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2013/2014
Cláudia Sofia Ferreira e Sousa Lima dos Santos
Doença de Machado‐Joseph: do
diagnóstico à terapêutica
março, 2014
Mestrado Integrado em Medicina
Área: Neurologia
Trabalho efetuado sob a Orientação de:
Doutora Maria Carolina Lobo Almeida Garrett
Trabalho organizado de acordo com as normas da revista:
SINAPSE
Cláudia Sofia Ferreira e Sousa Lima dos Santos
Doença de Machado-Joseph: do
diagnóstico à terapêutica
março, 2014
À memória da minha amiga
Mónica Castro
Doença de Machado‐Joseph: do diagnóstico à terapêutica Cláudia Santos1 1Faculdade de Medicina da Universidade do Porto Alameda do Professor Doutor Hernâni Monteiro 4200-319, Porto Portugal Telem: 939306592 [email protected]
Doença de Machado‐Joseph: do diagnóstico à terapêutica
Cláudia Santos
Resumo
A doença de Machado-Joseph ou Ataxia Espinocerebelosa tipo 3 é uma ataxia
hereditária dominante que, apesar de rara, é a mais frequente em todo o mundo.
Existe uma elevada prevalência desta doença, inevitavelmente fatal, em algumas
regiões de Portugal com forte impacto na qualidade de vida dos doentes e seus
familiares.
Esta revisão teve como objetivo descrever diferentes aspetos da DMJ, tais como
características clínicas, neuropatologia, genética, mecanismo patogénico e
terapêuticas atualmente em desenvolvimento.
A DMJ caracteriza-se clinicamente pelo aparecimento tardio de ataxia cerebelosa
progressiva, oftalmoplegia, sinais piramidais, e em alguns casos sinais
extrapiramidais, principalmente distonia e neuropatia periférica. A nível patológico, os
doentes apresentam perda neuronal nos núcleos espinocerebelosos, cerebelo,
gânglios da base, ponte, mesencéfalo, bolbo raquidiano. Mais recentemente, foram
observadas alterações noutras áreas como tálamo e lobos cerebrais. Estudos de
imagem revelaram atrofia da ponte, do bolbo raquidiano e do cerebelo, com o
consequente aumento do quarto ventrículo.
Esta doença é causada por uma mutação dinâmica no segmento (CAG)n do gene
MJD1/ATXN3 (Cr14q32.1), transmitida de uma forma autossómica dominante.
Indivíduos normais apresentam genes com 14-44 CAGs, enquanto que, indivíduos
doentes apresentam um segmento expandido de 54-86 CAGs. O número de
repetições CAG está diretamente relacionado com a gravidade da doença e
inversamente relacionado com a idade de início. A expansão de CAGs origina um
segmento expandido de glutamina na proteína ataxina-3, o que lhe confere
propriedades tóxicas e/ou perda da sua função biológica, por alteração da
conformação normal da proteína e consequente agregação em inclusões
intracelulares. A ataxina-3 participa no controlo da homeostasia celular como enzima
de desubiquitinação, mas o seu papel na célula parece ser muito mais abrangente, o
que tem dificultado o esclarecimento do mecanismo patogénico subjacente a esta
patologia.
Vinte anos após a descoberta do gene MJD1/ATXN3, não existe ainda cura para a
DMJ. No entanto, aos doentes pode ser oferecido aconselhamento genético e
tratamento farmacológico para os diversos sintomas tais como depressão, alterações
do sono, parkinsonismo, dor e distonia. Os doentes podem ainda beneficiar de apoio
que lhes assegure uma melhor qualidade de vida, como por exemplo, fisioterapia,
terapia da fala e terapia ocupacional.
O grande número de trabalhos publicado nos últimos anos no sentido de descobrir o
mecanismo através do qual a DMJ se desenvolve e, da forma como poderá ser
travada a sua progressão, leva-nos a pensar que num futuro próximo será possível
tratar esta patologia bem como outras semelhantes.
Palavras-chave: Doenças de poliglutaminas, Doença de Machado-Joseph, Ataxia
espinocerebelosa tipo 3, ATXN3, ataxina-3, repetições de CAG
Correspondência com o autor:
Cláudia Santos
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Alameda do Professor Doutor Hernâni Monteiro
4200-319, Porto
Portugal
Machado‐Joseph Disease: from diagnosis to therapeutics
Cláudia Santos
Abstract
Machado-Joseph disease or Spinocerebellar Ataxia type 3 is a dominant hereditary
ataxia that although rare, is the most common worldwide. There is a high prevalence of
this inevitably fatal disease in some regions of Portugal with a strong impact on the
quality of life of patients and their families.
This review aims to describe different aspects of MJD, such as clinical features,
neuropathology, genetics, pathogenic mechanism and promising therapeutics.
MJD is clinically characterized by delayed onset of progressive cerebellar ataxia,
ophthalmoplegia, pyramidal signs, and in some cases extrapyramidal signs, such as
dystonia and peripheral neuropathy. Neuropathological studies reveal neuronal loss in
spinocerebellar nucleus, cerebellum, basal ganglia, pons, midbrain and medulla
oblongata. More recently, changes in other areas such as thalamus and the cerebral
lobes were observed. Imaging studies revealed atrophy of the cerebellum, pons and
medulla oblongata with a consequent increase of the fourth ventricle.
This disease is caused by a mutation in the dynamic segment (CAG)n of the
MJD1/ATXN3 gene (Cr14q32.1), transmitted in an autosomal dominant pattern. Normal
individuals have 14-44 CAGs, whereas MJD individuals have an expanded segment of
54-86 CAGs. The number of CAG repeats is directly related to the severity of the
disease and inversely related to the age of onset.
The expansion of CAGs results in an expanded polyglutamine tract in ataxin-3 protein
altering its normal conformation. The mutated protein gains toxic properties and/or loss
its biological function, and aggregates in intracellular inclusions. Ataxin-3 regulates
cellular homeostasis as a Deubiquitinating enzyme, but its role in cells seems far from
being completly understood, thus MJD underlying pathogenic mechanism remains
elusive.
Twenty years after the discovery of the gene MJD1/ATXN3 there is still no cure for
MJD. However, it can be offered to patients, genetic counseling, as well as,
pharmacological treatment for symptoms such as depression, sleep disturbances,
parkinsonism, dystonia and pain. Patients may also benefit from other support, such as
physical therapy, speech therapy and occupational therapy to ensure them a better
quality of life.
The large number of studies published in recent years in order to elucidate the
pathogenic mechanism in MJD and also how its progression can be stopped, lead us to
think that in the near future it will be possible to treat this and other related diseases.
Keywords: Polyglutamine diseases, Machado-Joseph Disease, Spinocerebellar ataxia
type 3, ATXN3, ataxin-3, CAG repeats
To whom correspondence should be addressed:
Cláudia Santos
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Alameda do Professor Doutor Hernâni Monteiro
4200-319, Porto
Portugal
Introdução
O genoma humano foi durante muito tempo considerado um património estável, sujeito
a recombinação meiótica e muito raramente a mutações. No entanto, há duas décadas
atrás, com a identificação das mutações responsáveis pelo síndrome do X-frágil (1-4)
e pela distrofia miotónica (5-8) este conceito foi alterado. Surpreendentemente, foi
descoberto que aquilo que se pensava ser meras repetições benignas de
trinucleotídeos, quando ultrapassam um determinado tamanho, podem estar
relacionadas com doenças graves. Desde então, diversas patologias têm sido
associadas a este tipo de mutações dinâmicas. Dentro das doenças causadas por
expansão de repetições o grupo das doenças de poliglutaminas é o mais comum.
Foram descritas até à data 9 doenças relacionadas com expansão de sequências de
poliglutamina nos respectivos genes: doença de Huntington (HD), atrofia muscular
espino-bulbar (SBMA), atrofia dentatorubropalidoluysiana (DRPLA) e as outras ataxias
espinocerebelosas tipo (SCAs) 1, 2, 3 (doença de Machado-Joseph), 6, 7 e 17 (9) (ver
tabela I). Todas estas doenças são caracterizadas por disfunção neuronal progressiva
que ocorre tipicamente na meia-idade e que resulta em neurodegeneração. Contudo,
existem sintomas clínicos específicos de cada patologia. As doenças de poliglutaminas
(poliQ) são todas herdadas de forma dominante com exceção da SBMA que se
transmite ligada ao cromossoma X. Nesta revisão será focada especificamente a
Doença de Machado-Joseph, a ataxia dominante mais comum, nos seus aspetos
clínicos, neuropatologia, genética, mecanismo patogénico e estratégias terapêuticas.
Doença de Machado-Joseph
1. Definição
A doença de Machado-Joseph (DMJ) (OMIM #109150) foi descrita, pela primeira vez,
em 1972 por Nakano em famílias originárias do arquipélago dos Açores, sendo mais
tarde encontrada em Portugal continental e em famílias sem ancestrais portugueses,
nomeadamente americanas e japonesas. (10-15). A heterogeneidade clinica desta
patologia levou a que fosse durante vários anos descrita na literatura com diferentes
designações. Em 1978, Lima e Coutinho propõem o nome de doença de Machado-
Joseph (14) como forma de homenagearem as duas primeiras famílias descritas
“Machado” e “Joseph” e, assim unificarem as diferentes entidades clínicas descritas
anteriormente como Machado disease (10), degenerescência nigro-espino-dentada
com oftalmoplegia (11), Joseph disease (12) ou doença dos Açores (13). Mais tarde,
foi descrita uma ataxia autossómica dominante designada ataxia espinocerebelosa
tipo 3 (SCA3), tendo sido posteriormente demonstrado por estudos genéticos que esta
correspondia afinal à doença de Machado-Joseph (16-17). Assim, a DMJ passou a ser
referida como SCA3 em alguma literatura.
