Dissertação de Mestrado - UFPE

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Dissertação de Mestrado

AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DO

Ricinus communis L. NA DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE

ANTITUMORAL E EM ESTUDOS COM RADIOFÁRMACO.

Kristiana Cerqueira Mousinho

Recife, 2006

Kristiana Cerqueira Mousinho

AVALIAÇÃO FARMACOLÓGICA DO

Ricinus communis L. NA DETERMINAÇÃO DA

ATIVIDADE ANTITUMORAL E EM ESTUDOS COM

RADIOFÁRMACO.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Ciências Farmacêuticas, do

Departamento de Ciências Farmacêuticas, da

Universidade Federal de Pernambuco, como requisito

à obtenção do grau de Mestre em Ciências

Farmacêuticas na área de Produtos Naturais e

Bioativos.

Orientadora: Profª. Drª. Maria Teresa J. de A.Catanho

Co-Orientadora: Profa. Drª. Ivone Antônia de Souza

Recife, 2006

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

Reitor

AMARO HENRIQUE PESSOA LINS

Vice-Reitor

GILSON EDMAR GONÇALVES E SILVA

Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação

CELSO PINTO DE MELO

Diretor do Centro de Ciências da Saúde

JOSÉ THADEU PINHEIRO

Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde

MÁRCIO ANTÔNIO DE ANDRADE COELHO GUEIROS

Chefe de Departamento de Ciências Farmacêuticas

JANE SHEILA HIGINO

Vice-Chefe de Departamento de Ciências Farmacêuticas

SAMUEL DANIEL DE SOUZA

Coordenador de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

MIRACY MUNIZ DE ALBUQUERQUE

Vice-Coordenador de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas

PEDRO JOSÉ ROLIM NETO

Essa dissertação é dedicada aos meus pais,

Gabriel e Nádja, titia Nazaré, irmãos Karinne e

Diogo, as pequenas Lívian e Líris, pela

compreensão nos momentos em que precisei estar

ausente e por fazerem o sacrifício valerem à

pena.

AGRADECIMENTOS

• A Deus, o mestre dos mestres, por guiar todos os momentos da minha

vida, com seu infinito amor, misericórdia e bondade. A minha Virgem

Santíssima que sempre me há de valer, e que como mãe sempre me

confortou nos momentos de aflição.

• As orientadoras Profas. Teresa e Ivone, a minha gratidão, que

conhecendo as dificuldades e inexperiência dedicou total assistência em

todas as situações, para que eu pudesse superar as falhas. Agradeço pela

amabilidade, paciência e acima de tudo os ensinamentos transmitidos.

• A Profo. Mário Bernardo-Filho pela valiosa atenção e contribuição em

todo o trabalho, pela disposição e colocações pertinentes no intuito de

que este trabalho ficasse melhor.

• As Profas. Silene Carneiro e Julianna Albuquerque por toda atenção e

considerações feitas para a melhoria da dissertação.

• Aos meus pais, Gabriel e Nádja Mousinho, pelo apoio, incentivo,

compreensão e o amor dado em todos os momentos da minha vida, não

dispensando esforços para que eu realizasse esse sonho.

• Aos meus irmãos Karinne e Diogo por sempre torcerem pelo meu

sucesso. Ao meu cunhado Luciano por todo o apoio.

• As minhas pequenas e amadas sobrinhas Lívian, que é o meu xodó e a

bonequinha Líris, que chegou antes da hora só pra comemorar com a

titia este momento.

• As minhas estimadas Titia Nazaré e Vovó Nadege por todo o carinho

durante o mestrado.

• A Júnior por entender que a ausência era para o meu crescimento

profissional.

• A toda minha família pelo carinho dedicado, em especial, Paulinha, Tio

Pipico, Lucitânia, Airton, Tia Norma.

• As minhas amigas, Ângela e Sâmya, que sempre estiveram comigo.

• Ao corpo docente do Mestrado em Ciências Farmacêuticas da UFPE,

por todo o apoio recebido durante o curso.

• A Prof. Haroudo, por ter o prazer de poder estudar com uma pessoa tão

alegre e sábia.

• Aos amigos: Simey Magnata, André, Jailson, Odinilson, Thiago.

Elizângela Barbosa, pela valiosa contribuição na construção do

conhecimento e a riqueza dos experimentos; Luciana, Diogo Florêncio,

Janaína, Marigilson, André, Cínthia, Leonardo, Aldo, Júlio, Guedes,

Maria Patrícia por todo o companheirismo durante o tempo que

passamos juntos.

• Em especial a mamãe Jovita, Laurimar e Marília que são seres que

possuem luz própria, que transmitem paz, amor e acima de tudo

lealdade em tudo o que faz.

• A todos do pensionato, D. Vilma, Vitor, Madalena, Fernanda, Quinha,

Juliana, Débora, Thaís por todos os momentos maravilhosos que

passamos juntos.

• A Iguacy, Fal, Fredson e Edna por toda atenção dispensada.

Espero que não tenha esquecido de ninguém, e aproveito para agradecer mais

uma vez a Deus por estar sempre colocando anjos na minha vida, estrelas e

não cometas, desde o dia em que nasci...

Quem é você, surgindo das nuvens, trazendo esperança,

Que faz com que eu creia que o mal se irá chegando a bonança?

Quem é você, que sofre com a gente sofrida, aflita,

A dor que não é sua, mas muito lhe dói, pois é infinita?

Quem é você, sorriso tão franco, que acalma e ampara,

Que não por magia, da noite escura faz a noite mais clara?

Quem é você, que na chuva ou no sol, acode e mitiga

A dor desse irmão cuja cura em questão é a voz mais amiga?

Quem é você, humilde e atento, que herdou de Galeno o dom de curar

Que busca nos frascos da simples botica a mistura correta que há de

salvar?

Quem é você, que, nas grandes bancadas, um dia, quem sabe, irá

conceber

O tal comprimido da cura total e a doença deter,

Envolto em penumbra, modesto e avesso à fama e ao poder?

Enfim, já o vejo no embate sem tréguas vencendo tanatos

Com tantas poções, comprimidos, loções, milagrosos extratos,

Buscando a ciência e, quem sabe, um dia, talvez, transformar

A fera que somos num ser mais perfeito

Incapaz de odiar...

(A voz mais amiga - Isaac Schneider)

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS............................................................................................. III

LISTA DE TABELAS........................................................................................... VI

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS.............................................................. VII

RESUMO................................................................................................................ IX

ABSTRACT............................................................................................................ XI

1. INTRODUÇÃO.................................................................................................. 1

2. REVISÃO DA LITERATURA.......................................................................... 4

3. OBJETIVOS....................................................................................................... 13

3.1 GERAL.............................................................................................................. 14

3.2 ESPECÍFICO.................................................................................................... 14

4. ARTIGO I: Avaliação da Atividade Antitumoral da Fração Não-Oleosa do

Ricinus communis L. em Sarcoma 180................................................................... 15

RESUMO................................................................................................................... 16

INTRODUÇÃO......................................................................................................... 17

METODOLOGIA...................................................................................................... 18

RESULTADOS.......................................................................................................... 20

DISCUSSÃO.............................................................................................................. 23

ABSTRACT.............................................................................................................. 24

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 25

5. ARTIGO II: Efeitos do extrato de Ricinus communis L. na fragilidade

osmótica, marcação de hemácias com Tecnécio-99m e morfologia das

células...................................................................................................................... 29

ABSTRACT.............................................................................................................. 30

INTRODUÇÃO........................................................................................................ 30

METODOLOGIA...................................................................................................... 31

RESULTADOS......................................................................................................... 33

DISCUSSÃO............................................................................................................. 37

RESUMO.................................................................................................................. 38

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................... 38

I

6. ARTIGO III: Biodistribuição com Tc-99m do Ricinus communis L............. 42

ABSTRACT............................................................................................................. 43

INTRODUÇÃO....................................................................................................... 43

METODOLOGIA.................................................................................................... 44

RESULTADOS........................................................................................................ 47

DISCUSSÃO............................................................................................................ 49

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................... 51

7. CONCLUSÃO.................................................................................................... 60

8. PERSPECTIVAS............................................................................................... 62

9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................ 64

10. ANEXOS........................................................................................................... 71

ANEXO I................................................................................................................. 72

ANEXO II............................................................................................................... 79

II

LISTA DE FIGURAS

Revisão da Literatura Figura 1A. Ricinus communis L............................................................................... 6

1B. Sementes de Ricinus communis L.......................................................... 6

Figura 2. Esquema simplificado de um gerador de Molibdênio-99/Tecnécio-99m... 9

Artigo I Figura 1. Média dos pesos dos tumores, Sarcoma 180, para os grupos controle,

padrão e tratados (grupo 1- gr-1 e grupo 2 – gr - 2) com R. communis L nas doses de

2,0 e 3,0 mg/kg, respectivamente. Os resultados são expressos em média ± desvio

padrão com Teste- T,* p≤0,05................................................................................... 21

Figura 2. Percentagem de inibição tumoral, Sarcoma 180, para os grupos controle,

padrão e tratados (gr-1 e gr-2) com R. communis L nas doses de 2,0 e 3,0 mg/kg,

respectivamente....................................................................................................... 21

Figura 3. Comparação entre o grupo de camundongos machos com Sarcoma 180, no

controle, tratados com solução salina 0,9% e o grupo padrão, tratado com

ciclofosfamida na dose de 2,5 mg/kg...................................................................... 22

Figura 4. Comparação entre o grupo de camundongos machos com Sarcoma 180, no

controle, tratados com solução salina 0,9% e o grupo tratado com R. communis na

dose de 2,0 mg/kg................................................................................................... 22

Figura 5. Comparação entre o grupo de camundongos machos com Sarcoma 180 e no

controle tratados com solução salina 0,9% e o grupo tratado com R. communis com

dose de 3,0 mg/kg.................................................................................................... 23

Artigo II Figura 1. Curva de fragilidade osmótica das hemácias dos ratos (H) após tratamento

com Ricinus communis L. Os valores das médias são representativos de três

experimentos similares............................................................................................. 34

III

Figura 2. Efeitos do extrato de Ricinus communis na fixação de Tc-99m no plasma e

nas hemácias em água. Os resultados são expressos em médias ± desvio padrão com

Teste-T, p<0,05...................................................................................................... 34

Figura 3. Efeitos do extrato de Ricinus communis na fixação de Tc-99m na fração

insolúvel. Os resultados são expressos em médias ± desvio padrão com Teste-T,

*p<0,05................................................................................................................. 35

Figura 4. Células do controle - Esfregaço foi preparado, secado, fixado e corado.

Após isso, a morfologia das hemácias foi avaliada em microscópio óptico (x40)..... 36

Figura 5. Na presença do extrato de Ricinus communis L. (0,062 mg/mL), o

esfregaço foi preparado, secado, fixado e corado. Após isso, a morfologia das

hemácias foi avaliada em microscópio óptico (x40). A seta indica alteração na

morfologia celular................................................................................................................ 36

Figura 6. Na presença do extrato de Ricinus communis L. (0,125 mg/mL), o

esfregaço foi preparado, secado, fixado e corado. Após isso, a morfologia das

hemácias foi avaliada em microscópio óptico (x40). A seta indica alteração na

morfologia celular..................................................................................................... 37

Artigo III Figura 1. Determinação de proteínas totais, para os grupos controle e tratados (grupo

1 – gr-1 e grupo 2 – gr-2) com R. communis L nas doses de 1,0 e 3,0 mg/kg,

respectivamente. Os resultados são expressos em média ± desvio padrão com Teste-

T, *p≤0,05............................................................................................................... 56

Figura 2. Comparação entre o grupo de camundongos machos com Sarcoma 180 e o

controle, tratados com solução salina 0,9% e o grupo tratado com R. communis na

dose de 1,0 mg/kg................................................................................................... 57

Figura 3. Comparação entre o grupo de camundongos machos com Sarcoma 180 e no

controle tratados com solução salina 0,9% e o grupo tratado com R. communis com

dose de 3,0 mg/kg................................................................................................... 57

Figura 4. Frações de proteínas do extrato puro passado na coluna de cromatografia de

filtração.................................................................................................................... 58

IV

Figura 5. Frações do Tc-99m puro passado na coluna de cromatografia de filtração

em gel...................................................................................................................... 58

Figura 6. Frações do extrato marcado de R. communis com Tc-99m passado na

coluna de cromatografia de filtração....................................................................... 59

Figura 7. Frações do extrato marcado de R. communis com Tc-99m na marcação de

células sanguíneas, hemácia e plasma..................................................................... 59

V

LISTA DE TABELAS

Revisão da Literatura

Tabela 1. Sistema de geradores de radionuclídeos, adaptado de THRALL & ZIESSMAN,

2003.................................................................................................................................. 8

Artigo I Tabela 1. Efeito do R. communis na avaliação de inibição tumoral. Os resultados são

expressos em média ± desvio padrão com Teste-T, *p≤0,05........................................... 20

Artigo III Tabela 1. Efeito do R. communis na cinética da biodistribuição do Tc-99m em 25

camundongos normais Swiss sacrificados após 20 minutos da injeção do radiofármaco.

