Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro Escola Nacional de Botânica Tropical

Filogenia Molecular do Grupo Sclerolobium (Caesalpinieae, Leguminosae)

Vítor Hugo dos Santos Gomes Maia

2008

ii

Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro Escola Nacional de Botânica Tropical

Filogenia Molecular do Grupo Sclerolobium (Caesalpinieae, Leguminosae)

Vítor Hugo dos Santos Gomes Maia

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Botânica, Escola Nacional de Botânica Tropical, do Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em Botânica.

Orientadores: Dr. Sérgio Ricardo Sodré Cardoso Dr. Haroldo Cavalcante de Lima

Rio de Janeiro 2008

iii

Filogenia Molecular do Grupo Sclerolobium (Caesalpinieae, Leguminosae)

Vítor Hugo dos Santos Gomes Maia

Dissertação submetida ao corpo docente da Escola Nacional de Botânica Tropical, Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro - JBRJ, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre.

Aprovada por:

Prof. Dr. Sérgio Ricardo Sodré Cardoso (Orientador)

___________________________

Prof. Dra. Cláudia Augusta de Moraes Russo

__________________________

Prof. Dr. Vidal de Freitas Mansano

___________________________

Prof. Dr. Haroldo Cavalcante de Lima

___________________________

em __/__/2008

Rio de Janeiro 2008

iv

Maia, Vítor Hugo dos Santos Gomes.

M217f Filogenia molecular do grupo Sclerolobium (Caesalpinieae, Leguminosae) / Vítor Hugo dos Santos Gomes Maia. – Rio de Janeiro, 2008.

xiv, 62 f. : il. Dissertação (Mestrado) – Instituto de Pesquisas Jardim Botânico

do Rio de Janeiro/Escola Nacional de Botânica Tropical, 2008. Orientador: Sérgio Ricardo Sodré Cardoso. Bibliografia. 1. Filogenia Molecular. 2. Monofiletismo. 3. Leguminosae. 4.

Caesalpinieae. 5. Sclerolobium. 6. Tachigali. I. Título. II. Escola Nacional de Botânica Tropical.

CDD 583.38

v

AGRADECIMENTOS

À ENBT e ao JBRJ que dão toda a estrutura para o desenvolvimento dos nossos trabalhos.

Ao CNPq, pela bolsa concedida.

Ao Sérgio que, além de ser um super orientador, generoso e sempre presente, é um grande

amigo. Obrigado pelo constante incentivo e por toda confiança depositada em mim.

Ao Haroldo, por ter aceitado me co-orientar, dando todo apoio possível e necessário. E por ser

tão solícito, paciente e gente boa.

À Luciana F. G. da Silva, por toda a ajuda e por compartilhar comigo um pouco do

conhecimento adquirido nos estudos taxonômicos do grupo.

Ao José Eduardo Meireles, vulgo Dudu, pela tutoria nos estudos morfológicos no gélido RB,

pelas idéias e sugestões sempre muito boas e pela amizade.

À Gracialda C. Ferreira, pelas coletas na Amazônia e pelos doces de cupuaçu.

Ao Dr. Matt Lavin que, por causa do seu curso oferecido na ENBT, me introduziu ao

maravilhoso mundo do PAUP em linha de comando e por fornecer as seqüências dos primers

de ITS desenhados para leguminosas, fundamentais no desenvolvimento do trabalho.

Ao Vidal, pelas sugestões e críticas feitas em seminários II e pelo ótimo convívio, quase

diário, na sala do Sérgio.

Aos Professores da ENBT pela dedicação aos alunos durante as disciplinas e fora das salas de

aula.

Aos Funcionários que passaram pela secretaria da ENBT nesses dois anos: Abílio, Catarina,

Diego, Janúzia, Márcia e Nilson, sempre dispostos a ajudar a resolver os nossos problemas.

Obrigado pelo tratamento VIP dado a mim e a todos os alunos.

Aos amigos da turma de mestrado e contemporâneos de pós-graduação na ENBT, pelo

convívio nas disciplinas, pelos corredores do JB e nas comemorações dos términos das

disciplinas.

vi

Ao Laboratório de Biologia Molecular de Plantas (LBMP), onde todo o trabalho de bancada

foi desenvolvido, e a todos os amigos de lá: Adriana, Bia, Camila, Catarina, Claire, Cristian,

Eduardo, Janaína, Luciana, Luiz, Marcelo, Mônica, Núbia, Paulo, Pedro, Ricardo, Tássia,

Thais, Thiago; pelo excelente convívio durante esses anos.

Em especial a Camila, Luciana e Thais, pela amizade e por sempre me ligarem quando sentem

minha falta.

Ao meu irmão Anderson, por ser um amigo tão presente, mesmo sem o convívio diário da

graduação, e por ter me apresentado o Endnote.

À minha família (avós, tios e primos) e aos meus amigos, que tanto ausentes quanto presentes,

sempre se mostram interessados em mim.

Aos meus pais e à minha irmã, por todo apoio, todo incentivo, paciência pra me atuar em

frente ao computador e todo amor dispensados a mim.

A Deus, por TUDO.

vii

RESUMO

O grupo Sclerolobium é uma das categorias informais da tribo Caesalpinieae, o qual foi

estabelecido para englobar os três gêneros neotropicais Sclerolobium, Tachigali e

Diptychandra, distribuídos em diferentes biomas brasileiros e países limítrofes, sendo a

Amazônia o centro de diversidade do grupo. Os gêneros Tachigali e Sclerolobium apresentam

difícil delimitação e alguns estudos recentes já os consideram congenéricos, embora os dados

até então apresentados sejam insuficientes para melhor esclarecer a sistemática do grupo.

Com o objetivo de elucidar as relações entre os gêneros e o seu posicionamento na

tribo Caesalpinieae, foram inferidas filogenias, através de diferentes abordagens analíticas

(Máxima Parcimônia, Máxima Verossimilhança e Análise Bayesiana) com diferentes

conjuntos de dados, utilizando os marcadores trnL-F, rps16 e ITS. O monofiletismo do Grupo

Sclerolobium e dos gêneros Tachigali e Sclerolobium foram testados através dos testes T-PTP

e LRT.

A filogenia inferida, que inclui uma vasta amostragem da tribo Caesalpinieae e táxons

afins (e.g., Mimosoideae), revelou que o grupo Sclerolobium não é monofilético, visto que

Tachigali e Sclerolobium são mais relacionados a Arapatiella e Jacqueshuberia. Os testes de

monofiletismo confirmam este dado, mas o posicionamento de Dipychandra na filogenia de

Leguminosae permanece incerto. Tachigali e Sclerolobium não se sustentam como grupos

monofiléticos, porém os dois gêneros constituem um único grupo monofilético, o que é

demonstrado pelas análises filogenéticas e apoiado pelos testes de monofiletismo, dando

suporte à proposta de considerá-los congenéricos. A filogenia inferida para Tachigali s.l.

(incluindo Sclerolobium) mostra que os grupos monofiléticos recuperados não são definidos

por nenhum caráter usado na taxonomia dos gêneros. O padrão homoplástico dos caracteres

aponta para a dificuldade de se construir uma classificação infragenérica filogenética para

Tachigali s.l..

Palavras-chave: Filogenia Molecular, Tachigali, Sclerolobium, Leguminosae, Caesalpinieae,

Monofiletismo.

viii

ABSTRACT

The Sclerolobium group is one of the eight informal groups of the Caesalpinieae tribe

(Leguminosae - Caesalpinoideae) described by Polhill and Vidal (1981) and comprises 3

neotropical genera - Sclerolobium, Tachigali and Diptychandra - distributed in different

Brazilian biomes and bordering countries. Sclerolobium and Tachigali are difficult genera

with difficult delimitation and some recent studies have considered them congeneric although,

currently, available data is not sufficient to determine this question.

In order to elucidate the relationship among these genera and their placement in

Caesalpinieae tribe, different phylogenetic inference approaches (maximum parsimony,

maximum likelihood and Bayesian analysis) were carried out based on three DNA regions:

trnL-F, rps16 and ITS. In addition, the monophyly of Sclerolobium group, Tachigali and

Sclerolobium were tested by T-PTP and LRT tests.

Phylogenetic analysis, with wide sampling of Caesalpinieae tribe and allies, revealed

that Sclerolobium group is not monophyletic, since Tachigali and Sclerolobium are closely

related to Arapatiella and Jacqueshuberia. Monophyly tests employed confirm this find, but

Diptychandra placement in Leguminosae phylogeny is still uncertain. Tachigali and

Sclerolobium are not monophyletic as distinct genera according to our phylogenetic analysis

and monophyly tests. They are, in fact, monophyletic if grouped in the same genus. These

results give support to the proposal of considering them congeneric taxa. The inferred

phylogeny of Tachigali s.l. (including Sclerolobium) showed that no clades could be defined

by any character used in Sclerolobium/Tachigali taxonomy. The homplastic pattern of these

characters point toward the difficulty of establishing an infrageneric classification, based on

phylogenetic concepts, for Tachigali s.l..

Keywords: Molecular phylogeny, Tachigali, Sclerolobium, Leguminosae, Caesalpinieae,

Monophyly.

ix

SUMÁRIO

Lista de Figuras xi

Lista de Tabelas xii

Lista de Abreviaturas xiii

1. Introdução 01

1.1. A Sistemática Molecular em Plantas 01

1.2. A Família Leguminosae Adans. 03

1.3. Os Gêneros Sclerolobium e Tachigali 05

2. Objetivos 07

3. Material e Métodos 08

3.1. Material Vegetal 08

3.2. Extração de DNA 08

3.3. Amplificação e Seqüenciamento 09

3.4. Montagem e Alinhamento das Seqüências 11

3.5. Análises Filogenéticas 11

3.5.1. Máxima Parcimônia 11

3.5.2. Máxima Verossimilhança 13

3.5.3. Análise Bayesiana 13

3.6. Testes de Monofiletismo 14

3.6.1. Teste de Permutação (T-PTP) 15

3.6.2. Teste da Razão da Verossimilhança (LRT) 15

3.7. Análise Morfológica 15

4. Resultados 17

4.1. Relações Filogenéticas do Grupo Sclerolobium em Caesalpinieae 17

4.1.1. Análise de Máxima Parcimônia 17

4.1.2. Análise de Máxima Verossimilhança 19

4.1.3. Análise Bayesiana 20

4.1.4. Monofiletismo do Grupo Sclerolobium 21

4.2. Monofiletismo de Tachigali e Sclerolobium 22

x

4.3. Filogenia de Tachigali s.l. 24

4.3.1. Análise de Máxima Parcimônia 24

4.3.2. Análise de Máxima Verossimilhança 27

4.3.3. Análise Bayesiana 28

4.3.4. Evolução dos Caracteres Morfológicos 29

5. Discussão 32

5.1. Relações Filogenéticas do Grupo Sclerolobium em Caesalpinieae 32

5.2. Monofiletismo de Tachigali e Sclerolobium 35

5.3. Filogenia de Tachigali s.l. 39

6. Conclusão 44

7. Referências Bibliográficas 45

8. Apêndices 52

8.1. Apêndice 1 – Tabela das amostras utilizadas. 52

8.2. Apêndice 2 – Parâmetros dos modelos de evolução 55

8.3. Apêndice 3 – Matriz de dados morfológicos 56

xi

Lista de Figuras

Figura 1: Árvore filogenética esquemática das angiospermas; e Sumário das relações

filogenéticas em Leguminosae. 4

Figura 2: Árvores de consenso estrito das análises de máxima parcimônia inferidas para o

grupo Sclerolobium e gêneros relacionados, baseadas nas regiões trnL-F, rps16 e da matriz de

dados combinados. 18

Figura 3: Árvore de máxima verossimilhança inferida para o grupo Sclerolobium e gêneros

relacionados a partir das seqüências de trnL-F e rps16 concatenadas. 19

Figura 4: Árvore de consenso de maioria derivada da análise bayesiana inferida para o grupo

Sclerolobium e gêneros relacionados dos dados combinados das regiões trnL-F e rps16. 20

Figura 5: Árvore de consenso estrito da análise de Máxima Parcimônia inferida para a da

Análise do Monofiletismo de Tachigali e Sclerolobium. 22

Figura 6: Árvores de consenso estrito das análises de máxima parcimônia inferidas para

Tachigali s.l., baseadas nas regiões rps16, ITS e da matriz de dados combinados. 26

Figura 7: Árvore de máxima verossimilhança inferida para Tachigali s.l. a partir das regiões

de rps16 e ITS. 27

Figura 8: Árvore de consenso de maioria inferida para de Tachigali s.l. derivada da análise

bayesiana dos dados combinados das regiões rps16 e ITS. 28

Figura 9: Evolução de alguns caracteres morfológicos (I). 30

Figura 10: Evolução de alguns caracteres morfológicos (II) . 31

Figura 11: Esquema das hipóteses para o monofiletismo de Tachigali e Sclerolobium. 36

Figura 12: Características morfológicas de Tachigali e Sclerolobium. 38

Figura 13: Proposta de Dwyer (1957) para as relações filogenéticas em Sclerolobium e

Filogenia inferida para Tachigali s.l., usando os regiões rps16 e ITS. 41

xii

Lista de Tabelas

Tabela 1: Primers utilizados no trabalho. 10

Tabela 2: Sumário das características das seqüências e das estatísticas das árvores (da análise

de máxima parcimônia) inferidas para a investigação das relações filogenéticas do grupo

Sclerolobium em Caesalpinieae. 17

Tabela 3: Teste LRT, para testar o monofiletismo do grupo Sclerolobium. 21

Tabela 4: Teste T-PTP. 23

Tabela 5: Teste LRT, para o teste do monofiletismo de Sclerolobium e Tachigali. 23

Tabela 6: Sumário das características das seqüências e das estatísticas das árvores (da análise

de máxima parcimônia) inferidas para a Filogenia de Tachigali s.l.. 24

Tabela 7: Caracteres morfológicos usados para diferenciar Tachigali e Sclerolobium. 38

