i

Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro

Escola Nacional de Botânica Tropical

Programa de Pós-graduação Stricto Sensu

Dissertação de Mestrado

Análise dos padrões filogeográficos de Calophyllum brasiliense Cambess (Calophyllaceae)

Jordana Néri

Rio de Janeiro

2011

ii

Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro

Escola Nacional de Botânica Tropical

Programa de Pós-graduação Stricto Sensu

Análise dos padrões filogeográficos de Calophyllum brasiliense Cambess (Calophyllaceae)

Jordana Néri

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Botânica, Escola Nacional de Botânica Tropical, do Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para obtenção do título de mestre em Botânica.

Orientador: Fabio Rubio Scarano

Co-orientador: Fabiano Salgueiro

Rio de Janeiro

2011

iii

Análise dos padrões filogeográficos de Calophyllum brasiliense Cambess (Calophyllaceae)

Jordana Néri

Dissertação submetida ao corpo docente da Escola Nacional de Botânica Tropical, Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro - JBRJ, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre.

Aprovada por:

Prof. Dr. Fabio Rubio Scarano (Orientador) __________________

Prof (a) Dra. Maria Bernadete Lovato (UFMG)_________________

Prof. Dr. Rui Cerqueira (UFRJ) ___________________________

em 29/04/ 2011

iv

Néri, Jordana. N445a Análise dos padrões filogeográficos de Calophyllum brasiliense Cambess

(Calophyllaceae) / Jordana Néri. – Rio de Janeiro, 2011. xv, 71 f. : il. Dissertação (Mestrado) – Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio

de Janeiro/Escola Nacional de Botânica Tropical, 2011. Orientador: Fabio Rubio Scarano. Bibliografia. 1. Filogeografia. 2. Filogenia. 3. Calophyllaceae. 4. Calophyllum

brasiliense. I. Título. II. Escola Nacional de Botânica Tropical. CDD 575.01

v

À minha mãe

Laudicéia Néri

E aos meus avôs

Edith dos Santos Néri

Jacinto Néri (in memorian)

vi

AGRADECIMENTOS

À Deus, por me dar forças e perseverança para seguir sempre em frente e

conquistar meus objetivos, aos quais sem Ele, esta etapa seria muito mais difícil.

Aos meus orientadores,

Fabio Rubio Scarano por aceitar minha orientação, pelo suporte científico e

pelas sugestões e correções ao manuscrito.

Ao Fabiano Salgueiro, pela excelente orientação, por todo aprendizado e

acompanhamento diário para conclusão deste trabalho. Muito obrigada de coração!

Ao Instituto de Pesquisas do Jardim Botânico do Rio de Janeiro.

À Escola Nacional de Botânica Tropical (ENBT) pela vaga na casa de

estudantes, importante para minha estadia no Rio de Janeiro e desenvolvimento do meu

Mestrado.

À CAPES, pela bolsa de estudo concedida.

Ao Laboratório de Biologia Molecular Vegetal (LGMV) da UFRJ, sob

responsabilidade do Prof. Marcio Alves Oliveira, por me aceitar em seu Laboratório e

permitir as extrações do DNA e pela ajuda no seqüenciamento das amostras.

Agradeço a Lina Felix por todo auxílio nas extrações do material, pela amizade e

por sempre estar torcendo pelo meu sucesso. A Sinara, Sara, Stéfanie, Roberta e Fábia,

por toda ajuda prestada em todos os momentos que estive trabalhando no LGMV.

Obrigada de coração meninas!!!

A todos os técnicos do laboratório do LGMV pelo auxílio e suporte técnico.

Ao Prof. Turan, do Departamento de Biofísica da UFRJ, por conceder o uso do

seqüenciador, para parte das minhas amostras.

Ao Dr. Jean L. S. de Araújo da Embrapa Agrobiologia, por conceder

inicialmente o uso do sequenciador.

Ao Laboratório de Biologia Reprodutiva de Plantas, do Instituto de Pesquisas da

Amazônia (INPA), e à Prof. Maristerra Lemes pelos testes dos microssatélites de

cpDNA.

Ao Laboratório Integrado de Biologia Vegetal da UNIRIO por todo suporte para

o desenvolvimento deste trabalho.

A todos os Professores, Funcionários e amigos do Instituto de Biologia, sala 512

da UNIRIO. Aos alunos de IC, Gabriel, Igor e Alessandra, pelo carinho e ajuda nos

PCR’s.

vii

À Andréia Carina Turchetto Zolet, pela ajuda nas análises dos resultados e

sugestões ao trabalho. Sou sinceramente grata por todo carinho, disponibilidade e

atenção. Muito obrigada!

À Mariana Machado Saavedra, ao Claudio Nicoletti de Fraga e ao José Eduardo

Meireles, vulgo “Dudu” pela ajuda nas coletas das populações da Bahia. Obrigada pela

amizade e carinho e por fazer das nossas coletas sempre muito divertidas.

À Márcia Marques e a Fernanda Cardoso pela ajuda nas coletas no Paraná e pela

ótima receptividade. Valeu meninas!

À Geanna e ao Fabio pela ajuda nas coletas no Espírito Santo.

Ao Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMbio), pela

licença de coleta e autorização de exportação do material genético para Coréia.

A todos que estiveram envolvidos nas coletas, e que por falha na minha memória

aqui não foram citados, o meu muito obrigado.

À minha amiga Karina Hmeljevski, pelo apoio e incentivo. Obrigada por sua

amizade, pelas comidas gostosas, pelas duras faxinas na casa 06, pelos bons papos e

pelas discussões sobre genética de populações e filogeografia. Vou carregar para sempre

sua amizade!

Ao Michel Barros pela revisão do Abstract.

Aos amigos que se fizeram presentes, de alguma forma, ao longo desta

caminhada: Ana Luiza Moura, Ana Paula Nogueira (IPGávea), Alessandro do Rosário,

Claudio Nicoletti, Daniele, Elaine Damasceno, Eline Martins, Eduardo Leal, Elidiene

Seleme, Flávia, Flaviane, Jacira Lima, Jussara, Karina Hmeljevski, Luciano de Araújo,

Michel Barros, Mariana Saavedra, Maria Paula, Paulinha, Cecília. Valeu galera!

Em especial:

À minha Mãe, Laudicéia Neri, por todo carinho, pelo amor incondicional e por

apoiar as minhas decisões, te amo Mãe!

A toda a minha família, que sempre esteve torcendo por mim e que me

sustentaram em Orações!

Ao meu namorado, Leonardo, pelo carinho e apoio, obrigada meu Amor!

A todos, os meus sinceros agradecimentos.

viii

“... mas a vereda dos justos é como a Luz da

aurora que vai brilhando mais e mais até ser dia

perfeito” Prov. 4:18

ix

SUMÁRIO

RESUMO ..............................................................................................................................................X

ABSTRACT .........................................................................................................................................XI

LISTA DE FIGURAS .........................................................................................................................XII

LISTA DE TABELAS ...................................................................................................................... XIV

LISTA DE ABREVIAÇÕES ............................................................................................................. XV

I. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................. 1

II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................................ 3

II.1 FILOGEOGRAFIA DE PLANTAS NEOTROPICAIS.................................................................................. 3 II.2 MUDANÇAS CLIMÁTICAS DO QUATERNÁRIO .................................................................................. 5 II.3 FLUXO GÊNICO VIA SEMENTES E PROCESSOS HISTÓRICOS DEMOGRÁFICOS ....................................... 7 II.4 MARCADORES MOLECULARES PARA ESTUDOS FILOGEOGRÁFICOS ................................................... 9

III. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................... 13

III.1 ESPÉCIE ESTUDADA ................................................................................................................... 13 III.2 LOCAIS DE COLETA .................................................................................................................... 17 III.3 COLETA DO MATERIAL VEGETAL ............................................................................................... 20 III. 4 OBTENÇÃO DOS DADOS MOLECULARES ...................................................................................... 21

A- Extração do DNA genômico total ............................................................................................ 21 B- Quantificação do DNA ............................................................................................................ 21 C-Amplificação e análise de locos microssatélites do genoma do cloroplasto (cpDNA) ................. 22 D-Amplificação e análise de regiões não-codificadoras do genoma do cloroplasto (cpDNA). ........ 23

D.1 Seleção das regiões não-codificadoras do cpDNA ............................................................................. 23 D.2 Amplificação via PCR das regiões não-codificadoras do cpDNA ....................................................... 23 D.3 Purificação dos produtos da PCR ...................................................................................................... 24 D.4 Reação de sequenciamento dos fragmentos amplificados ................................................................... 24 D.5 Edição e alinhamento das sequências ................................................................................................ 25

III.5 ANÁLISES DOS DADOS MOLECULARES ........................................................................................ 26 A- Diversidade e estrutura filogeográfica ...................................................................................... 26 B-Análises Demográficas ............................................................................................................. 27

IV. RESULTADOS............................................................................................................................. 29

IV. 1 EXTRAÇÃO DO DNA GENÔMICO TOTAL .................................................................................. 29 IV.2 MICROSSATÉLITES DO GENOMA DO CLOROPLASTO (CPDNA).................................................. 29 IV.3 SEQUÊNCIAS DE REGIÕES NÃO-CODIFICADORAS DO GENOMA DO CLOROPLASTO (CPDNA) ............ 33 IV.4 DIVERSIDADE E ESTRUTURA FILOGEOGRÁFICA........................................................................... 37 IV.5 HISTÓRIA DEMOGRÁFICA .......................................................................................................... 45

V. DISCUSSÃO .................................................................................................................................. 48

V.1 PADRÕES FILOGEOGRÁFICOS DE C. BRASILIENSE ........................................................................... 48

VI. CONCLUSÕES ............................................................................................................................ 55

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................... 57

ANEXOS............................................................................................................................................. 70

ANEXO 1 – COMPARAÇÃO PAR A PAR DO FST ENTRE POPULAÇÕES DE C. BRASILIENSE ........................... 70 ANEXO 2 - FIGURAS DOS DIFERENTES AMBIENTES DE OCORRÊNCIA DE C. BRASILIENSE. ........................ 71

x

RESUMO

A identificação dos padrões filogeográficos, principalmente de espécies situadas em

diferentes domínios fitogeográficos, permite o conhecimento das relações históricas e

atuais entre populações, e devem ser analisados sob a perspectiva ecológica e

biogeográfica, a fim de entender os processos que moldam os padrões de distribuição da

variação genética. Calophyllum brasiliense Camb. é uma espécie de áreas sujeitas a

inundação, tendo portanto o fator hídrico como determinante da sua distribuição. Esta

espécie ocorre do México ao Paraguai e no Brasil da Amazônia à Santa Catarina,

estando presente em todas as bacias hidrográficas do país. Neste estudo foram

investigados os padrões filogeográficos de populações naturais de C. brasiliense por

meio da análise de duas regiões do genoma do cloroplasto (cpDNA): atpH-atpI e psbA-

trnH. No total foram analisados 192 indivíduos em 24 populações, abrangendo

diferentes áreas fitogeográficas, com um total de dez haplótipos identificados. A maior

parte da variação se encontra entre as populações, sendo observada uma forte

estruturação genética entre populações de C. brasiliense (Gst = 0,935). O

compartilhamento de um mesmo haplótipo pela maioria das populações da Mata

Atlântica indica recente expansão demográfica e baixa diversidade genética nesta região

possivelmente causada por efeito fundador, durante os processos de expansão da

vegetação no período interglacial do pleistoceno. Os resultados apontam que bacias

hidrográficas na Mata Atlântica não são limitantes ao fluxo gênico em C. brasiliense,

reforçando a noção de que a quiropterocoria (dispersão por morcegos) e a hidrocoria

(dispersão pela água) contribuem efetivamente para a dispersão de sementes e a

colonização de novas áreas. A ocorrência de um haplótipo em comum entre Mata

Atlântica e Cerrado levanta a hipótese de dispersão via florestas de galeria entre estes

domínios fitogeográficos. A forte quebra filogeográfica entre a América Central e as

populações do Brasil sugere um longo período de isolamento entre estas áreas. Os

padrões de estruturação filogeográfica encontrados no presente estudo parecem estar

relacionados ao modo dispersão de sementes da espécie e aos eventos climáticos do

Quaternário.

Palavras-Chave: Calophyllum brasiliense; cpDNA; filogeografia; expansão

demográfica; Mata Atlântica; Cerrado.

xi

ABSTRACT

The identification of phylogeographic patterns, especially of species located in

different phytogeographical domains, allows the knowledge of historical and current

relations between populations, and should be analyzed under biogeographical and

ecological perspectives, aiming to understand the processes that shape the distribution

patterns of genetic variation. Calophyllum brasiliense Camb. is a species of flooded

areas, having presence of water as the factor determining its distribution. This species

occurs from Mexico to Paraguay and in Brazil from the Amazon to Santa Catarina,

present in all river basins in the country. In this study phylogeographic patterns in

natural populations of C. brasiliense where investigated, through the analysis of two

regions of the chloroplast genome (cpDNA): atpH-atpI and psbA-trnH. A total of 192

individuals in 24 populations were analyzed, covering different phytogeographical

areas, with ten haplotypes identified. Most of this variation is found among populations,

being observed a strong genetic structure among populations of C. brasiliense (Gst =

0,935). The sharing of the same haplotype by the majority of the populations of the

Atlantic Forest indicate recent demographic expansion and low genetic diversity in this

region possibly caused by a founder effect, during the expansion processes of vegetation

in the Pleistocene interglacial period. The results show that river basins in the Atlantic

Forest are not limiting to the gene flow in C. brasiliense, reinforcing the notion that

chiropterochory (bats by dispersion) and hydrochory (water by dispersion) contribute

effectively to seed dispersal and colonization of new areas. The occurrence of a

common haplotype between Atlantic Forest and Cerrado sustains the hypotheses of

dispersion via gallery forests between these phytogeographical domains. The sharp

phylogeographical breaking between Central America and the populations of Brazil

suggests a long period of isolation between these areas. The patterns of

phylogeographical structure found in this study seems to be related to the way of seed

dispersal in this species and to the climatic events of the Quaternary.

Keywords: Calophyllum brasiliense; cpDNA; phylogeography; demography

expansion; Atlantic Forest; Cerrado.

xii

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – Ampla distribuição geográfica de C. brasiliense na América Central e América do Sul. ....................................................................................................

14

FIGURA 2 – (A) Indivíduo adulto de C. brasiliense; (B) Detalhe do tronco de C. brasiliense; (C) Flor hermafrodita de C. brasiliense. (D) fruto do tipo drupa. ..........

15

FIGURA 3 – Móvel construído a partir da madeira de C. brasiliense. ..................... 16 FIGURA 4 – Localização das áreas de coleta das populações de C. brasiliense. Os números indicam os locais da onde procederam as coletas do material, e estão identificados ao lado da figura do mapa. ....................................................................

17

FIGURA 5- Procedência das coletas do câmbio (2A) e folha (2B) de C.brasiliense................................................................................................................

20

FIGURA 6 – Quantificação do DNA extraído a partir de folha de C.brasiliense em gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídio. As colunas L1 e L2 referem-se aos padrões de peso molecular do fago lambda (λ): L1=100ng e L2=200ng. As demais colunas referem-se ao DNA extraído da folha de 12 indivíduos de C.brasiliense (colunas 1 a 12). ...................................................................................

29

FIGURA 7 – Otimização das condições de amplificação dos sete locos de cpSSR analisados, para dois ou quatro indivíduos de C. brasiliense: (A) ccmp2; (B) ccmp3; (C) ccmp4; (D) emcrc74; (E) emcrc67; (F) ccmp6 e ccmp7, em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio. A coluna P refere-se ao padrão do DNA ladder de 1Kb plus. As colunas 1 à 5 referem-se ao DNA amplificado. As setas indicam o tamanho dos fragmentos em pares de base (pb). ...............................

31

FIGURA 8 – Eletroferogramas mostrando os alelos amplificados para quatro locos cpSSR de indivíduos de C. brasiliense pertencentes a quatro populações (Pontal do Sul-Paraná; Poço das Antas-Rio de Janeiro; Ilhéus-Bahia e Costa Rica). Cada pico representa um alelo. O tamanho dos alelos é indicado na barra superior em pares de base. A-D (ccmp2); E-H (ccmp3); I-M (emcrc67) e N-Q (emcrc74). ........................

32

FIGURA 9 – Otimização das condições de amplificação das regiões não-codificadoras do cpDNA de C. brasiliense utilizando os pares de iniciadores (A) rpl16; (B) psbA-trnH; (C) trnL-trnF; (D) atpH-atpI, em gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídio. A coluna P refere-se ao padrão de DNA lambda pstI, as demais colunas referem-se ao DNA amplificado. .........................................

34

FIGURA 10 - Polimorfismo de sequências de DNA da região aptH-atpI. Na área destacada observa-se polimorfismo do tipo deleção/inserção. ......................................................................................................................................

35

FIGURA 11 - Polimorfismo de seqüencias de DNA da região psbA-trnH . Na área destacada observa-se um polimorfismo do tipo substituição G-T...............................

35

xiii

FIGURA 12 - Eletroferogramas mostrando parte da sequência nucleotídica da região atpH-atpI para dois indivíduos de C. brasiliense. As setas indicam uma substituição (G - C). ....................................................................................................

36

FIGURA 13 - Mapa de distribuição dos 10 haplótipos identificados (atpH-atpI+ psbA-trnH) em 24 populações de C. brasiliense. As cores dos círculos indicam o haplótipo e o tamanho do círculo indica a frequência de ocorrência do haplótipo por população...............................................................................................................

39

FIGURA 14 - Rede de haplótipos construída com base na análise de duas regiões de cpDNA (atpH-atpI e psbA-trnH). As cores indicam os haplótipos e o tamanho do círculo a freqüência de ocorrência do haplótipo (considerando todos os 192 indivíduos das 24 populações). Os números representam as posições das mutações. Cada número é um passo mutacional. Nodos em vermelho representam vetores médios (haplótipos não amostrados ou haplótipos ancestrais extintos)........................................................................................................................

40

FIGURA 15 - Análise Bayesiana, de indivíduos de C. brasiliense para o modelo de agrupamento k=6. Os clusters genéticos, k=6, são indicados por diferentes cores. ...........................................................................................................................

41

FIGURA 16 - Identificação dos nove filogrupos de C. brasiliense, segundo a análise da SAMOVA. Algarismos em romanos nos círculos indicam o filogrupo.....

42

FIGURA 17 - Projeção das oito barreiras identificadas pelo programa Barrier 2.2. A Seta preta indica uma barreira que coincide com o Rio Grande, localizado entre a população BAR e as populações: SDE, COR e SIL; Seta vermelha indica uma barreira separando o agrupamento VIII (ECA, AND, SAU) dos filogrupos II e VII................................................................................................................................

44

FIGURA 18 - Distribuição Mismatch para todas as populações de C. brasiliense como um único grupo. Os valores observados estão como o esperado, distribuídos de forma unimodal. .....................................................................................................

46

FIGURA 19 - Distribuição Mismatch para as populações da Mata Atlântica. Os valores observados estão como o esperado, distribuídos de forma unimodal. ...........

47

FIGURA 20 - Figura 20: (A) Localização dos haplótipos por bacias hidrográficas no Brasil. ■ Bacia Amazônica; ■ Bacia do São Francisco; ■ Bacia do Atlântico leste; ■ Bacia do Atlântico Sudeste (B) Detalhe da Bacia do São Francisco e distribuição dos haplótipos. ........................................................................................

52

xiv

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Populações amostradas; código das populações; fitofisionomia abrangente; número de indivíduos analisados e localização geográfica. ................

18

TABELA 2 - Protocolo de reação de sequenciamento utilizando o Kit Dyenamic ET Dye Terminator Cycle (MegaBAce DNA analysis Systems). ...........................

25

TABELA 3 - Características dos sete locos cpSSR testados para C. brasiliense: Ta=temperatura de anelamento; pb = pares de base ...............................................

30

TABELA 4 - Características das seis regiões de sequências não-codificadoras do cpDNA utilizadas para amplificação em C. brasiliense. Ta=temperatura de anelamento; pb= pares de base.................................................................................