Abreviações: DP = desvio padrão; %ATI = percentual de radioatividade e * = p≤

0,05..................................................................................................................................... 55

Tabela 2. Efeito do R. communis na cinética da biodistribuição do Tc-99m em 25

camundongos com indução tumoral Swiss sacrificados após 20 minutos da injeção do

radiofármaco. Abreviações: DP = desvio padrão; %ATI = percentual de radioatividade e *

= p≤ 0,05........................................................................................................................... 56

VI

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

%ATI Percentagem de radioatividade ou da atividade total injetada

%H Percentual de hemólises

β Beta

C Células

cpm Contagem por minuto

DP Desvio Padrão

FDA Food and Drug Administration

FI Fração Insolúvel

FIP Fração Insolúvel do Plasma

FS Fração Solúvel

FSP Fração Solúvel do Plasma

g Grama

H Hemácias

ICLAS Normas Internacionais do Conselho do Laboratório de Animais

Experimentais

IF Insoluble Fraction

IP Intraperitoneal

keV kiloeletronvolt

kg kilograma 99m Tc Isótopo metaestável do elemento tecnécio de número de massa 99 99Mo Isótopo do elemento molibdênio de número de massa 99

Na99mTcO4 Pertecnetato de sódio

MBq Mega Bequerel

µL Microlitro

µCi Micro Curie

mg Miligrama

mL Mililitro

mm Milimetro

NaCl 0,9% Cloreto de Sódio 0,9% ou solução fisiológica (salina)

VII

nm nanômetro

DO Densidade Óptica

P Plasma

RBC Red Blood Cells

rpm Rotação por minuto

SF Soluble Fraction

SnCl2 cloreto estanoso

TCA 5% Ácido Tricloroacético 5%

TcO-4 Íon pertecnetato

v/v Volume por volume

VIII

RESUMO Ricinus communis L. é popularmente conhecida como carrapateira, mamona e pertence à família das Euforbiáceas. Possui três sementes em cada fruto, das quais é extraído o óleo de rícino. A fração não-oleosa, que é resultante da expressão do óleo, contém proteína tóxica (ricina) que é utilizada como adubo orgânico. Neste estudo foi avaliada a influência do Ricinus communis na atividade antitumoral, fragilidade osmótica, marcação (in vitro) de elementos sanguíneos com pertecnetato de sódio (Na99mTcO4) e morfologia celular; na biodistribuição com Tc-99m em animais sadios e com indução tumoral e análise de proteínas totais; como também a marcação e controle radioquímico do extrato com Tc-99m. Após 48 horas do implante do Sarcoma 180, os camundongos machos foram tratados com o extrato durante sete dias, sendo sacrificados após este período e os tumores dissecados e pesados. Na fragilidade osmótica, amostras de sangue de ratos Wistar foram incubadas com o extrato de R. communis e com soluções de NaCl (0,4; 0,7; 0,9%). Na marcação das células vermelhas do sangue (in vitro), amostras de sangue foram obtidas de ratos Wistar e incubadas com diferentes concentrações de R. communis, para o controle foi utilizado NaCl 0,9% e adicionados o cloreto estanoso (SnCl2) e o Tc-99m. As frações de plasma (P) e de hemácias (H) foram separadas e, também, precipitadas com ácido tricloroacético a 5% obtendo as frações solúvel (FS) e insolúvel (FI), sendo analisado também a morfologia das células. A percentagem de radioatividade (%ATI) de cada uma das frações foi calculada. Na biodistribuição foi realizado o implante tumoral nos dois grupos tratados com R. communis e o controle com solução salina 0,9%, injetados por via IP, em dose única por 7 dias, os animais foram sacrificados no 8° dia, 20 minutos após a administração do Tc-99m. Os órgãos foram isolados e a percentagem de radioatividade (%ATI) de cada órgão foi calculada; do sangue foi retirado o soro dos animais e feito a avaliação das proteínas totais. O extrato foi marcado com pertecnetato de sódio e cloreto estanoso, avaliando o controle radioquímico. O extrato protéico de R. communis apresentou resultados satisfatórios na inibição tumoral com 67% e 72% de resposta quando comparado com o controle. Os resultados de fragilidade osmótica indicam que houve aumento na taxa de hemólise na concentração de 0,125 mg/mL e que não houve ocorrência de alterações na marcação de células vermelhas do sangue nas concentrações de 6,25% para 25% do extrato quando comparado com o % do controle, entretanto, foi observado um decaimento de 49,69% na concentração de 100%, verificando que nestas concentrações ocorrem alterações morfológicas nas células do sangue e que a radiação nas frações insolúveis promoveu a redução da radioatividade. Na biodistribuição houve redução na captação do Tc-99m na maioria dos órgãos analisados, sendo significativo nos rins grupo 1, músculo e cérebro; e aumento no estômago (G2) e nos rins (G3); em animais tumorais, essa redução foi significativa, principalmente no coração, pulmão, rins e tumor, apresentando uma concentração de proteínas totais nos animais tumorais de 34,62 e 34% com relação ao % controle. Quanto ao controle radioquímico através da cromatografia de filtração observou-se que o extrato marcado com Tc-99m apresentou duas frações com 130.007 e 494.592 cpm, e que estas frações foram analisadas pela marcação das células sanguíneas, com % de ATI de 61,88 e 41,32 % nas frações 1 e 2, respectivamente. Portanto conclui-se que o extrato de R. communis possui grande potencial antitumoral, alterando a captação do Tc-99m nos testes in vitro e in vivo, competindo com o Tc-99m no sítios de ligação das

IX

hemácias devido à capacidade de oxidação do íon estanoso, pela competição nos sítios de ligação do íon pertecnetato, modificando assim as estruturas celulares. Palavras – Chave: Ricinus communis L., antitumoral, fragilidade osmótica, marcação de hemácias, morfologia celular, biodistribuição.

X

ABSTRACT Ricinus communis L. is popularly known as carrapateira, mamona and belongs to the Euforbiacea family. It has three seeds, where the ricin oil is extracted. The non-oil fraction, which is the result of the oil extraction, contains a toxic protein (ricin) which is used as organic manure. In this study, it was evaluated the influence of Ricinus communis in the antitumour activity, osmotic fragility, labeling (in vitro) of blood elements with sodium pertechnetate (Na99mTcO4) and cells morphology; in the biodistribution with Tc-99m in healthy animals and with tumours and analysis of total protein; and also the labeling and radiochemical control of the extract with Tc-99m. After 48 hours implanting Sarcoma 180 in the male mices it was realized the treatment with the extract during seven days, being sacrificed after this time, and the tumours were dissected and weighed. In the osmotic fragility, blood samples from Wistar rats were incubated with the R. communis extract and solutions of NaCl (0.4; 0.7; 0.9%). In the labeling of red blood cells (in vitro), blood samples were obtained from Wistar rats and incubated with different concentrations with of R. communis, for control group was used NaCl 0.9% and added stannous chloride (SnCl2) and Tc-99m. The plasma fractions (P) and the cells (C) were separated and, also, precipitated with trichloroacetic acid at 5% obtaining the soluble (SF) and insoluble fractions (IF), being analyzed also the cells morphology. The radioactivity rate (%ATI) of each fraction was calculated. In the biodistribution was realized the tumour implant in both groups treated with R. communis and the control group with salt solution 0.9% administrated IP, in single dose for 7 days, the animals were sacrificed in the 8th day, 20 minutes after the administration of Tc-99m. The organs were isolated and the radioactivity rate (%ATI) of each organ was calculated; from the blood was extracted the animals serum and realized the evaluation of total proteins. The extract was labeled with sodium pertechnetate and stannous chloride, evaluating the radiochemical control. The proteic extract of R. communis showed satisfactory results in the tumor inhibition with 67% and 72% of success comparing with the control. The osmotic fragility results indicate that there was an increase in the hemolysis rate in the concentration of 0.125 mg/mL and there weren’t alterations in the labeling of red blood cells in the concentrations of 6.25% to 25% of the extract when compared with the rate of the control group, however, it was observed a decrease of 49.69% in the concentration of 100%, verifying that in these concentrations occur morphological alterations in the red blood cells and the radiation in the insoluble fractions promoted a reduction of the radioactivity. In the biodistribution, there was a decrease in the uptake of Tc-99m in most of the analyzed organs, being significant in the kidney of group 1, muscle and brain; and increased in the stomach (G2) and in the kidneys (G3); in tumour animals, this reduction was significant, mainly in the heart, lung, kidney and tumour, presenting a concentration of total proteins in the tumour animals of 34.62 and 34% in relative to the rate of the control group. Concerning the radiochemical control through the filtration cromatograph, it was observed that the extract labeled with Tc-99m presented two fractions with 130.007 and 494.592 cpm, and these fractions were analyzed by the labeling of blood cells, with the rate of ATI of 61.88 and 41.32% in the fractions 1 and 2, respectively. So, it’s concluded that the extract of R. communis has great antitumour potential, changing the uptake of Tc-99m in the in vitro and in vivo, competing with Tc-99m in the binding sites of the blood cells of pertechnetate ion, modifying this way the cells structure.

XI

Keywords: Ricinus communis L., antitumour, osmotic fragility, labeling of red blood cells, morphology cells, biodistribution.

XII

Mousinho, K. C.; Avaliação Farmacológica do Ricinus communis L. na Determinação da Atividade Antitumoral e em Estudos com Radiofármaco.

1. INTRODUÇÃO

1


1. INTRODUÇÃO

Desde a antiguidade, o ser humano utilizava as espécies vegetais para tratar as

enfermidades (ELDIN & DUNFORD, 2001). Dentre os medicamentos comercializados no

mundo cerca de 40% tiveram origem direta ou indireta de fontes naturais, sendo 78% das drogas

antibacterianas e 60% dos antitumorais (DE LA CRUZ, 2005).

A alta capacidade de diagnóstico envolvendo a medicina nuclear deve-se a grande

diversidade dos radiofármacos disponíveis no mercado (THALL & ZIESSMAN, 2003).

Desde os últimos anos, a oncologia tem sido uma área representativa para a medicina

nuclear, transformando-se em área de maior crescimento tanto para métodos de diagnósticos

(imagem tumoral) quanto para tratamento. O tecnécio-99m é um radionuclídeo muito importante

para a imagem tumoral, aprovado pela Food and Drug Administration (FDA), além de possuir

ótimas características físicas, como meia-vida de 6 horas, energia gama de 140 keV, impacto

ambiental desprezível e baixo risco radiológico para o paciente (BRAGA et al., 2000; THALL &

ZIESSMAN, 2003 HOLANDA, 2004; SOUZA et al., 2005).

Muitos estudos têm analisado os efeitos de drogas naturais ou sintéticas em possíveis

alterações na biodistribuição dos radiofármacos, bem como no processo de marcação das células

sanguíneas com Tecnécio-99m utilizando técnicas in vivo e in vitro (GOMES et al., 1998; DIRÉ

et al., 2001; CAPRILES et al., 2002).

O Ricinus communis L. possui características de alta toxicidade tanto para animais como

para células em crescimento (KOGA et al.,1979) e é largamente utilizada na indústria como

lubrificante (SOUZA et al., 1994; OLSNES, 2001; OLSNES, 2004).

Os produtos naturais e sintéticos vêm sendo muito estudados na medicina nuclear nos

últimos anos, principalmente no Brasil, pela sua grande biodiversidade, podendo interferir nos

testes experimentais alterando o comportamento farmacocinético e farmacodinâmico do

radiofármaco, modificando a resposta farmacológica, como relatado nos estudos de Maytenus

ilicifolia, Coffea beans, Thuya occidentallis, Ginkgo biloba, Tabacco, Paullinia cupana

(OLIVEIRA et al., 1997; GUTFILEN et al., 1998; OLIVEIRA et al., 2000; MORENO et al.,

2001; FALCÃO, 2003; OLIVEIRA et al., 2003; SANTOS-FILHO et al., 2004).

2


Pujatti et al.(2005) analisaram o efeito da preparação do veneno de Crotalus marcado com

Tc-99m na marcação de hemácias e constataram que houve uma atividade hemolítica indireta

quando incubados em meio contendo uma fonte exógena de lecitina.

Capriles et al. (2002) estudaram o efeito do extrato de Solanum melogena (berinjela) na

biodistribuição com Na99mTcO4, observando aumento da captação do radiofármaco no fígado dos

animais tratados com o extrato, sendo causado provavelmente pelos glicocorticóides existentes

na planta.

Assim, este trabalho visa avaliar os efeitos do extrato hidroalcoólico de Ricinus communis

em vários modelos experimentais.

3


2. REVISÃO DA LITERATURA

4


2. Revisão da Literatura

2.1. Ricinus communis (mamona, carrapateira)

Ricinus communis Linn. pertence a família das Euforbiáceas. A família Euphorbiaceae

compreende uma das maiores dicotiledônias, cerca de 290 gêneros e aproximadamente 7.500

espécies, distribuídas principalmente nas regiões tropicais (JOLY, 1975). É popularmente

conhecida como carrapateira, mamona, palma-cristo (Figura 1a); é um arbusto silvestre grande,

de proporções diversas (geralmente 2-3 m), vegeta em quase todos os países do mundo sendo

aclimatado facilmente no Brasil, principalmente no Norte-nordeste. É originária provavelmente

da África intertropical, possui caule ereto e ramos grossos, lisos; as folhas são alternadas,

grandes e serradas; flores monóicas e dispostas em grupo, numerosas, que desabrocham no

verão. Os frutos possuem cápsulas de 10-12 mm de diâmetro com elevações espiniformes e

arredondadas, as sementes são em número de três, com coloração acinzentada e brilhante, lisas,

de aspecto parecido a um carrapato, da qual é extraído o óleo de rícino (Figura 1b). As sementes

fornecem até 50% de óleo com densidade de 0,961 a 0,966, altamente tóxico, usado como

combustível, fixador de cores e lubrificante para as máquinas, nos motores de alta rotação,

especialmente aéreos, por sua resistência as baixas temperaturas da alta atmosfera. A torta ou a

fração protéica é resultante da extração do óleo e utilizada como fertilizante e inseticida. Na

medicina popular, o óleo de rícino constitui um purgativo comumente usado que contém dois

componentes nocivos, a ricina que é um óleo composto de triglicerídeo do ácido ricinoléico, é

hidrolizado em glicerol no intestino delgado pela ação das lipases, agindo primariamente no

intestino delgado, onde estimula a secreção de água e eletrólitos, aumentando a motilidade

intestinal e podendo destruir em extensão o trato intestinal (HARDMAN & LIMBIRD, 2003;

OLSNES, 2004); é também usado como vermífugo e queimaduras. O decocto das folhas é

recomendado em banhos para o tratamento de hemorróidas. A raiz é empregada no tratamento de

moléstias dos rins (FEIJÃO, 1963; JOLY, 1975; BRAGA, 1976; PIO CORRÊA, 1984; SOUZA

et al., 1994; ALZUGARAY, 1996; CRUZ, 1997).

5


Fig 1-A Ricinus communis L. Fig 1-B Sementes de R. communis L.

2.2. Antitumorais O câncer é uma doença em que existe uma multiplicação descontrolada de células anormais

e pode disseminar no organismo (RANG et al., 2000).