Tabela 8: Características morfológicas das seções de Sclerolobium sensu Dwyer (1957). 40

xiii

Lista de Abreviaturas

°C – grau Celsius

µL , µg – microlitro, micrograma

AIC – Akaike Information Criterion

BP – bootstrap

cpDNA – DNA cloroplastidial

DNA – ácido desoxirribonucléico

dNTP – desoxirribunucleotídeos trifosfato

EDTA - ácido etileno diamino tetracético

g - grama (unidade de peso) / gravidade (centrífuga)

GTR - General Time Reversible

IC – índice de consistência

ILD – Incongruence Length Difference Test

IR – índice de retenção

ITS – Internal Transcribed Spacer, região espaçadora dos genes ribossomais

K81uf – Two transversion-parameters model 1 unequal frequencies

KH – Teste de Kishino & Hasegawa

LRT – Likelihood Ratio Test (teste da razão da verossimilhança)

M – Molar (unidade de molaridade)

MATAB – Mixed AlkylTrimethylAmmonium Bromide

MCMC – Markov Chain Monte Carlo

mg – miligrama

mL – mililitro

mtDNA – DNA mitocondrial

NA – Não se aplica

ng – nanograma

pb - pares de bases nucleotídicas

PCR – Reação da Polimerase em Cadeia (Polymerase Chain Reaction)

pH – inverso do logaritmo da concentração de H +

pmol - picomol

xiv

RC – índice de consistência rescalonado

rps16 – íntron do gene cloroplastidial que codifica a proteína ribossomal S16

s.l – sensu latu

s.s – sensu strictu

SH – Teste de Shimodaira & Hasegawa

SYM - Symmetrical Model

TAE - tampão tris ( tri- hidroximetil aminometano) acetato EDTA pH 8,0

Taq – T. aquaticus

TBR - Tree-Bisection-Reconection

THP – Teste de Homogeneidade de Partição

TIM - Transitional model

T-PTP - Topology-dependent Permutation Tail Probability test (teste de permutação)

trnL-F – região cloroplastidial que compreende o íntron trnL e o espaçador trnL-trnF

TVM - Transversional model

U - unidade de enzima

V – volume

1

1. Introdução

1.1. A Sistemática Molecular em Plantas

A sistemática molecular tem revolucionado os estudos filogenéticos em plantas através

da incorporação de metodologia cladística, proposta pelo entomólogo alemão Willi Hennig

(Hennig 1950, 1966) e das técnicas de biologia molecular, especialmente os dados de

seqüências de DNA nas reconstruções filogenéticas (Daly et al. 2001, Judd et al. 2002). Os

filogeneticistas consideram as árvores filogenéticas como reconstruções das relações

genealógicas e vêem que as classificações devem ser baseadas nestas árvores. A classificação

contendo apenas grupos monofiléticos e/ou espécies é um sistema natural, uma vez que

delimitando grupos baseados em ancestrais comuns podemos desenvolver uma hierarquia que

reflete as relações naturais. Em 1998 um grupo formado por sistematas, autodenominado de

“The Angiosperm Phylogeny Group” apresentaram uma nova proposta de sistema de

classificação das famílias de plantas com flores (APG 1998). Essa proposta de sistema de

classificação foi baseada na análise cladística de um grande número de seqüências de DNA

com suporte teórico e metodológico da análise filogenética, e vem sendo revista com diversos

trabalhos (Qiu et al. 1999, Savolainen et al. 2000, Soltis et al. 2000) de outros grupos e com

atualização mais recente do APG II (2003).

Nas análises filogenéticas através das seqüências de DNA são utilizadas três diferentes

fontes potenciais de caracteres: os genomas de cloroplasto, mitocondrial e nuclear (Karp et al.

1996). A combinação de diferentes genomas é uma das melhores ferramentas para ser usada

em reconstruções filogenéticas (Qiu et al. 1999). Seqüências provenientes do genoma do

cloroplasto (cpDNA) são as mais usadas para inferir relações filogenéticas em plantas. Sendo

circular e uniparental, herdado maternalmente, abundante nas folhas e facilmente isolado em

grandes quantidades. A seqüência do DNA do cloroplasto é altamente conservada em termos

de tamanho, estrutura, conteúdo e ordem dos genes (Judd et al. 2002). Com tais

características, o uso de seqüências de cpDNA apresenta vantagens em relação aos outros

tipos de seqüência. Por ser estável, pode ser usado para inferir filogenias, o que não ocorre no

DNA mitocondrial (mtDNA) onde os rearranjos são tão freqüentes que um mesmo indivíduo

pode ter diferentes cópias. Por ser haplóide, não apresenta problemas de paralogia, como

2

ocorre com o DNA de origem nuclear, que é geralmente diplóide. Além disso, é

metodologicamente mais simples; desde a amplificação, por haver muitas cópias do genoma

de cloroplasto, até o seqüenciamento, que pode ser feito direto do produto da amplificação,

também por causa da herança uniparental. O reduzido tamanho do cpDNA, frente aos outros

genomas presentes nas células vegetais, permitiu que, em muitas espécies, a seqüência

completa deste genoma fosse conhecida. Isto levou ao reconhecimento de regiões que

evoluem em diferentes taxas, que podem ser usadas para propósitos diversos em inferências

filogenéticas. Genes como o rbcL, que codifica a subunidade maior da ribulose-1,5-bisfosfato

carboxilase/oxigenase (RuBisCO) e que apresenta uma taxa de evolução lenta, apresentam boa

resolução ao nível de família, para angiospermas. Para níveis taxonômicos mais baixos, em

geral, gêneros e espécies, onde a divergência é mais recente, são usados íntrons e espaçadores

que são regiões que tendem a acumular mutações mais rapidamente (Doyle & Luckow 2003).

Com o desenvolvimento atual das tecnologias de seqüenciamento de DNA e

computação, a Sistemática Molecular está prestes a passar por uma revolução. Os

seqüenciamentos baseados na técnica tradicional de Sanger (Sanger & Coulson 1975), antes

muito demorados e caros, passaram por um processo de automatização e estão cada vez mais

rápidos e baratos, o que faz com que cada vez mais seqüências sejam depositadas nos bancos

de dados públicos. É surgida uma nova técnica de seqüenciamento, o pirosequenciamento

(Ronaghi et al. 1998, Ronaghi et al. 1996), que é capaz de seqüenciar um genoma inteiro de

um procarioto (ou organelas) em poucas horas (cerca de 100 milhões de nucleotídeos em 7

horas). Estas facilidades já começaram a ser usadas (Moore et al. 2006) e, à medida que mais

seqüências completas de genomas tornarem-se disponíveis, pode-se fazer estudos mais

acurados de evolução de genes e genomas, buscas por melhores marcadores para

reconstruções filogenéticas ou, até mesmo, utilizar genomas inteiros nesta tarefa. Portanto, o

potencial da Sistemática Molecular para compreensão da evolução em diferentes níveis

taxonômicos é imensurável.

3

1.2. A Família Leguminosae Adans.

Leguminosae (ou Fabaceae) é a terceira maior família de angiospermas, depois de

Orchidaceae e Asteraceae, e a segunda em importância econômica, perdendo apenas para

Poaceae. É composta por 727 gêneros e cerca de 19000 espécies (Lewis et al. 2005). Sua

diversificação atingiu tal ponto que apresenta distribuição cosmopolita, está presente nos mais

variados ambientes (florestas tropicais, temperadas, desertos, ambientes aquáticos) e apresenta

evidente variação quanto ao hábito (árvore, arbustos, ervas e lianas) e à morfologia

A família Leguminosae está posicionada na ordem Fabales, pertencente ao clado

“Eurosid I” que, por sua vez, está subordinado ao clado “Rosid” (APGII 2003). Apesar de o

clado “Rosid” ser um grupo mal definido devido a sua heterogeneidade morfológica, seu

monofiletismo é apoiado por análises filogenéticas com diferentes marcadores moleculares

(Soltis 2000, APGII 2003). A ordem Fabales (figura 1), também de difícil definição

morfológica, é composta por famílias que nunca tinham sido relacionadas nos sistemas

anteriores (i.e., Quillajaceae, Surianaceae, Polygalaceae e Leguminosae) e que têm como

principal característica a presença de espécies que fazem fixação do nitrogênio atmosférico via

associação com bactérias fixadoras de nitrogênio (Doyle & Luckow 2003, Endress &

Matthews 2006).

Leguminosae é claramente monofilética (figura 1), o que apoiado por estudos

filogenéticos baseados em caracteres morfológicos (Chappill 1995) e seqüências de DNA

(Chase et al. 1993, Kajita et al. 2001, Wojciechowski 2004). Por ser um grupo muito grande e

heterogêneo morfologicamente, é difícil precisar as sinapomorfias de Leguminosae. Porém,

um conjunto de características morfológicas é considerado relevante na circunscrição da

família: folhas alternas e compostas; inflorescências indeterminadas; flores com gineceu

unicarpelar e unilocular com placentação marginal; fruto do tipo legume (figura 2).

Tradicionalmente, Leguminosae é dividida em três subfamílias: Caesalpinioideae,

Mimosoideae e Papilionoideae (ou Faboideae). Em alguns sistemas, essas subfamílias são

tratadas como famílias distintas (Cronquist 1981). Embora o reconhecimento desses grupos

seja dado por características morfológicas gerais diagnósticas, a subfamília Caesalpinioideae

não é sustentada como um grupo natural (Doyle 1995, Kajita et al. 2001, Käss & Wink 1996).

Papilionoideae e Mimosoideae são reconhecidas como grupos monofiléticos, enquanto

4

Cesalpinioideae é um grupo parafilético onde alguns de seus gêneros são mais relacionados às

outras subfamílias (Bruneau et al. 2001). A subfamília Caesalpinioideae compreende

aproximadamente 160 gêneros e foi subdividida, na última classificação formal para família

(Lewis et al. 2005, Polhill 1994), em cinco tribos: Caesalpinieae, Cassieae, Cercideae,

Detarieae, e Amherstieae. Apesar das recentes análises cladísticas, baseadas em caracteres

morfológicos (Chappill 1995, Tucker & Douglas 1994) e moleculares (Doyle 1995, Doyle et

al. 2000, Doyle et al. 1997), as delimitações e relações entre estas tribos são problemáticas e

controversas. Em Leguminosae, o clado de divergência mais recente é a tribo Cercidae,

seguidos por dois clados compostos inteiramente de táxons caesalpinóides, os clados Detarieae

s.l. e Cassieae s.l.. A subfamília Mimosoideae e as tribos Caesalpinieae s.l. e parte de Cassieae

s.s. compreende um clado com forte suporte que é grupo irmão de Papilionoideae

(Wojciechowski et al. 2004).

Figura 1. A) Árvore filogenética esquemática das angiospermas, mostrando o posicionamento de

Leguminosae e a relação com os grupos próximos; a raiz da árvore são as gimnospermas e o asterisco se

refere ao clado das eudicotiledôneas. B) Sumário das relações filogenéticas em Leguminosae baseado em

estudos moleculares recentes. Fonte: Ambos de Doyle & Luckow (2003).

5

1.3. Os Gêneros Sclerolobium e Tachigali

A tribo Caesalpinieae foi dividida em oito grupos informais (Polhill 1994, Polhill &

Vidal 1981), onde 56 gêneros foram organizados com base em dados morfológicos.

Sclerolobium e Tachigali foram posicionados no grupo Sclerolobium, que engloba três

gêneros neotropicais – Sclerolobium, Tachigali e Diptychandra – distribuídos em diferentes

biomas brasileiros e países limítrofes. O grupo foi estabelecido baseado nas seguintes

características: flores regulares a zigomórficas, mas de estrutura simples, pentâmeras, com

pequenas pétalas similares, hipanto cupular pouco protegido, anteras lateralmente deiscentes e

estigma pequeno. Estas características foram consideradas um elo entre as tribos Caesalpinieae

e Detarieae.

O gênero Diptychandra Tul. possui apenas uma espécie, que ocorre como dois grupos

alopátricos morfologicamente distintos (um do Brasil central e adjacências e outro do

Nordeste brasileiro), sendo tratados como duas subespécies: D. aurantiaca subsp. aurantiaca e

D. aurantiaca subsp. epunctata (Lima et al. 1990). Atualmente, seu posicionamento é incerto

na filogenia das leguminosas (Lewis et al. 2005), visto que no último estudo filogenético de

Caesalpinioideae publicado que incluiu este táxon (Haston et al. 2003), a filogenia recuperada

apresentou baixa resolução e Diptychandra estava posicionado em uma politomia com outros

gêneros de Caesalpinieae.

Lewis et al. (2005) reavaliando as relações filogenéticas na tribo Caesalpinieae

propuseram o estabelecimento do grupo Tachigali, onde foram incluídos os gêneros Tachigali,

Sclerolobium, Arapatiella e Jacqueshuberia. Esse mesmo agrupamento já havia sido

verificado por Haston et al. (2005) que demonstraram, entre outras coisas, que os gêneros

Arapatiella e Jacqueshuberia, outrora posicionados no grupo Peltophorum, estão mais

relacionados com Tachigali.

Jacqueshuberia e Arapatiella são gêneros com respectivamente sete e duas espécies,

sendo o primeiro restrito ao norte da América do Sul e o outro ao sul da Bahia. São bem

distintos de Tachigali e Sclerolobium morfologicamente, porém a presença de um hipanto

cupular e de um ovário estipitado sugere uma afinidade entre estes gêneros.

Algumas espécies de Sclerolobium e Tachigali podem possuir importância econômica,

já que por ter usos paisagísticos (Lorenzi 1992), na marcenaria (Correa 1931, 1952) e na

6

medicina popular. Por apresentar associação com bactérias fixadoras de nitrogênio (Sprent

2000) e rápido crescimento, são também úteis na recuperação de áreas degradadas.