33

TABELA 5 - Posições variáveis das sequências alinhadas das duas regiões de cpDNA (aptH-atpI+ psbA-trnH) com os 10 haplótipos identificados de C. brasiliense. Os traços (_) indicam gaps, os pontos indicam as bases nucleotídicas que são iguais. .........................................................................................................

37

TABELA 6 - Parâmetros de diversidade molecular das populações de C. brasiliense. N (tamanho da população); S (número de sites polimórficos); H (número de haplótipos); h (diversidade haplotípica) e π (diversidade nucleotídica)............................................................................................................

38

TABELA 7 - Resultados da Análise de Variância Molecular baseado no cpDNA (atpH-atpI+ psbA-trnH) de C. brasiliense. .............................................................

43

TABELA 8 - índices de diferenciação genética para cloroplasto e núcleo de C. brasiliense. ..............................................................................................................

45

TABELA 9 - Parâmetros de expansão demográfica para cada população de C. brasiliense. γ (Distribuição Mismacht)....................................................................

45

TABELA 10 - Parâmetros do teste de expansão Demográfica de grupos e de todas as populações de C. brasiliense. ....................................................................

46

TABELA 11 - Parâmetros do teste de demografia por Bioma: Mata Atlântica, Cerrado, Caatinga, Amazônia e Floresta Tropical da Costa Rica............................

47

xv

LISTA DE ABREVIAÇÕES

ºC graus Celsius

CTAB Brometo de cetiltrimetilamônio

DNA Ácido desoxirribonucléico

dNTP Desoxiribonucléico trisfotato

EDTA Ácido etilenodianinotetracético

ng nanograma

µg micrograma

mg miligrama

ml mililitro

µl microlitro

M molar

mM milimolar

pb pares de base

PCR reação em cadeia da polimerase

pH potencial hidrogênico

pmol picomoles

PVP polivinilpirrolidona

rpm rotações por minuto

TAE tampão tris, acetato e EDTA

TE tampão tris EDTA

Tris tri- hidroximetil aminometano

V volts

1

I. INTRODUÇÃO

A filogeografia é um campo de estudo que vem crescendo nas últimas duas

décadas, desde que foi proposta em 1987 pelo biólogo John C. Avise. Pelo fato de ser

uma disciplina que lida com o arranjo espacial das linhagens genéticas, a

“filogeografia” tornou-se um campo de estudo conveniente para tratar relações

genealógicas dentro das dimensões espaciais e temporais da microevolução (Avise,

2009). A arquitetura genética espacial de qualquer espécie é o resultado complexo de

fatores demográficos contemporâneos, forças ecológicas e de fatores biogeográficos, os

quais vêm atuando ao longo da história evolutiva de uma espécie (Walker & Avise,

1998). O uso dos genomas citoplasmáticos (cpDNA - cloroplasto e mtDNA -

mitocondrial) é extremamente adequado em estudos filogenéticos. Devido à herança

uniparental e ao fato de não ocorrer recombinação nestes genomas, linhagens podem ser

identificadas e inferências filogenéticas podem ser feitas ao nível intra-específico

(Walker & Avise, 1998; Ouborg et al., 1999). Em plantas, o uso de marcadores

moleculares do genoma do cloroplasto, que apresenta herança uniparental materna para

a maioria das angiospermas, tem mostrado ser uma ferramenta adequada para estudos

filogeográficos. O polimorfismo encontrado neste genoma tem permitido identificar

padrões filogeográficos em espécies vegetais e assim conhecer os processos envolvidos

na formação de tais padrões (Hamza, 2010).

Poucos ainda são os estudos filogeográficos de plantas nos neotrópicos,

principalmente daquelas com ampla distribuição (Lira et al., 2003; Lorenz-Lemke et al.,

2005; Andrade et al., 2007; Dick et. al., 2007; Dick & Heuertz, 2008; Palma-Silva,

2008; Colevatti et al., 2009; Ramos et al., 2009; Lemes et al., 2010; Ribeiro et al.,

2011). O conhecimento dos padrões filogeográficos de espécies com ampla distribuição

pode contribuir ao conhecimento da história evolutiva das populações, principalmente

daquelas situadas em diferentes complexos vegetacionais. A identificação destes

padrões pode dar suporte ao conhecimento da história de formação dos biomas, e

contribuir para a conservação dos mesmos.

Os ambientes florestais neotropicais variam muito em relação à duração,

freqüência e amplitude do alagamento. Em várzeas e igapós amazônicos, a inundação

desses locais é sazonal podendo chegar a cobrir a copa das árvores durante

aproximadamente seis meses. Já nas florestas da planície litorânea, bastante encontradas

no Sudeste e Sul do Brasil, a inundação pode ser permanente ou periódica atingindo

2

alguns centímetros acima do nível do solo (Scarano, 1998). Em florestas ciliares, mais

comuns no interior, a inundação varia desde sazonal, nas florestas de galeria até o

alagamento permanente das florestas higrófilas. Calophyllum brasiliense Camb. é uma

espécie de ampla distribuição, típica destas áreas sujeitas ao alagamento (Reitz et al.,

1978). A sobrevivência desta espécie em áreas inundadas está associada a um conjunto

de características que vão desde a dispersão de sementes em períodos favoráveis à posse

de atributos morfo-anatômicos que possibilitam lidar com a baixa disponibilidade de

oxigênio no substrato decorrente da inundação (Scarano et al., 1997; Duarte et al.,

2005).

Por apresentar madeira de qualidade, esta espécie apresenta um alto valor

econômico, além de ser extremamente utilizada em programas para reflorestamento de

matas ciliares (Durigan & Silveira, 1999). Devido à sua ampla distribuição abrangendo

diferentes domínios fitogeográficos, associado às suas características ecofisiológicas

típicas de ambientes alagados, o estudo filogeográfico de C. brasiliense permite testar

efeitos de diferentes processos que podem ter influenciado a estrutura genética

populacional.

Tendo por objetivo determinar os padrões filogeográficos em populações

naturais de C. brasiliense através do polimorfismo de regiões do genoma do cloroplasto,

o presente trabalho procurou responder três perguntas: (1) As bacias hidrográficas

atuam como barreiras ao fluxo gênico entre as populações? (2) Qual a influência dos

eventos históricos do quaternário na atual estrutura genética de C. brasiliense? (3) As

relações genealógicas dos haplótipos situados em diferentes domínios fitogeográficos

podem inferir relações histórico-evolutivas entre os biomas amostrados (Mata Atlântica,

Floresta Amazônica, Cerrado e Caatinga)?

3

II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

II.1 Filogeografia de plantas neotropicais Além das mudanças na estrutura genética das populações causadas por

oscilações climáticas ao longo de uma escala temporal geológica, na escala temporal

ecológica, a perda e fragmentação de habitats têm também exercido grande impacto,

especialmente diante das profundas alterações na maior parte de áreas naturais nas

florestas neotropicais, o que têm levado a uma redução do tamanho das populações

naturais. A redução das paisagens naturais pode levar à diminuição do potencial

evolutivo das espécies, devido à perda de diversidade genética, tornando-as mais

vulneráveis a eventos ambientais demográficos e genéticos (Keller & Waller, 2002).

Desta forma, a importância da variação genética para a adaptação, viabilidade e

evolução das populações naturais, tem sido aceita como foco para a conservação

(Wilson et al., 2009). A diversidade genética é reconhecida como um componente

fundamental da biodiversidade, e tem sido incorporada nas estratégias para conservação

(Moritz & Faith, 1998).

De acordo com Moritz (2002) as estratégias de conservação devem levar em

conta os padrões de distribuição da diversidade genética e os processos evolutivos

envolvidos na formação destes padrões. A reconstrução dos padrões evolutivos,

principalmente em níveis populacionais, tem sido de grande importância para

determinação de estratégias adequadas para a conservação das espécies (Palma-Silva,

2008). Neste contexto, a Filogeografia permite inferir os processos evolutivos e

demográficos que moldam o padrão de distribuição da variação genética.

A Filogeografia examina os princípios e processos que determinam a

distribuição dos padrões intra-específicos da variabilidade genética ao longo da

distribuição geográfica (Avise, 2000). A abordagem filogeográfica proporciona uma

nova visão do papel do fluxo gênico na estrutura genética das populações de plantas.

Tal abordagem permite a detecção de eventos de fluxo gênico histórico, podendo

discriminar padrões genéticos causados por eventos de fluxo gênico atual ou ancestral

(Schaal et al., 1998). Também fornecem informações que permitem o entendimento da

evolução das diferentes linhagens e sua relação com os eventos históricos de

colonização, determinantes de sua diversificação (Olsen & Schaal, 1999).

Estudos filogeográficos na Mata Atlântica relatam populações do nordeste do

Brasil como um componente filogeográfico distinto daqueles localizados no Sudeste e

4

Sul (Lira et al., 2003; Andrade et al., 2007; Cabanne et al., 2007; Carnaval et al., 2009,

Ramos et al., 2009; Zolet, 2009; Ribeiro et al., 2011), e uma recente expansão para o

Sul da Mata Atlântica (Cabanne et al., 2007; Palma-Silva, 2008; Carnaval et al., 2009;

Zolet, 2009). Padrões filogeográficos observados em espécies animais têm mostrado a

existência de uma descontinuidade genética na parte central da Mata Atlântica, que vai

do estado da Bahia em direção ao estado de São Paulo: aves (Xiphorhynchus fuscus;

Cabanne et al., 2007), pequenos mamíferos (Matachirus nudicaudatus; Costa, 2003),

preguiças (Bradypus torquatus; Lara-Ruiz, et al., 2008, Bradypus variegates; Moraes-

Barros et al., 2006), serpentes (Brothrops jararaca; Grazziotin et al., 2006). Estes

estudos mostram que existe uma divergência marcante que separa geneticamente

populações do Nordeste (Bahia) das populações do sudeste da Mata Atlântica (Espírito

Santo, Rio de Janeiro e São Paulo). Nestes trabalhos, o ponto de divisão genética

localiza-se na região entre as Bacias do rio Doce (Espírito Santo) e do rio Jequitinhonha

(Bahia). Em espécies vegetais, alguns trabalhos também têm identificado esta

descontinuidade genética ao longo da Mata Atlântica com quebra filogeográfica

localizada principalmente na parte central da Mata Atlântica (Lira et al., 2003; Ramos et

al., 2009; Novaes et al., 2010; Ribeiro et al., 2011). Entretanto, este ponto não é

consenso, pois ainda são poucos os estudos, para espécies vegetais desta região da Mata

atlântica.

A persistência de uma unidade filogeográfica no nordeste, distinta do sul-sudeste

(Moraes-Barros, 2006; Cabanne et al., 2007; Ramos et al., 2009; Zolet, 2009; Ribeiro et

al., 2011) também foi identificada em estudos de modelagem climática que relatam a

região central da Bahia e uma pequena área em Pernambuco como refúgios florestais,

prováveis áreas de maior estabilidade climática durante o Quaternário (Carnaval &

Moritz, 2008; Carnaval et al., 2009). No entanto, resultados divergentes foram

encontrados para Plathymenia reticulata (Novaes et al., 2010). No caso dessa espécie

vegetal, todas as populações da Bahia, inclusive as do norte do Espírito Santo e nordeste

de Minas Gerais, apresentaram o mesmo haplótipo. Estes resultados sugerem a hipótese

que diferentes espécies podem ter respondido de forma diferente às oscilações

Climáticas do Quaternário.

No sudeste do Cerrado, a filogeografia de duas espécies de árvores, Caryocar

brasiliense (pequi - Colevatti et al., 2003) e Hymenaea stigonocarpa (jatobá do cerrado

- Ramos et al., 2007) revelou a evidência de colonização recente do sul do Cerrado, a

partir de fontes do Norte, que compreende a região Central-Norte de Minas Gerais.

5

Estes estudos têm sugerido que a redução do sudeste do Cerrado, durante a fase de

contração das florestas tropicais no pleistoceno, teve forte influência na atual estrutura

genética de espécies de árvores nesta parte do Neotrópico.

Na Amazônia, um estudo conduzido com populações de Swietenia macrophylla

(mogno - Lemes et al., 2010) com base em marcadores microssatélites do cloroplasto

detectou uma forte quebra filogeográfica separando populações da Amazônia das

populações da América Central. Além disso, observou-se também uma grande diferença

na estrutura filogeográfica das populações destas duas florestas. A estruturação genética

encontrada para as populações de mogno da América Central foi bem mais fraca (índice

de estruturação com base no genoma do cloroplasto - Fstc = 0,360) do que a

estruturação encontrada para as populações da Amazônia (Fstc = 0,906). Segundo os

autores, a história climática destas duas áreas podem ter influenciado os padrões de

estruturação genética divergentes observados. A fraca estrutura filogeográfica das

populações da América Central foi explicada pela maior instabilidade climática durante

o Pleistoceno e pelos constantes furações, que possivelmente contribuíram para a

dispersão à longa distância das sementes. Na Amazônia, a maior estabilidade climática

durante o Pleistoceno e a ausência de furacões podem ser o explicativo da alta

diversidade e forte estrutura genética das populações nesta região.

II.2 Mudanças Climáticas do Quaternário As mudanças climáticas do Quaternário ocorridas durante os últimos 2,5 milhões

de anos desempenharam um papel importante na mudança geográfica e distribuição das

espécies de plantas (Comes & Kadereit, 1998). Tais mudanças se deram pela alternância

cíclica de períodos mais frios e quentes, os chamados ciclos glaciais e interglaciais,

respectivamente.

Estas oscilações aconteceram devido às mudanças nas taxas de interceptação e

absorção da radiação solar pela superfície da Terra, controladas por ciclos astronômicos

conhecidos como ciclos de Milankovitch. Durante estes períodos havia diminuição

(período interglacial) e crescimento (período glacial) das regiões polares, que

ocasionaram subida (transgressão) ou descida (regressão) do nível do mar (Brown &

Lomolino, 2006). Acredita-se que esta dinâmica tenha reduzido parte das florestas

tropicais a refúgios isolados (durante os períodos glaciais), e que os organismos isolados

6

nestes refúgios poderiam ter divergido e originado novas linhagens (Haffer & Prance,

2002).

Dados paleoambientais de pólen e dados de radiocarbono mostram que durante o

Último Máximo Glacial do Pleistoceno (entre 23.000 - 11.000 anos A.P), a região do

Planalto-Sul do Brasil teve a predominância de uma vegetação de campos, onde hoje

domina a Floresta de Araucária. Neste período, pequenas populações de Araucária

ficaram restritas a refúgios em áreas mais úmidas. A região Sudeste do Brasil também

foi marcada por uma forte redução da paisagem, com uma larga predominância de

vegetação campestre, que hoje compreende as Florestas Estacionais Semideciduais, o

que sugere um clima mais seco e frio neste período (Behling, 2002). Assim como as

florestas de Araucárias, as matas tropicais da costa brasileira estavam restritas a refúgios

ecológicos (Behling, 2002). Provavelmente o deslocamento de áreas florestais ao longo

do eixo norte-sul se fazia através das florestas de galeria junto aos cursos dos rios

(Behling, 2002). No Sudeste do Brasil a presença de árvores estava restrita às áreas de

baixa altitude entre manchas com condições mais favoráveis (Behling et al., 2007).

Devido às condições mais frias, durante o Último Máximo Glacial Pleistoceno a

região norte do planalto do Sudeste Brasileiro foi substituída pelo Cerrado. No início do

Holoceno (11.000-10.000 anos A.P), quando o clima se tornou mais úmido e favorável,

houve migração de elementos do Norte da Mata Atlântica para o Sul, e nesta época o

cerrado foi substituído pela Floresta Estacional Semidecidual (Behling et al., 2007).

Além da dinâmica de temperatura ocasionada pelos ciclos glaciais e interglaciais, a

Mata Atlântica sofreu forte fragmentação devido às transgressões e regressões

ocasionadas pela elevação e diminuição do nível do mar (Behling & Negrelle, 2001).

Estudos florísticos sob o ponto de vista das mudanças climáticas do Quaternário

discutem a distribuição das florestas de galeria no Cerrado como um corredor entre as

duas grandes formações de floresta (Floresta Atlântica e Floresta Amazônica), pelo fato

de espécies nestas florestas de galerias estarem presentes tanto na Floresta Atlântica

como na Amazônica, como no caso de C. brasiliense (Oliveira-Filho & Ratter, 1995).

Rizzini (1963; 1997) afirma que as florestas de galeria, junto com outras formações

interioranas no Cerrado, são extensões da grande floresta Atlântica. Oliveira-Filho &

Ratter (1995) sugeriram que a rede de Florestas de Galeria do Brasil Central parece

conectar no sentido noroeste-sudeste a Floresta Amazônica à Floresta Atlântica.

Segundo estes autores a ocorrência de espécies endêmicas de florestas de galeria aponta

para a sobrevivência destas áreas de florestas durante as glaciações.

7

Muitos estudos têm procurado entender o efeito destas mudanças climáticas na

estrutura genética das espécies vegetais de Floretas Temperadas e Tropicais (Comes &

Kadeiret, 1998; Olsen, 2002; Lorenz-Lemke et al., 2005; Provan & Bennett, 2008;

Ramos et al., 2009; Lemes et al., 2010; Ribeiro et al., 2011). De um modo geral, tais

mudanças afetaram a estrutura e organização da diversidade genética das populações

naturais devido a mudanças nas taxas de migração (fluxo gênico), fragmentação e

isolamento das populações.

II.3 Fluxo gênico via sementes e processos históricos demográficos O fluxo gênico, tanto via pólen quanto via semente, e os eventos históricos

ocorridos no passado são processos determinantes na diversidade genética de

populações naturais contemporâneas. Estes processos, juntamente com a ação da deriva

genética e da seleção natural, são fatores evolutivos relevantes para explicar a

distribuição geográfica da diversidade genética (Loveless & Hamrick, 1984). A

interação destes fatores, tanto do âmbito genético quanto demográfico, dentro de um

contexto geográfico se reflete na estrutura genética das populações (Hamrick & Godt

1992; Oddou-Muratorio et al., 2004).

O fluxo gênico em plantas é realizado pelos mecanismos de dispersão do pólen e

da semente, os quais influenciam a estrutura genética espacial das populações. No

entanto, quando se quer estabelecer rotas de colonização da espécie, e traçar relações

filogenéticas entre populações, a análise do fluxo gênico via semente é o mais

adequado. Uma vez que as sementes são as que colonizam novas áreas, rotas de

dispersão podem ser analisadas e tal avaliação é feita através do uso de marcadores

genéticos plastidiais. No caso das sementes, existem vários tipos de mecanismos de

dispersão, sendo que para C. brasiliense os mais importantes parecem ser: a dispersão

por animais, principalmente os morcegos (Fischer & Santos, 2001) e a dispersão pela

água – hidrocoria (Scarano et al., 1997).

Segundo Hamrick & Nalson (1996), espécies com ampla capacidade de

dispersão, tais quais as que possuem sementes dispersas por animais que cobrem longas

distâncias, apresentam uma distribuição da variação genética homogênea dentro das

populações, não refletindo estruturação. Além disso, em tais espécies a estruturação

genética pode ocorrer ao longo da escala geográfica que tal espécie se encontra. Quando

o fluxo gênico é restrito a pequenas distâncias, como no caso de sementes dispersas por

8

animais que percorrem curtas distâncias, o nível de diferenciação genética entre

populações poderá aumentar em função da distância espacial entre elas. Neste caso, tais

populações serão mais suscetíveis a deriva e ao fluxo gênico limitado, aumentando a

diferenciação entre populações (Loveless & Hamrick 1984; Hamilton 1999a). Os

frugívoros, tais como os morcegos, são importantíssimos como agentes efetivos para a

dispersão de sementes, levando-as a longas distâncias e possibilitando a colonização e

regeneração de novas áreas (Figliolia & Kageyama, 1995). Os frutos de C. brasiliense

são dispersos por morcegos (Artibeus lituratus, A. obscurus, Carollia perspicillata e

Pygoderma bilabiatum) que comem a polpa dos frutos e descartam as sementes sobre

poleiros de alimentação (Fischer & Santos, 2001) o que pode contribuir para uma

distribuição espacial agregada de indivíduos e isso se refletirá na estrutura genética das

populações. Um estudo conduzido na Ilha do Cardoso, São Paulo, observou que os

morcegos do gênero Artibeus removem os frutos e comem a polpa de C. brasiliense,

agindo como legítimos dispersores. Apesar de muitos frutos terem sido jogados

próximos à árvore parental, alguns foram encontrados mais distantes (Mello et al.,

2005).