Atualmente as terapias genéticas, manipulação do sistema imune, inibição da angiogênese e

estimulação dos elementos hematopóieticos têm direcionado as pesquisas clínicas em cada uma

dessas áreas (HARDMAN & LIMBIRD, 2003). Há alguns anos, a descoberta de novos fármacos

derivados de produtos naturais, como os alcalóides da vinca, os taxóides, agentes semi-sintéticos,

proporcionou novos campos de investigação (HARDMAN & LIMBIRD, 2003). Estudos de

repercussão mundial mostram que o Ricinus communis possui atividade antitumoral. Segundo

Olsnes (2004) a ricina possui propriedades anticancerígenas quando testada em ratos frente ao

carcinoma de Ehrlich. Souza et al. (1994) investigou a fração protéica do R. communis e obteve

como resultado a inibição do crescimento tumoral de carcinosarcoma de Walker 256 em

camundongos.

A medicina nuclear vem investindo em pesquisas para diagnóstico e principalmente no

tratamento do câncer. Alguns tratamentos já possuem êxito, como o radionuclídeo iodo131 (131I)

para tumores específicos e gálio-67, Tálio-201, 99mTc-sestamibi, Tc-99m, anticorpos

monoclonais (THALL & ZIESSMAN, 2003).

2.3 Interação dos Produtos Naturais com Radiofármacos As drogas sintéticas e naturais podem interagir com o radionuclídeo e promover imagens

modificadas, alterando a biodisponibilidade dos radiobiocomplexos (BERNARDO-FILHO,

2005).

6


Estudos com plantas medicinais como Thuya occidentallis, Maytenus ilicifolia, Paullinia

cupana, Mentha crispa, Coffee beans, descrevem que essas plantas interferem na marcação de

células sanguíneas (OLIVEIRA et al., 1997; OLIVEIRA et al., 2000; OLIVEIRA et al., 2002;

OLIVEIRA, 2003; SANTOS-FILHO, 2004). A literatura descreve ainda que a toxina purificada

do R. communis foi testada no sangue e observou-se que ela induzia aglutinação dos eritrócitos e

precipitação das proteínas séricas (OLSNES, 2004).

2.4. Radiofármacos

O radiofármaco é um componente radioativo usado para diagnóstico e terapêutica (SAHA,

1998). É constituído de um radionuclídeo e fármaco, sendo detectado pelas características dos

componentes, que permite a detecção externa de uma porção biologicamente ativa e responsável

pela biodistribuição (THALL & ZIESSMAN, 2003).

Inicialmente, a escolha de um radiofármaco se deve as propriedades adequadas para os

procedimentos, como ser facilmente disponível no serviço de medicina nuclear, vida média

efetivamente curta evitando uma exposição maior ao paciente que a necessária; seletividade pelo

órgão desejado, devendo ser baixa a captação nos tecidos vizinhos; possuir uma inércia

metabólica, dosimetria e de fácil preparação (SAHA, 1998; SORIANO et al., 2002; THALL &

ZIESSMAN, 2003).

Os radiofármacos marcados com tecnécio-99m são mais utilizados para fins de diagnóstico

pelas suas excelentes características: período de semi-desintegração de 6 horas, emissão de

radiação gama com 140 keV de alto rendimento por imagem, impacto ambiental desprezível

(SORIANO et al., 2002; THALL & ZIESSMAN, 2003; HOLANDA, 2004; SOUZA et al.,

2005).

2.5. Radionuclídeo

Alguns átomos são instáveis sofrendo posteriormente um decaimento radioativo, devido as

suas propriedades físicas. O resultado deste processo é denominado de radionuclídeo e está

sempre num estado de energia menor que o radioisótopo, podendo ser obtidos a partir de um

subproduto de fissão nuclear (reator), por intermédio do bombardeamento de núcleos com

7


nêutrons, geradores, o uso de aceleradores de partículas-ciclotron (OWUWANNE et al., 1995;

THALL & ZIESSMAN, 2003).

Os geradores de radionuclídeos apresentam vantagens por sua praticidade de fácil

transporte e manuseio, podendo ser encontrado em clínicas e hospitais (SAHA, 1998).

Vários sistemas de geradores foram aperfeiçoados nos últimos anos (Tabela 1), sendo o

gerador de Molibdênio-99/Tecnécio-99m (Figura 2) o mais importante para a prática clínica.

Tabela 1-Sistema de geradores de radionuclídeos, adaptado de THRALL & ZIESSMAN, 2003.

Sistema de geradores de radionuclídeos, com meia-vida do pai e do filho

Radionuclídeo (pai) Meia-vida Radionuclídeo (filho) Meia-vida

Molibdênio-99 66 horas Tecnécio-99m 6 horas

Rubídio-81 4,5 horas Criptônio-81m 13 segundos

Estrôncio-82 25 dias Rubídio-82 1,3 horas

Estanho-113 115 dias Índio-113m 1,7 horas

Telúrio-132 3,2 dias Iodo-132 2,3 horas

8


Figura 2- Esquema simplificado de um gerador de Molibdênio-99/Tecnécio-99m.

O molibdênio-99 (99Mo) pode ser obtido em um reator por fissão nuclear do 235U, é eluído

em estruturas de alumina (Al2O3), acondicionado em coluna de vidro ou plástico; sendo a coluna

protegida por chumbo (SAHA, 1998).

2.6. Tecnécio-99m (99mTc)

O tecnécio é um metal de transição da tabela periódica e possui 7 elétrons na última

camada. Na perda dos elétrons o tecnécio passa para o estado oxidado +7, onde se obtém o íon

pertecnetato (TcO-4) (OLIVEIRA-JÚNIOR, 2003). É um dos radioisótopos mais utilizados na

medicina nuclear, com cerca de 85% das rotinas de procedimento de radiodiagnóstico, por suas

características que constitui em meia-vida curta de 6 horas, fácil disponibilidade em geradores de

Molibdênio-99/Tecnécio-99m (99Mo/99mTc), baixa dose de radiação para o paciente comparado

com os outros radionuclídeos; pequena energia gama de 140 keV, com rendimento de 90%,

facilidade de se ligar às hemácias sanguíneas, marcação de espécies biológicas e estruturas

celulares, baixo custo e impacto ambiental desprezível (HLADIK III et al., 1987; BERNARDO-

FILHO et al., 1992; EARLY & SODEE, 1995; BRITO et al. 1998; SAHA, 1998; SORIANO et

al., 2002; ; THALL & ZIESSMAN, 2003; HOLANDA, 2004; SOUZA et al., 2005).

O tecnécio na sua forma quimicamente ativa de pertecnetato de sódio (99mTcO4Na) na

forma +7 precisa sofrer pequena redução com auxílio de um agente redutor, o cloreto estanoso

9


(SnCl2), por não se ligar a nenhuma estrutura celular ou molecular através de ligação direta

(SRIVASTAVA, 1987; BERNARDO-FILHO et al., 1992; SAHA, 1998).

2.7. Marcação de Hemácias e Proteínas Plasmáticas com 99mTc

As hemácias têm formato discóide, flexível e fazem o transporte de oxigênio para os

tecidos do corpo. Origina-se das células-tronco da medula óssea durante o processo de maturação

e perdem os núcleos antes de caírem na circulação. A composição da membrana que reveste a

hemácia é de 49% de proteínas, 44% de lipídeos e 7% de carboidratos, é semipermeável,

permitindo a passagem de água e eletrólitos (SMITH, 1985; COMARCK, 1991; LORENZI &

WENDEL NETO, 2005).

A marcação de células sangüíneas envolve um pré-tratamento do tecnécio (pertecnetato de

sódio) com o cloreto estanoso (SnCl2), que é o agente redutor mais utilizado nos sistemas

biológicos, principalmente para a redução do pertecnetato de sódio (BRAGA et al., 2000;

OLIVEIRA-JÚNIOR, 2003), no qual é reduzido se ligando intracelularmente na cadeia beta da

hemoglobina (SRIVASTAVA, 1987). A marcação de hemácias é favorecida por vários fatores:

por constituírem os elementos sanguíneos em maior quantidade; são estruturas que pode ser

facilmente manipuladas, tanto química quanto fisicamente sem sofrerem alterações

consideráveis; são mais numerosas; sobrepõem-se às outras células na marcação com

radionuclídeos por intermediarem mecanismos de transporte celulares e pela hemoglobina ser o

constituinte principal, com sítio ativo de ligações metálicas (BRAGA et al., 2000).

O pertecnetato de sódio liga-se 70-80% das proteínas plasmáticas quando administrado por

via endovenosa. A meia-vida plasmática é de 30 minutos que corresponde a 30% da dose

administrada, com eliminação nas primeiras 24 horas (HLADIK III; SAHA; STUDY, 1987). O

íon pertecnetato no compartimento interno da hemácia é reduzido pelo cloreto estanoso, ao se

ligar à hemoglobina, utilizando o sistema de troca de ânions que é executado pela banda 3

proteína integral, abundante na membrana das hemácias, e é constituída por dupla cadeia

polipeptídica, com domínio extracelular, intracelular e transmembrana. O transporte do íon

estanoso, essencial para a marcação do 99mTc dentro da molécula de hemoglobina, utiliza os

canais de cálcio ou semelhantes a este (CALLAHAN & RABITO, 1990; SAMPSON, 1996;

DANTAS et al., 2005).

10


Bernardo-Filho et al. (1992) observaram que drogas bloqueadoras dos canais de cálcio

(nifedipina) exercem influência na passagem do cloreto estanoso para o interior da célula,

competindo pelo mesmo caminho para a entrada na hemácia, através dos canais de cálcio.

Nas proteínas plasmáticas, compostas principalmente por fibrinogênio, globulinas e

albumina, representando quase 60% das proteínas. A ligação que ocorre entre o radiofármaco e

as proteínas plasmáticas poderá influenciar na distribuição no organismo, na taxa de difusão para

o compartimento vascular e na eliminação da substância (RIPOLLHAMER et al., 1995).

Para quantificar a radioatividade ligada às células sangüíneas e as proteínas plasmáticas,

deve-se fazer o mesmo tratamento com o agente precipitante (ácido tricloroacético) é

responsável pela separação das frações (BERNARDO-FILHO et al., 1996).

A ligação dos radiofármacos nas células sangüíneas e órgãos alvo podem ser alteradas pela

presença de drogas naturais ou sintéticas (HESSEWOOD & LEUNG, 1994; EARLY & SODEC,

1995; SANTOS et al., 1995).

2.8. Biodistribuição

O estudo da biodistribuição é primordial para estabelecer a eficácia do uso do

radiofármaco. Este estudo inclui a absorção, distribuição, metabolismo e excreção da substância

(SORIANO et al., 2002).

A biodistribuição normal pode ser modificada por interação medicamentosa, que poderá

alterar a interpretação das imagens pelos profissionais, podendo acarretar em diagnóstico errôneo

(SAHA, 1998).

Uma droga terapêutica pode modificar a natureza do fármaco, o meio bioquímico ao qual o

radiofármaco está exposto, a capacidade do radiofármaco de se ligar aos elementos sangüíneos e

até os alvos preferenciais de ligação dos radiofármacos (HLADIK III et al., 1987;

SRIVASTAVA, 1987; SAMPSON, 1996). Encontra-se na literatura vários relatos de interações

de fármacos na biodistribuição, como a vincristina (BRITTO et al., 1998).

Atualmente a medicina nuclear vem investindo em pesquisas em torno do tratamento,

principalmente do câncer. Estudos com marcadores de anticorpos monoclonais; o uso do iodo-

11


131 para câncer de tireóide e outros radiofármacos que podem ser naturais ou sintéticos vêm

incentivando pesquisadores em todo o mundo a descobrir substâncias promissoras, que possam

ser marcadas pelos radionuclídeos e com atuação no órgão alvo, melhorando a resposta

terapêutica e diminuindo a ocorrência de toxicidade para o paciente.

12


3. OBJETIVOS

13


3. OBJETIVOS

3.1. Geral Este trabalho visa avaliar a influência do extrato protéico de Ricinus communis L. na

atividade antitumoral frente ao Sarcoma 180, fragilidade osmótica e analisar a marcação dos

elementos sanguíneos com tecnécio-99m na presença do extrato, verificando sua ação na

morfologia das células. Como também, verificar a biodistribuição do Tc-99m na presença de

extrato in vivo em camundongos sadios e com indução tumoral, analisando a concentração das

proteínas totais e promover a marcação do extrato com Tc-99m, avaliar a marcação através do

controle radioquímico.

3.2. Específicos

• Isolar o extrato protéico do Ricinus communis L. através da extração hidroalcoólica e o

óleo de rícinus retirado com acetona e concentrado a vácuo;

• Avaliar a atividade antitumoral, frente ao Sarcoma 180 em camundongos;

• Verificar o efeito do extrato protéico do Ricinus communis na fragilidade osmótica;

• Promover a marcação dos elementos sanguíneos com Tc-99m;

• Verificar a interação do extrato na morfologia das hemácias;

• In vivo, avaliar a influência do Ricinus communis na biodistribuição marcados com Tc-

99m em camundongos normais e com indução tumoral (Sarcoma 180);

• Determinar a concentração de Proteínas Totais em animais tumorais na presença do

extrato;

• Realizar o controle radioquímico do extrato protéico de Ricinus communis, promovendo

a marcação do extrato com Tc-99m.

14


4. ARTIGO I Artigo a ser submetido à Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas

15


Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences Vol. 00, n. 0, 00/00., 0000 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL DA FRAÇÃO NÃO-

OLEOSA DO RICINUS COMMUNIS L. EM SARCOMA 180

Kristiana Cerqueira Mousinho1*, Elisangela Christhianne Barbosa da Silva1, Aldo César Passilongo da

Silva1, Laurimar Thomé da Rocha1, Jovita Maria de Farias Braga 1, Ivone Antônia de Souza2, Maria

Teresa Jansem de Almeida Catanho3. 1Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal Pernambuco – UFPE; 2Departamento

de Antibióticos – UFPE; 3Departamento de Biofísica e Radiobiologia – UFPE.