Os gêneros Sclerolobium Vog. e Tachigali Aubl., com 35 e 22 espécies

respectivamente (Dwyer 1954, 1957), possuem centro de diversidade na Floresta Amazônica,

sendo que o primeiro também está presente com uma considerável riqueza de espécies no

Cerrado e na Mata Atlântica.

Esses dois gêneros têm uma história taxonômica controvertida, por serem de difícil

delimitação. Apesar de reconhecida uma grande afinidade, eles sempre foram tratados como

gêneros distintos e chegaram a ser posicionados em tribos diferentes: Tachigali em

Amherstieae e Sclerolobium em Sclerolobieae (Bentham 1865, 1870). Nas últimas revisões

para Tachigali e Sclerolobium, Dwyer (1954, 1957) os aceita como gêneros distintos, mas

comenta que a existência de espécies transicionais é um desafio à delimitação de ambos. Além

disso, sugere que Sclerolobium deve ser posicionado na tribo Amherstieae devido a sua

afinidade com Tachigali. Mais recentemente, alguns autores têm considerado Tachigali e

Sclerolobium congenéricos (Haston et al. 2005, Pipoly 1995, Zarucchi & Herendeen 1993),

embora os dados apresentados ainda sejam insuficientes para melhor esclarecer a sistemática

do grupo por utilizarem uma baixa amostragem que não representa toda a variação

morfológica existente no grupo.

A maioria das espécies de Sclerolobium e Tachigali ocorre em território brasileiro e

pouco se conhece sobre o ponto de vista evolutivo. Um estudo filogenético que contemple um

número suficiente de espécies é inédito. Além disso, os estudos de filogenia existentes para

Caesalpinioideae, que incluem estes gêneros, o fazem com poucas representantes, o que

resulta em filogenias com baixa resolução para esses táxons.

7

2. Objetivos

2.1. Objetivo Geral

Inferir uma filogenia para o grupo Sclerolobium baseada em marcadores moleculares,

contribuindo para o conhecimento da história evolutiva da família Leguminosae.

2.2. Objetivos Específicos

a) Testar o monofiletismo dos grupos Sclerolobium (Polhill 1994, Polhill & Vidal

1981) e Tachigali (Haston et al. 2005, Lewis et al. 2005);

b) Determinar a relação entre os gêneros atualmente posicionados nos grupos e entre

outros gêneros relacionados, principalmente de Diptychandra, que nos últimos

trabalhos tem sido classificado como sendo de posicionamento incerto;

c) Testar o monofiletismo de Tachigali e Sclerolobium quando um número

significativo de espécies é estudado, visando resolver o impasse taxonômico acerca

de suas delimitações;

8

3. Material e Métodos

3.1. Material Vegetal

Foram selecionados acessos de forma a representar o maior número possível de

espécies dos grupos Sclerolobium e Tachigali. Foram usados 9 (dez espécimes) de Tachigali,

19 táxons (22 espécimes) de Sclerolobium, além de representantes dos gêneros Diptychandra,

Arapatiella e Jacqueshuberia. Também foram selecionadas espécies de gêneros relacionados,

pertencentes à tribo Caesalpinieae e à subfamília Mimosoideae para que o monofiletismo dos

grupos pudesse ser testado da forma mais rigorosa possível. A aquisição destes táxons

envolveu coletas, amostras herborizadas e seqüências baixadas do GeneBank (National Center

for Biotechnology Information, website www.ncbi.nlm.nhi.gov). Detalhes sobre o material

testemunho e os acessos ao GeneBank dos táxons utilizados são mostrados no apêndice 1.

Para a nomenclatura das espécies de Sclerolobium e Tachigali, foram utilizadas as últimas

revisões disponíveis (Dwyer 1954, 1957).

3.2. Extração de DNA

Para extração de DNA, foram usadas folhas secas coletadas em sílica-gel. Das espécies

consideradas importantes para análise que não puderam ser coletadas, tentou-se extrair DNA

de material de herborizado. Todas as amostras de DNA extraídas foram depositadas no Banco

de DNA da Flora Brasileira do Jardim Botânico do Rio de Janeiro.

A extração de DNA foi realizada usando uma modificação do protocolo do CTAB

(Doyle & Doyle 1987). Resumidamente, cerca de 100 mg de folhas secas foram maceradas em

nitrogênio líquido com grau e pistilo ou num macerador automático (Mixer Mill, Retsch). Às

folhas pulverizadas, foi acrescentado 1 mL de tampão de extração (10 mM Tris-HCl pH 8.0;

1,4 M NaCl; 2% CTAB; 20 mM EDTA; 1% PVP40000 e 2% β-Mercaptoetanol). As amostras

foram agitadas vigorosamente e incubadas a 65ºC por 1 hora. Depois de um resfriamento a

temperatura ambiente, adicionou-se 700 µL de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1), e

misturou-se por inversão cuidadosa dos tubos por 10 minutos. As amostras foram submetidas

à centrifugação a 12.000 rpm por 15 minutos. Aproveitando-se somente a fase aquosa,

adicionou-se 1 V de isopropanol e deixou-se os tubos em repouso por 30 minutos à –20ºC.

9

Para amostras herborizadas, a precipitação do DNA era feita à -20oC por 1 semana. Passado

este período, os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 12.000 rpm e o sobrenadante foi

descartado. Os pellets foram lavados com 500 µL de etanol 70% por cerca de 10 minutos.

Após, os pellets foram secos à vácuo (SpeedVac® - Eppendorf) e o DNA ressuspendido em

100 µL de água MilliQ estéril. Alternativamente, para amostras herborizadas, quando não se

obteve sucesso com o protocolo descrito anteriormente, utilizou-se o DNEasy® Plant MiniKit

(Qiagen Ltd.), seguindo as orientações do fabricante.

Para verificar a qualidade do DNA extraído e também quantificá-lo, uma alíquota de 2

µL desse DNA foi submetida à eletroforese em gel de agarose 1% em TAE 0,5X, corado com

brometo de etídeo. Juntamente com as amostras, foram aplicados padrões de quantificação (de

concentração conhecida) de λ DNA para que a concentração do DNA extraído pudesse ser

inferida.

3.3. Amplificação e Seqüenciamento

Depois de extraído, o DNA foi amplificado pela Reação em Cadeia da Polimerase

(PCR). Três regiões foram utilizadas nas análises, com propósitos diferentes: trnL-F, rps16 e

ITS. A primeira compreende um íntron e um espaçador do DNA cloroplastidial, sendo

filogeneticamente informativa ao nível tribal para Leguminosae (Bruneau et al. 2001, Haston

et al. 2005, Luckow et al. 2000). A segunda é um íntron cloroplastidial com taxa de evolução

apropriada para resolver relações no nível genérico (Haston et al. 2005, Lee & Hymowitz

2001, Oxelman et al. 1997). E a terceira é uma região nuclear que compreende o gene

ribossomal 5.8S e os dois espaçadores (ITS1 e ITS2) e constitui, junto com locus trnK, a

região gênica conhecidamente mais informativa filogeneticamente para leguminosas, ou seja,

com maior taxa de substituição nucleotídica (Delgado-Salinas et al. 1999).

As reações de PCR foram feitas num volume final de 25 µL, contendo cerca de 1 µL

de DNA diluído 10 vezes, 1 mM de dNTPs, Tampão 1X (50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl; 1%

Gelatina; 2mM MgCl2), 10 pmol de cada primer e 1 U de Taq DNA polimerase. Os primers

usados nas diferentes reações, assim como suas referências bibliográficas, são mostrados na

tabela 1. As amplificações foram feitas sob as seguintes condições: (1) trnL-F: 94ºC por 5

minutos, 28 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 48ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto, e 72ºC por

10 minutos; (2) rps16: 94ºC por 5 minutos, 30 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 58ºC por 1

10

minuto e 72ºC por 1 minuto, e 72ºC por 10 minutos; (3) ITS: 94ºC por 5 minutos, 30 ciclos de

94ºC por 30 segundos, 55ºC por 1 minuto e 72ºC por 1 minuto, e 72ºC por 10 minutos. Para a

espécie Arapatiella psilophylla, os primers utilizados para amplificar a região ITS não

funcionaram adequadamente, produzindo múltiplas bandas. Desta forma, para tal espécie, foi

necessário amplificar os espaçadores separadamente, utilizando outra combinação de primers

(tabela 1). Em ambas as reações de amplificação, a ciclagem de temperatura foi a mesma:

94ºC por 5 minutos, 30 ciclos de 94ºC por 30 segundos, 50ºC por 1 minuto e 72ºC por 1

minuto, e 72ºC por 10 minutos.

Com o intuito de verificar a amplificação das regiões selecionadas, 5 µL de cada

reação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídeo.

Foi utilizado um padrão de peso molecular (DNA de fago λ digerido com a enzima de

restrição PstI) para confirmar o tamanho do amplicon gerado.

Tabela 1 - Primers utilizados no trabalho

Primers Seqüência (5’����3’) Região Referência

Bibliográfica rpsF GTGGTAGAAAGCAACGTGCGACTT

rps16 (Oxelman et al. 1997) rpsR2 TCGGGATCGAACATCAATTGCAAC ITS18 GTCCACTGAACCTTATCATTTAGAGG

ITS/5.8S (Delgado-Salinas et al.

1999) ITS26 GCCGTTACTAAGGGAATCCTTGTTAG P1 CAAGGTTTCCGTAGGTG

ITS1 (Martsinkovskaya et

al. 1996) P2 CGCTTATTGATATGCTT ITS3 GCATCGATGAAGAACGCAGC

ITS2 (White et al. 1990) ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC

c CGAAATCGGTAGACGCTACG trnL-F (Taberlet et al. 1991)

d ATTTGAACTGGTGACACGAG

Os produtos de PCR foram purificados (Qiagen PCR Purification kit, Qiagen Ltd.) e,

posteriormente, seqüenciados nos dois sentidos com os mesmos primers usados na

amplificação. Os seqüenciamentos foram feitos em seqüenciador automático ABI 3730xl

(Macrogen Inc., Seul, Coréia do Sul).

11

3.4. Montagem e Alinhamento das Seqüências

As seqüências obtidas foram minuciosamente examinadas para atestar sua qualidade e,

posteriormente, foram montadas. Ambas as tarefas foram feitas no programa ChromasPro™

(Technelysium Pty Ltd).

Os alinhamentos das seqüências foram feitos com o auxílio do aplicativo ClustalW

(Thompson et al. 1994) implementado no programa BioEdit (Hall 1999), utilizado o padrão do

programa para todos os parâmetros. O BioEdit também foi usado para fazer os ajustes nos

alinhamentos, quando se fez necessário.

3.5. Análises Filogenéticas

Para as análises filogenéticas, diferentes abordagens analíticas foram feitas,

dependendo do objetivo pretendido. Detalhes destas análises são dados nos itens subseqüentes.

Os diferentes protocolos de análises foram usados, de maneira geral, para todos os conjuntos

de dados. Para a análise das relações filogenéticas do grupo Sclerolobium em Caesalpinieae

(no apêndice 1, os táxons utilizados estão marcados como 1), foram usadas as regiões trnL-F e

rps16; Poeppigia procera foi selecionada como grupo externo para enraizamento das árvores

nesta análise. Para a análise do monofiletismo de Tachigali e Sclerolobium (no apêndice 1, os

táxons utilizados estão marcados como 2), foi usada a região rps16; Moldenhawera floribunda

foi selecionada como grupo externo. Para análise filogenética de Tachigali (já incluindo

Sclerolobium), os marcadores utilizados foram rps16 e ITS (no apêndice 1, os táxons

utilizados estão marcados como 3); Moldenhawera floribunda foi selecionada como grupo

externo.

3.5.1. Máxima Parcimônia

A máxima parcimônia é um método de reconstrução filogenética que presume que a

melhor hipótese filogenética é aquela que envolve o menor número de passos evolutivos, ou

seja, de mudanças que expliquem toda a variação de uma matriz de dados (seqüências de DNA

ou de proteínas alinhadas, dados morfológicos etc). Está diretamente ligada ao conceito de

ancestralidade, isto é, um estado de caráter compartilhado por dois ou mais táxons foram

potencialmente herdados de um ancestral comum. Desta forma, todos os sítios informativos

por parcimônia devem ter uma hipótese de ancestralidade comum entre táxons, ou seja, um

12

sítio informativo por parcimônia é aquele que apresenta variação e que os estados de caráter

são compartilhados por pelo menos dois táxons. A árvore que menos requerer mudanças para

explicar as substituições nesses sítios informativos, é considerada a melhor hipótese

filogenética para os dados em questão.

Todas as análises de máxima parcimônia foram feitas com o programa PAUP* 4b10

(Swofford 2002), codificando os gaps como dados perdidos (“missing data”). Foram

conduzidas buscas heurísticas das árvores mais parcimoniosas, com adição aleatória de

seqüências (opção RANDOM) com 1000 réplicas, mantendo 25 árvores por réplica, rearranjo

de ramos por “tree-bisection-reconection” (TBR), com retenção de múltiplas árvores mais

parcimoniosas (opção MAXTREES foi configurada para aumentar ilimitadamente). Para cada

análise foram inferidas as árvores de consenso estrito e de maioria e os valores de suporte de

bootstrap foram inferidos usando um algoritmo de busca heurística, com 10000 réplicas e com

uma réplica de adição de seqüência por busca aleatória, mantendo uma árvore por réplica.

Foram calculados ainda os seguintes índices das ávores mais parcimoniosas encontradas:

índice de consistência (IC), índice de retenção (IR) e índice de consistência rescalonado (RC).

Para o conjunto de dados cujo objetivo era verificar o monofiletismo de Tachigali e

Sclerolobium, a busca da árvore mais parcimoniosa, assim como as análises de bootstrap (com

1.000 réplicas), foram realizadas por busca branch-and-bound, usando as opções padrão do

programa.

