EFEITO DA CURCUMINA E DO RESVERATROL · 1 ana paula fontenele menezes efeitos da curcumina e do resveratrol em ratos com parkinsonismos experimental induzido por 6-hidroxidopamina:

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE MEDICINA CLÍNICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

ANA PAULA FONTENELE MENEZES

EFEITOS DA CURCUMINA E DO RESVERATROL EM RATOS COM

PARKINSONISMO EXPERIMENTAL INDUZIDO POR 6-HIDROXIDOPAMINA:

UM ESTUDO COMPORTAMENTAL E NEUROQUÍMICO

FORTALEZA

2012

1



PARKINSONISMOS EXPERIMENTAL INDUZIDO POR 6-HIDROXIDOPAMINA: UM

ESTUDO COMPORTAMENTAL E NEUROQUÍMICO

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências

Médicas, da Faculdade de Medicina da

Universidade Federal do Ceará, como requisito

parcial para obtenção do Título de Mestre em

Ciências Médicas. Área de concentração:

Pesquisa pré-clínica.

Orientadora: Profa. Dra. Geanne Matos de

Andrade.

FORTALEZA

2012

2

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Ciências da Saúde

M51 Menezes, Ana Paula Fontenele

Efeitos da curcumina e do resveratrol em ratos com parkinsonismo experimental

induzido por 6-Hidroxidopamina: um estudo comportamental e neuroquímico /

Ana Paula Fontenele Menezes. – 2012.

126 f. : il. color., enc. ; 30 cm.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de

Medicina, Departamento de Medicina Clínica, Programa de Pós-Graduação em

Ciências Médicas, Fortaleza, 2012.

Área de concentração: Pesquisa pré-clínica.

Orientação: Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade.

1. Doença de Parkinson. 2. Curcumina. 3. Estresse Oxidativo. 4. Depressão. I.

Título.

CDD 616.833

3



PARKINSONISMOS EXPERIMENTAL INDUZIDO POR 6-HIDROXIDOPAMINA: UM

ESTUDO COMPORTAMENTAL E NEUROQUÍMICO

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências

Médicas, da Faculdade de Medicina da

Universidade Federal do Ceará, como requisito

parcial para obtenção do Título de Mestre em

Ciências Médicas. Área de concentração:

Pesquisa pré-clínica.

Data de aprovação ___/ ___/ _____

BANCA EXAMINADORA

_____________________________________________

Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará – UFC

_____________________________________________

Profa. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana

Universiadade Federal do Ceará - UFC

Faculdade de Medicina de Juazeiro do Norte - FMJ /Universidade Estácio de Sá

_____________________________________________

Prof. Dr. André Ferrer Carvalho

Universidade Federal do Ceará – UFC

4

À Deus, que me deu a vida e a quem

tudo devo, por me proteger nessa jornada e a

Nossa Senhora por iluminar meus passos.

Aos meus pais pelo amor incondicional,

dedicação, compreensão, apoio e paciência.

Ao meu esposo, irmãos e amigos que

sempre acreditaram no meu potencial.

5

AGRADECIMENTOS

Um sonho, uma busca, uma realização... Muito a agradecer...

À Deus em primeiro lugar, por ter me protegido e iluminado durante a execução

desse trabalho assim como tem feito sempre em minha vida.

Aos meus pais, Paulo Pedro e Ana Maria, meus maiores mestres, não pelos

ensinamentos técnicos e científicos, mas sim pelo exemplo de vida, de Fé, de perseverança,

de moral, de ética e humildade. Por não terem medido esforços para que eu e meus irmãos

pudéssemos estudar, pelo constante incentivo, por terem me apoiado em todas as decisões e

por todo amor que me dedicaram.

Ao meu grande amor, meu esposo Paulo Jorge, pelo constante incentivo,

companheirismo e apoio, me ajudando nos experimentos e nos estudos, permanecendo

sempre ao meu lado, mesmo nos momentos mais difíceis. Pela dedicação, ajuda,

compreensão, cumplicidade e paciência em todos os momentos.

À Dra. Geanne Matos de Andrade, minha orientadora, que sempre foi para mim

um exemplo de pesquisadora, agradeço pela orientação valiosa, paciência, confiança, atenção,

dedicação, incentivo, compreensão e amizade, bem como, pelo incrível aprendizado e pela

oportunidade que me foi concedida.

Aos professores dos departamentos de Pós-Graduação em Ciências Médicas e

Farmacologia, em especial à Profª. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana, pelos

ensinamentos e pelo apoio na realização dos experimentos.

À amiga Marta Regina Santos do Carmo, pelos ensinamentos iniciais da minha

vida experimental, pela paciência, atenção, apoio e amizade.

À amiga Carolina Melo de Souza, pelo incrível apoio na realização dos

experimentos, pelos estudos, pela atenção, amizade sincera e companheirismo.

Às minhas queridas amigas que sempre estiveram presentes em todos momentos

do Laboratório de Neurociências e Comportamento: Analu, Julliana Catharina e Kelly Rose.

Através de vocês pude entender que amigos são os irmãos que escolhemos. Tudo isso, na

certeza que vocês estão sempre em meu coração.

Aos amigos do Laboratório de Neurociências e Comportamento: Ana Carla,

Diego, Camylla, Daniele, Rose, Patrícia, Marcos, Flávio e Neila. Agradeço pela

6

contribuição na parte experimental, pelos momentos de descontração e pela amizade que

fica.

Aos bolsistas Gerdean, Renan, Egberto, Mirlayne Olga, Júlia, Priscila, Thales e

Diego, meu agradecimento a todos vocês por terem colaborado na minha pesquisa científica,

fazendo do trabalho diário um ambiente agradável e alegre.

A todos os amigos com os quais convivi durante este tempo no Departamento de

Fisiologia e Farmacologia e que estão distribuídos pelos diversos laboratórios. Agradeço pelo

espírito de colaboração e pela amizade.

Aos técnicos dos laboratórios, Rafael, Paulo Ricardo, Matheus, Arnaldo, Vilani,

Lena, Débora e Graziely pela contribuição no trabalho, atenção e amizade.

Aos funcionários do departamento de Medicina Clínica, em especial às

secretárias da Pós-Graduação em Ciências Médicas, Ivone e Rita, pela atenção e

disponibilidade de sempre.

Às professoras Dra. Flávia Almeida Santos e Dra. Veralice Meireles Sales de

Bruin, por terem participado do meu exame de qualificação contribuindo com orientações

importantes concernentes à didática.

Aos meus irmãos. Paulo Jansen e Edgar Jefferson, pela amizade, pela

cumplicidade e por sempre acreditarem no meu potencial.

Aos meus sobrinhos, Pedro Yves e Maria Klara, pelos momentos felizes

compartilhados.

À toda minha famíla por ter suportado os momentos de ausência.

À todos os meus amigos, pela amizade e apoio em todos os momentos.

À minha Fé em Deus e grande otimismo, por ter me iluminado e guiado em

todas as decisões e ter me dado força, coragem e muita determinação em todos os

momentos.

À CAPES, pelo incentivo científico e suporte financeiro.

A todos que, de alguma forma, colaboraram direta ou indiretamente para a

execução deste trabalho. Muito obrigada!

7

“A ciência e a fé se juntam para

dizer que somos um milagre do amor e da

sabedoria de Deus. Não compreendemos

toda a nossa grandeza!

Somos, como disse Santo Irineu,

„a glória de Deus”.

Prof. Felipe Aquino

8

RESUMO

A doença de Parkinson é uma desordem neurodegenerativa caracterizada pela perda de

células dopaminérgicas no trato nigroestriatal, com uma correspondente diminuição no

conteúdo de dopamina (DA) no estriado. Diversos fatores têm sido envolvidos na

degeneração neuronal na DP incluindo, estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e

excitotoxicidade. A Curcumina é um polifenol e o Resveratrol é uma fitoalexina que têm sido

descritos como tendo propriedades antioxidantes e antiinflamatórias. O objetivo do presente

estudo foi investigar os efeitos do Resveratrol e da Curcumina sobre as alterações

comportamentais e bioquímicas induzidas pela 6-OHDA, um modelo animal de

parkinsonismo. Ratos machos Wistar (180-240g) receberam injeções de 6-OHDA (18 µg/3µl)

no estriado direito através de uma cirurgia estereotáxica e foram tratados por via intragástrica

com Curcumina (25, 50, 100 e 200 mg/kg) ou Resveratrol (5, 10 e 50 mg/kg) por quinze dias.

Não foram observadas diferenças estatísticas na atividade locomotora (teste do campo aberto)

e na função sensório-motora (teste da vibrissa) entre os grupos. A Curcumina e o Resveratrol

melhoraram a assimetria motora no teste do cilindro e a memória aversiva no teste da esquiva

passiva. Um resultado similar foi observado no teste do nado forçado, onde ambos os

antioxidantes reverteram o comportamento depressivo, assim como preveniram a redução do

conteúdo de dopamina e serotonina. Entretanto, somente o Resveratrol preveniu os déficits

apresentados pelos animais em uma versão com pistas do water maze, o aumento das rotações

contralaterais no teste da apomorfina e a perda de neurônios dopaminérgicos no estriado e

substância negra. Os resultados demonstraram efeitos neuroprotetores do Resveratrol, mas

somente efeitos parciais foram observados após o tratamento com Curcumina. Dessa forma, o

presente estudo fornece suporte para os efeitos benéficos dos antioxidantes como adjuvantes

do tratamento da Doença de Parkinson.

Palavras-chave: Doença de Parkinson. Curcumina. Resveratrol. Estresse Oxidativo.

Monoaminas. Comportamento motor. Depressão. Memória.

9

ABSTRACT

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder characterized by

dopaminergic cell loss in the nigrostriatal tract, with at corresponding decrease in striatal

dopamine (DA) content. Several factors have been involved in neuronal degeneration

including oxidative stress, mithocondrial dysfunction and excitotoxicity. Curcumin is a

polyphenol and Resveratrol is a phytoalexin that have been reported to have antioxidant and

antiinflammatory properties. In the present study, the effects of Curcumin and Resveratrol on

behavioral and biochemical alterations induced by 6-OHDA, an animal model of

Parkinsonism, were investigated. Male Wistar rats (180-240g) received stereotaxic injections

of 6-OHDA (18 µg/3µl) into the right striatum and were intragastrically treated with

Curcumin (25, 50, 100 and 200 mg/kg) or Resveratrol (5, 10 and 50 mg/kg) for fifteen days.

No differences were observed in locomotor activity (open field test) and in sensoriomotor

function (vibrissae test) between groups. Curcumin and Resveratrol improved 6-OHDA-

induced motor asymmetry in the cylinder test and aversive memory deficits in the passive

avoidance test. A similar result was observed in forced swim test where both antioxidants

reversed the depressive behavior, as well as prevented the reduction of dopamine and

serotonin contents. However, only Resveratrol prevented the 6-OHDA-induced impairment of

the performance in a cued version of water maze, the increase of contralateral rotations, after

the apomorphine challenge and DA neurons loss in both the striatum and SN. These results

demonstrate neuroprotective effects of Resveratrol, but only a partial protection by Curcumin.

Taken together, our study support a potential neural basis for the beneficial effect of

antioxidants as adjuvants treatment for Parkinson‟s disease.

Keywords: Parkinson's disease. Curcumin. Resveratrol. Oxidative stress. Monoamines. Motor

behavior. Depression. Memory.

10

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Mudanças relacionadas a DP na atividade global do circuito motor talamocortical

nos gânglios da base .................................................................................................................20

Figura 2 – Modelos experimentais da Doença de Parkinson .................................................. 28

Figura 3 – Estrutura química da curcumina.............................................................. ................30

Figura 4 – Fórmulas moleculares do resveratrol ...................................................................... 33

Figura 5 – Animal posicionado no aperelho estereotáxico com as suturas ósseas expostas ....38

Figura 6 – Desenho Experimental 1 ......................................................................................... 40

Figura 7 – Desenho Experimental 2 ......................................................................................... 41

Figura 8 – Representação da perda parcial de receptores de neurônios dopaminérgicos

nigroestratais ............................................................................................................................. 42

Figura 9 – Animal no teste rotacional induzido por apomorfina .............................................. 42

Figura 10 – Arena do teste de campo aberto dividido em quatro quadrantes iguais ................ 43

Figura 11 – Teste da vibrissa .................................................................................................... 44

Figura 12 – Animal durante o movimento de rearing no teste do cilindro .............................. 44

Figura 13 – Teste do nado forçado ........................................................................................... 45

Figura 14 – Animal durante o teste Y-maze ............................................................................. 46

Figura 15 – Animal no aparelho esquiva passiva ..................................................................... 47

Figura 16 – Labirinto aquático sinalizado e o animal sobre a plataforma ................................ 48

Figura 17 – Efeito da curcumina no comportamento rotacional induzido por apomorfina de

ratos parkinsonianos..................................................................................................................53

Figura 18 – Efeito do resveratrol no comportamento rotacional induzido por apomorfina de

ratos parkinsonianos .................................................................................................................54

Figura 19 –Efeito da curcumina sobre a atividade locomotora (Teste do Campo aberto) em


Figura 20 – Efeito do resveratrol sobre a atividade locomotora (Teste do Campo aberto) em


Figura 21 – Efeito da curcumina sobre a atividade sensório motora (Teste da Vibrissa) em


Figura 22 – Efeito do resveratrol sobre a atividade sensório motora (Teste da Vibrissa) em

ratos parkinsonianos.................................................................................................................58

Figura 23 – Efeito da curcumina sobre a assimetria dos membros anteriores (Teste do

Cilindro) em ratos parkinsonianos............................................................................................60

11

Figura 24 – Efeito do resveratrol sobre a assimetria dos membros anteriores (Teste do

Cilindro) em ratos parkinsonianos............................................................................................61

Figura 25 – Efeito da curcumina sobre a avaliação de desespero comportamental (Teste do

Nado forçado) em ratos parkinsonianos ...................................................................................62

Figura 26 – Efeito do resveratrol sobre a avaliação de desespero comportamental (Teste do

Nado forçado) em ratos parkinsonianos ...................................................................................63

Figura 27 – Efeito da curcumina sobre a avaliação de memória operacional (Labirinto em Y)

em ratos parkinsonianos ...........................................................................................................64

Figura 28 – Efeito do resveratrol sobre a avaliação de memória operacional (Labirinto em Y)

em ratos parkinsonianos ...........................................................................................................65

Figura 29 – Efeito da curcumina sobre a avaliação de memória aversiva (Teste da Esquiva

Passiva) em ratos parkinsonianos.............................................................................................67

Figura 30 – Efeito do resveratrol sobre a avaliação de memória aversiva (Teste da Esquiva

Passiva) em ratos parkinsonianos.............................................................................................68

Figura 31 – Efeito da curcumina sobre a avaliação de memória espacial (Labirinto aquático

sinalizado) em ratos parkinsonianos.........................................................................................69

Figura 32 – Efeito do resveratrol sobre a avaliação de memória espacial (Labirinto aquático

sinalizado) em ratos parkinsonianos ........................................................................................70

Figura 33 – Efeito da curcumina sobre a imunorreatividade para tirosina hidroxilase (TH) no

estriado direito de ratos parkinsonianos....................................................................................84

Figura 34 – Efeito do resveratrol sobre a imunorreatividade para tirosina hidroxilase (TH) no

estriado direito de ratos parkinsonianos....................................................................................85

Figura 35 – Efeito da curcumina sobre a integridade neuronal no estriado direito de ratos

parkinsonianos..........................................................................................................................87

Figura 36 – Efeito da curcumina sobre a integridade neuronal no mesencéfalo de ratos

parkinsonianos.. .......................................................................................................................88

12

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Sítios das lesões estriatais unilaterais com a 6-OHDA ..........................................38

Tabela 2 – Protocolo experimental .........................................................................................39

Tabela 3 – Efeito da curcumina sobre a peroxidação lipídica em tecidos cerebrais de ratos

parkinsonianos .........................................................................................................................71

Tabela 4 – Efeito do resveratrol sobre a peroxidação lipídica em tecidos cerebrais de ratos

parkinsonianos .........................................................................................................................74

Tabela 5 – Efeito da curcumina sobre a dosagem de nitrito/nitrato em tecidos cerebrais de


Tabela 6 – Efeito do resveratrol sobre a dosagem de nitrito/nitrato em tecidos cerebrais de


Tabela 7 – Efeito da curcumina sobre a determinação da concentração da glutationa reduzida

em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos ..........................................................................75

Tabela 8 – Efeito do resveratrol sobre a determinação da concentração da glutationa reduzida


Tabela 9 – Efeito da curcumina sobre determinação da atividade da superóxido dismutase em

tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos ................................................................................77

Tabela 10 – Efeito do resveratrol sobre determinação da atividade da superóxido dismutase


Tabela 11 – Efeito da curcumina na concentração de monoaminas em tecido estriatal direito

(lesionado) de ratos submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA ...............................................80

Tabela 12 – Efeito da curcumina na concentração de monoaminas em tecido estriatal esquerdo

de ratos submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA ..................................................................80

Tabela 13 – Efeito da curcumina na concentração de monoaminas em tecido mesencefálico de

ratos submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA .......................................................................80

Tabela 14 – Efeito do resveratrol na concentração de monoaminas em tecido estriatal direito

(lesionado) de ratos submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA ...............................................81

Tabela 15 – Efeito do resveratrol na concentração de monoaminas em tecido estriatal

esquerdo de ratos submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA ...................................................81

Tabela 16 – Efeito do resveratrol na concentração de monoaminas em tecido mesencefálico de

ratos submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA .......................................................................82

13

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

5-HT - Serotonina

6-OHDA -6-hidroxidopamina

ACM - Área cingulato-motora

ANOVA - Análise de variância

ATP - Adenosina trifosfato

AVC – Acidente vascular cerebral

BDNF - Fator neurotrófico derivado do cérebro

CEPA - Comissão de Ética em Pesquisa Animal

Cetrami - Centro de Tratamento dos Movimentos Involuntários

CM - Núcleo do tálamo centromediano

COBEA - Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

COMT - enzima catecol O-metiltransferase

D1 - Receptor de dopamina do tipo 1

D2 - Receptor de dopamina do tipo 2

DA - Dopamina

DAT - Transportador de dopamina

DMSO - Dimetilsulfóxido

DNA - Ácido desoxirribonucléico

DOPAC - Ácido dihidroxifenilacético

DP - Doença de Parkinson

EPM - Erro padrão da média

ERNs – Espécies reativas de nitrogênio

EROs - Espécies reativas do oxigênio

FDA - Food and Drug Administration (USA)

FO - Falso-operado

GABA - Ácido γ-amino butírico

GSH - Glutationa reduzida

GSH-Px – Glutationa peroxidase

H2O2 - Peróxido de hidrogênio

HPLC - Cromatografia líquida de alta performance

i.c.v. - Intracerebroventricular

i.p. - Intraperitoneal

i.v. - Intravenoso

http://www.fda.gov/

14

IL-1 – Interleucina 1

IL-6 – Interleucina 6

LPS - Lipopolisacarídeo

M1- Córtex motor primário

MAO – Monoamina oxidase

MAS - Área motora suplementar

MDA - Malonodialdeído

min - minuto

MPP+ - 1-metil- 4- fenilpiridina

MPTP - 1-metil- 4- fenil-1,2,3,6 – tetraidropiridina

NA - Noradrenalina

NE - Norepinefrina

NMDA - N-metil-D-aspartato

NF-kappaB - Fator de transcrição NF-KB

NO - Óxido nítrico

NO2 - Nitrito

NO3 - Nitrato

OMS - Organização Mundial de Saúde

•OH - Radical hidroxila

Pf - Núcleo do tálamo parafascicular

PMC - Córtex pré-motor

PPN - Núcleo pedúnculo-pontino

RLs – Radicais livres

rpm – Rotações por minuto

s - segundo

SNC – Sistema nervoso central

SNpc ou SNr – Substância negra pars compacta

SOD – Superóxido dismutase

TBARS - Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TH – Tirosina hidroxilase

TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa

v.o. – Via oral

VA - Núcleo do tálamo ventral anterior

VL - Núcleo do tálamo ventrolateral

15

LISTA DE SÍMBOLOS

% - Porcentagem

µ - Micro

® - Marca registrada

α - Alfa

β - Beta

± - Mais ou menos

˂ - Menor do que

16

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 18

1.1 Doença de Parkinson .......................................................................................................... 18

1.1.1 Epidemiologia .................................................................................................................. 18

1.1.2 Fisiopatologia ................................................................................................................. 19

1.1.3 Patogênese da DP ........................................................................................................... 22

1.1.3.1 Estresse Oxidativo na DP ............................................................................................. 22

1.1.3.2 Inflamação na DP ......................................................................................................... 24

1.1.3.3 Apoptose ....................................................................................................................... 24

1.1.3.4 Metabolismo energético na DP .................................................................................... 25

1.1.4 Modelos de Doença de Parkinson in vivo ...................................................................... 27

1.1.5 Tratamentos para a Doença de Parkinson ...................................................................... 29

1.2 Curcumina .......................................................................................................................... 31

1.3 Resveratrol .......................................................................................................................... 33

1.4 Relevância e justificativa .................................................................................................... 36

2 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 37

2.1 Objetivo Geral .................................................................................................................... 37

3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 38

3.1 Animais ............................................................................................................................... 38

3.2 Drogas ................................................................................................................................. 38

3.3 Cirurgia Estereotáxica (UNGERSTEDT, 1968) ................................................................ 38

3.4 Protocolos Experimentais ................................................................................................... 40

3.5 Testes Comportamentais .................................................................................................... 41

3.5.1 Avaliação do comportamento rotacional induzido por apomorfina (UNGERSTEDT,

1976) ......................................................................................................................................... 42