A dispersão pela água também assume um papel importante na estrutura

genética de espécies de plantas. Espécies que apresentam este mecanismo de dispersão

devem ter adaptações especiais na semente, como por exemplo, tolerância à baixa

disponibilidade de oxigênio devido ao alagamento, envoltório da semente com

capacidade de flutuação para atingir longas distâncias, dentre outros (Ridley 1930). De

acordo com Kubitzki & Ziburski (1994) as sementes de plantas de florestas inundáveis

mantêm-se flutuantes até o final do período de inundação, e tais sementes apresentam

estruturas que as confere a flutuabilidade. Marques & Joly (2000a) verificaram que as

sementes de C. brasiliense apresentam-se viáveis, mesmo quando estão encobertas pela

água e germinam quando o nível da água reduz.

De acordo com Honnay et al. (2010), o fluxo de sementes entre populações ao

longo de rios pode seguir dois principais padrões: 1- predomínio de dispersão entre

populações adjacentes ao longo do leito de um mesmo rio, apresentando um modelo

steppping stone unidirecional do fluxo de sementes. Neste caso espera-se um aumento

na diferenciação genética com o aumento da distância geográfica entre as populações.

2- predomínio de dispersão de sementes a longa distância entre populações não-

adjacentes. Este modelo resultaria na ausência de isolamento por distância e baixa

diferenciação genética entre populações (Bohrer et al., 2005).

9

Segundo Looy et al. (2009), áreas sujeitas a cheias extremas, principalmente

aquelas situadas nos cursos de rios, podem contribuir para a dispersão à longa distância

de sementes e promover a colonização de novas áreas. Neste caso, o padrão espaço-

temporal da diversidade genética pode estar fortemente relacionado ao histórico da

dinâmica do rio.

Além do fluxo gênico mediado pela dispersão de sementes, eventos históricos

demográficos podem afetar os padrões de distribuição da variabilidade genética de

populações naturais (Dutech et al., 2004). Eventos históricos, como fragmentação

seguida de rápida expansão na distribuição de espécies, podem modificar os padrões da

distribuição da variabilidade genética. A deriva gênica e a redução do fluxo gênico

durante períodos de contração da vegetação podem aumentar a divergência genética

entre populações, principalmente daquelas que estejam mais isoladas (Schaal et al.,

1998). Por outro lado, a recolonização por poucos indivíduos durante períodos de

expansão podem produzir “bottlenecks” e áreas com baixa diversidade genética. O sinal

genético produzido por esses eventos pode ser avaliado a fim de testar hipóteses

biogeográficas (Dutech et al., 2004). Tais eventos históricos têm sido relacionados às

mudanças climáticas ocorridas no Pleistoceno. Portanto, muitos estudos filogeográficos

têm mostrado que as alterações climáticas do Pleistoceno afetaram a organização da

diversidade genética de populações naturais em florestas temperadas e tropicais (Comes

& Kadereit, 1998; Olsen, 2002; Provan & Bennett, 2008; Ramos et al., 2009; Ribeiro et

al., 2011).

II.4 Marcadores moleculares para estudos filogeográficos Para a avaliação do fluxo gênico e demais aspectos filogeográficos de

populações naturais são necessárias ferramentas moleculares que proporcionem o

estudo da diversidade genética. Os marcadores moleculares são uma ferramenta

fundamental para os estudos de conservação da biodiversidade. Tais ferramentas

permitem o estudo da diversidade genética, sistemática molecular e filogeografia e,

portanto, são importantes para melhor compreensão de muitos aspectos que podem

auxiliar na conservação das populações naturais (Haig, 1998; Thomson et al., 2010).

Os marcadores moleculares podem ser nucleares ou citoplasmáticos (cpDNA e

mtDNA) e se diferem principalmente pelo modo de herança. Nos marcadores nucleares

a herança é biparental, e nos citoplasmáticos a herança geralmente é uniparental. No

10

caso do genoma nuclear, a informação genética contida é proveniente dos gametas

masculino e feminino (pólen e óvulo no caso das plantas). Além disso, o genoma

nuclear está sujeito à recombinação. Portanto, ao longo das gerações, há mistura da

informação genética proveniente de ambos os parentais. Estas características tornam os

marcadores baseados no genoma nuclear menos adequados para estudos filogenéticos.

Por sua vez, os genomas citoplasmáticos apresentam, em sua maioria, herança

uniparental e não recombinam o que torna os marcadores baseados nestes genomas,

excelentes ferramentas para estudos de relações filogenéticas (Ouborg et al., 1999).

Em espécies animais, o genoma mitocondrial é utilizado para reconstruir os

padrões filogeográficos devido à herança matrilinear, ao seu pequeno tamanho, ordem

conservada dos genes, rápida taxa de substituição e fácil disponibilidade de iniciadores

(Provan et al., 2001). No entanto, em espécies vegetais, o genoma mitocondrial

apresenta características bem distintas das observadas para espécies animais, como

taxas de evolução lenta (quando comparado com o genoma do cloroplasto) e está

suscetível à recombinação. Estas características praticamente inviabilizam o seu uso

para estudos filogeográficos na maior parte das espécies vegetais (Newton et al., 1999;

Hamza, 2010). Por isso, em plantas, os marcadores moleculares baseados no genoma do

cloroplasto (cpDNA) se mostram mais adequados para estudos filogeográficos

(McCauley, 1995; Schaal et al., 1998; Petit et al., 2002; Caicedo & Shaal, 2004). O

cpDNA possui características como: genoma circular, herança uniparental materna (na

maioria das angiospermas), ausência de recombinação e ordem conservada dos genes

(Provan et al., 2001; Hamza, 2010). Estas características do cpDNA tornam os

marcadores baseados neste genoma excelentes ferramentas para estudos sobre a história

evolutiva de populações de espécies vegetais. Pelo fato do cpDNA ser de herança

uniparental materna na maioria das angiospermas, e a maior parte das espécies vegetais

necessitarem das sementes para a colonização de novos ambientes, a análise da

distribuição espacial dos haplótipos do cpDNA permite traçar rotas de dispersão das

populações (Ennos, 1994; Ouborg et al., 1999).

O cpDNA é um genoma haplóide, enquanto que o nuclear geralmente é diplóide

ou poliplóide. Desta forma, o tamanho efetivo da população levando-se em

consideração a ploidia do genoma nuclear é duas vezes maior do que o tamanho efetivo

levando-se em consideração a ploidia do genoma do cloroplasto. Além disso, devido à

herança uniparental do cpDNA, o fluxo gênico para este genoma será menor do que

para o genoma nuclear, o que reduz ainda mais o tamanho efetivo da população para o

11

genoma do cpDNA. Assim, espera-se que haja maior estruturação genética quando o

genoma do cpDNA é analisado do que quando o genoma nuclear é empregado. Como o

efeito da deriva gênica é maior à medida que o tamanho efetivo da população diminui,

espera-se uma maior estruturação genética quando o genoma do cloroplasto é analisado

do que quando se utiliza marcadores baseados no genoma nuclear (McCauley, 1995;

Schaal et al., 1998). Desta forma, estudos baseados no cpDNA são mais eficientes em

revelar eventos históricos como os gargalos populacionais e efeitos fundadores

(McCauley, 1995; Caron et al., 2000; Provan et al., 2001). Assim, se a divergência entre

populações ocorreu recentemente, é provável que essa diferenciação seja mais marcante

no cpDNA do que no genoma nuclear (Hamilton et al., 2003).

Atualmente existem várias técnicas em biologia molecular que permitem a

detecção da variação genética ao nível do DNA. Entre os mais utilizados estão os

microssatélites e o seqüenciamento direto de regiões dos genomas.

Os microssatélites de DNA, também conhecidos como seqüências simples

repetitivas (Simple Sequence Repeats-SSR), são amplamente utilizados em estudos

genéticos populacionais. Os microssatélites são sequências de 1-6 nucleotídeos

repetidos em tandem, que estão amplamente distribuídos pelos genomas nucleares

citoplasmáticos dos eucariotos (Powell et al., 1995). Estas sequências repetitivas estão

mais vulneráveis a mutações devido ao erro ou “escorregões” da DNA-polimerase

durante o processo de replicação do DNA. Este processo produz repetições em número

variável, alongando ou encurtando os microssatélites (Selkoe & Toonen, 2006).

As taxas de mutação dos locos microssatélites são importantes, pois determinam

o nível de variabilidade dentro e entre das populações e, portanto, fornecem estimativas

da estrutura genética das populações (Provan et al., 1999). Atualmente estão disponíveis

na literatura iniciadores universais que amplificam regiões microssátelites do cpDNA de

diversas espécies vegetais (Weising & Gardner, 1999; Steane et al., 2005). Vários

estudos populacionais utilizando marcadores microssatélites de cpDNA mostraram ser

esta ferramenta muito informativa para o estudo de padrões históricos-evolutivos em

populações de plantas (Powell et al., 1995; Provan et al., 2001, 2004; Colevatti et al.,

2003; Lira et al., 2003; Lemes et al., 2010).

Além dos microssatélites, os estudos filogeográficos também têm sido

facilitados pela disponibilidade de iniciadores (primers) universais para a amplificação e

seqüenciamento de outras regiões do cpDNA. Estes locos são regiões não codificadoras

(intergênicas e introns), que são exploradas pelo pressuposto de serem regiões sob

12

menor pressão seletiva (regiões neutras) do que as regiões codificadoras, podendo

fornecer níveis de variação adequados para análises filogenéticas (Shaw et al., 2007).

Em plantas, foram desenvolvidos vários iniciadores capazes de amplificar estas

regiões não codificadoras do genoma do cloroplasto (Taberlet et al., 1991; Hamilton,

1999b; Grivet et al., 2001; Shaw et al., 2007). Estes iniciadores têm fornecido

marcadores moleculares polimórficos ao nível intra-específico para várias espécies

tropicais (Dick et al., 2007; Dick & Heuertz, 2008; Colevatti et al., 2009; Ramos et al.,

2009; Zolet, 2009; Novaes et al., 2010; Ribeiro et al., 2011). Neste tipo de estudo, a

variabilidade genética é avaliada pela detecção de variação nas bases nucleotídicas

através do seqüenciamento direto destas regiões, permitindo assim observar a presença,

por exemplo, de substituições, deleções, inserções, duplicações e inversões, que são

informativos importantes para reconstrução de padrões filogenéticos (Shaw et al.,

2007).

13

III. MATERIAL E MÉTODOS

III.1 Espécie estudada Calophyllum brasiliense: uma árvore de ambientes inundáveis

O gênero Calophyllum atualmente está inserido na família Calophyllaceae,

segundo o APGIII (2009), e compreende cerca de 100 espécies encontradas

principalmente em florestas tropicais distribuídas na América, Ásia, Madagascar e

Austrália. A espécie Calophyllum brasiliense Cambess é uma árvore de dossel,

freqüentemente encontrada nas florestas da América Central e América do Sul (Reitz et

al., 1978; Holl, 1998). Segundo a etimologia da palavra, Calophyllum remete à “Folha

Bonita” e brasiliense a do Brasil. Seu nome comum no sudeste brasileiro, Guanandi, é

derivado do tupi, e significa “o que é grudento” (Ferreira, 1975), provavelmente devido

ao látex amarelado que é exsudado pela casca e pelas folhas. Em outros locais do Brasil,

também pode ser conhecido como Jacareúba (Acre e Amazônia) e Landim (Amazônia e

Bahia).

A espécie é exclusiva de florestas pluviais localizadas em áreas sujeitas à

inundação, o que faz da condição hídrica um fator que influencia a sua distribuição

(Reitz et al., 1978). Sua distribuição geográfica estende-se desde o México ao Paraguai

e, no Brasil, da Amazônia ao Litoral norte Catarinense (Carvalho, 2003) (Figura 1). No

Brasil está presente em todas as bacias hidrográficas abrangendo quase todas as regiões

fitogeográficas do país, como na Floresta Ombrófila Densa (Floresta Atlântica), nas

formações aluviais das Terras Baixas e Baixo-Montana (Guimarães et al., 1988; Silva,

et al., 2007); na Floresta Amazônica, onde é freqüente nas Terras Baixas, sobretudo nas

Várzeas e Igapós (Schongart et al., 2002); na Floresta Estacional Semidecidual, nas

formações aluviais (Carvalho et al., 1996; Botrel et al., 2002; Teixeira & Assis, 2005) e

Montana (Pinto et al., 2005); no Cerrado, nas Matas de Galeria do Brasil Central

(Oliveira-Filho & Ratter, 1995; Van Den Berg & Oliveira-Filho, 2000); no Pantanal

Mato-grossense (Pott & Pott., 1994) e na Restinga (Araújo, 2000; Martins et al., 2008).

14

Figura 1: Ampla distribuição geográfica de C. brasiliense na América Central e

América do Sul (Fonte: Oliveira-Filho & Ratter, 1995).

Calophyllum brasiliense é uma árvore que pode atingir mais de 20 metros de

altura (Figura 2A). A casca externa é marrom-escura finamente fissurada descamando

em pequenas placas retangulares, provenientes de fissuras finas e transversais (Figura

2B). A casca interna é rósea, aromática e ácida, exsudando um látex amarelo-

esverdeado e pegajoso (Carvalho, 2003). Suas folhas são opostas, simples de margem

inteira e de textura coriácea. Apresenta o sistema reprodutivo composto de flores

masculinas com muitos estames, ou hermafroditas (figura 2C) (Marques, 1994;

Carvalho, 2003; Souza & Lorenzi, 2008). A floração do guanandi é variável em virtude

de sua ampla área de ocorrência. Em São Paulo, por exemplo, floresce nos meses de

novembro a dezembro e a frutificação se dá de janeiro a outubro (Fischer & Santos,

2001). Já no Paraná, a floração vai de outubro a novembro e frutifica a partir de janeiro

por um período de 10 meses (Marques, 1994).

As pequenas flores de C.brasiliense são polinizadas por abelhas (Fischer &

Santos, 2001; Carvalho, 2003) e os frutos são drupas esféricas, como bagas (figura 2D),

cuja dispersão zoocórica é feita principalmente por morcegos Phyllostomidae, Artibeus

lituratus, A. obscurus, Carollia perspicillata e Pygoderma bilabiatum. Estes comem a

polpa do fruto e descartam as sementes sob poleiros de alimentação (Fischer & Santos

2001; Passos & Graciolli, 2004). As sementes também podem ser dispersas pela água.

15

A hidrocoria e a tolerância à anoxia são fundamentais para a adaptação da espécie a

ambientes sujeitos à inundação (Marques e Joly, 2000a). Espécies de ocorrência em

ambientes com alta saturação hídrica devem apresentar adaptações morfológicas,

anatômicas e fisiológicas para suportar o estresse devido à falta de oxigênio. Scarano et

al. (1997), estudando a germinação de sementes de C. brasiliense, em que o pericarpo

de algumas sementes foi removido e os de outras não, observaram que 60% das

sementes que não tinham o pericarpo germinaram, e das que estavam intactas, apenas

18% germinaram. Marques & Joly (2000a) verificaram que as sementes de C.

brasiliense não germinam quando submersas, mas se mantêm viáveis, por pelo menos

três meses submersas, ou em solo encharcado. Ao encontrar a condição favorável, por

exemplo, quando reduz o nível da água, a semente germina.

Figura 2: (A) Indivíduo adulto de C. brasiliense; (B) Detalhe do tronco de C.

brasiliense; (C) Flor hermafrodita de C. brasiliense. (D) fruto do tipo drupa.

C. brasiliense atualmente é tido como uma espécie florestal de grande interesse

econômico devido à gama de produtos que podem ser produzidos a partir da sua

madeira: fabricação de móveis (figura 3), construção civil, construção naval,

marcenaria, laminados decorativos entre outros (Lorenzi, 1992). Além da produção de

madeira, C. brasiliense é indicado para obtenção de produtos veterinários a partir da

resina, taninos (folha e casca), óleo essencial (fruto) (Carvalho, 1994). É utilizado

popularmente para tratamento de reumatismo, varicoses e úlceras crônicas.

Estudos mostram o efeito anti-úlcera e anti-inflamátorio de frações obtidas do

extrato da casca e das folhas, respectivamente (Sartori et al., 1999; Da Silva et al.,

2001). A espécie apresenta ainda papel de destaque em programas para reflorestamento

de áreas degradadas, principalmente de Matas Ciliares (Carvalho, 1994; Silveira &

Durigan, 1999).

16

Figura 3: Móvel construído a partir da madeira de C. brasiliense (Foto: Alex Melloto)

Muitos trabalhos vêm sendo realizados com C. brasiliense a respeito dos

aspectos ecofisiológicos (Scarano, et al., 1997; Scarano, 1998; Marques & Joly, 2000a;

King, 2003; Duarte et al., 2005; Oliveira & Joly, 2009), bioquímicos e medicinais

(Gasparotto Junior et al., 2005a, b; Silva Junior et al., 2009), entre outros (Holl, 1998;

Ribeiro et al.,1998; Marques & Joly, 2000b; Fischer & Santos, 2001). Entretanto,

poucos trabalhos abordam aspectos moleculares, sendo em sua maioria relacionados à

genética de populações em pequena escala espacial (Kawaguici & Kageyama, 2001;

Bottino, 2006; Botrel, et al., 2006; Souza et al., 2007; Reis et al., 2009), mas nenhum

tratou de aspectos filogeográficos em ampla escala geográfica.

17

III.2 Locais de coleta Para o estudo filogeográfico da espécie C. brasiliense foram coletadas amostras

de populações naturais, procurando abranger sua ampla área de distribuição. Esta

distribuição contemplou no Brasil os estados: Paraná, São Paulo, Minas Gerais, Rio de

Janeiro, Espírito Santo, Bahia, Pará, Amazonas e na América Central, uma população

pertencente à Costa Rica (Figura 4). Ao longo desta distribuição foi possível coletar

populações pertencentes a cinco Biomas: (1) Mata Atlântica; (2) Cerrado; (3) Caatinga;

(4) Floresta Amazônica e (5) Floresta Tropical Chuvosa da Costa Rica. Foram

amostradas 24 populações abrangendo diferentes regiões fitogeográficas. Quatorzes

dessas populações foram amostradas na Mata Atlântica, cinco no Cerrado, duas na

Caatinga, duas na Floresta Amazônica e uma população da América Central cuja

vegetação é classificada como Bosque Úmido Tropical segundo Janzen (1991). As

populações encontram-se listadas na tabela 1.

Figura 4: Localização das áreas de coleta das populações de C. brasiliense. Os números

indicam os locais onde procederam as coletas do material e estão identificados ao lado

da figura do mapa.

18

Tabela1: Populações amostradas; código das populações; fitofisionomia abrangente; número de indivíduos analisados e localização geográfica.