Os conjuntos de dados foram analisados separada e combinadamente. Com os dados

combinados, foi realizado o Teste de Homogeneidade de Partição (THP ou ILD, de

Incongruence-Length Difference test) (Farris et al. 1994), que mede a significância da

incongruência entre as partições, ou seja, se os dois conjuntos de dados (cada marcador usado

na análise) são significativamente incongruentes, dando uma indicação se a combinação

desses dados é adequada para reconstrução filogenética.

13

3.5.2. Máxima Verossimilhança

O método de máxima verossimilhança é um método probabilístico que define como

ótima a topologia que apresenta a maior probabilidade de ter gerado os dados observados.

Neste método é usado um modelo probabilístico de evolução de caracteres, onde uma série de

parâmetros pode ser levada em consideração (e.g., freqüência das bases, taxas de substituição

nucleotídica). Desta forma, diferente do que ocorre na máxima parcimônia, todos os sítios são

considerados. A partir desses sítios e baseados no modelo selecionado, o valor da

verossimilhança de uma topologia é obtido pelo cálculo da probabilidade de ter ocorrido uma

combinação de eventos naquela topologia e que resulte na distribuição dos dados observados

(Meyer 1995). A árvore com o maior escore de verossimilhança (a árvore mais provável) é

escolhida como a melhor hipótese filogenética.

As análises de máxima verossimilhança foram realizadas com o programa PHYML

(Guindon & Gascuel 2003). A árvore mais verossímil (provável) foi calculada através do

modelo e dos parâmetros determinados pelo AIC (Akaike Information Criterion)

implementado no programa ModelTest 3.7 (Posada & Crandall 1998), a partir de uma árvore

inicial computada por BIONJ (Gascuel 1997), um algoritmo de reconstrução filogenética que

é bem adaptado a distâncias evolutivas obtidas de seqüências alinhadas. O programa

SEQBOOT do pacote PHYLIP 3.67 (Felsenstein 2007) foi utilizado para gerar 1000 réplicas

de bootstrap e o programa CONSENSE, também do pacote PHYLIP, foi utilizado para

construir a árvore de consenso de maioria.

3.5.3. Análise Bayesiana

Na inferência bayesiana em filogenias, o teorema de Bayes é usado para combinar a

probabilidade a priori de uma filogenia com a verossimilhança para produzir uma distribuição

da probabilidade posterior nas árvores. A probabilidade posterior de uma árvore pode ser

interpretada como a probabilidade que uma árvore seja correta. Normalmente, todas as árvores

são consideradas igualmente prováveis a priori, e a verossimilhança é calculada sob um

modelo de Markov padrão de evolução de caracteres. Para calcular a probabilidade posterior é

usado um modelo numérico, conhecido com Markov Chain Monte Carlo (MCMC) que

permite que a probabilidade posterior seja aproximada, visto que a sua formulação envolve o

somatório de todas as árvores, integração de todas as combinações possíveis de tamanho de

14

ramo e valores de parâmetros de modelos de substituição, o que não pode ser resolvido

analiticamente (Huelsenbeck et al. 2001).

A análise Bayesiana, utilizada para a determinação do posicionamento de

Diptychandra e para a filogenia de Tachigali, foi realizada com o programa MrBayes 3.1

(Huelsenbeck & Ronquist 2001). Os parâmetros iniciais foram estimados pelo AIC para cada

conjunto de dados, utilizando o programa MrModelTest 2.2 (Nylander 2004). Os modelos

selecionados foram o “General Time Reversible” (GTR), para rps16 e trnL-F, e “Symmetrical

Model” (SYM), para a região ITS. A forma da distribuição gama (Γ), a proporção de sítios

invariáveis (Ι) e os valores dos parâmetros de substituição nucleotídica foram estimados

marginalmente. Foram usadas 5.000.000 de gerações, com quatro cadeias, com uma

amostragem a cada 100 gerações. As gerações anteriores à convergência das cadeias foram

excluídas e uma árvore de consenso de maioria (50%) foi computada a partir das árvores

amostradas depois da convergência. As probabilidades posteriores foram usadas como valores

de suporte para os agrupamentos.

3.6. Testes de Monofiletismo

Para o estudo do monofiletismo de Tachigali e Sclerolobium, além do valor de suporte

para os ramos (bootstrap), que descreve estatisticamente o quão robusto é um determinado

agrupamento, foram feitos testes de monofiletismo para testar hipóteses de agrupamento

alternativas àquela recuperada na filogenia. Em ambos os testes, são usadas restrições, isto é,

grupos monofiléticos a priori, forçados. Para os dois testes, foram empregadas as mesmas

restrições: uma com táxons do gênero Sclerolobium e outra com táxons do gênero Tachigali,

em ambos os casos senso Dwyer (1954, 1957). Nesta análise, foi utilizado somente um

marcador (rps16), pois era o único disponível para todos os grupos externos e todas as

espécies de Tachigali e Sclerolobium. Para estas análises, teve-se o cuidado de selecionar, o

mesmo número de espécies para cada gênero e que as espécies de um mesmo gênero não

pertencessem à mesma região geográfica, para a análise não ficar tendenciosa caso existam

clados biogeográficos.

Os mesmos testes foram aplicados para testar o monofiletismo do grupo Sclerolobium

sensu Polhill e Vidal (1994, 1981).

15

3.6.1. Teste de Permutação (T-PTP)

No T-PTP, de Topology-dependent Permutation Tail Probability test (Faith 1991), é

feita uma análise de parcimônia e a melhor árvore, resultado de uma busca sem a restrição, é

comparada com outras árvores restringidas, ou seja, árvores cujo monofiletismo de um

determinado grupo é forçado. A diferença no número de passos (escore) das árvores com e

sem a restrição é estimada, e a diferença real é comparada com a dos dados aleatorizados

(permutações).

O T-PTP foi realizado no PAUP, utilizando o comando PERMUTE com a opção do

teste T-PTP (TEST=TPTP). Foram feitas 10.000 permutações e busca heurística como

estratégia de busca das árvores em cada permutação dos dados originais. A significância desse

teste é dada pelo valor da probabilidade ao nível de 1% (p=0,01).

3.6.2. Teste da Razão da Verossimilhança (LRT)

No LRT (Likelihood Ratio Test), são calculados os escores de Máxima

Verossimilhança para as topologias com e sem restrição. A significância da diferença entre as

duas hipóteses são dadas pelos testes KH (Kishino & Hasegawa 1989) e SH (Shimodaira &

Hasegawa 1999), implementados no PAUP. Para tal, os escores de verossimilhança são

calculados utilizando-se o comando LSCORES, e os testes são feitos usando-se as opções

KHTEST e SHTEST, ambos selecionando a opção RELL, que gera uma distribuição de

estimativa pelo método de re-amostragem dos logaritmos de verossimilhança (Schneider

2007).

Os parâmetros para o cálculo dos escores de verossimilhança foram estimados pelo

AIC, através do programa ModelTest v.3.7 (Posada & Crandall 1998).

3.7. Análise Morfológica

Uma matriz de dados morfológicos foi preparada utilizando o programa Nexus Data

Editor (Page 2001). Foram selecionados 54 caracteres vegetativos e reprodutivos considerados

importantes na taxonomia de Tachigali e Sclerolobium (Baillon 1870, Bentham 1865, Dwyer

1954, 1957) e outros que se mostraram interessantes durante o desenvolvimento do trabalho.

A maior parte dos caracteres utilizados era qualitativa (51), no entanto os poucos caracteres

quantitativos utilizados foram codificados como caracteres qualitativos, utilizando-se o

16

programa MorphoCode v1.1 (Schols et al. 2004). Os dados morfológicos foram obtidos

principalmente de material herborizado ou preservado em álcool, que estão depositados nas

coleções do herbário do Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro (RB).

Dados da literatura foram utilizados para verificação das observações feitas e para a retirada

de caracteres quando esses estavam inacessíveis no material de botânico. A matriz de dados

morfológicos e as informações sobre os caracteres empregados estão no apêndice 3.

Os dados morfológicos foram usados essencialmente para otimização da evolução dos

caracteres no programa MacClade 4.0 (Maddison & Maddison 2001) a partir da hipótese

filogenética baseada em caracteres moleculares previamente estabelecida.

17

4. Resultados:

4.1. Relações Filogenéticas do Grupo Sclerolobium em Caesalpinieae

4.1.1. Análise de Máxima Parcimônia

Para esta análise, foram usados o íntron do gene cloroplastidial rps16 e a região trnL-F

(que compreende o íntron do gene trnL e o espaçador). Os táxons incluídos na análise estão

especificados no apêndice 1, codificados pelo número 1. As informações sobre as

características das seqüências e alinhamento de cada região seqüenciada e as estatísticas da

análise de parcimônia são sumarizadas tabela 2.

Tabela 2. Sumário das características das seqüências e das estatísticas das árvores (da análise de máxima

parcimônia) inferidas para a investigação das relações filogenéticas do grupo Sclerolobium em

Caesalpinieae, para cada região gênica e dos dados combinados.

Característica trnL-F rps16 Combinada Número de Táxons Analisados 25 25 25 Características das Seqüências Tamanho das seqüências (faixa) 475-992 583-867 1315-1853 Tamanho do alinhamento 1126 989 2115 Sítios variáveis 363 307 670 Sítios informativos por parcimônia 162 120 282 % Divergência (média) 5,617 5,389 5,525 % GC (média) 33,493 33,374 33,437 Estatística das Árvores Número de árvores mais parcimoniosas 193 1459 4 Número de passos 557 480 1043 Índice de Consistência (IC) 0,8007 0,7937 0,7929 Índice de Retenção (IR) 0,6199 0,5769 0,2071 Índice de Retenção Rescalonado (RC) 0,4963 0,4579 0,4673

As árvores geradas nas análises individuais de cada marcador são muito similares

(figura 2). Os clados da árvore gerada pela análise da região rps16 têm maiores valores de

suporte, o que era esperado, visto que é uma região mais variável. Essa harmonia entre as

análises dos dois marcadores também é verificada pelo teste de homogeneidade de partição,

cuja incongruência entre esses dois conjuntos de dados mostrou uma alta probabilidade

(P=0,8594; P<0,01), não sendo possível rejeitar a hipótese nula.

18

A análise combinada dos dois marcadores gerou um número significativamente menor

de árvores mais parcimoniosas em comparação com as análises dos marcadores em separado

(tabela 2). Os clados com suporte das outras análises são mantidos, porém com valores

maiores de bootstrap na análise combinada. Tachigali e Sclerolobium são mais relacionados à

Arapatiella e Jacqueshuberia, formando um clado com alto valor de bootstrap (94%).

Diptychandra aparece em meio a uma politomia, não apresentando nenhuma relação mais

estreita com nenhum outro táxon amostrado, como visto na árvore de consenso estrito (figura

2).

Figura 2. Árvores de consenso estrito das análises de máxima parcimônia inferidas para o grupo

Sclerolobium e gêneros relacionados, baseadas nas regiões trnL-F, rps16 e da matriz de dados combinados.

Os valores de bootstrap (>50%) dos clados são mostrados acima ou abaixo dos ramos. A caixa vermelha

destaca os gêneros do grupo Sclerolobium (Tachigali, Sclerolobium e Diptychandra).

trnL-F rps16

trnL-F

+

rps16

19

4.1.2. Análise de Máxima Verossimilhança:

A árvore mais verossímil foi gerada a partir dos dados combinados das duas regiões de

cloroplasto, e o modelo de evolução foi inferido separadamente para cada marcador. Como o

modelo selecionado foi o mesmo para as duas regiões (TMV+Γ), foi feita uma nova inferência

do modelo de substituição nucleotídica, mas desta vez, com os dados concatenados (apêndice

2) para que os parâmetros se adequassem a esta situação.

A análise de máxima verossimilhança gerou uma árvore com uma topologia coerente

com a da análise de parcimônia (figura 3). Os clados com valores de suporte moderados a

altos (acima de 70%) na análise de máxima de verossimilhança são os mesmos bem apoiados

na análise de máxima parcimônia.

Figura 3. Árvore de máxima verossimilhança inferida para o grupo Sclerolobium e gêneros relacionados a

partir das seqüências de trnL-F e rps16 concatenadas. Números acima ou abaixo dos ramos são valores de

suporte obtidos por 1000 réplicas de bootstrap. A caixa vermelha destaca os gêneros do grupo Sclerolobium

(Tachigali, Sclerolobium e Diptychandra).

20

4.1.3. Análise Bayesiana:

A análise bayesiana dos dados combinados usou o modelo de substituição GTR+Γ para

ambas as regiões, selecionados pelo AIC. A árvore gerada tem topologias similares às

produzidas por parcimônia e por máxima verossimilhança. A topologia apresentou-se um

pouco melhor resolvida (figura 4), porém apresentando alguns clados com baixos valores de

suporte bayesiano (probabilidades posteriores). Outra diferença é que o clado formado por

Tachigali, Sclerolobium, Arapatiella e Jacqueshuberia, presentes nas outras análises, emerge

como grupo irmão do clado formado por Peltophorum e Parkinsonia com probabilidade

posterior de 96%. Diptychandra surge como grupo irmão dos táxons citados anteriormente,

porém essa relação tem baixo valor de suporte (56%), assim como na árvore inferida por

máxima verossimilhança (BP = 29%).

Figura 4. Árvore de consenso de maioria derivada da análise bayesiana dos dados combinados das regiões

trnL-F e rps16 inferida para o grupo Sclerolobium e gêneros relacionados. Número acima ou abaixo dos

ramos são as probabilidades posteriores, que servem de suporte aos clados. A caixa vermelha destaca os

gêneros do grupo Sclerolobium (Tachigali, Sclerolobium e Diptychandra).