*[email protected]

Resumo

Ricinus communis L., é popularmente conhecida como carrapateira, mamona, pertence à família das

Euforbiáceas. Possui folhas grandes e longo-pecioladas, seu fruto apresenta cápsula com elevações

espiniformes, com sementes em número de três, das quais é extraído o óleo de rícino. É originária

provavelmente da África, mas encontrada também no Brasil, sobretudo no Norte-Nordeste. Este estudo

visa avaliar a atividade antitumoral da fração protéica do extrato de R. communis no Sarcoma 180. Após

48 horas do implante da massa tumoral os camundongos machos albinos Swiss (mus musculus), foram

tratados com solução salina 0,9% para o controle, 2,5 mg/kg de ciclofosfamida para o padrão e extrato

hidroetanólico de R. communis (2,0 mg/kg e 3,0 mg/kg) via intraperitonial, durante 7 dias, sendo

sacrificados os animais no 8° dia e os tumores dissecados e pesados. Os resultados indicaram que o

extrato utilizado apresentou resposta antitumoral expressiva (67% e 72%) em comparação com os grupos

padrão (62%) e controle, comprovando a atividade antitumoral da substância e perfazendo-se a idéia de

mais uma substância promissora para o tratamento do câncer.

Unitermos: Ricinus communis L., tumor maligno, atividade antineoplásica, Sarcoma 180. *

Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas

* Autor para correspondência

16


Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences Vol. 00, n. 0, 00/00., 0000

INTRODUÇÃO

Ricinus communis L., é popularmente conhecida como carrapateira, mamona, palma de

Cristo, pertence à família das Euforbiáceas, originária provavelmente da África, mas encontrada

em quase todas as partes do mundo, também no Brasil, sobretudo no Norte-Nordeste, São Paulo,

Minas Gerais e Rio de Janeiro (CORRÊA, 1984; ALZUGARAY, 1996; FETROV & ÁVILA,

2000; OLSNES, 2004). Possui folhas grandes e longo-pecioladas, seu fruto apresenta cápsula

com elevações espiniformes, com sementes em número de três, das quais é extraído o óleo de

rícino (FEIJÃO, 1963; CORRÊA, 1984). A torta ou fração não oleosa, que é resultante da

expressão do óleo, contém proteína tóxica (ricina) que é muito utilizada como adubo orgânico,

contendo 50% de nitrogênio, 1% de fósforo e 1% de potássio (SOUZA et al., 1994). É uma

planta que possui alta toxicidade tanto para animais como para células em crescimento (KOGA

et al., 1979). Além de sua comprovada ação antineoplásica in vitro e in vivo através de estudos

de repercussão mundial, o Ricinus communis é utilizado também como laxante, pois aumenta o

peristaltismo ao estimular o plexo nervoso intramural da musculatura do intestino delgado

(FEIJÃO, 1963; FODSTAD et al., 1979; SOUZA et al., 1994; FETROV & ÁVILA, 2000;

ZHAN & ZHOU, 2003).

O uso dos produtos naturais vem aumentando cada vez mais no mundo desde últimas

décadas, além do que, são importantes fontes de pesquisa para os farmacêuticos (STEPP, 2004;

SOUZA et al., 2005). A ricina é uma proteína muito tóxica que compromete a síntese de DNA e

o metabolismo das proteínas, resultando em morte celular (FETROV & ÁVILA, 2000).

Nos últimos anos a descoberta de produtos naturais como agentes anti-proliferativos tem

proporcionado novos campos de investigação nesta área. A Vincristina é um exemplo de

substância antineoplásica derivada de planta como a Vinca rosea, amplamente utilizada no

tratamento quimioterápico, que atua em protocolos para tumores como os linfomas, leucemias,

mama, ovário. Outros derivados de compostos naturais também fazem parte dos tratamentos

convencionais, como os taxanos, antibióticos, enzimas, epipodofilotoxinas, campotecinas e

modificadores da resposta biológica (RANG et al., 2000; HARDMAN & LIMBIRD, 2003,

ALMEIDA, 2004).

17


Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences Vol. 00, n. 0, 00/00., 0000

Este estudo tem como objetivo avaliar a atividade antitumoral da fração protéica do Ricinus

communis L. em Sarcoma 180.

MATERIAIS E MÉTODOS

Animais

Os camundongos machos albinos Swiss (mus musculus), com 45 dias de nascidos,

pesando entre 25-35 g, foram adquiridos no Biotério Aggeu Magalhães (Fiocruz), Brasil. Os

animais foram abrigados em gaiolas de plástico individual com estante e ventilação interna,

temperatura e umidade controlada, ciclo claro-escuro de 12 horas, de acordo com as normas

internacionais do Conselho do Laboratório de Animais Experimentais (ICLAS). O ensaio foi

aprovado pelo Comitê de Ética Experimental da Universidade Federal de Pernambuco de acordo

com o processo número 011553/2005.

Coleta do vegetal e extração

Ricinus communis L. foi coletado no bairro de Pau Amarelo, cidade de Paulista em

Pernambuco, Brasil, identificado por Dra. Marlene Barbosa e a espécie registrada no Herbário

Geraldo Mariz, com número 52.116, da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE, Brasil). O

material botânico foi obtido da trituração e extraído em solução hidroetanólica 8:2 (v/v), e para a

retirada do óleo de rícino foi acrescentado acetona e concentrado a vácuo, obtendo a fração

protéica. O extrato foi preparado e utilizado no período de 12 meses.

Parte experimental

Os ensaios de atividade antitumoral foram realizados de acordo com a metodologia

descrita por Stock et al. (1965). Foram utilizados camundongos, machos, albinos Swiss (mus

musculus) com implantação do tumor Sarcoma 180.

18



Implante da Massa Tumoral

Para a realização da atividade antitumoral do Ricinus communis foi utilizado 5

camundongos machos por grupo, totalizando 4 grupos. O implante da massa tumoral foi

realizado através do transplante do Sarcoma 180 de um animal doador, após remoção do material

que foi fragmentado e colocado em solução antibiótica (80 mg de Garamicina). Um fragmento

tumoral com cerca de 3mm de diâmetro, equivalente a massa, foi introduzido por via subcutânea,

na região axilar do animal receptor, segundo a técnica descrita por Stock et al.(1965) e

Funayama e Komaiyama (1993).

Tratamento

A quimioterapia experimental teve início 48 horas após o implante dos tumores. O

extrato hidroalcoólico (8:2 v/v) de Ricinus communis foi diluído em solução salina 0,9%, Tween

80 a 0,2% (Falcão, 2003) e administrada por via intraperitoneal durante 7 dias em doses diárias

de: 2,0 e 3,0 mg/kg para o grupo tratado. Para o grupo controle os animais foram tratados com

solução salina 0,9% e 2,5 mg/kg para a droga com atividade antitumoral conhecida,

ciclofosfamida, utilizada como padrão positivo. Os animais foram sacrificados através de

deslocamento cervical, no oitavo dia e os tumores foram retirados, dissecados, pesados e em

seguida calculada a diferença entre os grupos tratados e controle para o índice de inibição

tumoral usando a fórmula (Machon et al., 1981):

TWI%= C-T x 100

C

Onde:

TWI%= % de inibição tumoral

C= Média dos pesos dos tumores dos animais do grupo controle

T= Média dos pesos dos tumores dos animais do grupo teste.

19


Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences Vol. 00, n. 0, 00/00., 0000 Análise estatística

Para o teste estatístico foi utilizado T-Student, média ± desvio padrão, com p≤0,05.

RESULTADOS

A Tabela 1 apresenta a taxa de inibição tumoral do Sarcoma 180, sendo observado o

valor dos pesos tumorais, a percentagem de inibição tumoral, onde foi verificado que a

substância padrão (ciclofosfamida) e as concentrações do extrato de R. communis de 2,0 e 3,0

mg/kg tiveram pesos proporcionais quando comparado com o grupo controle. Através dos

cálculos de percentagem de inibição tumoral foi verificado que o extrato de R. communis nos

valores de 67% e 72% respectivamente, em comparação com o padrão (62%) teve resultado

expressivo frente a atividade inibitória sobre o crescimento tumoral.

TABELA 1- Efeito do R. communis na avaliação de inibição tumoral. Os resultados são expressos em

média ± desvio padrão com Teste-T, *p≤0,05.

Grupos Média de Peso do

Tumor (g)

Desvio Padrão

(±)

Teste T-Student % de Inibição

Tumoral

Controle 2,60 0,38

Padrão 2,5

mg/Kg

0,99 0,09 0,0038* 62%

2,0 mg/kg 0,87 0,24 0,0010* 67%

3,0 mg/kg 0,73 0,29 0,0006* 72%

Por outro lado, foi observado que a figura 1 apresenta a média de pesos referentes aos

tumores dos grupos tratados com o R. communis nas doses de 2,0 e 3,0 mg/kg, com 0,87g e 0,73

g respectivamente e o grupo controle apresentou peso tumoral de 2,60g, enquanto que o padrão

tratado com ciclofosfamida (2,5 mg/kg), o peso tumoral foi de 0,99g.

20



0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

controle padrão gr1 gr2

méd

ia d

os p

esos

dos

tum

ores

(g)

controlepadrãogr1gr2

*

* * *

FIGURA 1-Média dos pesos dos tumores, Sarcoma 180, para os

grupos controle, padrão e tratados (grupo 1- gr-1 e grupo 2- gr-2)

com R. communis L nas doses de 2,0 e 3,0 mg/kg, respectivamente.

Os resultados são expressos em média ± desvio padrão com Teste-

T, *p≤0,05.

Em relação à figura 2, foi observado que a percentagem de inibição tumoral, em que 2,5 mg/kg

de ciclofosfamida (padrão) ficou com 62% de inibição, a dose de 2,0 mg/kg de R. communis teve

resposta de 67% e na dose de 3,0 mg/kg do extrato a resposta foi de 72% de inibição

respectivamente.

0102030405060708090

100

padrão gr1 gr2

% d

e In

ibiç

ão T

umor

al

padrãogr1gr2

FIGURA 2- Percentagem de inibição tumoral, Sarcoma 180,

para os grupos controle, padrão e tratados (gr-1 e gr-2) com R.

communis L nas doses de 2,0 e 3,0 mg/kg, respectivamente.

21



Com relação à massa tumoral, a figura 3 mostra a imagem dos tumores dissecados após sacrifício

dos animais do grupo controle que receberam solução salina 0,9% e o grupo padrão tratado com

2,5 mg/kg de ciclofosfamida, onde se observa a inibição do crescimento tumoral para os animais

tratados com a substância padrão.

FIGURA 3- Comparação entre o grupo de camundongos

machos com Sarcoma 180, no controle, tratados com solução

salina 0,9% e o grupo padrão, tratado com ciclofosfamida na

dose de 2,5 mg/kg.

Na figura 4, os animais tratados com 2,0 mg/kg de R. communis em relação ao controle,

mostra uma redução tumoral relevante.

FIGURA 4- Comparação entre o grupo de camundongos machos

com Sarcoma 180, no controle, tratados com solução salina 0,9% e

o grupo tratado com R. communis na dose de 2,0 mg/kg.

22



Enquanto que, na figura 5 foi observado uma inibição tumoral maior, no grupo 2 tratado

com R. communis na dose de 3,0 mg/kg do que no grupo 1 tratado com 2,0 mg/kg e em relação a

ciclofosfamida, substância padrão.

FIGURA 5- Comparação entre o grupo de camundongos machos

com Sarcoma 180 e no controle tratados com solução salina 0,9% e

o grupo tratado com R. communis com dose de 3,0 mg/kg.

DISCUSSÃO

A substância extraída da fração protéica do R. communis apresentou ação inibitória para

Sarcoma 180, nas duas concentrações (2,0 e 3,0 mg/kg) em comparação ao grupo controle e

padrão por via intraperitoneal, considerada estatisticamente significativa, com p≤0,05. O Ricinus

communis L. por sua atividade tóxica tem sido muito estudada como inibidor tumoral por

diversos pesquisadores do mundo (FODSTAD et al., 1979; SOUZA et al., 1994; OLSNES &

KOZLOV, 2001).

De acordo com os resultados apresentados foi evidenciado que o extrato hidroalcoólico

de Ricinus communis L. possui atividade antitumoral equivalente à substância padrão

(ciclofosfamida). Atualmente os protocolos clínicos usam a ciclofosfamida para tratamento de

sarcomas em humanos.

23



Por não existirem substâncias antineoplásicas que sejam especificas para as células

tumorais, pois geram muitas reações adversas e toxicidade, as pesquisas com produtos naturais

estão direcionadas para substâncias com características tóxicas (ALMEIDA, 2004).

O número cada vez maior de pesquisas acerca de substâncias antitumorais vem

demonstrando a necessidade de tratamentos mais completos no mercado terapêutico. Os produtos

naturais estão sendo os maiores alvos mundiais das pesquisas científicas (SOUZA et al., 2005).

Segundo Sutherland et al. (1990), para uma substância ser considerada ativa, deve

promover uma inibição do crescimento celular acima de 50% em relação ao grupo controle. Em

face ao exposto, os resultados apresentados ratificaram uma redução tumoral de 67 e 72 % com

relação à dose estabelecida. Sendo observado que a percentagem de inibição tumoral aumentou

de acordo com a quantidade do extrato aplicado.

Os nossos resultados estão de acordo com outras investigações desenvolvidas com

plantas medicinais, como Vellozia pusilla P. e Ocimum campechianim M. (SOUZA, 2004;

DANTAS et al., 2005), e análogos pirimidínicos 4-amino-2,6-diarilpirimidinas-5-carbonitrilas,

onde se obteve 77,47% para carcinoma de Ehrlich e 91,21% para Sarcoma 180 (FALCÃO,

2003).

O desafio da medicina está focado na descoberta de novos agentes que possam contribuir

para o tratamento e melhoria na qualidade de vida do paciente oncológico. O Ricinus communis

mostrou-se ativo para tumores malignos, tornando-se mais uma substância com alta

potencialidade e promissora, o que abre novas perspectivas para a terapêutica do câncer.