A DMJ apesar de ser uma doença rara é a ataxia dominante mais prevalente (0,3 -
2,0:100000) (18). A sua distribuição geográfica é alargada a todo o mundo com
frequência relativa elevada dentro das Ataxias Espinocerebelosas (SCA) em países
como Brasil (69-72%) (19-20); Portugal (58-74%) (21-22); Singapura (53%) (23); China
(49%) (24-25); Holanda (44%) (26); Alemanha (42%) (27) e, Japão (28-63%) (28-29).
Curiosamente, a prevalência difere consoante a região dentro de um mesmo país. Por
exemplo, em Portugal continental a MJD é relativamente rara 1:100000 (30), com
exceção da região do Vale do Tejo em que a prevalência é 1:1000 (31). No
arquipélago dos Açores particularmente na ilha das Flores foi encontrada a maior
prevalência a nível mundial 1:239 (32).
2. Aspetos clínicos
A doença de Machado-Joseph é uma doença de início tardio, manifestando-se em
média por volta dos 40 anos existindo, no entanto, uma grande variabilidade da idade
de início, tendo como extremos os 5 e os 73 anos (33). Os critérios de diagnóstico
clínico desta doença estão bem estabelecidos e comportam um vasto leque de
sintomas, dos quais o mais frequente é a ataxia cerebelosa progressiva. Os doentes
apresentam inicialmente desequilíbrio, marcha de base alargada (ataxia), a que se
segue disartria, disfonia e perda de coordenação dos membros inferiores. A
descoordenação dos membros superiores aparece anos mais tarde. O segundo sinal
clínico mais comum é a oftalmoplegia, caracterizada inicialmente por dificuldades no
olhar para cima e da convergência e, anos mais tarde, por limitações no olhar lateral
(34). Em alguns doentes é igualmente observada uma retração palpebral que dá
origem ao aspeto de “olhos arregalados”. Outras alterações oculares igualmente
frequentes e precoces são o nistagmo, presente em 88% dos doentes (35) e a diplopia
(30). Os sinais piramidais são também bastante frequentes, incluindo hiperreflexia,
sinal de Babinski e espasticidade. Além destes, os doentes podem apresentar em grau
variável, sinais extrapiramidais, principalmente distonia, e sinais periféricos, que
podem ir desde a mera ausência de reflexos aquilianos até a atrofias musculares mais
ou menos pronunciadas. Um estudo recente revelou que a fadiga é um sintoma
comum a 60% dos doentes e agrava-se com a evolução da doença (36). A dor crónica
manifesta-se em 50% dos doentes e embora possa ter múltiplas etiologias, muscular,
neuropática ou devido à distonia, na maioria dos casos é de etiologia multifactorial.
Outras manifestações clinicas menos comuns incluem retinopatia, atrofia ótica,
alterações esfinctéricas, hiposmia, epilepsia, caimbras, distúrbios cognitivos e
comportamentais. Distúrbios do sono também podem ocorrer na DMJ e incluem o
distúrbio do sono REM presente em 50% dos doentes, sonolência diurna em 60%,
apneia do sono, insónia, e o síndrome das pernas inquietas presente em 55% dos
doentes (37-43). A depressão é uma manifestação psiquiátrica que poderá estar
subestimada na DMJ. Estas manifestações clinicas não motoras, não descritas
inicialmente, podem ser explicadas pelo facto de existir degenerescência de estruturas
não cerebelosas na DMJ, tal como nos gânglios da base, córtex cerebral, mesencéfalo
ou ponte. Para além disso, sabe-se hoje que, o cerebelo possui outras funções para
além da coordenação motora.
Existem atualmente pelo menos 30 diferentes tipos de ataxia hereditária dominante.
Geralmente estas ataxias são espinocerebelosas (SCAs) e vão sendo numeradas à
medida que os seus loci vão sendo descobertos. Este enorme número de SCAs, são
um desafio diagnóstico para qualquer neurologista, mais ainda, quando cada uma
delas apresenta uma variabilidade fenotípica considerável. Contudo, os doentes DMJ
quando comparados com doentes com outras formas hereditárias de ataxia dominante
manifestam sintomas distintivos que podem auxiliar o seu diagnóstico. Por exemplo,
apresentam geralmente características mais sugestivas de doença extrapiramidal (44)
o que pode ser explicado por um maior envolvimento dos gânglios basais. Em alguns
casos, conforme foi referido anteriormente, apresentam bradicinesia, rigidez, distonia e
tremor muito semelhantes a um doente com Parkinson (45). A espasticidade grave e
neuropatia periférica pronunciada estão também mais associadas à DMJ do que a
outras ataxias dominantes. Particularmente na doença de início mais tardio, a
neuropatia axonal periférica pode ser proeminente e por vezes acompanhada por
amiotrofia e fasciculações (46), o que revela que os danos no sistema nervoso
periférico dependente da idade são precoces na DMJ. Outra característica que ocorre
mais frequentemente na DMJ do que em outras SCAs é a presença de “olhos
arregalados” por combinação da retração das pálpebras e diminuição dos movimentos
palpebrais (30). O síndrome das pernas inquietas é também mais frequente na DMJ e
normalmente manifesta-se pela ausência de atonia muscular durante os sonhos Esta
pode mesmo ser a única manifestação da doença em casos menos graves (40). Os
movimentos coreicos, são caraterísticos da doença de Huntington mas podem ser
encontrados em ataxias como a SCA1, SCA17 ou DRPLA mas não na DMJ. A
mioclonia pode ser detetada mais frequentemente na SCA2, SCA14, SCA19 ou
DRPLA, a retinopatia pigmentar e cegueira estão associadas à SCA7, a discinesia
ocular à SCA10 e a ataxia cerebelar “pura” com nistagmo vertical é característica da
SCA6. A epilepsia é mais frequente na SCA10, SCA17 e DRPLA (47). Um dado
importante no diagnóstico diferencial da DMJ é que a capacidade cognitiva se mantém
preservada nestes doentes mesmo em estadios avançados da doença, ou seja,
embora possam ocorrer défices cognitivos ligeiros, a demência ou alterações
cognitivas graves raramente ocorrem. Pelo contrário, na SCA17 os doentes sofrem de
problemas cognitivos graves. Existem, portanto, algumas particularidades que
permitem ao neurologista distinguir clinicamente algumas das ataxias. Mesmo entre
doentes com DMJ é notória a grande variabilidade clínica o que, inclusivamente,
originou alguma controvérsia desde as primeiras descrições que, como se referiu, a
definiram como entidades clínicas diferentes. Foi, assim, necessário organizar uma
classificação em subtipos com o objetivo de tornar a prática clínica mais eficaz em
termos de diagnóstico (15). Na classificação proposta por Lima e Coutinho, o subtipo 1
apresenta uma idade de início menor (menos de 20 anos), com um rápido e mais
grave percurso da doença que associa a ataxia cerebelosa e a oftalmoplegia com
sinais piramidais graves (rigidez e espasticidade) e extrapiramidais (bradicinesia e
distonia). O subtipo 2 é o mais comum, e corresponde a um estado intermédio em
termos de gravidade e idade de início (20 a 50 anos), caracterizando-se pelos
tradicionais sintomas de ataxia cerebelosa e oftalmoplegia com ou sem sinais
piramidais, podendo ser considerada a forma inicial e transitória da doença que pode
ou não evoluir para o subtipo 1 ou subtipo 3. O subtipo 3 é uma forma de início mais
tardio (40 a 75 anos), com uma progressão lenta, apresentando ataxia cerebelosa e
oftalmoplegia, associadas a sinais periféricos mais marcados tais como neuropatia
motora e atrofia muscular. Posteriormente, foi descrito um subtipo 4 mais raro, que
corresponde a doentes com a doença de Machado-Joseph associada a parkinsonismo
que inclusivamente podem responder a L-dopa (45, 48). Finalmente foi descrito um
subtipo 5 muito raro, em que os doentes apresentam paraplegia espástica pura (49).
A sobrevida média na DMJ é de 21 anos, acabando os doentes por falecer devido ao
alectuamento prolongado, pneumonia de aspiração ou asfixia (30).
3. Patologia e neuroimagem
Macroscopicamente os cérebros de doentes DMJ pesam significativamente menos
que os cérebros de indivíduos sem patologia (50-51). É igualmente notória a
despigmentação da substantia nigra e atrofia do cerebelo, ponte, bolbo raquidiano e
nervos cranianos II a XII (30, 33, 51-52).
Estudos neuropatológicos convencionais documentaram perda neuronal nos núcleos
espinocerebelosos, cerebelar denteado, pálido, subtalâmico, rubro, pôntico, vestibular,
substancia nigra e, coluna de Clarke (12, 14, 30, 51-54). Segundo estes estudos a
lesão da matéria branca está confinada ao lemnisco medial, trato espinocerebelar e
colunas dorsais (51-52, 54).