Populações/Bioma Código Fitofisionomia Nº de indivíduos Material Coletado Coordenadas Geográficas Elevação (m)

Longitude W Latitude S

MATA ATLÂNTICA

Pontal do Sul-PR PSUL Floresta de Restinga Inundável 9 Folha 48º 27’ 59.55’’ 25º 34’ 18.51’’ 9

Ilha do Mel-PR IDM Floresta de Restinga Inundável 9 Folha 48º 20’ 27.36’’ 25º 30’ 55.52’’ 0

Antonina-PR ANT Floresta Ombrófila Densa baixo Montana 6 Folha 49º00’ 09.90’’ 25º 01’20.72’’ 813

Picinguaba-SP PIC Floresta de Restinga Inundável 5 Folha e Câmbio 44º 50’ 04.77’’ 23º 21’ 59.59’’ 6

Poço das Antas-RJ POA Floresta Ombrófila Densa Baixo Montana 7 Folha 42º 16’ 30.05’’ 22º 34’ 45.21’’ 13

Casimiro de Abreu-RJ CAB Floresta Ombrófila Densa Baixo Montana 7 Folha e Câmbio 42º 06’14’’ 22º 29’ 37’’ 51

RebioUnião-RJ UNI Floresta Ombrófila Densa Baixo Montana 7 Folha 42º 02’ 51’’ 22º 26’ 42’’ 59

Macaé-RJ MAC Floresta de Restinga Inundável 7 Folha 41º 41’ 45.04’’ 22º 18’ 02.97’’ 9

Linhares-ES LIN Floresta de Tabuleiro 9 Folha 39º 57’ 14.3’’ 19º 11’ 55’’ 36

Vila Velha-ES VVE Floresta de Restinga Inundável 9 Folha e Câmbio 40º 18’ 45’’ 20º 26’ 25’’ 4

Caravelas-BA CAR Floresta de Tabuleiro 9 Folha 39º 36’ 14.8’’ 17º 47’ 12.4’’ 3

Porto Seguro-BA PSE Floresta de Tabuleiro 8 Folha 37º 02’ 13.8’’ 16º 22’ 39.7’’ 4

Ilhéus-BA ILH Floresta de Restinga Inundável 7 Folha 39º 03’ 21.4’’ 14º35’ 59.4’’ 2

Sauípe-BA SAU Floresta de Restinga Inundável 8 Folha 37º 54’ 23’ 12º 21’ 00.8’’ 10

CERRADO

Tiradentes-MG TIR Floresta de Galeria em Cerrado 10 Folha 44º 10’ 07.31’’ 21º 06’ 35.23’’ 900

Correntina-BA COR Mata Ciliar em Cerrado 8 Folha 44º 33’ 31,9’’ 13º 19’ 50.5’’ 493

Sete Ilhas-BA SIL Mata Ciliar em Cerrado 8 Folha 44º 37’12.21’’ 13º 20’ 04.48’’ 536

São Desidério-BA SDE Mata Ciliar em Cerrado 7 Folha 45º 05’ 15.0’’ 12º 30’ 38.7’’ 579

Barreiras-BA BAR Floresta de Galeria em Cerrado 9 Folha 45º 36’ 3.3’’ 11º 53’ 36.6’’ 712

19

Tabela1 (cont.): Populações amostradas; código das populações; fitofisionomia abrangente; número de indivíduos analisados e localização geográfica.

Populações/Bioma Código Fitofisionomia Nº de indivíduos Material Coletado Coordenadas Geográficas

Elevação (m) Longitude W Latitude S

CAATINGA-BA

Erico Cardoso-BA ECA Mata Ciliar em Caatinga 9 Folha 42º 07’ 55.2’’ 13º 15’ 28.6’’ 994

Andaraí-BA AND Mata Ciliar em Caatinga 8 Folha 41º 19’ 40.8’’ 12º 45’ 19.3’’ 322

FLORESTA AMAZÔNICA

Oriximiná-PA PAR Floresta Ombrófila Densa (Floresta de igapós) 8 Folha 55º 59’ 59.97’’ 1º 39’ 59.97’’ 61

Reserva Ducke-AM RDU Mata de Terra Firme (Floresta de Baixio) 10 Câmbio 59º 59’ 59.97’’ 3º 07’ 02.31’’ 38

FLORESTA TROPICAL CHUVOSA

Costa Rica CRI Bosque úmido tropical 9 Câmbio 83º 47’ 21.04’’ *10º 12’ 19.00’’ 294

*coordenada – N (Latitude Norte)

20

III.3 Coleta do Material Vegetal Foram coletadas folhas sem sinais de predação ou ataque de patógenos ou o

câmbio (figura 5) de indivíduos distantes no mínimo 15 metros entre si. Em cada uma

das populações foram amostrados de 5 a 10 indivíduos adultos (DAP > 15 cm)

totalizando 192 indivíduos de C. brasiliense distribuídos em 24 populações. Na maioria

dos casos a posição de cada população foi georeferenciada por meio de coordenadas

geográficas (GPS) tomadas durante as expedições de coleta (tabela 1). A posição

geográfica das populações VVE; MAC; IDM; PSUL; PIC; TIR; CRI; PAR; RDU foram

estimadas por meio do Google Earth, de acordo com as informações fornecidas pelos

coletores. O material coletado foi armazenado em tubos de plástico de 50 ml ou em

sacolas plásticas do tipo zipiloc contendo sílica gel (sulfato de cobre) como agente

dessecante. A desidratação do material é importante para evitar a degradação do DNA

por oxidação ou pela ação de DNAases. No laboratório as amostras foram estocadas em

freezer a – 80ºC. As exsicatas do material coletado referente às populações: LIN; ILH;

AND; SDE; CAV; COR; ECA; PSE; CAR; VVE e SAU (ver tabela 1) foram

depositadas no herbário do Jardim Botânico do Rio de Janeiro (RB).

Figura 5: Procedimento de coleta de amostras de câmbio (2A) e folhas (2B) de

C.brasiliense.

21

III. 4 Obtenção dos dados moleculares

A- Extração do DNA genômico total A extração do DNA de C. brasiliense a partir do tecido foliar e câmbio seguiu o

protocolo com uso do detergente CTAB descrito por Doyle & Doyle (1987), com

pequenas modificações descritas em Margis et. al (2002). O tecido foliar e do câmbio

congelado à – 80ºC foi triturado em nitrogênio líquido até a formação de um pó fino. A

cada 150 mg do material foram adicionados 900µl de tampão de extração (2% CTAB,

NaCl 1,4 M, EDTA 20 mM, Tris-HCl 100mM pH 8,0, 2% de PVP-40, 0,2% de β-

mercaptoetanol). A mistura foi agitada por 30 segundos em um agitador vórtex e em

seguida incubados por 60 minutos em banho-maria à 65ºC, sendo agitada por inversão a

cada 10 minutos. Em seguida foi adicionado à mistura 700 µl de clorofórmio - álcool

isoamílico (24:1). A mistura foi então agitada por inversão durante 5 minutos e

centrifugada a 13000 rpm por 5 minutos em temperatura ambiente. A fase aquosa

superior foi transferida para um novo tubo, e a lavagem com clorofórmio-

álcoolisoamílico (24:1) repetida mais duas vezes nas mesmas condições anteriores. Ao

sobrenadante da terceira lavagem foi adicionado 1/10 do volume de uma solução 10%

de CTAB e 1,4 M de NaCl. A mistura foi agitada por inversão até que homogeneizasse

a solução. Em seguida foram adicionados 2/3 (aproximadamente 400µl) de isopropanol

frio para precipitação dos ácidos nucléicos. Em seguida o material foi incubado por

aproximadamente 16 horas à -20ºC. Posteriormente esta solução foi então centrifugada

por 20 minutos à 13000 rpm à temperatura de 4ºC. Após a centrifugação, a fase aquosa

foi descartada e o precipitado obtido foi lavado duas vezes com 1 ml de etanol 70% por

5 minutos e uma vez com 1 ml de etanol 95% por mais 3 minutos. Após estas lavagens

o precipitado foi seco à temperatura ambiente e resuspenso em 50 µl de TE (Tris-Cl

10mM pH 8,0, 1mM EDTA) contendo 10µg/ml de RNAse. As amostras foram

armazenadas à – 20ºC.

B- Quantificação do DNA A concentração e a integridade do DNA extraído foram determinadas por

eletroforese em gel de agarose 0,8 % e TAE 0,5 X (Tris Base 24,3 g/l; ácido acético

glacial 5,7 (P/V); EDTA 10%; pH 8,0), e 1,5 µl/100ml de brometo de etídeo para

posterior visualização das bandas em um transiluminador com luz ultravioleta. A

quantificação do DNA extraído se deu por meio da comparação com o DNA padrão do

fago λ de concentração conhecida. As concentrações usadas do DNA do fago λ foram

22

de 25, 50, 100 e 200 ng/µl. Em cada 2µl de cada amostra foi adicionado 1µl de loading

(0,025% de azul de bromofenol, 0,25% de xileno cianol FF e 30% de glicerol em água).

As amostras foram aplicadas no gel de agarose em uma cuba de eletroforese horizontal

a uma voltagem de 100 V por 20 minutos. Após a migração eletroforética o DNA foi

analisado em um transiluminador com luz ultravioleta e fotodocumentado.

C-Amplificação e análise de locos microssatélites do genoma do cloroplasto (cpDNA) Inicialmente foram testados doze locos microssatélites do genoma do cloroplasto

(cpSSR), dos quais dez foram originalmente desenvolvidos para Nicotiana tabacum

(Weising & Gardner, 1999) e dois desenvolvidos para Eucalyptus globulus (Steane et

al., 2005). São eles: ccmp1, ccmp2, ccmp3; ccmp4; ccmp5; ccmp6; ccmp7; ccmp8;

ccmp9; ccmp10; emcrc67; emcrc74. A amplificação dos locos cpSSR foi realizada via

PCR (do inglês “Polymerase Chain Reaction” ou Reação em Cadeia da Polimerase)

utilizando as seguintes condições: Desnaturação inicial de 94ºC durante 5 minutos, com

30 ciclos de: Desnaturação à 94ºC durante 1 minuto; Anelamento dos pares de

iniciadores, na temperatura específica de cada primer, por 1 minuto; Extensão da nova

fita à 72ºC por 1 minuto; ao final de 30 ciclos ocorre uma extensão final à 72ºC durante

10 minutos.

Para a amplificação dos locos cpSSR foi utilizado por reação: 1µl de tampão10X

PCR; 0,8µl de dNTPs (2,5µM); 0,3µl de MgCl2 (50µM); 1,0µl de BSA - Bovine Serum

Albunin- (2,5mg/ml); 0,4µl de primer (10µM); 0,2µl de taq DNA polimerase (5U/µl);

2,0µl de DNA (2,5ng/µl) e água ultrapura (MilliQ) para completar 10µl de reação final.

Os produtos amplificados foram analisados em gel de agarose 1,5% corado com

brometo de etídio e fotodocumentado utilizando um transiluminador com luz

ultravioleta. A estimativa do tamanho dos produtos amplificados foi feita a partir do

DNA padrão Ladder 1Kb plus.

Em seguida os produtos amplificados foram diluídos em água ultrapura e

analisados em géis de poliacrilamida de alta resolução ou em seqüenciador automático

DNA 3130 XL (Applied Biosystems, Inc.), seguindo as instruções do fabricante. No

caso do seqüenciador, a estimativa dos tamanhos dos alelos foi feita utilizando o

marcador Genescan ROX 500 e analisados por meio do software GeneMapper (Applied

Biosystems, Inc.). A otimização das condições de amplificação e análise dos locos

23

microssatélites do cpDNA no seqüenciador automático 3130 XL (Applied Biosystems,

Inc.) foram realizadas pela Dra. Maristerra Lemes no Laboratório de Genética e

Biologia Reprodutiva de Plantas (LabGen) do INPA, em Manaus, AM.

As análises em gel de poliacrilamida foram realizadas e géis desnaturantes de

poliacrilamida 5% (acrilamida 19: 1 bis-acrilamida, uréia 7M, em tampão TBE 1X, pH

8.0) corados com nitrato de prata. Para isto foi usado um sistema de eletroforese vertical

em tampão TBE 1X.

D-Amplificação e análise de regiões não-codificadoras do genoma do cloroplasto (cpDNA)

D.1 Seleção das regiões não-codificadoras do cpDNA Foram testados diferentes iniciadores (primers) universais para amplificação de

regiões não-codificadoras do cpDNA. Foram testadas condições de amplificação via

PCR para os seguintes pares de iniciadores: psbA-trnH (Hamilton, 1999), trnL-trnF

(Taberlet et al., 1991), atpH-atpI (Grivet et al., 2001), trnG-trnS (Hamilton, 1999),

íntron rpl16 (Asmussen, 1999), íntrons rpoB e rpoC1 (Kress & Erickson, 2007);

matK4la-trnk2R (Wojciechowski et al., 2004); psbC-trnS (Grivet et al., 2001). Destes,

foi possível otimizar as condições de amplificação via PCR para: psbA-trnH; trnL-trnF;

atpH-atpI; íntrons rpl16, rpoB e rpoC1.

D.2 Amplificação via PCR das regiões não-codificadoras do cpDNA Para a análise do polimorfismo de sequências de regiões não-codificadoras

foram avaliados seis pares de iniciadores: psbA-trnH; trnL-trnF; atpH-atpI; íntrons

rpl16, rpoB e rpoC1. A amplificação destas regiões foi feita via PCR utilizando um

termociclador Biocycler. As condições de amplificação estão descritas abaixo:

intron rpl16- 94°C por 4 minutos, 30 ciclos à 94°C por 45 segundos; 52°C por 45

segundos; 72°C por 45 segundos; ao final dos 30 ciclos ocorre uma extensão final de

72°C por 4 minutos; psbA-trnH- 94ºC por 4 minutos, 35 ciclos de: 94°C por 45

segundos; 45°C por 45 segundos 72°C por 2 minutos;extensão final de 72°C por 4

minutos; atpH-atpI- 94ºC por 4 minutos, 35 ciclos de: 94°C por 45 segundos; 52º C

por 45 segundos; 72°C por 45 segundos; extensão final de 72°C por 4 minutos; introns

rpoB e rpoC1- 94ºC por 4 minutos, 40 ciclos de: 94°C por 45 segundos; 49º C por 45

segundos; 72°C por 2 minutos; extensão final de 72°C por 4 minutos; trnL-trnF (PCR

24

touchdown)- 94ºC por 4 minutos, 10 ciclos de: 94°C por 45 segundos; 52º C por 45

segundos; 72°C por 45 segundos; Etapa touchdown:-10 ciclos de: 94°C por 45

segundos; 52-50° (- 0,2°C) por 45 segundos; 72°C por 45 segundos;15 ciclos de: 94°C

por 45 segundos; 50°C por 45 segundos; 72°C por 45 segundo; extensão final de 72°C

por 4 minutos.

A reação de PCR foi feita para um volume final de 30µl contendo: 3,0µl de

Tampão 10X PCR; 2,4µl a 1,8µl de MgCl2 (25mM); 1,2µl de dNTPs (5mM); 0,3µl de

Taq DNA polimerase (5u/µl); 1,2µl de cada iniciador (10mM); 3,0µl de DNA(5ng/µl) e

água ultrapura até completar o volume final de 30ul. Após a reação, 5µL dos produtos

amplificados foram analisados em gel de agarose 0,8% e tampão TAE 1X em uma cuba

de eletroforese horizontal a uma voltagem de 120V por 15 minutos. Os géis foram

corados com brometo de etídio e em seguida as amostras foram analisadas em

transluminador com luz ultravioleta (Sistema EasyDoc 200) para verificação da

amplificação. As estimativas dos tamanhos dos fragmentos amplificados foram feitas

utilizando-se padrão de DNA Ladder 10pb (Invitrogen).

D.3 Purificação dos produtos da PCR Os produtos da PCR (25µl restantes) foram purificados utilizando o Kit de

purificação GE Heathcare illustra TM GFX TM PCR and Gel Band, conforme

instruções do fabricante.

D.4 Reação de sequenciamento dos fragmentos amplificados O sequenciamento das amostras foi realizado em colaboração com laboratórios

no Brasil ou através da contratação deste serviço fornecido pela empresa especializada

Macrogen Inc. na Coréia (neste último caso os produtos da PCR foram enviados para

serem purificados e seqüenciados).

As reações de seqüenciamento feitas no Brasil foram realizadas tanto para a fita

molde como para a fita complementar, com o uso do Kit Dyenamic ET Dye Terminator

Cycle (MegaBAce DNA analysis Systems). As reações foram feitas em volume final de

10µl conforme instruções do fabricante. Na tabela 2 segue o protocolo utilizado para

esta reação.

25

Tabela 2: Protocolo de reação de sequenciamento utilizando o Kit Dyenamic ET Dye

Terminator Cycle (MegaBAce DNA analysis Systems).

A reação de seqüenciamento foi conduzida de forma: 25 ciclos de 95ºC durante

20 minutos, 50ºC durante 15 segundos e 60ºC durante 1 minuto. Em seguida, o produto

da reação foi precipitado utilizando etanol absoluto e acetato de amônio (7,5M)

conforme instruções do fabricante do Kit Dyenamic ET Dye Terminator Cycle

(MegaBAce DNA analysis Systems). Os seqüenciamentos foram realizados em dois

sequenciadores MegaBAce DNA Analysis Systems gentilmente cedidos pelo Dr. Jean

S. de Araujo, da EMBRAPA Agrobiologia, e pelo Dr. Turan Peter Urmenyi, do

Laboratório de Microbiologia do Departamento de Biofísica da UFRJ.

D.5 Edição e alinhamento das sequências As seqüências obtidas pelas reações de seqüenciamento foram abertas no

programa Chromas e os alinhamentos realizados através do CLUSTAL-W

implementado no programa MEGA 4.0 (Tamura et al., 2007). As sequencias alinhadas

foram conferidas manualmente para evitar artefatos introduzidos pelo programa.

Reagentes Volume (µl)

Dye (reagent premix MegaBace) 4,0

Primer F ou R (10mM) 0,5

Água ultrapura 3,0

Produto de PCR (25ng/µl) 2,5

Total 10,0

26

III.5 Análises dos dados moleculares

A- Diversidade e estrutura filogeográfica

Os haplótipos de cpDNA foram definidos utilizando o software DNASP 5. -

DNA Sequence polymorphism (Librado & Rozas, 2009). Os parâmetros de diversidade

genética, tais como, diversidade haplotípica (h) e diversidade nucleotídica (π), foram

também calculados no programa DNASP5.

As relações genealógicas entre os haplótipos foram determinadas por meio de

uma análise de rede “network” utilizando o algoritmo median-joining (Bandelt et al.,

1999) implementado no programa NETWORK 4.1 (Fluxus Technology Ltd. At www.

Fluxus-engineering.com). A árvore de haplótipos gerada utilizou o critério de máxima

parcimônia.

Os índices de estruturação genética Gst e Nst foram calculados no programa

PERMUT (Pons & Petit 1996 – disponível em

www.pierroton.inra.fr/genetics/labo/Software/Permut/). O Gst é calculado pela

freqüência dos haplótipos e o valor do Nst é baseado na freqüência e na distância

genética entre os haplótipos. A existência de estruturação filogeográfica é definida

quando o valor de Gst é significativamente menor do que o valor de Nst..

A análise espacial da variância molecular foi realizada utilizando-se o programa

SAMOVA (Dupanloup et al., 2002). Esta análise é feita para definir os grupos de

populações que estão geograficamente diferenciados. Foram testados de k=2 à k=21

grupos. A escolha do melhor agrupamento esta associado ao maior Fct. Corroborando

esta análise, foi feita uma análise bayesiana para avaliar se há estrutura genética entre

grupos de populações. Esta análise foi feita pelo programa BAPS 3.2. (Corander et al.,

2005). Para esta análise também foram testados k grupos (k=2 à K=10). O melhor

agrupamento foi considerado como o que apresentou o menor valor de Log (máxima

verossimilhança).

Para as análises de diferenciação dentro e entre os grupos de populações de C.

brasiliense foi feito a análise de variância molecular (AMOVA) implementada no

programa ARLEQUIN 3.1 (Excoffier et al., 2005). A AMOVA foi feita considerando

(i) todas as populações como um único grupo e (ii) o agrupamento definido pela análise

do SAMOVA.

Para o teste da influência de possíveis barreiras geográficas ao fluxo gênico

entre as populações de C. brasiliense foi feita análise com o programa BARRIER

27

version 2.2 (Manni et al., 2004). Para esta análise foram utilizadas as coordenadas

geográficas listadas na tabela 1 e uma matriz de comparação par a par dos valores de Fst

entre as populações (anexo 1). Este teste utiliza métodos de regressão e autocorrelação

espacial por meio do algoritmo de Monmnier (Manni et al., 2004) e possibilita

identificar onde existem taxas discrepantes de variação genética entre as populações.