3.6 Avaliação do comportamento motor .................................................................................. 44

3.6.1 Teste do Campo Aberto (Open Field) (BROADHURST, 1957) ...................................... 44

3.6.2 Teste da Vibrissa (Vibrissae-elicited forelimb placing) (SCHALLERT et al., 2002) ...... 44

3.6.3 Teste do cilindro (Limb-use asymmetry test) (SCHALLERT et al., 2002) ...................... 45

3.7 Teste do Nado forçado (Forced Swim test) (PORSOLT et al., 1978) ............................... 46

3.8 Testes de Memória.............................................................................................................. 46

3.8.1 Labirinto em Y (Y-maze) (STONE et al., 1991) ............................................................... 46

3.8.2 Esquiva passiva (Passive avoidance test) (DeNOBLE et al., 1986) ............................... 47

3.8.3 Teste do labirinto aquático com plataforma sinalizada (Cued Water Maze) (PACKARD

& McGAUGH, 1992; MIYOSHI et al., 2002) .......................................................................... 48

3.9 Avaliação do Estresse oxidativo ......................................................................................... 49

3.9.1 Determinação da peroxidação lipídica (DRAPER & HADELY,1990) ........................... 49

17

3.9.2 Dosagem de Nitrito (GREEN et al., 1982) ...................................................................... 49

3.9.3 Determinação da concentração de glutationa reduzida (GSH) (SEDLAK & LINDSAY,

1968) ......................................................................................................................................... 50

3.9.4 Determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD) (BEAUCHAMP &

FRIDOVICH, 1971) ................................................................................................................. 51

3.10 Dosagem de monoaminas e metabólitos com HPLC (AGUIAR, 2006) .......................... 51

3.12 Análise Estatística ............................................................................................................ 53

4 RESULTADOS ..................................................................................................................... 54

4.1 Efeito da curcumina e do resveratrol no comportamento rotacional induzido por

apomorfina de ratos parkinsonianos ......................................................................................... 54

4.2 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a atividade locomotora (Teste do Campo

aberto) em ratos parkinsonianos ............................................................................................... 56

4.3 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a atividade sensório motora (Teste da Vibrissa)

em ratos parkinsonianos ........................................................................................................... 58

4.4 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a assimetria dos membros anteriores (Teste do

Cilindro) em ratos parkinsonianos ............................................................................................ 60

4.5 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a avaliação de desespero comportamental

(Teste do Nado forçado) em ratos parkinsonianos ................................................................... 63

4.6 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a avaliação de memória operacional (Labirinto

em Y) em ratos parkinsonianos ................................................................................................ 65

4.7 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a avaliação de memória aversiva (Teste

Esquiva Passiva) em ratos parkinsonianos ............................................................................... 67

4.8 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a avaliação de memória espacial (Labirinto

aquático sinalizado) em ratos parkinsonianos .......................................................................... 70

4.9 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a peroxidação lipídica (TBARS) em tecidos

cerebrais de ratos parkinsonianos ............................................................................................. 72

4.10 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a dosagem de nitrito/nitrato (NO2/NO3) em

tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos ................................................................................. 74

4.11 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a determinação da concentração da glutationa

redutase (GSH) em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos ................................................. 76

4.12 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a determinação da atividade da superóxido

dismutase (SOD) em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos .............................................. 78

4.13 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a determinação das concentrações de

Dopamina (DA), seu metabólito (DOPAC), Noradrenalina (NE) e Serotonina (5-HT) em

tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos ................................................................................. 80

4.14 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a imunorreatividade para a tirosina

hidroxilase (TH) no estriado direito de ratos parkinsonianos................................................... 84

4.15 Efeito da curcumina sobre a integridade neuronal no estriado direito e mesencéfalo de

ratos parkinsonianos ................................................................................................................. 87

5 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 90

REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 105

ANEXO .................................................................................................................................. 129

18

1 INTRODUÇÃO

1.1 Doença de Parkinson

1.1.1 Epidemiologia

A doença de Parkinson (DP) é o distúrbio neurodegenerativo do movimento que

afeta 1% da população na faixa etária de 65 anos, com absoluta prevalência e aumentando

para 4%- 5% na população acima de 85 anos (ERIKSSEN, 2003). Trata-se da segunda

principal doença neurológica degenerativa depois da doença de Alzheimer (DA), mas ainda

não se conhece sua etiologia, nem se dispõem de tratamentos efetivos para evitar a

degeneração dopaminérgica progressiva acometida nesta doença (CHOI et al., 1993). No

Brasil a prevalência estimada da doença em pessoas com idade entre 60 e 69 anos é de

700/100 mil e entre 70 e 79 anos é de 1500/100 mil (AGUIAR et al., 2008). Além disso, 36

mil casos surgem por ano no país. Segundo o Centro de Tratamento dos Movimentos

Involuntários do Hospital 9 de Julho (Cetrami), a situação é alarmante, uma vez que muitas

das pessoas que desenvolverão a doença não terão acesso a informações esclarecedoras

(Julia Segatto, www.radiobras.gov.br/ct/2002/notas_180102). A patologia DP já ultrapassa

200.000 casos (Associação Brasil Parkinson), sendo a maior parte concentrada nas regiões

Sudeste e Sul, responsável por um total estimado de 64 mil casos (BRASIL, 2006).

Segundo a Associação Européia de Doença de Parkinson (European Parkinson

Disease Association), a estimativa é de 6,3 milhões de pessoas no mundo com DP. A idade

do aparecimento é comumente após os 60 anos de idade, mas um entre dez indivíduos é

afetado antes dos 50 anos. De acordo com as estatísticas, 1,2 milhões de pessoas na Europa

tem DP: aproximadamente 260.000 na Alemanha, 200.000 na Itália, 150.000 na Espanha,

120.000 no Reino Unido e 117.000 na França. Estudos recentes acerca da incidência da

doença apontam que ela atinge mais indivíduos brancos que negros que habitam grandes

cidades nos Estados Unidos (WILLIS et al., 2011). Alguns estudos epidemiológicos

demonstrarem ainda uma maior freqüência no sexo masculino (MENESES & TEIVE,

2003). Na Ásia, a doença parece ser menos prevalente que em países do ocidente

(MUANGPAISAN et al., 2009).

http://www.radiobras.gov.br/ct/2002/notas_180102)

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=

19

1.1.2 Fisiopatologia

A DP caracteriza-se clinicamente por tremor de repouso, acinesia, rigidez,

instabilidade e anormalidades posturais (WHITE et al., 2009; MORIGUCHI et al., 2012).

Morfologicamente, caracteriza-se por uma degeneração dos neurônios com a presença de

corpúsculos de Lewy (inclusões de proteína no citoplasma intraneural) na substancia negra

pars compacta (SNpc) e outras estruturas, tais como, no locus cerulus, núcleos da base,

hipotálamo, córtex cerebral, núcleos motores dos nervos craniais e estruturas centrais e

periféricas do sistema nervoso autonômico (SCHULZ & FALKENBURGER, 2004; PAL et

al., 2011). Os sintomas clássicos da doença de Parkinson manifestam-se após uma perda de

70-80% dos neurônios dopaminérgicos da SNpc, levando a uma grave redução nos níveis de

dopamina estriatais (LEVY et al., 2009). O diagnóstico definitivo requer tanto a identificação

desta neurodegeneração, quanto a presença dos corpúsculos de Lewy. Os corpúsculos de

Lewy encontrados nos neurônios dopaminérgicos da substância negra e em outras regiões

cerebrais contêm agregados de muitas proteínas, sendo a α-sinucleína a mais abundante

(WEINTRAUB et al., 2008).

A DP também pode ser de carater genético/hereditário, portanto existem cerca de

oito genes reconhecidos e relacionados à patologia, dos quais os mais importantes são a

parkina e a α-sinucleina. A doença genética pode ser autossômica dominante, quando ocorre

mutação do gene da α-sinucleina; ou autossômica recessiva, com mutação no gene da parkina.

O último subtipo freqüentemente surge em doentes mais jovens, com menos de 35 (trinta e

cinco) anos (NUSSBAUM & ELLIS, 2009).

Os sintomas motores da DP são o foco da farmacoterapia, contudo os sintomas

não motores, como demência, psicose, ansiedade, distúrbios de insônia, disfunção autonômica

e distúrbios do humor, podem ser os aspectos mais incapacitantes, perturbadores e não

compreendidos da doença (MACHT et al., 2005; BAGLIO et al., 2011).

A DP resulta de anormalidades primárias nos núcleos da base, uma estrutura

cerebral que atua em tarefas como a motivação crítica, planejamento motor e funções de

aprendizagem (PRESCOTT, 2009). Pois, sabe-se que os gânglios da base são parte de uma

alça fechada que conectam sequencialmente todas as áreas corticais através do corpo estriado,

globo pálido e tálamo com o córtex frontal. O córtex frontal se projeta para baixo em direção

ao nível espinhal formando circuitos. Os componentes dos gânglios da base incluem além do

http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Parkina&action=edit&redlink=1

http://pt.wikipedia.org/wiki/Alfa-sinucleina

http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Autoss%C3%B4mica_dominante&action=edit&redlink=1

http://pt.wikipedia.org/wiki/Autoss%C3%B4mica_recessiva

20

corpo estriado (caudato e putamên) e os segmentos palidais internos e externos (globo pálido

interno-GPi e externo-GPe), também o núcleo subtalâmico (NST) e a substância negra pars

reticulata (SNr) e SNpc (ROSIN et al.,2007; GALVAN et al., 2008).

As estruturas dos gânglios da base formam circuitos paralelos que são divididos

em alças motoras, associativas e límbicas, dependendo da função da área cortical envolvida

(MIDDLETON & STRICK, 2000). O estriado e NST recebem aferências glutamatérgicas de

áreas específicas do córtex cerebral ou tálamo e transferem a informação para os núcleos de

saída dos gânglios da base, que são o globo pálido interno e SNr. A projeção entre o estriado e

o GPe/SNr está dividida em duas vias separadas: uma via direta e uma via indireta, através da

intercalação do globo pálido externo e do núcleo subtalâmico. A via direta conecta

diretamente o estriado aos núcleos de saída (GPi/SNr), e age facilitando o movimento pela

desinibição do tálamo. A via indireta começa na projeção que vai do estriado ao GPe, segue

então ao NST e só depois termina nos núcleos de saída (GPi/SNr) (GALVAN et al., 2008).

Os neurônios que se projetam para o córtex, NST e tálamo utilizam o

neurotransmissor glutamato, que é conhecido por suas propriedades excitatórias no SNC, o

que resulta em um efeito excitatório na via direta. Desta forma, na via direta há uma

facilitação do movimento. Contrariamente, a projeção de neurônios no estriado e em ambos os

segmentos do globo pálido utiliza GABA, que é considerado um neurotransmissor inibitório

do SNC, resultando em efeitos inibitórios. Portanto, a via indireta inibe o movimento,

inibindo o tálamo (TEPPER et al., 2007).

Além das aferências corticais que chegam ao corpo estriado, existe outra projeção

muito importante que é a via dopaminérgica nigro-estriatal. Essa projeção se inicia nos

neurônios SNc, e termina diretamente nas projeções espinhais dendríticas dos neurônios

médios espinhosos. São esses neurônios que dão origem à via direta e à via indireta. Nessa

posição estratégica, a via nigro-estriatal é capaz de modular o afluxo de informações corticais

que chegam aos neurônios de projeção no estriado. Assim, ela pode modular a atividade das

vias direta e indireta. A dopamina é o neurotransmissor dessa via. Ela atua como

neurotransmisor excitatório aos neurônios que vão formar a via direta, ligando-se a receptores

do tipo D1. Por outro lado, a dopamina é inibitória aos neurônios que vão formar a via

indireta, ligando-se a receptores do tipo D2. Dessa forma, a via nigro-estriatal age facilitando

o movimento, já que ela ativa a via direta e inibe a via indireta (GROENEWEGEN et al.,

2003) (Figura 1).


21

Existem vários estudos acerca do papel da dopamina a nível estriatal, porém

muitos aspectos ainda não foram compreendidos. Na DP, a degeneração de neurônios

dopaminérgicos da SNpc inicia uma cascata de mudanças funcionais afetando todos os

circuitos do gânglios da base. As alterações mais relevantes afetam o núcleo de saída do

circuito, o globo pálido e a SNr, que se tornam hiperativos, levando a uma inibição excessiva

dos sistemas motores tálamo-cortical e mesencefálico. Tal hiperatividade é sustentada pela

entrada glutamatérgica acentuada que o núcleo de saída recebe do NST (CALABRESI et al.,

2000). A reduzida ativação dos receptores dopaminérgicos, causada pela deficiência de

dopamina, resulta na inibição reduzida dos neurônios da via indireta e na diminuição da

excitação dos neurônios da via direta. A redução da inibição da via indireta origina potente

inibição do gpe, desinibição do NST e excitação aumentada dos neurônios do GPi e da SNr.

Já a ativação diminuída da via direta causa redução de sua influência inibitória sobre o GPi e a

SNr. O resultado final é uma ativação excessiva dos neurônios de saída dos gânglios da base,

gerando excessiva inibição dos sistemas motores e ocasionando os prejuízos motores

característicos da DP (SANTENS et al., 2003) (Figura 1).

Figura 1 - Mudanças relacionadas à DP na atividade global do circuito motor talamocortical nos gânglios da

base. Setas negras indicam conexões inibitórias e setas cinza indicam conexões excitatórias. A espessura das

setas corresponde a sua atividade presumida. Abreviações: CM, núcleo do tálamo centromediano; ACM, área

cingulato-motora; Dir, via direta; D1 e D2, subtipos dos receptores de dopamina; GPe, globo pálido externo;

GPi, globo pálido interno; Indir, via indireta; M1, córtex motor primário; Pf, núcleo do tálamo parafascicular;

PMC, córtex pré-motor; PPN, núcleo pedúnculo-pontino; MAS, área motora suplementar; SNc ou SNpc,

substância negra pars compacta; SNr, substância negra pars reticulata; VA, núcleo do tálamo ventral anterior;

VL, núcleo do tálamo ventrolateral.

Fonte: GALVAN et al., 2008.

22

Os sintomas depressivos ocorrem em aproximadamente metade dos pacientes e

são uma causa significante de prejuízos funcionais (McDONALD et al., 2003). Duas teorias

apontam para a etiologia da depressão na DP, uma argumenta que ela é reativa e secundária

ao estresse psicossocial de uma doença crônica e incapacitante (COLE et al., 1996), outra que

ela é secundária a uma degeneração neuroanatômica subjacente, antes que simplesmente uma

reação ao estresse psicossocial (McDONALD et al, 2003). A depressão correlaciona-se com

mudanças na função serotoninérgica e dopaminérgica e com a neurodegeneração de vias

corticais e subcorticais específicas (BLANDINI et al., 2000). Possivelmente, os sintomas

depressivos iniciais no curso da DP relacionam-se a um declínio cognitivo mais rápido

(STARKSTEIN et al., 1990a) e a um risco elevado do desenvolvimento de demência

(HUGHES et al., 2000). Por outro lado, o prejuízo cognitivo associa-se a um risco aumentado

do desenvolvimento de depressão (LIMA et al., 2012) e já foi observado que a combinação

demência e depressão correlaciona-se com uma diminuição do metabólito da dopamina nos

pacientes com DP (POLETTI & BONUCCELLI, 2012).

1.1.3 Patogênese da DP

Vários fatores têm sido implicados na patogênese da morte celular na DP. A

origem da degeneração neuronal é desconhecida e provavelmente envolve diversos eventos

celulares e moleculares, incluindo aumento do estresse oxidativo, acúmulo de proteínas

alteradas, excitotoxicidade, processo inflamatório, mecanismos pró-apoptóticos e disfunção

mitocondrial (NUSSBAUM & ELLIS, 2009).

1.1.3.1 Estresse Oxidativo na DP

Na estrutura dos átomos e das moléculas, os elétrons associam-se normalmente

em pares. Definem-se radicais livres (RLs) espécies altamente reativas que contêm um ou

mais elétrons não pareados. Em sistemas biológicos os RLs gerados a partir de oxigênio e

nitrogênio são classificados como espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de

nitrogênio (ERNs). EROs e ERNs são produzidas fisiologicamente devido ao metabolismo

celular e desempenham importantes papéis em processos de sinalização celular, apoptose,

expressão gênica e transporte iônico. Os níveis de RLs são controlados por antioxidantes que

podem agir de maneira direta, atuando como limpadores, ou de maneira indireta através do

aumento da expressão de enzimas antioxidantes (VALKO, 2007; LÜ et al., 2010).

23

Recentemente, o estresse oxidativo tem sido discutido como um importante

contribuinte na patologia das doenças neurodegenerativas (CHEN et al., 2009; TANSEY &

GOLDBERG, 2010). Uma das idéias relacionadas à patogênese da doença de Parkinson

baseia-se na formação de EROs e conseqüente início de estresse oxidativo, levando à lesão na

substancia nigra pars compacta (SNpc) (PAL et al., 2011).

As evidências que dão suporte ao envolvimento de estresse oxidativo na

patogênese da DP incluem alterações na quantidade de ferro no cérebro (GRUNBLATT et al.,

2004), que produz a formação de EROs quando está numa forma reativa; deficiência no

funcionamento mitocondrial, particularmente no complexo I da cadeia respiratória, alterações

nos sistemas protetores antioxidantes do cérebro, notadamente na superóxido dismutase

(SOD) e glutationa reduzida (GSH) (PEARCE et al., 1997), além de evidências de dano

oxidativo a lipídeos, proteínas e DNA (KNEKT, 1996).

Modelos experimentais de parkinsonismo com toxinas que inibem a função

mitocondrial foram a primeira indicação da existência de uma disfunção mitocondrial na DP.

Os genes mutantes ligados ao parkinsonismo promovem alteração na estrutura ou na função

de proteínas que estão direta ou indiretamente relacionadas à função mitocondrial (GODEIRO

JUNIOR et al., 2007).

A DP é uma doença neurodegenerativa que se associa com níveis aumentados de

metais no cérebro. Altos níveis de ferro vistos durante autópsias de pacientes associam-se

com degeneração nigral na DP e correlacionam-se com a gravidade das alterações

neuropatológicas (GOTZ et al., 2004). Deve ser lembrado que embora um aumento no ferro

possa sinalizar um papel primário do estresse oxidativo na DP, alternativamente esse aumento

pode ser uma conseqüência do seqüestro pelos eosinófilos dos agregados de proteínas.

O ferro tem sido implicado na promoção da agregação da -sinucleína tanto

diretamente quanto via aumento do estresse oxidativo, sugerindo um papel importante para

este na formação dos corpos de Lewy (KAUR & ANDERSEN, 2004). Os esforços para

explicar os mecanismos que levam à morte seletiva dos neurônios dopaminérgicos, têm sido

focados nas conseqüências da oxidação da dopamina (DA). Assume-se que o estresse

oxidativo desempenha um importante papel na causa da DP. Em cultura de células PC12 a

DA é tóxica via estresse oxidativo, o que leva a apoptose (HATTORIA et al., 2009), e deve

ser entendido que a desaminação metabólica da DA e seu metabólito metilado pela MAO

24

resulta na formação de peróxido de hidrogênio (H2O2). Além disso, a oxidação da DA

acompanha-se da inativação da tirosina hidroxilase (TH), enzima envolvida na síntese desta

(XU et al., 1998) e isso pode explicar a inativação da parkina pela DA (LaVOIE et al., 2005).

Atualmente existem vários estudos que tentam explicar os mecanismos que levam

à morte seletiva dos neurônios dopaminérgicos: o foco relaciona-se com as conseqüências da

oxidação da DA, tornando assim o estresse oxidativo relevante na DP.

1.1.3.2 Inflamação na DP

A degeneração dos neurônios dopaminérgicos na DP associa-se com uma grande

atividade microglial (McGEER et al., 1988), a qual pode ser conseqüência da morte neuronal

ou pode refletir uma participação ativa da microglia no processo neurodegenerativo. Se essa

ativação microglial protege ou exacerba a perda neuronal ainda é assunto de debate (HIRSCH

et al., 2003), embora a maioria das evidências sugerem que ela exerce efeitos tóxicos para os

neurônios.

Vários estudos em humanos e usando modelos experimentais mostram uma

participação ativa da inflamação na DP (HIRSCH & HUNOT, 2009), Blum-Degen e

colaboradores (1995) mostraram um aumento nos níveis de citocinas (IL-1 e IL-6) no estriado

de pacientes com DP. Outros evidenciaram uma ativação microglial no cérebro destes

pacientes (TANSEY & GOLDBERG, 2010).

Estudos usando modelos experimentais mostram que a ativação microglial

induzida por LPS, com aumento na expressão de iNOS, leva a uma degeneração

dopaminérgica (ARIMOTO & BING, 2003). Além disso, outros trabalhos evidenciaram uma

diminuição dos riscos de desenvolvimento da DP em usuários regulares de drogas

antiinflamatórias não-esteroidais (CHEN et al., 2003).

1.1.3.3 Apoptose

A apoptose tem sido implicada em várias doenças neurodegenerativas como um

importante fator que contribui significativamente para a morte neuronal (BREDESEN, 2004).

O mecanismo celular de apoptose é marcado por alterações na permeabilidade da

membrana mitocondrial onde há formação de um canal de alta condutância com perda do

potencial para a fosforilação oxidativa; há extravasamento de citocromo c para o meio

25

intracitoplasmático; ativação de uma série de substâncias serino-proteases como as caspases,

transglutaminases, endonucleases e fosfatidilserina/trombospondina. O processo implica na

fragmentação da cromatina e das organelas com posterior clivagem das mesmas. Os

corpúsculos apoptóticos formados são fagocitados por macrófagos, que reconhecem suas

sinalizações (DAMIANI, 2004).

