), com cepa de B. subtilis KO

isolada de melaço de cana, foi observado bom crescimento do microrganismo no meio

contendo melaço de cana como fonte de carbono.

Entretanto, em virtude da sua composição, o melaço é utilizado fundamentalmente

como fonte de carbono e energia, sendo necessário suplementá-lo com nitrogênio e alguns

minerais, especialmente fósforo e magnésio (Diez & Yokoya, 1996). Dessa forma, Feltrin et

al., (2000) afirmaram em seu trabalho que o baixo teor de nitrogênio no melaço a 3% requer a

adição deste elemento para o desenvolvimento de microrganismos.

Contudo, apesar de o melaço ser um substrato adequado para a síntese de

biossurfactante, durante todos os ensaios apresentados neste estudo, verificou-se a presença de

uma expressiva quantidade residual de fonte de carbono ao final do processo fermentativo,

restando em torno de 74,10 a 87,22% da concentração inicial. Comportamento similar foi

obtido no estudo da influência da fonte de nitrogênio na produção de surfactina por B. subtilis

ATCC 21332, no qual observaram grande quantidade residual de glicose ao utilizarem 30 g/L

de glicose como fonte de carbono e 1,0 g/L de nitrato de amônio como fonte de nitrogênio,

em condições aeróbias (Davis et al., 1999). Os autores observaram que não houve limitação

75



da produção devido a fonte de carbono, pois a produção de surfactina apresentou-se crescente

até o final do processo fermentativo e tornou-se intensa quando a fonte de nitrogênio

(NH4NO3) estava esgotada. Oliveira (2010), também relatou em seu estudo realizado com B.

subtilis LAMI005 em meio contendo suco de caju clarificado e 1 g/L de sulfato de amônio

como fonte de nitrogênio, baixo consumo de substrato com 60% de carbono residual ao final

do cultivo.

Debon (2015) investigou a produção de biossurfactante por B. subtilis ATCC 21332

sob diversas condições e verificou-se que a glicose não foi totalmente consumida, atribuindo

isso devido à limitação de algum micronutriente no meio mineral. Para comprovar tais fatos,

foi realizado outro cultivo com as mesmas concentrações de glicose (20 g/L) e NaNO3 (13,6

g/L) utilizando meio mineral adicionado de micronutrientes (3,0 g/L MnSO4.H2O; 0,1 g/L

CoCl2.6H2O; 0,01 g/L 0,01 g/L Na2MoO4.2H2O e 0,01 g/L AlK(SO4)2.12H2O). Através dos

resultados, foi evidenciado que a adição desses micronutrientes no meio de cultivo contribuiu

para que o microrganismo consumisse totalmente a glicose disponível aumentando assim a

concentração celular. No entanto, a síntese de surfactina não foi favorecida, na qual a sua

concentração foi aproximadamente igual à encontrada no ensaio anterior.

Diante do exposto, acredita-se na hipótese de que as elevadas concentrações de

substrato residual apresentadas no presente trabalho se deve a presença de fonte de nitrogênio

(1 g/L de (NH4)2SO4) disponível ao microrganismo e o mesmo utilizá-la conjuntamente com a

fonte de carbono para seu crescimento, ou devido à limitação de algum micronutriente

disponível no meio.

Em todos os ensaios se observa que a máxima produção de surfactina ocorre quando o

microrganismo se encontra na fase estacionária de crescimento. Para a maioria dos ensaios

essa concentração máxima ocorre no intervalo de 24 h de cultivo, com exceção do ensaio B

que ocorre em 48 h.

76



Figura 5.11 – Concentração de surfactina em função do tempo de cultivo de B. subtilis

UFPEDA 438.

Através da Figura 5.11 que mostra a variação da concentração de surfactina em função

do tempo, é possível observar que a partir do intervalo de produção máxima de surfactina

existe uma queda brusca na concentração de biossurfactante. Essa queda foi observada nos

ensaios A, B e D. Alguns autores demonstraram quedas nas concentrações de surfactina em

seus trabalhos, tendo como justificativa a acidificação do meio (Abdel-Mawgoud et al.,

2008b; Lima Júnior, 2012). Entretanto, esse fato pode ser descartado neste estudo, visto que

não houve queda de pH nos cultivos aqui realizados.