Estudos de neuropatologia utilizando técnicas não convencionais mostraram
degeneração em outros locais não descritos anteriormente, nomeadamente na
substância cinzenta de múltiplas áreas envolvendo a ansa motora
cerebelotalamocortical, a ansa motora gânglio basal-talamocortical, vários sistemas:
visual, auditivo, somatossensorial, oculomotor e vestibular, região do tronco cerebral
relacionado com a ingestão e pré-cerebelar, sistema pôntico noradrenérgico e sistema
dopaminérgico e colinérgico do mesencéfalo e núcleo reticular talâmico GABAérgico
(55). A degeneração da substância branca é pouco acentuada e foi apenas observada
no cerebelo, medula espinal e tronco cerebral (55).
A característica mais frequentemente encontrada na RMN de DMJ é o aumento do
quarto ventrículo. Estudos volumétricos utilizando RMN revelaram a atrofia da ponte,
cerebelo, pedúnculo médio e superior do cerebelo, dos gânglios da base (putamen,
caudado e globo pálido), alterações do diâmetro ântero-posterior e transverso do
mesencéfalo e do diâmetro ântero-posterior do bolbo raquidiano (56-60). A utilização
de uma nova técnica de imagem associada à RMN ajudou a clarificar o envolvimento
do tálamo na DMJ (61). Estudos de espectroscopia RM mostraram ainda alterações
metabólicas na substância branca sugerindo disfunção neuronal e axonal extensa
(62). A utilização da glucose pelos hemisférios cerebelares, tronco cerebral e córtex
cerebral é deficitária, e pode ser detetada por PET em portadores da DMJ mesmo
antes de manifestarem os sinais clínicos, o que sugere a existência de uma atividade
pré-clinica da doença (63). Outras alterações detetáveis por PET com 18F-fluorodopa
revelaram diminuição da ligação do transportador da Dopamina em regiões como
cerebelo, tronco cerebral e sistema dopaminérgico nigro-estriado e curiosamente no
córtex cerebral e no estriado (58).
Nos cérebros de doentes DMJ podem ser encontrados agregados proteicos em três
diferentes locais da célula. Foram detetadas inclusões intranucleares (IN) em diversas
regiões do encéfalo de doentes DMJ, principalmente na ponte, mas também no
tálamo, substancia nigra, e mais raramente no estriado (64-65). Estas inclusões
contêm a proteína ataxina-3 (ATXN3) envolvida na DMJ, juntamente com outras
proteínas, tais como, ubiquitina e proteínas ubiquitinadas, fatores de transcrição,
proteínas contendo cadeias poliglutaminas, sub-unidades do proteassoma e proteínas
de Heat-shock (HSP) (64-71). Ao contrário do que inicialmente se pensava, a
presença das IN pode ocorrer não só em zonas afetadas pela neurodegeneração mas
também em regiões do encéfalo geralmente poupadas (55, 72-73). Assim, apesar das
IN serem um marcador da DMJ o seu papel preciso nesta patologia continua por
esclarecer. São igualmente observadas inclusões citoplasmáticas contendo a proteína
ATXN3 mutada em regiões do encéfalo onde geralmente também se observam IN (72,
74-75). Estas inclusões são negativas para a ubiquitina e consistem em grânulos de
1,5 µm de diâmetro. Agregados da proteína mutada podem, também, ser observados
em fibras nervosas que degeneram na DMJ e contêm as proteínas ubiquitina e p62 e
sub- unidades do proteassoma, podendo por isso ser prejudiciais para o transporte
axonal e assim contribuírem para a degeneração das células nervosas (76).
4. Genética da DMJ
4.1 Gene MJD1/ATXN3
Em 1993 foi mapeado o gene MJD1, atualmente designado gene ATXN3 no
cromossoma 14q24.3-q32.1 em famílias japonesas (77), confirmando-se mais tarde
essa localização em famílias açorianas (78). O gene ATXN3 foi clonado em 1994 (79),
possuindo uma sequência de repetições do trinucleotídeo CAG que se encontra
expandida nos doentes DMJ (79-81). O segmento de trinucleotídios CAG é bastante
polimórfico, apresentando os indivíduos normais entre 12 e 44 CAGs, e os indivíduos
com DMJ entre 54 e 86 CAGs (31). Casos de alelos de tamanho intermédio foram já
descritos, mas são muito raros. Os alelos intermédios provavelmente têm penetrância
incompleta e não parecem associar-se a sintomas da doença ou então associam-se
apenas a manifestações menos graves de ataxia, como o síndrome das pernas
inquietas ou disautonomias (31, 82-85). A confirmação de que alelos entre 44 e os 54
CAG possam estar associados à presença de sintomas associados à DMJ poderá
levar à alteração dos intervalos de repetições CAGs patológicos inicialmente
propostos.
Apesar do gene MJD1/ATXN3 ter sido clonado em 1994, apenas em 2001 foi
determinada a estrutura da sua sequência genómica, que compreende 48240 bp,
incluindo 11 exões (86). A sequência repetitiva de CAGs encontra-se no exão 10.
Foram inicialmente detetados quatro transcritos, expressos ubiquamente, com
diferentes tamanhos - 1.4, 1.8, 4.5, e 7.5 kb que resultam provavelmente de splicing
alternativo dos exões 2, 10 ou 11 e da utilização de diferentes sinais de poliadenilação
(79, 86-87). Com a análise das sequências dos clones de cDNA provou-se a
existência de pelo menos 5 produtos do gene ATXN3: o primeiro clone inicialmente
descrito, MJD1a (79), utiliza o exão 10 como local de terminação a 3´. Outros clones
de cDNA MJD1-1 e MJD5-1 foram descritos por Goto (87) e utilizam o exão 11 como
região 3´ terminal. A diferença entre os clones MJD1-1 e MJD5-1 reside na utilização
de diferentes sinais de poliadenilação. O clone MJD2-1 também descrito por Goto
utiliza o exão 10 como local de terminação 3´ e contém, relativamente ao cDNA
MJD1a, uma alteração do codão stop (TAA/TAC1118), um polimorfismo frequente na
população (88). O clone H2 salta o exão 2, provavelmente por splicing alternativo
mantendo, no entanto, um quadro de leitura idêntico ao clone MJD1-1 (86).
Um estudo recente realizado a partir de amostras de sangue periférico mostrou a
presença de dois novos exões no gene ATXN3 (6a e 9a) e, ainda, 50 novos
transcritos, dos quais 20 com probabilidade de tradução em diferentes isoformas
proteicas (89). No futuro, é ainda necessário provar a existência destas variantes no
SNC e, ainda, demonstrar o seu nível de expressão nos diferentes tecidos, bem como,
determinar a sua relevância funcional e contribuição diferencial para a patologia da
DMJ.
4.2 Transmissão genética e diagnóstico
A DMJ é transmitida de forma autossómica dominante, o que significa que basta que
um dos progenitores (independentemente do sexo) seja portador da mutação para que
haja um risco de 50% de os seus filhos ou filhas serem afetados.
Na DMJ tal como noutras doenças de repetições de nucleotídeos, ocorre uma
correlação inversa entre o tamanho da repetição, a idade de início da doença, e a
tendência para uma expansão maior da repetição patogénica em gerações sucessivas
(34, 46, 80). Este fenómeno designado por Antecipação explica-se pelo facto de existir
instabilidade genética da repetição de CAG entre gerações. Ou seja, o número de
repetições pode ser diferente entre pais e filhos, existindo inclusivamente maior
tendência para expandir quando o alelo mutado transmitido é paterno. O alelo normal
geralmente é estável entre gerações. O alelo expandido apresenta também alguma
instabilidade somática, ou seja, apresenta diferentes tamanhos de repetições CAG em
diferentes tecidos, fenómeno designado por mosaicismo somático. Contudo a
presença de repetições maiores não está preferencialmente associado a locais do
cérebro afetados (90).
Apesar de estar bem estabelecida uma forte correlação entre o tamanho da repetição,
a gravidade da doença e a idade de inicio, ou seja quanto maior for o tamanho da
repetição mais grave serão os sintomas e mais precoce será o seu aparecimento. Hoje
sabe-se que deverão existir outros fatores modificadores genéticos e/ou ambientais
que podem contribuir para as diferenças clínicas encontradas entre doentes.
Curiosamente, na DMJ parece haver um efeito de dose, já que doentes apresentando
dois alelos expandidos, ou seja homozigóticos para a mutação têm uma idade de
início mais precoce e um fenótipo mais grave (91-96).
Após a descoberta da sequência do gene ATXN3 passou a ser possível confirmar
molecularmente o diagnóstico clínico da DMJ através da determinação do número de
(CAG)n utilizando a técnica de polymerase chain reaction (PCR). Atualmente, estão
disponíveis testes genéticos para doentes e indivíduos pré-sintomaticos que
pertencem a famílias com doentes DMJ. Em alguns países como Portugal podem ser
oferecidos aos casais em risco testes pré-natal ou pré-implantatorio para que possam
fazer as suas escolhas relativamente à sua descendência já que, conforme foi referido
anteriormente, a probabilidade de terem um filho afetado é de 50%. Indivíduos que
desejarem realizar os diferentes testes genéticos deverão simultaneamente ser
encaminhados para consultas de aconselhamento genético e avaliação psicossocial
seguindo protocolos internacionais. Este aconselhamento torna-se particularmente
importante em doenças dominantes de início tardio que permanecem sem tratamento
pois o apoio médico, psicológico e psicossocial pode contribuir grandemente para a
alteração da qualidade de vida dos doentes e dos seus familiares.