As caspases são proteases, conhecidas por estarem envolvidas na apoptose. Foram

descobertos mais de 14 tipos de caspases no tecido nervoso dos mamíferos, elas podem agir

como iniciadoras da apoptose, executoras da apoptose ou como mediadores inflamatórios,

dependendo do tipo de caspase. A ativação das caspases pode ser observada em várias

doenças como no trauma (caspase-3), na DP (caspase-3) e na DA (caspase-3 e caspase 9)

(WALDMEIER & TATTON, 2004).

A mitocôndria atua como um regulador central da via intrínseca da apoptose, além

disso, também pode amplificar e mediar a via extrínseca. A mitocôndria tem um papel

“chave” na integração e propagação dos sinais de morte originados intrinsicamente por danos

ao DNA, por estresse oxidativo, extravasamentos de proteínas e outros. A maior parte dos

sinais pró-apoptóticos é derivada da disrruptura mitocondrial originada pela perda do

potencial para fosforilação oxidativa, aumentando subitamente a permeabilidade da

membrana mitocondrial com formação de um edema com grande influxo de água para a

matriz mitocondrial e eventual ruptura da membrana. Proteínas são liberadas para o meio

intracitoplasmático (extra-mitocondrial) incluindo fator indutor da apoptose (AIF),

endonucleases (endoG) e o citocromo c, que ativa o aptossomo e, conseqüentemente, a

cascata de caspases (WALDMEIER & TATTON, 2004).

Vários estudos sugerem que o fator de necrose tumoral (TNF-α) e a ativação dos

receptores TNFR ativam a via extrínseca da indução da apoptose, e possuem um papel

importante na patogênese de algumas doenças neurodegenerativas como a DP e a DA

(WALDMEIER & TATTON, 2004).

1.1.3.4 Metabolismo energético na DP

As mitocôndrias são organelas citoplasmáticas relacionadas ao metabolismo

energético resultante de várias reações bioquímicas que ocorrem dento dela. Essa energia

produzida é que faz com que a vida dos metazoários seja possível. O ATP (trifosfato de

adenosina) mitocondrial é quem gera tal energia. Diferente de outras organelas nos animais, a

26

mitocôndria tem seu próprio genoma (DNA mitocondrial) que codifica componentes do

sistema de fosforilação oxidativa (OXPHOS). A maquinaria mitocondrial é composta de

cinco multisubunidades (complexo I–V). A fosforilação oxidativa é o processo metabólico de

síntese de ATP a partir da energia liberada pelo transporte de elétrons na cadeia respiratória

(MORAES, 1996).

Por causa do seu alto nível de atividade metabólica e estrutura complexa, as

mitocôndrias são vulneráveis a uma variedade de problemas funcionais (FEARNLEY &

LEES,1991, MULLER-HOCKER, 1992), incluindo aqueles decorrentes de mutações no

DNA nuclear e mitocondrial, uma série de fatores exógenos, como drogas, infecções,

encargos metabólicos (como obesidade ou diabetes mellitus tipo II) certos fatores da dieta, e

episódios de hipóxia cerebral. Finsterer e colaboradores (2006) enfatizaram que tecidos ou

órgãos com alta demanda de oxigênio e energia, tais como o cérebro, coração, fígado, pele,

intestino e túbulos renais, são aqueles mais afetados pelas mitocondriopatias.

Danos nas enzimas mitocondriais na cadeia transportadora de elétrons,

membranas mitocondriais ou na própria cadeia (a partir de qualquer fonte) irão interferir na

formação de ATP e mesmo levar a apoptose celular ou reduzir a sua habilidade da célula em

funcionar. Este processo de fosforilação oxidativa promove a formação de numerosos radicais

livres (espécies reativas ao oxigênio-ERO) os quais são extremamente reativos e causam

oxidação de moléculas vizinhas através da extração de um elétron. As mitocôndrias são a

principal fonte celular de ERO, particularmente os radicais superóxido que são gerados no

complexo I da cadeia transportadora de elétrons. As ERO podem atacar DNA e proteína

mitocondrial (SCHEFFER, 2001). A razão de formação de EROs pode exceder a habilidade

de enzimas como a superóxido dismutase (SOD), catalase e outros mecanismos protetores em

convertê-las para formas menos reativas ou inofensivas. O estresse oxidativo descontrolado

pode desencadear consequências que resultariam na morte celular programada (MARTIN,

2006; LANG & LOZANO, 1998).

Evidências sugerem a hipótese que o complexo I mitocondrial tem importante

papel na etiologia da DP. A atividade do complexo I está reduzida em 35–40% em

homogenatos de substância negra de pacientes da DP em estudos postmortem (SCHAPIRA et

al.,1989; SCHAPIRA et al.,1990; SCHAPIRA et al., 1990). Recentemente foi relatada a

ocorrência de uma mutação no DNA mitocondrial na forma idiopática da doença (PARKER

27

JR & PARKS, 2005) e uma redução associada da atividade do complexo I nas mitocôndrias

do córtex frontal (PATHAK & DAVEY, 2008).

A exposição crônica a inibidores do complexo I, como pesticidas, pode contribuir

para o desenvolvimento da forma idiopática da doença, no entanto, é improvável que somente

a exposição à toxina seja responsável pelo defeito seletivo no complexo I na população em

geral. Pacientes com a DP sem qualquer história de exposição a toxinas também exibem

defeitos no complexo I de plaquetas (GU et al., 1998).

1.1.4 Modelos de Doença de Parkinson in vivo

A DP tem sido amplamente estudada através de modelos experimentais que são

capazes de reproduzir a perda de neurônios dopaminérgicos. O emprego desses modelos tem

contribuído para o conhecimento sobre os mecanismos patológicos da doença. Além disso,

tem permitido o surgimento de várias hipóteses para explicar os processos neurodegenerativos

do sistema nervoso central possibilitando a pesquisa por novos agentes terapêuticos que

venham a ser úteis no tratamento dessa patologia.

Deste modo foram desenvolvidos modelos animais utilizando-se neurotoxinas

dopaminérgicas e modelos de linhagens genéticas com deleção genética para a doença.

Assim, foram introduzidos agentes que seletivamente lesam e destroem os sistemas

catecolaminérgicos tais como as toxinas 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) e

6-hidroxidopamina (6-OHDA) (DAUER & PRZEDBORSKI, 2003). Além desses, alguns

agentes químicos utilizados na agricultura como a rotenona e o paraquat, quando

administrados sistemicamente podem induzir algumas das características da DP, apesar de

serem menos reproduzíveis (SPIVEY, 2011).

O MPTP é um inibidor do complexo I mitocondrial que foi acidentalmente

descoberto após humanos serem expostos a ele e desenvolverem sintomas parkinsonianos em

poucas semanas. Ele é altamente lipofílico e atravessa facilmente a barreira hematoencefálica.

Para exercer efeitos tóxicos o MPTP deve ser convertido em MPP+ pela enzima MAO-B. O

MPP+ é então transportado para dentro dos neurônios dopaminérgicos pelo sistema

transportador de dopamina, onde inibe o sistema de transporte de elétrons do complexo I,

resultando em falha de energia na célula e na formação de ânions superóxido (EMBORG,

2004). Os animais mais freqüentemente utilizados neste modelo são os camundongos e os

28

macacos. Ratos são relativamente insensíveis à toxina (GIOVANNI et al, 1994). Esta toxina

tem a desvantagem de ser muito liposolúvel e, portanto ser tóxica para o experimentador.

A 6-OHDA é uma das neurotoxinas mais frequentemente utilizadas

experimentalmente em modelos de degeneração da substancia negra, tanto in vitro como in

vivo (SCHOBER, 2004). Ela é incapaz de atravessar a barreira hematoencefálica, sendo

necessária a administração diretamente na estrutura cerebral que se deseja lessionar. A injeção

bilateral de 6-OHDA na SNpc ou em outras regiões cerebrais provoca uma elevada destruição

neuronal, principalmente dos neurônios catecolaminérgicos. Esta droga apresenta similaridade

estrutural com as catecolaminas e tem alta afinidade pelo sistema de transporte das mesmas,

mostrando assim a sua seletividade por neurônios catecolaminérgicos. Ela produz lesões na

SNpc pela indução da produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) e EROs, como radical

hidroxil, e também pela inibição do complexo I mitocondrial (BLUM et al., 2001).

A 6-OHDA é usualmente injetada unilateralmente, enquanto o hemisfério intacto

serve como controle interno. Esta injeção unilateral representa o modelo conhecido como

“hemiparkinsoniano” (PERESE et al., 1989), que se caracteriza por um comportamento de

assimetria motora após a administração de drogas dopaminérgicas, devido ao desbalanço

fisiológico de receptores entre o corpo estriado lesionado e o não-lesionado (BETARBET et

al., 2002). Por isso, os animais apresentarão um comportamento rotacional contralateral no

sentido do hemisfério o qual a estimulação do receptor dopaminérgico for predominante. O

comportamento rotacional pode ser quantificado e correlacionado com o grau da lesão, a

maior vantagem desde modelo (BEAL, 2001).

Alguns agentes químicos empregados na agricultura, como o pesticidas rotenona e

o herbicida paraquat, quando administrados sistematicamente podem induzir algumas

características da DP, apesar dos resultados serem menos reproduzíveis. Estes compostos

atravessam facilmente a barreira hematoencefálica, pois são bastante lipossolúveis, nos

neurônios acumulam-se nas mitocôndrias, inibindo o complexo I da cadeia respiratória

mitocôndrial, provocando a morte neuronal (VON BOHLEN UND HALBACH et al., 2004).

As toxinas liposolúveis atravessam as membranas celulares e atingem diretamente

a mitocôndria tanto no complexo I como no III. O MPTP através dos transportadores de

dopamina (DAT) pode ficar acumulado nas vesículas sinápticas ou alcançar o complexo I

mitocondrial. A 6-OHDA atinge a cadeia respiratória mitocondrial, através do DAT,

induzindo um colapso na membrana mitocondrial, no complexo I da cadeia respiratória,

29

ocorre então a liberação de EROs e desacoplação da fosforilação oxidativa, gerando prejuízo

na função mitocondrial (Figura 2) (SHOBER, 2004).

Figura 2 - Modelos experimentais da Doença de Parkinson

Fonte: VON BOHLEN UND HALBACH et al., 2004.

Alguns modelos genéticos usando camundongos transgênicos já estão disponíveis,

entretanto os que usam neurotoxinas específicas conseguem reproduzir algumas

características específicas da doença. São mais simples e mais baratos e por este motivo são

mais utilizados. Agentes que alteram ou destroem o sistema catecolaminérgico, incluindo o

sistema nigroestriatal, como a 6-OHDA e o MPTP, são os mais utilizados.

1.1.5 Tratamentos para a Doença de Parkinson

Até o momento, não existe cura para a DP. As terapias atualmente disponíveis não

conseguem impedir a progressão da doença. No entanto, muitas opções de tratamento

descobertas recentemente são capazes de controlar os sintomas, levando a uma melhora

significante do controle motor tanto em estágio inicial, quanto nos estágios avançados da

doença. Porém, os tratamento disponíveis não alteram a progressão do processo

neurodegenerativo. As drogas utilizadas no tratamento da DP agem aumentando os níveis de

dopamina no cérebro ou imitando os efeitos da DA (SINGH et al., 2006).

30

O tratamento atual para a DP consiste essencialmente na reposição do precursor

da dopamina (levodopa), inibição de sua degradação ou o uso de agonistas dopaminérgicos,

contudo com a progressão da doença, observa-se uma redução da eficácia, bem como

sintomas incapacitantes não responsivos ao tratamento (EMBORG et al., 2004).

A maioria dos pacientes faz uso da levodopa, considerada o padrão ouro no

tratamento da DP. Para minimizar os efeitos indesejáveis, como flutuações na resposta

motora, confusões, alucinações e fadiga, inicialmente são usadas baixas doses e tendo

elevação gradual. Além da levodopa, drogas que são prescritas atualmente no tratamento da

DP incluem agonistas dos receptores de DA, tais como, selegilina (inibidor de MAO-B),

amantadina (anti-viral com influência na síntese da DA), inibidores de catecol-O-metil

transferase (COMT) e anticolinérgicos (NAGATSU & SAWADA, 2009).

Outra opção terapêutica seriam os agentes neuroprotetores, cuja importância está

nas suas propriedades antioxidantes, estes poderiam ser capazes de mudar o curso da doença,

barrando a neurodegeneração dopaminérgica. Muitos agentes potencialmente neuroprotetores

tem sido identificados e requerem testes clínicos (HART et al., 2009; SCHAPIRA et al.,

2006). A vitamina E, o deprenil e a nicotina vêm sendo bastante estudados (AGUIAR et al.,

2006). Agentes anti-inflamatórios, melatonina, coenzima Q10, ácido fólico, selênio, vitaminas

A, C e E são algumas substâncias promissoras e que podem contribuir para o tratamento da

DP (SINGH et al., 2006; KLIVENYI & VECSEI, 2009).

Tendo em vista a regeneração celular na medicina pretende-se descobrir novas

terapias para patologias que permanecem sem tratamento efetivo. Esta evolução é verdadeira

para a maioria das doenças neurodegenerativas. O transplante de novos neurônios no cérebro

foi realizado nas doenças de Parkinson e Huntington. O implante de tecido mesencefálico

embrionário foi testado de forma experimental e clínicas, mostrando uma eficácia limitada.

Nos dias de hoje já parece ser possível gerar neurônios funcionais dopaminérgicos ou estriatal

formados por uma variedade de células tronco, incluindo células tronco embrionárias ou

neurais, bem como células tronco pluripotentes (SCHWARZ & SCHWARZ, 2011).

As intervenções cirúrgicas para DP mostraram-se benéficas para alguns sintomas

refratários. No entanto estas cirurgias apresentam indicações específicas e um papel é limitado

como "último recurso”, devido ao custo elevado. A eficácia a longo prazo é limitada.

Recentes avanços nessa área têm levado a uma maior quantidade de procedimentos cirúrgicos.

31

Estes avanços são agora examinados com um renovado interesse devido ao advento das novas

tecnologias na forma de neurocirurgia estereotáxica, os avanços da neuroimagem e o

desenvolvimento da Estimulação Cerebral Profunda (DBS). Atualmente a DBS é a

intervenção de escolha, melhorando resultados, devido ao fato de que essa técnica é

potencialmente mais segura do que outras opções disponíveis (SCHAPIRA et al., 2006;

SINGH et al., 2007).

1.2 Curcumina

Cúrcuma é um tempero indiano derivado do rizoma da planta Curcuma longa que

tem sido utilizada na medicina Ayurvédica para tratar infecções oculares, feridas, picadas de

cobra, queimadura e acne. A Curcuma longa pertence à família Zingiberaceae e é amplamente

cultivada na Índia e em outras partes do sudeste asiático, é conhecida popularmente como

açafrão. O principal constituinte ativo da cúrcuma e um dos responsáveis por sua cor amarela

vibrante é a curcumina (HATCHER et al., 2008).

A curcumina foi isolada pela primeira vez em 1815 por Vogel e Pelleitier, obtida

na forma cristalina é identificada como 1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-1,6-heptadieno-3,5-

diona ou diferuloilmetano em 1870 e, finalmente, teve sua estrutura confirmada por Lampe

em 1910 (GOEL et al., 2008). Embora a curcumina seja o diferuloilmetano, a sua formulação

estudada também contém em menor proporção demetoxicurcumina e bisdemetoxicurcumina

(Figura 3).

Figura 3 - Estrutura química da curcumina.

Fonte: HATCHER et al, 2008.

A curcumina ou diferuloilmetano (1,7-bis(4-hidroxi-3-metoxifenil)-1,6-

heptadieno-3,5-diona) apresenta natureza polifenólica (CHEN & HUANG, 1998), seu peso

molecular é de 368,4 g/mol e fórmula molecular C21H20O6. Apresenta solubilidade em etanol,

acetona e dimetilsulfóxido (DMSO), sendo pouco solúvel em água (TONNESEN &

KARLSEN, 1985).

http://1.bp.blogspot.com/_97aJUWhciM0/TG7Y5y591JI/AAAAAAAAAM8/edW0ITOJn7c/s1600/curcumina.gif

32

Quando administrada oralmente a curcumina pode sofrer reações de

glucuronidação, sulfatação e redução no intestino formando produtos como: curcumina

glicuronido, curcumina sulfato, tetrahidrocurcumina, hexadihidrocurcumina e

hexahidrocurcumino (IRESON et al., 2001). A farmacocinética da curcumina tem sido

estudada desde os anos 70, sua excreção pela urina é insignificante sendo aproximadamente

75% da dose excretada pelas fezes (WAHLSTRÖM & BLENNOW, 1978). Dentre as razões

para a biodisponibilidade reduzida estão a baixa taxa de absorção e seu metabolismo de

primeira passagem (ANAND et al., 2007).

De acordo com autoridades em saúde como o FDA (Food and Drug

Administration) e a Organização Mundial de Saúde (OMS), a curcumina é considerada segura

(GOEL et al., 2008). Diversos estudos pré-clínicos in vitro e in vivo tanto com a

curcumina quanto com a cúrcuma têm sido realizados. Além disso, para avaliar a eficácia

terapêutica da curcumina existem mais de 40 ensaios clínicos finalizados e cerca de 30 em

andamento nas fases I e II, que demonstram suas propriedades terapêuticas. Em muitos

destes estudos além da avaliação da eficácia também foram incluídas observações

clínicas sobre possíveis efeitos adversos, fornecendo assim oportunidade para acessar com

segurança a tolerabilidade da curcumina (GOEL et al., 2008). Os resultados dos ensaios

clínicos indicaram que a curcumina em doses elevadas como 12 g/dia por via oral (v.o.) por 3

(três) meses não provocou muitos efeitos adversos, somente efeitos gastrointestinais como

diarréia e nauseas, sendo bem tolerada (AGGARWAL & SUNG, 2008).

A curcumina tem sido usada há séculos na Ásia para várias desordens

inflamatórias, infecções e doenças digestivas. Tem apresentado efeito terapêutico para

artereosclerose, hiperlipidemia, tromboembolismo, infarto do miocárdio, artrite reumatóide,

AIDS e câncer (ALI et al., 2012).

A curcumina apresenta atividade neuroprotetora em doenças neurodegenerativas

tanto pela redução da atividade inflamatória, como através da diminuição do estresse

oxidativo na doença de Creutzfeld-Jakob e na DP (WANG et al., 2010). Mansouri e

colaboradores (2012) em modelo de parkinsionismo induzido por homocisteína observaram

que a curcumina foi capaz de inibir a morte por apoptose dos neurônios da substância negra.

Em modelos induzidos por MPTP a curcumina protegeu tanto contra a neurodegeneração

dopaminérgica e inibiu ativação astrocitária in vivo como inibiu a morte neuronal suprimindo

o aumento da caspase 3 pela via c-JUNK in vitro (YU et al., 2010).

33

Em modelos de parkinsionismo em cultura de celulas SH-SY5Y a curcumina

protegeu os neurônios dopaminérgicos da toxicidade induzida pela 6-OHDA via diminuição

das espécies reativas de oxigênio, e subsequente atenuação da fosforilação de p53 e redução

da razão Bax/Bcl-2 (JAISIN et al., 2011). Tripanichkul e Jaroensuppaperch (2012)

verificaram que em modelo induzido pela injeção unilateral de 6-OHDA em camundongos a

curcumina promoveu efeito neuroprotetor, que parece ser mediado por suas propriedades

antiinflamatórias ou proteção direta de neurônios nigroestriatais, observou-se dessa maneira

redução da ativação glial induzida por injúria neuronal.

Evidenciou-se que a curcumina tem atividade inibitória em uma grande variedade

de tumores como no adenocarcinoma de mama, câncer de estômago, duodeno e cólon em

camundongos (SAMAHA et al., 1997; JAISIN et al., 2011). Essa atividade é justificada pela

indução de apoptose em células neoplásicas (NAGAI et al., 2005), além da inibição da

atividade da proteína quinase C (LIN , 2004).

Apesar da biodisponibilidade da curcumina ser limitada e sua meia-vida muito

curta já foi demonstrado em estudos clínicos sua presença nas porções mais distais do trato

gastrointestinal (HATCHER et al., 2008) e em estudos pré-clínicos quando administrada por

via oral foi evidenciada sua presença no cérebro, demonstrando sua capacidade de atravessar

a barreira hematoencefálica (BEGUM et al., 2008).

1.3 Resveratrol

O resveratrol (3, 4, 5-trihidroxi-trans-estilbeno) é uma fitoalexina de natureza

polifenólica (FRÉMONT, 2000), seu peso molecular é de 228,24 g/mol e sua fórmula

molecular C14H12O3. Está presente em mais de 70 espécies de plantas. Comumente é

encontrado em grande quantidade na casca de uva, vinho tinto e em baixas quantidades no

amendoim e em várias outras plantas (LU et al., 2008).

O composto foi identificado pela primeira vez em 1940 nas raízes de Verartum

grandiflorum O. Loes (TAKAOKA, 1940), cuja função biológica atribui-se a proteção contra

agentes potencialmente lesivos à estrutura da planta e estresse ambientais. A raiz de

Polygnum cuspidatum, erva usada na medicina popular chinesa e japonesa, também apresenta

níveis elevados de resveratrol (SOLEAS et al., 1997).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&term=%22Lin+JK%22%5BAuthor%5D

34

Quimicamente, trata-se de um composto polifenólico derivado da fenilalanina,

que contém dois aneis aromáticos com hidroxilas reativas em sua estrutura e que pode se

apresentar sob duas formas isoméricas: cis e trans-resveratrol. O processo de isomerização

ocorre pela ação da luz e o isômero trans é o principal responsável pelos efeitos biológicos do

resveratrol em mamíferos (SOLEAS et al., 1997) (Figura 4).