De acordo com Anwar & Saleemudin (1998), microrganismos pertencentes ao gênero

Bacillus são capazes de produzir proteases. Nitschke & Pastore (2004), observaram crescente

atividade proteolítica de B. subtilis 21332 em meio composto por manipueira, concluindo que

a queda na concentração de surfatante estava relacionada à ação enzimática. A hidrólise

enzimática também foi relatada por Grangemard et al. (1999), que averiguaram a ação de uma

endoprotease V8 produzida por Staphylococcus aureus. Segundo os autores, a enzima atuava

sobre a porção peptídica do surfactante, gerando um lipopeptídeo de cadeia aberta. Portanto,

77



essa redução na concentração de biossurfactante sugere possível consumo ou degradação de

surfactina pelo microrganismo, pois este é capaz de produzir proteases e hidrolisar a molécula

para suprir o metabolismo microbiano (Nitschke & Pastore, 2004; Shaligram & Singhal,

2010).

A Tabela 5.2 apresenta o resumo dos parâmetros cinéticos obtidos em todos os

ensaios, bem como as concentrações máximas de células e produto. Pode-se observar uma

diferença nesses resultados que pode estar relacionada a diversos fatores tais como

temperatura de cultivo, velocidade de agitação e razão de aeração.

Tabela 5.2 – Parâmetros cinéticos dos ensaios de produção de surfactina por B. subtilis

UFPEDA 438.

Ensaio

S0

(g/L)

SR

(%)

Xmáx

(g/L)

TXmáx

(h)

Pmáx

(mg/L)

TPmáx

(h)

YX/S

(g/g)

YP/S

(g/g)

YP/X

(g/g)

PX

(g/L.h)

PP

(mg/L.h)

A 48,43 87,22 1,23 24 63,46 24 1,353 0,013 0,007 0,030 2,537

B 49,10 74,10 1,08 24 57,26 48 0,080 0,004 0,011 0,011 1,148

C 50,13 78,00 1,42 10 199,45 24 0,138 0,046 0,012 0,031 8,187

D 50,58 78,58 1,48 24 15,35 24 0,108 0,003 0,006 0,041 0,530

E1 50,86 76,31 1,48 12 76,46 24 0,062 0,003 0,043 0,028 3,050

E2 50,95 76,86 1,47 12 74,03 24 0,072 0,003 0,040 0,025 2,928

Nota: S0: concentração de substrato no início do processo; SR: porcentagem de substrato residual ao final do

cultivo (72h); Xmáx: concentração máxima de biomassa; TXmáx: tempo em que ocorreu a concentração máxima de

biomassa; Pmáx: concentração máxima de surfactina; TPmáx: tempo em que ocorreu a concentração máxima de

surfactina; YX/S: conversão de subtrato em células na fase exponencial de crescimento; YP/S: conversão de

substrato em produto na fase estacionária de crescimento; YP/X: conversão de células em produto na fase

exponencial de crescimento; PX: produtividade em biomassa; PP: produtividade em produto.

Quando comparados os ensaios A e B, que diferem entre si apenas pela razão de

aeração de 0,4 e 0,6 para os ensaios A e B, respectivamente, os valores obtidos em termos

concentração de surfactina foi de 63,46 ± 0,29 mg/L para o ensaio A e 57,26 ± 0,20 mg/L

para o ensaio B, indicando que nas mesmas condições de agitação (100 rpm) e temperatura

(30 ºC) a menor razão de aeração favoreceu a maior síntese de surfactina. Isso pode ser

explicado pelo fato de que a concentração de oxigênio está intimamente relacionada à

produção de biossurfactante por B. subtilis. Silva (2013), avaliou a produção de surfactina por

78



Bacillus subtilis sp ITP-001 em biorreator e obteve máxima concentração de surfactina em

valores mínimos de razão de aeração. Em outro estudo, Yao et al. (2015) utilizaram Bacillus

amyloliquefaciens fmb50 para produção de surfactina e observou melhor produção de

surfactina em menor razão de aeração.