21

4.1.4. Monofiletismo do Grupo Sclerolobium

Com o intuito de confirmar o não monofiletismo do Grupo Sclerolobium sensu Polhill

e Vidal (1981), como é indicado nas análises mostradas na seção anterior, foram feitos o teste

de permutação (T-PTP) e o teste da razão da verossimilhança (LRT). Neles, o monofiletismo

do grupo foi forçado e foram feitas comparações entre as árvores com a sem restrição.

Ambos os testes indicam que o Grupo Sclerolobium não é monofilético. No T-PTP, o

valor de P igual a 0,8919 mostra que a diferença do comprimento dos dados originais entre a

topologia com e sem restrição não é significativa, quando comparada com os dados

aleatorizados. No LRT, foram usados os mesmos parâmetros estimados para o modelo de

substituição nucleotídica selecionado pelo AIC (apêndice 2). Os testes de KH e SH indicam

que a árvore sem restrição é significativamente melhor que a árvore restringida (tabela 3).

Tabela 3. Teste LRT, para testar o monofiletismo do grupo Sclerolobium.

Árvore -lnL Dif.-lnL Teste KH Teste SH

P P Sem restrição 8540.22379 (melhor) Com restrição 8571.25401 31.03022 0,015* 0.014*

*P<0,05

22

4.2. Monofiletismo de Tachigali e Sclerolobium

O alinhamento para esta análise apresentou 872 caracteres, sendo 763 constantes, 109

variáveis com 40 caracteres informativos por parcimônia. Foram geradas dez árvores mais

parcimoniosas com comprimento de 131 passos e os seguintes índices de parcimônia:

IC=0,9160; IR=0,8675; RC= 0,7946.

A filogenia recuperou um só clado (figura 5) formado por Tachigali e Sclerolobium,

com alto valor de suporte (BP=98%).

Figura 5. Árvore de consenso estrito da análise de Máxima Parcimônia inferida com a região rps16 para a da Análise do Monofiletismo de Tachigali e Sclerolobium. Os números acima ou abaixo dos ramos são valores de bootstrap, obtidos por 10.000 réplicas.

23

No T-PTP, para ambas as restrições, os valores de probabilidade encontrados foram

superiores a 0,5 (P<0,01) (tabela 4), o que faz com que não se rejeite a hipótese nula de não

monofiletismo dos gêneros separadamente, uma vez que a diferença do comprimento dos

dados sem permutação entre a topologia com e sem restrição não é significativa, pois se

encontra dentro da distribuição das diferenças dos dados permutados ao acaso.

Tabela 4. Teste T-PTP.

Restrições Valor de P

Sclerolobium 0,5047*

Tachigali 0,5044*

*P<0,01

No segundo teste, as diferenças entre os escores de Máxima Verossimilhança da árvore

sem restrição e das árvores com restrição foram calculadas, e os testes de KH e SH verificam a

significância dessas diferenças. O modelo de evolução que melhor se adequou para o conjunto

de dados foi o “Two transversion-parameters model one unequal frequencies” (K81uf+Ι). Para

as duas restrições os valores de P, foram inferiores a 0,05 (tabela 5), o que rejeita a hipótese

nula de que não há diferença entre as árvores sem e com restrições, ou seja, a árvore sem

restrição é significativamente melhor (mais provável, pelo escore de verossimilhança obtido)

que a árvore restringida.

Tabela 5. Teste LRT, para o teste do monofiletismo dos gêneros Sclerolobium e Tachigali.

Árvore -lnL Dif.-lnL Teste KH Teste SH

P P Não restringida 1683.20844 (melhor)

Restringida (Sclerolobium) 1701.44251 18.23407 0,032* 0.031* Restringida (Tachigali) 1700.06539 16.85696 0,040* 0.033*

*P<0,05

24

4.3. Filogenia de Tachigali s.l.

Sabendo que Tachigali e Sclerolobium formam um grupo monofilético e reconhecendo

o status de congenéricos, o objetivo desta análise foi inferir a filogenia de Tachigali s.l. (com a

circunscrição ampliada para incluir Sclerolobium). Além de táxons desses gêneros, foram

usados os outros táxons do grupo Tachigali (Haston et al. 2005), do grupo Peltophorum e

Moldenhawera, usado como grupo externo.

Os terminais denominados Tachigali sp. 1, Tachigali sp. 2 e Tachigali sp.3

correspondem a amostras recentemente coletadas na Amazônia, que ainda não puderam ser

identificadas. Por esta razão, não foram incluídas na discussão.

4.3.1. Análise de Máxima Parcimônia

Para a análise de parcimônia, foram usados o íntron do gene cloroplastidial rps16 e a

região ITS. Os táxons incluídos na análise estão especificados no apêndice 1, codificados pelo

número 3. As informações sobre as características das seqüências e alinhamento de cada

região seqüenciada e as estatísticas da análise de parcimônia são sumarizadas na tabela 6.

Tabela 6. Sumário das características das seqüências e das estatísticas das árvores (da análise de máxima

parcimônia) inferidas para a Filogenia de Tachigali s.l., para cada região gênica e dos dados combinados.

Característica rps16 ITS Combinada Número de Táxons Analisados 33 27 25 Características das Seqüências Tamanho das seqüências (faixa) 765-858 269-752 1111-1602 Tamanho do alinhamento 876 808 1684 Sítios variáveis 120 453 753 Sítios informativos por parcimônia 58 346 509 % Divergência (média) 0,982 31,748 13,222 % GC (média) 33,824 52,086 42,233 Estatística das Árvores Número de árvores mais parcimoniosas 286912 2 1 Número de passos 83 1235 1898 Índice de Consistência (IC) 0,8916 0,5830 0,6159 Índice de Retenção (IR) 0,8816 0,7105 0,6914 Índice de Retenção Rescalonado (RC) 0,7860 0,4142 0,4248

25

As árvores geradas pelos conjuntos de dados analisados separadamente não tiveram

topologias significativamente conflitantes (P=0,0213 para o THP), porém diferiram muito em

resolução (figura 6). A região rps16 é mais conservada, o que pode ser observado pela

porcentagem de divergência entre as seqüências (< 1%) e número de sítios variáveis,

contrastando com sua maior extensão. Por causa destas características, foram geradas

numerosas árvores igualmente parcimoniosas e não houve resolução entre os táxons dentro de

Tachigali.

Em contraste, a região ITS se mostrou muito variável, o que pode ser notado pelo alto

valor de divergência entre as seqüências, e pela quantidade de sítios variáveis. Como

conseqüência, foram geradas apenas duas árvores mais parcimoniosas, com as relações

internas ao gênero bem resolvidas e com bom suporte para muitos ramos (figura 6). Por

diferentes dificuldades técnicas, não foi possível obter as seqüências da região ITS para

Jacqueshuberia e Peltophorum. Em Arapatiella os espaçadores ITS1 e ITS2 foram

amplificados separadamente, porém o seqüenciamento de ITS2 não foi bem sucedido. Por esta

razão, somente ITS1 consta no alinhamento da região ITS para A. psilophylla.

Na análise combinada, optou-se por utilizar somente os táxons com as seqüências

disponíveis para os dois marcadores. A análise com os dados combinados resultou em uma

única árvore mais parcimoniosa, a qual é muito similar à árvore de consenso estrito da análise

com ITS, com pequenas diferenças na resolução e valores de suporte.

26

Figura 6. Árvores de consenso estrito das análises de máxima parcimônia inferidas para Tachigali s.l., baseadas nas regiões rps16, ITS e da matriz de

dados combinados. Os valores de bootstrap (>50%) dos clados são mostrados acima ou abaixo dos ramos.

rps16 ITS

rps16

+ ITS

27

4.3.2. Análise de Máxima Verossimilhança

Para a análise de máxima verossimilhança, foi selecionado pelo AIC, no ModelTest, o

modelo “Transitional Model” (TIM+Γ+Ι) para os conjuntos de dados concatenados (os

parâmetros estimados são mostrados no apêndice 2).

A filogenia inferida pela análise de máxima verossimilhança (figura 7) foi muito

semelhante às das inferidas pela análise de parcimônia, porém quase todos os clados estão

resolvidos (apenas um clado com valor de bootstrap inferior a 50%). Ocorrem algumas

diferenças nos valores de suporte dos clados coincidentes entre as análises, que, em geral,

foram maiores na árvore de máxima verossimilhança.

Figura 7. Árvore de máxima verossimilhança inferida para Tachigali s.l. a partir das seqüências de rps16 e

ITS concatenadas. Números acima ou abaixo dos ramos são valores de suporte obtidos por 1000 réplicas

de bootstrap.

28

4.3.3. Inferência Bayesiana

A análise bayesiana dos dados combinados usou os modelos GTR+Γ, para a região

rps16, e SYM+Γ, para a região ITS. A árvore de consenso de maioria (50%) gerada pela

análise bayesiana é congruente com as árvores inferidas pelas análises anteriores, quanto aos

agrupamentos formados e aos valores de suporte para esses clados (figura 8).

Figura 8. Árvore de consenso de maioria derivada da análise bayesiana dos dados combinados das regiões

rps16 e ITS, inferida para Tachigali s.l.. Número acima ou abaixo dos ramos são as probabilidades

posteriores, que servem de suporte aos clados.

29

4.3.4. Evolução dos Caracteres Morfológicos

A partir da otimização dos caracteres morfológicos, pôde-se observar que nenhum

deles define grupos monofiléticos dentro de Tachigali s.l.. Desta forma, foram selecionados,

nesta seção, os caracteres usados na definição dos gêneros Tachigali s.s. e Sclerolobium e,

assim, avaliar a evolução destes caracteres e a distribuição dos estados de caráter na filogenia.

A hipótese filogenética usada nesta etapa (figuras 9 e 10) foi uma árvore “consensual”,

resultante de todas as análises anteriores.

30

Figura 9. Evolução de alguns caracteres morfológicos (I). A) Presença de pedicelo; B) Simetria do hipanto;

C) Tamanho do Botão floral; D) Forma da pétala; E) Dimorfismo dos estames.Terminais não precedidos

pelo pequeno quadrado na árvore, não foram considerados para o caráter (dado perdido ou NA).

A B

C D

31

Figura 10. Evolução de alguns caracteres morfológicos (II). A) Dimorfismo dos estames; B) Posição do

estípite; C) Presença de mirmecodomáceas; D) Tipo de Fruto. Terminais não precedidos pelo pequeno

quadrado na árvore, não foram considerados para o caráter (dado perdido ou NA).

C

A B

D

32

5. Discussão

5.1. Relações Filogenéticas do Grupo Sclerolobium em Caesalpinieae

A subfamília Caesalpinioideae é reconhecidamente um grupo parafilético

(Wojciechowski et al. 2004). Algumas linhagens são consideradas basais na família

Leguminosae e que partir delas teriam derivado as outras subfamílias, as monofiléticas

Mimosoideae e Papilionoideae (Doyle & Luckow 2003). Devido a este atributo,

Caesalpinioideae é de difícil definição morfológica, ou seja, não há características comuns a

todos os táxons colocados no grupo, mas sim características gerais e muito abrangentes, que

fazem que linhagens evolutivas distintas sejam agrupadas. A despeito de sua condição

filogenética, a subfamília Caesalpinioideae é válida e continua sendo usada por especialistas,

seja por tradição ou por facilitar a comunicação.

Atualmente, se aceita, baseando-se em uma compilação de diferentes estudos de

filogenia molecular (abordagem chamada de supertree), que a subfamília Caesalpinioideae é

um grado formado por quatro linhagens: tribo Cercideae, tribo Detarieae s.l., tribo Cassieae

s.l. (pro parte) e de algumas linhagens de um grupo denominado "Caesalpinioid crown" clade

(Wojciechowski et al. 2004). Este último é composto pelas tribos Caesalpinieae e Cassieae s.s.

(Cassiinae) e a subfamília Mimosoideae.

Caesalpinieae, conforme estabelecida por Polhill & Vidal (1981), é definida por

ausências e é composta por gêneros considerados transicionais a grupos maiores. A tribo foi

dividida em oito grupos genéricos informais, sendo adicionado um grupo posteriormente

(Polhill 1994), baseados em características morfológicas, que serviram como um meio de

comunicar hipóteses acerca dos agrupamentos genéricos sem a necessidade de se criar

categorias taxonômicas formais (Haston et al. 2005). Não surpreende, então, os últimos

trabalhos apontarem para uma Caesalpinieae parafilética, com Cassieae s.s. e Mimosoideae

junto a outras linhagens caesalpinóides (figura 1).

Devido ao parafiletismo da tribo Caesalpinieae, no presente trabalho, se fez necessário

amostrar o máximo possível do clado caesalpinóide, onde está posicionado o grupo

Sclerolobium, com o objetivo de verificar se este constitui um grupo monofilético, como

também esclarecer as relações com os gêneros afins. Para tal, utilizou-se seqüências oriundas

33

do GenBank e oito amostras, que tiveram seu DNA extraído e as regiões trnL-F e rps16

amplificadas e seqüenciadas para estas análises.

Pela filogenia inferida, o grupo Sclerolobium (Polhill & Vidal 1981) não se sustenta

como monofilético. Sclerolobium e Tachigali são mais relacionados a Jacqueshuberia e

Arapatiella. Este agrupamento está presente nas análises de parcimônia inferidas para as duas

regiões gênicas separada ou combinadamente (figura 2), embora na do trnL-F o suporte seja

baixo (BP=50%). Em todas as outras análises o suporte para o grupo é alto, tendo valores de

bootstrap de 100% e 94% para análise de parcimônia com o marcador rps16 e com os

marcadores combinados, respectivamente e, na análise bayesiana, o clado é apoiado com

100% de probabilidade posterior.