ABSTRACT

Ricinus communis L., is popularly known as carrapateira, castor oil plant, belongs to the

Euforbiaceae family. It has large leaves and its fruits present thorny capsules, with seeds in

number of three, where the ricin oil is extracted. It’s probably originated from Africa, but also

24


Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas Brazilian Journal of Pharm l Sciences aceuticaVol. 00, n. 0, 00/00., 0000

found in Brazil, above all in North and Northeast regions. This study aims to evaluate the

antitumour activity of the proteic fraction of the extract of R. communis in Sarcoma 180. After 48

hours of the tumour implant the albin Swiss male mices (mus musculus), were treated with salt

soluction 0.9% to the control group, 2.5 mg/kg of cyclosphosphamide to the standard group, and

hydroalcoholic extract of R. communis (2.0 mg/kg and 3.0 mg/kg) I.P., during 7 days, being

sacrificed in the 8th day and the tumours were dissected and weighed. The results indicated that

the extract used obtained expressive antitumour answers (67% and 72%) in comparison with the

standard group (62%) and control group, proving the antitumour activity of the substance and

completing the idea of one more promising substance in the treatment of cancer.

keywords: Ricinus communis L., malign tumour, antineoplasic activity, Sarcoma 180.

AGRADECIMENTOS

A Vitor Ferreira pela formatação do artigo.

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5. ARTIGO II Artigo submetido à Brazilian Archives of Biology and Technology

29


Efeitos do extrato de Ricinus communis L. na fragilidade

osmótica, marcação de hemácias com Tecnécio-99m e

morfologia das células.

Kristiana Cerqueira Mousinho1*, Marília Bezerra Libório Correia1, Jailson Oliveira da Silva1, Simey de

Souza Leão Pereira Magnata1, Ivone Antônia de Souza2 e Maria Teresa Jansem de Almeida Catanho1. 1 Departamento de Biofísica e Radiobioloia; 2 Departamento de Antibióticos;Universidade Federal de Pernambuco-

UFPE, Av. Prof. Morais Rego, 1236, Cidade Universitária – Recife/PE– [email protected], Brasil.

ABSTRACT

This article presents studies involving the influence of the proteic extract of R. Communis, with strong

antitumor activity in the osmotic fragility, where blood samples of rats Wistar were incubated with

concentrations of R. Communis and with solutions of NaCl (0.4; 0.7; 0.9%), in the labeling of the blood

elements, where the rats blood was treated with a solution of Tc-99m and TCA at 5%, determining the

rate of radioactivity (%ATI) in the plasma (P)and in the red blood cells (RBC). The soluble and insoluble

fractions of the plasma were also evaluated, as also the morphology cells. The results indicate that the

rate of hemolysis increased in the presence of 0.125 mg/mL of the extract, there was a decay of 49.69% in

the rate of ATI in the insoluble fraction of the cells, occurring morphologic alterations of the blood cells.

These results suggest that the extract changes the capacity of ligation of the red blood cells due to the

stannous ion oxidation, modifying the cells structure.

Key words: Ricinus communis, labeling of red blood cells, osmotic fragility, Technetium-99m,

morphology cells.

INTRODUÇÃO

Ricinus communis L. é uma Euforbiaceae com folhas grandes, palmadas e frutos muito típico

de onde é extraído o “óleo de rícino”, usado na medicina como laxativo ou purgativo e as outras

utilidades do óleo é na indústria como lubrificante (Feijão, 1963; Corrêa, 1984; Souza et al.,

1994; Olsnes, 2004).

* Autor para correspondência

30


É uma planta que possui alta toxicidade tanto para animais como para células em crescimento

(Koga et al., 1979), além de sua comprovada ação antineoplásica através de estudos de

repercussão mundial (Feijão, 1963; Fodstad et al., 1979; Souza et al., 1992; Zhou et al., 2003).

Em particular, o extrato também é muito usado no tratamento do câncer terminal na medicina

alternativa. O uso dos produtos naturais vem aumentando cada vez mais no mundo desde últimas

décadas (Olsnes et al., 2001; Souza, 2005).

A fragilidade osmótica visa avaliar a influência do extrato na membrana plasmática das

células vermelhas do sangue de forma qualitativa.

A marcação dos eritrócitos com o tecnécio-99m vem sendo muito estudada. O tecnécio é o

radionuclídeo mais utilizado em pesquisas diagnósticas na medicina nuclear, por possuir

características físicas aceitáveis, meia-vida plasmática de 6 horas e impacto ambiental

desprezível. É usado basicamente no estudo da influência das drogas naturais ou sintéticas na

marcação de células sanguíneas (H) e proteínas plasmáticas (P) em todo o mundo (Braga et al.,

2000; Oliveira et al., 2000; Holanda, 2004; Dantas et al., 2005; Souza et al., 2005)

Neste estudo, foi avaliado o efeito de diferentes concentrações da fração não oleosa do

Ricinus communis na fragilidade osmótica, marcação de células vermelhas do sangue e proteínas

plasmáticas com o tecnécio-99m e na morfologia das hemácias.


Coleta da planta

Ricinus communis foi coletado no bairro de Pau Amarelo, cidade de Paulista-

Pernambuco, e identificado por Dra. Marlene Barbosa e a espécie está localizada no herbário

Geraldo Mariz, com o número 52.116, da Universidade Federal de Pernambuco- Brasil.

Preparação do extrato

O extrato foi preparado através da trituração das sementes e extraído em solução

hidroalcoólica 8:2 v/v. Para retirada do óleo foi feito uma partição com acetona e concentrado a

vácuo, obtendo a fração protéica.

31


A diluição do extrato para a realização dos experimentos foi realizada com Tween 80

0,2% (Falcão, 2003) e solução salina 0,9%.

Fragilidade Osmótica

Foi retirado amostras de sangue venoso na presença de heparina, sendo incubado 0,5

mL de sangue com 0,5 mL do extrato protéico de R. communis em diferentes concentrações

(0,125 mg, 0,0625 mg, 0,0312 mg) por 1 hora à temperatura ambiente. O controle foi incubado

com 0,5 mL de solução salina 0,9%. Após o período de incubação as amostras foram lavadas 3

vezes com NaCl 0,9% para remover o excesso de extrato. As células do sangue foram

resuspendidas em NaCl 0,9%. A fragilidade osmótica das células vermelhas do sangue foi

realizada de acordo com o método de Dacie (1984), modificado. As hemácias foram submetidas

as diferentes concentrações de NaCl (0,4%; 0,7%; 0,9%). Amostras de hemácias (50 µL) tratadas

com R. communis foram adicionadas em tubos com 5 mL dessas soluções de NaCl. Após 1 hora,

à temperatura ambiente, esses tubos foram submetidos à centrífuga clínica (centrifugador

EXCEL SA2; Fanem Ltda) a 2000 rpm por 5 minutos. Os sobrenadantes foram isolados e foi

determinada a densidade óptica (DO) no espectrofotômetro (modelo UV-Vis 634-5; Varian) em

545 nm. O teste foi realizado em triplicata. Após a determinação da fragilidade osmótica foi

realizada a curva de fragilidade em função do percentual.

Marcação dos elementos sanguíneos

Amostras de 0,5 mL de sangue de rato Wistar foram incubadas com heparina à

temperatura ambiente, por uma hora, com 100µL de Ricinus communis, nas concentrações pré-

determinadas, sendo realizada em triplicata para cada concentração que correspondem de

0,0039-0,0625 mg, contendo o controle solução salina 0,9%. Em seguida adicionou-se 0,5 mL de

solução de cloreto estanoso (SnCl2) contendo 1,2 µL/mL à temperatura ambiente. Após mais

uma hora de incubação, foram adicionados 0,1 mL de Tc-99m (3,7 MBq) na forma de

pertecnetato de sódio (Na99m TcO4), sendo incubada por mais 10 minutos. As amostras foram

centrifugadas (centrifugador Excelsa 2; Fanem Ltda) à 1500 rpm durante 5 minutos, para separar

as frações contendo plasma (P) e células (C), respectivamente. Alíquotas de 20 µL de plasma e

células foram utilizadas para a contagem de radioatividade, e a %ATI calculada. Alíquotas de 20

32


µL de (P) e (C) foram precipitadas em 1 mL de ácido tricloroacético (TCA 5%), sendo

posteriormente centrifugadas (1500 rpm; 5 min.), isolando-se as frações solúvel e insolúvel do

plasma (FS-P; FI-P) e célula (FS-C; FI-C), sendo em ambas realizada a contagem de

radioatividade no contador gama (modelo DPC- Gambyt CR. Série: 95-3/1122), e

posteriormente foi calculado a %ATI.

Morfologia das células vermelhas do sangue

Para observar o efeito do extrato protéico sobre a morfologia das hemácias, foram

realizados esfregaços em lâminas de microscopia do extrato de Ricinus communis nas

concentrações 0,0625 mg/mL e 0,125 mg/mL em contato com amostras de sangue de rato

Wistar, e no grupo controle o sangue ficou em contato com solução salina à 0,9% durante uma

hora. O teste foi realizado em triplicata e as lâminas foram coradas com metanol, eosina e azul

de metileno (Kit Instant-Prov®). A análise das lâminas foi realizada utilizando microscópio

óptico (40X).

Análise Estatística

Os resultados foram analisados pelo teste T-Student. As diferenças foram consideradas

significativas nos valores em que p≤0,05.

RESULTADOS

Fragilidade Osmótica das hemácias dos ratos com Ricinus communis.

A figura 1 mostra a curva de fragilidade osmótica obtida após o tratamento de amostras

sanguíneas de um rato com diferentes concentrações de Ricinus communis (0,125 mg/mL;

0,0625 mg/mL; 0,0312 mg/mL). A análise dos resultados indica que houve uma diminuição

significativa, com p<0,05, no percentual de hemólises (%H) nas concentrações de 0,062 mg/mL

e 0,031 mg/mL do extrato em comparação ao controle nas três concentrações de NaCl (0,4; 0,7 e

0,9%). Em meio hipotônico (até 0,4% NaCl) foi observado um aumento desse percentual na

33


concentração de 0,125 mg/mL do extrato, enquanto que em meio isotônico (0,7 e 0,9% NaCl)

houve uma discreta diminuição da %H e posteriormente uma estabilidade da taxa de hemólise.

0

50

100

150

0.0 0.4 0.7 0.9

NaCl (%)

(%) H

emól

ise Control

0,125 mg/mL0,062 mg/mL0,031 mg/mL

Fig.1 – Diagrama de fragilidade osmótica das hemácias

dos ratos (H) após tratamento com diferentes

concentrações de Ricinus communis L. Os valores das

médias são representativos de três experimentos similares.

Marcação de hemácias com Tecnécio-99m.

A Figura 2 mostra a distribuição da radioatividade nas hemácias (H) e plasma (P) do

sangue, tratado com solução de diferentes concentrações de Ricinus communis. A análise dos

resultados indica que existe uma diminuição significativa (p<0,05) da radioatividade nas frações

25% (84,77%), 50% (64,87%), 100% (58,55%) do extrato nas células vermelhas, enquanto que

houve um aumento significativo na ligação com o plasma nas mesmas frações com 15,23%;

35,13% e 41,45%, respectivamente.

0

50

100

150

0 6,25 12,5 25 50 100 Extrato de Ricinus communis L.

(%)

% d

e lig

açã

o c

om

T

c9

9m H

PL

* ** *

Figura 2 - Efeitos do extrato de Ricinus communis na

fixação de Tc-99m no plasma e nas hemácias em água. Os

resultados são expressos em médias ± desvio padrão com

Teste-T, *p<0,05.

34


Na Figura 3 foi observado a distribuição da radioatividade nas frações solúveis (FS-H)

e insolúveis (FI-H) das células sanguíneas, tratadas com diferentes concentrações (0,0038- 0,062

mg/mL) da solução de R. communis e TCA à 5%. A análise dos resultados indica que houve uma

alteração significativa (p<0,05). Nas doses de 0% a 25%, a capacidade de ligação do Tc-99m

permanece inalterada após precipitação com TCA, no entanto foi verificado entre as

concentrações de 50% e 100% que ocorre um decréscimo de até 49,69% na presença de TCA.

Foi observado que a fração solúvel das hemácias apresentou um %ATI de 60% na capacidade de

ligação do Tc-99m nas concentrações de 6,25 a 25% do extrato, enquanto que as frações de

100% do extrato ocorreu uma redução de 25 a 30%, isso mostra que as frações insolúveis das

células promovem uma ligação específica mantendo-se inalterada quando comparado com o

gráfico da figura 2.

0

20

40

60

80

100

0 50 100 150

Extrato de Ricinus communis L. (%)

% d

e lig

ação

com

Tc-

99m

FS-H

FI-H

*

*

*

*

*

Figura 3 - Efeitos do extrato de Ricinus communis na

fixação de Tc-99m nas frações solúveis e insolúveis das

hemácias. Os resultados são expressos em médias ±

desvio padrão com Teste-T, *p<0,05.

A morfologia das hemácias foi avaliada sob microscópio óptico.

A Figura 4 mostra a preparação histológica das hemácias do grupo controle em contato

com solução fisiológica 0,9%, observando-se que as células (H) são discóides e anucleadas.

35


Figura 4 – Células do controle - Esfregaço foi preparado,

secado, fixado e corado. Após isso, a morfologia das

hemácias foi avaliada em microscópio óptico (x40).

Na Figura 5, onde mostra as hemácias que foram incubadas com R. communis 0,062 mg/mL.

Foram observadas discretas alterações morfológicas nas células, em comparação com o grupo

controle, com pouca hemólise.

Figura 5 - Na presença do extrato de Ricinus communis

L. (0,062 mg/mL), o esfregaço foi preparado, secado,

fixado e corado. Após isso, a morfologia das hemácias foi

avaliada em microscópio óptico (x40). A seta indica

alteração na morfologia celular.

A Figura 6 mostra o tratamento realizado na concentração 0,125 mg/mL do R. communis,

apresentando importantes alterações na morfologia das células com quebra da membrana celular,

fragmentação, hemólises e hemoaglutinação.

36


Figura 6 – Na presença do extrato de Ricinus communis

L. (0,125 mg/mL), o esfregaço foi preparado, secado,

fixado e corado. Após isso, a morfologia das hemácias foi

avaliada em microscópio óptico (x40). A seta indica

alteração na morfologia celular.

DISCUSSÃO

O Ricinus communis L. tem-se mostrado uma planta extremamente tóxica para animais

e células em crescimento in vitro (Koga et al., 1979; Zhou et al., 2003).