5. Proteína ATXN3
O gene ATXN3 codifica a proteína ataxina-3 (ATXN3), uma proteína de apenas 42
kDa. Esta proteína apresenta um segmento variável de glutaminas na região C-
terminal que corresponde ao segmento CAG do gene ATXN3 (79), cuja expansão está
associada à DMJ. A ATXN3 está conservada em vários organismos eucariotas
incluindo plantas (97-98), no entanto, apenas a proteína humana contém uma cadeia
de glutaminas longa o que indica que esta não é essencial para a função da proteína.
5.1 Isoformas da proteína ATXN3
As isoformas mais representativas da proteína ATXN3 distinguem-se por terem
diferentes regiões carboxílicas, e são atualmente designadas 2UIM e 3UIM. A primeira
é uma variante de splicing que corresponde ao clone MJD1a inicialmente descrito que
inclui 10 exões (79), e contém um domínio Josephin, dois motivos de interação com a
ubiquitina, a cadeia de poliglutaminas e uma região C-terminal hidrofóbica. Esta
variante pode conter mais 16 aminoácidos dependendo da ausência de um codão stop
prematuro devido a um polimorfismo muito frequente na população e passa a
designar-se 2UIM-long. A isoforma 3UIM foi descrita por Goto e corresponde a uma
variante de splicing MJD 1-1 que contém 11 exões e apresenta mais um UIM na região
carboxílica (87). A isoforma 3UIM é largamente expressa (65) e é a principal isoforma
encontrada a nível do encéfalo (99). Um estudo recente revelou que as duas principais
isoformas, 2UIM e 3UIM, partilham a mesma função de desubiquitinação in vitro.
Contudo, a variante 2UIM agrega mais facilmente e é mais rapidamente degradada
pelo proteassoma. Estes dados indicam que sequências de aminoácidos diferentes
conferem propriedade distintas às variantes proteicas da ATXN3, o que associado ao
facto da sua expressão ser também diferenciada pode explicar porque só uma
população específica de neurónios é afetada na DMJ.
5.2 Padrão de expressão
A ATXN3 apresenta uma expressão ubíqua, ou seja, encontra-se distribuída tanto no
SNC como em outros tecidos do organismo (65, 97, 100-104). A nível celular a ATXN3
pode ser encontrada no citoplasma e no núcleo (65, 101, 103, 105). Atualmente,
existem dados que apoiam o facto da proteína normal se encontrar sobretudo no
citoplasma, embora também seja possível a sua localização nuclear. A presença da
proteína mutada no núcleo é essencial para a patogénese da doença (106-107), nesse
local encontra-se em inclusões nucleares e é completamente imóvel formando
verdadeiros agregados (64-65, 108).
A presença da proteína no núcleo pode ser explicada pela existência de possíveis
sinais de localização nuclear (NLS) na proteína ATXN3 nos resíduos 282-285 e/ou
273-286, este último confirmado por estudos funcionais (109). Uma vez no núcleo, a
ATXN3 associa-se à matriz nuclear (103). Na proteína existem igualmente vários
possíveis sinais de exportação nuclear (NES) que poderão opor-se à atividade dos
NLS, o que explica a presença da proteína normal sobretudo no citoplasma.
5.3 Estrutura e domínios
A região N-terminal da ATXN3 tem conformação globular e compacta, sobretudo em α-
hélice, em contraste com uma porção C-terminal, contendo as poliglutaminas mais
flexível, destruturada e desorganizada (110-112).
A região N-terminal encontra-se bastante conservada e contém um domínio Josephin,
comum a 30 proteínas de diferentes espécies. Hofmann e os seus colaboradores
através de um estudo bioinformático propuseram, pela primeira vez, que a ataxina-3
está estruturalmente relacionada com uma classe de proteases específicas da
ubiquitina assumindo a mesma conformação das famílias de proteases UCH (Ubiquitin
C-terminal hydrolase) e UBP (Ubiquitin specific protease), o “papain fold” (113). Este
mesmo estudo mostrou que a ATXN3 mantém conservado o local de atividade
catalítica destas proteases e permitiu prever que o domínio Josephin contém um local
catalítico de protease cisteínica (Q9-C14-H119-N134), provavelmente envolvido na
proteólise da ubiquitina, ou seja na hidrólise de ligações isopeptídicas entre
monómeros de ubiquitina ou entre a ubiquitina e outras proteínas (113), observação
posteriormente confirmada experimentalmente (112, 114-116). Assim, a ATX3 em
conjunto com as restantes proteínas contendo o motivo Josephin foram agrupadas
numa nova classe de enzimas de desubiquitinação (DUBs).
Foi posteriormente demonstrado que o domínio Josephin é constituído por dois
subdomínios, um catalítico e globular e outro com uma conformação essencialmente
em gancho helicoidal (helical hairpin) (115-116). O domínio Josephin apresenta na sua
superfície dois locais de ligação para a ubiquitina, o primeiro entre os dois
subdomínios e o segundo contíguo mas na face oposta (117). A importância estrutural
do domínio Josephin originou estudos da sua estabilidade conformacional e tendência
para agregar. Um resultado surpreendente provou que este domínio apresenta um
comportamento semelhante ao da ATXN3, no que diz respeito à estabilidade e às
propriedades de agregação, ou seja, uma transição conformacional de α para β
associada à agregação e dependente da temperatura e concentração (111).
A região C-terminal da ATXN3 é parcialmente desorganizada, sobretudo na região que
contém o segmento poliglutaminas, mas com elevado conteúdo de estrutura
secundária nas regiões onde estão localizados os motivos de interação com a
ubiquitina (UIMs), que se sabe serem em α-hélice (110, 112). Os domínios UIMs foram
inicialmente encontrados na subunidade S5a (Rpn10) do complexo 19S do
proteassoma, e estão conservados nos vários ortólogos da ATXN3, o que sugeriu a
sua relevância na função normal da proteína. Na ataxina-3, existem dois UIMs
localizados antes do segmento de glutaminas, e um outro localizado após o segmento
de glutaminas apenas presente na variante proteica 3UIM (118-119).
5.4 Função e interações
Apesar do número crescente de trabalhos publicados nos últimos anos tendo como
objetivo o esclarecimento das propriedades biológicas da ATXN3, a sua exata função
permanece por determinar. As hipóteses propostas para a função da ATXN3 são as
seguintes:
(i) vários estudos indicam que a ATXN3 pertence a uma classe de proteases da
ubiquitina também designadas de enzimas de desubiquitinação (DUBs). As enzimas
DUB estão implicadas na remoção de monoubiquitina ou poliubiquitinas de proteínas
alvo e também na separação das ligações entre monómeros de ubiquitina. O processo
de ubiquitinação é um mecanismo através do qual a célula regula várias atividades
celulares, nomeadamente a degradação de proteínas misfolded e proteínas de semi-
vida curta pelo proteassoma, a reparação do DNA, a remodelação da cromatina e o
ciclo celular e vias de sinalização. A ATXN3 liga-se a cadeias com mais de 4
ubiquitinas através dos seus dois primeiros UIMs que atuam de uma forma sinérgica
(114, 119-122). Foi demonstrado que nos neurónios, a ATXN3 liga-se a proteínas
poliubiquitinadas, mais uma vez, de uma forma dependente dos UIMs (123). Quando
os seus UIM estão mutados a capacidade de ligação à ubiquitina é perdida. Foi
demonstrado in vitro que a ATXN3 pode clivar cadeias de poliubiquitina de substratos
ubiquitinados, bem como, separar monómeros de ubiquitina de cadeias de
poliubiquitina. Esta atividade de desubiquitinação é perdida após mutação da cisteína
14 do local catalítico (112, 114-116). Foi ainda possível verificar o aumento de
proteínas poliubiquitinadas em ratinhos KO para a ATXN3 e em células expressando a
proteína inativa (123-124). Vários resultados sugerem que a ATXN3 funciona como
protease na edição das cadeias de ubiquitina, ou seja encurta o tamanho dessas
cadeias em vez de as remover totalmente do substrato alvo (114, 125-127). Desta
forma, é proposto que como DUB a ATXN3 recruta as proteínas poliubiquitinadas
através dos seus UIMs que juntamente com o local 1 de ligação à ubiquitina situado no
domínio Josephin posicionam corretamente as cadeias de ubiquitinas que serão assim
expostas ao local catalítico do domínio Josephin responsável pela sua proteólise. O
facto de não terem sido ainda encontrados o(s) substrato(s) alvo da desubiquitinação
da ATXN3 limita de certa forma o seu enquadramento preciso neste mecanismo
celular.
(ii) Diversas evidências associam a ATXN3 com a via da ubiquitina-proteassoma, por
exemplo, a inibição do proteassoma origina a coprecipitação de proteínas
poliubiquitinadas juntamente com a ATXN3 (119, 121).
Adicionalmente, as diferentes isoformas da proteína podem ligar-se ao proteassoma e
a duas proteínas- hHR23 e VCP- implicadas no transporte de substratos para o
proteassoma para posterior degradação (120). Os homólogos humanos -hHR23A e
hHR23B - da proteína de levedura RAD23 interatuam com a ATXN3 através do
domínio ubiquitin-like (UBL) (128). As proteínas hHR23A e hHR23B ligam-se ao 2º
local de ligação à ubiquitina presente no domínio Josephin da ATXN3 (115, 128). As
hHR23 interatuam ainda com a subunidade S5a do proteassoma (Rpn10) (129); ligam-
se à ubiquitina (130-131), a cadeias de poliubiquitina (132) e a proteínas
poliubiquitinadas (133). A ATXN3 através da sua região C-terminal liga-se à VCP
(valosin-containing protein)/p97, uma ATPase AAA envolvida no controlo da divisão
celular, na fusão membranar, transporte vesicular e na via de degradação ubiquitina-
proteassoma (120, 134-136). Foi assim proposto que a ATXN3 participaria num
complexo que transporta proteínas para o proteassoma com vista à sua degradação.