Diversos autores (Hbid et al., 1996, Davis et al., 1999, Jacques et al., 1999) têm

relatado na literatura que a concentração de oxigênio dissolvido desempenha um papel crucial

na eficiência da produção de lipopeptídeos. Guez et al. (2008) mostraram recentemente que a

síntese dos lipopeptídeos surfactina e micosubtilina em B. subtilis ATCC 6633 é influenciado

pelo fornecimento de oxigênio. Os resultados obtidos revelaram que a regulação do oxigênio

atuou em diferentes níveis, sugerindo que existe um sistema complexo para a regulação da

produção de biossurfactante.

Ao comparar os ensaios C e D, cujas diferenças entre si são apenas as razões de

aeração, as quais correspondem a 0,4 para o ensaio C e 0,6 para o ensaio D, operando nas

mesmas condições de agitação (200 rpm) e temperatura (36 ºC). Foram obtidas concentrações

máximas de surfactina de 199,45 ± 0,13 mg/L e 15,35 ± 0,61 mg/L para o ensaio C e D,

respectivamente, o que indica que a menor razão de aeração, novamente, favoreceu a

produção de surfactina. Entretanto, observa-se grande diferença entre os valores de

concentrações máximas.

O ensaio B foi então comparado com o ensaio D. A velocidade de agitação e

temperatura são as únicas diferenças entre eles: agitação de 100 rpm e temperatura de 30 ºC

para o ensaio A e agitação de 200 rpm e temperatura de 36 ºC para o ensaio D, ambos com

mesma razão de aeração (0,6). Neste caso, o aumento da velocidade de agitação e temperatura

não favoreceram a produção de surfactina, pois a maior concentração de biossurfactante foi

observada no ensaio A (63,46 ± 0,29 mg/L). Talvez porque a razão de aeração foi considerada

muito alta e teve um efeito negativo ao ser combinada com uma elevada velocidade de

agitação, no ensaio D. Yeh et al. (2006) ao cultivarem cepa de B. subtilis para produção de

biossurfactante, observaram que elevada taxa de agitação e razão de aeração, apesar de

produzirem considerável quantidade de espuma, prejudica o crescimento do microrganismo e

a produção de surfactina.

Como visto, as diferenças encontradas nos valores de concentração de surfactina

podem estar relacionadas a diversos fatores, de acordo com Desai & Banat (1997) e Makkar

& Cameotra (1998), o processo de produção de surfactina é influenciado pelas condições

79



ambientais como pH, temperatura, velocidade de agitação e razão de aeração, e também pelas

concentrações e tipo das fontes de carbono e nitrogênio.

Dentre os cultivos realizados, o ensaio C apresentou maiores valores de concentração

de surfactina Pmáx (199,45 ± 0,13 mg/L), produtividade em produto PP (8,187 mg/L.h) e fator

de conversão de substrato em produto na fase estacionária YP/S (0,046 g/g). Resultado

semelhante ao obtido por Oliveira (2010), em seu estudo sobre a produção de biossurfactante

por B. subtilis LAMI005 utilizando suco de caju clarificado. No qual obteve YP/S de 0,039 g/g

para a concentração de 96,10 g/L de açúcares redutores totais (ART). Martins (2016) ao

avaliar a influência da transferência de oxigênio na produção de biossurfactante por B. subtilis

ATCC 21332, encontrou valor de YP/X de 0,009 g/g. Em relação a produtividade em produto

(PP), a analisar meio de cultivo contendo soja, Lima Júnior (2012) obteve produtividade PP de

3,79 mg/L.h em 36 h de ensaio, resultado inferior ao obtido no presente estudo.