Esta análise por meio de componentes geométricos permite evidenciar os locais e as

direções das barreiras. Desta forma, é possível identificar barreiras genéticas e comparar

geograficamente ao longo da distribuição da espécie com alguma barreira geográfica

que possa coincidir com o local da barreira genética entre as populações. Um número de

oito barreiras foi projetado nesta análise. Neste trabalho, esta análise teve o objetivo de

avaliar se tais barreiras detectadas coincidem com bacias hidrográficas e se as mesmas

podem ser barreiras ao fluxo gênico entre as populações de C. brasiliense, uma vez que

esta espécie é típica de ambientes ribeirinhos.

Para estimar a taxa de fluxo de pólen em relação ao fluxo de sementes, foi feito

um cálculo a partir dos índices de diferenciação populacional (Fst) com base em

marcadores AFLPs nucleares (dados de Bottino, 2006) e de marcadores plastidiais

(dados do presente trabalho). O cálculo foi baseado na fórmula descrita por Ennos

(1994) e é apropriada para espécies hermafroditas, diplóides, com fecundação cruzada e

que apresentam herança materna do DNA do cloroplasto.

- mp e ms representam a taxa de migração via pólen e semente respectivamente.

r = mp/ms= [(1/Fstn -1) – 2(1/Fstc - 1)]

(1/Fstc - 1)

Todas estas análises interpretadas em conjunto foram utilizadas para inferir os

padrões filogeográficos das populações de C. brasiliense analisadas.

B-Análises Demográficas Para testar a hipótese de expansão populacional em populações de C.

brasiliense, foi feito o teste de neutralidade de Tajima’s D (Tajima, 1989), Fu’s Fs (Fu,

1997), Fu and Li’s D e F (Fu & Li, 1993). Estas análises foram feitas no programa

ARLEQUIN 3.1 (Excoffier et al., 2005) e DNASP5. O teste Tajima’s D e o Fu and Li’s

D e F consideram a frequência de mutações e o Fu’s Fs é baseado na distribuição dos

haplótipos. A história demográfica das populações foi interpretada comparando tais

testes de neutralidade. O indicativo de expansão populacional é inferido quando o

28

Tajima’s D, o Fu’s Fs, Fu and Li’s D e F são significativamente negativos. Tais testes

foram realizados considerando os seguintes grupos de populações: (i) os agrupamentos

identificados pelo SAMOVA, (ii) todas as populações como um único grupo e (iii) por

bioma (Mata Atlântica, Cerrado, Caatinga, Amazônia e Floresta Tropical da Costa Rica,

conforme a tabela 1). Complementando estas análises foi feita a Distribuição Mismatch,

usando o software DNASP5.

29

IV. RESULTADOS

IV. 1 Extração do DNA genômico total

A extração do DNA genômico total a partir da folha e câmbio de

indivíduos de C. brasiliense utilizando o método CTAB, foi realizada satisfatoriamente.

Na figura 6 observa-se a quantidade e qualidade do DNA extraído a partir de folhas.

Figura 6: Quantificação do DNA extraído a partir de folha de C.brasiliense em gel de

agarose 0,8% corado com brometo de etídio. As colunas L1 e L2 referem-se aos padrões

de peso molecular do fago lambda (λ): L1=100ng e L2=200ng. As demais colunas

referem-se ao DNA extraído da folha de 12 indivíduos de C.brasiliense (colunas 1 a

12).

IV.2 Microssatélites do genoma do cloroplasto (cpDNA)

Foram otimizadas as condições de amplificação para nove dos doze pares

de iniciadores (primers) testados: ccmp1; ccmp2; ccmp3; ccmp4 ccmp6; ccmp7;

ccmp10; emcrc67; emcrc74. Na tabela 3 são apresentadas as sequências nucleotídicas

dos iniciadores utilizados, regiões do genoma amplificadas; temperaturas de anelamento

otimizadas e as estimativas dos tamanhos dos fragmentos para cada um dos pares de

iniciadores testados.

A figura 7 apresenta os produtos de amplificação otimizados para nove

locos cpSSR para indivíduos de C. brasiliense, em gel de agarose 1.5% corado com

brometo de etídio. O teste inicial para detecção de polimorfismos nos locos cpSSR em

C. brasiliense foi feito para indivíduos das seguintes populações: Pontal do Sul- Paraná;

Poço das Antas-Rio de Janeiro, Ilhéus-BA e Costa Rica- América Central.

Deste teste inicial foi possível obter eletroferogramas de boa qualidade

para os locos ccmp2, ccmp3; emcrc67 e emcrc74 (Figura 8), sendo que o loco ccmp2

apresentou polimorfismo para a população da Costa Rica. Os outros dois locos, ccmp6 e

30

ccmp7, necessitam de pequenos ajustes para interpretação dos eletroferogramas. Para os

locos ccmp1; ccmp3; ccmp4; ccmp10; emcrc67; emcrc74 não foi detectada variação,

levando-se em conta os quatro indivíduos analisados por população (para as quatro

populações). Os locos microssatélites não foram utilizados para inferir os padrões

filogeográficos de C. brasiliense devido apenas um loco (ccmp2) ter sido polimórfico.

Tabela 3: Características nove locos cpSSR otimizados para C. brasiliense:

Ta=temperatura de anelamento; pb = pares de base. Locos SSR

Sequência 5’ 3’

Região amplificada Ta (ºC) Estimativa do tamanho dos alelos (pb)

ccmp1 CAGGTAAACTTCTCAACGGA CCGAAGTCAAAAGAGCGATT

trnK intron 50ºC Não-estimado

ccmp2 GATCCCGGACGTAATCCTG ATCGTACCGAGGGTTCGAAT

5’ to trnS 51ºC 120-150

ccmp3 CAGACCAAAAGCTGACATAG GTTTCATTCGGCTCCTTTAT

trnG intron 47ºC 110

ccmp4 AATGCTGAATCGAGACCTA CCAAAATATTBGGAGGACTCT

atpF intron 54ºC 120

ccmp6 CGATGCATATGTAGAAAGCC CATTACGTGCGACTATCTCC

ORF 77–ORF 82 Intergenic

56ºC 100

ccmp7 CAACATATACCACTGTCAAG ACATCATTATTGTATACTCTTC

atpB–rbcL intergenic

56ºC 150

ccmp10 TTTTTTTTTAGTGAACGTGTCA TTCGTCGDCGTAGTAAATAG

rpl2–rps19 intergenic

50ºC Não-estimado

emcrc67 CATCCTCAAATCCGTCCT TATTGCTTAGTCTGGCTTTTAG

atpF-atpH intergenic

56ºC 230

emcrc74 GGCCGTGTACGAGAAGTCAA CCAAGGGCTATAGTCATAGTGATCC

trnT-psbD intergenic

50ºC 130

31

Figura 7: Otimização das condições de amplificação para sete locos de cpSSR analisados, para

dois ou quatro indivíduos de C. brasiliense: (A) ccmp2; (B) ccmp3; (C) ccmp4; (D) emcrc74;

(E) emcrc67; (F) ccmp6 e ccmp7, em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio. A

coluna P refere-se ao padrão do DNA ladder de 1Kb plus. As colunas 1 à 5 referem-se ao DNA

amplificado. As setas indicam o tamanho dos fragmentos em pares de base (pb).

32

Figura 8: Eletroferogramas mostrando os alelos amplificados para quatro locos cpSSR de indivíduos de C. brasiliense pertencentes a quatro

populações (Pontal do Sul-Paraná; Poço das Antas-Rio de Janeiro; Ilhéus-Bahia e Costa Rica). Cada pico representa um alelo. O tamanho dos

alelos é indicado na barra superior em pares de base. A-D (ccmp2); E-H (ccmp3); I-M (emcrc67) e N-Q (emcrc74).

33

IV.3 Sequências de regiões não-codificadoras do genoma do cloroplasto (cpDNA) Foram otimizadas as condições de amplificação para seis pares de

iniciadores para regiões não-codificadoras do cpDNA. Na tabela 4 são apresentadas as

sequências nucleotídicas das regiões do genoma amplificado; temperaturas de

anelamento otimizadas e o tamanho dos fragmentos amplificados para C. brasiliense. A

figura 9 apresenta o padrão dos produtos amplificados via PCR, depois de otimizados,

para cinco das seis regiões não-codificadoras amplificadas do cpDNA de C. brasiliense,

em gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídio.

Para escolha dos marcadores polimórficos foi feita uma análise preliminar,

para qual foram sequenciados alguns indivíduos de C. brasiliense de diferentes

procedências geográficas utilizando os seis pares de iniciadores para os quais foi

possível otimizar as condições de amplificação.

Tabela 4: Características das seis regiões de sequências não-codificadoras do cpDNA

utilizadas para amplificação em C. brasiliense. Ta=temperatura de anelamento; pb=

pares de base.

Região do cpDNA

Sequência nucleotídica 5’ 3’

Ta de anelamento

(ºC)

Tamanho observado dos

fragmentos

Polimórfico Referências

rpoB F: ATGCAACGTCAAGCAGTTCC R: GATCCCAGCATCACAATTCC

49ºC 304

não Kress & Erickson (2007)

rpoC1 F: GTGGATACACTTCTTGATAATGG R:TGAGAAAACATAAGTAAACGGGC

49ºC 350

não Kress & Erickson (2007)

psbA-trnH F:CGAAGCTCCATCTACAAAG R:ACTGCCTTGATCCACTTGGC

45ºC 356-263

sim Hamilton (1999b)

trnL-trnF F: CGAAATCGGTAGACGTACG

R: ATTTGAACTGGTGACACGAG

52ºC 690 não Taberlet et al.

(1991)

atpH-atpI F: CCAGCAGCAATAACGGAAGC R: ATAGGTGAATCCATGGAGGG

52ºC 712-721

sim Grivet et al. (2001)

rpl16 F:CTTCCTCTATGTTGTTTACG R:GCTATGCTTAGTGTGTGACTC 52ºC 856

sim Asmussen (1999)

34

Figura 9: Otimização das condições de amplificação das regiões não-codificadoras do

cpDNA de C. brasiliense utilizando os pares de iniciadores (A) rpl16; (B) psbA-trnH;

(C) trnL-trnF; (D) atpH-atpI, em gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídio. A

coluna P refere-se ao padrão de DNA lambda pstI, as demais colunas referem-se ao

DNA amplificado.

Das seis regiões não-codificadoras do genoma do cloroplasto avaliadas no

presente trabalho, três foram polimórficas para C. brasiliense: psbA-trnH; atpH-atpI e

rpl16. Os demais locos não apresentaram polimorfismo (tabela 4). Para o estudo

filogeográfico, foram escolhidas duas regiões intergênicas: psbA-trnH e atpH-aptI, as

quais apresentaram maior número de mutações.

Para as regiões atpH-atpI e psbA-trnH foram obtidos fragmentos de 712 a 721pb

e 253 a 263pb respectivamente. Na região intergênica atpH-atpI foram encontrados

polimorfismos do tipo microssatélites, substituições, inserções e deleções. Neste

trabalho optou-se por trabalhar somente com mutações do tipo substituições, deleções e

inserções. No total foram obtidos onze sítios variáveis. Destes foram considerados

somente sete mutações. Excluíram-se três mutações em regiões microssatélites e uma

duplicação de sete pares de base encontrada entre as posições 219 a 225, o qual foi

considerada como um único evento mutacional.

Para a região psbA-trnH foi caracterizado um total de 39 sítios polimórficos,

sendo que destes foram consideradas 28 mutações. Excluíram-se seis mutações do tipo

microssatélite e o polimorfismo encontrado entre as posições 195 a 200 foi considerado

com um único evento mutacional.

As figuras 10 e 11 mostram um segmento alinhado com polimorfismo para

região atpH-atpI e psbA- trnH, respectivamente

35

Figura 10: Polimorfismo de sequências de DNA da região aptH-atpI. Na área destacada

observa-se um polimorfismo do tipo deleção/inserção.

Figura 11: Polimorfismo de sequências de DNA da região psbA-trnH. Na área destacada observa-se um polimorfismo do tipo substituição, G-T.

36

Na figura 12 são apresentados os eletroferogramas obtidos a partir do

seqüenciamento da região atpH-atpI de dois indivíduos de C. brasiliense, um da

população de Picinguaba-SP e outro da população da Costa Rica, respectivamente, nos

quais observa-se uma mutação do tipo substituição.

Figura 12: Eletroferogramas mostrando parte da sequência nucleotídica da região atpH-

atpI para dois indivíduos de C. brasiliense. As setas indicam uma substituição (G - C).

(A) indivíduo de Picinguaba; (B) indivíduo da Costa Rica.

A

B

37

IV.4 Diversidade e Estrutura Filogeográfica A combinação das duas regiões atpH-atpI + psbA-trnH caracterizou 961pb ,

com 35 posições variáveis. Dez haplótipos foram identificados em C. brasiliense pela

combinação destas duas regiões e estão listados e caracterizados na tabela 5.

Tabela 5: Posições variáveis das sequências alinhadas das duas regiões de cpDNA

(aptH-atpI+ psbA-trnH) com os 10 haplótipos identificados de C. brasiliense. Os traços

( _ ) indicam gaps, os pontos indicam as bases nucleotídicas que são iguais.

sítios polimórficos atpH-atpI psbA-trnH

28

218

219

220

235

554

649

763

771

777

779

780

803

804

809

814

846

860

878

902

910

928

938

939

941

943

944

947

950

951

953

954

956

957

9 6 0

H1 C _ _ A C A A T A G G G T A T C T C T G A A G G C A T A C T C T T C G

H2 . . . . G . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

H3 . . . . . G . . . . T A . G . G C G C . C T A C A C C C G A A G A G .

H4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . T . . . . . . . . . . . . . . .

H5 . T C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

H6 _ T . _ . . . . T . . . . C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

H7 . T . _ . . . A . T T . A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

H8 . T . _ . . . . . . . . . C . . . . . _ . . . . . . . . . . . . . . .

H9 . T . _ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

H10 . T . _ . . C . . . . . . . G . . . . . . . A . . C C C G A A G A G T

38

A diversidade nucleotídica (π) das populações amostradas variou de 0 a 0, 00056

e a diversidade haplotípica (h) variou de 0 a 0,533 (Tabela 6). Das 24 populações

analisadas 21 foram monomórficas, sendo que apenas as populações de PIC, VVE e

RDU apresentaram dois haplótipos. Na figura 13 e 14 estão apresentadas a distribuição

dos haplótipos ao longo das áreas amostradas e a rede de haplótipos (“Network”),

respectivamente. Observa-se que o haplótipo H1 foi o haplótipo com maior frequência,

identificado em 13 das 14 populações da Mata Atlântica, exceto na população de SAU.

Este mesmo haplótipo H1 foi encontrado em três populações do Cerrado da Bahia

(COR, SDE e SIL), sendo também o único haplótipo identificado nestas populações. As

populações de ECA e AND, localizadas na Bahia, na porção do Bioma Caatinga, e a

população de SAU, na Mata Atlântica do litoral Baiano, compartilharam o mesmo

haplótipo (H4), também único destas populações. As duas populações da Amazônia,

PAR e RDU não compartilharam nenhum haplótipo. Nota-se que o baixo valor da

diversidade haplotípica (h) é dado pelo grande número de populações monomórficas.

Tabela 6: Parâmetros de diversidade molecular das populações de C. brasiliense. N

(tamanho da população); S (número de sítios polimórficos); H (número de haplótipos);

h (diversidade haplotípica) e π (diversidade nucleotídica).

Populações N S H h π PSUL-PR 9 0 1(H1) 0,00 0,00 IDM-PR 9 0 1(H1) 0,00 0,00 ANT-PR 6 0 1(H1) 0,00 0,00 PIC-SP 5 1 2(H1;H2) 0,40 0,00042 POA-RJ 7 0 1(H1) 0,00 0,00 CAB-RJ 7 0 1(H1) 0,00 0,00 UNI-RJ 7 0 1(H1) 0,00 0,00

MAC-RJ 7 0 1(H1) 0,00 0,00 LIN-ES 9 0 1(H1) 0,00 0,00 VVE-ES 9 22 2(H1; H3) 0,222 0,00510 CAR-BA 9 0 1(H1) 0,00 0,00 PSE-BA 8 0 1(H1) 0,00 0,00 ILH-BA 7 0 1(H1) 0,00 0,00 SAU-BA 8 0 1(H4) 0,00 0,00 TIR-MG 10 0 1(H6) 0,00 0,00 COR-BA 8 0 1(H1) 0,00 0,00 SIL-BA 8 0 1(H1) 0,00 0,00 SDE-BA 7 0 1(H1) 0,00 0,00 BAR-BA 8 0 1(H5) 0,00 0,00 AND-BA 8 0 1(H4) 0,00 0,00 ECA-BA 9 0 1(H4) 0,00 0,00 PAR-PA 8 0 1(H7) 0,00 0,00

RDU-AM 10 1 2(H8;H9) 0,533 0,00056 CRI-CR 9 0 1(H10) 0,00 0,00

39

Figura 13: Mapa de distribuição dos 10 haplótipos identificados (atpH-atpI+ psbA-

trnH) em 24 populações de C. brasiliense. As cores dos círculos indicam o haplótipo e o

tamanho do círculo indica o número de indivíduos amostrados por população.

40

Figura 14: Rede de haplótipos construída com base na análise de duas regiões de

cpDNA (atpH-atpI e psbA-trnH). As cores indicam os haplótipos e o tamanho do

círculo a freqüência de ocorrência do haplótipo (considerando todos os 192 indivíduos

das 24 populações). Os números representam as posições das mutações. Cada número é

um passo mutacional. Nodos em vermelho representam median vectors (haplótipos não

amostrados ou haplótipos ancestrais extintos).

Os resultados da análise Bayesiana, implementada a fim de identificar a

estruturação genética das populações de C. brasiliense, revelou seis clusters como o

melhor agrupamento (K=6 e Log-marginal likelihood igual -382.2681). Nota-se que as

populações da Mata Atlântica, exceto a população de SAU na Bahia, junto com as

populações do Cerrado da Bahia, formaram um único agrupamento. A população de

SAU e as duas populações no enclave de Caatinga, ECA e AND, formam um único

grupo (Figura 15). A análise bayesiana, não leva em conta a distribuição geográfica das

populações, e se baseia nas relações genealógicas dos haplótipos. Observa-se que esta

análise identificou agrupamentos que são formados por mais de um “cluster”, por

exemplo, a população de RDU é formada por três “clusters”: cluster 1 (predominante

41

nas populações da Mata Atlântica), cluster 3, presente nas populações da Caatinga e

cluster 4, presente na população de TIR no cerrado mineiro (figura 15). Os resultados

também revelam a população de BAR, no Cerrado, como agrupamento das populações

situadas na Mata Atlântica, pelo fato de tal população, apresentar o haplótipo H5

originado do haplótipo H1 (figura 14, Network), comum em quase todas as populações

da Mata Atlântica.

Figura 15: Análise Bayesiana de indivíduos de C. brasiliense para o modelo de

agrupamento k=6. Os clusters genéticos, k=6, são indicados por diferentes cores.

A Análise de estruturação geográfica por meio do SAMOVA mostrou que as

populações de C. brasiliense estão geograficamente estruturadas em nove filogrupos

(k=9, Fct = 94,53) (figura 16). A baixa diversidade haplotípica dentro das populações e

existência de haplótipos únicos em determinadas populações contribui para esta alta

estruturação geográfica de C. brasiliense. As populações de SAU, ECA e AND

formaram um único filogrupo, corroborando com os dados da Análise Bayesiana.

42

Figura 16: Representação dos nove filogrupos de C. brasiliense segundo a análise da

SAMOVA. Algarismos em romanos nos círculos indicam os filogrupos.

Os índices de estruturação, Nst e Gst, mostraram que as populações estão

altamente estruturadas (Gst =0, 858 ± 0.0688 e Nst =0, 804± 0.1093). Considerando toda

a diversidade haplotípica, o Gst foi maior do que o Nst e não significativo (Gst =0, 858 e

Nst=0, 804). Removendo o haplótipo H3, da população de VVE, haplótipo este muito

divergente dos demais para esta população, um novo Gst e Nst foi calculado (Gst=

0.935± 0.0421 e Nst=0, 986± 0.0117). Apesar do maior valor de Nst em relação ao Gst,

indicativo de estruturação, o teste não foi significativo.