Figura 4 - Fórmulas moleculares do resveratrol

Fonte: SOLEAS et al., 1997.

Atualmente, muitos estudos sobre o resveratrol são direcionados aos vinhos (em

especial, ao vinho tinto) e apontam a presença da molécula nessa bebida, sob suas duas

formas isoméricas (WANG et al., 2006). O efeito do resveratrol já foi testado e apresentou

benefício na prevenção e tratamento de muitas doenças, dentre elas câncer, diabetes,

distúrbios cardiovasculares, doenças neurodegenerativas, autoimunes e metabólicas (BAUR

& SINCLAIR, 2006a).

A diversidade dos efeitos biológicos do resveratrol deriva de sua capacidade de

afetar diversos alvos moleculares. Estes alvos podem ser divididos em duas categorias:

aqueles modulados por interação física direta com o resveratrol e aqueles modulados

indiretamente, através da mudança nos níveis de expressão de diversos genes (HARIKUMAR

& AGGARWAL, 2008).

Tem sido especulado que o consumo de resveratrol na dieta pode funcionar como

antioxidante, induzir a produção de óxido nítrico, induzir a agregação plaquetária e aumentar

os níveis de HDL. Os primeiros achados do uso de extratos de uva na saúde humana datam

35

mais de 1.000 anos atrás. Na Índia, a medicina ayurvédica já prescrevia Vitis vinifera L., o

qual possui como principal componente o resveratrol, como droga cardiotônica (BHAT et al.,

2001). O resveratrol é preferencialmente produzido nas cascas das uvas maduras como

resposta à infecções fúngicas e encontra-se praticamente ausente em plantas não estimuladas.

Esse composto não é o único estilbeno envolvido na resposta às infecções, porém é o

precursor da viniferina, composto utilizado na síntese de diversos outros estilbenos (BHAT et

al., 2001).

O efeito neuroprotetor do resveratrol já foi demonstrado em modelos de lesão

cerebral com o pepitídeo β-amilóide em culturas de células PC12, atribuindo esse resultado à

sua capacidade antioxidante (JANG & SURH, 2003), à inibição de receptores glutamatérgicos

pós-sinápticos, diminuindo a excitotoxicidade glutamatérgica (GAO et al., 2009). Também

apresenta neuroproteção em modelo crônico de esclerose múltipla em camundongos

(FONSECA-KELLY et al., 2012)

O resveratrol está ganhando considerável atenção por suas propriedades

anticâncer, ele por sua atividade antiproliferativa, pode suprimir a invasão de metástases em

carcinoma hepatocelular (YU et al., 2008) e induzir apoptose (ROCCARO et al., 2008).

O resveratrol bloqueia a produção de espécies reativas de oxigênio em células

endoteliais bovinas (LU et al., 2008) e inibe a colinesterase e a agregação do peptídio beta

amilóide (JANG & SURH, 2003), além de proteger contra a cardiotoxicidade induzida por

trióxido de arsênico (ZHAO et al., 2008) e contra a apoptose (ANTONIO & DRUSE, 2008).

Finalmente já está demonstrado que o resveratrol protege contra a toxicidade

induzida por glutamato, através do aumento de sua recaptação sináptica em cultura de

astrócitos (De ALMEIDA et al., 2007). Inibe também os receptores pós-sinápticos de

glutamato (GAO et al., 2009) e protege contra o dano cerebral isquêmico (DELLA-MORTE

et al., 2009). Inibe a ativação microglial e a liberação de citocromo c em ratos isquemiados

(CSISZAR, 2011) e previne contra déficits de memória, aumentando a atividade da

acetilcolinesterase em ratos diabéticos (SCHMATZ et al., 2009). Tais efeitos podem atuar de

forma convergente com sua ação antioxidante, para reduzir o dano cerebral durante vários

tipos de injúrias e fornecem substrato para o seu uso futuro em várias doenças

neurodegenerativas.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Roccaro%20AM%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

36

1.4 Relevância e justificativa

A Doença de Parkinson é uma doença degenarativa progressiva que atinge

aproximadamente 1% da população mundial com idade acima de 65 anos. É descrita como

um distúrbio motor em que os pacientes apresentam tremor, rigidez muscular, bradicinesia,

depressão e distúrbios posturais. Além desses déficits motores pode ocorrer também

disfunção cognitiva e, em alguns casos, demência, provavelmente pelo fato de que o processo

degenerativo não se limitar aos gânglios da base, mas afetando também outras áreas de

cérebro (ZHOU et al., 2008).

Os dados recentes mostrando um aumento alarmante na incidência da DP no

Brasil (36 mil casos surgem por ano no país) estimulam a procura de novas terapias, não

somente que reduzam a perda dopaminérgica, e os conseqüentes distúrbios motores, como

também que vise diminuir as complicações associadas como a demência e a depressão. Que

agravam as complicações associadas à doença. Novas drogas estão sendo testadas, e

compostas com atividade antioxidante podem ser promissores no tratamento adjuvante, na

prevenção e/ou na inibição da progressão da DP. Assim este trabalho visou estudar os efeitos

da curcumina e do resveratrol que apresentam atividade antioxidante comprovadas sob o

ponto de vista comportamental e neuroquímico no modelo de parkinsionismo animal induzido

por 6-OHDA.

37

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Este trabalho objetivou estudar o efeito neuroprotetor da curcumina e do

resveratrol, em ratos com lesão estriatal produzida pela 6-hidroxidopamina (6-OHDA), num

modelo experimental de DP. Foram analisados os aspectos comportamentais, os efeitos

motores, sintomas depressivos, a memória, e neuroquímico, analisando o estresse oxidativo, a

liberação de monoaminas e o dano neuronal.

2.2 Objetivos Específicos

- Estudar o efeito neuroprotetor da curcumina e do resveratrol, usando o modelo

de parkinsonismo em ratos, pela injeção intra-estriatal de 6-OHDA, avaliando os efeitos sobre

a atividade motora, o comportamento depressivo e da memória;

- Estudar o efeito neuroprotetor da curcumina e do resveratrol, no modelo citado,

avaliando os efeitos na peroxidação lipídica, liberação de nitrito, glutationa redutase e

superóxido dismutase;

- Estudar o efeito da curcumina e do resveratrol, no modelo citado, avaliando a

depleção de monoaminas (HPLC) e a morte neuronal (imunohistoquímica para tirosina

hidroxilase, violeta de cresil).

38

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Animais

Foram utilizados ratos Wistar albinos (Rattus novergicus), com peso entre 180-

240 gramas, provenientes do biotério central do Campus do Pici, da Universidade Federal do

Ceará (UFC) e transferidos para o biotério setorial do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia, Faculdade de Medicina, UFC. Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas

apropriadas, forradas com raspas de madeira, com ciclo de claro/escuro de 12h/12h e

alimentados com ração padrão e água à vontade.

No que se refere aos cuidados com os animais, este estudo seguiu os princípios

éticos da experimentação animal, estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de Experimentação

Animal (COBEA). O estudo foi submetido e aprovado pela comissão de Ética em Pesquisa

Animal (CEPA) da Universidade Federal do Ceará (UFC) sob o número de registro 33/2011

(Anexo 1).

3.2 Drogas

As seguintes drogas foram utilizadas: 6-OHDA (Sigma Aldrich, USA),

Curcumina (Sigma Aldrich, USA), Resveratrol (Sigma Aldrich, USA), Quetamina (König,

Argentina), Xilazina (König, Argentina) e Apomorfina (Sigma Aldrich, USA). Os demais

reagentes foram de grau analítico.

3.3 Cirurgia Estereotáxica (UNGERSTEDT, 1968)

Os procedimentos de lesão do corpo estriado foram realizados através de cirurgia

estereotáxica. Os animais do grupo falso-operado foram submetidos aos mesmos

procedimentos cirúrgicos, no entanto, não receberam a neurotoxina 6-OHDA, sendo somente

introduzida à agulha nas mesmas coordenadas estereotáxicas, seguido de infusão de salina

estéril com ácido ascórbico a 0,1% (veículo para 6-OHDA)

Os animais foram anestesiados com xilazina (10mg/kg via intraperitoneal, i.p.) e

quetamina (50mg/kg via intramuscular, i.m.) e posicionados no aparelho estereotáxico

(Stoelting®). Foi realizada uma incisão de aproximadamente 2 cm de comprimento com um

bisturi, no alto do crânio, expondo-se as suturas ósseas cranianas, com o objetivo de localizar

o bregma (Figura 5).

39

Figura 5 - Animal posicionado no aperelho estereotáxico com as suturas ósseas expostas.

Fonte: Arquivo pessoal.

Três coordenadas de acesso ao corpo estriado foram marcadas de acordo com o

atlas de Paxinos e Watson (1984). O modelo experimental de lesão do corpo estriado foi

proposto por Ungerstedt (1968). Foram feitas perfurações nos crânios dos animais com uma

broca de baixa rotação (Dremel), permitindo entrada da seringa Hamilton com a 6-OHDA

diretamente no corpo estriado. As lesões foram feitas unilateralmente, apenas no hemisfério

direito dos animais. Os animais receberam três microinjeções de 6-OHDA na dose de 6 µg/µL

em cada sítio, perfazendo um total de 18 g/3L. Os sítios onde a lesão foi realizada

situavam-se nas coordenadas descritas na Tabela 1. Após as injeções, os animais tiveram sua

pele suturada com fio cirúrgico de algodão (AP 0,4 15x45 cm) e desinfectada com povidine.

Tabela 1 - Sítios das lesões estriatais unilaterais com a 6-OHDA.

Coordenadas estriatais 1a 2

a 3

a

Antero-posterior (A-P) + 0,5 - 0,5 - 0,9

Medio-lateral (M-L) - 2,5 - 3,0 - 3,7

Dorso-ventral (D-V) + 5,0 + 6,0 + 6,5

Fonte: PAXINOS & WATSON, 1984.

Após os testes, os animais foram subdivididos dentro dos grupos e mortos por

decaptação e tiveram as áreas cerebrais (estriado direito, estriado esquerdo e mesencéfalo)

dissecadas para a realização das análises bioquímicas e dosagem de monoaminas. Para a

análise imunohistológica, os animais foram anestesiados com xilazina (10mg/kg i.p.) e

40

quetamina (100mg/kg i.m.) e perfundidos com paraformaldeído a 4%, os cérebros foram

retirados e mantidos em paraformolaldeído tamponado over night, posteriormente preservados

em solução de sacarose a 30%. Para realização das imunohistoquímicas os cérebros foram

congelados e fatiados no criostato (20m), montados em lâminas gelatinizadas e estocados à -

20C.

3.4 Protocolos Experimentais

Os animais foram divididos em 10 (dez) grupos, cada um com 16 (dezesseis)

animais da seguinte forma (Tabela 2):

Tabela 2 - Protocolo experimental.

Grupo Tratamento

1 Salina 3 L, intrastriatal + Veículo v.o. durante 15 dias.

2 6-OHDA (18 g/3 L, intrastriatal) + Veículo, v.o., 15 dias.

3 6-OHDA (18 g/3 L, intrastriatal) + Curcumina 25 mg/kg, v.o., 15 dias.





8 Salina 3 L, intrastriatal + Curcumina 200 mg/kg, v.o., 15 dias.

9 6-OHDA (18 g/3 L, intrastriatal) + Resveratrol 5 mg/kg, v.o., 15 dias.



12 Salina 3 L, intrastriatal + Resveratrol 50 mg/kg, v.o., 15 dias.

Os animais foram submetidos à lesão nigroestriatal com injeção estereotáxica de

6-OHDA e tratados com curcumina nas doses 25, 50, 100, 200, 400 mg/kg e com resveratrol

nas doses 5, 10 e 50 mg/kg durante 15 (quinze) dias. Decorridos 15 dias após a cirurgia, todos

os animais foram submetidos a testes comportamentais. Após a realização destes testes, os

animais foram eutanaziados para a realização de testes bioquímicos e imunohistoquímicos.

41

A curcumina e o resveratrol foram dissolvidos em tampão fosfato com 6%

dimetilsulfóxido (DMSO) e administrada por via oral (v.o.), a partir de vinte e quatro horas

após a cirurgia até o 15º (décimo quinto) dia de tratamento.

3.5 Testes Comportamentais

Após 15 (quinze) dias de tratamento, os animais foram divididos em dois

grupos de 8 (oito) animais. Os animais do primeiro grupo foram submetidos aos testes para

avaliar o comportamento rotacional, atividade locomotora e assimetria dos membros

anteriores, comportamento depressivo e memória; os testes realizados foram: apomorfina,

campo aberto, vibrissa, cilindro, nado forçado, labirinto em Y e esquiva passiva

respectivamente. E os animais do segundo grupo foram submetidos aos testes para avaliar o

comportamento rotacional e a memória espacial, os testes realizados foram apomorfina e o

labirinto aquático. Os animais foram submetidos a no máximo dois testes por dia. O último

teste realizado foi o teste rotacional induzido por apomorfina.

Figura 6 - Desenho Experimental 1.Os animais sofreram a lesão estriatal pela 6-OHDA (ou foram falso-

operados) no primeiro dia e começaram a ser tratados no dia seguinte. No 16º dia os animais foram submetidos

ao teste do campo aberto e Y-maze. No 17º dia foram submetidos ao teste da vibrissa e nado forçado. No18º dia

foram submetidos ao teste do cilindro e esquiva passiva. E no 19º dia os animais foram submetidos à segunda

parte do teste da esquiva passiva e ao teste de rotacional induzido por apomorfina, sendo sacrificados e seus

cérebros dissecados ou perfundidos.

42

Figura 7 - Desenho Experimental 2.Os animais sofreram a lesão estriatal pela 6-OHDA (ou foram falso-

operados) no primeiro dia e começaram a ser tratados no dia seguinte. No 16º dia os animais foram submetidos

ao primeiro dia do treino do labirinto aquático. No 17º dia foram submetidos ao segundo dia do treino do

labirinto aquático. No18º dia foram submetidos ao terceiro dia do teste do labirinto aquático. E no 19º dia os

animais foram submetidos quarto dia do teste do labirinto aquático e ao teste de rotacional induzido por

apomorfina, sendo sacrificados e seus cérebros dissecados ou perfundidos.

3.5.1 Avaliação do comportamento rotacional induzido por apomorfina (UNGERSTEDT,

1976)

A gravidade da depleção de dopamina foi avaliada pelo comportamento

rotacional. Este é um teste sensível para lesões estriatais com extensões maiores que 80%.

(DEUMENS et al., 2002) (Figura 8).

43

Figura 8 - Representação da perda parcial de receptores de neurônios dopaminérgicos nigroestratais. O animal

roda para o lado que estiver com menos receptores devido a uma assimetria nos hemisférios cerebrais, decorrente

de uma up regulation dos receptores dopaminérgicos no lado lesionado.

Fonte: adaptado de WIETZIKOSKI, 2006.

Após 18 dias da lesão estriatal, foi injetada uma dose de 0,6 mg/kg de apomorfina

i.p. (dissolvidos em salina) em cada animal, estes foram colocados por 60 minutos em bacias

plásticas (Figura 9). O comportamento rotacional foi observado e determinado através do

monitoramento das rotações induzidas pela apomorfina, tanto no número de rotações na

direção contrária à lesão (lado contralateral), quanto no número de rotações na direção da

lesão (ipsilaterais).

Figura 9 - Animal no teste rotacional induzido por apomorfina


44

3.6 Avaliação do comportamento motor

3.6.1 Teste do Campo Aberto (Open Field) (BROADHURST, 1957)

Neste teste é possível avaliar a atividade exploratória do animal, foi usado o

modelo do Campo Aberto. O Campo aberto consiste de uma arena quadrada de acrílico preto

(50 x50 cm), iluminada com luz vermelha (Figura 3). O piso da arena é dividido em quatro

quadrados iguais. No teste os animais foram colocados na arena e deixados para explorar o

ambiente por 5 (cinco) minutos, durante este período foi registrado o número de quadrantes

atravessados pelo animal (crossings). Também foi avaliado o número de vezes que o animal

se levantou para explorar o ambiente, mantendo-se suspenso apenas pelas patas traseiras,

caracterizando o comportamento exploratório vertical (rearing) (Figura 10). Após cada

animal ser retirado a arena foi limpa com uma solução de álcool a 20% e secada com toalhas

de papel, para evitar que o cheiro de urina e fezes interferissem no teste, este procedimento foi

feito após cada teste comportamental. O ambiente foi iluminado com luz vermelha.

Figura 10 - Arena do teste de campo aberto dividido em quatro quadrantes iguais.


3.6.2 Teste da Vibrissa (Vibrissae-elicited forelimb placing) (SCHALLERT et al., 2002)

O teste avalia déficits motores dos membros afetados por lesões unilaterais. Neste

teste, seguramos gentilmente o animal pelo dorso e esfregamos as vibrissas do animal por 10

(dez) vezes de cada lado contra um anteparo, para provocar a resposta de estiramento do

membro anterior na direção do anteparo (Figura 11). Avaliamos a resposta motora a um

estímlo sensório, onde o animal não lesionado estira a pata anterior na horizontal.

45

Figura 11. Teste da vibrissa.


3.6.3 Teste do cilindro (Limb-use asymmetry test) (SCHALLERT et al., 2002)

Nesse teste foi avaliada a assimetria dos membros anteriores, que é determinada

durante o comportamento de rearing (o animal fica em pé sobre as patas posteriores –

exploração vertical). Colocamos o animal em um cilindro de acrílico (60 cm de altura e 18 cm

de diâmetro) e observamos por 5 (cinco) minutos (Figura 12). Durante o comportamento

exploratório de rearing o contato com a parede do cilindro é contado de acordo com o

membro anterior que tocar o cilindro, contralateral (membro afetado), ipsilateral (membro não

afetado) ou ambos (simultaneamente). A assimetria é calculada pela fórmula:

• Percentual ipsilateral [(ipsilateral/Total)x100];

• Percentual contralateral [(contralateral/Total)x100];

• Percentual de ambas [(ambas/Total)x100];

Figura 12. Animal durante o movimento de rearing no teste do cilindro.


46

3.7 Teste do Nado forçado (Forced Swim test) (PORSOLT et al., 1978)

Este modelo experimental é utilizado para o estudo da atividade depressiva

através do desespero comportamental. Neste teste, os roedores foram submetidos a um

período de nado forçado, uma situação inescapável de estresse como o objetivo de identificar

se os animais estavam com comportamento depressivo. Eles foram colocados em um cilindro

de acrílico (60 cm de altura e 23 cm de diâmetro), contendo 25 cm de água por 6 (seis)

minutos, com o primeiro minuto de adaptação e registramos o tempo de imobilização nos 5

(cinco) minutos posteriores (Figura 13). O tempo de imobilização (apenas com pequenos

movimentos que os impediam de submergir) foi registrado.

Figura 13. Teste do nado forçado.


3.8 Testes de Memória

3.8.1 Labirinto em Y (Y-maze) (STONE et al., 1991)

Esse teste avalia a memória operacional (working memory) e o aprendizado. O

labirinto em forma de Y consiste de uma caixa de acrílico (35 cm de altura, 40 cm de

comprimento e 12 cm de largura) com os três braços iguais (Figura 14). Neste teste, o animal

foi colocado em um braço e alternou espontaneamente as entradas nos outros braços durante

8 (oito) minutos. Os animais falsos operados apresentam forte tendência de alternar a entrada

nos diferentes ambientes.

Todas as entradas em cada braço foram sequencialmente anotadas, assim o

número total de entradas em cada baço, bem como a seqüência de entradas, foram registradas.

47

As informações foram analisadas para determinar o número de entrada do braço sem

repetição. Os dados foram expressos como a porcentagem de alternância nos braços sem

repetição.

O sucesso do teste é indicado pela alta taxa de alternância nos grupos controle,

indicando que os animais podem se lembrar em qual braço eles entraram por último. O

resultado é expresso em porcentagem e obtido através de uma fórmula matemática:

Figura 14. Animal durante o teste Y-maze.


3.8.2 Esquiva passiva (Passive avoidance test) (DeNOBLE et al., 1986)

O teste tem como objetivo, avaliar a memória aversiva. Após 17 (dezessete) dias

da lesão com 6-OHDA e tratamento com as drogas, os animais foram habituados ao aparelho

de esquiva passiva (Ugo Basille® 21025). O aparelho consiste de uma caixa de acrílico (48 x

22 x 22 cm), dividida em dois compartimentos separados por uma porta, um branco

(iluminado) e um preto (escuro), este tem o piso eletrificado (Figura 15).

O animal foi deixado para ambientação no aparelho durante um 1 (um) minuto, e

retirado. Após 30 (trinta) segundos o animal foi colocado novamente no compartimento

iluminado. A tendência de o animal preferir o ambiente escuro faz com que, ao passar para

este compartimento, o mesmo recebesse um choque de 1,0 mA, durante 1s, com o tempo de

latência para entrar sendo registrado, até um máximo de 300 (trezentos) segundos (treino). O

animal foi retirado e após 15 (quinze) minutos, foi colocado novamente no compartimento

claro sendo registrada a latência de entrada (memória recente). A retenção do aprendizado foi

48

testada após 24 (vinte e quatro) horas, quando os animais foram colocados no compartimento

claro e o tempo de latência para a entrada no escuro foi registrado (os animais nesta fase não

levaram choque) (memória tardia).

Figura 15. Animal no aparelho esquiva passiva.

Fonte: Ugo Basille®.