Em relação à concentração de surfactina, observa-se que os resultados apresentados

por esse estudo foi superior ao estudo realizado por Liu et al., (2012), o qual obtiveram valor

máximo de surfactina de 134,20 mg/L no tempo de 48 h de cultivo. Lima Júnior (2012) ao

avaliar a obtenção de surfactina pelo microrganismo B. subtilis ATCC 6633, obteve

concentrações máximas de surfactina no tempo de 36 h de 135,00 mg/L e 131,00 mg/L,

quando utilizou cultivos em meio mineral e mineral modificado, respectivamente. No meio

formulado de acordo com a composição centesimal do microrganismo, a produção de

surfactina obtida pelo autor atingiu a concentração de 66,00 mg/L em 96 h de ensaio,

enquanto que no meio contendo melaço de soja com 2% açúcares totais, obteve 136,00 mg/L.

Valor semelhante ao relatado aqui foi encontrado por Oliveira (2010), na produção de

surfactina por B. subtilis LAMI005, tal estudo encontrou o correspondente a 215,00 mg/L, em

meio composto por suco de caju com concentração de 96,10 g/L de açúcares. Wei et al.

(2003) reportaram produção máxima de 250,00 mg/L de surfactina, cultivando B. subtilis

ATCC 21332 em meio definido usando 40 g/L de glicose, em agitador orbital. Por outro lado,

Makkar & Cameotra (1997) obtiveram cerca de 1,0 g/L de biossurfactante produzido por B.

subtilis MTCC 2423, cultivado em meio mineral suplementado com melaço, porém a

produção por B. subtilis MTCC 1427 foi cerca de 200,00 mg/L. Enquanto que Al-Bahry et al.

(2013), ao estudarem a utilização de melaço de tamareira (Phoenix dactylifera. L.) como

única fonte de carbono e energia para a produção de biotensoativo por B. subtilis B20,

obtiveram concentrações de 2,29 g/L. A Tabela 5.3 apresenta a produção de surfactina

reportada em alguns estudos.

80



Tabela 5.3 – Produção de surfactina relatada na literatura.

Referência Cepa Meio de Cultivo Produção de

surfactina (mg/L)

Este estudo (maior

produção)

B. subtilis UFPEDA 438 Meio formulado com 4%

de melaço

199,45

Lima Júnior (2012) B. subtilis ATCC 6633 Meio mineral 135,00

Lima Júnior (2012) B. subtilis ATCC 6633 Meio mineral modificado 131,00

Lima Júnior (2012) B. subtilis ATCC 6633 Meio contendo melaço

soja com 2% de açúcares

136,00

Oliveira (2010) B. subtilis LAMI005 Meio composto por suco

de caju (96,10 g/L de

açúcares)

215,00

Wei et al. (2003) B. subtilis ATCC 21332 Meio formulado com 40

g/L de glicose

250,00

Makkar e Cameotra

(1997)

B. subtilis MTCC 1427 Meio mineral

suplementado com

melaço

200,00

Al-Bahry et al., (2013) B. subtilis B20 Melaço de tamareira

(Phoenix dactylifera. L.)

2290,00

Os fatores de rendimento indicam a eficiência da produção e são importantes

parâmetros de otimização em processos comerciais. Desta forma, os resultados aqui obtidos

podem ser considerados suficientes para uma produção potencial de surfactina, pois está

acima de alguns valores já reportados.

5.1.1 Determinação da Concentração de Iturina

As cepas de B. subtilis são conhecidas pela capacidade de produzir diversos tipos de

lipopeptídeos, particularmente iturina, surfactina e fengicina. Algumas cepas produzem

apenas um tipo de lipopeptídeo, enquanto outras produzem dois ou mais tipos de moléculas

simultaneamente (Nitschke, 2004). A produção destes lipopeptídeos é dependente de diversos

fatores, como condições ambientais e composição do meio de cultura (Akpa et al., 2001).

81



Dessa forma, se realizou a determinação da concentração de iturina presente no caldo de

cultura de B. subtilis UFPEDA 438.

Destaca-se que muito embora o produto de interesse deste estudo seja a surfactina, a

análise realizada através de cromatografia mostrou que, em algumas condições de cultivo, foi

detectada pequenas concentrações de iturina. A Tabela 5.4, mostra as concentrações máximas

de iturina em seus respectivos intervalos de tempo, encontradas em cada ensaio realizado.