Esse mesmo agrupamento foi verificado por Haston et al. (2005) que demonstrou,

entre outras coisas, que os gêneros Arapatiella e Jacqueshuberia, outrora posicionados no

grupo Peltophorum, estão mais relacionados ao grupo Sclerolobium. A partir disto,

objetivando criar grupos genéricos que fizessem sentido à luz da sistemática filogenética, isto

é, dividir as tribos em grupos genéricos monofiléticos, propuseram o estabelecimento do grupo

Tachigali, composto por Tachigali, Sclerolobium, Arapatiella e Jacqueshuberia. Pelos

resultados da análise bayesiana, o provável grupo irmão do grupo Tachigali é o grupo

Peltophorum s.s. (representado aqui por Peltophorum e Parkinsonia), o que é compatível com

as análises de Haston et al. (2005). As outras análises (de MP com os dados combinados e a de

máxima verossimilhança) apresentam a mesma topologia, porém com baixos valores de

suporte. Entretanto, a presença de um alto valor de suporte bayesiano para o clado (>95%)

sugere que o agrupamento é provável, mesmo que a probabilidade posterior seja uma medida

de suporte menos conservadora que o bootstrap (Alfaro & Holder 2006).

Tanto Jacqueshuberia quanto Arapatiella são gêneros pequenos (sete e duas espécies,

respectivamente), sendo o primeiro restrito ao norte da América do Sul e o outro ao Sul da

Bahia. São bem distintos de Tachigali e Sclerolobium morfologicamente e não foi observada

ou encontrada na literatura nenhuma característica que possa ser uma sinapomorfia para o

grupo Tachigali. Na descrição de Arapatiella, Rizzini & Mattos (1972) posicionam o novo

gênero na tribo Sclerolobieae sensu Benthan (1870), mais especificamente entre Sclerolobium

e Campsiandra. Neste trabalho, os autores fazem um comentário sobre a afinidade da estrutura

floral entre os Sclerolobium e Arapatiella (“a Sclerolobio Vog. cui structura floris magis

34

affinis”), porém sem explicitar quais são estas características que fazem a estrutura floral tão

similar e apenas são apontados os caracteres florais diferenciáveis entre os gêneros, porém, é

evidente a presença de um hipanto cupular e de um ovário estipitado em comum. É

interessante notar que Arapatiella já esteve associada com Tachigali em sua história

nomenclatural: Arapatiella psilophylla é uma combinação nova de Cowan (1973) para

Tachigali psilophylla, descrita por Harms (1915), quando esta foi sinonimizada com A.

trepocarpa, descrita por Rizzini & Mattos (1972) como espécie tipo do gênero.

Diptychandra é o terceiro gênero colocado no grupo Sclerolobium (Polhill & Vidal

1981) e foi considerado por Lewis et al. (2005) como um táxon de posicionamento incerto na

filogenia de Leguminosae. Isso ocorre porque este gênero fez parte da amostragem de apenas

de um trabalho de filogenia e nele, Haston et al. (2003) apresentam uma “investigação

filogenética do grupo Peltophorum”, considerada ainda preliminar ou “em andamento” pelos

autores, onde vários táxons de Caesalpinieae são incluídos. Diptychandra aparece em meio a

uma politomia com outros táxons de Caesalpinieae, não formando um clado com o

Sclerolobium e Tachigali (esses emergiram formando um clado com suporte moderado) na

árvore de consenso estrito. A partir destas análises poder-se-ia ter uma idéia da natureza

filogenética do grupo Sclerolobium, dando a indicação para supor o seu não monofiletismo,

porém seria muito pré-maturo fazer tal afirmação. Na publicação posterior (Haston et al.

2005), mais completa, Diptychandra não foi incluída na amostragem, permanecendo incerto o

seu posicionamento e o monofiletismo do grupo Sclerolobium.

Em todas as análises, Diptychandra não está associada a Tachigali e Sclerolobium que,

como já demonstrado anteriormente, estão agrupados num clado de alto suporte estatístico

com outros gêneros. O gênero aparece em meio a uma politomia ou como grupo irmão do

clado formado por (((((Tachigali, Sclerolobium) Arapatiella) Jacqueshuberia)),(Peltophorum,

Parkinsonia)) nas análises de máxima verossimilhança e bayesiana, porém em agrupamentos

com baixo suporte (figuras 3 e 4). Os testes de monofiletismo aplicados (tabela 3) dão suporte

para o não monofiletismo do grupo, classificando-o, pelo menos, como improvável.

Na classificação tribal de Bentham (1865), Diptychandra e Sclerolobium são

posicionados na tribo (Sclerolobieae). Baillon, na sua Histoire des Plantes (1870), menciona

que Diptychandra “tem as mesmas flores que Sclerolobium da seção Cosymbe” e, de fato,

caracteres florais como a presença de hipanto e ovário estipitado os aproximam

35

morfologicamente. Polhill & Vidal (1981), ao redefinirem Caesalpinieae e dividi-la em grupos

informais, alegam que tais grupos “são usados para indicar diferentes direções de divergência

do que parece ser a organização floral mais simples”; e Diptychandra, Sclerolobium e

Tachigali foram unidos em um desses grupos por terem características que ligam

Caesalpinieae a Detarieae (vide seção 1.3). Apesar da proximidade morfológica, os próprios

autores proponentes alegam que os esses grupos informais podem ser considerados

“essencialmente fenéticos” e os resultados apresentados aqui, indicam que essas semelhanças

são convergências evolutivas cuja natureza ainda não se pode inferir pelos dados disponíveis.

Uma possibilidade, já vislumbrada por alguns especialistas, é que as similaridades

morfológicas encontradas entre Diptychandra e Campsiandra, um gênero do grupo

Peltophorum sensu Polhill (1981) e também considerada atualmente como de posicionamento

incerto (Lewis et al. 2005), sejam fruto de um compartilhamento mais recente de suas histórias

evolutiva. Lima et al. (1990) apontam que o relacionamento entre os dois gêneros pode ser

evidenciado através da morfologia do fruto e das flores (e.g., sementes aladas e estigma

expandido no ápice). Desta forma, o compartilhamento de um ancestral comum mais recente

por Diptychandra e Campsiandra constitui uma hipótese a ser testada. Ainda que as presentes

análises não tenham resolução filogenética para sustentar esta hipótese, elas também não são

suficientes para refutá-la. Desta forma, esta questão continua em aberto e as relações

filogenéticas entre Diptychandra e outros gêneros de Caesalpinieae permanecem obscuras. O

uso de outros marcadores e de uma amostragem mais ampla se faz necessário para aumentar a

resolução das análises e poder esclarecer a evolução do grupo.

5.2. Monofiletismo de Tachigali e Sclerolobium

Os gêneros Tachigali e Sclerolobium foram descritos em épocas diferentes, por Aublet

(1775) e Vogel (1837) respectivamente, e a princípio não foram associados. Tulasne (1844)

foi o primeiro a comentar sobre a “grande afinidade” dos gêneros e que eles difeririam

essencialmente pela posição do estípite do ovário: adnato à parede do receptáculo, em

Tachigali, e adnato ao fundo do receptáculo, em Sclerolobium. Posteriormente, Bentham

(1865) enfatiza as diferenças entre os dois gêneros, posicionando-os em tribos distintas:

Amherstieae e Sclerolobieae, respectivamente. Nas últimas revisões para os gêneros, Dwyer

36

(1954, 1957) mantém suas circunscrições, mas comenta que algumas espécies transicionais

são um desafio à segregação dos gêneros.

Mais recentemente, alguns autores vêm propondo considerar os gêneros sinônimos

(Haston et al. 2005, Pipoly 1995, Zarucchi & Herendeen 1993), e, inclusive, são descritas

novas espécies (Pipoly 1995) e combinações novas são feitas (Oliveira-Filho 2006, Silva &

Lima 2007) baseadas nessa proposta. Entretanto, este status congenérico nunca foi

demonstrado por nenhum trabalho. Embora alguns estudos baseados em anatomia do lenho

(Barreta-Kuipers 1981) e morfologia polínica (Graham & Barker 1981), e também a existência

de espécies transicionais apontem para esta conclusão, os dados são insuficientes porque

fizeram uso de baixa amostragem que não compreendia a toda a variação morfológica e a

distribuição geográfica conhecida para os gêneros.

A análise de parcimônia confirmou a relação entre os gêneros, visto que todos os

táxons foram agrupados em um clado com alto suporte (BP=98%). Como não há resolução

para as relações internamente ao clado e sabendo que Tachigali e Sclerolobium constituem um

clado bem apoiado estatisticamente, foram cogitadas as seguintes possibilidades (figura 11): 1)

Tachigali ser monofilético e Sclerolobium não; 2) Sclerolobium ser monofilético e Tachigali

não; e 3) ambos serem monofiléticos e grupos irmãos. Com o intuito de testar o estas hipótese,

foram feitos testes de monofiletismo que indicam o quão provável é um determinado

agrupamento. Nestes testes, o monofiletismo do grupo é forçado, ou seja, a melhor hipótese

filogenética encontrada contém obrigatoriamente a restrição, ou seja, o agrupamento imposto.

Figura 11. Esquema das hipóteses acerca do monofiletismo de Tachigali e Sclerolobium. Em 1, os dois

gêneros são monofiléticos individualmente; em 2 e 3, apenas um dos gêneros é monofilético

O teste T-PTP rejeitou as duas restrições (tabela 4), indicando o não monofiletismo,

tanto de Tachigali quanto de Sclerolobium, pois a diferença entre os escores dos dados

originais estão na distribuição dos dados permutados aleatoriamente. No teste LRT, a árvore

37

sem a restrição (melhor, com o maior escore de verossimilhança) é significativamente

diferente que a árvore com a restrição, o que também apóia o não monofiletismo de ambos os

gêneros. Existem muitas discussões sobre a utilidade e a validade do teste de permutação

(Faith & Trueman 1996, Felsenstein 2004). Uma delas é a de que o teste não testaria o

monofiletismo, pois a hipótese nula do teste não é o não monofiletismo do grupo em questão e

sim, a ausência de estrutura filogenética nos dados (Swofford et al. 1996); de fato, a hipótese

nula do teste, como observado pelo próprio propositor, é que a estrutura hierárquica observada

(a restrição forçada) poderia ter sido encontrada nos dados permutados ao acaso (Faith 1991).

Outra crítica é que, em diferentes simulações, uma estrutura irrelevante dos dados faz o teste

rejeitar a aleatoriedade muito freqüentemente (Swofford et al. 1996), ou seja, agrupamentos

não monofiléticos teriam significância por este teste. Embora a validade das críticas seja

inquestionável, na presente análise, o teste não rejeitou a hipótese nula (de falta de

estruturação) para as duas restrições impostas, não incorrendo na problemática da segunda

crítica. Além disso, mesmo que o monofiletismo não seja testado diretamente pelo T-PTP, o

fato dos dados originais não diferirem dos aleatórios é um bom indicativo de que os gêneros

são improváveis como grupos monofiléticos distintos.

Embora exista certa contestação quanto a se usar unicamente grupos monofiléticos na

taxonomia (Brummitt 2006, Ebach et al. 2006, Hörandl 2006), a tendência é estabelecer

táxons monofiléticos e, se for necessário, redefini-los para se adequarem ao novo conceito.

Exemplos disso, em angiospermas, são as famílias Apocynaceae e Malvaceae, que tiveram

suas circunscrições ampliadas para incluir táxons que anteriormente eram tratados como

famílias separadas (Asclepiadaceae, no caso de Apocynaceae; Bombacaceae, Tiliaceae e

Sterculiaceae, no caso de Malvaceae) e formar um único táxon bem definido

filogeneticamente e sustentado por caracteres morfológicos consistentes (sinapomorfias).

Além da posição do estípite do ovário, citada anteriormente, outras características são

normalmente utilizadas para diferenciar Sclerolobium de Tachigali (figura 12 e tabela 7).

Segundo Silva & Lima (2005), embora haja estados de caráter predominantes a um ou outro

gênero, eles não são exclusivos, o que confirma a difícil delimitação dos gêneros. Além disso,

existem características compartilhadas pelos gêneros que são únicas na família, como o tipo de

fruto, a criptossâmara (figura 12), e a mirmecofilia (associação com formigas), presentes em

algumas espécies de ambos os gêneros, observada pela presença de mirmecodomáceas.

38

Tabela 7. Caracteres morfológicos usados para diferenciar Tachigali e Sclerolobium.

Caracteres Tachigali Sclerolobium Flor (tamanho) Grande (> 1 cm) Pequena

Hipanto (simetria) Assimétrico Simétrico Estames Heteromórficos Homomórficos

Pétalas (forma) Filiformes Largas (lanceoladas a

obovadas)

Estípite do Ovário (posição) Adnado a parede do

receptáculo Central (no fundo do

receptáculo)

Figura 12. Características morfológicas de 1) Tachigali paratyensis e 2) Sclerolobium denudatum; a) flor

grande pedicelada com pétalas largas; b) botão floral; c) estames heteromórficos; d) hipanto assimétrico

com estípite adnato à parede do hipanto; e) fruto; f) flor pequena séssil; g) hipanto simétrico, estípite do

ovário central (adnado ao fundo do resceptáculo), estames homomórficos; h) pétala filiforme; i) botão

floral; j) fruto.

Os dados morfológicos existentes e as análises apresentadas nesta seção convergem de

forma a apoiar as propostas anteriores de considerar Tachigali e Sclerolobium congenéricos,

ou seja, ampliar a circunscrição de Tachigali, por ser o nome mais antigo, de forma a incluir

Sclerolobium. Todavia, pela primeira vez, há o suporte da filogenia baseada em caracteres

moleculares, dentro do conceito atual de se reconhecer categorias taxonômicas monofiléticas,

39

e com uma amostragem que inclui a variação morfológica e distribuição geográfica dos

gêneros.

5.3. Filogenia de Tachigali s.l.

Nas revisões de Tachigali e Sclerolobium, Dwyer (1954, 1957) reconheceu a grande

afinidade entre os dois gêneros e discordou veementemente de Bentham (1870), por tê-los

colocado em tribos diferentes, argumentando que o único caráter da posição estípite do ovário

no hipanto não daria base para a segregação. Posteriormente, vários autores, baseados na

similaridade morfológica e na artificialidade dos caracteres que delimitam os gêneros, os

consideraram congenéricos (Pipoly 1995, Silva & Lima 2007, Zarucchi & Herendeen 1993).