A análise de variância molecular mostrou que, considerando todas as populações

como um único grupo, a maior parte da diferenciação encontra-se entre as populações.

Quando as populações são agrupadas de acordo com os grupos identificados pelo

SAMOVA (nove grupos), a maior parte da diferenciação está entre os grupos (tabela 7).

43

Tabela 7: Resultados da Análise de Variância Molecular baseado no cpDNA (atpH-

atpI+ psbA-trnH) de C. brasiliense.

Índice de fixação - Fst: 0.91025, P=0.0000 Teste de significância (1023 permutações)

P=0.000000 Teste de significância (1023 permutações) Fct = 0,94531; Fst = 0,93725; Fsc = -0,14734

Considerando os resultados do algoritmo de Monmonier’s (programa Barrier),

tal teste sugeriu algumas barreiras ao fluxo gênico entre as populações de C. brasiliense.

Uma das barreiras coincide com um afluente do Rio São Francisco, o Rio Grande,

localizado entre a população de BAR e as demais populações do Cerrado da Bahia. Para

as demais barreiras sugeridas não foi possível identificar nenhuma Bacia Hidrográfica

coincidente. Observa-se que há uma barreira separando o filogrupo VIII (AND, ECA,

SAU) dos filogrupos II e VII, o que pode ser um indicativo de uma barreira fisiográfica.

Na figura 17 são apresentadas as figuras gráficas de oito barreias genéticas projetadas

ao longo do mapa de distribuição geográfica das populações de acordo com a análise

realizada no programa Barrier versão 2.2.

Um grupo (compreendendo as 24 populações)

Fonte de variação Soma dos quadrados

Componentes de variação Porcentagem de variação

Entre populações 282,6 1, 51861 91,02

Dentro das populações 25, 156 0, 14974 8,98

Nove grupos identificados pelo SAMOVA

Fontes de variação Soma dos quadrados Componentes de Variação

Porcentagem de variação

Entre grupos 282, 600 2,25588 94,53

Entre populações dentro grupos

0, 000 -0,01923 -0,81

Dentro das populações 25, 156 0,14974 6,27

44

Figura 17: Projeção das oito barreiras identificadas pelo programa Barrier 2.2. A Seta

preta indica uma barreira que coincide com o Rio Grande, localizado entre a população

BAR e as populações: SDE, COR e SIL; Seta vermelha indica uma barreira separando o

agrupamento VIII (ECA, AND, SAU) dos filogrupos II e VII

A razão r entre o fluxo de pólen e de sementes foi de mp/ms = 26,89, indicando

que o pólen contribui de maneira muito mais efetiva para o fluxo gênico total de C.

brasiliense do que a semente (Tabela 8).

45

Tabela 8: índices de estruturação genética com base em marcadores com herança

biparental (nuclear) e uniparental materna (cloroplasto). mp e ms = taxa de migração via

pólen e via sementes, respectivamente.

Fst Nuclear Fstc Cloroplasto mp/ms

0,26 (Bottino, 2006) 0, 91025 26,89

IV.5 História Demográfica

A história demográfica foi analisada para (i) todas as populações como um único

grupo, (ii) para cada população, (iii) para os filogrupos identificados pela SAMOVA e

(iv) por bioma. Devido à baixa variabilidade haplotípica dentro das populações, só foi

possível aplicar os testes Tajima D e Fu’s F e o Fu and Li’s D e F nas populações com

mais de um haplótipo (Tabela 9).

Tabela 9: Parâmetros de expansão demográfica por população de C. brasiliense.

Significância *p<0,01; **p<0,002

Populações Tajima’s D Fu's Fs Fu and Li’s F Fu and Li’s D PSUL-PR - - - - IDM-PR - - - - ANT-PR - - - - PIC-SP -0,816 0,090 -0,771 0,81650 POA-RJ - - - - CAB-RJ - - - - UNI-RJ - - - -

MAC-RJ - - - - LIN-ES - - - - VVE-ES -1,957* 7,059 -2,427** -2,232** CAR-BA - - - - PSE-BA - - - - ILH-BA - - - - SAU-BA - - - - TIR-MG - - - - COR-BA - - - - SIL-BA - - - - SDE-BA - - - - BAR-BA - - - - ECA-BA - - - - AND-BA - - - - PAR-PA - - - - RDU-AM 1,302 1.029 1,02604 0,80424 CRI-CR - - - -

46

A análise de todas as populações como único grupo não revelou expansão

demográfica para C. brasiliense (tabela 10). Na figura 18 é apresentado o gráfico da

distribuição Mismatch como não - unimodal para as populações como um único grupo.

Considerando os nove filogrupos identificados na SAMOVA, o filogrupo III, formado

apenas pela população de VVE, apresentou sinal de expansão demográfica. Este

filogrupo obteve valores negativos e significativos para Tajima’ D, Fu and Li’s D, F e

Fu’Fs

Tabela 10: Parâmetros do teste de expansão demográfica de filogrupos e de todas as

populações de C. brasiliense.

Parâmetros Único grupo

GI GII GIII GIV GV GVI GVII GVIII GIX

Tajima’s D -1,730 - - -1, 957* -0, 81650 - 1, 3026 - - -

Fu and Li’s F

-2,106 - - -2,427** -0,77152 - 1,02604 - - -

Fu and Li’s D

-1,764 - - -2,232** -0,81650 - 0,80424 - - -

Fu’s Fs 2,299 - - 7,059 0.090 - 0,090 - - -

Distribuição Mismatch

Não Unimodal

- - - - - - - - -

Significância*p <0, 01; **p < 0,02

Figura 18: Distribuição Mismatch para todas as populações de C. brasiliense como um

único grupo. Os valores observados estão como o esperado, distribuídos de forma não-

unimodal.

47

Considerando os testes de demografia por bioma: Mata atlântica, Cerrado,

Caatinga, Amazônia e Floresta Tropical da Costa Rica, os valores de Tajima’D, Fu and

Li’s F e D foram negativos e significativos para Mata Atlântica, indicando expansão

demográfica. Este resultado indica uma recente colonização de C. brasiliense na Mata

Atlântica (Tabela 11). A Distribuição Mismatch foi unimodal para as populações

situadas no bioma Mata Atlântica (Figura 19).

Tabela 11: Parâmetros do teste de demografia por Bioma: Mata Atlântica, Cerrado,

Caatinga, Amazônia e Floresta Tropical da Costa Rica.

Parâmetros Mata Atlântica

Cerrado Caatinga Amazônia Floresta Tropical CR

Tajima’s D -2, 541*** 1, 158 - 2, 413 -

Fu and Li’s F -6, 263** 1, 0217 - 1, 763* -

Fu and Li’s D -6, 913** 0, 756 - 1, 198 -

Fu's Fs 0,188 2,831 - 3, 940 -

Distribuição Mismatch

Unimodal Não-unimodal - Não-unimodal -

Significância *p<0,05; ** p>0,02; ***P>0, 001

Figura 19: Distribuição Mismatch para as populações da Mata Atlântica. Os valores

observados estão como o esperado, distribuídos de forma unimodal.

48

V. DISCUSSÃO

V.1 Padrões filogeográficos de C. brasiliense Considerando todas as populações como pertencentes a um único grupo, a

AMOVA indicou alto nível de estruturação genética, com 91% da variação estando

relacionada às diferenças entre as populações. O Gst (0,935), apesar de não

significativo, foi menor do que Nst (0,986), indicando a presença de estrutura

filogeográfica. Como esperado, a estruturação populacional com base no genoma do

cloroplasto (Gst = 0,935) foi maior do que para o genoma nuclear (Fst = 0,26 – Bottino,

2006). O resultado da razão entre fluxo gênico via pólen versus semente (r = 26,89)

mostra que há maior movimento do pólen que da semente, e consequentemente a

semente contribui de maneira menos efetiva para o fluxo gênico total da espécie.

Resultados similares foram encontrados para a espécie arbórea Symphonia globulífera

L. (Clusiaceae), que apresenta características semelhantes à Calophyllum brasiliense,

como dispersão de sementes mediada por morcegos e ocorrência exclusivamente em

locais alagados (Fstc = 0,953 e r = 86,37 ou 20,50 – dependendo do marcador nuclear

utilizado). Dados obtidos com base em nSSR e sequenciamento de regiões nucleares do

cloroplasto (Dick & Heuertz, 2008).

Segundo Degen et al. (2001), uma baixa dispersão de sementes esta

relacionada a uma forte estruturação genética, e uma ampla dispersão esta relacionada a

uma baixa estruturação. O baixo nível de diversidade genética intra-populacional (21

das 24 populações foram monomórficas), somado ao alto nível de diferenciação

populacional, principalmente entre populações de diferentes biomas, indicam baixo

fluxo gênico mediado pelas sementes em C. brasiliense.

Collevatti et al. (2003) também encontrou uma alta contribuição do pólen

em relação ao fluxo de sementes para Caryocar brasiliense Camb - pequi (r= 101,34,

dados com base em microssatélites nucleares e no sequenciamento de regiões não

codificadoras do cloroplasto). Estes resultados foram atribuídos ao fato das sementes

(barocóricas) de Caryocar brasiliense possuírem mecanismos de dispersão menos

eficientes do que o pólen (disperso por morcegos). O guanandi é uma espécie polinizada

por abelhas e com dispersão das sementes por morcegos. Embora os morcegos ajam

como dispersores efetivos das sementes, para a colonização de novas áreas e

estabelecimento da semente de C. brasiliense é necessário solo úmido. Desta maneira,

mesmo que os morcegos as transportem à longa distância, se as mesmas caem em locais

49

impróprios, a espécie não se estabelece. Esta característica pode de certa forma limitar o

sucesso do fluxo gênico via sementes em C. brasiliense e, por tanto, refletir a alta

estruturação genética e a baixa diversidade encontrada, principalmente, dentro das

populações.

Embora a estruturação da variação genética ao longo do espaço geográfico

seja influenciada principalmente por fatores ligados à biologia reprodutiva da espécie

como dispersão de pólen e semente, outros fatores também são determinantes para

moldar padrões filogeográficos, tais como fatores biogeográficos, históricos-

demográficos e barreiras geográficas (Walker & Avise, 1998). Os padrões

filogeográficos encontrados para C. brasiliense podem estar relacionados com a história

do quaternário nas florestas brasileiras.

As análises filogeográficas de C. brasiliense indicam uma recente expansão

demográfica para as populações situadas na Mata Atlântica. As populações amostradas

de C. brasiliense neste estudo estão principalmente presentes em florestas inundáveis na

Mata Atlântica (Floresta Atlântica – Baixo Montana) e em florestas de Galeria e Mata

Ciliar no bioma Cerrado. Estudos Paleoclimáticos sugerem que áreas do Sul e Sudeste

do planalto brasileiro foram encobertos com campos subtropicais durante o Último

Máximo Glacial, o que refletia um clima mais seco e frio (Behling, 2002). Durantes os

períodos glaciais as Matas de Galeria e as florestas tropicais semideciduais poderiam ter

existido onde as geadas não fossem muito freqüentes, provavelmente na parte Norte e

Sudeste do Brasil. No Holoceno, quando o clima tornou-se mais favorável, houve início

da expansão das matas tropicais, provavelmente originadas das matas de galeria e de

remanescentes em regiões que eram livres das fortes geadas (Behling, 1998). A

expansão das populações de C. brasiliense na Mata Atlântica, após o restabelecimento

das condições climáticas, pode ter ocorrido inicialmente pelas matas ciliares. Resultado

semelhante também foi encontrado para Hymenaea coubaril L. que aponta para uma

recente expansão de populações do Cerrado via florestas de galeria, e que tais

populações compartilham haplótipos com a Mata Atlântica (Ramos et al., 2009).

Segundo Oliveira-Filho e Ratter (1995), muitas espécies, tanto da Amazônia quanto do

Atlântico, são conhecidas por expandirem sua distribuição via florestas de galeria. As

populações de SDE, SIL e COR no Cerrado, contêm o haplótipo mais comum da Mata

Atlântica (H1). O sinal de uma recente expansão demográfica de C. brasiliense (análises

demográficas) na Mata Atlântica reforça a hipótese que esta região pode ter sido

recolonizada, por uma única linhagem comum ao Cerrado, via florestas de galeria, ou

50

por imigrantes da parte Nordeste (Litoral da Bahia) da Mata Atlântica. Espera-se que

regiões colonizadas depois dos períodos glaciais tenham reduzidos níveis de variação

genética e grandes áreas geográficas fixadas por apenas um haplótipo (Hewitt, 2000),

como encontrado para C. brasiliense ao longo da Mata Atlântica (Figura 13). O

haplótipo H1 é o mais freqüente. Isso sugere que este haplótipo fez parte de uma

população ancestral de C. brasiliense, e que por efeito fundador colonizou a Mata

Atlântica. O sucesso de um evento de fundação que ocorre durante o período de

colonização resulta em forte diferenciação e baixa diversidade genética dentro das

populações (Austerlitz et al., 2000) como encontrado para nossa espécie. A baixa

diversidade em populações recém fundadas esta diretamente ligada ao pequeno número

de fundadores (Austerlitz et al., 2000).

O compartilhamento do haplótipo H1 por todas as populações da Mata atlântica,

exceto SAU, sugere dispersão à longa distância entre as populações na Costa Atlântica.

Nossos resultados sugerem que barreiras geográficas, como bacias hidrográficas não

foram limitantes ao fluxo gênico via sementes entre as populações de C. brasiliense na

Mata Atlântica, contrastando com resultados encontrados para outras espécies de

árvores, tal como Dalbergia nigra Vell. (Ribeiro et al., 2011). Em populações de D.

nigra, há um ponto de divisão genética que se encontra entre as Bacias do Rio Doce

(Espírito Santo) e Jequitinhonha (Bahia). Este padrão também foi encontrado para

espécies animais, como pequemos mamíferos (Costa, 2003) e aves (Cabanne et al.,

2007). A análise do algoritmo de Monmonier- programa Barrier (Figura 17) não

identificou nenhuma barreira relevante ao longo da Costa Atlântica. O guanandi

apresenta síndromes de dispersão de sementes que podem explicar o padrão genético

encontrado. Os morcegos possivelmente conseguem transpor os rios e alcançar

populações situadas em margens opostas, em diferentes rios ou até mesmo em

diferentes bacias hidrográficas. Os morcegos são importantíssimos como agentes

efetivos para dispersão de sementes de diversas espécies vegetais, levando-as a longas

distâncias e possibilitando a colonização e regeneração de novas áreas (Figliolia &

Kageyama, 1995).

Além disso, a dispersão pela água contribui para este padrão encontrado para as

populações da Mata Atlântica. Para espécies situadas ao longo de rios, a dispersão de

sementes a longas distâncias entre populações não-adjacentes resulta em baixa

diferenciação genética (Honnay et al., 2010). As extremas cheias, somadas à dinâmica

dos rios (correnteza), nas margens dos quais se encontra C. brasiliense, pode contribuir

51

para a dispersão à longa distância e promover a colonização de novas áreas. C.

brasiliense possui sementes com capacidade de flutuação, o que permite seu

deslocamento ao longo do fluxo do corpo da água nos rios. A colonização recente de

uma única linhagem na Mata Atlântica, somado aos mecanismos eficientes de dispersão

de sementes, explicam a rápida expansão demográfica desta espécie ao longo da Costa

Atlântica.

Em termos de áreas geográficas, o estado da Bahia foi o que apresentou maior

número de haplótipos (H1, H4 e H5). Outras árvores neotropicais, como Dalbergia

nigra (jacaradá da Bahia - Ribeiro et al., 2011), Hymenaea stigonocarpa Mart. (jatobá

do cerrado - Ramos et al., 2007), Hymenaea courbaril L. (jatobá - Ramos et al.,2009) e

Schizolobium parahyba (Vell.) Blake (guapuruvu - Zolet, 2009) apresentam a região da

Bahia como uma área de alta diversidade haplotípica. Estudos de modelagem climática

relatam a parte central da Bahia como uma área de estabilidade climática durante o

quaternário, o que aponta esta região como um provável refúgio no passado (Carnaval

& Moritz, 2008; Carnaval et al., 2009). No entanto, apesar desta região ter apresentado

maior número de háplotipos, o haplótipo H1 também foi encontrado em outras regiões

geográficas (ES, RJ, SP, PR), o que sugere que o padrão encontrado para C. brasiliense

não vai ao encontro do modelo filogeográfico encontrado para outras espécies, no qual

populações no Nordeste formam um componente filogeográfico totalmente distinto do

Sul-Sudeste (Carnaval & Moritz, 2008; Cabanne et al., 2007; Carnaval et al., 2009;

Ribeiro et al., 2011). Dados semelhantes também foram encontrados para Plathymenia

reticulata (vinhático - Novaes et al., 2010), o que sugere que diferentes espécies

responderam de forma diferente às mudanças climáticas do Quaternário.

A existência de um filogrupo distinto (filogrupo VIII), abrangendo o enclave de

Caatinga e uma população da costa Atlântica (SAU) (Figura 15 e 16), pode estar

associada ao clima e ao complexo vegetacional nesta área. O enclave de Caatinga da

Bahia onde procedeu à amostragem, hoje é um mosaico de vegetação que inclui as

florestas estacionais semideciduais, cadeias de montanhas, e o complexo da Chapada

Diamantina. O frio e a aridez, somado à complexidade da paisagem poderiam ter

afetado a vegetação durante os períodos glaciais, resultando no padrão distinto

observado nesta área. Segundo Pennington et al., (2000) a Caatinga passou por períodos

secos no Último Máximo Glacial e pode ter ampliado sua distribuição durante tais

períodos. Mesmo que estas populações ocorressem próximas aos cursos dos rios, a

vegetação e o clima árido seriam obstáculos fluxo de sementes. O clima seco e frio

52

possivelmente impossibilitaria a ocorrência dos dispersores limitando o fluxo gênico, e

aumentando a diferenciação entre as populações situadas nesta área (ECA, AND, SAU)

das demais populações. A análise do Barrier apontou uma barreira separando estas

populações (ECA, AND, SAU) das demais populações da Bahia e das populações da

Mata Atlântica. Esta barreira não coincide com nenhuma bacia hidrográfica, mas

observa-se que estas populações estão localizadas em um ponto de divisão entre a bacia

do São Francisco e a Bacia do Atlântico Leste (Figura 20) e mesmo que tais bacias não

sejam barreiras, o padrão encontrado para estas populações podem ser o indicativo de

uma barreira fisiográfica.

Figura 20: (A) Localização dos haplótipos por bacias hidrográficas no Brasil. ■ Bacia

Amazônica; ■ Bacia do São Francisco; ■ Bacia do Atlântico leste; ■ Bacia do Atlântico

Sudeste (B) Detalhe da Bacia do São Francisco e distribuição dos haplótipos.

Os dados indicam a ocorrência de nove linhagens em C. brasiliense (Figura 16).

Como C. brasiliense é uma espécie de ampla distribuição, este resultado pode ser

devido ao isolamento por distância (Wrigth 1943) ou por uma alta frequência de

mutação nas regiões não-codificadoras estudadas no presente trabalho. A análise

Bayesiana identificou que a população da Reserva Ducke (RDU), situada na Floresta

Amazônica, possui agrupamentos genéticos similares aos da Caatinga, Mata Atlântica e

da população de Minas Gerais, situada no Cerrado mineiro, indicando uma possível

ancestralidade em comum (Figura 15). A propagação de áreas favoráveis depois das

53

glaciações pode ter causado contato entre diferentes linhagens durante os períodos

interglaciais. A presença de haplótipos pertencentes a linhagens evolutivas similares na

população da RDU e nas populações do Cerrado, Caatinga e Mata Atlântica vai ao

encontro do modelo proposto por Oliveira-Filho & Ratter (1995) que sugerem que a

rede de Florestas de Galeria do Brasil Central parece conectar no sentido noroeste-

sudeste a Floresta Amazônica à Floresta Atlântica. Segundo estes autores, esta rota teria

existido para espécies dependentes de solos mais úmidos, como C. brasiliense, o que

operaria por meio das matas ciliares. Segundo Oliveira-Filho e Ratter (2000) essa

conexão teria ocorrido no Brasil Central, seja na forma de um corredor contínuo, ou

como várias manchas florestais. Para Pires (1984), a existência de refúgios florestais na

Amazônia durante as eras glaciais não teria a configuração de ilhas, mas sim um padrão

dendrítico ao longo da drenagem dos rios. Estudos palinológicos indicam que durante a

maior parte do Pleistoceno, o clima do Brasil Central, teria sido mais seco que o atual,

mas não severamente árido (Ledru, 1993), o que teria favorecido a permanência das

matas ciliares.