3.8.3 Teste do labirinto aquático com plataforma sinalizada (Cued Water Maze)

(PACKARD & McGAUGH, 1992; MIYOSHI et al., 2002)

O teste do labirinto aquático sinalizado consiste em quatro dias de treinamento,

quatro treinos consecutivos por dia, durante os quais os animais foram colocados na piscina

(180 cm de diâmetro e 60 cm de profundidade) de frente para a parede da piscina, permitindo

que nadem livremente para uma plataforma de escape, transparente, de acrílico (11 cm × 14

cm) submersa 2 (dois) cm na água turva. Presa no topo da plataforma e saliente a água é

colocada uma bola de 7 (sete) cm de diâmetro (Figura 16). Além disso, nesta versão modifica-

se a posição da plataforma em cada treino do dia, variando de acordo com o quadrante. Se o

animal não encontrar a plataforma durante um período de 60 (sessenta) segundos este é

gentilmente guiado para a plataforma e permanece lá por 20 (vinte) segundos e depois

removido da piscina por 30 (trinta) segundos antes de ser colocado na próxima posição inicial

aleatória. O tempo de latência para encontrar o local da plataforma é registrado em todos os

treinos, nos quatro dias.

49

Figura 16. Labirinto aquático sinalizado e o animal sobre a plataforma.


3.9 Avaliação do Estresse oxidativo

3.9.1 Determinação da peroxidação lipídica (DRAPER & HADELY,1990)

A atividade antioxidante foi medida pela dosagem das substâncias reativas ao

ácido tiobarbitúrico (TBARS). Os tecidos mesencefálicos e estriatais foram homogeneizados

a 10% em tampão fosfato 50 mM (pH 7,4) gelado. Duzentos e cinquenta microlitros (250 µL)

do homogenato foram incubados no banho de água a temperatura de 37ºC por uma hora. Após

a incubação, 400 µL de ácido perclórico (35%) foram adicionados, para interromper a

peroxidação, e centrifugados a 12000 rotações por minuto (rpm) 4ºC por dez minutos. Em

seguida, 600 µL do sobrenadante foram retirados, e adicionados a 400 µL de ácido

tiobarbitúrico 0,6%. A mistura foi levada ao banho de água, por 30 (trinta) minutos, a uma

temperatura variável de 95 - 100ºC. A solução foi então retirada e colocada para esfriar a

temperatura ambiente. Após isso, foi feita a leitura em 532 nm. A curva-padrão foi obtida

mediante a leitura das concentrações de malonaldialdeido (MDA)-padrão.

3.9.2 Dosagem de Nitrito (GREEN et al., 1982)

O reativo de Griess (N-1-naftiletilenodiamina a 0,1% em água bidestilada,

sulfanilamida 1% em ácido fosfórico 5%) revela a presença de nitrito/nitrato (NO2/NO3) em

uma amostra (urina, plasma, homogenato tecidual) por uma reação de diazotização que forma

um cromóforo de cor róseo, com um pico de absorbância em 560 nm.

50

Para realização do ensaio foram usados 100 μL do reagente de Griess e

adicionados 100 μL do sobrenadante (amostras previamente centrifugadas) do homogenato a

10% do corpo estriado e mesencéfalo dos ratos em salina ou 100 μL μos padrões nas várias

concentrações. Para o branco foram usados 100 μL do reagente de Griess adicionados a 100

μL de salina. A leitura da absorbância foi feita em 540 nm. As leituras da absorbância dos

padrões (y) foram plotadas contra a concentração de cada padrão (x), então se determinou a

equação da reta, que foi usada para a determinação da concentração de nitrito em cada

amostra.

3.9.3 Determinação da concentração de glutationa reduzida (GSH) (SEDLAK &

LINDSAY, 1968)

A glutationa, um tripeptídeo (g-L-glutamil-L-cisteinil-glicina), existe no

organismo em suas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG), atuando direta ou

indiretamente em muitos processos biológicos importantes, incluindo metabolismo e proteção

celular. Em particular, problemas na síntese de glutationa estão associados a algumas doenças,

nas quais os níveis de glutationa e enzimas que atuam no seu metabolismo podem ser

significativos na avaliação do estresse oxidativo. Mudanças na concentração deste tripeptídeo

podem ser um indicador útil em certas desordens fisiológicas como alterações dos estados

antioxidantes.

A determinação da concentração da GSH foi realizada em placa de ELISA

(método SEDLAK & LINDSAY, 1968 modificado). Baseia-se na reação do reagente de

Ellman, o 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) com o tiol livre originando um

dissulfeto misto mais ácido 2-nitro-5-tiobenzóico. O preparo das amostras foi feito da

seguinte forma: 40µL de cada amostra (homogenato do tecido a 10% em tampão fosfato) foi

adicionada a um eppendorf + 50µL de água destilada e 10µL de TCA (ácido tricloro acético)

50%. As amostras foram centrifugadas a 3000 rpm, por 15 (quinze) minutos, à temperatura

de 4ºC. Os sobrenadantes foram separados. Adicionou-se 60µL dos sobrenadantes à placa de

ELISA (mantida resfriada), assim como os brancos. O material permaneceu resfriado durante

todo o ensaio. Imediatamente antes da leitura, a este foi adicionado o tampão fosfato p.H 7,4

+ 0,65mL de DTNB 0,01 M em metanol. Adicionou-se 102µL desta solução em cada poço da

placa. A medida do produto de reação formado foi feita a leitura da absorbância a 412 nm. A

concentração da glutationa reduzida foi expressa em μg de GSH por grama de tecido. A curva

51

padrão foi obtida mediante leitura de várias concentrações de GSH padrão (1,56; 3,12; 6,25;

12,5; 25; 50; 100) e os resultados foram expressos em µg.

3.9.4 Determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD) (BEAUCHAMP &

FRIDOVICH, 1971)

A atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) foi avaliada medindo-se sua

capacidade de inibir a redução fotoquímica do azul de nitrotetrazolio (NBT). Nesse método a

riboflavina, reduzida fotoquimicamente, gera O2-

, o qual reduz o NBT, produzindo formazam,

que absorve no comprimento de onda de 560 nm. Na presença de SOD, a redução do NBT é

inibida. 80 µL do homogenato (10% em tampão fosfato) foi centrifugado (10 minutos, 3.600

rotações por minuto-rpm, 4°C). O sobrenadante foi retirado e centrifugado novamente (20

minutos, 12.000 rpm, 4°C). Para o ensaio, foi utilizado o sobrenadante. Numa câmara escura,

foram misturados 1 mL do meio de reação (tampão fosfato 50 mM, EDTA 100 nM e L-

metionina 13 mM pH 7,8), 150 μL do NBT 75 μM, 300 μL riboflavina 2 μM e 20 μL da

amostra ou do tampão utilizado para o preparo dos homogenatos. Os tubos contendo a

solução obtida foram expostos a lâmpadas fluorescentes (15 W) por 15 minutos. Ao término

do tempo o material foi lido em espectrofotômetro 560 nm. Os resultados foram expressos em

unidades da enzima, que é a quantidade de SOD necessária para inibir a taxa de redução do

NBT em 50%.

3.10 Dosagem de monoaminas e metabólitos com HPLC (AGUIAR, 2006)

O corpo estriado e o mesencéfalo foram utilizados para preparar homogenatos a

10% respectivamente. Os tecidos cerebrais foram sonicados em ácido pérclórico (HCLO4)

por 30 segundos e centrifugados por 15 minutos em centrífuga refrigerada a 15000 rpm. O

sobrenadante foi separado e filtrado através de uma membrana (Millipore- 0,2μm) e uma

alíquota de 20μl foi retirada e injetada no equipamento de HPLC para a análise eletroquímica.

Para a análise das monoaminas, uma coluna CLC-ODS (M) com comprimento de

25cm, calibre 4,6mm e diâmetro da partícula de 3μm da (Shimadzu, Japão) foi utilizada. A

fase móvel foi composta por tampão ácido cítrico 0,163M, pH 3,0, contendo ácido

octasulfônico sódico, 0,69M (SOS), como reagente formados do par iônico, acetonitrila 4%

v/v. Dopamina (DA), ácido diidroxifenilacético (DOPAC), noradrenalina (NE) e serotonina

(5-HT) foram eletricamente detectados usando um detector amperométrico (Modelo L-ECD-

52

6A da Shimadzu, Japão) pela oxidação em um eletrodo de carbono vítreo fixado em 0,85V

relativo a um eletrodo de referência de Ag-AgCl.

Foram pesados 15,75g de ácido cítrico (Grupo Química, RJ, Brasil) e completado

para um volume de 400 mL com água puríssima (Milli-Q). Esta solução foi ajustada para pH

3,0 com hidróxido de sódio 12,5M (Reagen, RJ, Brasil). A esta solução foi adcicionado o

ácido octasulfônico sódico 75g (Sigma, MO, EUA) e completado o volume para 471,5 ml

com água Milli-Q. Em seguida, procedeu-se a filtração e degaseificação, e, posteriormente,

adicionados 20 mL de acetonitrila (Carlo Erba Reagenti. MI, Itália) e 10 ml de

tetrahidrofurano (Sigma, Mo, EUA) para um volume final de 500 ml.

Os padrões foram preparados em uma concentração final de DA, DOPAC, NE e

5-HT. A partir da área dos picos desses padrões, as concentrações das amostras foram

calculadas e os resultados expressos em ng/g de tecido.

3.11 Análise imunohistopatológica

Os animais foram perfundidos através do coração, pelo ventrículo esquerdo com

salina gelada, seguido de paraformaldeído a 4% em PBS. Os cérebros foram removidos e pós-

fixados com formol tamponado por 24 (vinte e quatro) horas, após esse período foram

armazenados em solução crioprotetora de sacarose a 30%. O tecido foi cortado (20µm) no

criostato e montado em lâminas gelatinizadas.

3.11.1 Imunohistoquímica para Tirosina Hidroxilase

A Tirosina Hidroxilase (TH) é uma enzima envolvida na síntese de dopamina e

um marcador molecular de neurônios dopaminérgicos. Na doença de Parkinson há uma

deficiência de TH, assim como baixos níveis de dopamina. A detecção imunohistoquímica foi

realizada sobre cortes estriatais e mesencefálicos. Para examinar a extensão da desnervação

presente na substância negra, a imunorreatividade a TH foi avaliada comparando o lado

lesionado e não lesionado.

Os cortes foram lavados três vezes com tampão fosfato (PBS, pH 7.4) por 5

(cinco) minutos, o bloqueio da peroxidase endógena foi feito com peróxido de hidrogênio

0,3% (H2O2) durante 10 (dez) minutos durante e depois de lavou mais 2 (duas) vezes por 5

(cinco) minutos em PBS. Foram incubados com o anticorpo primário (1:500, anti-TH;

53

“antibody produced in rabbit”, Milipore, USA) em albumina bovina 5% (BSA) durante a

noite a 4°C. No outro dia as lâminas foram lavadas 3 (três) vezes em PBS por 5 (cinco)

minutos, em seguida os cortes foram incubados com um anticorpo secundário (“biotinylated

goat anti-rabbit” IgG – ABC, Santa Cruz) por 1 (uma) hora, enxaguados novamente 3 (três)

vezes com PBS por 5 (cinco) minutos. Posteriormente os cortes foram cobertos com o

conjugado enzimático avidina/biotina (AB) durante 30 (trinta) minutos, enxaguados

novamente 3 (três) vezes com PBS por 5 (cinco) minutos, em seguida os cortes foram

incubados com um anticorpo secundário (“biotinylated goat anti-rabbit” IgG – ABC, Santa

Cruz), seguindo as especificações do fabricante. Em seguida, as lâminas foram desidratadas

em álcool (50, 70 e 100%), diafanizadas e montadas em meio à base de xilol (Entelan®), e

posteriormente examinadas.

3.11.2 Histoquímica Violeta de Cresil (BITTENCOURT, 2007)

A coloração de Nissl é uma das técnicas mais utilizadas para investigação do

sistema nervoso. Ela permite a evidenciação da substância de Nissl, material granular

constituído por DNA ribossomal, o qual se concentra principalmente no nucléolo,

possibilitando a discriminação desta estrutura celular específica. As lâminas foram

mergulhadas em água destilada durante 1 (um) minuto para posterior incubação na solução de

violeta de cresil 0,5% em ácido acético, por um período de 3 (três) minutos. Em seguida, as

lâminas foram desidratadas em álcool (50, 70 e 100%), diafanizadas e montadas em meio à

base de xilol (Entelan®), e posteriormente examinadas.

3.12 Análise Estatística

A avaliação dos testes comportamentais foi realizada utilizando o teste de

Kruskal-Wallis e, para comparação entre os grupos, foi utilizado o teste de Mann-Whitney.

Para os testes da esquiva passiva e treino do labirinto aquático também foram realizados o

teste ANOVA de medidas repetidas e, para comparações dentro dos grupos, o teste de

Bonferroni. Para avaliação dos demais resultados foi utilizada a análise de variância

(ANOVA), seguido do teste de Tukey. Em todos os testes o critério de significância de p <

0,05. Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média. O programa de

computador usado foi GraphPad Prism® 5.0.

54

4 RESULTADOS

4.1 Efeito da curcumina e do resveratrol no comportamento rotacional induzido por

apomorfina de ratos parkinsonianos

A gravidade da depleção de dopamina foi avaliada através do comportamento

rotacional no teste da apomorfina, onde observamos um aumento rotacional do grupo 6-

OHDA, no sentido contralateral, em relação ao grupo FO (nº de rotação: FO: 2,76 ± 1,07; 6-

OHDA: 249,40 ± 31,17). Não houve diferença significativa entre os grupos tratados com

curcumina nas doses 25, 50, 100 e 200 mg/kg (Figura 17).

Nos grupos tratados com resveratrol houve diferença significativa no número de

rotações contralaterais na dose de 50 mg/kg em relação ao grupo 6-OHDA (nº de rotação: 6-

OHDA + Resv50: 101,60 ± 29,92), significando uma neuroproteção (Figura 18).

Figura 17 – Teste da Apomorfina. Avaliação do comportamento rotacional induzido por apomorfina (0,6 mg/kg)

em ratos parkinsonianos tratados com curcumina 25, 50, 100 e 200 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo).

Os animais sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), a vs FO Contralateral, p<0,05. Testes de

Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os valores representam a média EPM.

FO

6-OHDA

6-OHDA+C

urc25

6-OHDA+C

urc50

6-OHDA+C

urc10

0

6-OHDA+C

urc20

0

FO +

Curc

200

0

100

200

300Ipsilateral

Contralaterala

nº

de r

ota

çõ

es /

60 m

in

55

Figura 18 - Teste da Apomorfina. Avaliação do comportamento rotacional induzido por apomorfina (0,6 mg/Kg)

em ratos parkinsonianos tratados com resveratrol 5, 10 e 50 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os

animais sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), a vs FO Contralateral e b vs 6-OHDA, p<0,05.

Testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os valores representam a média EPM.

FO

6-OHDA

6-OHDA +

Res

v5

6-OHDA +

Res

v10

6-OHDA +

Res

v50

FO+ R

esv5

0

0

100

200

300Ipsilateral

Contralateral

b

a

nº

de r

ota

çõ

es /

60 m

in

56

4.2 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a atividade locomotora (Teste do Campo

aberto) em ratos parkinsonianos

Os resultados obtidos no teste de campo aberto mostraram não haver diferenças

estatísticas significativas entre o grupo falso operado e o grupo operado na atividade

locomotora (crossing: FO: 19,76 ± 1,46; 6-OHDA: 17,53 ± 1,67) e exploratória (rearing: FO:

13,76 ± 1,30; 6-OHDA: 13,47 ± 2,52). Foi observada uma diminuição no número de crossing

e rearing nos animais parkinsonianos tratados com curcumina, na dose de 200 mg/kg

(crossing : 6-OHDA + Curc200: 9,86 ± 1,83; rearing: 6-OHDA + Curc200: 4,43 ± 2,08)

(Figura 19).

Não foi verificada diferença estatística nos animais tratados com resveratrol, nas

doses de 5, 10 e 50 mg/kg (Figura 20).

Figura 19 - Teste do Campo aberto. Avaliação da atividade locomotora em ratos parkinsonianos tratados com

curcumina 25, 50, 100 e 200 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão

intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), a vs 6-OHDA (crossing) e b vs 6-OHDA (rearing), p<0,05. Testes de

Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os valores representam a média EPM.

FO

6-OHDA

6-OHDA+C

urc25

6-OHDA+C

urc50

6-OHDA+C

urc10

0

6-OHDA+C

urc20

0

FO +

Curc

200

0

5

10

15

20

25Crossing

Rearing

a

b

nº

de e

ven

tos /

5 m

in

57

Figura 20 - Teste do Campo aberto Avaliação da atividade locomotora em ratos parkinsonianos tratados com

resveratrol 5, 10 e 50 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal com

6-OHDA (18µg/3µL).

FO

6-OHDA

6-OHDA +

Res

v5

6-OHDA +

Res

v10

6-OHDA +

Res

v50

FO+

Res

v50

0

5

10

15

20

25Crossing

Rearing

nº

de e

ven

tos /

5 m

in

58

4.3 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a atividade sensório motora (Teste da

Vibrissa) em ratos parkinsonianos

Os resultados obtidos no teste da vibrissa mostraram não haver diferenças

estatísticas significativas na atividade sensório motora ipsilateral e contralateral, entre o grupo

falso operado e o grupo parkinsoniano (nº de toques: ipsilataeral: FO: 7,86 ± 0,59; 6-OHDA:

8,83 ±0,50 e contralateral: FO: 8,79 ± 0,32; 6-OHDA: 8,00 ± 0,64). Também não foi

verificada diferença estatística entre os animais tratados com curcumina nas doses 25, 50,

100, 200 mg/kg (Figura 21).

Também não houve diferença na atividade sensório motora entre os animais

tratados com resveratrol nas doses 5, 10 e 50 mg/kg (Figura 22).

Figura 21 – Teste da Vibrissa. Avaliação sesório motora dos animais parkinsonianos tratados com curcumina 25,

50, 100 e 200 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal com 6-

OHDA (18µg/3µL).

FO

6-OHDA

6-OHDA+C

urc25

6-OHDA+C

urc50

6-OHDA+C

urc10

0

6-OHDA+C

urc20

0

FO +

Curc

200

0

2

4

6

8

10

Contralateral

Ipsilateral

nº

de t

oq

ues

59

Figura 22 - Teste da Vibrissa. Avaliação sesório motora dos animais parkinsonianos tratados com resveratrol 5,

10 e 50 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA

(18µg/3µL).

FO

6-OHDA

6-OHDA +

Res

v5

6-OHDA +

Res

v10

6-OHDA +

Res

v50

FO +

Res

v50

0

2

4

6

8

10

Contralateral

Ipsilateral

nº

de t

oq

ues

60

4.4 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a assimetria dos membros anteriores

(Teste do Cilindro) em ratos parkinsonianos

No teste do cilindro foi observada uma assimetria do grupo parkinsoniano (6-

OHDA) em relação ao grupo falso operado (FO), o que demonstra um comprometimento

motor unilateral no grupo que sofreu a lesão com a 6-OHDA (% ipsilateral: FO: 21,51 ± 4,13;

6-OHDA: 48,04 ± 8,61; % contralateral: FO: 19,90 ± 3,93; 6-OHDA: 12,34 ± 4,90 e % ambas

as patas: FO: 58,89 ± 4,32; 6-OHDA: 39,57 ± 5,23). Observou-se diferença significativa entre

o grupo controle e o grupo parkinsoniano, sendo que este último apresentou maior número de

toques ipsilaterais, e menor número de toques com ambas as patas dianteiras.

A administração de curcumina nas doses de 25 e 50 mg/kg não protegeu do

comprometimento motor fino induzido pela 6-OHDA. Observamos uma aumento

significativo da taxa de toques com ambas as patas, nos animais tratados com a dose de 100

mg/kg (% ambas as patas: 6-OHDA + Curc100: 61,74 ± 6,63) e uma porcentagem (%)

aproximada dos valores do controle (Figura 23).

Não foi verificada nos animais tratados com resveratrol, nas doses 5, 10 e 50

mg/kg e lesionados com 6-OHDA (Figura 24).

61

Figura 23 – Teste do Cilindro. Avaliação da simetria dos membros anteriores em ratos parkinsonianos tratados

com curcumina 25, 50, 100 e 200 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão

intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), a vs FO (ipsilateral), b vs FO (ambas), d vs 6-OHDA (ipsilateral), c vs

6-OHDA (ambas), e vs 6-OHDA (contralateral), p<0,05. Testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os

valores representam a média EPM.

FO

6-OHDA

6-OHDA+C

urc50

6-OHDA+C

urc10

0

6-OHDA+C

urc20

0

FO +

Curc

200

0

20

40

60

80%Ipsilateral

%Contralateral

%Ambas a

b

c

e

d

c

% n

º d

e t

oq

ues /

5 m

in

e

62

Figura 24 – Teste do Cilindro. Avaliação da simetria dos membros anteriores em ratos parkinsonianos tratados

com resveratrol 5, 10 e 50 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal

com 6-OHDA (18µg/3µL), a vs FO (ipsilateral), b vs FO (ambas), p<0,05. Testes de Kruskall-Wallis e Mann-

Whitney. Os valores representam a média EPM.

FO

6-OHDA

6-OHDA +

Res

v5

6-OHDA +

Res

v10

6-OHDA +

Res

v50

FO+ R

esv5

0

0

20

40

60

80%Ipsilateral

%Contralateral

%Ambasa

b

% n

º d

e t

oq

ues /

5 m

in

63

4.5 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a avaliação de desespero comportamental

(Teste do Nado forçado) em ratos parkinsonianos

Os animais que sofreram lesão por 6-OHDA apresentaram um aumento

significativo no tempo de imobilização, quando comparados ao grupo falso operado (FO:

45,83 ± 5,10s; 6-OHDA: 86,33 ± 12,01s), significando que os animais parkinsonianos tiveram

um comportamento depressivo.