No presente trabalho (seção 5.2), foi apresentada uma investigação do monofiletismo de

Tachigali e Sclerolobium que apóia a proposição de sinonimização dos gêneros. Baseando-se

nesta premissa, a partir desta seção, considera-se Tachigali no seu sentido amplo, embora,

como referido anteriormente, os nomes utilizados sejam os da circunscrição anterior para

facilitar a discussão.

Dwyer (1957) dividiu Sclerolobium em quatro seções, baseando-se nas formas das

pétalas, presença de pedicelo, venação dos folíolos e indumento das pétalas (tabela 8). A seção

Cosymbe é composta por espécies com pétalas espatuladas; era considerada primitiva porque o

tipo de pétala era muito similar às de Tachigali. A seção Eusclerolobium, é a maior e mais

diversa morfologicamente, porém não é definida por nenhuma característica única para todas

as espécies. A seção Sclerolobiastrum (não amostrada aqui) é composta por uma única espécie

(S. melinonii) que se difere pela presença de tricomas estrelados nos órgãos vegetativos. A

seção Oriens é formada principalmente por espécies extra-amazônicas (com exceção a S.

subbullatum) e é diferenciada por algumas características vegetativas e florais, tais como

pétalas moderadamente pubescentes da base ao ápice e nervuras secundárias planas a imersas.

Tachigali não foi dividido em seções e os principais caracteres usados para

diferenciação das espécies foram: a forma do hipanto, a forma e o indumento dos filetes, o

indumento das pétalas e a posição do estípite do ovário.

40

Tabela 8. Características morfológicas das seções de Sclerolobium Vog. sensu Dwyer (1957)

Seções de Sclerolobium Características Morfológicas Espécies Cosymbe Pétalas largas (espatuladas a

obovadas) S. aureum S. micropetalum S. sp. nov.

Eusclerolobium Pétalas lineares, flores pediceladas, nervuras

secundárias proeminantes, tricomas das pétalas muito

densos

S. chrysophylum S. densiflorum, S. froesii S. guianense S. hypoleucum S. paniculatum var. paniculatum S. paniculatum var. subvelutinum S. pilgerianum

Oriens Nervuras secundárias impressas, Flores sésseis e

pétalas com poucos tricomas distribuídos uniformemente;

S. beaurepairei S. denudatum S. duckei S. friburgense S. rugosum S. urbanianum

Sclerolobiastrum Tricomas estrelados nos órgãos vegetativos S. melinonii (não amostrada)

Na filogenia inferida, baseada nas regiões rps16 e ITS, nas diferentes análises

empregadas, é evidente a presença de dois clados (figura 13B): A) ((((((T. paniculata, T.

paniculata var. alba), T. myrmecophila), T. formicarum), S. pilgerianum), Sclerolobium sp.

nova), S. aureum) e B) (((((S. beaurepairei, S. duckei), S.friburgense), S. rugosum), S.

densiflorum), S. paniculatum var. paniculatum). As outras espécies incluídas estão em uma

posição mais basal, em agrupamentos menores. Vale ressaltar que S. aureum e S. paniculatum

var. paniculatum são sustentados nos clados A e B, respectivamente, por baixos valores de

suporte. Porém o posicionamento é recorrente nos diferentes tipos de análises realizadas.

As espécies formalmente tratadas como Tachigali estão posicionadas no clado A, com

exceção a T. paratyensis. Elas estão agrupadas em grupo monofilético e compartilham uma

série de características, tais como: hipanto assimétrico, estípite aderido à parede do hipanto,

pétalas largas e o fato serem plantas de distribuição restrita à Amazônia. T. paratyensis possui

distribuição geográfica limitada à Mata Atlântica (do Rio de Janeiro a Pernambuco) e é a

única espécie de Tachigali s.s. que ocorre nesse bioma. Possui as mesmas características

citadas anteriormente, mas é prontamente distinguível pela flor grande (1,5-2 cm) e pelo

41

numero de folíolos (10-21 pares). A ausência de um ancestral comum mais próximo entre as

espécies amazônicas e T. paratyensis, sugere que as características comuns podem ser

interpretadas como convergências evolutivas (figuras 9 e 12B).

Figura 13. A) Proposta de Dwyer (1957) para as relações filogenéticas em Sclerolobium. B) Árvore

filogenética ilustrativa, baseada nas análises filogenéticas (MP, ML e Análise Bayesiana) inferidas para

Tachigali s.l., usando os regiões rps16 e ITS; Clados A e B em vermelho e azul, respectivamente.

S. pilgerianum emergiu como grupo irmão das espécies amazônicas do clado A. É uma

espécie restrita a Mata Atlântica, encontrada somente nos estados do Rio de Janeiro, Minas

Gerais e Espírito Santo (Silva & Lima 2007). Tem características típicas de Sclerolobium

(tabela 7), mas o hipanto apresenta uma leve assimetria. O clado ((((((T. paniculata, T.

paniculata var. alba), T. myrmecophila), T. formicarum), S. pilgerianum) pode ser

caracterizado pela assimetria do hipanto, embora este estado de caráter não possa ser

considerado uma sinapomorfia na filogenia inferida porque é compartilhada com T.

paratyensis. A pétala filiforme de S. pilgeriana pode ser interpretada como uma reversão

autapomórfica dentro do clado A.

As duas espécies mais basais do clado (S. aureum e S. sp. nov.) apresentam as pétalas

espatuladas, características da seção Cosymbe. Este caráter é compartilhado com todas as

B A

42

espécies do clado A, exceto S. pilgerianum, que apresenta as pétalas filiformes. A espécie S.

micropetlum também possui pétalas espatuladas, o que desqualifica a presença de pétalas

largas como uma sinapomorfia para o clado A. Cosymbe já esteve ligada a Tachigali no

passado, quando foi estabelecida como uma seção de Tachigali por Tulasne (1844).

Posteriormente, Baillon (1870) transferiu esta seção para Sclerolobium, o que foi aceito por

Bentham (1865, 1870) que fez as novas combinações para as espécies.

Os outros agrupamentos formados são todos compostos por espécies descritas

originalmente no gênero Sclerolobium, sendo que as características morfológicas em geral, são

aquelas que caracterizam o gênero, como expresso na tabela 7. Desta forma, nos comentários a

seguir só são apontados os estados de caráter que são discrepantes aos da tabela 7 ou algum

caráter que não esteja lá contemplado.

O clado B é composto por espécies de Mata Atlântica e S. paniculatum var.

paniculatum, ocorrente também na região Amazônica, que ocupa a posição mais basal do

clado. É um clado muito coeso morfologicamente. Para todos os caracteres florais codificados

(apêndice 3), observou-se diferença apenas no indumento das pétalas (S. paniculatum var.

paniculatum tem pétalas glabras), no pedicelo (presente em S. paniculatum var. paniculatum)

e no tamanho do estilete (maior que comprimento do ovário em S. densiflorum, enquanto nas

outras espécies é menor). É interessante notar que no subclado formado por S. duckei, S.

beaureiparei, S. friburgense e S. rugosum, todas as espécies pertencem à seção Oriens. Dwyer

(1957) cita e ilustra no seu diagrama com a proposta das relações filogenéticas em

Sclerolobium (figura 13A) que estas quatro espécies estão mais proximamente relacionadas.

O clado ((S. chrysophyllum, S. denudatum), S. urbanianum) só é evidente e apoiado

com suporte moderado nas análises de máxima verossimilhança (BP=79%) e de parcimônia

com o marcador ITS (BP=71%). Nas outras árvores inferidas, existe um clado formado por S.

chrysophyllum e S. denudatum, e a relação deste clado com S. urbanianum não está bem

resolvida. S. chrysophyllum é uma espécie de ampla distribuição na Amazônia (brasileira,

peruana e venezuelana). Ocasionalmente, a espécie apresenta pétalas com o ápice mais largo

que a base (“club-shaped”), uma característica incomum em Sclerolobium. S. denudatum e S.

urbanianum são citadas como as espécies aparentemente “mais avançadas” da seção Oriens

(Dwyer 1957). Curiosamente, foram as únicas espécies da seção que ficaram separadas em

outro clado.

43

O clado ((S. paniculatum var. subvelutinum, S. froesii), S. hypoleucum) só está presente

na análise de parcimônia para o ITS, pois não foram obtidas seqüências da região rps16 para

os dois primeiros táxons. As três espécies pertencem à seção Eusclerolobium. S. paniculatum

var. subvelutinum é a única que ocorre em áreas de Mata Atlântica e Cerrado (as outras duas

são amazônicas). Apesar de S. paniculatum var. subvelutinum ser tratada como uma variedade

de S. paniculatum, seu posicionamento não está de acordo com essa categoria infra-específica.

As duas variedades ficaram bem separadas na filogenia (figura 13B), apesar de apenas

diferirem quanto ao indumento da face abaxial dos folíolos e de não apresentarem diferenças

nos caracteres florais codificados. Assim, este resultado dá apoio ao tratamento dessas

variedades como espécies separadas.

Os caracteres florais usados classicamente para diferenciar os gêneros Tachigali s.s. e

Sclerolobium se mostraram fracos para filogenia, ou seja, para definir grupos monofiléticos.

Os estados de caráter que definem Tachigali s.s. (tabela 7) se mostraram um pouco melhores e

estão concentrados no denominado clado A (com exceção a T. formicarum, que tem flores

pequenas e estames subiguais), embora T. paratyensis exiba essas mesmas características e T.

micropetalum tenha pétalas largas (figuras 9 e 10). Os estados de caráter que definem

Sclerolobium (tabela 7) estão espalhados por toda a filogenia (figuras 9 e 10). Embora seja

evidente a existência de dois grupos morfológicos, os caracteres que definem esses grupos

parecem estar muito sujeitos a homoplasia. Esse componente homoplástico pode ser bem

observado pelas seções de Sclerolobium, que definidas por esses caracteres morfológicos, se

mostraram artificiais na filogenia.

Estes resultados confirmam o status congenérico de Tachigali e Sclerolobium, pois

mostram não-monofiletismo desses grupos como gêneros separados (figura 13B). Além disso,

é mostrada a distribuição de caracteres empregados na taxonomia, na filogenia, onde foi

observado um padrão homolpástico desses caracteres. Este dado aponta para a grande

dificuldade na construção de uma classificação infragenérica filogenética para Tachigali s.l.

com conhecimento obtido até o momento, já que nenhum atributo morfológico define

qualquer grupo monofilético dentro do gênero.

44

6. Conclusão

São apresentadas, a seguir, as principais conclusões do presente trabalho:

• O grupo Sclerolobium sensu Polhill & Vidal (1981) não é monofilético. Os testes

onde o monofiletismo do grupo Sclerolobium (Tachigali, Sclerolobium,

Diptychandra) é forçado não apóiam esse agrupamento e, na filogenia inferida com

os marcadores trnL-F e rps16, Tachigali e Sclerolobium se mostraram mais

relacionados a Arapatiella e Jacqueshuberia, o que dá apoio ao grupo Tachigali, um

grupo monofilético composto por estes quatro gêneros, e estabelecido por Lewis et

al. (2005), com base em análises filogenéticas moleculares recentes (Haston et al.

2005).

• Apesar de uma amostragem mais ampla de Caesalpinieae, incluindo táxons nunca

amostrados em uma mesma filogenia (Dimorphandra, Mimosoideae,

Campsiandra), o posicionamento de Diptychandra permanece incerto na filogenia

da Leguminosae, embora sua possível posição como grupo irmão de Tachigali e

Sclerolobium tenha sido definitivamente refutada.

• A análise filogenética com os marcadores rps16 e ITS e os testes de monofiletismo

empregados mostraram que os gêneros Tachigali e Sclerolobium sensu Dwyer

(1954, 1957), não são monofiléticos. Porém, os dois constituem um único grupo

monofilético, o que dá suporte a proposta de considerá-los sinônimos, ampliando a

circunscrição de Tachigali Aubl. (1775) para incluir Sclerolobium Vogel (1837).

• A filogenia inferida para Tachigali s.l., baseada nos marcadores rps16 e ITS, além

de confirmar o status congenérico de Tachigali e Sclerolobium, mostra que os

grupos monofiléticos recuperados não são definidos por nenhum caráter usado na

taxonomia dos gêneros. O padrão homoplástico dos caracteres aponta para a

dificuldade de se construir uma classificação infragenérica filogenética para

Tachigali s.l..

45

7. Referências Bibliográficas

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Zarucchi, J. & Herendeen, P. 1993. Tachigali (Fabaceae). In: Brako, L. & Zarucchi, J. Catalogue of the flowering plants and Gymnosperms of Peru, Monographs in Systematic Botany from Missouri Botanical Garden 45, 1254-1255.

52

8. Apêndices

8.1. Apêndice 1 Tabela das amostras utilizadas. As amostras estão representadas pelo nome, o respectivo número de tombo do material

testemunho*, o número do Banco de DNA do JBRJ e número de acesso do GeneBank (no caso das seqüências baixadas) e em que

análises foram utilizadas. * Número de tombo do herbário (RB) ou número do coletor.