A região da Floresta Amazônica, amostrada no presente estudo pelas populações

da Reserva Ducke (RDU) e do Pará (PAR), apresentou haplótipos únicos, e tais

populações não compartilharam nenhum dos haplótipos entre si. Este padrão parece ser

comum para espécies da Amazônia. Resultado semelhante foi observado para

populações de mogno (Switenia macrophylla) as quais praticamente não compartilham

haplótipos entre si (Lemes et al., 2010), o que aumenta a estrutura genética destas

populações. A estabilidade climática da América do Sul durante o pleistoceno pode ter

contribuído para a manutenção da diversidade na região Amazônica, refletindo no

padrão encontrado para esta área (Lemes et al., 2003).

Em nosso estudo a população da Costa Rica apresentou um único haplótipo,

divergente dos demais háplotipos encontrados no Brasil. Apesar da baixa amostragem

nesta área, os resultados indicam uma alta diferenciação entre a população da América

Central e as populações do Brasil. Resultado semelhante foi encontrado por Zolet

(2009) para populações de Schizolobuim parahyba. Neste estudo foi observado apenas

um haplótipo nas populações da América Central, e tais populações eram muito

diferenciadas das demais populações do Brasil. Os estudos de Dick & Heuertz (2008) e

Lemes et al. (2010) também relatam uma forte quebra filogeográfica entre populações

da América Central e populações situadas na Floresta Amazônica. Esta forte divisão

filogeográfica entre América Central e as populações situadas na Amazônia pode estar

54

relacionada a um longo período de isolamento destas áreas para diferentes espécies

vegetais.

55

VI. CONCLUSÕES

De acordo com os resultados apresentados neste estudo pode-se concluir:

As bacias hidrográficas atuam como barreiras ao fluxo gênico entre as

populações?

Bacias hidrográficas não são barreiras ao fluxo gênico via sementes entre

as populações amostradas de C. brasiliense, principalmente entre as populações da Mata

Atlântica. O compartilhamento de um mesmo haplótipo entre diferentes bacias sugere

que há fluxo gênico via sementes entre populações de distintas áreas geográficas. A

ocorrência de fluxo gênico entre populações de C. brasiliense, principalmente das

situadas no domínio Atlântico, pode ser explicado pelos modos de dispersão de

sementes da espécie. A zoocoria (morcegos) e a hidrocória (água) atuam

simultaneamente e promovem o fluxo gênico. Os morcegos conseguem transpor os rios

e assim colonizar novas áreas. A dispersão pela água aliada as características

adaptativas da espécie é fator relevante, que contribui para o fluxo gênico a longa

distância via sementes.

Qual a influência dos eventos históricos do quaternário na atual estrutura genética

de C. brasiliense?

Os eventos históricos do pleistoceno parecem ter exercido influência na

atual distribuição da variabilidade genética do guanandi. O padrão de estruturação atual

observado para as populações de C. brasiliense na Mata Atlântica apontam para uma

recente expansão demográfica, o que parece ser explicado pela colonização de uma

única linhagem após o restabelecimento das condições climáticas na fase interglacial. A

dispersão de uma única linhagem, somada a rápida expansão, possivelmente foi

facilitada pelos mecanismos de dispersão de sementes da espécie.

56

As relações genealógicas dos haplótipos situados em diferentes domínios

fitogeográficos podem inferir relações histórico-evolutivas entre os biomas

amostrados (Mata Atlântica, Floresta Amazônica, Cerrado e Caatinga)?

Os dados sugerem uma possível relação entre a população da Amazônia e

as populações do Cerrado, Caatinga e Mata Atlântica, indicando que no passado pode

ter ocorrido contato entre diferentes linhagens. Este contato possivelmente operaria por

meio das floretas de galeria no Cerrado, atuando como corredor entre as duas grandes

florestas. Linhagens se divergiram ao longo do tempo, resultando no atual padrão

observado.

57

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Andrade, I. M.; Mayo, S. J.; Van Den Berg, C.; Fay, M. F.; Chester, M.; Lexer, C.;

Kirkup, D. 2007. A Preliminary Study of Genetic Variation in Populations

of Monstera adansonii var. klotzschiana (Araceae) from North-East Brazil,

Estimated with AFLP Molecular Markers. Annals of Botany, 100: 1143–

1154.

Angiosperm Phylogeny Group 2009. An update of the Angiosperm Phylogeny Group

classification for the orders and families of flowering plants: APG III.

Botanical Journal of the Linnean Society, 161: 105-121.

Araujo, D. S. D. 2000. Análise florística e fitogeográfica das restingas do estado do Rio

de Janeiro. Tese de Doutorado. Departamento de Ecologia. IB. UFRJ.

Asmussen, C. B. 1999. Toward a chloroplast DNA phylogeny of the tribe Geonomeae

(Palmae). Mem. N.Y. Bot. Gard, 83. 121–129.

Austerlitz, F.; Mariette, S.; Machon, N.; Gouyon, P. H.; Godelle, B. 2000. Genetics,

154: 1309-1321.

Avise, J. C. 2000. Phylogeography: the history and formation of species. Harvard

University Press.

Avise, J. C. 2009. Phylogeography: retrospect and prospect. Journal of biogeography,

36:3-15.

Bandelt, H. J; Forster, P. Ro¨hl, A. 1999. Median-joining networks for inferring

intraspecific phylogenies. Mol Biol Evol, 16: 37–48.

Behling, H. 1998. Late Quaternary vegetational and climatic changes in Brazil. Rev

Paleobot Palynol, 99: 143–156.

Behling, H. (2002). South and southeast Brazilian grasslands during late Quaternary

times: a synthesis. Palaeogeogra Palaeoclimatol Palaeoecol, 177: 19–27.

Behling, H & Negrelle, R. R. B. 2001. Tropical Rain Forest and Climate Dynamics of

the Atlantic Lowland. Southern Brazil. during the Late Quaternary.

Quaternary Research, 56: 383-389.

Behling, H.; Dupont, L.; Safford, H. D.; Wefer, G. 2007. Late Quaternary vegetation

and climate dynamics in the Serra da Bocaina. southeastern Brazil.

Quaternary International, 161: 22-31.

58

Behling, H. 2002. South and southeast Brazilian grasslands during Late Quaternary

times: a synthesis. Palaeogeography Palaeoclimatology Palaeoecology, 177:

19-27.

Bohrer, G.; Nathan, R.; Volis, S. 2005. Effects of long-distance dispersal for

metapopulation survival and genetic structure at ecological time and spatial

scales. Journal of Ecology ,93: 1029-1040.

Botrel, R. T.; Oliveira-Filho, A. T.; Rodrigues, L. A.; Curi, N. 2002. Influência do solo

e topografia sobre as variações da composição florística e estrutura da

comunidade arbórea-arbustiva de uma floresta semidecidual em Ingaí. MG.

2002. Revista Brasileira de Botânica, 25 (2): 195-213.

Botrel, M. C. G.; Souza, A. M.; Carvalho, D.; Pinto. S. I. C.; Moura, M. C. O.; Estopa,

R. A. 2006. Caracterização genética de Calophyllum brasiliense Camb. em

duas populações de mata ciliar. Revista Árvore, 30 (5): 821-827.

Bottino, M. C. Análise da diversidade Genética de Calophyllum brasiliense Camb

(Clusiaceae) utilizando marcadores AFLP. Dissertação de Mestrado.

Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Brown, J. H & Lomolino. M. V. 2006. Biogeografia. Funpec. 2ªedição.

Cabanne, G. S.; Santos, F. R.; Miyaki, C. Y. 2007. Phylogeography of Xiphorhynchus

fuscus (Passeriformes. Dendrocolaptidae): vicariance and recent

demographic expansion in southern Atlantic forest. Biological Journal of the

Linnean Society,91: 73–84.

Caicedo, A. L. & Schaal, B. A. 2004. Population structure and phylogeography of

solanum pimpinellifolium inferred from a nuclear gene. Molecular Ecology,

13: 1871-1882.

Carnaval, A. C. & Moritz, C. 2008. Historical climate modelling predicts patterns of

current biodiversity in the Brazilian Atlantic forest. Journal of

Biogeography, 35: 1187-1201.

Carnaval, A. N.; Hickerson, M. J.; Haddad, C. B. F.; Rodrigues, M. T.; Moritz, C. 2009.

Stability Predicts Genetic Diversity in the Brazilian Atlantic Forest Hotspot.

Science, 323: 785- 789.

Caron, H.; Dumas. S.; Marque, G.; Messier, C.; Bandou, E.; Petit, R. J.; Kremer, A.

2000. Spatial and temporal distribution of chloroplast DNA polymorphism

in a tropical tree species. Molecular Ecology, 9: 1089- 1098.

59

Carvalho, P. E. R. Espécies florestais Brasileiras recomendações silviculturais,

potencialidades e uso da madeira. Colombo: Embrapa Florestas. 1994. 640p.

Carvalho, P. E. R. 2003. Espécies arbóreas brasileiras. EMBRAPA.

Carvalho, D. A.; Oliveira-Filho, A. T.; Vilela. E A. 1996. Flora arbustivo-arbórea de

Mata Ripária do Médio Rio Grande (Conquista. Estado de Minas Gerais).

Cerne, 2 (2):48-68.

Cavers, S.; Navarro, C. & Lowe, A. J. 2003. Chloroplast DNA phylogeography revels

colonization history of a neotropical tree. Cedrela odorata in mesoamerica.

Molecular Ecology, 12: 1451-1460.

Collevatti, R. G.; Grattapaglia, D.; Hay, J. D. 2003. Evidences for multiple maternal

lineages of Caryocar brasiliense populations in the Brazilian Cerrado based

on the analysis of chloroplast DNA sequences and microsatellite haplotype

variation. Molecular Ecology, 12: 105-115.

Collevatti, R. G.; Rabelo, S. G.; Vieira, R. F. 2009. Phylogeography and disjunct

distribution in Lychnophora ericoides (Asteraceae). an endangered Cerrado

shrub species. Annals of Botany, 104: 655-664.

Comes, H. P. & Kadereit, J. W. 1998. The effect of Quaternary climatic changes on

plant distribution and evolution. Trends in plant science, 3 (11): 432-438.

Corander, J.; Marttinen, P.; Mäntyniemi, S. 2005. Bayesian identification of stock

mixtures from molecular marker data. Fishery Bulletin, in press.

Costa, L. P. 2003. The historical bridge between the Amazon and the Atlantic Forest of

Brazil: a study of molecular phylogeography with small mammals. Journal

of Biogeography, 30: 71-86.

Da Silva, K. L.; Santos, A. R. S.; Mattos, P. E. O.; Yunes, R. A.; Delle-Monache, F.;

Cechinel – Filho, V. 2001. Chemical composition and analgesic activity of

Calophyllum brasiliense leaves. Thérape, 56: 431-434.

Degen, B.; Bandou, E.; Caron, H. 2004. Limited pollen dispersal and biparental

inbreeding in Symphonia globulifera in French Guiana. Heredity, 93: 585-

591.

Degen, B; Petit, R. J.; Kremer, A. 2001. SGS. Spatial Genetic Software : a computer

program for analysis of spatial genetic and phenotypic structure of individuals

and populations. Journal of Heredity, 92 (5): 447-449

60

Dick, C. W.; Bermingham, E.; Lemes, M. R.; Gribel, R. 2007. Extreme long-distance

dispersal of the lowland tropical rainforest tree Ceiba pentandra L.

(Malvaceae) in Africa and the Neotropics. Molecular Ecology, 16: 3039-

3049.

Dick, C. W.; Heuertz, M. 2008. The complex biogeographic history of a widespread

tropical tree species. Evolution, 62 (11): 2760-2774.

Doyle, J. J. & Doyle, J. L. 1987. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12:

13-15.

Duarte, H. M.; Gebler, A.; Scarano, F. R.; Franco, A. C.; Mattos, A.; Nahm, M.;

Rennenberg, H.; Rodrigues, P. J. F. P.; Zaluar, T. L.; Luttge, U. 2005.

Ecophysiology of six selected shrub species in different plant communities

at the periphery of the Atlantic Forest of SE-Brazil. Flora, 200: 456-476.

Durigan, G. & Silveira, E. R. 1999. Recomposição da mata ciliar em domínio de

cerrado. Assis. SP. Brasil. Scientia Forestalis, 56: 135-144.

Dupanloup, I.; Schneider, S.; Excoffier, L. 2002. A simulated annealing approach to

define the genetic structure of populations. Molecular ecology, 11:2571-2581.

Dutech, C.; Joly, H. I.; Jarne, P. 2004. Gene flow, historical population dynamics and

genetic diversity within French Guianan populations of a rainforest tree

species. Vouacapoua americana. Heredity, 92: 69-77

Excoffier, L.; Laval, G.; Schneider, S. 2005. Arlequin ver. 3.0: An integrated software

package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics

Online 1, 47-50

Ennos, R. A. 1994. Estimating the relative rates of pollen and seed migration among

plant populations. Heredity, 72: 250-259.

Ferreira, A. B de H. Novo dicionário da língua Portuguesa. Rio de Janeiro: Nova

Fronteira. 1975. 1499p.

Figliolia, M. B.; Kageyama, P.Y. Dispersão de sementes de Inga uruguensis Hook. Et

Arn. Em floresta ripária do rio Mogi Guaçu. município de Mogi Guaçu SP.

Revista Instituto Florestal, 7: 65-80. 1995.

Fischer, E. & Dos Santos, F. A. M. 2001. Demography, phenology and sex of

Calophyllum brasiliense (Clusiaceae) trees in the Atlantic forest. Journal of

Tropical Ecology, 17:903–909.

Fu, Y.X. 1997. Statistical tests of neutrality of mutations against population growth,

hitchhiking and background selection. Genetics, 147, 915-925

61

Fu, Y. X & Li, W. H. 1993. Statistical tests of neutrality of mutations. Genetics 133:

693–709.

Gasparotto Junior, A.; Brenzan, M. A.; Piloto, I. C.; Cortez, D. A. G.; Nakamura, C. V.;

Dias-Filho, B. P.; Rodrigues-Filho, E.; Ferreira, A. G. 2005a. Estudo

Fitoquímico e Avaliação da atividade Moluscicida do Calophyllum

brasiliense Camb. (Clusiaceae). Química. Nova, 28 (4): 575-578.

Gasparotto Junior, A.; Ferreira, I. C. P.; Nakamura, C. V.; Filho, B. P. D.; Jacomassi,

E.; Young, M. C. M.; Cortez, D. A. G. 2005b. Estudo morfo-anatômico das

folhas e caule da Calophyllum brasiliense (Clusiaceae), uma contribuição ao

estudo farmacognóstico da droga vegetal. Acta Farm. Bonaerense, 24 (3):

371-376.

Grazziotin, F. G.; Monzel, M.; Echeverrigaray, S.; Bonatto, S. 2006. Phylogeography of

the Bothrops jararaca complex (Serpentes: Viperidae): past fragmentation

and island colonization in the Brazilian Atlantic Forest. Molecular Ecology,

15: 3969-3982.

Grivet, D.; Heinze, B.; Vendramin, G. G.; Petit, R. J. 2001. Genome walking with

consensus iniciadores: application to the large single copy region of

chloroplast DNA. Molecular Ecology Notes, 1: 345-349.

Guimarães, E. F.; Mautone, L.; Mattos-Filho. A. 1998. Considerações sobre a floresta

pluvial baixo-montana: composição florística em área remanescente no

Munícipio de Silva Jardim. Estado do Rio de Janeiro. Boletim da Fundação

Brasileira para Conservação da Natureza. Rio de Janeiro. 23: 45-53.

Haffer, J. & Prance, G. T. 2002. Impulsos Climáticos da evolução biótica na Amazônia

durante o Cenozóico: sobre a teoria dos refúgios da diferenciação biótica.

Estudos Avançados, 16 (46): 175-206.

Haig, S. M.. 1998. Molecular contributions to conservation. Ecology, 79. 413-425.

Hamilton, M. B.; Braverman, J. M.; Soria- Hernanz, D. F. 2003. Patterns and Relative

Rates of Nucleotide and Insertion/Deletion Evolution at Six Chloroplast

Intergenic Regions in New World Species of the Lecythidaceae. Molecular

Biology and Evolution, 20 (10): 1710-1721.

Hamilton, M. B. 1999a. Tropical tree gene flow and seed dispersal. Nature, 401: 129-

130.

62

Hamilton, M. B. 1999b. Four iniciadores pairs for the amplification of chloroplast

intergenic regions with intraspecific variation. Molecular Ecology, 8: 521-

523.

Hamrick, J. L.; Godt, M. J. W. Sherman-Broyles. S. L. 1992. Factorms influencing

levels of genetic diversity in woody plant species. New Forest, 6:95-124.

Hamrick, J. L. & Nason, J. D. 1996. Consequence of dispersal in plants. In: Rhodes OE.

Ronald KC. Smith MH (eds) Population Dynamics in Ecological Space and

Time. The University of Chicago Press: Chicago, 203–235.

Hamza, N. B. 2010. Cytoplasmic and nuclear DNA markers as powerful tools in

populations’ studies and in setting conservation strategies. African Journal

of Biotechnology, 9 (29): 4510-4515.

Holl, K. D. 1998. Effects of above- and below-ground competition of shrubs and grass

on Calophyllum brasiliense (Camb.) seedling growth in abandoned tropical

pasture. Forest ecology and Management, 109: 187-195.

Honnay, O.; Jacquemyn, H.; Nackaerts, K.; Peter, B.; Looy, 2010. Patterns of

populations genetic diversity in riparian and aquatic plant species along

rivers. Journal of Biogeography, 1-10.

Kawaguici, C. B. & Kageyama, P. Y. 2001. Diversidade Genética de três grupos de

indivíduos (adultos. jovens e plântulas) de Calophyllum brasiliense em uma

população de Mata de Galeria. Scientia Forestalis, 59: 131-143.

Keller, L. F. & Waller, D. M. Inbreeding effects in wild populations. 2002. Trends in

Ecology and Evolution, 17: 230-241.

Hewitt, G. 2000. The genetic legacy of the Quaternary ice ages. Nature, 405: 907-913.

King, R. T. 2003. Succession and Micro-elevation Effects on Seedling Establishment of

Calophyllum brasiliense Camb. (Clusiaceae) in an Amazonian River

Meander Forest. Biotropica, 35 (4):462-471.

Kress, W. J. & Erickson, D. L. A. 2007. Two-Locus Global DNA Barcode for Land

Plants: The Coding rbcL Gene Complements the Non-Coding trnH-psbA

Spacer Region. Plos One, 6: 1- 10.

Kubitzki, K & Ziburski, A. 1994. Seed Dispersal in flood Plain forest of Amazonia.

Biotropica, 26 (1): 30-43.

Lara-Ruiz, P.; Chiarello, A. G.; Santos, F. R. 2008. Extreme population divergence and

conservation implications for the rare endangered Atlantic Forest sloth.

63

Bradypus torquatus (Pilosa: Bradypodidae). Biological conservation,

141:1332-1342.

Ledru, M. P. 1993. Late Quaternary environmental and climatic changes in central

Brazil. Quaternary Research, 39: 90-98.

Lemes, M. R.; Gribel, R.; Proctor, J.; Grattapaglia, D. 2003. Population genetic

structure of mahogany (Swietenia macrophylla King, Meliaceae) across the

Brazilian Amazon, based on variation at microsatellite loci: implications for

conservation. Molecular Ecology, 12: 2875-2883.

Lemes, M. R.; Dick, C. W.; Navarro, C.; Lowe, A. J.; Cavers, S.; Gribel, R. 2010.