A administração de curcumina nas doses de 100 e 200 mg/kg protegeu

significativamente os animais (6-OHDA + Curc100: 40,60 ± 6,94s; 6-OHDA + Curc200:

16,86 ± 5,76s) (Figura 25).

O resveratrol também protegeu significativamente os animais nas doses 5, 10 e 50

mg/kg (6-OHDA + Resv5: 49,50 ± 19,12s; 6-OHDA + Resv10: 29,33 ± 3,01s; 6-OHDA +

Resv50: 18,43 ± 6,31s) (Figura 26).

Figura 25 – Teste do Nafo forçado. Avaliação de ansiedade em ratos parkinsonianos tratados com curcumina 25,

50, 100 e 200 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal com 6-

OHDA (18µg/3µL), a vs FO, b vs 6-OHDA, p<0,05. Testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os valores

representam a média EPM.

FO

6-OHDA

6-OHDA+C

urc25

6-OHDA+C

urc50

6-OHDA+C

urc 1

00

6-OHDA+C

urc20

0

FO +

Curc

200

0

20

40

60

80

100

120

a

b

b

tem

po

de i

mo

bil

ização

(s)

/ 5 m

in

64

Figura 26 – Teste do Nado forçado. Avaliação de ansiedade em ratos parkinsonianos tratados com resveratrol 5,

10 e 50 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA

(18µg/3µL), a vs FO, b vs 6-OHDA, p<0,05. Testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os valores


FO

6-OHDA

6-OHDA +

Res

v5

6-OHDA +

Res

v10

6-OHDA +

Res

v50

FO +

Res

v50

0

20

40

60

80

100

120

a

b

bb

tem

po

de i

mo

bil

ização

(s)

/ 5 m

in

65

4.6 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a avaliação de memória operacional

(Labirinto em Y) em ratos parkinsonianos

No teste Y-Maze avaliamos a memória de trabalho ou memória operacional.

Observamos que os animais que sofreram lesão por 6-OHDA não apresentaram diferença

significativa na porcentagem de alternações espontâneas no labirinto em Y em relação ao

grupo falso operado (% FO: 68,81 ± 2,53; % 6-OHDA: 67,22 ± 2,88) significando que o

parkinsonismo não leva a déficit na memória operacional.

Também não foram observadas diferenças significativas entre os grupos tratados

com curcumina, nas doses 25, 50, 100 e 200 mg/kg (Figura 27), nem nos tratados com

resveratrol, nas doses 5, 10 e 50 mg/kg (Figura 28).

Figura 27 – Teste do Labirinto em Y. Avaliação da memória operacional em ratos parkinsonianos tratados com


intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL).

FO

6-OHDA

6-OHDA+C

urc25

6-OHDA+C

urc50

6-OHDA+C

urc 1

00

6-OHDA+C

urc20

0

FO +

Curc

200

0

20

40

60

80

100

% d

e a

cert

os /

8m

in

66

Figura 28 – Teste do Labirinto em Y. Avaliação da memória operacional em ratos parkinsonianos tratados com


6-OHDA (18µg/3µL).

FO

6-OHDA

6-OHDA +

Res

v5

6-OHDA +

Res

v10

6-OHDA +

Res

v50

FO +

Res

v50

0

20

40

60

80

100

% d

e a

cert

os /

8m

in

67

4.7 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a avaliação de memória aversiva (Teste

Esquiva Passiva) em ratos parkinsonianos

A avaliação da memória aversiva foi realizada através do teste da esquiva passiva,

onde observamos um déficit na memória recente e memória tardia no grupo 6-OHDA em

relação ao grupo FO (Memória recente: FO: 299,80 ± 0,00s; 6-OHDA: 100,80 ± 34,92s;

Memória tardia: FO: 219,30 ± 32,65s; 6-OHDA: 120,80 ± 32,80s).

A curcumina na dose de 200 mg/kg foi capaz de proteger os animais

parkinsonianos dos déficits observados na memória recente (6-OHDA + Curc200: 239,20 ±

38,49s) (Figura 29). Quando foi realizada a análise do desempenho dentro do grupo foi

observado que animais FO aprenderam e que os animais parkinsonianos não aprenderam tanto

na memória recente quanto tardia. Os animais tratados com curcumina (100 e 200 mg/kg)

apresentam uma melhora significativa de desempenho na memória recente (ANOVA de

medidas repetidas, Teste de Bonferroni, p<0,05).

O resveratrol na dose de 10 mg/kg foi capaz de proteger os animais

parkinsonianos dos déficits observados na memória tardia (6-OHDA + Resv10: 252,50 ±

47,50s), e na dose de 50 mg/kg foi capaz de proteger dos déficits observados tanto na

memória recente como na memória tardia (Memória recente: 6-OHDA + Resv50: 249,10 ±

34,45s; Memória tardia: 6-OHDA + Resv50: 241, 20 ± 38,88s), quando comparado ao grupo

operado (Figura 30). Os animais tratados com a dose de 5 mg/kg aprenderam, porém o

aprendizado não foi significativamente diferente do grupo parkinsoniano.

68

Figura 29 – Teste da Esquiva passiva. Avaliação da memória aversiva em ratos parkinsonianos tratados com


intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), a vs FO (memória recente), b vs FO (memória tardia) e c vs 6-OHDA

(memória recente), p<0,05. Testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os valores representam a média EPM.

FO

6-OHDA

6-OHDA+C

urc25

6-OHDA+C

urc50

6-OHDA+C

urc10

0

6-OHDA+C

urc20

0

FO +

Curc

200

0

100

200

300Treino

Memória recente

Memória tardia

ab

c

latê

ncia

(s)

69

Figura 30 – Teste da Esquiva passiva. Avaliação da memória aversiva em ratos parkinsonianos tratados com


6-OHDA (18µg/3µL), a vs FO (memória recente), b vs FO (memória tardia), c vs 6-OHDA (memória recente) e

d vs 6-OHDA (memória tardia), p<0,05. Testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os valores representam a

média EPM.

FO

6-OHDA

6-OHDA+R

esv5

6-OHDA+R

esv1

0

6-OHDA+R

esv5

0

FO +

Res

v50

0

100

200

300Treino

Memória recente

Memória tardia

b

cc

a

d

latê

ncia

(s)

70

4.8 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a avaliação de memória espacial

(Labirinto aquático sinalizado) em ratos parkinsonianos

A avaliação da memória espacial foi realizada através do teste do labirinto

aquático sinalizado (Cued Water Maze), onde observamos um déficit na memória espacial no

grupo 6-OHDA em relação ao grupo FO em todos os dias de treino (Dia 1: FO: 22,19 ± 2,03s;

6-OHDA: 37,52 ± 3,10s; Dia 2: FO: 13,88 ± 1,30s; 6-OHDA: 23,40 ± 2,22s; Dia 3: FO: 10,00

± 1,19s; 6-OHDA: 23,95 ± 2,37s; Dia 4: FO: 7,18 ± 0,60s; 6-OHDA: 16,20 ± 1,93s).

A curcumina na dose 400 mg/kg foi capaz de reverter os déficits observados na

memória espacial durante o treino do dia 2 (6-OHDA + Curc200: 16,33 ± 3,11s) (Figura 31).

O grupo tratado com resveratrol na dose de 50 mg/kg foi capaz de reverter os

déficits observados na memória espacial durante os treinos dos dias 3 e 4 (Dia 3: 6-OHDA +

Resv50: 16,14 ± 1,70s; Dia 4: 6-OHDA + Resv50: 10,18 ± 1,21s) (Figura 32).

Figura 31 – Teste do Labirinto aquático. Avaliação da memória espacial em ratos parkinsonianos tratados com

curcumina 400 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal com 6-

OHDA (18µg/3µL), a vs FO, b vs 6-OHDA, p<0,05. Testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os valores


Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 40

10

20

30

40

50

6-OHDA

a

a

aa

FO

6-OHDA + Curc400

FO + Curc400

b

latê

ncia

(s)

71

Figura 32 – Teste do Labirinto aquático. Avaliação da memória espacial em ratos parkinsonianos tratados com

com resveratrol 5, 10 e 50 mg/kg v.o. por 15 dias (n = 8 animais/grupo). Os animais sofreram lesão intraestriatal

com 6-OHDA (18µg/3µL), a vs FO, b vs 6-OHDA, p<0,05. Testes de Kruskall-Wallis e Mann-Whitney. Os

valores representam a média EPM.

Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 40

10

20

30

40

50

6-OHDA

a

a

aa

FO

6-OHDA + Resv5

6-OHDA + Resv10

6-OHDA + Resv50

FO + Resv50b

b

latê

ncia

(s)

72

4.9 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a peroxidação lipídica (TBARS) em

tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos

As tabelas abaixo mostram as concentrações de MDA nos animais que sofreram

lesão unilateral estriatal por 6-OHDA no estriado direito (lesionado), estriado esquerdo e

mesencéfalo. Nos animais parkinsonianos observamos um aumento dos níveis de MDA em

relação ao grupo FO no estriado direito, estriado esquerdo e mesencéfalo.

O tratamento com a curcumina na dose de 200 mg/kg preveniu esse aumento de

MDA nas áreas cerebrais analisadas (Tabela 3).

O tratamento com o resveratrol na dose de 50 mg/kg preveniu esse aumento de

MDA no estriado direito e no mesencéfalo (Tabela 4).

Tabela 3 - Efeito da curcumina sobre a peroxidação lipídica em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos.

Grupo Estriado Dir. Estriado Esq. Mesencéfalo

FO 11,05 ± 1,27 16,18 ± 1,90 19,47 ± 0,24

6-OHDA 16,79 ± 0,93* 22,76 ± 0,36* 23,04 ± 0,73*

6-OHDA + Curc200 mg/kg 12,48 ± 1,04# 14,67 ± 1,16# 15,66 ± 0,77#

A curcumina foi administrada na dose de 200 mg/kg, v.o. por 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os animais

sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), * vs FO, # vs 6-OHDA, p<0,05. Testes ANOVA e teste

de Tukey. Os valores representam a média EPM em µM.

73

Tabela 4 - Efeito do resveratrol sobre a peroxidação lipídica em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos.


FO 11,25 ± 0,61 10,81 ± 0,97 19,42 ± 0,30

6-OHDA 15,14 ± 0,94* 12,31 ± 0,44 21,76 ± 0,87*

6-OHDA + Resv10 mg/kg 13,10 ± 1,48 13,64 ± 1,11 17,93 ± 0,44#

6-OHDA + Resv50 mg/kg 12,13 ± 0,49# 12,74 ± 0,69 15,73 ± 1,82#

O resveratrol foi administrado nas doses de 10 e 50 mg/kg, v.o. por 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os animais



74

4.10 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a dosagem de nitrito/nitrato (NO2/NO3)

em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos

A partir a dosagem de NO2/NO3 podemos avaliar a presença de NO no tecido,

visto que estes dois são seus metabólitos. As tabelas aabaixo mostram a concentração de

NO2/NO3 dos animais que sofreram lesão unilateral estriatal por 6-OHDA no estriado direito

(lesionado), estriado esquerdo e mesencéfalo. A 6-OHDA promoveu um aumento de

nitrito/nitrato no estriado direito dos animais parkinsonianos.

O tratamento com a curcumina diminuiu, mas não de maneira significativa estes

níveis (Tabela 5).

O tratamento com o resveratrol na dose de 50 mg/kg diminuiu significativamente

os níveis de nitrito/nitrato no estriado direito e no mesencéfalo (Tabela 6).

Tabela 5 - Efeito da curcumina sobre a dosagem de nitrito/nitrato em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos.


FO 7,85 ± 0,84 6,88 ± 0,99 7,04 ± 0,97

6-OHDA 10,90 ± 1,32 6,63 ± 0,91 8,11 ± 1,58

6-OHDA + Curc200 mg/kg 9,26 ± 1,15 8,77 ± 0,54 10,98 ± 1,43


sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL). Os valores representam a média EPM em µM.

75

Tabela 6 - Efeito do resveratrol sobre a dosagem de nitrito/nitrato em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos.


FO 8,05 ± 0,57 8,9 ± 1,31 7,64 ± 0,58

6-OHDA 13,85 ± 2,05* 8,60 ± 1,33 12,18 ± 1,43*

6-OHDA + Resv10 mg/kg 10,49 ± 1,21 9,76 ± 1,39 9,33 ± 1,46

6-OHDA + Resv50 mg/kg 7,96 ± 0,95# 7,75 ± 0,85 7,77 ± 0,73#




76

4.11 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a determinação da concentração da

glutationa redutase (GSH) em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos

As tabelas abaixo mostram as concentrações de GSH dos animais que sofreram

lesão unilateral estriatal por 6-OHDA no estriado direito (lesionado), estriado esquerdo e

mesencéfalo. A 6-OHDA promoveu um aumento nos animais parkinsonianos em relação ao

grupo FO.

O tratamento com a curcumina não foi capaz de prevenir esse aumento nas áreas

cerebrais analizadas (Tabela 7).

O tratamento com o resveratrol na dose de 10 mg/kg foi capaz de prevenir esse

aumento no estriado esquerdo e no mesencéfalo, e a dose de 50 mg/kg previniu esse aumento

no estriado direito (Tabela 8).

Tabela 7 - Efeito da curcumina sobre a determinação da concentração da glutationa reduzida em tecidos

cerebrais de ratos parkinsonianos.


FO 0,59 ± 0,32 5,17 ± 2,19 2,66 ± 0,72

6-OHDA 1,79 ± 0,72 6,66 ± 0,44 3,36 ± 0,36

6-OHDA + Curc200 mg/kg 2,36 ± 0,81 2,59 ± 0,43 6,05 ± 1,99


sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL). Os valores representam a média EPM em µg.

77

Tabela 8 - Efeito do resveratrol sobre a determinação da concentração da glutationa reduzida em tecidos

cerebrais de ratos parkinsonianos.


FO 2,24 ± 0,43 2,38 ± 0,27 5,14 ± 1,88

6-OHDA 3,46 ± 0,69 3,32 ± 0,32 4,81 ± 0,40

6-OHDA + Resv10 mg/kg 3,15 ± 0,36 2,12 ± 0,15# 3,66 ± 0,5#

6-OHDA + Resv50 mg/kg 2,86 ± 0,38# 3,19 ± 0,33 4,55 ± 0,69


sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), # vs 6-OHDA, p<0,05. Testes ANOVA e teste de

Tukey. Os valores representam a média EPM em µg.

78

4.12 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a determinação da atividade da

superóxido dismutase (SOD) em tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos

As tabelas abaixo mostram os níveis de SOD dos animais que sofreram lesão

unilateral estriatal por 6-OHDA no estriado direito (lesionado), estriado esquerdo e

mesencéfalo. A 6-OHDA promoveu uma diminuição significativo nos níveis de SOD dos

animais parkinsonianos em relação ao grupo FO no estriado direito.

O tratamento com a curcumina não interferiu neste parâmetro (Tabela 9).

O tratamento com o resveratrol protegeu os animais parkinsonianos na dose de 10

mg/kg no estriado esquerdo e na dose de 50 mg/kg no estriado direito (Tabela 10).

Tabela 9 - Efeito da curcumina sobre determinação da atividade da superóxido dismutase em tecidos cerebrais de

ratos parkinsonianos.


FO 658,91 ± 9,96 629,70 ± 66,17 632,22 ± 23,56

6-OHDA 533,20 ± 18,51* 602,64 ± 42,56 686,51 ± 1,36

6-OHDA +Curc200 mg/kg 457,35 ± 12,25# 591,0 ± 69,24 662,5 ± 22,17



de Tukey. Os valores representam a média EPM em U/mg de tecido.

79

Tabela 10 - Efeito do resveratrol sobre determinação da atividade da superóxido dismutase em tecidos cerebrais

de ratos parkinsonianos.


FO 658,91 ± 9,96 629,70 ± 66,17 632,22 ± 23,56

6-OHDA 533,20 ± 18,51* 602,64 ± 42,56 686,51 ± 13,6

6-OHDA + Resv10 mg/kg 457,35 ± 117,65 734,23 ± 13,3# 587,22 ± 56,13#

6-OHDA + Resv50 mg/kg 702,33 ± 20,5# 697,8 ± 3,24 687,0 ± 6,89



de Tukey. Os valores representam a média EPM em U/mg de tecido.

80

4.13 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a determinação das concentrações de

Dopamina (DA), seu metabólito (DOPAC), Noradrenalina (NE) e Serotonina (5-HT) em

tecidos cerebrais de ratos parkinsonianos

A injeção intraestriatal de 6-OHDA produziu diminuição da concentração de

monoaminas no estriado direito, estriado esquerdo e mesencéfalo quando comparados aos

animais controles (FO). Houve uma redução de aproximadamente 99% nos níveis de

dopamina no estriado direito, 89% no estriado esquerdo e 56% no mesencéfalo dos animais

que sofreram lesão estriatal. Os níveis de DOPAC reduziram aproximadamente 56% no

estriado direito e mesencéfalo, e aumentou 51% no estriado esquerdo nos animais que

sofreram lesão estriatal.

Também houve uma redução de aproximadamente 94% nos níveis de

noradrenalina (NE) no estriado direito, 95% no estriado esquerdo e 75% no mesencéfalo dos

animais que sofreram lesão estriatal. E uma redução de aproximadamente 97% nos níveis

serotonina (5-HT) no estriado direito e esquerdo e 73% no mesencéfalo dos animais que

sofreram lesão estriatal.

A curcumina protegeu significativamente contra a depleção dopaminérgica

induzida pela 6-OHDA no estriado direito, no estriado esquerdo e no mesencéfalo. Também

protegeu a depleção do seu metabólito (DOPAC) no estriado direito e no mesencéfalo. Ela

não protegeu da depleção noradrenérgica induzida pela 6-OHDA, mas protegeu da depleção

serotonimérgica no mesencéfalo (Tabelas 11, 12 e 13).

O resveratrol protegeu contra a depleção dopaminérgica induzida pela 6-OHDA

no estriado direito e no estriado esquerdo, mas não protegeu no mesencéfalo, também

protegeu contra a depleção do seu metabólito (DOPAC) no estriado direito. Ele não protegeu

a depleção noradrenérgica induzida pela 6-OHDA no estriado direito, no estriado esquerdo e

no mesencéfalo. Contudo ele protegeu a depleção serotonimérgica no estriado esquerdo e no

mesencéfalo (Tabelas 14, 15 e 16).

81

Tabela 11 - Efeito da curcumina na concentração de monoaminas em tecido estriatal direito (lesionado) de

ratos submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA.

Grupo DA DOPAC NE 5-HT

FO 2.234 ± 257 111,3 ± 8,5 12.766 ± 1.165 10.842 ± 1.739

6-OHDA 20,6 ± 13,6* 49,3 ± 14* 727,2 ± 209,1* 299 ± 87,3*

6-OHDA+Curc100mg/kg 286 ± 93,1# 132 ± 28# 64,5 ± 11,7 302,1 ± 53,9

6-OHDA+Curc200mg/kg 8,3 ± 5,3 21,9 ± 12,4 58,1 ± 33# 71 ± 71

A curcumina foi administrada nas doses de 100 e 200 mg/kg, v.o. por 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os animais


de Tukey. Os valores representam a média EPM em pg/mg de tecido.

Tabela 12 - Efeito da curcumina na concentração de monoaminas em tecido estriatal esquerdo de ratos

submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA.


FO 2.539 ± 121,6 121,4 ± 9,1 11.802 ± 3.166 5.667 ±2.547

6-OHDA 297,2 ± 44,4* 249 ± 41,6* 547 ± 113,5* 225,6 ± 103*

6-HDA+Curc100mg/kg 591,5±40,8# 301 ± 28,4 88,1 ± 13,7# 222,7 ± 78,6

6-HDA+Curc200mg/kg 1.532±295# 375±27,8# 720 ± 156,2 614± 268,6#




Tabela 13 - Efeito da curcumina na concentração de monoaminas em tecido mesencefálico de ratos submetidos

à lesão estriatal por 6-OHDA.


FO 29,7 ± 40,6 11,9 ± 2,2 1.279 ± 229,3 3.105 ±1.143

6-OHDA 13 ± 2,9* 4,2 ± 2,8 320 ± 59,4* 849,1 ± 198,8*

6-OHDA+Curc100mg/kg 17,7 ± 14,9 22,1 ± 9,0 147,6 ± 63,65 555,3 ± 301,9

6-OHDA+Curc200mg/kg 380 ± 78,7# 60,8± 8,4# 194,9 ± 39,6 10.256±3.067#




82

Tabela 14 - Efeito do resveratrol na concentração de monoaminas em tecido estriatal direito (lesionado) de

ratos submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA.


FO 2.234 ± 257 111,3 ± 8,5 12.766 ± 1.165 10.842 ± 1.739

6-OHDA 20,6 ± 13,6* 49,3 ± 14* 727,2 ± 209,1* 299 ± 87,3*

6-OHDA+ Resv10 mg/kg 45,3 ± 23,21 31,7 ± 13,1 16,8 ± 2,0# 1.051 ± 296,8#

6-OHDA+ Resv50 mg/kg 400 ± 67,8# 229±23,2# 12,3 ± 1,3# 996,8 ± 243,8#

FO + Resv 50 mg/kg 1.198 ± 127 969,4 ± 107 6,1 ± 1,9 442,1 ± 39,78

O resveratrol foi administrado nas doses de 10 e 50 mg/kg, v.o. durante 15 dias (n = 6 animais/grupo). Os

animais sofreram lesão intraestriatal com 6-OHDA (18µg/3µL), * vs FO, # vs 6-OHDA, p<0,05. Testes

ANOVA e teste de Tukey. Os valores representam a média EPM em pg/mg de tecido.