Adicionalmente, foi proposta que esta função possa estar relacionada em particular
com a degradação de proteínas associada com o retículo endoplasmático (ERAD). O
ERAD é o mecanismo através do qual ocorre a ubiquitinação de proteínas com
defeitos de conformação ou elementos não complexados das vias de secreção que
são exportadas do retículo endoplasmático (RE) para o citosol para serem degradadas
pelo proteassoma. Sabe-se que o complexo VCP/ATXN3 interatua com componentes
da membrana do RE controlando a exportação e a degradação de proteínas misfolded
do RE (137-138). Foi assim porposto que o complexo VCP/ATXN3 pode servir para
transferir substratos poliubiquitinados, após terem sido editados pela ATXN3,
diretamente para o proteossoma ou para outras proteínas transportadoras tal como a
hHRAD23A/B (120, 128).
Outro aspeto interessante que tem vindo a ser estudado é o possível envolvimento da
ATXN3 na regulação da formação de agressomas de uma forma dependente da sua
atividade DUB (125, 139). Estes agressomas correspondem a proteínas misfolded
agregadas junto ao centro organizador dos microtúbulos (MTOC). Os agressomas são
de extrema importância sempre que o proteassoma não consegue lidar com as
proteínas misfolded já que permitem que estas possam ser degradas pelos lisossomas
contribuindo assim para a manutenção da homeostasia celular. A interação da ATXN3
com outros componentes implicados na organização do agressoma tais como, dineina,
HDAC6 (Histone deacetylase 6 inhibition), PLIC1 (protein linking IAP to the
cytoskeleton) e microtúbulos apoiam a importância da ATXN3 neste processo celular
(125, 139-140). Estes dados apontam para o envolvimento da ATXN3 em mecanismos
de controlo de qualidade celular reconhecendo-a como uma proteica neuroprotetora,
seja como transportadora de substratos para o proteossoma ou como DUB.
(iii) A ATXN3 é capaz de regular a transcrição. A regulação da transcrição pode ser
feita por diversos mecanismos já que a ATXN3 interatua com inúmeros reguladores da
transcrição como por exemplo: TATA box binding protein (TBP)-associated factor 4
(TAF4); com os ativadores da transcrição CBP, P300 e PCAF; Nuclear receptor co-
repressor (NCoRI); Histone deacetylase (HDAC) 3 e 6; Forkhead box O (FOXO) e
hHRAD23A/B. Assim, pode inibir a transcrição por ligação a ativadores da transcrição
CBP, P300 e PCAF impedindo a acetilação do DNA (141-142). Por outro lado, esta
proteína pode inibir diretamente a transcrição in vivo, impedindo a acetilação de
histonas, uma vez que ao ligar-se às histonas H3 e H4 pode bloquear o acesso dos
co-ativadores aos locais de acetilação (142). A ATXN3 interatua igualmente com dois
repressores da transcrição HDAC3 (histone deacetylase 3) e NCor (nuclear receptor
corepressor) promovendo a desacetilação de histonas e a consequente inibição da
transcrição (143).
Estudos recentes revelaram que a ATXN3 para além de estar envolvida na
homeostasia celular, e na regulação da transcrição pode ainda participar em outros
mecanismos celulares tais como miogénese ou organização do citoesqueleto, (140,
144). Contudo, é possível que a proteína esteja envolvida nestes diversos
mecanismos apenas de uma forma indireta, já que participando em mecanismos de
controlo de qualidade da célula como DUB ou como proteína transportadora de
proteínas para o proteassoma, ela inevitavelmente vai interferir com a semi-vida de
diferentes proteínas que fazem parte de diversos mecanismos celulares.
6. Mecanismo patogénico
Foram descritas 9 doenças relacionadas com expansão da sequência de poliglutamina
nos respetivos genes (9) (ver tabela I). Não foi, até à data, esclarecido o mecanismo
patogénico subjacente a esta classe de doenças, mas diversos estudos em modelos
celulares e animais revelaram que são causadas pela presença da expansão do
segmento de glutaminas (poliQ) (9). Existem aspetos partilhados por todas as doenças
de glutaminas que sugerem a existência de um mecanismo patogénico comum: (I) As
proteínas envolvidas nas doenças de glutaminas não possuem qualquer característica
comum entre elas, para além do segmento de poliglutamina; (II) quanto maior o
tamanho da repetição mais graves são os sintomas da doença; (III) existe uma
correlação inversa entre o tamanho da repetição e a idade de início da doença; (IV)
apresentam inclusões intracelulares, predominantemente intranucleares (IN) que
correspondem a agregados insolúveis contendo as proteínas mutadas ubiquitinadas;
(V) as poliglutaminas mesmo fora do seu contexto proteico particular induzem
neurodegeneração em modelos celulares e animais. Apesar das semelhanças acima
mencionadas, algo que continua a intrigar os investigadores interessados neste grupo
de patologias, é o facto de o leque de sintomas que as caracteriza ser distinto, bem
como, o padrão de degeneração neuronal.
Na DMJ pensa-se que o segmento PoliQ é o fator precipitante da doença mas outros
fatores podem contribuir para o seu desenvolvimento e especificidade, tais como:
contexto génico onde se localiza a expansão, expressão temporal e espacial da
proteína ATXN3, perda da sua função biológica e alteração das suas interações
proteicas (145).
Seguidamente, irão ser considerados alguns dos mecanismos patogénicos proposto
para a DMJ, os quais, não sendo mutuamente exclusivos, podendo ocorrer em
simultâneo ou funcionarem como uma sequência de fenómenos ao longo da vida.
6.1 Misfolding e Inclusões Nucleares
A ATXN3 contendo um segmento expandido de poliglutamina apresenta uma
conformação anormal, o que lhe confere propriedades tóxicas e a capacidade de
precipitar no interior da célula (146). As inclusões intracelulares foram detetadas nas
diferentes doenças de glutaminas e aparentemente correlacionam-se com o tamanho
de CAGs e a gravidade da doença (64, 66, 147-148). As proteínas mutadas são
ubiquitinadas (64, 66) e, quando presentes no núcleo, recrutam subunidades do
proteassoma formando agregados nucleares (67-68, 70). Este facto indicia o
envolvimento do sistema ubiquitina-proteassoma (UP) no processo patogénico,
provavelmente na tentativa de degradar as proteínas misfolded.
Em linhas celulares e organismos modelo, a toxicidade das cadeias poliQ pode ser
revertida pela sobreexpressão de chaperones (68, 70, 149-153), sugerindo, uma vez
mais, que a célula ativa mecanismos de refolding, eliminação e/ou desagregação das
proteínas que contenham expansão de poliglutaminas. Contudo verificou-se que a
distribuição das IN em tecidos de doentes com DMJ nem sempre corresponde à
distribuição da patologia (154-159).
Assim, se inicialmente parceria óbvio que os agregados eram tóxicos, atualmente
coloca-se a hipótese de estes serem uma forma de diminuir os níveis da forma difusa
das proteínas mutadas. Na doença de Huntington, Arrasate e colaboradores
mostraram que a formação de corpos de inclusão (citoplasmáticos ou nucleares)
provocava a diminuição da forma difusa da huntingtina e prolongava a sobrevida dos
neurónios (160). Bevivino e Loll mostraram, in vitro, que a ATXN3 com expansão de
glutaminas formava rapidamente fibrilas em forma de folha β tipo amiloide (161-163).
Nesse processo são formados vários elementos intermédios como pequenos
agregados, monómeros ou oligómeros que, atualmente se julga ser as verdadeiras
entidades tóxicas e não agregados macromoleculares como inicialmente se pensava
(164). Posteriormente, verificou-se que quer a variante normal da ATXN3 quer o
domínio Josephin têm tendência para agregar em determinadas condições
desestabilizadoras (111, 165-168). Isto sugere que o ambiente proteico em que o
segmento de glutaminas se insere, e não apenas o segmento de glutaminas, possa ter
interferência no processo de agregação. O domínio Josephin apresenta tendência
intrínseca para auto-associação através dos seus locais de ligação à ubiquitina e pode
constituir um primeiro passo para a alteração da conformação da proteína e modelar a
agregação quer da proteína mutada quer da normal. De facto, julga-se que os
agregados formados pela proteína mutada são insolúveis, mais estáveis e mais
rapidamente formados, enquanto que, os agregados formados pela proteína normal
são solúveis, instáveis e facilmente degradados pelos sistemas de controlo celular.
Apesar de, os dados atuais demonstrarem que as inclusões nucleares não são por si
só as causadoras de citotoxicidade, a verdade é que a redistribuição do proteassoma
e de chaperones para os agregados pode ter como consequência a ausência destes
elementos nos locais da célula onde são normalmente necessários, um aspeto que
poderá ser fundamental no mecanismo patogénico. Um outro factor eventualmente
relevante para a patogénese é a presença nos agregados da proteína normal e de
outras proteínas que contêm um segmento de glutaminas como, por exemplo, fatores
de transcrição que, desta forma, se tornariam limitantes no interior da célula (78, 119,
141, 169-172). Recentemente, foi demonstrado que a presença de agregados nos
axónios pode bloquear o transporte axonal, indicando que o papel das inclusões na
patogénese não foi ainda completamente esclarecido (173).