Tabela 5.4 – Concentração de Iturina produzida por B. subtilis UFPEDA 438.

Ensaio

Concentração de

Iturina (mg/L)

Tempo

(h)

A 0,70 24

B ND -

C 1,30 24

D ND -

E 0,69 72

F 0,75 48

*ND: não detectado.

É possível observar que todos os resultados apresentaram baixas concentrações de

iturina e para todos os ensaios em que foram detectadas a formação deste biossurfactante,

percebe-se que a síntese do produto ocorreu durante a fase estacionária de crescimento

microbiano. Comportamento semelhante foi observado por Besson & Michel (1992), que

afirmaram em seu estudo que a produção de surfactina se iniciava na fase exponencial,

enquanto que a da iturina ocorria durante a fase estacionária. No estudo realizado por

Nitschke (2004), no qual avaliou a produção e caracterização de biossurfatante por B. subtilis

utilizando manipueira, os resultados confirmaram apenas a presença de surfactina na amostra.

Diante do exposto, os resultados confirmam que as culturas de B. subtilis UFPEDA 438 aqui

estudadas, não exibiram potencial para produção de iturina.

82



5.2 Índice de Emulsificação (E24)

Um importante parâmetro de avaliação do poder de um emulsificante é o índice de

emulsificação (E24) e a estabilidade da emulsão, uma vez que uma das principais propriedades

dos biossurfactantes é a sua capacidade de formar emulsões (Cooper & Goldenberg, 1987;

Nitschke et al., 2004; Costa, 2005). Segundo estudos, as bactérias com atividade

biossurfactante produzem emulsões estáveis após 24 h, pelo fato de produzirem substâncias

anfifílicas como os biossurfactantes (Banat et al., 2000).

A Tabela 5.5 apresenta o índice de emulsificação (E24), após 24 h em querosene, de

amostras da melhor condição de cultivo (Ensaio C) nos tempos de 24 e 48 h do cultivo.

Tabela 5.5 – Índice de Emulsificação (E24) obtido em querosene, realizado a partir de

sobrenadante de cultura produzido por B. subtilis UFPEDA 438 para as amostras do ensaio C

(200 rpm, 36 ºC e razão de aeração 0,4) nos tempos de 24 e 48 h de cultivo.

Amostra

E24 (%)

24 h 62,10 ± 0,00

48 h 59,03 ± 1,30

Por meio da análise dos resultados, todas as amostras apresentaram índice de

emulsificação superior a 50%. Foi obtido maior índice de emulsificação (62,10% ± 0,00) na

amostra que continha maior concentração de biossurfactante (199,45 mg/L em 24 h de

cultivo). Resultados semelhantes foram verificados por Gong (2009), que revelou em seu

estudo que o índice de emulsificação da surfactina obtida a partir de B. subtilis E8 foi em

torno de 68%, e estava próximo dos valores dos índices de emulsificação de diferentes

tensioativos sintetizados quimicamente (triton-X, tween 80 e dodecil sulfato de sódio).

Bezerra (2006), utilizando Pseudomonas aeruginosa e melaço de cana como substrato

obteve em seu trabalho índice de emulsificação de aproxidamente 64%. Em outro estudo,

Abdel-Mawgoud et al. (2008b) ao analisarem as propriedades emulsificantes do

biossurfactante produzido por isolados de B. subtilis BS5 em meio contendo melaço,

83



encontraram valores índices de emulsificação em querosene variando entre 59 e 62, 5%,

sendo estes resultado semelhantes aos obtidos no presente estudo.

Segundo a literatura, para que a emulsão seja considerada eficaz, o índice de

emulsificação deve ser superior a 40% (Youssef et al., 2004). Dessa forma, o presente estudo

apresentou resultados satisfatórios, sendo possível observar que todas as amostras testadas

foram capazes de manter a emulsão formada durante 24 h de análise (Figura 5.12), indicando

que o microrganismo estudado é produtor de um bom bioemulsificante.