Tabela 15 - Efeito do resveratrol na concentração de monoaminas em tecido estriatal esquerdo de ratos

submetidos à lesão estriatal por 6-OHDA.


FO 2.539± 121,6 121,4 ± 9,1 11.802 ± 3.166 5.667 ± 2.547

6-OHDA 297,2± 44,4* 249 ± 41,6* 547 ± 113,5* 225,6 ± 102,9*

6-OHDA+Resv10mg/kg 1.077 ± 179# 375 ± 77,8 19,1 ± 4,1# 710,4 ± 244,1

6-OHDA+Resv50mg/kg 1.008 ± 450 191,5± 60,4 58,0 ± 22,2# 560,3 ± 182,6

FO + Resv50 mg/kg 1.160± 209,4 453,8± 49,9 14,3 ± 1,5 432,1 ± 58




83

Tabela 16 - Efeito do resveratrol na concentração de monoaminas em tecido mesencefálico de ratos submetidos

à lesão estriatal por 6-OHDA.


FO 29,7±4,6 11,9±2,2 1.279 ± 229,3 3.105 ± 1.143

6-OHDA 13,0±2,9* 4,2±2,8* 320 ± 59,4* 849,1 ± 198,8*

6-OHDA+ Resv10 mg/kg 17,3 ± 6,7 4,1 ± 2,6 125,6 ± 9,4# 2.693 ± 375,4#

6-OHDA+ Resv50 mg/kg 20,8 ± 4,4 6,6 ± 2,2 91,6 ± 39,8# 2.953 ± 246,3#

FO + Resv 50 mg/kg 34,6 ± 10,1 21,8 ± 7,4 109,8 ± 19,1 833,6 ± 2 90,2




84

4.14 Efeito da curcumina e do resveratrol sobre a imunorreatividade para a tirosina

hidroxilase (TH) no estriado direito de ratos parkinsonianos

As figuras 33 e 34 mostram que a 6-OHDA (B) causou uma redução de

neurônios dopaminérgicos no estriado direito, quando comparados ao grupo FO (A).

O tratamento com a curcumina na dose de 200 mg/kg aumentou discretamente a

imunorreatividade para TH (Figura 33 C), prevenindo a degeneração dos neurônios expostos

à toxicidade da 6-OHDA.

O tratamento com o resveratrol na dose de 50 mg/kg aumentou a

imunorreatividade para TH (Figura 34 C), prevenindo a degeneração dos neurônios expostos

à toxicidade da 6-OHDA.

85

Figura 33 - Fotomicrografia representativas de neurônios imunorreativos para tirosina-hidroxilase no estriado

direito (lesionado) de ratos submetidos a lesão estriatal com 6-OHDA (18µg/3µL). Coloração marron

representa células imunorreativas a tirosina-hidroxilase no estriado. A- Falso-operado, B- Parkinsoniano, C-

Parkinsoniano tratado com Curcumina 200 mg/kg. Aumento de 4 vezes (barra 2,0 mm) e 40 vezes (barra

200μm).

86

Figura 34 - Fotomicrografia representativas de neurônios imunorreativos para tirosina-hidroxilase no estriado

direito (lesionado) de ratos submetidos a lesão estriatal com 6-OHDA (18µg/3µL). Coloração marron

representa células imunorreativas a tirosina-hidroxilase no estriado. A- Falso-operado, B- Parkinsoniano, C-

Parkinsoniano tratado com Resveratrol 50 mg/kg. Aumento de 4 vezes (barra 2,0 mm) e 40 vezes (barra

200μm).

87

4.15 Efeito da curcumina sobre a integridade neuronal no estriado direito e mesencéfalo

de ratos parkinsonianos

A avaliação do dano neuronal foi realizada através da técnica histológica Violeta

de Cresil, onde podemos observar a morfologia de neurônios. Os animais parkinsonianos

apresentaram neurônios com citoarquitetura celular anormal, com células vacuolizadas e

picnóticas, sem visualização de nucléolos no estriado direito (Figuras 35B) e no mesencéfalo

(Figura 36B).

A curcumina na dose 200 mg/kg mostrou uma ação citoprotetora no estriado

direito (Figura 35C) e um pouco mais discreta no mesencéfalo (Figura 36C) com células

apresentando citoarquitetura normal, com núcleos e nucléolos bem visualizados, semelhantes

ao FO (Figuras 35A e 36A).

88

Figura 35. Fotomicrografia da região do estriado de ratos submetidos a lesão unilateral pela 6-OHDA

(18µg/3µL).. Coloração violeta de cresil. A- Falso-operado, B- Parkinsoniano, C- Parkinsoniano tratado com

Curcumina 200 mg/kg. Aumento de 10 vezes (barra 500 µm) e 40 vezes (barra 200μm).

89

Figura 36. Fotomicrografia da região do mesencéfalo de ratos submetidos a lesão estriatal pela 6-OHDA

(18µg/3µL). Coloração violeta de cresil. A- Falso-operado, B- Parkinsoniano, C- Parkinsoniano tratado com

Curcumina 200 mg/kg. Aumento de 10 vezes (barra 500 µm) e 40 vezes (barra 200μm).

90

5 DISCUSSÃO

A Doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa associada com a

perda de neurônios na SNpc (CHEN et al, 2009). A etiologia da doença ainda não está

completamente conhecida, mas, ao que parece, o estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial

têm papel importante (MARTIN et al, 2006; PATHAK et al, 2008). A DP ainda é

considerada incurável apesar de existirem inúmeros tratamentos para melhorar a qualidade de

vida dos pacientes como a L-dopa, um precursor de dopamina, inibidores da MAO-B, que

atuam melhorando flutuações motoras, agonistas dopaminérgicos, que mimetizem o efeito da

dopamina, anticolinérgicos, que são indicados para diminuição de tremores, amantadina, um

antiviral que promove a liberação de dopamina, aliviando os sintomas motores (SALAWU et

al, 2010).

O dano neuronal induzido por 6-OHDA é principalmente devido ao estresse

oxidativo maciço causado pela toxina. Sendo semelhante à dopamina, a 6-OHDA mostra alta

afinidade para o transportador de dopamina, que carrega a toxina para dentro dos neurônios

dopaminérgicos. Uma vez no neurônio, 6-OHDA acumula-se no citosol e sofre rápida auto-

oxidação, levando à alta taxa de formação de radicais livres (principalmente o peróxido de

hidrogênio) (BLANDINI et al, 2008). Como um mecanismo adicional, a 6-OHDA pode

acumular-se na mitocôndria, onde inibe a atividade da cadeia de transporte de elétrons através

do bloqueio do complexo I (BLANDINI et al, 2008). A 6-OHDA possui a desvantagem de

não atravessar a barreira hematoencefálica, sendo necessária a cirurgia extereotáxica para

administração intraestriatal da toxina, o que nem sempre leva a uma perda maciça das células

dopaminérgicas (IANCU et al., 2005). Este modelo não imita todas as características

patológicas e clínicas da DP, como por exemplo, a formação de inclusões citoplasmáticas

(corpúsculos de Lewy), mas, no entanto é o modelo mais útil e seguro para o estudo de

substâncias neuroprotetoras (HIRSCH et al, 2008). Apesar da disponibilidade de novos

modelos, a 6-OHDA permenece sendo a ferramenta experimental mais utilizada para induzir a

lesão nigroestriatal em ratos (BLANDINI et al, 2008).

A curcumina um polifenol presente na C. longa possui atividade antioxidante e

supressora da resposta inflamatória de células da micróglia. Possui também efeito

neuroprotetor em doenças degenerativas tanto pela redução da atividade inflamatória, como

através da inibição da “dobradura incorreta” e agregação de proteínas na Doença de

Creutzfeld-Jakob e na Doença de Parkinson (WANG et al, 2010). Zbarsky e colaboradores

91

(2005) demonstraram um efeito protetor da curcumina em modelo de Parkinson in vivo, com a

6-OHDA, atenuando o déficit de dopamina e a imunorreatividade para tirosina hidroxilase.

Além deste trabalho, foi evidenciada que a curcumina, protege cultura de células PC12, contra

a citotoxicidade induzida pelo MPTP, uma neurotoxina dopaminérgica (CHEN et al., 2009).

A curcumina apresenta também atividade antiinflamatória análoga à da fenil-

butasona (SATOSKAR et al., 1986). Inibe a produção de citocinas inflamatórias produzidas

por monócitos no sangue periférico e por macrófagos alveolares (LIN et al., 1997), além de

inibir as formas induzidas da óxido nítrico sintase (ZHANG et al., 1999), a ciclooxigenase e

lipoxigenase (ABE et al., 1999). Esta droga penetra facilmente no citoplasma das células

acumulando-se em estruturas membranosas como a membrana plasmática, o retículo

endoplasmático e a membrana nuclear (JARUGA et al., 1998). Alguns resultados sugerem

que os efeitos antiinflamatório e antitumoral da curcumina podem ser devidos à inibição do

metabolismo do ácido araquidônico e à atividade antioxidante do composto (SRISVASTAVA

et al., 1995). Assim como outros anti-inflamatórios não-esteroidais, a curcumina mostrou-se

capaz de suprimir a transcrição do fator NF-kappaB, que controla a expressão de genes como

a ciclooxigenase-2 e ciclina D1, levando a inibição da proliferação de células tumorais

(TAKADA et al., 2004).

O resveratrol é uma fitoalexina polifenólica comumente encontrada em grande

quantidade na casca de uva e vinho tinto (FREMONT et al., 2000). Ele tem sido o foco de

muitos estudos que visam investigar os seus atributos biológicos, incluindo sua atividade

antioxidante (OLAS et al., 1999, MARTINEZ & MORENO, 2000). Estudos in vivo mostram

que o resveratrol pode exercer neuroproteção contra isquemia, convulsões, doenças

neurodegenerativas (MARKUS & MORRIS, 2008) e possui efeitos benéficos em modelos

experimentais de DP (CHAO et al., 2008). Além disso, estudos in vitro, também

demonstraram que o resveratrol possui efeitos neuroprotetores contra diferentes neurotoxinas

(JIN et al., 2008) e capacidade de exercer efeito neuroprotetor sobre os neurônios

dopaminérgicos (BLANCHET et al., 2008; LU et al., 2008). O principal mecanismo de

neuroproteção do resveratrol seria a sua capacidade sequestradora de radicais livres

(ZHUANG et al., 2003). O resveratrol quando administrado i.p. conseguiu reduzir convulsões

induzidas por FeCl3, ácido caínico, além de restaurar parcialmente a cognição em ratos

induzido por estreptozotocina (GUPTA et al., 2002). Estes resultados levam a crer que o

resveratrol é capaz de atravessar a barreira hemato-encefálica e que exerce de maneira eficaz

92

efeitos neuroprotetores, mesmo em doses baixas após um AVC ou lesão neurotóxica. (LU et

al., 2008).

Com o objetivo de investigar um novo agente neuroprotetor capaz de prevenir a

neurodegeneração que ocorre na doença, bem como outros sintomas clínicos associados à

doença, investigamos o papel da curcumina e do resveratrol, com ação antioxidante e

antiinflamatória já comprovadas, usando um modelo experimental de DP.

O modelo de “hemiparkinsionismo” da 6-OHDA é um modelo robusto,

reprodutível, que leva a uma assimetria motora evidenciada após a administração de agonistas

dopaminérgicos resultando em um comportamento rotacional contralateral à lesão

(BETARBET et al, 2002). Este é o clássico teste da apomorfina ou rotacional, primeiramente

descrito por Ungerstedt (1976), que proporciona a verificação de grandes lesões

nigroestriatais.

Neste trabalho mostramos que animais lesionados com a 6-OHDA apresentaram

um grande número de rotações contralaterais à lesão. Este resultado está em concordância

com a literatura (RIZELIO et al., 2010; YU et al., 2010) que demonstra que lesões extensas

promovidas pela 6-OHDA acarretam esse tipo de comportamento durante a realização do

teste. O agonista dopaminérgico, apomorfina, induz rotações contralaterais ao lado lesionado,

uma vez que estimula no lado lesionado uma “up regulation” dos receptores D2.

Não foi observada proteção no teste rotacional induzido pela apomorfina nas

doses de curcumina testadas, apesar de um estudo com lesão estriatal unilateral de 6-OHDA

em ratos Sprague-Dawley pré tratados com curcumina da dose de 50 mg/Kg (dissolvida em

10% de cremophor) apresentou atividade protetora (ZBARSKY et al., 2005).

O resveratrol conseguiu diminuir as rotações estando de acordo com algumas

literaturas (ZHANG et al., 2002; RIZELIO et al., 2010). Wang e colaboradores (2011) em

modelo de lesão estriatal unilateral de 6-OHDA em ratos demontraram a mesma proteção com

um dose de 20 mg/kg de resveratrol por 14 (quatorze) dias via oral.

A locomoção no campo aberto reflete a atividade exploratória do animal

(KONTINEN et al., 1999). O presente estudo demonstrou que a 6-OHDA não induziu déficit

na atividade exploratória no teste do campo aberto, corroborando com o estudo de Iancu e

colaboradores (2005) onde demonstram que, os animais lesionados unilateralmente pela 6-

93

OHDA, demonstraram comprometimento na atividade locomotora no teste do rotarod e no

teste do cilindro, mas não no teste do campo aberto. Alguns estudos existentes (RIZELIO et

al., 2010) demonstraram uma diminuição no número total de movimentos de exploração

vertical e também em outros teste para avaliação a atividade locomotora. Estas alterações

motoras são mais evidenciadas em outros modelos de parkinsonismo animal, como nos

modelos do MPTP e rotenona, pois no modelo da 6-OHDA não observamos alterações

visíveis como a bradicinesia (SCHOBER, 2004).

Os sintomas sensoriais são uma queixa freqüente dos pacientes com DP, o que

piora sua qualidade de vida e interfere na capacidade deste paciente participar das atividades

da vida diária, contribuindo para a perturbação do sono ou depressão (YOSHII, 2012).

O comportamento sensório motor foi avaliado através do teste da vibrissa onde

observamos que não houve diferença neste modelo, corroborando com alguns autores

(WOODLEE et al., 2005) que utilizou o nosso mesmo modelo em ratos e compando com

outros modelos neuronais.

Na clínica, os pacientes com alterações do movimento, como a DP, apresentam

um importante comprometimento quando foram avaliados com base na função total

de extremidades, através da avaliação das atividades da vida diária, a coordenação fina de

equilíbrio na mão, e na marcha (RAH et al., 2009).

O presente estudo demostrou que a 6-OHDA foi capaz de produzir danos motores

finos através do teste do cilindro, corroborando com a literatura. Woodlee e colaboradores

(2008) observaram em ratos Sprague-Dawley lesionados unilateramente pela 6-OHDA, um

comprometimento da atividade motora fina através dos testes do cilindro e da instabilidade

postural.

A curcumina foi capaz de previnir esta assimetria, corroborando com outros

estudos onde a curcumina aumenta a atividade motora (BISHNOI et al., 2008). Mansouri e

colaboradores (2012) em modelo de parkinsonismo induzido pela administração de

homocisteína (2 mmol/µL) intracerebroventricular (i.c.v.), usando ratos Wistar, observaram

que a curcumina na dose de 50 mg/kg i.p., uma vez ao dia, por um período de 10 (dez) dias

começando 5 (cinco) dias antes da cirurgia, aumentava a atividade locomotora, a velocidade e

a distância percorrida pelo animal.

94

O resveratrol não mostrou proteção neste teste, e até o momento não foi

encontrada na literatura nenhuma referência com o resveratrol avaliando este tipo de

comportamento.

O modelo de “hemiparkinsonismo” induzido pela 6-OHDA promoveu um

comportamento depressivo nos animais lesionados, este comportamento também é observado

na clínica, onde ocorre um alto índice de depressão entre os pacientes com DP. (CHEN et al,

2011; KASTEN et al, 2012). Esta depressão pede ser funcional, pelo conhecimento do

diagnóstico da DP pelo paciente, ou fisiológica devido à diminuição das catecolaminas,

principalmente dopamina e serotonina. Casas e colaboradores (2011) também observaram o

comportamento depressivo em ratos Sprague-Dawley que sofreram lesão unilateral pela 6-

OHDA, através do teste no nado forçado. Outro estudo com este mesmo modelo demonstrou

que o comportamento depressivo está relacionado com a diminuição dopaminérgica nos

neurônios daqueles animais (JAUNARAJS et al., 2010).

A curcumina e o resveratrol protegeram os animais do comportamento depressivo

corroborando com estudos anteriores. Kulkarni e colaboradores (2009) demostraram que a

curcumina nas doses de 10-80 mg/kg i.p. foi capaz de proteger camundongos do

comportamento depressivo farmacológico tanto no teste do nado forçado como no teste de

suspenção da calda. No modelo de depressão induzido por um inibidor da síntese de

serotonina (p-clorofenilalanina) em camundongos, o trans-resveratrol nas doses de 40 e 80

mg/kg i.p. protegeu do comportamento depressivo nos testes do nado forçado e suspenção da

calda (XU et al., 2010).

Os pacientes com DP têm a memória de trabalho e espacial prejudicada (OWEN,

2004; KASTEN et al, 2012). Segundo Stebbins (1999), a redução da atividade dopaminérgica

no estriado e no lobo frontal pode levar a déficits de memória operacional. Em animais,

existem vários testes usados para avaliar a memória de trabalho ou operacional, o hipocampo

parece também estar envolvido (SHARMA et al., 2010).

A memória operacional ou de trabalho pode ser definida como uma memória de

curta duração para estímulos ou localizações espaciais. Há um armazenamento de uma

informação temporária que será utilizada para o planejamento de uma ação futura

(DUDCHENKO, 2004). A alternação entre os braços de um labirinto em Y (Y-maze) após um

curto prazo tem sido proposta como modelo de memória de trabalho (LALONDE et al, 2002).

95

Nakagawa e colaboradores (2004) mostraram que no modelo da doença de Parkinson usando

a neurotoxina 6-OHDA houve um dano na memória de trabalho, no entanto observou-se, em

nosso teste Y-maze, que os animais que lesionados com 6-OHDA não apresentaram déficits

neste tipo de memória.

Em relação à memória aversiva, o presente estudo constatou que a 6-OHDA

promoveu danos significativos na memória aversiva de curta duração (memória recente) e de

longa duração (memória tardia). Corroborando com estes dados, Fernadez e Espejo (2003)

demonstraram que as lesões com a neurotoxina 6-OHDA i.c.v afetam a memória aversiva e

espacial, principalmente por prejudicarem as funções cognitivas dependente do córtex pré-

frontal e do núcleo accumbens. Outro estudo com modelo de parkinsonismo em camundongos

C57/BL induzido por MPTP i.p. também demonstrou um déficit na memória aversiva

avaliada através do teste da esquiva passiva, devido à diminuição da DA no sistema nervoso

(MORIGUCHI et al., 2012).

A curcumina protegeu a memória aversiva de curta duração, corroborando com o

trabalho de Awasthin e colaboradores (2010) que demonstraram uma proteção na memória

aversiva no modelo de excitotoxicidade induzida por estreptozotosina pela curcumina nas

doses de 20 e 50 mg/kg, mediado pela diminuição do estresse oxidativo. Em modelo de DA

induzida por alumínio v.o. e D-galactose i.p. por 90 (noventa) dias em camundongos, a

curcumina 200 mg/kg v.o. por 45 (quarenta e cinco) dias protegeu dos défcites de memória

aversiva pelo teste da esquiva passiva (PAN et al, 2008) e de disfunção cognitiva induzida por

antiepiléticos (REETA et al., 2010). A curcumina diminui a morte dos neurônios hipocampais

e o estresse oxidativo, diminuindo os níveis de MDA e de ânion superóxido, induzida por

homocisteína, protegendo a memória aversiva (ATAIE et al, 2010).

O resveratrol protegeu tanto a memória aversiva recente quanto a tardia,

corroborando com o estudo de Gacar e colaboradores (2011) que utilizaram um modelo de

perda de memória induzido por escopolamina em ratos, onde o resveratrol nas doses de 25 e

50 mg/kg v.o. Protegeu tanto a memória aversiva como a espacial. Karalis e colaboradores

(2011) demonstraram que o resveratrol foi capaz de proteger a memória aversiva e espacial de

animais submetidos à isquemia por traumatismo. Também em modelo dos ratos Wistar

diabéticos pela administração da estreptosozina i.v. o resveratrol nas doses de 10 e 20 mg/kg

protegeu contra os déficits de memória aversiva no teste da esquiva passiva (SCHMATZ et

al., 2009).

96

No teste do labirinto aquático com plataforma sinalizada (Cued Water Maze)

avaliamos a memória espacial dependente de estriado através do aprendizado nos quatro dias

de testes (MIYOSHI et al., 2002). Os animais parkinsonianos apresentaram um déficit de

memória espacial em todos os dias, corroborando com estudos anteriores (PACKARD &

McGAUGH, 1992). Tadaiesky e colaboradores (2008) também observaram este défcit em

modelo de parkinsonismo em ratos induzido pela injeção unilateral de 6-OHDA, e justificam

pela depleção de dopamina, noradrenalina e serotonina nas áreas cerebrais afetadas destes

animais.

A curcumina não conseguiu reverter o déficit na memória espacial no nosso

modelo de doença neurodegenerativa, Kumar e colaboradores (2009) mostraram que no

modelo de DA, com administração de alumínio, a curcumina nas doses 30 e 60 mg/kg por 6

(seis) semanas protegeu a memória espacial utilizando o labirinto aquático de Moris (Moris

Water Maze).