O estudo do processo de agregação e das entidades tóxicas formadas na DMJ, bem
como, em outras doenças de poliglutaminas é de extrema importância, pois permitirá o
desenvolvimento de estratégias terapêuticas dirigidas a este mecanismo.
6.2 Hipótese dos fragmentos tóxicos
Em trabalhos utilizando linhas celulares e modelo em ratinho da DMJ, foi descrita uma
maior toxicidade resultante da expressão do segmento truncado do gene ATXN3
contendo as poliglutaminas, relativamente ao gene completo (64, 174-175). Alguns
autores propuseram que a ATXN3 sofre proteólise por caspases ou proteases calpaina
dependentes do cálcio, dando assim origem a um fragmento tóxico contendo as
poliglutaminas com uma maior tendência para agregar (176-179). Um modelo de
ratinho demonstrou a existência de um local de proteólise na ATXN3, o qual origina
um fragmento tóxico de 37 kDa, detetado em linhas celulares, em animais e doentes
DMJ (108, 178, 180-181). Em Drosophila a mutação dos locais de clivagem por
caspases reduziu a formação de fragmentos C-terminal e reduziu a toxicidade (178).
Num modelo de ratinho transgénico DMJ foi provada a clivagem da ATXN3 pela
calpaina e, quando o inibidor endógeno desta proteína – a calpastatina – é retirado,
houve um aumento do número de agregados nucleares, da neurodegeneração e o
agravamento do fenótipo (182).
É assim possível que a proteólise da ATXN3 seja um passo importante para a
agregação e a toxicidade. No entanto, a importância deste mecanismo não é
consensual, uma vez que estes fragmentos não são detetados em muitos dos modelos
experimentais da doença e, noutros, foi mesmo demonstrado o contrário, ou seja, a
sequência de glutaminas expandida está menos sujeita a clivagem e por isso a
patogénese seria explicada pela acumulação da proteína expandida completa (183).
6.3 Perda de função da proteína ATXN3
Na DMJ o segmento de poliQ para além de contribuir para a formação de agregados
proteicos pode interferir com a função normal da proteína, com as suas interações e
com a sua localização. Animais KO para a ATXN3 em ratinho ou no nemátode C.
elegans não apresentaram fenótipos detetáveis pelos métodos utilizados, o que indica
que a perda de função não é deletéria nem é crucial para o desenvolvimento da
doença (98, 124, 184). Uma outra hipótese proposta admite que o segmento PoliQ
confere um ganho de função tóxico à proteína. Por exemplo, se de facto a ATXN3
participar em mecanismos de remodelação e degradação de proteínas misfolded, uma
perturbação nesse mecanismo poderá originar acumulação de produtos celulares
tóxicos. No entanto, sabe-se que a proteína mutada com expansão de poliQ mantém a
função de DUB, tal como, a proteína normal (114, 123). A proteína mutada mantém
ainda a sua capacidade de se ligar através dos seus domínios UIM, com substratos
poliubiquitinados (123).
Uma forma do segmento de poliglutaminas expandido causar distúrbios na regulação
da homeostasia celular poderá ser através da alteração da força de interação com
complexos envolvidos nesse mesmo processo, p.e. proteassoma, estabelecendo com
eles interações mais estáveis e promovendo assim a agregação proteica (120).
Da mesma forma, a interação com os seus parceiros moleculares pode ser alterada
pela existência do segmento poliQ. Por exemplo, a ligação com as proteínas hHR23A
e hHR23B mantém-se mesmo na proteína mutada, no entanto, a hHR23 colocaliza
com a ATXN3 mutada nos agregados (128). Não deixa de ser interessante que a
ATXN3 se ligue à VCP/p97 de uma forma dependente do tamanho do segmento
PoliQ, ou seja, a proteína mutada tem maior afinidade para a VCP do que a proteína
normal. Sabe-se que o complexo VCP/ATXN3 interatua com componentes da
membrana do RE controlando a exportação e a degradação de proteínas misfolded do
RE (137-138).
Assim, é possível que esta alteração no mecanismo ERAD induza stresse no RE e
que isso de alguma forma contribua para o mecanismo neurodegenerativo (137-138).
A confirmação de que a presença da mutação na proteína ATXN3 lhe confere
propriedades tóxicas por um ganho de função depende do completo esclarecimento,
em trabalhos futuros, da sua função biológica e do seu papel nos diferentes
mecanismos celulares.
6.4 Envolvimento na maquinaria de transcrição
A ATXN3 tem capacidade de se ligar ao DNA e, por outro lado, interatua com vários
reguladores da transcrição. É por isso possível que a desregulação da transcrição
contribua para a patogénese da DMJ. As inclusões insolúveis, principalmente
nucleares, resultantes da agregação das proteínas mutadas recrutam entre outras
proteínas, ativadores e repressores da transcrição, o que indica que o envolvimento da
maquinaria de transcrição pode ocorrer de forma generalizada na patologia das
doenças de poliglutaminas. Foi detetado o sequestro de ativadores/co ativadores
transcricionais tais como TBP, CREB, CREB-binding protein (CBP) e TATA box-
binding protein-associated factor II 130 kDa (TAFII130) para as inclusões formadas
pelas proteínas contendo o segmento de poliglutamina expandido (141, 170-172, 185-
186). O sequestro de ativadores transcricionais para as inclusões formadas pelas
proteínas mutadas, pode ser de grande relevância quando estes se encontram em
quantidades limitantes na célula como acontece, por exemplo, com a CBP (171).
A ATXN3 inibe a acetilação das histonas. Contudo, quando está mutada pela
expansão de poliglutamina este mecanismo de repressão da transcrição fica alterado,
aumenta a acetilação da histona H3, aumentando também a transcrição. Este efeito foi
observado quer em células quer em material humano (143).
Em vários modelos celulares e animais DMJ foram reportadas alterações da
expressão de vários genes relacionados com a maquinaria da transcrição reforçando a
ideia da desregulação desta via nesta doença (98, 187).
Contudo, a hipótese da desregulação da transcrição como mecanismo causador da
DMJ necessita de mais investigação.
7. Estratégias terapêuticas
A doença de Machado-Joseph, tal como todas as outras doenças de poliglutaminas,
permanece sem cura. Contudo, o tratamento farmacológico e não farmacológico pode
ser utilizado nestes doentes de forma a minimizar a sintomatologia e a melhorar a sua
qualidade de vida (18, 188). Conforme está padronizado em guidelines internacionais,
aos doentes DMJ e familiares em risco deve ser oferecido aconselhamento genético.
Estes doentes devem ser informados da forma como se transmite a doença, do risco
para os seus filhos e outros membros da família, bem como, da atual impossibilidade
de tratamento curativo. Aos familiares em risco pode ser oferecida a possibilidade de
realizarem testes preditivos se assim o desejarem. Os casais que pretendem ter filhos
têm a possibilidade de realizar o diagnóstico pré-natal ou em alternativa o teste pré-
implantatorio com seleção de embriões.
Atualmente, estão disponíveis tratamentos para os diferentes sintomas da doença. Por
exemplo, na depressão podem ser utilizados antidepressivos ou em alternativa
psicoterapia comportamental. As alterações do sono devem ser estudadas por
polissonografia e tratadas em consonância. Por exemplo, no síndrome das pernas
inquietas podem ser utilizados agonista da dopamina e/ou levodopa. A dor deve ser
tratada consoante a sua etiologia, músculo-esqueletica, neuropática, devido à distonia
ou mista. O Parkinsonismo, a distonia e espasticidade podem ser tratados com
Levodopa. Como alternativa podem ser utilizados anticolinérgicos, benzodiazepinas,
baclofeno ou carbamazepina. As caimbras podem ser tratadas com magnésio,
mexiletina ou carbamazepina. A fadiga pode melhorar com tratamento farmacológico
com metilfenidato, modafinil e amantidina, ou não farmacológico, exercício físico,
educação e modificação comportamental. Os doentes podem também beneficiar de
fisioterapia e terapia da fala para avaliar e melhorar a sua disartria e disfagia. A
maioria dos doentes vão precisar de alterações em casa para assegurar a sua
segurança. A médio prazo será necessária a utilização de auxiliadores da marcha
como canadianas ou andarilhos e mais tarde cadeira de rodas.
Como é evidente, o tratamento sintomático não consegue aliviar totalmente o
sofrimento destes doentes, e por isso torna-se urgente conseguir-se um tratamento
curativo para esta doença. Há vários anos que os cientistas se empenham na
obtenção e estudo de modelos celulares e animais que melhor imitem as
características fenotípicas da DMJ com vista a encontrarem possíveis agentes
terapêuticos preventivos. Várias estratégias estão atualmente ser utilizadas em
diferentes estudos com modelos da doença.
Suportando a ideia de que o silenciamento do gene mutado pode ser uma terapêutica
efetiva nesta doença, um estudo realizado por Boy e colaboradores demonstrou que o
fenótipo de um ratinho transgénico condicional expressando o gene ATXN3 humano
mutado, foi revertido após se “desligar” a expressão da proteína mutada (189).