Figura 5.12 – Capacidade de emulsificação do biossurfactante produzido por B. subtilis

UFPEDA 438 para as amostras do ensaio C (200 rpm, 36 ºC e razão de aeração 0,4): (A) 24 h

de cultivo; (B) 48 h de cultivo.

5.3 Avaliação da atividade Emulsificante

O acompanhamento da estabilidade da emulsão através da análise de Atividade

Emulsificante (U) é apresentado na Figura 5.13. A análise foi realizada durante o período de

60 minutos, em intervalos de 10 minutos, utilizando-se querosene como agente emulsificante.

No presente estudo foi realizada a análise de amostras da melhor condição de cultivo

(Ensaio C) nos intervalos de 24 e 48 h de cultivo, e ambas as amostras exibiram boa

estabilidade ao longo dos 60 minutos de análise. A emulsão apresentou valores próximos de

1,5 U no tempo de 24 h de cultivo e valores entre 1,0 e 1,2 U no tempo de 48 h, o que

demonstra que houve pouca variação da estabilidade da emulsão ao longo do tempo.

Conforme o esperado, a maior concentração de biossurfactante (199,45 mg/L) contribuiu para

o aumento da atividade emulsificante.

A B

84



Figura 5.13 – Atividade emulsificante (U) da surfactina produzida por B. subtilis UFPEDA

438 para as amostras do ensaio C (200 rpm, 36 ºC e razão de aeração 0,4) nos tempos de 24 e

48 h de cultivo.

Resultados semelhantes aos reportados aqui, foram encontrado por Oliveira (2010) ao

estudar a produção de biossurfactante por B. subtilis LAMI005 em meio mineral, o qual

encontrou valores variando de 1,0 a 1,7 U. Bueno et al., (2010) observaram em seu estudo

com B. pumilus utilizando diferentes fontes de carbonos como glicose, sacarose, manitol,

frutose, glicose + frutose e caldo de cana nas concentrações de 1 a 5%, valores de atividade

emulsificante variando entre 0,3 e 0,7 U.

5.4 Determinação da Concentração Micelar Crítica (CMC)

Uma das propriedades mais importantes dos tensoativos é sua eficiência quanto à

redução da tensão, seja ela superficial ou interfacial, e a Concentração Micelar Crítica (CMC)

é um índice largamente utilizado para avaliar essa atividade surfactante (Medeiros, 2007). A

CMC é a concentração mínima necessária para atingir valores mais baixos de tensão

85



superficial, na qual se inicia a formação de micelas (Banat et al., 2000). A eficiência de um

biossurfactante é medida através da Concentração Micelar Crítica (CMC) que varia de 1 a

2000 mg/L (Gouveia et al., 2003)

Neste trabalho, a CMC foi determinada através de medição da tensão superficial para

várias concentrações de biossurfactante. Foram utilizadas para realização dos testes de CMC

amostras do sobrenadante do caldo de cultura de B. subtilis UFPEDA 438 em que houve

maior formação de produto, os resultados são apresentados na Figura 5.14.

Figura 5.14 – Concentração Micelar Crítica (CMC) do biossurfactante produzido por B.

subtilis UFPEDA 438 no ensaio C (200 rpm, 36 ºC e razão de aeração 0,4).

Através dos resultados é possível observar que o aumento na concentração do

biossurfactante produzido provocou diminuição da tensão superficial da água destilada até o

ponto na qual a CMC foi atingida, ou seja, 20,73 mg/L. A partir deste ponto, mesmo com o

aumento da concentração de surfactina, praticamente não houve redução da tensão superficial.

O biossurfactante produzido por B. subtilis UFPEDA 438 exibiu boa capacidade de redução

da tensão superficial, visto que com apenas 20,73 mg/L o mesmo foi capaz de reduzir a tensão

86



superficial da água de 70,54 ± 0,03 para 28,69 ± 0,07 mN/m, provocando reduções de tensão

de 48,67%.