Chloroplast DNA Microsatellites Reveal Contrasting Phylogeographic

Structure in Mahogany (Swietenia macrophylla King. Meliaceae) from

Amazonia and Central America. Tropical Plant Biology, 3: 40-49.

Librado, P. & Rozas, J. 2009. DnaSP v5: A software for comprehensive analysis of

DNA polymorphism data. Bioinformatics, 25: 1451-1452.

Lira, C. F.; Cardoso, S. R. S.; Ferreira, P. C. G.; Cardoso, M. A.; Provan, J. 2003. Long-

term population isolation in the endangered tropical tree species Caesalpinia

echinata Lam. revealed by chloroplast microsatellites. Molecular Ecology,

12: 3219-3225.

Lorenz-Lemke, A. P.; Muschner, V. C.; Bonatto, S. L.; Cervi, A. C.; Salzano, F. M.;

Freitas, L. B. 2005. Phylogeographic Inferences Concerning Evolution of

Brazilian Passiflora actínia and P. elegans (Passifloraceae) Based on ITS

(nrDNA) Variation. Annals of Botany, 95:799-806.

Lorenzi, H. 1992. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas

arbóreas nativas do Brasil. Nova Odessa: Plantarum, 352p.

Looy, K. V.; Jacquemyn, H.; Breyne, P.; Honnay, O. 2009. Effects of flood events on

the genetic structure of riparian populations of the grassland plant Origanum

vulgare. Biological Conservation, 142: 870-878.

Loveless, M. D. & Hamrick, J. L. 1984. Ecological determinants of genetics structure in

plant populations. Annual Review of Ecology and Systematics, 15: 65-95.

Manni, F.; Guérard, E.; Heyer, E. 2004. Geographic Patterns of (Genetic, Morphologic,

Linguistic) Variation: How Barriers Can Be Detected by Using

Monmonier’s Algorithm. Human Biology, 76 (2): 173-190.

Margis, R.; Felix, D.; Caldas, J. F.; Salgueiro, F.; Araujo, D. S. D.; Breyne, P.; Van

Montagu, M.; De Oliveira, D.; & Margis-Pinheiro, M. 2002. Genetic

64

differentiation among three neighboring Brazil-cherry (Eugenia uniflora L.)

populations within the Brazilian Atlantic rain forest. Biodiversity and

Conservation, 11(1): 149-163.

Marques, M. C. M. 1994. Estudos auto-ecológicos do guanandi (Calophyllum

brasiliense Camb. Clusiaceae) em uma mata ciliar do município de Brotas.

SP. M.Sc. Thesis. Universidade Estadual de Campinas. Brasil. 105pp.

Marques, M. C. M. & Joly, C. A. 2000a. Germinação e crescimento de Calophyllum

brasiliense (Clusiaceae) uma espécie típica de florestas inundadas. Acta

Botanica Brasilica, 14 (1): 113-120.

Marques, M. C. M & Joly, C. A. 2000b. Estrutura e dinâmica de uma população de

Calophyllum brasiliense Camb. em floresta higrófila no sudeste do Brasil.

Revista Brasileira de Botânica, 23: 107 – 112.

Martins, S. E.; Rossi, L.; Sampaio, P. D. S. P.; Magenta, M. A. G. 2008. Caracterização

florística de comunidades vegetais de restinga em Bertioga. SP. Brasil. Acta

Botânica Brasilica, 22 (1): 249-274.

McCauley, D. E. 1995. The use of chloroplast DNA polymorphism in studies ok gene

flow in plants. Tree, 10(5): 198-202.

Mello, M. A. R.; Leiner, N. O.; Guimarães, P. R.; Jordano, P. 2005. Size-based fruit

selection of Calophyllum brasiliense (Clusiaceae) by bats of the genus

Artibeus (Phyllostomidae) in a Restinga area. southeastern Brazil. Short

Notes.

Moraes-Barros, N. D.; Silva, J. A. B.; Miyaki, C. Y.; Morgante, J. S. 2006. Comparative

phylogeography of the Atlantic forest endemic sloth (Bradypus torquatus)

and the widespread three-toed sloth (Bradypus variegatus) (Bradypodidae.

Xenarthra). Genetica, 126: 189-198.

Moritz, C. & Faith, D. P. 1998. Comparative phylogeography and the identification of

genetically divergent areas for conservation. Molecular Ecology, 7: 419-

429.

Moritz, C. 2002. Strategies to Protect Biological Diversity and the Evolutionary

Processes That Sustain It. Syst. Biol., 51(2): 238-254.

Novaes, R. M. L.; Lemos-Filho, J. P.; Ribeiro, R. A.; Lovato, M. B. 2010.

Phylogeography of Plathymenia reticulata (Leguminosae) reveals patterns

of recent range expansion towards northeastern Brazil and southern

65

Cerrados in Eastern Tropical South America. Molecular Ecology, 19:985-

998.

Oddou-Muratorio, S.; Demesure-Musch, B.; Pélissier, R.; Gouyon, P. H. 2004. Impacts

of gene flow and logging history on the local genetic structure of a scattered

tree species, Soubus torminalis L. Crantz. Molecular Ecology, 13: 3689-

3702.

Oliveira, V. C. & Joly, C. A. 2009. Flooding tolerance of Calophyllum brasiliense

Camb. (Clusiaceae): morphological, physiological and growth responses.

Tress, 4(1):185-193.

Oliveira-Filho, A. T. & Ratter, J. A. 1995. A study of the origin of central Brazilian

forests by the analysis of plant species distribution patterns. Edinb. J. Bot.,

52 (2):141-194.

Oliveira-Filho, A. T. & Ratter, J. A. 2000. Padrões florísticos de matas ciliares da região

do Cerrado e a evolução das paisagens do Brasil Central durante o

Quaternário Tardio. In: Rodrigues, R. R.; Leitão Filho, H. F. (Eds) Matas

ciliares: conservação e recuperação. EDUSP/FAPESP, São Paulo. p.73-89.

Olsen, K. M & Schaal, B. A. 1999. Evidence on the origin of cassava: Phylogeography

of Manihot esculenta. Proc. Natl. Acad. Sci., 96: 5586-5591.

Olsen, K. M. 2002. Population history of Manihot esculenta (Euphorbiaceae) inferred

from nuclear DNA sequences. Molecular Ecology, 11: 901-911.

Ouborg, N. J.; Piquot, Y.; Van Groenendael, J. M. 1999. Population genetics. molecular

markers and the study of dispersal in plants. Journal of Ecology, 87: 551-

568.

Palma-Silva, C. 2008. Genética. Filogeografia e Fertilidade de populações de Vriesea

gigantea (Bromeliaceae). Tese de Doutorado. Universidade Federal do Rio

Grande do Sul. 173p.

Passos, F. C. & Graciolli. G. 2004. Observações da dieta de Artibeus lituratus (Olfers)

(Chiroptera. Phyllostomidae) em duas áreas do sul do Brasil. Revista

Brasileira de Zoologia, 21 (3): 487–489.

Pennington, R. T.; Prado, D. E.; Pendry, C. A. 2000. Neotropical seasonally dry forests

and Quaternary vegetation changes. Journal of Biogeography, 27: 261-273.

Petit, J .R. ; Csaikl,U.M. ; Bordács, S. ; Burg, K. ; Coart, E. ; Cottrell, J. ; Vam Dam,

B. ; Deans, J. D. ; Dumolin-Lapégue, S. ; Fineschi, S. ; Finkeldey, R. ;

Gillies, A. ; Glaz, I. ; Goicoechea, P.G. ; Jensen, J.S ; Koning, A.O. ; Lowe,

66

A.J. ; Madsen, S.F. ; Matyas, G. ; Munro, R.C. ; Olalde, M. ; Pemonge,

M.H. ; Popescu, F. ; Slade, D. ; Tabbener, H. ; Taurchini, D. ; De Vries,

S.G.M. ; Ziegenhagen, B. ; Kremer, A. 2002. Chloroplast DNA variation in

Europen white oaks Phylogeography and patterns of doversity based on data

from over 2600 populations. Forest Ecology and Management, 156 : 5-26.

Pinto, L. V. A.; Botelho, S.A.; Oliveira-Filho, A. T.; Davide, A. T. 2005. Estudo da

Vegetação como subsídios para propostas de recuperação das nascentes da

Bacia Hidrográfica do Ribeirão Santa Cruz. Lavras. MG. Revista Árvore, 29

(5): 775-793.

Pires, J. M. 1984. The Amazonian forest. In: Sioli, H. (Ed). The Amazon: limnology

and landscape ecology of a mighty tropical river and its basin. Junk Pub,

Dordrecht, 581-602.

Pons, O. & Petit, R. J.1996. Measuring and testing genetic differentiation with ordered

and unordered alleles. Genetics, 144: 1237–1245.

Pott, A. & Pott, V. J. Plantas do pantanal. Corumbá: EMBRAPA-CPAP: Brasília:

EMBRAPA-SPI. 1994.320p.

Powell, W.; Morgante, M.; McDevitt, R.; Vendramin, G. G.; Rafalski, J. A. 1995.

Polymorphic simple sequence repeat regions in chloroplast genomes:

Applications to the population genetics of pines. Population Biology,

92:7759-7763.

Provan, J.; Soranzo, N.; Wilson, N. J.; Goldstein, D. B.; Powel, W. 1999. A Low

Mutation Rate For Chloroplast Microsatellites. Genetics, 153: 943-947.

Provan, J.; Powel, W.; Hollingsworth, P. M. 2001. Chloroplast microsatellites: new

tools for studies in plant ecology and evolution. Trends in Ecology &

Evolution, 16 (3): 142-147.

Provan, J.; Biss, P. M.; McMeel, D.; Mathews, S. 2004. Universal iniciadores for the

amplification of chloroplast microsatellites in grasses (Poaceae). Molecular

Ecology Notes, 4; 262-264.

Provan, J. & Bennett, K. D. 2008. Phylogeographic insights into cryptic glacial refugia.

Trends in Ecology and Evolution, 23 (10): 564- 571.

Ramos, A. C. S. ; Lemos-Filho, J. P.; Ribeiro, R. A.; Santos, F. R.; Lovato, M. B. 2007.

Phylogeography of the Tree Hymenaea stigonocarpa (Fabaceae:

Caesalpinioideae) and the Influence of Quaternary Climate Changes in the

Brazilian Cerrado. Annals of Botany, 100: 1219-1228.

67

Ramos, A. C. S.; Lemos- Filho, J. P.; Lovato, M. B. 2009. Phylogeographical Structure

of the Neotropical Forest Tree Hymenaea courbaril (Leguminosae:

Caesalpinioideae) and Its Relationship with the Vicariant Hymenaea

stigonocarpa from Cerrado. Journal of Heredity, 100 (2): 206-216.

Reis, C. A. F.; Souza, A.M.; Mendonça, E.G.; Gonçalvez, F. R.; Melo, R.M.G.;

Carvalho, D. 2009. Diversidade e estrutura genética espacial de

Calophyllum brasiliense Camb. (Clusiaceae) em uma floresta paludosa.

Revista Àrvore, 33 (2): 265-275.

Reitz, R.; Klein, R. M.; Reis, A. 1978. Projeto madeira de Santa Catarina. Sellowia, 28-

30: 218-224.

Ribeiro, K. T.; Madeira, J. A.; Monteiro, R F. 1998. Does flooding favour galling

insects? Ecological Entomology, 23: 491-494.

Ribeiro, R. A.; Lemos-Filho, J. P.; Ramos, A. C. S.; Lovato, M. B. 2011.

Phylogeography of the endangered rosewood Dalbergia nigra (Fabaceae):

insights into the evolutionary history and conservation of the Brazilian

Atlantic Forest. Heredity, 106: 46-57.

Ridley, H. N. 1930. The dispersal of plants throughout the world. Ashford: L. Reeve &

Co.

Rizzini, C. T. 1997. Tratado de Fitogeografia do Brasil: aspectos ecológicos.

sociológicos e florísticos. Âmbito Cultural Edições. 719p.

Rizzini, C. T. 1963. Nota prévia sobre a divisão fitogeográfica (florístico-sociológica do

Brasil). Revista Brasileira de Geografia, 25 (1): 3-64.

Sartori, N. T.; Canapelle, D.; Souza, Jr. P. T.; Martins, D.T.O. 1999. Gastroprotective

effect from Calophyllum brasiliense Camb. bark on experimental gastric

lesions in rats and mice. J. Ethonpharmacol, 67: 149-156.

Selkoe, K. A.; Toonen, R. J. 2006. Microsatellites for ecologists: a practical guide to

using and evaluating microsatellite markers. Ecology Letters, 9: 615-629.

Scarano, F. R.; Ribeiro, K. T.; Moraes, L. F. D.; Lima, H.C. 1997. Plant establishment

on flooded and unflooded patches of a freshwater swamp forest in

Southeastern Brazil. Journal of Tropical Ecology, 14: 793-803.

Scarano, F. R. 1998. A Comparison of dispersal. germination and establishment of

woody plants subjected to distinct flooding regimes in Brazilian flood-prone

forests and estuarine vegetation. Pp 177-194. In: F.R. Scarano & A.C.

Franco (Eds). Ecophysiological strategies os xerophytic and amphybious

68

plants in the Neotropics. Series Oecologia brasiliensis. vol.IV. PPGE-UFRJ.

Rio de Janeiro.

Schaal, B. A. Hayworth, D. A. Olsen, K. M.; Rauscher, J. T.; Smith, W. A. 1998.

Phylogeographic studies in plants: problems and prospects. Molecular

Ecology, 7: 465-474.

Schongart, J.; Piedade, M. T.; Ludwigshausen, S.; Hornas, V.; Worbes, M. 2002.

Phenology and stem-growth periodicity of tree species in Amazonian

floodplain forests. Journal of Tropical Ecology, 18:581-597.

Shaw, J.; Lickey, E. B.; Schilling, E. E.; Small, R. L. 2007. Comparison of whole

chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for

phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise and the hare III 1.

American Journal of Botany, 94 (3): 275-288.

Silva, A. N.; Van Den Berg, E.; Higuchi, P.; Oliveira – Filho, A. T. 2007. Comparação

florística de florestas inundáveis das regiões Sudeste e Sul do Brasil.

Revista Brasileira de Botânica, 30 (2): 257-269.

Silva Junior, I. F.; Cechinel Filho, V.; Zacchino, S. A.; Lima, J. C. S.; Martins, D. T. O.

2009. Antimicrobial screening of some medicinal plants from Mato Grosso

Cerrado. Brazilian Journal of Pharmacognosy, 19 (IB): 242-248.

Souza,V. C & Lorenzi, H. 2008. Botânica Sistemática. Guia ilustrado para identificação

das famílias de fanerógamas nativas e exóticas no Brasil, baseado no APGII.

2 edição. Plantarum.

Souza, A. M.; Carvalho, D.; Vieira, F. A.; Nascimento, L. H.; Lima, D.C. 2007.

Estrutura Genética e espacial de populações naturais de Calophyllum

brasiliense Camb. em Mata de Galeria. Cerne, 13 (3): 239-247.

Steane, D. A.; Jones, C.; Vaillancourt, R. E. 2005. A set of chloroplast microsatellite

iniciadores for Eucalyptus (Myrtaceae). Molecular Ecology Notes, 5: 583-

541.

Taberlet, P.; Gielly, L.; Pautou, G.; Bouvet, J. 1991. Universal iniciadores for

amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant

Molecular Biology, 17: 1105-1109.

Tajima, F. 1989. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA

polymorphism. Genetics, 123: 585–595.

69

Tamura, K. Dudley, J. Nei, M.; Kumar, S. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary

Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and

Evolution, 10.1093/molbev/msm092.

Teixeira, A. D. P. & Assis, M. A. 2005. Caracterização Florística e Fitossociológica do

componente arbustivo-arbóreo de uma Floresta paludosa no município de

Rio Claro (SP). Brasil. Revista Brasileira de Botânica, 28 (3): 467-476.

Thomson, R. C.; Wang, I. J.; Johnson, J. R. 2010. Genome-enabled development of

DNA markers for ecology. evolution and conservation. Molecular Ecology,

19: 2184-2195.

Van Den Berg, E. & Oliveira-Filho, A. T. 2000. Composição florística e estrutura

fitossociológica de uma floresta ripária em Itutinga, MG e comparação com

outras áreas. Revista Brasileira de Botânica, 23 (3): 231-253.

Walker, D. & Avise, J.C. 1998. Principles of phylogeography as illustrated by

freshwater and terrestrial turtles in the southeastern united states. Annual

Review of Ecology and Systematics, 29: 23-58.

Weising, K. & Gardner, R. C. 1999. A set of conserved PCR iniciadores for the analysis

of simple sequence repeat polymorphisms in chloroplast genomes of

dicotyledonous angiosperms. Genome, 42: 9-19.

Wilson, A.; Arcese, P.; Keller, L. F.; Pruett, C. L.; Winker, K.; Patten, M.A.; Chan, Y.

The conservation of island populations to in situ genetic conservation. 2009.

Conservation Genetic, 10: 419-430.

Wojciechowski, M. F.; Lavin, M.; Sanderson, M. J. 2004. A phylogeny of legumes

(leguminosae) based on analysis of the plastid matk gene resolves many

well-supported subclades within the family1. American Journal of Botany,

91 (11): 1846-1862.

Zolet, A. C. T. 2009. Filogeografia e Sistemática Molecular de Schizolobium parahyba

(Vell.) Blake (Guapuruvu) através do seqüenciamento de regiões

cloroplásticas e nucleares. Tese de Doutorado. Universidade Federal do Rio

Grande do Sul.

70

ANEXOS

Anexo 1 – Comparação par a par do Fst entre populações de C. brasiliense PSUL IDM ANT PIC MAC POA CAB UNI LIN VVE SAU CAR ILH PSE AND ECA COR SDE SIL BAR TIR PAR RDU CRI

PSUL 0,000

IDM 0,000 0,000

ANT 0,000 0,000 0,000

PIC 0,822 0,822 0,773 0,000

MAC 0,000 0,000 0,000 0,792 0,000

POA 0,000 0,000 0,000 0,792 0,000 0,000

CAB 0,000 0,000 0,000 0,792 0,000 0,000 0,000

UNI 0,000 0,000 0,000 0,792 0,000 0,000 0,000 0,000

LIN 0,000 0,000 0,000 0,822 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000

VVE 0,000 0,000 -0,051 0,101 -0,030 -0,030 -0,030 -0,030 0,000 0,000

SAU 1,000 1,000 1,000 0,917 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,269 0,000

CAR 0,000 0,000 0,000 0,822 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 1,000 0,000

ILH 0,000 0,000 0,000 0,792 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 -0,030 1,000 0,000 0,000

PSE 0,000 0,000 0,000 0,809 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 -0,014 1,000 1,000 0,000 0,000

AND 1,000 1,000 1,000 0,917 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,269 0,000 1,000 1,000 1,000 0,000

ECA 1,000 1,000 1,000 0,923 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,269 0,000 0,000 1,000 1,000 0,000 0,000

COR 0,000 0,000 0,000 0,809 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 -0,014 1,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1,000 0,000

SDE 0,000 0,000 0,000 0,792 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 -0,030 1,000 0,000 0,000 0,000 1,000 1,000 0,000 0,000

SIL 0,000 0,000 0,000 0,809 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 -0,014 1,000 1,000 0,000 0,000 1,000 1,000 0,000 0,000 0,000

BAR 1,000 1,000 1,000 0,947 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,429 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,000

TIR 1,000 1,000 1,000 0,978 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,681 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,000

PAR 1,000 1,000 1,000 0,978 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0.687 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,000

RDU 0,824 0,824 0,793 0,789 0,805 0.805 0.805 0.805 0,824 0,477 0,835 0,824 0,805 0,815 0,835 0,844 0,815 0,805 0,815 0,815 0,822 0,885 0.000

CRI 1,000 1,000 1,000 0,992 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,847 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 0,962 0,000

71

Anexo 2 - Figuras dos diferentes ambientes de ocorrência de C. brasiliense.

Sete Ilhas-BA Ilhéus-BA

Cachoeira do Acaba Vida, Barreiras-BA

Porto Seguro - BA São Desidério - BA