Estudos já realizados mostraram a ação de drogas sintéticas e naturais, Thuya

occidentallis, Tabacco, Maytenus ilicifolia, Paullinea cupana e Coffee beans que interferem na

marcação de células sanguíneas com 99mTc (Oliveira et al., 1997; Vidal et al., 1998; Oliveira et

al., 2000; Lima et al., 2002; Oliveira et al., 2002; Oliveira et al., 2003). O mecanismo para a

fixação do 99mTc nas células sanguíneas consiste na ligação do elemento radioativo na cadeia β

da hemoglobina (Bernardo-Filho et al., 2005).

Nossos resultados mostraram que houve aumento na taxa de hemólise na concentração

de 0,125 mg/mL e que não houve ocorrência de alterações na marcação de células vermelhas do

sangue nas concentrações de 6,25% para 25% do extrato quando comparado com o percentual do

grupo controle, entretanto, foi observado um decaimento de 49,69% na concentração de 100%,

verificando que nestas concentrações ocorrem alterações morfológicas nas células do sangue e

que a radiação nas frações insolúveis promovem a redução da radioatividade. Alguns estudos

mostram que a toxina ricina provoca aglutinação dos eritrócitos e precipitação das proteínas

séricas (Olsnes, 2004) e nossos resultados mostraram alterações morfológicas com aglutinação

37


dos eritrócitos (Fig. 6). O extrato hidroetanólico de Ricinus communis pode alterar a marcação

das hemácias e FI-H diminuindo a fixação da radioatividade nas células sanguíneas.

Os resultados deste estudo sugerem que o extrato protéico de Ricinus communis

promove efeitos tóxicos, alterando a capacidade de ligação das hemácias devido à capacidade de

oxidação do íon estanoso, inibição direta (ação quelante) referentes à competição dos íons pelos

sítios de ligação do íon pertecnetato, modificando assim as estruturas celulares.

AGRADECIMENTO

A Vitor Ferreira pela revisão do texto em inglês e formatação do artigo.

RESUMO

Este trabalho apresentou estudos envolvendo a influência do extrato protéico de R. communis L.,

com potente atividade antitumoral na fragilidade osmótica, onde amostras de sangue de rato

Wistar foram incubadas com concentrações de R. communis e com soluções de NaCl (0,4; 0,7;

0,9%), na marcação dos elementos sanguíneos. O sangue de rato foi tratado com solução de Tc-

99m e TCA à 5%, determinando o percentual de radioatividade (%ATI) no plasma (P) e nas

hemácias (H). As frações solúvel e insolúvel do plasma também foram avaliadas, como também

a morfologia das células. Os resultados indicam que a % hemólise aumentou na presença de

0,125 mg/mL do extrato, houve decréscimo de 49,69% na % ATI na fração insolúvel das células,

ocorrendo alterações morfológicas das células sangüíneas. Esses resultados sugerem que o

extrato altera a capacidade de ligação das células vermelhas devido à oxidação do íon estanoso,

modificando as estruturas celulares.

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41


6. ARTIGO III Artigo a ser submetido à Acta Biologica Hungarica

42


Biodistribuição com Tc-99m do Ricinus communis L.

Mousinho, Kristiana C.1, Correia, Marília B. L.1, Barros, A. L. S.1, Magnata, Simey S. L. P.1, Souza,

Ivone A.2 and Catanho, Maria T. J. A.1. 1 Department of Biophysics and Radiobiology; 2 Antibiotics Department; Federal University of Pernambuco-

UFPE, Av. Prof. Morais Rego, 1236, Cidade Universitária – Recife/PE, Brazil.

ABSTRACT

Ricinus communis L. belongs to the Euforbiaceae family, which from fruits is extracted the ricin oil,

highly toxical. It was analyzed the extract effect in the normal and tumour biodistribution with Tc-

99m, counting the %ATI in organs like heart, lungs, pancreas, stomach, liver, intestine, kidneys,

muscles, bones and brain, blood and tumour; in the total proteins, the extract was labeled with Tc-

99m and evaluated the radiochemical control in the labeling of red blood cells. The results showed

that in the biodistribution there was a decrease in the captivating of Tc-99m in most of the analyzed

organs, being significant in the kidneys (G1), muscles, brain and an increase in the stomach, kidneys

(G3); in tumour animals, there was a significant reduction in the heart, lungs, kidneys and tumour, in

the concentration of total proteins of 34.62 and 34% relative to the rate of the control group. In the

radiochemical control through chromatography, it was observed that the extract labeled with Tc-99m

showed two fractions with 130.007 and 494.592 cpm, analyzed by the labeling of red blood cells,

with %ATI of 61.88 and 41.32% in the fractions 1 and 2. It’s concluded that the extract of R.

communis alterates the captivating of Tc-99m in vitro and in vivo, competing with Tc-99m in the

binding sites of the red blood cells by the capacity of oxidation of the stannous ion or competition in

the binding sites of the pertechnetate ion.

Keywords: Ricinus communis L., Technetium-99m, Biodistribution, radiochemical control, labeling

of red blood cells.

INTRODUÇÃO

O Tecnécio-99m (99mTc) é o radionuclídeo mais utilizado na medicina nuclear para

procedimentos de diagnóstico com imagem funcional de diferentes órgãos e estudos

experimentais (8; 9; 19), possuindo características físicas aceitáveis: meia-vida de 6 horas,

emissão fóton gama de 140 keV, impacto ambiental desprezível e resultando em baixa

43


exposição da radiação para o paciente (4; 7; 8; 14; 19; 21; 24). O uso dos produtos naturais

nos estudos experimentais tem aumentado consideravelmente no mundo (1; 2; 4).

Ricinus communis L. pertence à família das Euforbiáceas, dos frutos típicos é extraído o

óleo de rícino, que é muito utilizado na medicina popular como laxante, purgativo e como

lubrificante na indústria (3; 5; 17; 18; 22).

Neste estudo foi avaliado o efeito da fração protéica do Ricinus communis na

biodistribuição com Tc-99m em camundongos normais e tumorais, análise das proteínas

totais, marcação das células sanguíneas com frações do extrato marcado.


ANIMAIS

Os camundongos machos albinos Swiss (mus musculus), adultos foram adquiridos no

Biotério Aggeu Magalhães (Fiocruz), Brasil. Os animais foram abrigados em gaiolas de

plástico individual com estante e ventilação interna, temperatura e umidade controlada, ciclo

claro-escuro de 12 horas, de acordo com as normas internacionais do Conselho do

Laboratório de Animais Experimentais (ICLAS). O ensaio foi aprovado pelo Comitê de Ética

Experimental da Universidade Federal de Pernambuco de acordo com o processo número

011553/2005.

COLETA DA PLANTA E EXTRAÇÃO

Ricinus communis L. foi coletado no bairro de Pau Amarelo, cidade de Paulista em

Pernambuco, Brasil, identificado por Dra. Marlene Barbosa e a espécie registrada no

Herbário Geraldo Mariz, com número 52.116, da Universidade Federal de Pernambuco

(UFPE, Brasil). O material botânico foi obtido por trituração e extraído em solução

hidroetanólica 8:2 (v/v), e para a retirada do óleo de rícino foi acrescentado acetona e

concentrado em seguida a vácuo, obtendo a fração protéica.

44


BIODISTRIBUIÇÃO

CAMUNDONGOS NORMAIS

Neste estudo foi utilizado 4 grupos com 5 camundongos em cada gaiola, sendo um grupo

controle, que recebeu solução salina 0,9%, três grupos tratados com doses diárias de Ricinus

communis de 0,1, 0,3 e 1,0 mg/kg, por via IP, durante 7 dias consecutivos. No 8° dia foi

administrado 0,1 mL de pertecnetato de sódio e cloreto estanoso com atividade radioativa

inicial de 100µCi, via IP, em cada animal, obtido pela adição de pertecnetato de sódio,

recentemente eluído de um gerador de 99Mo/99mTc produzido no Hospital das Clínicas de

Pernambuco. Após 20 minutos da administração do tecnécio-99m, os animais foram

sacrificados e isolados os seguintes órgãos: coração, pulmão, pâncreas, estômago, fígado,

intestino grosso e delgado, rins, músculo, osso e cérebro e uma amostra de sangue. Foi

realizada a contagem do percentual de atividade radioativa total injetada (%ATI) no contador

gama (modelo DPC - Gambyt CR. Série: 95-3/1122). O experimento foi realizado em

triplicata.

CAMUNDONGOS COM INDUÇÃO TUMORAL

Os ensaios de atividade antitumoral foram realizados de acordo com a metodologia

descrita por Stock (23) e Funayama e Komaiyama (6). Foram utilizados camundongos,

machos, albinos Swiss (mus musculus) com implantação do tumor Sarcoma 180.

Implante da Massa Tumoral

Para a realização da atividade antitumoral do Ricinus communis foi utilizado 5

camundongos machos por grupo. O implante da massa tumoral foi realizado através do

transplante do Sarcoma 180 de um animal doador, após remoção do material que foi

fragmentado e colocado em solução antibiótica (80 mg de Garamicina). Um fragmento

tumoral com cerca de 3mm de diâmetro foi introduzido por via subcutânea, na região axilar

do animal receptor, segundo a técnica descrita por Stock (23) e Funayama e Komaiyama (6).

45


ESTUDO DA BIODISTRIBUIÇÃO EM CAMUNDONGOS COM INDUÇÃO

TUMORAL

Após 48 horas do implante tumoral os camundongos foram tratados e subdivididos em:

controle, que recebeu solução salina 0,9% e dois grupos tratados com doses diárias de

Ricinus communis de 1,0 e 3,0 mg/kg, por via IP, durante 7 dias consecutivos. No 8° dia foi

administrado 0,1 mL de Tc-99m com atividade radioativa inicial de 100 µCi, via IP, em cada

animal, obtido pela adição de pertecnetato de sódio, recentemente eluído de um gerador de 99Mo/99mTc do Hospital das Clínicas de Pernambuco. Após 20 minutos da administração do

tecnécio-99m, os animais foram sacrificados e isolados os seguintes órgãos: coração,

pulmões, rins, músculo, tumor e amostras de sangue. Foi realizada a contagem do percentual

de atividade radioativa total injetada (%ATI) no contador gama (modelo DPC-Gambyt CR.

Série: 95-3/1122). O experimento foi realizado em triplicata. Para o índice de inibição

tumoral foi calculado através da fórmula de Machon (11):

TWI%= C-T x 100

C

Onde:

TWI%= % de inibição tumoral

C= Média dos pesos dos tumores dos animais do grupo controle

T= Média dos pesos dos tumores dos animais do grupo teste.

ANÁLISE DAS PROTEÍNAS TOTAIS

Para a análise de proteínas totais foram utilizados os soros sanguíneos das amostras dos

animais tumorais e analisados na Universidade Federal Rural de Pernambuco, com auxílio do

Kit da Katal®.

CONTROLE RADIOQUÍMICO

Para a elaboração da coluna cromatográfica de filtração, foi utilizado para a fase

estacionária de SEPHADEX G100®, sendo compactado com solução salina 0,9%. O extrato

46


de Ricinus communis foi diluído com Tween 80 0,2% e solução salina 0,9% na concentração

de 1,0 mg/mL. O extrato frio não marcado foi eluído na coluna obtendo as frações de 1mL,

coletadas em tubos de ensaio e analisados através do espectrofotômetro a 280 nm. Em

seguida foi realizado a reação de pertecnetato com cloreto estanoso por 10 minutos e

cromatografado obtendo as frações no volume de 1 mL e contado no contador gama.

Posteriormente, a concentração do extrato de 1,0 mg/mL foi incubada na presença do Tc-

99m (0,1 mL de Tc-99m e 0,9 mL do extrato), passando então pela coluna e coletada as

frações, onde foi feita a contagem da radiação. Para cada procedimento a coluna foi lavada

repetida vezes com solução salina 0,9%.

MARCAÇÃO DE HEMÁCIAS COM EXTRATO MARCADO

A marcação das hemácias foi realizada com extrato marcado após a cromatografia,

utilizando as duas frações obtidas anteriormente no controle radioquímico. O sangue foi

obtido através de punção cardíaca em rato Wistar e heparinizado, e colocado em contato com

as duas frações coletadas do extrato marcado com Tc-99m. Para o controle foi utilizado

solução salina 0,9%, incubados por 10 minutos e centrifugado os tubos para a separação do

plasma e hemácias, sendo feita à contagem da radiatividade no contador gama.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Para o teste estatístico foi utilizado T-Student, média ± desvio padrão, com p≤0,05.

RESULTADOS

Na tabela 1 encontram-se os resultados referentes à captação (%ATI) do Tc-99m nos

grupos tratados com R. communis, grupo 1 (0,1 mg/kg), grupo 2 (0,3 mg/kg), grupo 3 (1,0

mg/kg) e no grupo controle com solução salina 0,9%, 20 minutos após a injeção do Tc-99m.

A análise dos resultados mostrou um aumento significativo (p≤0,05) do %ATI do grupo 1

nos rins; grupo 2 no estômago e redução no músculo; enquanto que no grupo 3 houve

aumento na captação nos rins e cérebro. Não houve nenhuma alteração significativa do

%ATI nos demais órgãos.

INSERIR TABELA 1

47


Enquanto que na Tabela 2, encontra-se os resultados referentes à captação (%ATI) do Tc-

99m em animais com tumor induzido, com dois grupos tratados com R. communis, grupo 1

com 1,0 mg/kg, grupo 2 com 3,0 mg/kg e o grupo controle com solução salina 0,9%,

sacrificados após 20 minutos da administração do Tc-99m. A análise dos resultados mostrou

uma redução significativa (p≤0,05) do %ATI no coração, pulmão e tumor nos grupos 1 e 2

com relação ao controle, e rins no grupo 2; e aumento dessa captação nos rins do grupo 1.

Não houve nenhuma alteração significativa do %ATI no músculo nos 2 grupos.

INSERIR TABELA 2

Na concentração das proteínas totais observadas nos animais tumorais, foi verificado que

a concentração sérica protéica foi reduzida de 34,64 e 34 % nos animais tratados nas doses

1,0 e 3,0 mg/kg quando comparado ao % controle. Como pode ser observado na Figura 1.