A técnica de silenciamento pós-transcricional de genes por RNA interference (RNAi)
permite silenciar de uma forma eficiente vários genes causadores de doenças
genéticas, através da degradação do mRNA e consequente diminuição da síntese das
respetivas proteínas mutadas (190). Foi já testada a técnica de RNAi em transcritos do
gene ATXN3 em ratos modelo conseguindo-se suprimir a ATXN3, diminuir o número
de inclusões e a degeneração (191-193). Curiosamente, o silenciamento em
simultâneo da proteína mutada e normal foi bem tolerada, o que indica que a
estratégia de suprimir a expressão do gene ATXN3 mesmo que de forma não
especifica, pode ser considerada como uma estratégia terapêutica eficaz. Contudo,
esta hipótese terá que ser melhor estudada, antes de se passar para ensaios clínicos
humanos. Adicionalmente, a técnica RNAi foi bem sucedida num modelo de ratinhos
transgénicos DMJ contendo um fragmento C-terminal ATXN3 já que conseguiu
melhorar o fenótipo motor e as anomalias patológicas mesmo quando realizada em
estadios avançados da doença (194). Contudo, um outro modelo animal em ratinho
DMJ que se aproxima mais do modelo da doença, a técnica de RNAi conseguiu
silenciar o gene no cerebelo sem que, no entanto, consiga anular o fenótipo motor
(195).
Outra estratégia que pode ser utilizada para inibir a expressão da ATXN3 mutada
utiliza um diferente tipo de moléculas, os oligomeros antisense complementares ao
mRNA, que atuam com base nas diferenças de tamanho da sequência CAG. Estas
moléculas foram já testadas em fibroblastos mostrando uma redução dos níveis da
ATXN3 in vitro (196-197).
Foi igualmente proposto, um novo método de modificação de proteínas que consiste
na remoção da repetição de poliglutaminas expandida da ATXN3 através de uma
técnica de exon skipping sem alterar a função normal da proteína (198). A vantagem
desta técnica é que mantém os níveis de mRNA e da proteína na célula, já que
apenas uma porção da proteína é retirada, mas não foi ainda avaliada a possibilidade
de modificar o fenótipo de animais DMJ (198).
Uma alternativa às técnicas referidas anteriormente são os procedimentos que
permitem o aumento da degradação da proteína mutada, por indução da autofagia ou
da via ubiquitina-proteassoma. Um éster da rapamicina, o temsirolimus, aumenta a
degradação da ATXN3, reduz o número de agregados e melhora o fenótipo motor de
um modelo da DMJ em ratinhos por aumento da autofagia (199). Outro aspeto que
suporta a indução de autofagia como terapêutica eficaz é o facto da sobreexpressão
da proteína beclina-1 aumentar a degradação da proteína ATXN3 mutada, diminuir os
agregados por ela formados e melhorar coordenação motora em modelos de ratinho
principalmente quando administrada em fases iniciais da doença (200).
Recentemente, o composto H1152, através da indução do proteassoma conseguiu
reduzir os níveis da ATXN3 mutada e mostrou capacidade de redução da morte
neuronal e do fenótipo neurológico de ratinhos DMJ (201).
Um outro estudo mostrou a possibilidade da utilização do lítio num modelo DMJ em
Drosophila (202). Este composto foi utilizado num estudo clinico fase II/III mas,
segundo os resultados publicados, não provocou alterações significativas na
progressão da doença utilizando a escala “Neurological Examination Score for the
Assessment of Spinocerebellar Ataxia” (NESSCA) após 48 semanas de estudo.
Contudo, o estudo foi limitado no tempo e em termos de amostra (62 doentes divididos
por dois grupos de estudo) (203).
À medida que o mecanismo patogénico vai sendo desvendado, outras estratégias
possíveis vão surgindo, já que certos elementos chave da patologia que participam na
formação de agregados, desregulação da transcrição, alterações da sinalização e dos
padrões de interação proteica podem ser sérios candidatos a alvos terapêuticos.
Outros candidatos a alvos terapêuticos na DMJ são também os genes modificadores
da doença. Por exemplo, sabe-se que as proteínas chaperones podem neutralizar a
toxicidade induzida por proteínas misfolded ou por agregados in vitro e in vivo e por
isso tornam-se um alvo terapêutico atrativo (149, 204-205). Por exemplo, em
Drosophila e C. elegnas foi observada diminuição da agregação da ATXN3 após
tratamento com o composto 17-(allylamino)-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG), um
inibidor da HSP90 (heat shock protein) que aumenta a expressão de várias
chaperones (206-207). Um composto análogo o 17-DMAG utilizado em ratinhos DMJ
fez com que melhorassem os aspetos motores, para além da diminuição da proteína
mutada e redução dos agregados nucleares. Contudo, embora tenha havido um atraso
do aparecimento dos défices motores em 8 semanas, o efeito protetor foi perdido às
30 semanas de vida destes ratinhos DMJ (208).
Na tentativa de diminuir a produção de fragmentos tóxicos da ATXN3 pelas calpainas,
um grupo de trabalho testou a sua inibição pela calpastatina, em modelos de ratinho
transgénico DMJ, verificando uma diminuição da toxicidade e da agregação proteica
(209). Da mesma forma, num outro modelo de ratinho DMJ quando os inibidores
endógenos das calpainas são retirados o número de agregados nucleares aumenta,
assim como, a neurodegeneração havendo agravamento do fenótipo dos animais
(182).
Outra possibilidade em estudo tem como objetivo atuar na desregulação da
transcrição, outro mecanismo alterado na DMJ, focando-se na reversão da
hipoacetilação das histonas H3/H4 em ratinhos DMJ tratados com butirato de sódio,
um inibidor da desacetilação de histonas (HDAC). Este composto consegui induzir um
atraso no aparecimento dos sintomas, aumento da sobrevida e progresso na
performance motora (210). Outro inibidor HDAC, o valproato foi testado em vários
modelos DMJ com sucesso, com a vantagem de já ser usado há várias décadas em
doentes com epilepsia e doença bipolar, sendo portanto um composto seguro e bem
tolerado (206, 211). Uma vez que, é possível que, a homeostasia do cálcio esteja
alterada na DMJ, uma outra estratégia foi analisada em ratinhos DMJ, utilizando
Dantroleno com o objetivo de estabilizar a sinalização do Ca+ intracelular, permitindo
uma melhoria do fenótipo motor e redução da perda neuronal (212). Um ativador de
canais de potássio dependentes do cálcio, o SKA-31 conseguiu, para além de
melhorar a função motora de ratinhos DMJ, corrigir as alterações na despolarização
das células Purkinje (213).
Por último, foi descrita a possibilidade da cafeína através do antagonismo dos
recetores Adenosina A2A conseguir diminuir a neuropatologia num modelo ratinho
SCA3 (214). Devido à sua administração segura os autores propõem que esta
substância possa ser implementada como medida profilática.
Os trabalhos referidos anteriormente mostram todo o esforço que nos últimos anos
tem vindo a ser aplicado no sentido de se encontrar o tratamento da DMJ. Embora
haja ainda um longo percurso a percorrer, o elevado número de trabalhos publicados
nos últimos anos e os resultados por eles revelados criaram a expectativa de que é
possível encontrar uma cura para esta doença devastadora num futuro próximo.
Qualquer fármaco que possa ser utilizado na prevenção ou tratamento da DMJ muito
provavelmente terá sucesso em outras doenças de poliglutaminas tais como a Doença
de Huntington.
Conclusão
Este ano completam-se 20 anos desde que foi descoberto o gene MJD1/ATXN3
responsável pela DMJ. A partir dessa extraordinária descoberta passou a ser possível
oferecer aos doentes a confirmação molecular do diagnóstico clínico e disponibilizar
testes preditivos aos familiares em risco. Para além disso, a descoberta da mutação
responsável pela doença, um segmento de repetições de CAGs permitiu integrar a
DMJ num leque de nove doenças neurodegenerativas designada no seu conjunto de
doenças de poliglutaminas. Esta classe, que inclui igualmente a doença de Huntington
tem sido extensivamente estudada, pela particularidade de terem por base proteínas
contendo segmentos repetitivos de glutaminas que lhes confere propriedades tóxicas e
que as leva a precipitar em inclusões neuronais. A possibilidade de haver um
mecanismo neurotóxico comum a estas doenças foi apoiada pela presença de
inclusões intracelulares em todas estas doenças. Se inicialmente parecia óbvio que os
agregados eram tóxicos, atualmente coloca-se a hipótese de estes serem um
epifenómeno ou até mesmo um processo benéfico para a célula. Na verdade, só o
cabal esclarecimento da função das proteínas envolvidas em cada uma destas
patologias e da forma como o segmento poliglutaminas pode alterar essa mesma
função vai permitir o conhecimento do mecanismo patogénico subjacente. Assim, a
ATXN3 passou a ser alvo dos mais variados estudos estruturais e de função e
atualmente sabe-se que atua como enzima de desubiquitinação participando em
mecanismo de homeostasia celular e na regulação da transcrição. Nos últimos anos,
foram criados inúmeros modelos celulares e animais na tentativa de recriarem a DMJ.
Estes modelos permitiram o reconhecimento da participação da ATXN3 em diversos
mecanismos celulares e oferecem uma oportunidade única de se testarem diversas
estratégias terapêuticas preventivas. Estas estratégias atualmente estão focadas na
tentativa de silenciar a expressão do gene mutado ou diminuir os níveis da proteína
alterada. Em alternativa, estão a ser testados agentes farmacológicos que possam
interferir nas vias celulares provavelmente envolvidas na patogénese da doença.