Táxons Material

Testemunho* RBdna GeneBank

rps16 GeneBank

trnL-F Análises

Abarema cochliacarpos 418722 1750 - - 1

Acrocarpus fraxinifolius - - AY899741 AY899683 1

Arapatiella emarginata - - AY899746 AY899688 1, 3

Arapatiella psilophylla H. C. Lima 6318 1558 - - 1, 2, 3

Caesalpinia calycina - - AY899749 AY899691 1

Caesalpinia coriaria - - AY899750 AY899692 1

Caesalpinia eriostachys - - AY899751 AY899693 1

Campsiandra comosa 418580 2157 - - 1

Dimorphandra sp. 438945 - - - 1

Dinizia excelsa 418579 2156 - - 1

Diptycandra aurantiaca 440031 - - - 1

Jacqueshuberia loretensis - - AY899761 AY899704 1, 2, 3

Jacqueshuberia purpurea - - AY899762 AY899705 1, 2, 3

Melanoxylon brauna - - AY899757 AY899700 1

Moldenhawera brasiliensis - - AY899759 AY899702 1

53

Moldenhawera floribunda 425390 2176 - - 2, 3

Mora paraensis 418741 1774 - - 1

Parapiptadenia pterosperma 418744 1777 - - 1

Parkinsonia peruviana - - AY899771 AY899714 1, 2, 3

Peltophorum dubium H. C. Lima 6343 1565 - - 1, 2, 3

Poeppigia procera - - AY899740 AY899682 1

Pterogyne nitens - - AY899747 AY899689 1

Recordoxylon speciosum - - AY899756 AY899699 1

Sclerolobium aff. setiferum H. C. Lima 6702 - - - 3

Sclerolobium aureum A. Salino 7899 - - - 2, 3

Sclerolobium beaureparei 419645 2474 - - 3

Sclerolobium chrysophyllum 384785 - - - 3

Sclerolobium densiflorum H. C. Lima 6288 1557 - - 3

Sclerolobium densiflorum - - AY899763 AY904429 1, 3

Sclerolobium denudatum 425394 2470 - - 3

Sclerolobium duckei 430982 2599 - - 3

Sclerolobium friburgense 419650 2473 - - 3

Sclerolobium froesii 417861 - - - 3

Sclerolobium guianense 439496 2601 - - 2, 3

Sclerolobium guianense 442452 2647 - - 3

Sclerolobium guianense 442455 2649 - - 3

Sclerolobium hypoleucum 445941 - - - 3

54

Sclerolobium micropetalum 442451 2650 - - 3

Sclerolobium paniculatum var. paniculatum 418574 2151 - - 2, 3

Sclerolobium paniculatum var. subvelutinum 115095 - - - 3

Sclerolobium paraense 442454 2648 - - 3

Sclerolobium paraense 359714 - - - 2, 3

Sclerolobium pilgerianum 425395 2467 - - 2, 3

Sclerolobium rugosum 414798 1705 - - 3

Sclerolobium sp. nov. 419652 2469 - - 3

Sclerolobium urbanianum 420613 2180 - - 3

Tachigali formicarum H. C. Lima 6700 - - - 3

Tachigali macrostachya 394154 - - - 2, 3

Tachigali myrmecophila 442453 2602 - - 2, 3

Tachigali myrmecophila - - AY899764 AY899706 1

Tachigali paniculata 418585 2158 - - 2, 3

Tachigali paniculata var. alba 439495 2600 - - 2, 3

Tachigali paratyensis 419636 2471 - - 2, 3

Tachigali sp. 1 H. C. Lima 6721 - - - 3

Tachigali sp. 2 H. C. Lima 6730 - - - 3

Tachigali sp. 3 H. C. Lima 6756 - - - 3

Tetrapterocarpon geayi - - AY899742 AY899684 1

Vouacapoua americana - - AY899758 AY899701 1

55

8.2. Apêndice 2

Parâmetros dos modelos de substituição nucleotídica estimados via AIC pelo

ModelTest v3.7 (Posada & Crandall 1998) para as análises de máxima verossimilhança e

testes de monofiletismo (LRT).

Parâmetros trnL-F + rps16 rps16 (LRT) rps16 + ITS

Modelo Selecionado TVM+Γ K81uf+Ι TIM+Ι+Γ f(A) 0,3493 0,3334 0,2713 f(C) 0,1485 0,1337 0,2016 f(T) 0,1706 0,2062 0,2410 f(G) 0,3316 0,3267 0,2860

R (A-C) 0,9558 1,0000 1,0000 R (A-G) 1,6101 1,2653 5,4321 R (A-T) 0,3999 0,1821 0,7052 R (C-G) 0,7715 0,1821 0,7052 R (C-T) 1,6101 1,2653 4,2155 R (G-T) 1,0000 1,0000 1,0000

Γ 0,6042 0,0000 1,7317

Ι 0,0000 0,7709 0,4725

56

8.3. Apêndice 3

Matriz de dados morfológicos montada no programa Nexus Data Editor (NDE) (Page 2001), no formato NEXUS, com as

devidas anotações sobre os táxons utilizados, caracteres e estados de caráter codificados.

#NEXUS

BEGIN TAXA;

DIMENSIONS NTAX=26;

TAXLABELS

'Peltophorum dubium'

'Moldenhawera floribunda'

'Jacqueshuberia purpurea'

'Arapatiella psilophylla'

T.formicarum

T.myrmecophila

T.paniculata

'T.paniculata var. alba'

T.paratyensis

S.aureum

S.micropetalum

'S.sp. nov.'

S.chrysophyllum

S.densiflorum

S.froesii

S.guianense

S.hypoleucum

S.pilgerianum

'S.paniculatum var. subvelutinum'

'S.paniculatum var. paniculatum'

S.beaurepairei

S.denudatum

S.duckei

S.friburgense

S.rugosum

S.urbanianum

;

ENDBLOCK;

BEGIN CHARACTERS;

DIMENSIONS NCHAR=54;

FORMAT DATATYPE=STANDARD MISSING=? GAP=- SYMBOLS="0123";

CHARLABELS

[1] 'Tipo de folha'

[2] 'Tipo de pinacao'

[3] 'Raque [em secao transversal]'

[4] 'Raque [domaceas p mirmecofilia]'

57

[5] 'Raque [seta terminal]'

[6] 'Foliolos / Foliolulos [pulvinulos]'

[7] 'Pulvinulo [secao transversal]'

[8] 'Foliolos [numero de pares]'

[9] 'Foliolos / Foliolulos [simetria da base]'

[10] 'Foliolos [base]'

[11] 'Foliolos [apice]'

[12] 'Estipula [tipo]'

[13] 'Estipula [limbo]'

[14] 'Nervuras secundarias [face abaxial]'

[15] 'Nervuras terciarias [face abaxial]'

[16] 'Inflorescencia unidade de floracao [laxa/congesta]'

[17] 'Pedunculo [tamanho]'

[18] 'Pedicelo [presença]'

[19] 'Pedicelo [tamanho]'

[20] 'Pre-floraçao [tipo]'

[21] 'Hipanto [presenca]'

[22] 'Hipanto [simetria]'

[23] 'Botao Floral [tamanho]'

[24] 'Sepelas [posicao na flor]'

[25] 'Petala [forma da lamina]'

[26] 'Petala [unha]'

[27] 'Petalas [diferenciacao]'

[28] 'Petala [indumento]'

[29] 'Estames [tamanho]'

[30] 'Dimorfismo dos estames [presenca]'

[31] 'Dimorfismo dos estames [tipo]'

[32] 'Filetes [conacao]'

[33] 'Antera [tipo de insercao]'

[34] 'Estipite [presenca]'

[35] 'Estipite [posicao]'

[36] 'Estipite [tamanho]'

[37] 'Ovario [distribuicao do indumento]'

[38] 'Estilete [tamanho]'

[39] 'Estigma [forma]'

[40] 'Fruto [tipo]'

[41] 'Fruto [tipo de deiscencia]'

[42] 'Fruto [consistencia do pericarpo]'

[43] 'Fruto [septacao]'

[44] 'Fruto [tamanho]'

[45] 'Endosperma [presenca]'

[46] 'Eixo hipocotilo-radicula [orientacao]'

[47] 'Semente [secao transversal]'

[48] 'Semente [orientacao]'

[49] 'Testa [consistencia]'

[50] 'Plumula [tricomas]'

[51] 'Tectum (padrao geral da superficie)'

[52] 'Tectum [tipo de reticulacao]'

[53] 'Aberturas [tamanho]'

[54] '"Foot layer" estrutura'

58

;

STATELABELS

1

pinada

bipinada,

2

paripinada

imparipinada,

3

cilindrica

'achatada na parte superior'

canaliculada

alada,

4

ausente

presente,

5

ausente

presente,

6

sesseis

pulvinulados,

7

cilindrico

achatado,

8

'classe 1 '

'classe 2 '

'classe 3',

9

'simetricos '

assimetricos,

10

'aguda '

atenuada

arredondada

cordada,

11

obtuso

agudo

acuminado

cuspidado,

12

inteira

'pouco ramificada'

'muito ramificada',

13

foliosa

estreita,

59

14

impressas

'levemente proeminentes'

'muito proeminentes',

15

impressas

'pouco proeminentes'

'muito proeminentes',

16

laxa

congesta,

17

'menor que a raque '

'maior que a raque ',

18

'ausente (flor sessil/subsessil) '

presente,

19

'menor que o comprimento do botão floral '

'aproximadamente igual ao botão floral'

'1,5x maior que o botão floral',

20

valvar

imbricada,

21

ausente

presente,

22

'simetrico [cupular] '

'pouco assimetrico [turbinado com os lados alcançando a mesma altura]'

'muito assimetrico [turbinado com os lados alcançando alturas diferentes]',

23

' classe 1 '

'classe 2 '

'classe 3',

24

'nao reflexas'

reflexas,

25

'filiforme '

'estreito-eliptico'

espatulada,

26

'sessil/subsesil'

unguiculada

'longo-unguiculada',

27

indiferenciadas

diferenciadas,

60

28

'glabra '

'com indumento',

29

'menores que as petalas'

'maiores que as petalas',

30

ausente

presente,

31

'3 estames adaxiais menores'

'9 estames adaxiais menores',

32

ausente

presente,

33

basifixa

dorsifixa,

34

'ausente '

'presente ',

35

'centro do receptaculo'

'levemente deslocado do centro '

'aderido a parede do hipanto',

36

'menor que o comprimento do ovario '

'maior que o comprimento do ovario '

'mesmo tamanho que o ovario',

37

'por todo o ovario'

'nas margens'

glabro,

38

'menor que o comprimento do ovario'

'igual ao comprimento do ovario'

'maior que o comprimento do ovario',

39

puntiforme

pateliforme,

40

samaroide

ciptossamara

legume,

41

'passiva '

'explosiva, com as valvas reflexas'

'explosiva, com as valvas helicoidais',

61

42

'cartaceo/coriaceo '

lenhoso,

43

'ausente '

presente,

44

'classe 1 '

'classe 2 '

'classe 3'

'classe 4',

45

'ausente '

presente,

46

'paralelo ao ao eixo dos coltiledones'

'obliquo ao eixo dos cotiledones',

47

plana

compressa,

48

'perpendicular ao fruto '

'obliqua ao fruto'

'paralela ao eixo do fruto',

49

membranacea

coriacea,

50

ausente

presente,

51

'reticulado '

punctado,

52

'regular '

irregular,

53

'menor que a metade da distancia polar'

'maior que a metade da distancia polar',

54

lisa

'com projecoes',

62

MATRIX

'Peltophorum dubium’ 100000--1- -2-0--0111 10---11-00 -01100--10 -00-100200 0(01)01

'Moldenhawera floribunda' (01)12001--0- -2-0--1120 0----10-01 1000----02 210-100010 1?1?

'Jacqueshuberia purpurea' 102000--1- -2-0--0121 10---20-10 -110----02 111-101110 0100

'Arapatiella psilophylla' 000001--0- -0-0?-0101 11---1?-10 -01101--12 111?011101 01??

T.formicarum 00(13)1?11112 (23)??1010101 1201210010 -011(12)00?01 0001?002?0 ????

T.myrmecophila 00110110(01)(12) 3101010101 1211210111 0011200201 0002?002?0 ????

T.paniculata 003111100(12) 3201010101 1211210111 0011200201 0001?002?0 ????

'T.paniculata var. alba' 00???1???? ?????10??1 1???210?11 0011200201 000??002?0 ????

T.paratyensis 0010110212 (23)101000101 1221210111 0011200201 0001000200 0010

S.aureum 00(02)0110102 1??1110101 1001210010 -011000201 0000100210 ????

S.micropetalum 002011011(012) (23)212(01)10101 1001210010 -0110(01)1101 0003?002?0 ????

'S.sp. nov.' 0000010000 2101010101 100?210110 -011000?01 0000?002?0 ????

S.chrysophyllum 0021011012 3??2010(01)01 1000(01)(01)0010 -011000(12)01 0001?002?0 ????

S.densiflorum 00(01)0011012 22122100-1 1000000110 -011001201 0001100210 (01)01(01)

S.froesii ?????????? ?????????1 10??000010 -011001201 000??002?0 ????

S.guianense 00(12)01111(01)(23) 32110100-1 1000000010 -011000201 0002?002?0 ????

S.hypoleucum 0010110002 2100010101 100(01)000110 -011000201 0000?002?0 ????

S.pilgerianum 00(02)001(01)10(01) (23)101010101 1(01)01000110 -011000001 0001?002?0 ????

'S.paniculatum var. subvelutinum' 0000111112 1??2010111 1000000010 -011000201 0001?002?0 ????

'S.paniculatum var. paniculatum' 0010110012 (23)011010111 1000000010 -011000101 0001100210 (01)01(01)

S.beaurepairei 0010011011 21010100-1 1000000110 -011000(01)01 0001?002?0 ????

S.denudatum 002011100(12) (23)1010100-1 1000000110 -011000001 0001?002?0 ????

S.duckei 000011111(12) (12)0120100-1 1000000110 -011000001 0001?002?0 ????

S.friburgense 0010111112 (12)0120100-1 1000000110 -011000001 0001?002?0 ????

S.rugosum 00(12)1111102 10121100-1 1000000110 -011000001 0001?002?0 ????

S.urbanianum 000011(01)00(12) (12)2000100-1 1000000110 -011000001 0001?002?0 ????

; ENDBLOCK;