INSERIR FIGURA 1

Na figura 2, os animais tratados com 1,0 mg/kg de R. communis (grupo 1) apresentou

29,59% de redução tumoral em relação ao controle, não sendo significativa essa dose como

antitumoral.

INSERIR FIGURA 2

Enquanto que na figura 3, os animais tratados com 3,0 mg/kg de R. communis (grupo 2)

em relação ao controle, mostra uma redução tumoral significativa de 74,55%.

INSERIR FIGURA 3

Para a análise radioquímica do extrato puro de R. communis, a figura 4 mostra as frações

obtidas pela cromatografia de filtração em gel, obtendo duas frações iniciais de 2 e 0,405 em

absorbância, leitura feita no espectrofotômetro à 280 nm, onde foi observada a expressão da

proteína tóxica nestas frações.

INSERIR FIGURA 4

48


Para a análise radioquímica do Tc-99m puro, a figura 5 mostra as frações obtidas pela

cromatografia de filtração em gel, obtendo duas frações, com maior atividade de radiação em

cpm de 1.527.880 e outra 778.043, respectivamente. A leitura foi feita no contador gama,

onde se observou a expressão do Tc-99m nestas frações.

INSERIR FIGURA 5

Na determinação da análise radioquímica do extrato marcado de R. communis com Tc-

99m, a figura 6 mostra as frações obtidas pela cromatografia de filtração em gel nas duas

frações, uma que corresponde a fração protéica e outra que corresponde a radiação do Tc-

99m isolado, com contagem de 130.007 e 494.592 cpm, respectivamente. A leitura foi

realizada no contador gama, onde se observa a expressão da proteína tóxica marcada com Tc-

99m nestas frações.

INSERIR FIGURA 6

Enquanto que a figura 7 apresenta a marcação das células sangüíneas do extrato marcado

com Tc-99m, após eluição, foi verificado que o extrato comparado as hemácias marcadas

com Tc-99m apresenta um %ATI de 61,88 e 41,32 nas frações 1 e 2, respectivamente.

INSERIR FIGURA 7

DISCUSSÃO

Diante do exposto, esse trabalho comprovou que na biodistribuição o extrato competiu

com o pertecnetato de sódio, diminuindo a captação do mesmo na maioria dos órgãos

analisados, sendo significativo para os rins (grupo 1), músculo e cérebro e aumentando a

captação nos rins (grupo 3) e estômago, havendo uma possível interação com o R. communis,

facilitando a ligação do pertecnetato de sódio. No protocolo experimental dos camundongos

com tumor induzido, foi escolhido um modelo para analisar a atividade antitumoral em doses

específicas do extrato de R. communis e verificou a %ATI nos órgãos dos camundongos

reduzindo a captação do Tc-99m quando comparado aos órgãos dos animais controle;

entretanto nas doses de 1,0 e 3,0 mg/kg, os rins apresentaram um aumento da captação do

49


Tc-99m de 1,086% com relação a primeira dose, enquanto que na segunda dose foi reduzida

a captação em 0,167%. Esses resultados mostram que o extrato de R. communis apresenta

uma interação com os sítios de ligação e modifica o processo metabólico, uma vez que nos

animais com tumores ocorreu uma redução das proteínas séricas de 34,62 e 34% com relação

ao % controle, avaliando ainda a atividade antitumoral que ficou de 29,59 e 74,55% para as

doses de 1,0 e 3,0 mg/kg, respectivamente. Este estudo mostra que comparando a

biodistribuição de camundongos normais e com tumores induzidos pode-se observar que o

grupo controle de animais com tumor apresentou um aumento do %ATI nos órgãos, como

coração e pulmão, em relação ao grupo de animais normais. Este resultado se deve a

presença do tumor nos animais. Estudos demonstraram que os tumores sólidos possuem

células hipóxicas sendo um fator limitante de tratamento pela radioterapia, incluindo a

deficiência na vascularização tumoral e na microcirculação (12). Quanto ao controle

radioquímico através da cromatografia de filtração foi observado que o extrato marcado com

Tc-99m apresentou duas frações com 130.007 e 494.592 cpm, e que estas frações foram

analisadas pela marcação das células sanguíneas, com % de ATI de 61,88 e 41,32 % nas

frações 1 e 2, respectivamente, mostrando que o extrato de R. communis compete com o Tc-

99m na ligação com as hemácias ficando mais livre no plasma.

Segundo Lugnier (10) as propriedades físicas e químicas da ricina foram estudadas em

coluna cromatográfica com SEPHADEX G100® para obtenção da massa molecular, obtendo

um valor de 51.000 à 58.000. No mesmo estudo foi feita a cromatografia de DEAE –

celulose, onde a ricina foi encontrada em duas frações. Esse resultado comprova o nosso

trabalho, onde também obtivemos duas frações e que provavelmente a proteína encontrada é

a ricina, proteína tóxica que é descrita em vários trabalhos de repercussão mundial,

mostrando propriedade altamente tóxica e farmacologicamente ativa como as atividades

antineoplásicas.

Alguns trabalhos também mostram a interferência dos produtos naturais na marcação de

células sanguíneas, reduzindo a captação do Tc-99m nas hemácias, como Thuya occidentalis

(13), Paullinia cupana (15), Coffee beans (16) e no artigo anterior a este, ainda em fase

avaliação (ANEXO 1) com o R. communis (2006). Sabe-se que a forma das células depende

da organização das proteínas presentes na membrana plasmática, portanto quando uma droga

sintética ou natural altera a morfologia de uma célula, provavelmente está alterando também

50


as estruturas protéicas, como vimos no estudo anterior, justificando ainda essa diminuição na

marcação das hemácias e aumento da expressão do radiofármaco nas proteínas plasmáticas.

Murugesan et al.(2001) descreveram o aumento da concentração de radioatividade nestes

tumores pode marcar células hipóxicas. Este trabalho pode ser um modelo de atividade

antitumoral e produção de radiofármaco para fins terapêuticos, uma vez que o extrato reduz o

tumor e promove ligação com o Tc-99m.

Em geral, o extrato protéico de Ricinus communis altera os processos de biodistribuição,

bem como a marcação das células sanguíneas com o Tc-99m. Desta forma percebe-se que

algumas drogas facilitam a localização do radiofármaco no órgão alvo, enquanto que outras

drogas dificultam (21). Vale ressaltar que como a população utiliza esta planta na medicina

popular como laxante, a administração concomitante do extrato com o Tc-99m, pode

interferir nos resultados de exames radiológicos.

AGRADECIMENTOS

À Vitor Ferreira pela imensa colaboração na formatação deste artigo.

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54


Biodistribuição com Tc-99m em camundongos machos Swiss tratados com Ricinus

communis.

Tabela 1 – Efeito do R. communis na cinética da biodistribuição do Tc-99m em 25 camundongos normais Swiss

sacrificados após 20 minutos da injeção do radiofármaco. Abreviações: DP = desvio padrão; %ATI =

percentual de radioatividade e * = p≤ 0,05.

%ATI (média±DP)

__________________________________________________________

Órgãos Grupo controle Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3

Coração 0,162 ± 0,048 0,186 ± 0,069 0,166 ± 0,015 0,160 ± 0,048

Pulmão 0,111 ± 0,072 0,072 ± 0,03 0,077 ± 0,065 0,150 ± 0,072

Pâncreas 0,727 ± 0,285 0,739 ± 0,366 0,896 ± 0,349 0,628 ± 0,285

0,21 ± 0,268 Estômago 0,488 ± 0,204* 0,344 ± 0,228 0,408 ± 0,268

Fígado 2,058 ± 1,183 1,631 ± 0,501 1,483 ± 1,077 2,138 ± 1,183

I. Grosso 0,215 ± 0,157 0,093 ± 0,095 0,196 ± 0,113 0,312 ± 0,157

I. Delgado 0,318 ± 0,209 0,183 ± 0,086 0,195 ± 0,057 0,316 ± 0,209

Rins 1,301 ± 0,524* 2,98 ± 0,964* 1,925 ± 0,964 1,604 ± 1,148

Músculo 0,263 ± 0,053* 0,465 ± 0,167 0,396 ± 0,05 0,621 ± 0,167

Osso 0,025 ± 0,011 0,031 ± 0,018 0,028 ± 0,027 0,021 ± 0,011

Cérebro 0,03 ± 0,011* 0,014 ± 0,011 0,019 ± 0,009 0,018 ± 0,008

55


Biodistribuição com Tc-99m em camundongos machos Swiss com Sarcoma 180 tratados

com Ricinus communis.

Tabela 2 – Efeito do R. communis na cinética da biodistribuição do Tc-99m em 25 camundongos com indução

tumoral Swiss sacrificados após 20 minutos da injeção do radiofármaco. Abreviações: DP = desvio padrão;

%ATI = percentual de radioatividade e * = p≤ 0,05.

%ATI (média±DP)

__________________________________________________________

Órgãos Grupo controle Grupo 1 Grupo 2

0,045 ± 0,012* 0,08 ± 0,01* Coração 0,677 ± 0,161

0,175 ± 0,037* 0,084 ± 0,011* Pulmão 0,59 ± 0,162

1,086 ± 0,224* 0,167 ± 0,026* Rins 0,703 ± 0,097

Músculo 0,304 ± 0,16 0,198 ± 0,066 0,417 ± 0,167

1,147 ± 0,267* 1,191 ± 0,327* Tumor 6,019 ± 0,924

Análise de proteínas totais em camundongos machos Swiss.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

controle gr1 gr2

prot

eina

s to

tais

(g/d

L)

controlegr1gr2

* *

Figura 1: Determinação de proteínas totais, para os grupos controle e tratados

(grupo 1 – gr-1 e grupo 2 – gr-2) com R. communis L nas doses de 1,0 e 3,0

mg/kg, respectivamente. Os resultados são expressos em média ± desvio padrão

com Teste-T, *p≤0,05.

56


Tumores (Sarcoma 180) em camundongos machos Swiss tratados com Ricinus

communis.

Figura 2: Comparação entre o grupo de camundongos machos com Sarcoma 180 e o

controle, tratados com solução salina 0,9% e o grupo tratado com R. communis na dose

de 1,0 mg/kg.

Tumores (Sarcoma 180) em camundongos machos Swiss tratados com Ricinus

communis.

Figura 3: Comparação entre o grupo de camundongos machos com Sarcoma 180 e no

controle tratados com solução salina 0,9% e o grupo tratado com R. communis com dose

de 3,0 mg/kg.

57


Frações de proteínas do extrato puro

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

0 20 40 60 80

números de tubos

dens

idad

e óp

tica

( 280

nm

)

Figura 4: Frações de proteínas do extrato puro passado

na coluna de cromatografia de filtração.

Frações do Tc-99m puro

0200000400000600000800000

10000001200000140000016000001800000

0 10 20 30 40 50 60

números de tubos

cont

agem

em

CPM

do

Tc99

m

Figura 5: Frações do Tc-99m puro passado na coluna de

cromatografia de filtração em gel.

58


Frações do extrato marcado de Ricinus communis com Tc-99m

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

0 10 20 30 40 50 60

números de tubos

Tc99

m

(cpm

)

Figura 6: Frações do extrato marcado de R. communis

com Tc-99m passado na coluna de cromatografia de

filtração.

Marcação de células sanguíneas com extrato de Ricinus communis marcado com Tc-

99m

0

20

40

60

80

100

120

controle fração1 fração 2

% d

e A

TI

hemáciasplasma

Figura 7: Frações do extrato marcado de R. communis com Tc-99m na marcação de

células sanguíneas, hemácia e plasma.

59


7. CONCLUSÃO

60


7. Conclusão

De acordo com os resultados obtidos, podemos concluir que o extrato de Ricinus

communis possui:

(i) Atividade antitumoral nas concentrações de 2,0 e 3,0 mg/kg;

(ii) A concentração de 0,125 mg/mL do extrato promoveu fragilidade osmótica;

(iii) Alteração na marcação de hemácias reduzindo sua eficiência de ligação com o

Tc-99m em 50%;

(iv) Mudança da morfologia celular com fragmentação das hemácias;

(v) Na biodistribuição, o extrato marcado com Tc-99m é mais efetivo nos rins e

estômago;

(vi) O extrato marcado apresenta maior captação do Tc-99m em células tumorais;

(vii) O extrato de Ricinus communis promoveu uma redução das proteínas séricas em

animais com tumores induzidos.

61


8. PERSPECTIVAS

62


8. Perspectivas Na oncologia, a prática da Medicina nuclear representou um avanço em diagnóstico e

tratamento nos últimos anos (THRALL & ZIESSMAN, 2003).

Há uma grande flexibilidade para direcionar radiofármacos naturais ou sintéticos para

diagnósticos específicos, até porque várias moléculas podem ser marcadas (THRALL &

ZIESSMAN, 2003).

Em face aos resultados apresentados podemos sugerir que o extrato de Ricinus

communis pode ser usado como radiofármaco e marcador de células tumorais. Como também

identificar os possíveis mecanismos de ação que envolve a redução da massa tumoral,

provavelmente em células cancerígenas sanguíneas. Entretanto o cuidado com a toxicidade

deste produto é muito importante, já que o objetivo dos alvos terapêuticos é também a

melhoria da qualidade de vida do paciente.

63


9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

64


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70


10. ANEXOS

71


10. ANEXOS ANEXO I: Artigo submetido à Brazilian Archives of Biology and Technology

EFFECTS OF THE EXTRACT OF RICINUS COMMUNIS ON THE OSMOTIC FRAGILITY,

LABELING OF RED BLOOD CELLS WITH TECHNETIUM-99M AND MORPHOLOGY CELLS. Coresponding author: Kristiana Cerqueira Mousinho E-mail address: [email protected] Federal University of Pernambuco, Department of Biophysics and Radiobiology – Phone number: +55-81-21268535 and +55-81-21268536. Av. Prof. Morais Rego, 1236, 50670-420- Cidade Universitária – Recife/PE Brazil Word Processor: Microsoft Word, version 2003 File name on disk: Effects …Fragility, by Mousinho et al.

72

mailto:[email protected]


Effects of the extract of Ricinus communis on the osmotic fragility, labeling of red blood cells with technetium-99m and morphology cells. Kristiana Cerqueira Mousinho1*, Marília Bezerra Libório Correia1, Jailson Oliveira da Silva1, Simey de Souza Leão Pereira Magnata1, Ivone Antônia de Souza2 and Maria Teresa Jansem de Almeida Catanho1. 1 Department of Biophysics and Radiobiology, Federal University of Pernambuco-UFPE, Av. Prof. Morais Rego, 1236, Cidade Universitária – Recife/PE, Brazil – [email protected]; 2 Antibiotics Department, Federal University of Pernambuco-UFPE.

ABSTRACT This article presents studies involving the influence of the proteic extract of R. Communis, with strong antitumor activity in the osmotic fragility, where blood samples of rats Wistar were incubated with concentrations of R. Communis and with solutions of NaCl (0,4; 0,7; 0,9%), in the labeling of the blood elements, where the rats blood was treated with a solution of Tc-99m and TCA at 5%, determining the rate of radioactivity (%ATI)in the plasma (P)and in the red blood cells (BC). The soluble and insoluble fractions of the plasma were also evaluated, as also the morphology cells. The results indicate that the rate of hemolysis increased in the presence of 0,125 mg/mL of the extract, there was a decay of 49,69% in the rate of ATI in the insoluble fraction of the cells, occurring morphologic alterations of the blood cells. These results suggest that the extract changes the capacity of ligation of the red blood cells due to the stannous ion oxidation, modifying the cells structure. Key words: Ricinus communis, labeling of red blood cells, osmotic fragility, Technetium-99m, morphology cells.

INTRODUCTION

Ricinus communis is a Euforbiaceae with large palm leaves, and very typitcal fruits, where the “ricin oil” is extracted, and used in the Medicine as a laxative and purgative. Other utility from this oil is in the industry as a lubricant (Corrêa, 1984; Feijão, 1963; Olsnes, 2004; Souza et al., 1992). It’s a highly toxic plant as for animals as for cells in growth (Koga et al., 1979), it has a proved antitumor action through studies with worldwide repercussion (Feijão, 1963; Fodstad et al., 1979; Souza et al., 1992; Zhou et al., 2003). In particular, the extract is also very used in the treatment of terminal cancer in the alternative Medicine. The use of natural products is increasing more and more in the world throughout the last decades (Olsnes et al., 2001; Souza, 2005). The osmotic fragility tends blood cells membrane in a qualitative way. The labeling of red blood cells with Technetium-99m

(99m TC-RBC) is being studied with frequency recently. to evaluate the influence of the extract in the red The Technetium is the most used radionuclides in scientific researches and diagnostics in the nuclear medicine, because of its acceptable physical characteristics: six hours of plasmatic half-life and despicable environment impact. It’s basically used in the study of the influences of natural or synthetic drugs in the labeling of red blood cells (RBC) and plasmatic proteins throughout the world (Braga et al., 2000; Dantas et al., 2005; Holanda, 2004; Oliveira et al., 2000; Souza et al., 2005). In this study, it was evaluated the effects of different concentrations of the non-oily fraction of Ricinus communis in the osmotic fragility, labeling of red blood cells and plasm proteins with Technetium 99m and morphology cells.

†

73


MATERIALS AND METHODS Plant Materials Ricinus communis was collected in the district of Pau Amarelo in the town of Paulista-Pernambuco, and identified by Dr. Marlene Barbosa. The species are located in the Geraldo Mariz herbarium, with the number 52.116, of the Federal University of Pernambuco-Brazil. Extract preparation The extract was prepared by triturating the seeds and extracting in a hydroalcoholic solution 8:2 v/v, and for the oil extraction it was used acetone and dried right under vacuum, obtaining the proteic fraction. The extract dilution for the realization of the experiments was done with the help of Tween 80 and salt solution 0,9%. Osmotic Fragility It was retracted venous blood samples in the presence of heparin, incubating 0,5ml of blood with 0,5ml of the extract of Ricinus communis in different concentrations (0,125 mg, 0,0625 mg, 0,0312 mg) during 1 hour at local temperature. The control group was incubated with 0,5 ml salt solution 0,9%. After the incubation period, the samples were washed 3 times with NaCl 0,9% to remove the excess of extract. The blood cells were resuspended in NaCl 0,9%. The osmotic fragility of the red blood cells was realized by the Dacie Method (1984), with some modifications. The RBC were submitted to different concentrations of NaCl (0,4%; 0,7%; 0,9%). Samples RBC (50 µL) treated with R. Communis were added in tubes with 5mL of these NaCl solutions. After 1 hour, at local temperature, these tubes were centrifuged in the clinic centrifuge (centrifuge EXCEL SA2; Fanem Ltda) at 2000 rpm for 5 minutes. The sobrenadants were isolated and the optic density (OD) was determinated in the spectrophotometer (model UV-Vis 634-5, Varian) 545 nm. The test was realized three times. After the osmotic fragility determination, were realized fragility curves in function of the percent.

Labeling of blood elements

Samples of 0,5 ml of Wistar rats blood, with heparin were incubated at local temperature, during one hour, with 100µL of Ricinus communis, in the predetermined concentrations, being realized three times for each concentration (100%-0,0625 mg, 50%-0,0312 mg, 25%-0,0156 mg, 12,5%-0,0078 mg, 6,25%- 0,0039 mg), and the control group containing salt solution 0,9%. Then it was added 0,5ml of stannous chlorite (SnCl2) containing 1,2 µL/mL, also at local temperature. After one hour of incubation, was added 0,1ml of Tc-99m (3,7 MBq) in the form of sodium pertechnetate (99mNaTcO4), incubating for more 10 minutes. The samples were centrifuged (centrifugador Excelsa 2. Fab.: Fanem Ltda) at 1500 rpm for 5 minutes, in order to separate the fractions containg plasma (P) and cells (C), respectively. Aliquots of 20 µL of plasma and cells were used for the counting of radioactivity, calculating the percentage (%ATI). Aliquots of 20 µL of P e C were precipitated in 1 mL of trichloroacetic acid (TCA 5%), being centrifuged later (1500 rpm; 5 min.), isolating the soluble and insoluble fractions of plasma (SF-P; IF-P) and cell (SF-C; IF-C). It was also done in both of them the counting of radioactivity in the gamma counter (model DPC-Gambyt CR. Série: 95-3/1122), and later it was calculated at %ATI. Morphology cells To observe the effect of the proteic extracted on the morphology cells, were realized blood smears in microscope shades of the Ricinus communis extract in the concentrations of 0,0625 mg/mL and 0,125 mg/mL in contact with blood samples of Wistar rats, and in the control group, the blood was in touch with salt solution at 0,9% during one hour. The tests were realized three times. Blood smears were prepared, dried, fixed and staining. The morphology of the red blood cells was evaluated under optical microscope (x40). Statistic Analysis The results were analyzed by the T-student test. The differences were considered significant in the values where p≤0,05.

74


RESULTS Osmotic Fragility in mice red blood cells with Ricinus communis. Figure 1 shows an osmotic fragility curve obtained after the mice’s red blood cells samples treatment with different concentrations of Ricinus communis (0,125 mg/mL; 0,0625 mg/mL; 0,0312 mg/mL). The analysis of the results indicate that there was a significant decrease, with p<0,05, in the hemolysis rate (%H) in the concentrations of 0,062 mg/mL and 0,031 mg/mL of the extract in comparison with the control group in the three concentrations of NaCl (0,4; 0,7 e 0,9%). In the hypotonic media (up to 0,4% NaCl) it’s observed an increase of this rate in the concentration of 125 mg/mL of the extract, while in the isotonic media (0,7 and 0,9% NaCl) there was a little decrease in the %H and then a stability of the hemolysis rate.

0

50

100

150

0.0 0.4 0.7 0.9

NaCl (%)

(%) H

emol

ysis Control

0,125 mg/mL0,062 mg/mL0,031 mg/mL

Fig.1 - Curve of Osmotic fragility in mice red

blood cells (RBC) after treatment with Ricinus communis L. The mean values are representative of tree similar experiments.

Labeling of Red Blood Cells with Technetium-99m. Figure 2 shows that the distribution of radioactivity in the red blood cells (RBC) and plasma (P), treated with solution of different concentrations of Ricinus communis. The analysis

of the results indicate that there is a significant decrease (p<0,05) of the radioactivity in the fractions of 25% (84.77%), 50% (64.87%), 100% (58.55%) of the extract in red blood cells while it has a significant increase in the ligation with plasma in the same fraction with 15.23%; 35.13%; 41.45% respectively.

0

50

100

150

0 6,25 12,5 25 50 100 Ricinus communis L. Extract

(%)

% o

f ligati

on

wit

h

Tc99

m RBCPL

Fig.2 - Effects of Ricinus communis extract in

fixation of Tc-99m on the plasma and red blood cells in water. The results are averages ± standard deviations with Test-T, *p<0,05.

In the Figure 3 we observe that the distribution of radioactivity in the insoluble fractions of the blood cells (IF-BC) and plasma (IF-P) in blood, treated with different concentrations of the solution of R. Communis and TCA at 5%. The analysis of he results indicate that there was a significant alteration (p<0,05). In the doses from 0% to 25% the ligation capacity of Tc99m remains unaltered after the precipitation with TCA, but it was verified that between the concentrations of 50% and 100% occurred a decrease of until 49,69% in the presence of TCA. However, observing the plasmatic fraction it was verified that the small doses remains unaltered, promoting an increase in the doses 50% and 100% of 49,69%. This shows that insoluble fractions of cells and plasma promote a specific ligation and maintains unaltered when compared with the graphic on Figure 2.

75


0

20

40

60

80

100

0 50 100 150

% o

f lig

ati

on

wit

h T

c9

9m

IF-RBC

IF-P

Ricinus communis L . Extract (%)

*

***

Fig.3 - Effects of Ricinus communis extract in

fixation of Tc-99m on insoluble fraction. The results are averages ± standard deviations with Test-T, *p<0,05.

The morphology of red blood cells was evaluated under optical microscope. Figure 4 shows the histological preparation of RBC (control group – not treated) in contact with a physiological solution 0,9%, observing that the cells were discoid, anucleate and with normal aspect. In Figure 5, shows RBC treated with R. Communis 0,062 mg/mL, were we observed little morphological alterations in the cells, in comparison with the control group, with little hemolysis.

Fig.4 - Control group cells -. Blood smears were

as evaluated under optical microscope

Fig.5 -

optical microscope (x40).

agmentation, hemolysis and hemoagglutination.

(x40).

Blood smears were prepared, dried, fixed and staining. After that, the morphology of the red blood cells was evaluated under

Figure 6 shows the treatment realized in the concentration of 0,125 mg/mL of R. communis, presenting important the alterations of the cells morphology with the break of cells membrane,fr

Fig.6 - In the presence of the extract of Ricinus

communis L. (0,125 mg/mL), blood smears were prepared, dried, fixed and staining. After that, the morphology of the red blood cells was evaluated under optical microscope (x40).

prepared, dried, fixed and staining. After that, the morphology of the red blood cells

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RESUMO DISCUSSION

It was proved Ricinus communis L. to be a extremely toxic plant to animals and cells in growth in vitro (Koga et al., 1979; Zhou et al., 2003). Early studies show the action of synthetic and natural drugs, Thuya occidentallis, Tabacco, Cauliflower, Maytenus ilicifolia, Paullinea cupana and Coffee beans that interfere in the labeling of red blood cells with

Este trabalho apresenta estudos envolvendo a influência do extrato protéico de R. communis L., com potente atividade antitumoral na fragilidade osmótica, onde amostras de sangue de ratos Wistar foi incubado com concentrações de R. communis e com soluções de NaCl (0,4; 0,7; 0,9%), na marcação dos elementos sanguíneos, onde o sangue de rato foi tratado com solução de Tc-99m e TCA à 5%, determinando o percentual de radioatividade (%ATI) no plasma (P) e nas células vermelhas (BC). As frações solúvel e insolúvel do plasma também foram avaliadas, como também a morfologia das células. Os resultados indicam que a % hemólise aumentou na presença de 0,125 mg/mL do extrato, houve decréscimo de 49,69% na % ATI na fração insolúvel das células, ocorrendo alterações morfológicas das células sangüíneas. Esses resultados sugerem que o extrato altera a capacidade de ligação das células vermelhas devido à oxidação do íon estanoso, modificando as estruturas celulares.

99mTC (Oliveira et al., 1997; Vidal et al., 1998; Lima et al., 2002; Oliveira et al., 2000; Oliveira et al., 2002; Oliveira et al., 2003). The mechanism for the fixation of 99mTC in the blood cells consists in the ligation of the radioactive element in the hemoglobin by the β channel found in the cells membrane (Bernardo-Filho et al., 2005). Our results indicate that there was an increase in hemolysis tax in the concentration of 0,125 mg/mL and that there wasn’t any alteration in the labeling of red blood cells in the concentrations from 6,25% to 25% of the extract when compared to the rate of the control group. However, it was observed a decay of 49,69% in the concentration of 100%, verifying that in these concentrations occur morphologic alterations in the blood cells and the radioactivity in the insoluble fractions and in the plasma promote a reduction in the radioactivity. Some studies show that the toxin ricin an agglutination of the erythrocytes and precipitation of the serium proteins (Olsnes, 2004). The hydroalcoholic extract of Ricinus communis may alterate the labeling of red blood cells and IF-CB decreasing the fixation of the radioactivity in the blood cells. The results of this study suggest that the proteic extract of Ricinus communis promotes toxic effects, changing the ligation capacity of the red blood cells due to the stannous ion capacity of oxidation, direct inhibition (chelating action) referring to the ions competition for the ligation sites of the pertechnetate ion, modifying this way the cells structure.

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To Vitor Ferreira and Mariane for the English review and for the manuscript layout.

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78


ANEXO II

Trabalho intitulado de “Effect of Extract of Ricinus communis on the Morphology and Labeling of Red Blood

Cells with Technetium-99m” reconhecido como melhor pôster na seção de Farmácia Nuclear do V Scientific

Meeting of the Brazilian Society of Nuclear Biosciences, que foi realizado em Belo Horizonte, MG, no período

de 26 a 29 de outubro de 2005.

79

Documents

Dissertação de Mestrado - UFPE