Por enquanto, pode ser oferecido aos doentes aconselhamento genético e apoio
psicossocial, tratamentos farmacológicos e não farmacológicos que aliviem os seus
sintomas.
Apesar do longo caminho percorrido, e dos resultados promissores entretanto obtidos
é ainda necessário ultrapassar várias etapas até que se possam iniciar ensaios clinico
em doentes DMJ. Na verdade, há uma forte esperança de que estratégias terapêuticas
bem sucedidas em qualquer uma das doenças de poliglutaminas possam ser utilizada
na prevenção/tratamento das restantes doenças dessa classe.
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Tabela 1. Lista de doenças causadas por expansão de CAGs/poliglutamina nas regiões codificantes.
Doença Modo de
Gene Locus Proteína
Tamanho da repetição CAG
transmissão normal mutada
Atrofia muscular espino-bulbar recessiva ligada ao X AR Xq13-21 receptor de androgénio 9-36 38-66
(Doença de Kennedy)
Doença de Huntington autossómica dominante HD 4p16.3 huntingtina 6-35 36-121
Atrofia dentatorubropalidoluysiana autossómica dominante DRPLA 12p13-31 atrofina-1 6-35 49-88
(Sindroma de Haw-River)
Ataxia espinocerebelosa tipo 1 autossómica dominante ATXN1 6p23 ataxina-1 6-44 39-82
Ataxia espinocerebelosa tipo 2 autossómica dominante ATXN2 12q24.1 ataxina-2 15-31 36-63
Ataxia espinocerebelosa tipo 3 autossómica dominante ATXN3 14q32.1 ataxina-3 12-44 54-86
(Doença de Machado-Joseph)
Ataxia espinocerebelosa tipo 6 autossómica dominante CACNA1A 19p13 subunidade canal cálcio 1A 4-18 21-33
Ataxia espinocerebelosa tipo 7 autossómica dominante ATXN7 13p12-13 ataxina-7 4-35 37-306
Ataxia espinocerebelosa tipo 17 autossómica dominante TBP 6q27 TATA binding protein 30-42 45-63
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer à minha família especialmente aos meus pais por todo o apoio
que me deram ao longo destes anos. Ao meu irmão, à minha cunhada Paula e sobrinha
Inês agradeço o carinho com que sempre me brindaram.
À Doutora Carolina Garrett agradeço-lhe a disponibilidade e por ter aceite a minha
orientação.
Um especial agradecimento aos meus colegas de curso ano 2008/2014 pelo excelente
ambiente que me proporcionaram durante estes 6 anos.
Ao Paulo pela compreensão e por ter estado sempre ao meu lado.
Anexos
Anexo
Normas de candidatura Revista SINAPSE
1. Os trabalhos candidatos a publicação serão inéditos, e não deverão ser enviados para
outras publicações.
2. Deverão ser remetidos por correio electrónico, em documentos anexos (attached files)
Microsoft WordTM, em qualquer versão actual.
3. Deverão ser evitados símbolos, sublinhados, palavras em maiúsculas, bolds, itálicos, notas
de topo ou de rodapé, e artifícios formais.
4. As páginas não deverão ser numeradas.
5. Deverão ser redigidos em português ou em inglês. Poderão, excepcionalmente, aceitar-se
trabalhos em francês ou espanhol.
6. Da primeira página constarão: título do trabalho, nome próprio, apelido, departamento ou
serviço, instituição, profissão, cargo, endereço, telemóvel e correio electrónico de todos os
autores.
7. A segunda página incluirá: o título do trabalho, o nome dos autores, o resumo, as palavras-
chave e o título de cabeçalho; a morada institucional e o endereço de correio electrónico a
incorporar no artigo.
8. A terceira página será a versão em inglês da segunda página, se o artigo foi redigido em
português (e vice-versa). Se o artigo for redigido em francês ou espanhol, a terceira e quarta
página serão versões em português e Inglês, respectivamente.
9. As restantes folhas incluirão as diferentes secções do trabalho. Os trabalhos originais
incluirão as seguintes secções: introdução/objectivos, metodologia, resultados,
discussão/conclusões e bibliografia. Os casos clínicos serão estruturados em introdução, caso
clínico, discussão e bibliografia. As revisões incluirão, pelo menos, introdução,
desenvolvimento, conclusões e bibliografia. Os editoriais e as cartas estarão isentos de
organização em secções. No texto das secções, a identificação institucional será evitada,
podendo ser acrescentada, se imprescindível, no fim do processo de avaliação e antes da
publicação do artigo.
10. As tabelas e figuras deverão ser enviadas em documento adicional Microsoft WordTM, uma
por página, precedidas por uma página que inclua as notas correspondentes. As figuras serão
enviadas em ficheiros GIF ou JPEG.
11. Os agradecimentos ou menções particulares constarão em página própria.
12. Os compromissos particulares ou institucionais (patrocínios, financiamentos, bolsas,
prémios) serão expressos obrigatoriamente em página adicional.
Regras para elaboração do trabalho
1. Título
Será claro e informativo, representativo do conteúdo do artigo e captando a atenção do leitor.
Não terá iniciais ou siglas, nem excederá vinte palavras. Sub-títulos genéricos ou vulgares
como “caso clínico” ou “ a propósito de um caso clínico” não serão aceites.
2. Autores e instituições
A autoria exige, cumulativamente, contribuições substanciais para:
a) concepção e desenho, ou aquisição de dados, ou análise e interpretação de dados;
b) redacção ou revisão crítica de uma parte importante do seu conteúdo intelectual;
c) responsabilidade pela aprovação da versão final. Cada um dos autores deve ter participado
suficientemente no trabalho para assumir responsabilidade pública pelo seu conteúdo. A
obtenção de financiamento, a colecção de dados ou a supervisão da equipa de investigação
não justificam a autoria. Todas pessoas designadas por autores devem cumprir os critérios;
nenhuma pessoa qualificada para autoria deve ser excluída. Membros do grupo de trabalho
(coordenadores, directores, técnicos, consultores), que não cumpram os critérios internacionais
de autoria, poderão ser listados em “agradecimentos”. O número de autores será parcimonioso,
particularmente em “Casos Clínicos”. A inclusão e compromisso do nome das instituições é da
responsabilidade dos autores.
3. Resumo
O resumo tem um limite máximo de 400 palavras. Não deve incluir abreviaturas. Deve
apresentar-se estruturado.
Originais: Introdução, Objectivos, Metodologia, Resultados e Conclusões.
Revisões: Introdução, Objectivos, Desenvolvimento e Conclusões.
Casos clínicos: Introdução, Caso Clínico e Conclusões.
O resumo será coerente com o conjunto do artigo.
4. Palavras-chave
Devem ser incluídas até seis palavras-chave, na língua original do artigo e em inglês,
preferencialmente previstas na lista do Medical Subject Headling List of the Index Medicus.
5. Cabeçalho
Versão reduzida do título, para eventuais efeitos de composição gráfica.
6. Introdução / Objectivos
Exposição, completa e sucinta, do estado actual do conhecimento sobre o tema doartigo.
Expressão clara das motivações e objectivos que levaram ao planeamento do trabalho.
7. Metodologia
Descrever os critérios de selecção do material do estudo e o desenho do mesmo. Usar
unidades internacionais. Assinalar os métodos estatísticos.
8. Resultados
Devem ser escritos os dados relevantes.
Os dados constantes de tabelas ou figuras não devem, em princípio, ser repetidos no texto. As
tabelas devem ser nomeadas em numeração romana (p. ex.: Tabela IV), por ordem de
aparecimento no texto. As figuras devem ser nomeadas em numeração árabe (p. ex.: Fig. 4.),
pela ordem de aparecimento no texto. A responsabilidade de protecção dos direitos de figuras
previamente publicadas é da responsabilidade dos autores. A publicação de fotografias de
pessoas exige a completa dissimulação da sua identidade ou uma folha assinada de
consentimento informado e parecer de uma Comissão de Ética de uma instituição pública.
9. Discussão
Não voltar a apresentar resultados, evitando redundâncias. Não mencionar dados que não
foram apresentados nos resultados. Dar-se-á relevo aos aspectos novos, reflectir sobre as
limitações e justificar os erros ou omissões. Relacionar os resultados com outros estudos
relevantes. As conclusões deverão basear-se apenas nos resultados. Poderão fazer-se
recomendações.
10. Bibliografia
As referências bibliográficas devem ser identificadas no texto através de numeração árabe,
entre parêntesis, ao nível da linha. Devem ser numeradas segundo a ordem de aparecimento
no texto. A referência deve incluir o apelido e inicial de todos os autores; se o artigo tiver mais
de seis autores, devem ser referidos apenas os três primeiros, seguindo-se a expressão et al.
Os nomes dos autores devem ser seguidos por título do artigo, abreviatura da revista segundo
as recomendações do List of Journals Indexed in Index Medicus, ano de edição, volume,
primeira e última página. As referências a livros devem incluir o título do livro, seguido do local
de publicação, editor, ano, e páginas relevantes. Se alguma referência se encontrar pendente
de publicação deverá descrever-se como “in press”. A referência a comunicações pessoais não
é aceitável.
11. Dúvidas ou casos omissos
Serão resolvidos de acordo com as normas do ICMJE (http://www.icmje.org).