O biossurfactante produzido neste trabalho demonstrou maior capacidade de redução

da tensão superficial do que a dos biossurfactantes produzidos por B. subtilis em estudos

realizados por Kim et al. (1997) e Altmajer Vaz et al. (2012), obtendo concentrações

micelares críticas de 40 mg/L. Em contrapartida, os resultados reportados por Felix (2012) e

Oliveira et al. (2013) apresentaram CMC iguais a 12 e 10 mg/L, respectivamente.

Resultado próximo ao obtido no presente trabalho foi encontrado por Barros et al.,

(2007), ao estudarem a surfactina e suas propriedades químicas, tecnológicas e funcionais

para aplicações em alimentos, o qual apresentou CMC de 19,0 mg/L.

A partir dos dados apresentados é possível afirmar que a surfactina produzida

apresentou grande atividade superficial e baixa CMC, propriedades estas que a caracterizam

como um potencial agente tensoativo. Uma vez que, quanto menor o valor da CMC mais

eficiente será o biossurfactante, portanto, a surfactina produzida apresenta características

desejáveis para aplicação industrial (Bognolo, 1999).

Capítulo 6

Conclusões

88

6. Conclusões


6. Conclusões

A produção de surfactina por Bacillus subtilis UFPEDA 438 cultivada em meio

contendo melaço de cana apresentou melhores resultados para o ensaio realizado na

condição de 200 rpm, 36 º C e razão de aeração de 0,4, o qual se obteve valores de

concentrações de surfactina satisfatórios quando comparados aos valores reportados na

literatura, chegando a uma produção de 199,45 ± 0,13 mg/L em 24 h.

Pelo que foi verificado através da cinética de crescimento celular, consumo de

substrato e formação de produto, pode-se afirmar que embora na maior parte dos

ensaios a formação do produto foi parcialmente associada ao crescimento, em alguns

casos ela foi não associada (Ensaios B e C), evidenciando a influência da temperatura,

velocidade de agitação e razão de aeração na síntese da surfactina.

Em todos os ensaios apresentados neste estudo, verificou-se a presença de uma

expressiva quantidade residual de fonte de carbono ao final do processo fermentativo,

restando de 74,10 a 87,22% de substrato.

Os ensaios fermentativos mostraram que Bacillus subtilis UFPEDA 438 é um bom

produtor de biossurfactante e que o melaço de cana é um substrato viável para a

produção de biossurfactantes por esta cepa.

A iturina presente na maioria dos caldos de cultura de Bacillus subtilis UFPEDA 438

foi detectada em pequenas concentrações, variando de 0,69 a 1,3 mg/L.

O presente estudo apresentou resultados satisfatório em relação a sua capacidade de

formar emulsões frente a querosene, apresentando índice de emulsificação superior a

50%. Sugerindo que o biossurfactante produzido por B. subtilis UFPEDA 438 é um

potencial candidato para aplicação em estudos futuros.

O biossurfactante produzido apresentou Concentração Micela Crítica (CMC) de 20,73

mg/L, na qual foi capaz de reduzir a tensão superficial da água de 70,54 ± 0,03 para

28,69 ± 0,07 mN/m, caracterizando-se assim, como um biossurfactante eficaz.

Referências Bibliográficas

90




ABDEL-MAWGOUD, A. M.; ABOULWAFA, M. M.; HASSOUNA, N.A. Characterization

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Apêndice

113

Apêndice

APÊNDICE I

Curva de calibração da concentração da solução padrão de surfactina

y = 0,0018x + 0,0066

R² = 0,9967

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 100 200 300 400 500 600

Co

nce

ntr

açã

o d

e su

rfa

ctin

a (

mg

/mL

)

Áreax105

CURVA DE CALIBRAÇÃO DE SURFACTINA

114

Apêndice

APÊNDICE II

Curva de calibração da concentração da solução padrão de iturina

y = 0,0007x - 0,0585 R² = 0,9867

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

90 110 130 150 170 190 210 230

Co

nce

ntr

açã

o d

e i

turi

na

(m

g/m

L)

Áreax105

CURVA DE CALIBRAÇÃO DE ITURINA

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