O resveratrol consegui reverter o dano de memória em animais parkinsonianos no

terceiro e quarto dia de teste, corroborando com o estudo de Karalis e colaboradores (2011)

que demonstraram que o trans-resveratrol 90 mg/kg i.p. foi capaz de proteger a memória

espacial de ratos jovens submetidos a isquemia por traumatismo craniano.

Os compostos estudados neste trabalho apresentaram melhora nos tipos de

memória estudados. A curcumina reduz o dano oxidativo em modelo de demência em

camundongo transgênico para doença de Alzheimer (DA) (GARCIA-ALLOZA et al., 2007;

ONO et al., 2004) e exerce um efeito positivo sobre a neurogênese e concentrações de fatores

neurotróficos no cérebro, ativação da via BDNF/TrkB especialmente na região CA3 do

hipocampo (XU et al 2009), provavelmente estes mecanismos de ação podem explicar seus

efeitos neuroprotetores. A atividade antioxidante da curcumina protege os animais dos danos

cognitivos, melhorando a memória de ratos, em modelo de excitotoxicidade cerebral induzido

pela hemocisteína ela apresentou proteção na memória espacial e na memória aversiva

(AWASTHI et al., 2010).

Em humanos, o consumo de curcumina tem sido associado a uma menor

incidência de doenças de Alzheimer e de Parkinson além de melhora cognitiva (NG et al.,

2006). Em modelos animais os mecanismos responsáveis pela prevenção dos déficits

cognitivos parecem ser mediados por suas propriedades antiapoptóticas (PAN et al. 2008) e

97

sua capacidade de alterar bioquímica e morfologicamente as sinapses (AHMED et al., 2010;

XU et al. 2009).

As EROs e ERNs são produzidas fisiologicamente através do metabolismo celular

e, em concentrações moderadas, desempenham importantes papéis em processos de

sinalização celular, apoptose, expressão gênica e transporte iônico. Essas moléculas são

rigidamente controladas por antioxidantes que podem agir de maneira direta, atuando como

varredoras, ou de maneira indireta através do aumento da expressão de enzimas antioxidantes

(LU et al., 2010). Entretanto, o excesso desses radicais causa o estresse oxidativo, um

processo deletério que pode ser um importante mediador dos danos a estruturas celulares,

como lipídeos, proteínas e DNA (VALKO et al., 2007).

Um dos principais componentes celulares afetados pelo estresse oxidativo é a

membrana celular que sofre um processo de peroxidação. O MDA é um aldeído de cadeia

curta, sendo o principal produto da peroxidação lipídica. No presente trabalho a 6-OHDA

promoveu o aumento das concentrações de MDA no estriado direito, esquerdo e mesencéfalo,

corroborando com dados da literatura (KHAN et al., 2010). Kumar e colaboradores (2009)

mostraram que ratos com lesão estriatal por 6-OHDA apresentaram um aumento de 40% nas

concentrações de MDA, indicando altos níveis de peroxidação lipídica. Esses efeitos foram

associados à redução dos conteúdos de GSH, SOD e GSH-Px (glutationa peroxidase), juntos

esses fatores podem levar à diminuição da geração de radicais livres.

O tratamento com curcumina preveniu o aumento nos níveis de MDA nas áreas

cerebrais avaliadas. Estudos mostram a inibição da peroxidação lipídica pela curcumina em

modelos de isquemia focal (RATHORE et al., 2008). Zhu e colaboradores (2004) mostraram

que neurônios corticais em cultura expostos ao indutor de estresse oxidativo t-BHP

apresentam perda do potencial de membrana mitocondrial, seguido da liberação do citocromo

c para o citosol, ativação da caspase 3 e de apoptose, nesse modelo a curcumina se mostrou

protetora, restaurando o potencial de membrana mitocondrial, inibindo a caspase 3 e a

alteração na expressão de proteínas da famíla Bcl-2, diminuindo assim a morte por apoptose.

Segundo Wang e colaboradores (2005) a curcumina também apresenta efeito

protetor quando administrada por 20 (vinte) dias antes da isquemia/reperfusão. A diminuição

da peroxidação lipídica, do dano no potencial de membrana mitocondrial, da liberação do

98

citocromo c e da ativação da caspase 3, com conseqüente diminuição da morte de neurônios e

células da glia, parecem ser os mecanismo responsáveis.

O tratamento com o resveratrol preveniu o aumento nos níveis de MDA no

estriado direito e no mesencéfalo. Uma das mais conhecidas propriedades do resveratrol é a

de ser antioxidante, atenuando a acumulação de EROs. Dados da literatura mostram que o

resveratrol é capaz de impedir o aumento das EROs e a morte por apoptose causada por um

dano oxidativo (OVESNÁ et al., 2006). Jin e colaboradores (2008) demonstraram este efeito

neuroprotetor do resveratrol em modelo animal de parkinsonismo induzido pela injeção

unilateral de 6-OHDA em ratos Sprague-Dawley onde ocorreu diminuição dos níveis de

COX2, TNFα e NO2 na substância negra dos animais lesionados.

A molécula de óxido nítrico (NO) é extremamente tóxica e danifica proteínas,

lipídeos de membrana e DNA. De maneira indireta podemos quantificar a produção do NO

através da dosagem de seu metabólito nitrito/nitrato. A 6-OHDA aumentou os níveis de

nitrito/nitrato, no estriado direito e mesencéfalo dos animais, corroborando com outros

estudos (GUO et al., 2007). Em trabalho realizado no nosso laboratório in vitro em cultura

primárias de células mesencefálicas de rato foi observado que a 6-OHDA aumentou os níveis

de nitrito e a peroxidação lipídica. (NOBRE Jr. et al., 2003).

No presente trabalho o tratamento com curcumin diminui, mas não

significativamente os níveis de nitrito/nitrato no estriado direito induzido pela 6-OHDA.

Outros autores usando um modelo de isquemia tromboembólico também encontraram uma

diminuição dos níveis de nitrito/nitrato pela curcumina (DOHARE et al., 2008).

O resveratrol na dose de 50 mg/kg diminui significativamente os níveis de

nitrito/nitrato induzido pela 6-OHDA no estriado direito e no mesencéfalo. Estudos

demonstram que o resveratrol pode agir inibindo a formação do radical hidroxil e do ânion

superóxido (LEONARD et al., 2003; SOARES et al., 2003), postulando que seu principal

mecanismo de neuroproteção seria a sua capacidade varredora de radicais livres (ZHUANG et

al., 2003).

Uma das primeiras mudanças bioquímicas observadas no cérebro de pacientes

da DP postmortem é o decréscimo nos níveis da GSH. A GSH é o mais importante

componente das defesas antioxidantes celulares (DICKINSON et al., 2003). Em geral, a

99

SNpc é uma das estruturas onde o GSH se encontra em níveis mais baixos e na DP os níveis

de GSH sofrem um decréscimo ainda maior (BHARATH et al., 2002). Níveis baixos de

GSH levam a um aumento do estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e

consequentemente morte celular (JHA et al., 2000).

No nosso estudo, não foi observado um decréscimo nos níveis de GSH induzido

pela 6-OHDA nas áreas cerebrais analisadas, discordando dos dados da literatura que

mostram esta diminuição (CHEN et al., 2009; YU et al., 2010). A 6-OHDA induz um

aumento do estresse oxidativo, especificamente por promover a produção de radicais

superóxido, H2O2, hidroxil e quinonas, através da sua ação inibitória sobre a cadeia

respiratória mitocondrial (EMBORG, 2004).

O tratamento com a curcumina não alterou os níveis de GSH. Jagatha e

colaboradores (2008) demonstraram em estudos in vitro e in vivo, que a curcumina restaura

os níveis de GSH, protegendo contra oxidação protéica e preservando a atividade do

complexo I mitocondrial.

O tratamento com o resveratrol na dose de 10 mg/kg restaurou os níveis de GSH

diminuindo no estriado esquerdo e no mesencéfalo e a dose de 50 mg/kg restaurou os níveis

de GSH no estriado direito. Outros autores em estudo com o modelo de 6-OHDA em ratos

causou uma diminuição do estresse oxidativo pelo resveratrol através da diminuição das

enzimas glutationa peroxidase e reduzida e do aumento das substâncias reativas ao ácido

tiobarbitúrico, da proteína carbonil e atividade da fosfolipase A2 (KHAN et al., 2010).

A enzima superóxido dismutase (SOD) é uma das responsáveis pelo seqüestro de

radicais livres, mais especificamente retirando o anion superóxido com conseqüente formação

de peróxido de hidrogênio (LU et al., 2010). No presente trabalho a 6-OHDA promoveu uma

diminuição significativa da SOD no estriado lesado corroborando com outros estudos

(AHMAD et al., 2010). O tratamento com a curcumina não restaurou os níveis de SOD. Yu e

colaboradores (2010) demonstraram em estudos in vitro em células SH-SY5Y, e in vivo em

camundongos C57BL no modelo do MPTP, que a curcumina restaura os níveis de SOD

protegendo contra o aumento das EROs e o estresse oxidativo. Rathore e colaboradores

(2008) também demonstraram que a administração de curcumina reverteu a depleção de SOD,

aumentou de EROs e causou ativação de caspase-3 induzidos por isquemia focal transitória.


100

O resveratrol restaurou os níveis de SOD na dose de 50 mg/kg no estriado direito,

protegendo contra o aumento das EROs e o estresse oxidativo. Outros autores em estudos in

vivo e in vitro usando cultura de células SH-SY5Y também demonstraram o efeito

neuroprotetor do resveratrol, protegendo do estresse oxidativo, utilizando diferentes

neurotoxinas (CHAO et al., 2008).

Os resultados do nosso estudo demonstraram que a 6-OHDA promoveu um

aumento significativo dos níveis de MDA e NO2 e diminuição da SOD. Outros trabalhos com

a 6-OHDA reportam que a lesão nigroestriatal causa aumento da peroxidação lipídica

(AHMAD et al 2010; GUO et al., 2007; KABUTO et al., 2007), nos níveis de nitrito (SINGH

et al., 2005; GUO et al., 2007; XIONG et al., 2009), além do decréscimo nos níveis da SOD

(AHMAD et al., 2010; YU et al., 2010).

Begum e colaboradores (2008) mostraram em modelo de Doença de Alzehaimer

in vitro e in vivo que a curcumina foi capaz de reduzir a inflamação e a neurodegeneração

diminuindo a interleucina 1β (IL-1β) e o marcador astrocitário GFAP. Assim como outros

anti-inflamatórios não-esteroidais, a curcumina mostrou-se capaz de suprimir a transcrição do

fator NF-kappaB, que controla a expressão de genes como a ciclooxigenase-2 e ciclina D1,

levando a inibição da proliferação de células tumorais (TAKADA et al., 2004). Outro estudo

mostrou que os níveis neuronais de EROs, de peroxinitrito e de NO foram significativamente

inibidas após o tratamento com a curcumina (DOHARE et al., 2008). Além disso, a

curcumina também foi capaz de aumentar a atividade das enzimas envolvidas no estresse

oxidativo como a superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase de forma dose-

dependente (MOKNI et al., 2007), assim como o conteúdo da glutationa (ATES et al., 2007).

Todos estes achados corroboram com os nossos resultados e apontam para o mecanismo de

neuroproteção da curcumina no modelo de DP com a 6-OHDA.

Em modelo de isquemia cerebral in vitro, o resveratrol mostrou-se capaz de

mimetizar condições pré-isquêmica, aumentando o tempo de sobrevida de células

hipocampais isquemiadas (RAVAL et al., 2004). Também mostrou significativa atenuação da

citotoxicidade induzida por Lipoproteína de Baixa Densidade Oxidada (oxLDL) (CAO &

WANG, 2005) e MPP(+) (GELINAS & MARTINOLI, 2002) em cultura de células PC12, e

neuroproteção (por inibição de NF-kappaB p65) em ratos com isquemia induzida (WANG et

al., 2003). Além de ação antioxidante, o resveratrol possivelmente promove neuroproteção

por inibir os canais de K+ dependente de voltagem (GAO & HU, 2005), aumentar a liberação



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101

de óxido nítrico (NO) (KIZILTEPE et al., 2004) e antagonizar as ações excitotóxicas do

ácido kaínico (VIRGILI & CONTESTABILE, 2000).

O presente trabalho mostrou que a injeção unilateral de 6-OHDA no corpo

estriado causou uma diminuição significativa nas concentrações de dopamina (DA), DOPAC,

noradrenalina (NE) e serotonina (5-HT) no estriado direito, estriado esquerdo e mesencéfalo

corroborando com outros estudos (YANG et al., 2009). A 6-OHDA foi injetada no corpo

estriado, ocasionando uma lesão retrógrada, atingindo o mesencéfalo e depletando as

monoaminas. As lesões estriatais pela 6-OHDA induzem neurodegeneração retrógrada dos

neurônios da SNpc, que são progressivas nas primeiras semanas da lesão (BERGER et al.,

1991; BLANDINI et al., 2008). Além da perda massiva de DA, são descritas alterações em

outros neurotransmissores, o que inclui redução dos níveis de 5-HT no corpo estriado e SNpc

e redução do conteúdo de NA na SNpc pela 6-OHDA (READER & DEWAR, 1999).

A curcumina nas doses estudadas conseguiu diminuir significativamente a perda

de DA no estriado direito, esquerdo e mesencéfalo induzida pela 6-OHDA. Em um trabalho

realizado em camundongos Swiss, a curcumina na dose 80 mg/kg (i.p.) e a

tetrahidrocurcumina na dose 60 mg/kg (i.p.) previnem a perda de DA e seu matabólito

(DOPAC) nos animais submetidos à lesão nigroestriatal pelo MPTP (RAJESWARI &

SABESAN 2008), no entanto, não foi capaz de reverter a perda de NE e 5-HT.

O resveratrol nas doses estudadas conseguiu diminuir significativamente a perda

de DA induzida pela 6-OHDA no estriado direito e esquerdo, e do metabólito no estriado

direito. Wang e colaboradores (2011) observaram a mesma neuroproteção encontrada em um

modelo de parkinsonismo animal induzido pela 6-OHDA, neste o resveratrol na dose de 20

mg/kg v.o., por 14 (quatorze) dias, protegeu os neurônios dopaminérgicos da depleção de DA,

diminuindo a atividade das EROs possivelmente por sua capacidade antioxidante.

Corroborando com o que foi dito foi constatado que a administração de uma dieta

ou tratamento à base de resveratrol para camundongos adultos antes de serem lesionados pela

neurotoxina MPTP exerce efeito neuroprotetor sobre os neurônios dopaminérgicos,

aumentando os níveis da DA no estriado e na SNpc (BLANCHET et al., 2008; LU et al.,

2008). O resveratrol também foi capaz de reverter à depleção de 5-HT induzida pela 6-

OHDA, mas não a depleção de NE. Xu e colaboradores (2010) demonstraram em que o trans-

resveratrol nas doses de 40 e 80 mg/kg i.p. restaurou os níveis de 5-HT e NE no córtex frontal

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6W81-50JHBP5-1&_user=686348&_coverDate=12%2F31%2F2010&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=search&_origin=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_acct=C000037259&_version=1&_urlVersion=0&_userid=686348&md5=04b0bbb71b2beddd2da0ec21b38268bd&searchtype=a#bib0140

102

e no hipocampo de camundongos submetidos à um modelo de depressão induzido por um

inibidor da síntese de serotonina.

A tirosina hidroxilase (TH) tem provado ser um bom marcador para neurônios

que contêm catecolaminas e tem sido utilizada para proporcionar mapas de sistemas

contendo catecolaminas (CUELLO, 1978). No presente trabalho a lesão pela 6-OHDA

promoveu a diminuição da imunorreatividade para TH no corpo estriado e SN. Estes

resultados estão em concordância com a literatura (CHATURVEDI et al., 2006;

YOKOIAMA et al., 2010) que demonstraram que a 6-OHDA é capaz de diminuir a

expressão de TH em neurônios dopaminérgicos.

A curcumina na dose testada promoveu uma discreta proteção nos neurônios

dopaminérgicos contra a 6-OHDA, o que foi observado pelo aumento da imunorreatividade

para TH no corpo estriado e pela manutenção da citoarquitetura normal, com núcleos e

nucléolos bem visualizados, através da coloração violeta de cresil, no corpo estriado e no

mesencéfalo. Zbarsky e colaboradores (2005) também demonstraram um efeito protetor da

curcumina em modelo de Parkinson in vivo induzido pela 6-OHDA, atenuando o déficit de

dopamina e aumentando a imunorreatividade para tirosina hidroxilase na SNpc. Mansouri e

colaboradores (2012) observaram que a curcumina na dose 50 mg/kg i.p., administrada 5

(cinco) dias antes e após a indução do parkinsonismo em ratos com homocisteína i.c.v.,

protegeu os neurônios dopaminérgicos da SNpc da morte e relacionaram os achados à sua

atividade anti-apoptótica.

O resveratrol na dose testada protegeu os neurônios dopaminérgicos contra a

toxicidade pela 6-OHDA. Srivastava e colaboradores (2012) observaram no modelo de

parkinsonismo experimental, em camundongo Swiss, induzido por paraquat (10 mg/kg) que

sozinho ou em combinação com maneb (30 mg/kg), duas vezes por semana, por 9 semanas,

o resveratrol na dose de 10 mg/kg i.p. diariamente aumentou a imunorreatividade para

tirosina hidroxilase na SNpc. Em outro estudo, Blanchet e colaboradores (2008) observaram

a ação neuroprotetora do pré-tratamento com resveratrol nas doses de 50 e 100 mg/kg por

duas semanas, no modelo de parkinsonismo induzido pelo MPTP i.p em camundongos

C57BL, onde foi visto uma diminuição da depleção de estriatal DA, e manutenção da

imunorreatividade para TH estriatal.



103

O efeito neuroprotetor da curcumina contra os danos motores causados pela 6-

OHDA pode não ter sido evidente por problemas farmacocinéticos, uma vez que, quando

administrada oralmente, a curcumina pode sofrer reações de glucuronidação, sulfatação e

redução no intestino formando produtos como: curcumina glicuronido, curcumina sulfato,

tetrahidrocurcumina, hexadihidrocurcumina e hexahidrocurcumina (IRESON et al., 2001).

Sua farmacocinética vem sendo estudadas desde os anos 70 e sabe-se que apresenta baixa

biodisponibilidade, aproximadamente 75% da curcumina é excretada pelas fezes

(WAHSTROMAND & BLENNOW,1978) e sua meia-vida é muito curta. Atualmente, estão

estudando novas formas para o melhoramento da molécula da curcumina, para tentar

solucionar os problemas da farmacocinética e biodisponibilidade, assim como diminuir os

efeitos colaterais (MYTHRI et al., 2011).

Através do nosso estudo, podemos afirmar que a curcumina demonstrou exerce

uma ação neuroprotetora parcial no modelo experimental de DP com a 6-OHDA, mas

protegeu o comportamento depressivo e contra o défcit na memória aversiva, possivelmente

por diminuição na peroxidação lipídica e produção de nitrito, restaurando assim parcialmente

os conteúdos das monoaminas e dos seus metabólitos.

O resveratrol, mas não a curcumina mostrou exercer uma forte ação

neuroprotetora contra os danos motores no modelo experimental de DP com 6-OHDA. Os

dois compostos demonstram exercer efeito protetor contra sinais/sintomas apresentados na DP

como perda de memória e depressão. Deste modo, os resultados elegem o resveratrol como

forte candidato a uso como terapia adjuvante no tratamento da DP.

104

6 CONCLUSÃO

- O resveratrol, mas não a curcumina protegeu os animais parkinsonianos de

danos motores induzidos pela 6-OHDA.

- No modelo de parkinsonismo utilizado não observamos déficit na atividade

locomotora nem na atividade sensório-motor, porém foi visto um déficit no comportamento

motor fino. A curcumina na dose de 100 mg/kg protegeu o animal desse déficit. Essa proteção

foi comprovada no teste do cilindro. O resveratrol não mostrou esta proteção

- Os animais parkinsonianos apresentaram um comportamento depressivo que foi

revertido pela curcumina e pelo resveratrol.

- A 6-OHDA promoveu déficit na memória aversiva e espacial, mas não na

memória de trabalho. A curcumina e o resveratrol protegeram contra os déficits na memória

aversiva recente e tardia. O resveratrol também protegeu os animais parkinsonianos na

memória espacial.

- Ocorreu um aumento do estresse oxidativo pela 6-OHDA, que foi revertido

parcialmente pela curcumina e amplamente pelo resveratrol.

- A depleção das monoaminas foi induzida pela 6-OHDA. A curcumina e o

resveratrol reverteram os níveis de Dopamina e Serotonina.

- A morte dos neurônios dopaminérgicos pela 6-OHDA foi demonstrada através

da imunorreatividade para Tirosina Hidroxilase e pela coloração Violeta de Cresil. A

curcumina e o resveratrol protegeram a morte dos neurônios no estriado direito e no

mesencéfalo.

A proteção observada pelos compostos pode ser atribuida aos mecanismos

antioxidantes que podem estar relacionados com redução de espécies reativas do oxigênio e

nitrogênio, anti-apopitóticos relacionados à diminuição da morte dos neurônios

dopaminérgicos e à diminuição da depleção das monoaminas. Através desses achados

podemos propor o resveratrol como uma substância promissora a ser explorada como agente

neuroprotetor para doença de Parkinson.

105

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128

ZHUANG, H., KIM, Y.S., KOEHLER, R.C., DORE, S. Potential mechanism by which

resveratrol, a red wine constituent, protects neurons. Annals of the New York Academy of

Sciences, v. 993 (Neuroprotective Agents), p.276-286, 2003.

129

ANEXO

Documents

EFEITO DA CURCUMINA E DO RESVERATROL · 1 ana paula fontenele menezes efeitos da curcumina e do resveratrol em ratos com parkinsonismos experimental induzido por 6-hidroxidopamina: