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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE EDUCAÇÃO FÍSICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM EDUCAÇÃO FÍSICA
CLAODETE HASSELSTROM NEVES
Efeitos da administração crônica da digoxina e do verapamil
sobre o desempenho físico e a estrutura e função cardíaca em
ratos submetidos ao treinamento físico intervalado
CUIABÁ-MT
2015
CLAODETE HASSELSTROM NEVES
Efeitos da administração crônica da digoxina e do verapamil
sobre o desempenho físico e a estrutura e função cardíaca em
ratos submetidos ao treinamento físico intervalado
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Educação Física da Universidade Federal de Mato
Grosso como requisito para a obtenção do título de Mestre
em Educação Física na Área de Concentração: Atividade
Física, Desempenho e Corporeidade, Linha de Pesquisa:
Ajustes e adaptações metabólicas e fisiológicas ao
exercício físico e a dieta.
Orientador: Profº. Dr. Mário Mateus Sugizaki
CUIABÁ-MT
2015
Dedico esse trabalho ao meu marido Alisson Leal das Neves, pela paciência, incentivo
e carinho. Sem o seu apoio seria impossível.
Ao meu filho Murilo H. Neves pela benção e alegria em minha vida. O seu sorriso e
carinho são o meu refúgio nas horas difíceis.
Dedico também às muitas pessoas (familiares, amigos, colegas de trabalho e minhas
atletas) que precisaram compreender minha ausência e distância durante esta caminhada.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus pelo dom da vida e por me dar força e fé para
continuar.
À minha família, em especial aos meus pais Nelso Ari Hasselstrom e Irma Maria
Hasselstrom, pela minha formação e base de sustentação, aos meus irmãos e irmãs (de quem
estive muito ausente durante os meus estudos e viagens).
Ao meu orientador Mario Mateus Sugizaki pela atenção em me orientar, pelo seu
exemplo profissional e pessoal na vida diária. Agradeço a oportunidade de ser sua orientanda.
Ao professor Danilo Henrique Aguiar, pela paciência e ajuda nas análises histológicas.
A professora Luanna Ferreira Gomes pelas análises de ecocardiograma.
A todos os colegas do mestrado, pela convivência, pelo aprendizado e pela força, em
especial a Camila Brandão, Maria Luisa Lima Holland, Greicielle Pereira Arruda e Silva pelo
apoio em Cuiabá e por colaborarem fazendo com que os meus dias longe de casa fossem
menos solitários e mais acolhedores.
Aos professores e alunos do grupo de estudo e do laboratório, principalmente aos que
se esforçaram junto comigo na execução deste trabalho, Sergio Luiz B. Souza, Gustavo A. F.
Mota, Caroline Tomazelli, Milena Nascimento, Antônio, Clarice, Isabela Signor, Karyn
Gysele de Souza, João F. M. Tavares, Luana Vuollo Botan e Maiara Petri Pires.
A minha secretaria Jéssica dos Santos e Sousa que cuidava do meu “anjinho” com
muito carinho e dedicação, principalmente durante as minhas viagens.
A minha auxiliar Fernanda da Rocha Schonberger que me substituía em tudo que era
possível na minha ausência com muita dedicação.
Enfim, a todos que acompanharam minha luta diária com os estudos, sem deixar de
lado meus papéis (mãe, esposa, professora, irmã e filha) e me apoiaram para que eu pudesse
continuar sem desistir de mais uma etapa importantíssima da minha vida.
“Fazer de tudo como se tudo dependesse de nós,
Sabendo que tudo depende de Deus”
Santo Inácio de Loyola
RESUMO
O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da administração crônica de digoxina e do
verapamil durante treinamento físico intervalado de alta intensidade (TFI) sobre o
desempenho físico, capacidade funcional e morfologia cardíaca de ratos. Para tanto, 48 ratos
Wistar, com 60 dias de idade, foram aleatoriamente distribuídos em 6 grupos(N=8/grupo):
controle, não treinado (C), treinado, sem administração de droga (T), digoxina sem
treinamento (DIGO), verapamil sem treinamento (VERA), treinado, com administração de
digoxina (TDIGO) e treinado, com administração de verapamil (TVERA). A digoxina e o
verapamil foram administrados via gavagem, na dose de 30µg/kg/dia e 5,0 mg/kg/dia
respectivamente, durante todo o período experimental. Os grupos T, TDIGO e TVERA foram
submetidos a um programa de TFI em esteira rolante durante 60 dias. Foi aplicado o teste de
esforço progressivo máximo (TEM) e determinada a concentração sérica de lactato (LAC)
sanguíneo. O TFI consistiu de sessões de corrida em esteira rolante 1 h/dia, 5 dias/semana por
60 dias. A intensidade de treino foi 80% da velocidade máxima (Vmáx) atingida no teste de
esforço antes do TFI por 8 min e 20% da Vmáx por 2 min. A função cardíaca foi avaliada por
ecocardiograma. Foi coletado o músculo esquelético, o músculo cardíaco e a gordura corporal
total (GOR) para os dados anatômicos, o ventrículo esquerdo (VE) para análise histológica e o
sangue para a análise bioquímica. A comparação entre os grupos foi realizada por meio da
análise de variância (ANOVA) e Kruskal Wallis para o esquema de dois fatores
independentes, complementada com o teste de Bonferroni, Tukey ou Dunn. O índice de
significância considerado foi de 5%. A relação VE/peso corporal final (PCF), o diâmetro
diastólico do VE (DDVE) e diâmetro sistólico do VE (DSVE) foram maiores no grupo
TDIGO do que o grupo T e DIGO. Os parâmetros do TEM foram maiores e a concentração de
LAC foi menor em ratos treinados em relação aos não treinados. A relação GOR/PCF foi
menor no TDIGO e TVERA em relação ao DIGO e VERA, respectivamente. A relação
VE/PCF foi maior no TVERA em relação ao VERA. O diâmetro interno do VE (DIVE) do
grupo T, TDIGO e TVERA foram maiores em relação ao C, o TDIGO teve aumento em
relação ao DIGO. O colesterol total e o LDL foram maiores no TDIGO comparado ao DIGO.
A área do cardiomiócito foi maior nos grupos VERA e T comparados ao grupo C. Conclusão:
O Treinamento intervalado promoveu hipertrofia cardíaca do tipo excêntrica. Entretanto, a
administração concomitante de digoxina ou de verapamil não afetaram a morfologia cardíaca,
a função cardíaca e o desempenho físico em ratos submetidos ao treinamento.
Palavras Chave: digoxina, verapamil, treinamento físico intervalado, desempenho físico,
função cardíaca, morfologia cardíaca
ABSTRACT
The aim of this study was to investigate the effects of chronic administration of cardiotonic
(digoxin) and the calcium channel blocker (verapamil) during high-intensity interval exercise
training (IET) on physical performance, functional capacity and cardiac morphology of rats.
For this study, 48 Wistar rats, 60 days old, were randomly distributed into 6 groups (N = 8 /
group): control, untrained (C), trained without drug administration (T), digoxin untrained
(DIGO), verapamil without training (VERA), trained with digoxin administration (TDIGO)
and trained with verapamil administration (TVERA). Digoxin and verapamil were
administered by gavage at a dose of 30μg/kg/day and 5.0 mg.kg-1
, respectively, throughout
the experimental period. The groups T, TDIGO and TVERA underwent a IET program on a
treadmill for 60 days. The progressive maximal exercise test was applied (TPM) and
determined the serum concentration of lactate (LAC) blood. The IET consisted of sessions
running on a treadmill 1 h/day, 5 days/week for 60 days. The training intensity was 80% of
the maximum velocity (Vmax) achieved in the stress test before the TAI for 8 min and 20% of
Vmax for 2 min. Cardiac function was assessed by echocardiography. Was collected skeletal
muscle, cardiac muscle and total body fat (TBF) for anatomical data, the left ventricle (LV)
for histological analysis and blood for biochemical analysis. The comparison between groups
was performed using analysis of variance (ANOVA) or Kruskal Wallis for the two
independent factors, complemented by the Bonferroni test, Tukey or Dunn. The significance
level considered was 5%. The ratio VE final body weight (FBW), LV diastolic diameter
(LVDD) and LV systolic diameter (LVSD) were higher in TDIGO group than the group T
and DIGO. The parameters MET were higher and the concentration of LAC was lower in rats
training in relation to the untrained. The relationship GOR/FBW was lower in TDIGO and
TVERA compared to DIGO and VERA respectively. The ratio VE/FBW was higher in
TVERA compared to VERA. The of the LV inside diameter (LVID) T group, TDIGO and
TVERA were higher compared to C, TDIGO had increased compared to DIGO. Total
cholesterol and LDL were higher in TDIGO compared to DIGO. The area of cardiomyocytes
was higher in VERA and T compared to group C. Conclusion: TAI induced cardiac
hypertrophy of the eccentric type. However, concomitant administration of digoxin or
verapamil did not affect the cardiac morphology, cardiac function and physical performance
in rats submitted to training.
Keywords: digoxin, verapamil, interval exercise training, physical performance, cardiac
function, cardiac morphology
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Transporte de cálcio nos miócitos cardíacos .......................................................... 16
Figura 2 - Via de sinalização no cardiomiócito resulta na hipertrofia cardíaca ...................... 17
Figura 3 - Estrutura química do verapamil .............................................................................. 20
Figura 4 - Mecanismo de ação, balanço iônico e contração no sarcolema ............................... 22
Figura 5 - Corte transversal da região endocárdica-miocárdica do ventrículo esquerdo ........ 33
Figura 4.1.1 - Weight gain of groups during experimental period ........................................... 40
Figura 4.1.2 - [A] Skeletal muscles weight e [B] Left ventricular weight normalized by body
weight of groups ...................................................................................................................... 41
Figura 4.1.3 - [A] Lactatemia e [B] Glycemia immediately after maximum progressive
exercise test at the end of internal training program ................................................................ 43
Figura 4.2.1 - Teste de esforço [A], Tempo total de teste (min) e [B] Distância total percorrida
(m) ............................................................................................................................................ 62
Figura 4.2.2 - Concentração plasmática de lactato após o teste de esforço máximo no
momento pós-treinamento ........................................................................................................ 63
Figura 4.2.3 - Dados histológicos do ventrículo esquerdo [A] Número de capilares, [B]
Relação capilares x área, [C] Número de capilares [D] Área nuclear [E] Área do
cardiomiócito ........................................................................................................................... 64
Figura 4.2.4 - Corte transversal da região endocárdica-miocárdica do ventrículo esquerdo .. 65
LISTA DE TABELAS
Tabela 4.1.1 - Energy intake and feed efficiency .................................................................... 40
Tabela 4.1.2 - Maximum progressive exercise test in pré-training, after 30 days and in post-
training ...................................................................................................................................... 42
Tabela 4.1.3 - Echocardiographic data of cardiac structural parameters .................................. 44
Tabela 4.1.4 - Echocardiographic data of cardiac functional parameters ............................... 44
Tabela 4.2.1 - Características somáticas e consumo alimentar dos grupos experimentais ...... 61
Tabela 4.2.2 - Relações entre gordura corporal, músculo cardíaco e esquelético com o peso
corporal final, espessura da parede e diâmetro interno do ventrículo esquerdo ....................... 61
Tabela 4.2.3 - Efeitos da administração de digoxina e verapamil sobre os parâmetros
bioquímicos séricos de animais submetidos ao treinamento físico intervalado ....................... 63
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 14
1.1 Objetivo geral ..................................................................................................................... 15
1.2 Objetivos específicos .......................................................................................................... 15
2. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 16
2.1 O Íon cálcio, o acoplamento (E-C) e a hipertrofia cardíaca ............................................... 16
2.2 Bloqueadores dos canais de cálcio (BCC) .......................................................................... 19
2.3 Cardiotônicos ...................................................................................................................... 21
2.4 Treinamento físico e o coração ........................................................................................... 24
3. METODOLOGIA ............................................................................................................... 27
3.1 Animais e grupos experimentais ........................................................................................ 27
3.2 Seleção e adaptação dos animais à esteira rolante .............................................................. 28
3.3 Teste de esforço progressivo máximo ................................................................................ 28
3.4 Protocolo de treinamento físico intervalado de alta intensidade ....................................... 29
3.5 Determinação do lactato e glicose sanguínea ..................................................................... 29
3.6 Avaliação da função ventricular por ecocardiograma ........................................................ 29
3.7 Perfil nutricional, dados anatômicos e análise bioquímica................................................. 30
3.8 Análise histológica ............................................................................................................ 31
3.9 Análises Estatísticas ........................................................................................................... 33
4. RESULTADOS ................................................................................................................... 34
4.1 Capítulo I ............................................................................................................................ 34
4.2 Capítulo II ........................................................................................................................... 55
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................................................. 71
6. REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 72
14
1 INTRODUÇÃO
O íon cálcio (Ca2+
) é um mensageiro intracelular que participa de vários processos
fisiológicos, incluindo a transcrição gênica, contração muscular e proliferação celular
(BERRIDGE, 1993; PETERSEN; BERRIGDE, 1994; CLAPHAM, 1995; BERRIDGE et al.,
1998). Nos cardiomiócitos, a superfície de cada célula contém milhares de canais que
controlam precisamente a entrada do Ca2+
(CLAPHAM, 2003) e sua homeostase é mantida,
principalmente, pela liberação e recaptura de Ca2+
pelo retículo sarcoplasmático (RS)
(STUDER et al.,1994). O receptor de rianodina (RyR2) medeia o efluxo de Ca2+
do RS, sendo
primordial no acoplamento excitação-contração (E-C), que resulta na contração e relaxamento
do miocárdio (BERS, 2000; CURRIE et al., 2004; CHEN et al., 2013).
O influxo de Ca2+
extracelular é inibido pelos fármacos bloqueadores dos canais de
cálcio (BCC) que bloqueiam os canais de Ca2+
(tipo L). A diminuição na concentração do
Ca2+
promove inotropismo negativo (diminuição da força de contração cardíaca) e
dromotropismo negativo (inibição da formação de impulsos e redução da velocidade de
condução no nódulo sinoatrial [SA] e átrio ventricular [AV] do coração) (GUTMAN, 1987).
Os BCCs agem também nas células do músculo liso vascular promovendo relaxamento,
resultando em vasodilatação (sistêmica e periférica) e redução da pressão arterial (PA)
(ELLIOTT; RAM, 2011).
Por outro lado, a utilização de glicosídeos cardiotônicos (GC) pode elevar o influxo de
Ca2+
. Os GCs inibem a bomba de sódio-potássio ATPase (Na+/K
+-ATPase) o que impede o
efluxo ativo de sódio (Na+) possibilitando sua troca com o Ca²
+ extracelular por meio do
trocador Na+/Ca
2+ (NCX) (SMITH, 1989). O consequente aumento do Ca²
+ intracelular
promove inotropismo positivo, dromotropismo negativo e cronotropismo negativo
(diminuição da frequência cardíaca) (GROSSMANN, 2001).
A literatura demonstra que a prática regular de exercício físico (EF) melhora a função
cardíaca (FERGUSON et al., 2001), pois está correlacionado com hipertrofia cardíaca (HC)
(PLUIM et al., 2000; OLIVEIRA; KRIEGER, 2002) e melhora da contratilidade dos
cardiomiócitos em decorrência do aumento dos níveis de Ca2+
intracelular e da sensibilidade
dos miofilamentos ao Ca2+
nos miócitos cardíacos (DIFFEE et al., 2001; NATALI et al.,
2004; WISLOF et al., 2001).
Embora o EF promova hipertrofia e aumente a contratilidade miocárdica, os exatos
mecanismos celulares e moleculares que promovem esses efeitos ainda permanecem
15
desconhecidos. Uma vez que o íon Ca²+
tem papel central na contratilidade cardíaca, a
hipótese do estudo é que alterações na condutância ao Ca²+
podem afetar diretamente o
desempenho físico, bem como a estrutura e função do coração. Desta forma, o objetivo desse
trabalho foi avaliar os efeitos da administração crônica de verapamil ou digoxina em ratos
submetidos ao treinamento físico intervalado de alta intensidade (TFI). Para responder essa
indagação, utilizou-se um GC (digoxina) ou um BCC (verapamil) para aumentar ou reduzir a
disponibilidade de Ca²+
intracelular em ratos saudáveis treinados.
1.1 Objetivo geral
Avaliar os efeitos da administração crônica de digoxina ou verapamil sobre o
desempenho físico e sobre a estrutura e função cardíaca em ratos submetidos ao treinamento
físico intervalado de alta intensidade.
1.2 Objetivos específicos
Testar a influência da administração das drogas sobre o desempenho físico;
Testar a influência da administração das drogas sobre parâmetros in vivo da estrutura e
função cardíaca utilizando a técnica de ecocardiograma;
Testar a influência da administração das drogas sobre a estrutura do miocárdio
utilizando as técnicas histológicas;
16
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 O Íon Cálcio, o acoplamento excitação-contração (E-C) e a hipertrofia cardíaca
O Ca2+
atua como segundo mensageiro nas células e controla grande variedade de
funções, abrangendo respostas de curta duração como contração e secreção, bem como
respostas de longa duração como transcrição, divisão e morte celular (CLAPHAM, 1995;
BOOTMAN et al., 2001). No sistema cardiovascular, o Ca2+
participa de diversos processos
como, condutância elétrica, acoplamento excitação-contração, morte celular, regulação
transcricional e sinalização hipertrófica no coração (BERS, 2008).
Para controlar a concentração intracelular de Ca2+
as células possuem mecanismos
altamente eficientes que utilizam um "kit" de canais, bombas e tampões citosólicos (Figura1)
(BERRIDGE; LIPP; BOOTMAN, 2000). Apesar do Ca2+
ser essencial para a atividade
normal da célula, a alta concentração é tóxico ao organismo.
Figura 1. Transporte de cálcio nos miócitos cardíacos. Fonte: (BERS, 2013).
O íon Ca2+
penetra no citoplasma celular por meio de diferentes canais. No sistema
cardiovascular os canais mais importantes são os de voltagem-dependente: canal tipo L (alta
voltagem) e canal tipo T. A corrente de Ca2+
predominante na maioria das células musculares
cardíacas e vasculares é efetuada por meio dos canais tipo L que se constituem em
17
subunidades alfa1, alfa 2, beta e delta, sendo que quatro subunidades alfa1 variantes já foram
identificadas (DOLPHIN, 2006). O canal de Ca2+
tipo L, no coração normal, está presente
tanto no miocárdio como no sistema de condução, enquanto o canal tipo T está
exclusivamente presente no sistema de condução, no nódulo SA e AV (OIGMAN; FRITSCH,
1998; GRANT, 2009). A despolarização do tubo T ativa o canal de Ca2+
tipo L, resultando em
um pequeno influxo de Ca2+
e garantindo a interação com o receptor de RyR2
(MOLKENTIN, 2006; BOOTMAM, 2012). A ativação sincronizada destes canais causa um
aumento transitório da concentração citoplasmática de Ca2+
de aproximadamente 100 nM a
aproximadamente 1 µM e uma subsequente contração transitória (CURRIE et al., 2004).
O Ca2+
é originário também de fontes intracelulares, este mecanismo de transdução no
músculo cardíaco é comumente referido como liberação Ca2+
induzida pelo Ca2+
(FABIATO,
1983). Durante o acoplamento E-C no músculo cardíaco, os íons Ca2+
são liberados no
sarcoplasma pelo retículo sarcoplasmático (RS), em resposta à despolarização do exterior das
membranas das fibras, o Ca2+
, em seguida, difunde-se para os filamentos finos, onde se ligam
aos sítios reguladores de Ca2+
troponina para ativar a contração muscular (BAYLOR;
HOLLINGWORTH, 2011).
Um conjunto de mudanças estruturais, no complexo troponina, permite a tropomiosina
deslocar-se ao longo do filamento de actina e permite a interação miosina-actina para produzir
força mecânica. O aumento e a redução na concentração do Ca2+
são os mecanismos
principais, o Ca2+
ativa diretamente os miofilamentos durante a sístole cardíaca causando
contração e durante a diástole o Ca2+
se dissocia dos miofilamentos levando ao relaxamento
(MAIER; BERS, 2002).
Para que ocorra o relaxamento do cardiomiócito, o Ca2+
livre deve ser transportado
para fora do citoplasma para restabelecer o potencial da membrana, sendo necessária a
dissociação do Ca2+
dos sítios de ligação com a troponina C e sua diminuição/remoção do
sarcoplasma. Essa remoção do Ca2+
do sarcoplasma durante o relaxamento ocorre por meio de
processos que envolvem a isoforma cardíaca da Ca2+
ATPase do retículo sarcoplasmático
(SERCA2a) (74%), trocadores NCX sarcolemal (24%), a Ca2+
ATPase do sarcolema (1%) e a
captação mitocondrial de Ca2+
(1%) em miócitos ventriculares de humanos e coelhos.
Alterações na regulação intracelular do Ca2+
podem resultar em disfunção elétrica e mecânica
(arritmias e redução do débito cardíaco) e algumas doenças são associadas (BERS, 2013). Em
geral, na insuficiência cardíaca, a função e a expressão da SERCA2a são reduzidas, enquanto
que a expressão e função do NCX é aumentada (MAIER; BERS, 2002).
18
Durante condições estáveis, a mesma quantidade de Ca2+
deve ser fornecida e
removida a partir do citosol durante cada fluxo cardíaco (MAIERS; BERS, 2002). O
transiente de Ca2+
pode estar elevado em condições fisiológicas durante ativação simpática do
receptor β1 – adrenérgico, ou em circunstâncias fisiopatológicas, como durante hipóxia ou
isquemia do músculo cardíaco. As catecolaminas liberadas por via endógena ativam os
receptores β-adrenérgicos, o que resulta na ativação da adenilato-ciclase, aumento da
adenosina monofosfato cíclico (AMP) e da atividade da proteína quinase A dependente do
AMP cíclico (PKA). A PKA possibilita a fosforilação e ativação direta tanto de canais de
cálcio tipo L e T, dos RyRs, da troponina I (reduz a sensibilidade da TnC ao Ca2+
) e da
fosfolambam (PLB) culminando no aumento da concentração de Ca2+
(BERS, 2008).
A sinalização dependente de Ca2+
além da resposta funcional, também está envolvida
na regulação transcricional e sinalização hipertrófica no coração (Figura 2).
Figura 2. Via de sinalização no cardiomiócito resulta na hipertrofia cardíaca. Fonte: (FREY; OLSON, 2003).
O tipo de resposta, funcional ou hipertrófica, é dependente da velocidade e da
intensidade do aumento da concentração do Ca2+
citosólico (KATZ, 2010). Enquanto que a
resposta funcional é dependente de elevadas e breves variações, a resposta hipertrófica está
relacionada a pequenas e sustentadas variações nas concentrações de Ca+2
.
No músculo cardíaco, o Ca²+ contribui diretamente como um importante fator para a
ativação de cinases e fosfatases envolvidas na regulação de genes envolvidos no processo de
19
excitação-transcrição (BERRIDGE, 1993). Evidências sugerem que a resposta hipertrófica
miocitária ao Ca+2
está associada com a ativação das proteínas quinases C (PKC), da cálcio-
calmodulina-quinase II (CaMKII) e da calcineurina-fosfatase (CaN) pelo complexo
cálcio/calmodulina (CaM) (CLAPHAM, 2007; KATZ, 2010).
A Ca+2
calmodulina quinase (CaMK) pertence à classe das serina-treonina quinases,
sendo ativada por aumento nos níveis de Ca+2
intracelular, esta enzima atua no processo de
fosforilação de proteínas envolvidas no transporte de Ca+2
, como os RyR, PLB e também
modulando os canais de Ca+2
do tipo L e consequentemente o acoplamento excitação-
contração nos miócitos cardíacos (BERS, 2008). A modulação da CaMK pelo Ca+2
é dada
através de sua capacidade de se ligar ao complexo Ca+2
/CaM. A ligação com o complexo
Ca+2
/CaM induz mudança conformacional da enzima promovendo sua ativação e subsequente
autofosforilação, a ativação da PKC e da CAMKII fosforilam fatores transcricionais nucleares
(ANDERSON, 2005).
A calcineurina é uma serina-treonina fosfatase dependente de Ca+2
/CaM. O
envolvimento da via Ca+2
-CaM-calcineurina-NFAT é reconhecido como uma das principais
vias que interligam a sinalização da membrana celular ao núcleo da célula. Em resposta ao
aumento da concentração intracelular de Ca+2
, o complexo Ca+2
-CaM liga-se à subunidade
regulatória da calcineurina, induzindo modificação conformacional que permite a
defosforilação de substratos, tais como o fator nuclear de células T ativadas (NFAT) do
inglês, nuclear fator of activated T-cells (FREY;OLSON 2003).
Em condições basais, o NFAT fosforilado, encontra-se no citoplasma; após a
desfosforilação é translocado para a região promotora nuclear, promovendo ativação de genes
músculo-específicos e, consequentemente, a hipertrofia cardíaca (ANDERSON, 2005; KATZ,
2010).
O processo de aumento da massa celular em resposta a estímulos de crescimento não é
apenas um processo adaptativo do cardiomiócito em resposta ao aumento da carga de
trabalho, mas também uma das mais importantes complicações clínicas de distúrbios
cardiovasculares (SCHLUTER; PIPER, 1999).
2.2 Bloqueadores dos canais de cálcio (BCC)
Os BCCs são um grupo heterogêneo de drogas com muitos efeitos variáveis no músculo
cardíaco como: função do nodo sinusal, condução atrioventricular, vasos sanguíneos
20
periféricos e circulação coronariana (FRISHMAN, 1997). São compostos por um grupo
heterogêneo com quatro famílias distintas: os derivados das diidropiridinas (como, por
exemplo, nifedipina, felodipina, lacidipina e amlodipina), dos benzotiazepínicos (como, por
exemplo, diltiazem), das fenilalquilaminas (como, por exemplo, verapamil) e tetralol
(mebefradil). Esses fármacos compartilham o mecanismo comum de ação que inibe
seletivamente o fluxo de Ca2+
nos canais de Ca2+
tipo L (PITT, 1997; OPIE et al., 1987). As
três primeiras classes são as mais amplamente empregadas no manejo das desordens
cardiovasculares como hipertensão, angina pectoris e arritmia cardíaca (SRINIVASAN;
SIVARAMAKRISHNAN; KARTHIKEYAN, 2011; SUWALSKY et al., 2010).
Os canais de Ca2+
voltagem dependente do miocárdio são compostos de subunidades e
os BCCs ligam-se à subunidade alfa1 (NIGRO; FORTES, 2005); cada subclasse de BCC atua
em um sítio específico do canal e, consequentemente, exibem diferentes comportamentos
farmacológicos (BEAN, 1991).
O efeito terapêutico do verapamil baseia-se na inativação do influxo de Ca2+
para o
meio intracelular, de modo que os níveis citosólicos desse íon tornam-se mais baixos
(FISHER; GROTTA, 1993) (Figura 3).
Figura 3. Estrutura química do verapamil. Fonte: SUWALSKY et al., 2010.
Esse mecanismo de ação ocorre quando o fármaco se liga ao receptor no canal de
Ca2+
, interagindo entre si e com o maquinário de transporte do canal, vetando sua abertura,
com consequente inibição da entrada do Ca2+
(RANG et al., 2007).
A ativação de receptores RyR2 é inibida com a baixa concentração de Ca2+
e a
liberação deste íon por parte do RS também fica comprometida, resultando em inotropismo
negativo (KATZ et al., 2010).
As baixas concentrações de Ca2+
no interior dos cardiomiócitos proporcionam
respostas que incluem vasodilatação arterial coronária e periférica, bem como restrição da
21
contração miocárdica e perda de velocidade de condução nodal (BOMBIG; PÓVOA, 2009),
embora os mecanismos envolvidos no acoplamento E-C do miocárdio e do músculo liso
vascular sejam substancialmente diferentes (OIGMAN; FRITSCH, 1998).
Os BCCs tem ação direta dilatadora sobre o músculo liso arterial periférico (STONE
et al., 1980; OPIE, 1984) e inativam os canais voltagem-dependente na musculatura lisa
arterial em concentrações significativamente inferiores àquelas necessárias para alterar a
liberação de Ca2+
intracelular ou para inibir os canais de Ca2+
operados por receptores
(BRUNTON et al., 2006).
São utilizados no tratamento da insuficiência cardíaca congestiva (ICC) devido às suas
ações como dilatadores arteriolares, agentes anti-isquêmicos e relaxantes de função diastólica
ventricular esquerda, podendo também prevenir a progressão da disfunção do miocárdio
(PIEPER, 1996).
O verapamil diminui a magnitude da corrente de Ca2+
e, adicionalmente, diminui a
taxa de recuperação do canal de Ca2+
. A velocidade de condução AV sobre a atividade do
marca-passo do nódulo SA é dependente do potencial retardador de recuperação do canal
resultando em efeito dromotrópico negativo (BRUNTON et al.,2006).
Os BCCs como o verapamil, diidropiridinas (ex.: nifedipino) e diltiazem previnem
alterações moleculares e celulares associadas com hipertrofia e são utilizados como anti-
hipertensivos, antiarrítmicos e antianginosos, sendo que o verapamil afeta preferencialmente o
coração (HENRY, 1980; CHAFFMAN; BROGDEN, 1985; BOMBIG et al. 1996; PEREIRA;
MANDARIM-DE-LACERDA, 2001; GROSSMAN; MESSERLI, 2004; RANG et al., 2007;
AGO et al., 2010).
Estudos de meta-análise têm demonstrado que os BCCs determinam regressão na
hipertrofia ventricular esquerda, promovem melhora na função diastólica do VE e reduzem
significativamente a resistência vascular periférica mantendo o débito cardíaco normal nos
indivíduos sem comprometimento na função sistólica (OIGMAN; FRITSCH, 1998).
2.3 Cardiotônicos
Os termos “digital” ou glicosídeo cardiotônico” são usados para se referir a qualquer
um dos esteroides ou compostos glicosídeos esteroides que exercem efeitos característicos
positivamente inotrópicos e eletrofisiológicos no coração. Todos os esteroides cardioativos
22
partilham a propriedade de serem inibidores potentes da bomba de Na+/K
+-ATPase
(HAUPTMAN; KELLY, 1999).
As bombas e os trocadores iônicos são de extrema importância para a regulação direta
ou indireta dos níveis citosólicos de cálcio. A Figura 4 mostra os principais mecanismos de
controle de influxo e efluxo de íons Ca2+
do meio intracelular, onde a regulação da
concentração de Ca2+
determina os mecanismos de contração e/ou relaxamento muscular.
Figura 4. Mecanismo de ação, balanço iônico e contração no sarcolema. Fonte: (BRUNTON; LAZO;
PARKER, 2006).
A etapa 1 corresponde ao influxo de Na+ pela abertura do canal de Na
+ ativado na
despolarização, durante o potencial de ação cardíaco normal e acoplamento E-C, uma
quantidade relativamente pequena de Ca2+
entra na célula via ativação de canais de Ca2+
tipo
L (local da ação do verapamil) (etapa 2); esta entrada de Ca2+
estimula o receptor de RyR2 e
desencadeia a liberação de Ca2+
do RS através do sistema de liberação induzida por Ca2+
(etapa 3); o aumento da concentração de Ca2+
faz que o íon interaja com a troponina C (TnC),
removendo o efeito inibitório que o complexo troponina-tropomiosina exerce sobre a
interação actina-miosina, resultando em encurtamento do sarcômero e, consequentemente,
contração muscular (etapa 4); o relaxamento inicia-se na etapa 5, onde a bomba de Ca2+
do
RS (SERCA2a) recaptura a maior parte do Ca2+
citosólico ao RS; a etapa 6 mostra a bomba
Ca2+
ATPase da membrana celular removendo o Ca2+
citosólico para o meio extracelular e a
etapa 7 mostra o trocador NCX contribuindo com a remoção do Ca2+
(BERS, 2013). A bomba
de Na+/K
+-ATPase (etapa 8) bombeia 3 cargas positivas (3Na
+) para fora e 2 cargas (2K
+)
para dentro, o ambiente intracelular torna-se mais negativo que o extracelular e essa diferença
Contraction
External
Internal
23
de voltagem é essencial para a manutenção do potencial de repouso das células e determina a
atividade excitatória do músculo.
A ação inotrópica positiva induzida pela digoxina é decorrente da inibição da Na+/K
+-
ATPase que interfere no transporte ativo de Na+ e de K
+ através da membrana celular. A
inibição, por sua vez, eleva o Na+ intracelular, sua remoção via trocador NCX aumenta a
disponibilidade de Ca2+
intracelular. O aumento da disponibilidade de Ca2+
junto às proteínas
contráteis resulta na dissociação da tropomiosina e maior possibilidade de sítios de interação
entre actina e miosina, resultando na contração mais forte do miocárdio (SMITH, 1993;
KATZ et al., 2010) e resultam em hipertrofia de cardiomiócitos (PENG et al., 1996;
HUANG; LI; XIE, 1997; BRUNTON; LAZO; PARKER, 2006; SCHONER; SCHEINER-
BOBIS, 2007; SAINI-CHOHAN; GOYAL; DHALLA, 2010).
Os efeitos benéficos dos GCs na insuficiência cardíaca congestiva (ICC) são
provavelmente atribuíveis ao seu efeito inotrópico positivo, a redução da taxa de condução
cardíaca e neuro-hormonal (LIU; BROWN; O’ROURKE, 2010). A redução da taxa de
condução cardíaca se traduz por alentecimento da condução AV do estímulo elétrico, isso se
deve ao estímulo vagal proporcionado pelo GC, além de sua ação direta nas células da junção
de oclusão (KATZ, 2010). O efeito neuro-hormonal caracteriza-se pela redução da atividade
simpática, estimulação da ação vagal e aumento da sensibilidade dos reflexos barorreceptores
e cardiopulmonares (GUIMARÃES et al., 2002). O estímulo vagal e a melhoria das
condições hemodinâmicas, com consequente menor estimulação simpática, causam redução
da frequência cardíaca (FC) (GILLIS, 1979; GHEORGHIADE; FERGUNSON, 1991).
Devido a seus efeitos benéficos, os GCs têm sido utilizados há décadas para tratar a
ICC (SCHONER; SCHEINER-BOBIS, 2007) e certos tipos de arritmias cardíacas (XIONG et
al., 2012). Seu uso é recomendado em pacientes sintomáticos com ICC predominantemente
sistólica e em pacientes com ritmo de fibrilação atrial e frequência ventricular elevada,
(GUIMARÃES et al., 2002; HAAS; YOUNG, 1999). A digoxina é recomendada por diversas
associações para o tratamento da ICC em circunstâncias clínicas específicas, no entanto,
atualmente é menos utilizada do que no passado, devido à janela terapêutica e toxicidade da
droga (HUNT et al., 2005, 2009; KATZ, 2010).
O aumento da concentração de Ca2+
no citosol é responsável pelo efeito inotrópico
positivo e pelos efeitos arritmogênicos dos glicosídeos em doenças cardiovasculares, o
principal efeito adverso das drogas digitálicas (XIONG et al, 2012; LIU; BROWN;
O’ROURKE, 2010). Clinicamente, a dosagem de digoxina usualmente empregada é de 0,25
mg/dia para pacientes com função renal normal. Por apresentar um índice terapêutico baixo, a
24
digoxina expressa frequentemente manifestações tóxicas em pacientes que fazem o seu uso e
deve ser acompanhada pela dosagem do seu nível sérico.
Ações tóxicas e inotrópicas de GCs podem, de fato, compartilhar um mecanismo
comum e estudos procuram descobrir fatores importantes na determinação dos efeitos
terapêuticos e toxicidade, reduzindo a taxa de mortalidade por intoxicação devido a novas
modalidades de tratamento (KIRILMAZ et al., 2012).
2.4 Treinamento físico e o coração
O EF é o estímulo fisiológico mais importante para o aumento da demanda de
oxigênio do miocárdio. A exigência do músculo exercitado para o aumento do fluxo de
sangue exige um aumento do débito cardíaco, o que resulta em aumentos nas três principais
determinantes da demanda de oxigênio do miocárdio: FC, a contratilidade miocárdica e o
trabalho ventricular (DUNCKER; BACHE, 2008). A resposta cardiovascular ao EF depende
da característica do exercício executado, ou seja, o tipo, a intensidade, a duração e a massa
muscular envolvida (BRUM et al., 2004).
O treinamento físico (TF) induz respostas adaptativas por meio de adaptações
morfológicas, eletrofisiológicas, bioquímicas e metabólicas no músculo cardíaco (MARON,
2001). Os diferentes sinais (mecânico, neuro-humoral, etc) são traduzidos no interior da célula
como alterações bioquímicas que levam à ativação de segundos mensageiros (citosólicos) e
terceiros e quartos mensageiros (nucleares) que irão agir no núcleo da célula, interagindo com
o DNA, promovendo a reprogramação da atividade celular (OLIVEIRA; KRIEGER, 2002).
As adaptações no sistema cardiovascular induzidas pelo TF incluem aumento do peso
e volume das câmaras ventriculares, hipertrofia do cardiomiócito, aumento do débito cardíaco
e melhora da função contrátil. Estas adaptações produzem melhora no desempenho nos níveis
de trabalho máximo e submáximo, proporcionando melhora da função cardíaca por meio de
adaptações celulares e subcelulares (DIFFEE et al., 2001; KEMI et al., 2002; WISLOFF et al.,
2002).
O EF pode aumentar a sensibilidade dos miofilamentos ao Ca2+
(WISLOFF et al.,
2002; KEMI et al., 2007), estas adaptações são mais pronunciadas nas células situadas
próximas ao endocárdio (NATALI, 2004). Os estudos de Kemi e colaboradores (2005)
encontraram relação direta e positiva entre a capacidade de exercício e concentração de Ca2+
25
em cardiomiócitos isolados dos ventrículos de ratos. Esta relação também foi relatada por
outro estudo, sendo reforçada pelo aumento observado nos níveis de expressão de SERCA2a
e RyR2 (PRIMOLA-GOMES et al., 2009).
A literatura tem documentado que o TF induz hipertrofia ventricular e aumento da
contratilidade miocárdica (NAYLOR et al., 2008; PLUIM et al., 2000; WISLOFF et al.,
2001). Essas adaptações morfo/funcionais estão relacionas ao aumento do Ca2+
transiente
(WISLOFF et al., 2001; PRIMOLA-GOMES et al., 2009) e às estruturas envolvidas na
homeostasia do Ca2+
citosólico como o aumento da Ca2+
ATPase do RS (SERCA2a)
(BUTTRICK et al. 1994; TATE et al, 1996; WISLOFF et al., 2001, KEMI et al., 2007;
MEDEIROS et al., 2008; PRIMOLA-GOMES et al., 2009) e dos receptores de rianodina
(STAUFFER; MITRO; MOORE, 1993; LANKFORD et al., 1998, PRIMOLA-GOMES et al.,
2009).
Este processo é complexo e envolve a geração de sinais na membrana celular que
ativam uma cascata de vias de sinalização intracelular, as quais regulam a atividade gênica e
proteica necessária para o crescimento do miócito (HEINEKE; MOLKENTIN, 2006). O Ca2+
é um mensageiro intracelular que participa de vários processos fisiológicos e um importante
mensageiro citoplasmático da cascata de eventos da hipertrofia cardíaca (BERS, 2008).
A hipertrofia cardíaca constitui-se num dos principais mecanismos de adaptação do
coração em resposta à sobrecarga de trabalho, de pressão ou de volume imposta ao coração
em determinadas condições. Esse aumento da massa ocorre em decorrência de alterações
genéticas isoladas, como a cardiomiopatia hipertrófica, em resposta a condições
fisiopatológicas, tais como a hipertensão arterial, infarto do miocárdio ou de hiperatividade
simpática ou como resposta fisiológica devido à sobrecarga de trabalho impostas pelo
treinamento físico dinâmico e estático realizado de forma crônica por atletas (MCMULLEN;
JENNINGS, 2007).
Estudos em animais tem demonstrado que hipertrofia fisiológica e patológica possuem
distintas bases moleculares e estruturais, o treinamento intervalado de alta intensidade ativa a
via de sinalização Akt/mTOR no coração, enquanto genes fetais não são ativado. A
sobrecarga de pressão induz hipertrofia patológica e reativação de genes fetais no coração e
baixa regulação da via Akt/mTOR , sugerindo que esta via é associada com a hipertrofia
fisiológica com melhora da função contrátil (KEMI et. al, 2008).
Exercícios isotônicos como a corrida, caminhada, ciclismo e natação, envolvem
movimento de grandes grupos musculares. A profunda vasodilatação do músculo esquelético
que é envolvido produz hipertrofia excêntrica pelo aumento do retorno venoso para o coração
26
e sobrecarga de volume (aumento de pré-carga), com a adição dos sarcômeros em série
resultando em aumento da câmara cardíaca e sem aumento na espessura da parede. Por outro
lado, exercícios estáticos ou isométricos, como o levantamento de peso, envolve o
desenvolvimento da tensão muscular contra a resistência com pouco movimento, causando a
sobrecarga de pressão (aumento da pós-carga) com a adição dos sarcômeros em paralelo
resultando em aumento da espessura da parede sem aumento de câmaras (GROSSMAN,
1980; HASHIMOTO et al., 2011; PELLICCIA, 2012).
O TFI de alta intensidade consiste em períodos alternados de alta e baixa intensidade,
podendo induzir alterações centrais (cardiovascular) e periféricas (músculo esquelético)
semelhantes ou até mesmo superiores que os exercícios contínuos em uma série de
marcadores fisiológicos, de desempenho e relacionados à saúde, tanto em indivíduos
saudáveis como em populações doentes (PEREIRA et al., 2013; GIBALA et al., 2012).
A hipótese de que o TFI resulta em maiores adaptações benéficas ao coração
comparado com o observado depois do treinamento moderado (TM) é suportada por recentes
estudos clínicos, experimentais e epidemiológicos. O TFI tem demonstrado maior influência
na função cardíaca e capacidade aeróbica do que TM em humanos (HELGERUD et al., 2007),
roedores (KEMI et al., 2005) e em pacientes com insuficiência cardíaca (WISLOFF et al.,
2007).
De maneira geral, o treinamento físico melhora a função cardíaca que está relacionada
ao aumento no consumo máximo de oxigênio, do volume sistólico, do débito cardíaco, na
condutância sistêmica vascular, na diferença do oxigênio arteriovenoso e bradicardia de
repouso (BLOMQVIST; SALTIN, 1983), além de modificações no balanço simpático-vagal
(ALMEIDA; ARAÚJO, 2003) e redução da PA pós-exercício em relação aos níveis pré-
exercício (MACDONALD, 2002).
27
3 METODOLOGIA
3.1 Animais e grupos experimentais
No presente estudo, foram utilizados 48 ratos machos da linhagem Wistar, com 60
dias de idade, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal de Mato Grosso
(UFMT) - Campus Cuiabá, Mato Grosso, Brasil. Os animais foram mantidos em gaiolas
coletivas de polipropileno (4 animais/gaiola) cobertas com grades metálicas, ambiente com
temperatura controlada (24 ± 2ºC) e sob um ciclo claro-escuro de 12h (12h/12h). A ingestão
alimentar foi controlada diariamente e o peso corporal dos animais monitorado
semanalmente, os animais foram alimentados com ração comercial (3,5 kcal/g em 26%
proteína, 3% lipídeos, 54% carboidratos e 17% outros; Labina; Purina, Paulínia, SP, Brazil) e
água ad libitum. Esta dieta padrão segue as recomendações sobre as necessidades
nutricionais de animais de laboratório (BENEVENGA et al. 1995) e garante tanto o bem-
estar dos animais como a confiabilidade dos resultados experimentais. Este estudo foi
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Federal de Mato
Grosso (CEPA – UFMT) (protocolo nº: 23108.019254/11-0) e conduzido de acordo com as
normas estabelecidas no "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals", na Lei
11.794/2008, e Princípios Éticos na Experimentação Animal do Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA).
Os ratos foram aleatoriamente distribuídos em seis grupos (N=8/grupo): controle, não
treinado (C), treinado, sem administração de droga (T), digoxina sem treinamento (DIGO),
verapamil sem treinamento (VERA), treinado, com administração de digoxina (TDIGO) e
treinado, com administração de verapamil (TVERA). A dose de digoxina (Pharlab Indústria
Farmacêutica, Lagoa da Prata-MG) foi de 30,0 µg/kg, a dose de Verapamil foi de 5,0 mg/kg
e ambas foram administrada via gavagem, uma vez ao dia, durante todo período
experimental, incluindo a fase de adaptação e treinamento (75 dias). A concentração de
digoxina estabelecida em nosso estudo baseou-se nos trabalhos de Wang et al. (2001) e
Manunta et al. (2000) os quais utilizaram 32µg/kg/dia e 30µg/kg/dia respectivamente, em
ratos Sprague-Dawley normotensos durante 5 ou 6 semanas. A dosagem de verapamil
utilizada em nosso estudo é a mesma dosagem empregada clinicamente para pacientes
hipertensos. Os grupos C e T foram submetidos ao mesmo procedimento da gavagem,
28
porém, receberam apenas o mesmo volume do veículo da dissolução da droga para garantir
as mesmas condições a todos os grupos.
3.2 Seleção e adaptação dos animais à esteira rolante
Os animais dos grupos treinados (T, TDIGO e TVERA) foram previamente
selecionados por meio de testes submáximos, a partir dos quais se observou a resposta
positiva de cada animal ao estímulo de corrida em pelo menos cinco testes (MANCHADO-
GOBATTO, et al., 2010). Antes de iniciar o programa de treinamento, os grupo T, TDIGO e
TVERA foram submetidos a um protocolo de adaptação à esteira, com duração de 1 semana
(velocidade de 10m/mim, 15 minutos por dia). O objetivo da fase de adaptação foi minimizar
os efeitos do estresse do ambiente (esteira rolante), sem promover qualquer estímulo
adaptativo ao treinamento físico.
3.3 Teste de esforço progressivo máximo
Para avaliar o desempenho físico nos momentos pré e pós-treinamento, os grupos T,
TVERA e TDIGO foram submetidos ao teste de esforço máximo (TEM) em esteira rolante,
de acordo com o protocolo adaptado de Manchado-Gobatto et al. (2007). As variáveis
analisadas durante o teste foram: velocidade média (Vm), velocidade máxima (Vmáx), tempo
e distância percorrida. A velocidade inicial do teste foi de 10 m/mim, sendo
progressivamente aumentada (2m/min) a cada 2 minutos, até a exaustão.
O critério de exaustão adotado para o teste foi à incapacidade de manter a velocidade
requerida durante 5 segundos. O teste máximo foi repetido após 30 dias do início do
treinamento para ajuste das cargas de exercício. Ao final do período experimental os grupos
T, TVERA e TDIGO foram novamente submetidos ao teste de esforço, juntamente com os
grupos C, VERA e DIGO.
29
3.4 Protocolo de treinamento físico intervalado de alta intensidade
O protocolo de treinamento físico foi adaptado de Kemi et al. (2007). O treinamento
intervalado tem sido proposto como estratégia adequada para promover respostas benéficas
sobre a função e hipertrofia cardíaca (WANG; WISLOFF; KEMI, 2010). Após o pré-teste, os
grupos T, TVERA e TDIGO foram submetidos a um programa de TF intervalado em esteira
rolante (8 minutos em velocidade correspondente à 80% da Vmáx e 2 minutos em velocidade
correspondente à 20% da Vmáx), durante 60 dias. O tempo diário de treinamento foi
adaptado progressivamente nas 4 primeiras semanas (30, 40, 50 e 60 minutos
respectivamente).
3.5 Determinação do lactato e glicose sanguínea
Para avaliar a eficácia do protocolo de TF, foi determinada a concentração de lactato
sanguíneo imediatamente após o teste de esforço máximo. Para tanto, foi utilizado um
lactímetro portátil da marca Roche (modelo: Accutrend Plus, Alemanha), capaz de quantificar
a concentração de lactato em pequenas quantidades de sangue. Para o teste de glicemia foi
utilizado um glicosímetro portátil da marca Roche (modelo: Accu-Check Advantage,
Alemanha). Para cada teste foi coletada uma gota de sangue da extremidade da cauda do
animal (FREITAS et al. 2010).
3.6 Avaliação da função ventricular por ecocardiograma
O ecocardiograma representa uma alternativa para o estudo da função ventricular e
pode oferecer importantes informações sobre o desempenho cardíaco de roedores. Ao término
do período experimental e 24 horas antes da eutanásia, os ratos foram submetidos à avaliação
da função ventricular. Os animais foram anestesiados com cloridrato de cetamina (50mg/kg) e
cloridrato de xilazina (1mg/kg), administrados por via intramuscular. Após tricotomia da
região anterior do tórax, os ratos foram posicionados e as imagens ecocardiográficas
30
bidimensionais em modo-M foram obtidas por via transtorácica paraesternal esquerda,
utilizando o equipamento modelo (Mylab 30 Vetgold, marca Esaote, Gênova, Itália). Um
transdutor linear de 18 MHZ (Mylab 30 Vetgold, marca Esaote, Gênova, Itália) foi utilizado
para realizar os cortes no eixo curto. Para as medidas da parede posterior do VE e septo
interventricular, e diâmetro do VE em diástole e sístole, foram utilizadas imagens no modo-M
com o cursor colocado no nível médio do músculo papilar, visualizando as bordas endocardial
e epicardial do coração movendo e angulando o transdutor (REFFELMANN; KLONER,
2003). Para as medidas do diâmetro do átrio esquerdo e da aorta foram utilizadas imagens no
modo-M com o cursor colocado de modo a dividir a aorta ao meio quando os folhetos são
visibilizados e atravessando o átrio esquerdo (BOON, 2004). Para avaliar a função sistólica do
VE, foi calculada a fração de ejeção [(DDVE3 – DSVE
3) / DDVE
3], a porcentagem de
encurtamento endocárdico (∆D end), [(DDVE – DSVE) / DDVE], a porcentagem de
encurtamento mesocárdico, ∆D meso {[(DDVE + ½ EDPP + ½ EDSIV) – (DSVE + ½ ESPP
+ ½ ESSIV)] / (DDVE + ½ EDPP + ½ EDSIV)}.
3.7 Perfil nutricional, dados anatômicos e análise bioquímica
Dois dias após o término do período experimental, os animais (em estado de jejum -
12 horas) foram anestesiados com cloridrato de cetamina (50mg/kg) e cloridrato de xilazina
(1 mg/kg) e eutanasiados por decapitação.
A avaliação nutricional foi realizada pela análise de ingestão calórica (IC), eficiência
alimentar (EA) e gordura corporal total. A IC foi calculada de acordo com a seguinte
fórmula:
IC =
onde IAC é a ingestão alimentar diária (g), VER é o valor energético da ração (g x kcal) e N
é o número de animais na gaiola. Para o cálculo do VER deve-se considerar que 1 g de ração
corresponde a 3,5 kcal. A EA, que analisa a capacidade do animal converter a energia
alimentar consumida em peso corporal, foi calculada dividindo-se o ganho total do peso dos
animais (g) pela energia total ingerida (Kcal) (NASCIMENTO et al., 2008). Após a
eutanásia, foram coletados os depósitos de gordura. A quantidade de gordura corporal total
31
foi determinada pela somatória dos depósitos de gordura epididimal, retroperitoneal e
visceral, normalizada pelo peso corporal final (g/g).
Ao final do experimento, o coração foi imediatamente retirado da cavidade torácica e
lavado com solução fisiológica. O ventrículo direito (VD) e VE foram separados dos átrios;
também foram retirados o músculo sóleo e o extensor longo dos dedos (EDL). Todas as
amostras foram pesadas em balança analítica (marca Shimadzu, modelo AUY 220-
Alemanha). O peso dos músculos foi normalizado pelo peso corporal final. Fragmentos do
VE foram colocados em solução de cloreto de potássio (KCL) para que o ciclo cardíaco fosse
interrompido em diástole, foram medidas a espessura da parede do VE (EPVE) e o diâmetro
interno do VE (DIVE) com o auxílio de um paquímetro de aço inox (Jomarca- China) em
seguida, o VE foi colocado em solução de fixador para posterior análise histológica.
Para a análise bioquímica, as amostras de sangue foram coletadas em tubos Falcon,
centrifugadas a 3000 rpm por 10 minutos e armazenadas em freezer à -80º C. As
concentrações séricas de creatinina, colesterol total, triglicérides, lipoproteína de alta
densidade (hight density lipoproteín - HDL), lipoproteína de baixa densidade (light density
lipoprotein - LDL), lipoproteína de muito baixa densidade (very light density lipoprotein-
VLDL), transaminase glutâmica oxalacética (TGO), transaminase glutâmica pirúvica (TGP) e
proteínas totais foram determinadas utilizando-se kits específicos (BIOCLIN®
, Belo
Horizonte, MG, Brasil) e analisadas pelo método enzimático colorimétrico automatizado
(Technicon, RA-XTTM
System, Global Medical Instrumentation, Minessota, USA).
3.8 Análise histológica
Para a análise histológica foram obtidas amostras, no formato de anel, retiradas a partir
de cortes transversais do terço médio do VE e imersas em fixador paraformaldeído 10%
tamponado para posterior análise. As amostras foram lavadas em água corrente para retirar o
excesso de fixador e a seguir foram desidratadas em séries crescentes de álcoois (álcool 70%
por 24 horas, álcool 80% por 4 horas e álcool 95% por 4 horas). Em seguida, na pré-
infiltração, utilizou-se a mistura do etanol 95% com a resina de infiltração por 8 horas a - 4o
C. Na etapa seguinte, na infiltração, as amostras foram imersas apenas em resina de infiltração
por 24 horas a - 4o
C. Finalmente, na inclusão, as amostras foram posicionadas, na orientação
transversal, em moldes de plástico de medida 9x4mm, e sobre elas verteu-se a resina de
32
infiltração com uma solução aceleradora para iniciar o endurecimento da resina à temperatura
ambiente. Após o endurecimento das amostras, as mesmas foram retiradas dos moldes e fez-
se o emblocamento, na qual as peças de resina foram coladas sobre um suporte de madeira
para apoio na etapa de microtomia.
As peças de resina contendo as amostras do tecido cardíaco foram fatiadas
utilizando-se um micrótomo semi-automático (modelo 2245, marca Leica, Alemanha). Os
cortes, com espessura de 3µm, eram inicialmente imersos em água destilada e depois
capturados na lâmina histológica. As lâminas eram deixadas para secar em chapa aquecedora
e depois submetidas à coloração.
A coloração escolhida para o presente estudo foi a coloração PAS (ácido periódico +
reativo de Schiff) com a solução de metanilyellow, pois, a mesma facilitou a observação da
área de delimitação celular, intensificando a marcação da lâmina basal. Após microtomia e
estufa a 50o
C por uma hora, os cortes histológicos foram imersos em álcool 90% e hidratados
em água destilada. Em seguida, os cortes foram imersos em ácido periódico 1% por 10
minutos e na sequência foram lavados três vezes em água destilada. Depois, os cortes foram
imersos no Reativo de Schiff por 1 hora e na sequência lavados em água corrente por 10
minutos. Utilizou-se então a Hematoxilina Férrica por 6 minutos seguida de lavagem em água
corrente por 10 minutos e metanilyellow por 2 minutos. Finalmente, seguiu-se a desidratação
e montagem das lâminas histológicas em Permount®.
Para a análise morfométrica, as lâminas histológicas do tecido cardíaco foram
observadas com auxílio de um software de análise e processamento de imagem. Para cada
animal, escolheram-se quatro áreas da região endocárdica-miocárdica, próximas do lúmen,
onde os cardiomiócitos eram observados transversalmente em aumento de 20x. A área celular
(µm2) de cada cardiomiócito foi mensurada dentro das quatro áreas, totalizando
aproximadamente 200 cardiomiócitos para cada animal. A área nuclear dos cardiomiócitos
também foi mensurada, realizando-se a contagem do número de cardiomiócitos e de capilares
(Figura 5).
33
Figura 5. Corte transversal da região endocárdica-miocárdica do ventrículo esquerdo. Observa-se a área total
medida (ponta de seta), área do miocárdio (setas) e área do núcleo (círculo). Coloração PAS+ metanilyellow.
Aum. 20x.
3.9 Análise Estatística
As variáveis foram expressas por meio de medidas descritivas de posição e
variabilidade. A comparação dos grupos experimentais foi realizada pela técnica de análise de
variância (ANOVA) para o esquema de dois fatores independentes (droga e treinamento),
complementada com teste de comparações múltiplas de Tukey ou Bonferroni (BAYLEY,
1977) ou pela técnica de análise de Kruskal Wallis para o esquema de dois fatores
independentes (droga e treinamento), complementada com teste de comparações múltiplas de
Dunn. O índice de significância considerado para todas as variáveis foi de 5%.
34
4 RESULTADOS
Artigo submetido à revista The Journal Physiological Sciences
4.1 Capítulo I
Long-term administration of digoxin induces cardiac hypertrophy but does not affect
cardiac function and physical performance in trained normotensive rats
ABSTRACT
This study investigated the effects of long-term administration of digoxin on the heart
structure and function and physical performance of rats subjected to high-intensity interval
training (IT). Male Wistar rats distributed in control (C), digoxin (DIGO), trained (T), and
trained with digoxin (TDIGO). Digoxin was administered by gavage at dose (30µg/kg/day)
for 75 days. IT program on a treadmill (total time of 60 min, fractionated in two intensities: 8
min at a speed corresponding to 80% of the maximal speed (MS) and 2 min at a speed
corresponding to 20% of the MS) for 60 days. A maximum progressive exercise test (MET)
and serum lactate concentration was determined. The cardiac parameters were evaluated by
echocardiographic. The left ventricle (LV)/body weight (BW) mass was higher in TDIGO
than Digo (+13.22%), the LV/BW diastolic diameter, and LV/BW systolic diameter were
higher in TDIGO than T and DIGO (DDVE; TDIGO vs. T: +17.9%; TDIGO vs. DIG:
+16.9%, DSVE; TDIGO vs. T: +23.5%; TDIGO vs. DIG: +24.5%). The MET parameters
were higher and serum lactate concentration was lower in the trained rats that in the non-
trained rats. Conclusion: Long-term administration of digoxin promoted cardiac hypertrophy
but did not affect cardiac function and physical performance in the rats subjected to IT.
Key words: digoxin, calcium, interval physical training, cardiac function, physical
performance
35
INTRODUCTION
Calcium ion (Ca2+
) is an intracellular messenger that participates in several
physiological processes, including gene transcription, muscle contraction, and cell
proliferation [1-4]. In addition, Ca2+
plays an important role in the electrical activity and
contractility of the heart muscle, being essential in the excitation-contraction coupling (E-C)
process, which results in the contraction and relaxation of the myocardium. The
depolarization of the cardiomyocyte membrane promotes the opening of the voltage-
dependent Ca+2
channels (L-type channels), allowing the passage of small Ca+2
extracellular
amounts to the cytosol. The Ca+2
entry activates the ryanodine receptors (RyR) that increase
the release of Ca+2
ions from the sarcoplasmic reticulum (SR) to the cytosol [5]. The Ca+2
released by the SR interact with troponin C, eliminating the inhibitory effect that the troponin-
tropomyosin complex exerts on the actin-myosin interaction. The process results in the
reduction of the sarcomere and, consequently, in cardiac contraction [6]. Relaxation occurs
through cytosolic Ca+2
removal by the SR, mediated by the activity of the Ca+2
ATPase pump
of the SR (SERCA2a), Na+/Ca
+2 exchanger, and Ca
+2 pump of the sarcolemma, which
eliminates 88%, 10%, and 2% of the Ca+2
, respectively [6]. Changes in Ca+2
conductances
produce short-and long-term effects on cardiac function. The phosphorylation and
dephosphorylation reactions mediated by Ca-calmodulin-dependent enzymes such as the
calmodulin kinase (CaMK), calcineurin, and myosin light-chain kinase (MLCK) mediate the
acute effects in the E-C coupling activation processes and long-termeffects through activation
of nuclear hypertrophic signaling pathways. This raises questions about how the cardiac
myocytes distinguish different Ca+2
dependent intracellular signaling pathways during high
Ca+2
transients that are repeated during the E-C coupling.
It has been well documented that the regular practice of physical exercise (PE)
promotes positive adaptations in the cardiovascular system, resulting in the improvement of
physical performance in submaximal and maximal levels of exercise [7-9]. Among the
cardiovascular adaptations it has been shown, an increase in the peak of ventricular pressure
development, increased myocardial isometric tension, and cardiac hypertrophy [7,10].
Although PE increases myocardial contractility, the exact cellular and molecular mechanisms
that promote this effect remain unknown. A well-documented hypothesis in the literature is
that PE induces an increase in intracellular Ca+2
levels [8, 11-13] resulting in an increase in
contractile force and/or activation of hypertrophic pathways in cardiomyocytes. Several data
36
provide evidence that suggests that PE improves the inotropic response via SERCA2a [8, 13-
17] ryanodine [13, 18, 19] L- type Ca2+
channel [20, 21] and the beta-adrenergic system [22].
Considering that Ca2+
participates in the hypertrophic signaling and cardiac functional
response, an increase in the intracellular Ca2+
availability may cause hypertrophy and
increased cardiac function induced by physical training. It is a well-established fact that
cardiotonic glycosides increase the Ca2+
supply by inhibiting the Na+/K
+-ATPase pump,
promoting an increase in intracellular sodium, which in turn increases the intracellular
Ca2+
through the sodium-calcium exchanger system (Na+/Ca
2+ exchanger) [23]. Therefore, we
tested the hypothesis that the long-term administration of cardiotonic glycosides during a
high-intensity interval training program promotes cardiac hypertrophy, increased cardiac
function, and consequently, improved physical performance of rats.
METHODS
Experimental protocol
32 male Wistar rats (age: 60 days) were kept in collective polypropylene cages (4
animals per cage), covered with metal grids in a temperature-controlled environment (24 ±
2°C) under a 12-h light/dark cycle (12h/12h), and fed with commercial ration (3.5 kcal/g
with 26% protein, 3% lipids, 54% carbohydrates, and 17% other; Labina, Purina, Paulínia,
SP, Brazil) and provided with water ad libitum. This standard diet follows the
recommendations on the nutritional needs of laboratory animals [24], ensuring the well-being
of the animals. This study was approved by the Ethics Committee on Animal Research of the
UFMT (CEPA-UFMT; protocol number 23108.019254/11-0) and was conducted in
accordance with the standards established in the Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals (in Law 11,794/2008) and the ethical principles in animal experimentation of the
Brazilian College of Animal Experimentation (COBEA).
The rats were randomly distributed into four groups (n=8 per group) as follows:
control, non-trained (C), digoxin without training (DIGO), trained without digoxin (T), and
trained with digoxin (TDIGO). The digoxin dose (Pharlab Indústria Farmacêutica, Lagoa da
Prata-MG) was 30.0 µg/kg and administered via gavage, once a day during the entire trial
period, including the adaptation phase and training (75 days). The C and T groups were
subjected to the same procedure, but received only saline solution. The concentration of
37
digoxin established in our study was based on the work of Wang et al. [12] and Manunta et al.
[25] used 32 and 30µg/kg/day, respectively, for 5 or 6 weeks, in normotensive Sprague-
Dawley rats. Two days after the end of the trial period, the animals (after 12 h of fasting) were
anesthetized with ketamine hydrochloride (50 mg/kg) and xylazine hydrochloride (1 mg/kg),
and euthanized by decapitation.
The nutritional assessment was performed with energy intake, feed efficiency, and
body fat analyses. The energy intake (EI) was calculated according to the following formula:
EI=WFI x RCV/N, where WFI is the weekly food intake (g), RCV is the ration caloric value
(g kcal), and N is the number of animals in the cage. For the RCV calculation, we should
consider that 1 g of ration is equivalent to 3.5 kcal. Total body fat was determined by the
mass sum of epididymal, retroperitoneal, and visceral fat deposits.
Selection and adaptation of the animals to the treadmill
The animals of the trained groups (T and TDIGO) were previously selected through
submaximal tests in which we observed the positive response of each animal to race
stimulation in at least five tests [26]. Prior to starting the training program, groups T and
TDIGO underwent a treadmill adaptation protocol for 1 week (speed, 10m/min, 15 min/day).
The purpose of the adaptation phase was to minimize the stress effects of the environment
(treadmill) without promoting any adaptive stimulation of the physical training.
Maximum progressive exercise test
To evaluate the physical performance in pre- and post-training, the rats in groups T
and TDIGO were subjected to the maximum progressive exercise test on a treadmill, in
accordance with the protocol adapted from Manchado et al. [27]. The variables analyzed
during the test were as follows: average speed (AS), maximum speed (MS), and distance
traveled. The initial test speed was 10m/min, being progressively increased (2m/min) every 2
minutes until the animal reaches exhaustion. The exhaustion criterion adopted for the test
was the inability to maintain the required speed for 5s. The maximum test was repeated 30
days after the beginning of the training to adjust the exercise load level. At the end of the trial
period, all the groups were subjected to the exercise test.
38
Interval physical training protocol
The physical training protocol was adapted from Kemi et al. [16]. Interval training was
proposed as an appropriate strategy to promote beneficial responses on cardiac function and
hypertrophy [10]. After the pretest, the rats in groups T and TDIGO underwent an interval
physical training program on a treadmill (total time of 60 min, fractionated in two intensities:
8 min at a speed corresponding to 80% of the MS and 2 min at a speed corresponding to 20%
of the MS) for 60 days. The training daily time was 60 min.
Blood lactate determination
To assess the effectiveness of the physical training protocol, the blood lactate
concentration was determined immediately after the maximum stress test. For this purpose,
we used a Roche portable lactometer (model: Accutrend Plus, Germany), which enables the
quantification of lactate concentration in small quantities of blood. A blood drop sample was
collected from the tail of each animal for the test.
Assessing ventricular function under echocardiography
At the end of the trial period and 24 h before euthanasia, the rats were subjected to
evaluation of ventricular function. The animals were anesthetized with ketamine
hydrochloride (50 mg/kg) and xylazine hydrochloride (1 mg/kg), which were administered
intramuscularly. After trichotomy of the anterior thorax region, the rats were positioned, and
two-dimensional echocardiographic images in M-mode were obtained through the left
transthoracic parasternal view, using the MyLab 30 VET Gold, Esaote equipment. An18-
MHZ linear transducer was used to perform the short-axis cuts. For measurements of the left
ventricular (LV) posterior wall and interventricular septum, and the LV diastolic (LVDD) and
systolic (LVSD) diameters, we used M-mode images with the cursor placed at the middle
level of the papillary muscle, viewing the endocardial and epicardial boundaries bymoving
and gently angling the transducer [28]. For the left atrium and aorta diameter measurements,
we used M-mode images, with the cursor’s position dividing the aorta in half when the layers
were visualized and crossing the left atrium [29].
39
Statistical analysis
Variables were expressed through descriptive measures of positioning and variability.
The comparison of the trial groups (C, DIGO, T, and TDIGO) was performed by analysis of
variance for the scheme of two independent factors (digoxin and training), complemented
with the Tukey multiple comparisons test or kruskal Wallis, complemented with the Dunn
test. The index of significance for all the variables was 5%.
40
RESULTS
The body weight (BW) gain and food consumption of the trial groups are shown in
Figure 1 and Table 1, respectively. No significant difference (P>0.05) in BW gain was
observed between the groups during the trial period. These results indicate that the
administration of digoxin and physical training did not affect the somatic growth of the
animals. Groups T and TDIGO had lower (P< 0.05) weekly calorie intake than groups C and
DIGO. In addition, no significant difference (P>0.05) in feed efficiency was observed
between the groups.
Figure 1.Weight gain of groups during experimental period. (N = 8 rats/ group). Control (C), digoxin (DIGO),
trained (T) and trained + digoxin (TDIGO). Values are mean and standard deviation, ANOVA, Tukey test, p<
0,05.
Table 1. Energy intake and feed efficiency.
C
(N = 8)
DIGO
(N = 8)
T
(N = 8)
TDIGO
(N = 8)
Energy intake 92,5 ± 5,4 93,9 ± 7,3 86,9 ± 1,3* 80,8 ± 3,8#
FE 1,40 ± 0,23 1,59 ± 0,18
1,51 ± 0,33
1,57 ± 0,42
Values are mean ± SD. Groups: control (C), digoxin (DIGO), trained (T) and trained + digoxin (TDIGO), feed
efficiency (FE). * vs C; # vs Digo; Kruskal-Wallis, Dunn.
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
We
igh
t g
ain
(g
)
C o n tro l
D IG O
T
T D IG O
41
Figure 2A shows the relationship between the weight of the soleus muscles (SOLs) and
extensor longus digitorum (EDL); and Figure 2B, the LV weights according to the BWs of the
trial groups. No significant differences (P>0.05) in SOL and EDL muscle weight (normalized
by BW) were observed between the groups after the trial period. However, the LV/final BW
(BW) ratio was higher in group TDIGO than in group DIGO.
Figure 2. [A] Skeletal muscles weight (SM) and left ventricular weight (LV) [B] normalized by body weight
(BW) of groups. (N = 8/ group). Control (C), digoxin (DIGO), trained (T) and trained plus digoxin (TDIGO).
Soleus (SOL), Extensor longus digitolis (ELD). Values are mean ± SD * P<0,05 vs DIGO (Anova, Tukey).
S o le u s E L D
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
1 .0
SM
/ B
W (
mg
/g)
C o n tro l
D IG O
T
T D IG O
A
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
3 .0
LV
/ B
W (
mg
/g)
C o n tro l
D IG O
T
T D IG O
*
B
42
Table 2 shows the maximum progressive exercise test data of groups T and TDIGO in
pre-training (M1), after 30 days (M2), and in post-training (M3). Significant increases (P<
0.05) were observed in the following variables: time, speed, and distance from M1 to M2 in
groups T and TDIGO. Meanwhile, no difference was observed with training continuation (M3
vs. M2; P>0.05). In addition, no significant difference (P > 0.05) was observed between
groups T and TDIGO in the three test moments (M1, M2, and M3). Groups C and DIGO
performed the maximum stress test in M3 and presented statistically lower values (P<0.05)
for all the performance variables, compared with groups T and TDIGO (data not shown).
Table 2. Maximum progressive exercise test in pre-training (M1), after 30 days (M2) and in post-training (M3).
T TDIGO
M1 M2 M3 M1 M2 M3
T. Time 25,1 ± 2,8 35,3 ± 6,1# 39,3 ± 7,3# 22,6 ± 1,0 39,3 ± 2,7* 39,0 ± 3,6#
SpeedAver 22,5 ± 1,4 27,6 ± 3,0# 29,6 ± 3,6# 21,3 ± 0,5 29,6 ± 1,3# 29,5 ± 1,8#
SpeedMax 34,5 ± 1,4 44,5 ± 3,0# 48,2 ± 3,6# 31,5 ± 0,5 48,7 ±1,3# 48,0 ± 1,8#
Distance 570 ± 95 991 ± 243# 1189 ± 326# 485 ± 35 1168 ± 129# 1159 ± 172#
Values are mean ± SD. Control (C), Digoxin (DIGO), Trained (T) and trained + digoxin (TDIGO); T. Time:
total time; SpeedAver: speed average; SpeedMax: maximum speed; # vs M1. Kruskal-Wallis, Dunn.
Figure 3 shows the lactate and glucose concentration data immediately after the
maximum exercise test at post-training. The blood lactate levels immediately after the
maximum stress test were statistically lower in the trained groups (T and TDIGO) than in the
non-trained groups (C and DIGO). However, no significant difference (P>0.05) was observed
between groups T and TDIGO. In addition, glycemia was similar (P>0.05) in all the groups
after the maximum test. The results indicate that digoxin did not promote beneficial effects on
performance after the training program.
43
Figure 3. [A] Lactatemia (mM), and [B] glycemia immediately after maximum progressive exercise test at the
end of interval training program. (N = 8/group). Control (C), digoxin (DIGO), trained (T) e trained + digoxin
(TDIGO). Values are mean ± standard deviation. * P< 0,05vs C; # P< 0,05 vs DIGO. Anova, Tukey.
Table 3 shows the echocardiographic data of the cardiac structural parameters. The
TDIGO group showed an increase in LVDD/BW and LVSD/BW ratios when compared to
groups T and DIGO (P< 0.05).
0
2
4
6
8
1 0
1 2
1 4
1 6
La
cta
tem
ia (
mM
)C o n tro l
D IG O
T
T D IG O
A
*
#
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
Gly
ce
mia
(m
g/d
L)
C o n tro l
D IG O
T
T D IG O
B
44
Table 3. Echocardiographic data of the cardiac structural parameters.
C (N = 8) DIGO (N = 7) T (N = 8) TDIGO (N = 8)
LVDD/BW 15,4 ± 1,23 15,7 ± 2,22 15,5 ± 1,67 18,9 ± 1,14 #*
LVSD/BW 7,33 ± 1,13 7,54 ± 1,22 7,64 ± 1,55 9,99 ± 1,60
#*
DSWT/BW 3,37 ± 0,48 3,96 ± 1,18
3,55 ± 0,1
4,31 ± 0,86
SPWT/BW 6,54 ± 0,746 6,36 ± 1,22
6,46 ± 1,25
7,38 ± 0,534
DPWT/BW 3,96 ± 0,531 4,27 ± 0,979
3,71 ± 0,804
4,37 ± 0,702
SSWT/BW 5,97 ± 0,70 6,51 ± 0,91
6,19 ± 0,93
7,13 ± 0,97
LVD.vol (ml) 0,30 ± 0,04 0,35 ± 0,10
0,25 ± 0,06
0,31 ± 0,08
LVS.vol (ml) 0,036 ± 0,019 0,039 ± 0,017
0,026 ± 0,021
0,043 ± 0,026
LVMI 1,58 ± 0,24 2,10 ± 0,77
1,42 ± 0,37
1,80 ± 0,19
Values are mean ± SD. Control (C), digoxin (DIGO), trained (T) and trained + digoxin (TDIGO). Body weight
(BW), LV diastolic (LVDD) and systolic (LVSD) diameters, diastolic septal wall thickness (DSWT), posterior
wall thickness (SPWT); diastolic posterior wall thickness (DPWT); systolic septal wall thickness (SSWT), LV
diastolic volume (LVD. vol) and LV sistolic volume (LVS. vol); LV mass index (LVMI). # vs T; * vs DIGO.
Kruskal-Wallis, Dunn.
Table 4 shows the echocardiographic data of the heart functional parameters. No effect
of digoxin or physical training was observed, as no significant difference (P>0.05) was
observed between the groups in the functional parameters evaluated.
Table 4. Echocardiographic data of the cardiac functional parameters.
C(N = 8) DIGO(N = 7) T(N = 8) TDIGO(N = 8)
HR (bpm) 320 ± 16 333 ± 27
331 ± 36
331 ± 25
CO (ml/min) 85 ± 12 104 ± 36
77 ± 13 87 ± 21
ΔD end (%) 52 ± 6,5 52 ± 5,1
53 ± 6,3
46 ± 7,0
ΔD meso (%) 28,4 ± 4,6 29,6 ± 4,8
26,8 ± 4,1
25,4 ± 5,3
EF 0,88 ± 0,04 0,88 ± 0,03
0,89 ± 0,04
0,84 ± 0,05
Values are mean ± SD. Control (C), digoxin (DIGO), trained (T) and trained + digoxin (TDIGO). Heart rate
(HR); cardiac output (CO); endocardial fractional shortening (ΔD endo); mesocardial fractional shortening (ΔD
meso); EF: ejection fraction. Kruskal-Wallis, Dunn.
45
DISCUSSION
The objective of this study was to test that the increase in intracellular Ca2+
availability
induced by cardiotonic drugs could promote hypertrophy, increased cardiac function, and
physical performance improvement in rats subjected to interval training (IT). Contradicting
our hypothesis, the long-term administration of cardiotonic drugs did not improve the
physical performance or the cardiac function of the trained rats. However, the LVW/BW data
indicate that the cardiotonic drug induced cardiac hypertrophy in the rats subjected to IT.
The IT protocol promoted a significant increase in the physical fitness of the rats in
groups T and TDIGO, as evidenced by the increase in functional (e.g., increase in MS, AS,
total time, and distance traveled), reduction of body fat, and metabolic parameters (e.g.,
reduction of lactate accumulation) during the maximum progressive exercise test. Meanwhile,
the LVW/BW and echocardiographic data showed no cardiac hypertrophy in the trained rats.
It's well documented that lactate production by muscle during exercise and its
transport into the bloodstream, generating exponential increase of its concentration (i.e.
without stabilizing condition) is a limiting factor in relation aerobic metabolism [31] Thus, the
high blood lactate concentration demonstrated that animals at the end of the test of maximum
effort, was predominantly in the anaerobic domain, which configures, hypothetically, that the
same was in the process of exhaustion, since the animals were removed from the treadmill
only when they could no longer perform the correct movement. To better illustrate the
physical condition of animals, the total distance performed of four groups (C, DIGO, T and
TDIGO) along with the data of blood lactate, which allows a more accurate and convincing
display that the training caused positive adaptations and that the exercise protocol was
appropriate to the rats conditions in this sense. Moreover, the reduction of total fat/body
weight ratio in T and TDIGO groups also indicates a positive adaptation to exercise training.
It has been suggested that aerobic exercise has specific effects on decreasing visceral fat mass
as it may lead to increased sympathetic tonus, thereby increasing lipolysis especially in
abdominal fat [32, 33].
The long-term administration of digoxin during the high-intensity IT did not promote
any additional effects on heart physical performance and functional capacity. We found no
trial studies in the animals that investigated the effects of cardiotonic drugs on physical
performance. Nevertheless, our results are consistent with previous studies that analyzed the
effect of digitalis compounds on human physical performance. Coates et al. [34] found no
46
significant effects of digoxin on the physical performance of young subjects (aged 12–20
years) with cystic fibrosis with different degrees of airway obstruction. Friesen and Cumming
[35] evaluated the effects of digoxin in doses of 1.0 mg/day for 3 days, followed by 0.5
mg/day for 11 days, on the capacity of exercise and oxygen output in healthy young
individuals aged 21 to 35 years. The authors found no effects of digoxin on exercise capacity.
Fleg et al. [36] evaluated 10 patients with mild to moderate congestive heart failure (CHF)
treated for 4 weeks with digoxin, and no changes were observed in treadmill maximum stress,
oxygen pulse, ventilation, and ventilatory equivalent in the patients treated with digoxin
compared to those treated with placebo. Meanwhile, Sullivan et al. [37] observed significant
improvement in physical performance in patients aged 40 to 75 years who had CHF treated
with a digoxin dose of 0.25 mg/day. Morisco et al. [38] evaluated 10 patients with CHF
treated for 3 weeks with digoxin at a dosage of 0.25 mg/kg and found some improvements in
the exercise capacity of the patients studied. This difference in the results may be related to
the drug dosage, type of stress, and clinical conditions of the individuals tested, as digoxin
may be more sensitive to heart failure conditions.
Our findings regarding the effects of digoxin on cardiac function did not reveal any
benefit or injury of the drug in the trained animals, as the animals treated with digoxin
showed no changes in heart rate, cardiac output, shortening fraction, or ejection fraction.
However, these parameters were available with the animals anestesiated and at rest condition.
Endurance exercise training enhances functional capacity, better sympathetic system control,
and increase of cardiac output during exercise [39]. Furthermore, at in rest condition, the
cardiac output is not alter in sedentary or trained subjects that can be explain the absent
effects on cardiac function [40]. The effects of digitalis compounds on the heart function of
cardiac patients or healthy individuals are not well understood. Treatment with digitalis
compounds has been well documented to improve LV ejection fraction [41], improve
hemodynamics at rest and during exercise [42] slow down the atrioventricular conduction of
the electrical stimulation due to vagal stimulation, and decrease sympathetic stimulation,
which promotes heart rate reduction in patients with CHF [43-46]. In the case of healthy
individuals, Friesen and Cumming [35] found no effects of digoxin (1.0 mg/kg) on heart rate
before, during, or after stress test in young healthy individuals. This difference in results may
be related to the clinical conditions of the studies. In patients with CHF, the hemodynamic
and cardiac mechanisms are impaired and, under these conditions, may show greater
sensitivity to digitalis compounds, which has not been observed in healthy hearts.
47
Another important aspect that should be highlighted is related to the cardiac function
measurement technique. Echocardiography is an important auxiliary examination in the
clinical diagnosis of cardiac function, which allows the evaluation of 1) the morphology and
function of the heart, 2) the development of cardiac dysfunction caused by different types of
trauma, and 3) the cardiac effects of pharmacological interventions [47]. In small animals
used in trial laboratories, this method enables the monitoring of the trauma and/or treatment
effect on the heart. However, in order to perform this type of examination in laboratory
animals, the use of sedatives and anestheticsis required, which leads to decreased frequency
and cardiac output, possibly compromising the evaluation of ventricular function [10]. Other
important considerations may also justify the absence of digoxin effects on the physical
performance and cardiac function in trained healthy rats. First, the digoxin dose used in this
study could be very low without promoting any effect. However, we used a daily dose of
30µg/kg in our study, which would be considered clinically toxic. The most frequently used
dose is 0.25 mg for patients with normal renal function. This is equivalent to the
concentration of 3.57 µg/kg in patients weighing 70kg and is equivalent to 10 times less than
the dose that we used. Because we considered the therapeutic index of digoxin to below, we
assessed some clinical parameters of other concentrations (3.0, 300, and 3000µg/kg) to set the
optimal dose. The most common clinical symptoms of digitalis intoxication include lethargy,
irritability, changes in visual perception, anorexia, nausea, vomiting, abdominal pain,
diarrhea, and cardiac arrhythmia [48]. The long-term administration of 300 and 3000-µg/kg
doses resulted in adverse effects such as weight loss, food intake reduction, irritability,
diarrhea, and arrhythmia. We chose the 30-µg/kg dose, since it did not cause any adverse
effect. Second, digoxin can change the cellular electrochemical equilibrium or energy
metabolism. Classically, digoxin interferes with cell electrophysiology on the conductance of
sodium, potassium, and calcium because it inhibits the Na+/K
+ ATPase pump and reverses the
Na+/Ca
2+exchange action [23]. We found no data to support the idea that digoxin interferes
with energy metabolism. Our blood lactate result immediately after stress indicates that
digoxin did not interfere with energy metabolism. Other authors also found no effect of
digoxin on maximum oxygen consumption during stress tests in clinical studies [35, 49, 50].
As mentioned earlier, long-term administration of digoxin induced cardiac
hypertrophy in rats undergoing IT. However, the magnitude of cardiac hypertrophy is not
enough to modify the heart functionally. In normal hearts, the secured margin of control Na+,
K+, Ca
2+ ions homeostasis probably is higher than in failure heart condition. So, it can be
explained the lacking effects of digoxin in normal hearts. On the other hand, endurance
48
exercise training promotes volume overload to heart and, in this case, the digoxin can be
potential effects on homeostasis breaking induce to exercise training. The parameters used for
this statement are not considered as the best indicators. Evaluation of cell morphometry or
quantification of contractile protein would be necessary. Recent evidence suggests that the
hypertrophic response to calcium is associated with the activation of protein kinase C (PKC),
calcium-calmodulin kinase II (CAMKII), and calcineurin-phosphatase (CaN) by the
calcium/calmodulin complex (CAM) [23, 51]. The activation of PKC and CAMKII
phosphorylates transcriptional and nuclear factors, and CaN stimulation causes
dephosphorylation and activation of the nuclear factor of activated T-cells (NAFT), which is
located in the cytoplasm when it is phosphorylated in basal conditions. After
dephosphorylation, the NAFT is translocated to the nuclear promoter region, promoting
activation of muscle-specific genes and, consequently, cardiac hypertrophy [23, 52].
Contradicting our data, Aldinger [53] found no effects of digoxin administration (0.150
mg/100mg) on the cardiac structure of rats subjected to swimming training for 250 days.
The clinical implication of this study is based on the importance of the interaction between
digitalis glycosides and physical training. Digoxin has been used in CHF treatment for more
than 200 years and is one of the most frequently prescribed drugs worldwide [54, 55]. Until
very recently, physical activity was contraindicated for individuals with heart failure by the
presumption of worsening heart function. However, in the 1970s and 1980s, several studies
rejected the rest indication when treating the cardiovascular disease [56, 57]. Since elite
athletes use ergogenic resources to improve their performance, this study brings relevant
information that cardiotonic drugs will not benefit the physical training of healthy individuals.
Regarding future prospects, histological studies should be conducted to quantify cell
area to confirm the cardiac hypertrophy induced by digoxin administration in trained rats.
Other techniques to assess cardiac function such as isolated papillary muscle or isolated
myocytes will also be important because these analyze isolate systemic effects, as in in vivo
echocardiographic assessment.
In conclusion, long-term administration of digoxin at the aforementioned
concentrations for 75 days promoted cardiac hypertrophy but did not affect physical
performance in the stress test or cardiac function of the normotensive rats subjected to high-
intensity IT.
49
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Compliance with Ethical Standards
Funding: This study was funded by Fapemat (grant process number 470627/2011).
Conflict of Interest: The authors declare that they have no conflict of interest.
Ethical approval: This study was approved by the Ethics Committee on Animal Research of
the UFMT (CEPA-UFMT; protocol number 23108.019254/11-0) and was conducted in
accordance with the standards established in the Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals (in Law 11,794/2008) and the ethical principles in animal experimentation of the
Brazilian College of Animal Experimentation (COBEA).
Informed consent: “Informed consent was obtained from all individual participants included
in the study.”
55
4.2 Capítulo II
Artigo será submetido à Revista Brasileira de Medicina do Esporte
Administração crônica de Digoxina ou Verapamil não afetam a morfologia cardíaca em
ratos submetidos ao treinamento físico intervalado de alta intensidade
RESUMO
Introdução: Os cardiotônicos e os bloqueadores de canais de cálcio são fármacos que alteram
a biodisponibilidade intracelular de Ca2+
e podem afetar a estrutura e a função cardíaca.
Objetivo: Avaliar os efeitos da administração crônica de verapamil ou digoxina sobre a
morfologia cardíaca de ratos submetidos ao treinamento físico intervalado (TFI). Métodos:
Ratos Wistar machos (idade: 60 dias) foram distribuídos em seis grupos (N=8/grupo):
controle (C), digoxina, (DIGO), verapamil (VERA), treinado (T), treinado com digoxina
(TDIGO) e treinado com verapamil (TVERA). A digoxina e verapamil foram administrados
via gavagem, na dose única de 30,0µg/kg/dia e 5,0mg/kg/dia, respectivamente, durante todo o
período experimental. O TI foi realizado em esteira rolante (60 min/dia), por um período de
60 dias. O teste de esforço progressivo máximo (TEM) e a concentração sérica de lactato
(Lac) foram determinados. Foi coletado o músculo esquelético, cardíaco e a gordura corporal
total (GOR), o ventrículo esquerdo (VE) para análise histológica e o sangue para a análise
bioquímica. Resultados: A relação GOR/peso corporal final (PCF) foi menor no grupo
TDIGO (-26,8%) em relação ao grupo DIGO, e menor no grupo TVERA (-28,7%) em relação
ao VERA. A relação VE/PCF foi maior no TVERA (+17,9%) comparado ao grupo VERA. O
diâmetro interno do VE foi maior nos grupos T (+54,5%), TDIGO (+88,9%) e TVERA
(+56,9%), comparados ao grupo C, enquanto o TDIGO foi maior (+53,1%) do que o DIGO.
Os parâmetros do TEM foram maiores e a concentração de lactato menores nos grupos
treinados em relação ao grupo C. O colesterol total e o LDL foram maiores no TDIGO (+31,7
e +48,9%, respectivamente) comparado ao DIGO. A área do cardiomiócito foi maior no grupo
VERA (+21,5%) e T (+22,5%) comparados ao grupo C. Conclusões: A hipertrofia cardíaca
induzida pelo treinamento físico intervalado de alta intensidade não foi afetada pela
administração concomitante de digoxina ou verapamil.
Palavras Chave: digoxina, verapamil, treinamento físico intervalado, morfologia cardíaca.
56
Chronic administration of digoxin or verapamil do not affect cardiac morphology in rats
submitted to interval exercise training high intensity
ABSTRACT
Introduction: Cardiotonic and calcium channel blockers are drugs that alter intracellular Ca2+
bioavailability and can affect the heart structure and function. Objective: To evaluate the
effects of chronic administration of verapamil or digoxin on heart morphology of rats
submitted to physical training interval (PTI). Methods: Male Wistar rats (age: 60 days) were
distributed into six groups (N = 8 / group): control (C), digoxin (DIGO), verapamil (VERA),
trained (T), trained with digoxin (TDIGO ) and trained with verapamil (TVERA). Digoxin
and verapamil were administered by gavage in single dose of 30,0μg/kg/day and
5.0mg/kg/day, respectively, throughout the experimental period. The PTI was performed on a
treadmill (60 min / day) for a period of 60 days. The maximal graded exercise test (MET) and
the serum concentration of lactate (Lac) were determined. Skeletal muscle, heart and total
body fat was collected (GOR), the left ventricle (LV) for histological analysis and blood for
biochemical analysis. Results: The relationship GOR / final body weight (FBW) was lower in
TDIGO group (-26.8%) compared to DIGO group, and lowest in TVERA group (-28.7%)
compared to VERA. The ratio VE/PCF was higher in TVERA (+ 17.9%) compared to the
VERA group. The internal LV diameter was higher in groups T (+ 54.5%), TDIGO (+ 88.9%)
and TVERA (+ 56.9%) compared to group C, while the TDIGO was higher (+53, 1%) than
the mean. The parameters MET were higher and the lower lactate concentration in trained
groups compared to group C. The total cholesterol and LDL were higher in TDIGO (+31.7
and + 48.9% respectively) compared to DIGO. The area of cardiomyocytes was higher in the
VERA group (+ 21.5%) and T (+ 22.5%) compared to group C. Conclusions: Cardiac
hypertrophy induced by physical training interval of high intensity was not affected by
concomitant administration of digoxin or verapamil.
Keywords: digoxin, verapamil, interval exercise training, cardiac morphology.
57
INTRODUÇÃO
Os cardiotônicos e os bloqueadores de canais de cálcio (BCC) são classes de fármacos
comumente utilizados em pacientes com cardiopatias. Os primeiros aumentam a força de
contração cardíaca por elevarem os níveis citosólicos de cálcio (Ca2+
) (1,2)
. O mecanismo de
ação proposto mais aceito é que o cardiotônico se liga à bomba de sódio/potássio (Na+/K
+) da
membrana do cardiomiócito elevando os níveis de Na+ intracelular e, consequentemente, o
trocador Na+/Ca
2+ promove a troca de Ca
2+ para dentro da célula e o Na
+ para fora. Os BCCs
promovem efeitos inversos dos cardiotônicos. Ao se ligarem aos canais de Ca2+
voltagem
dependente, eles bloqueiam o influxo de Ca2+
promovendo assim redução da contratilidade e
condutibilidade cardíaca. Desta forma, esses fármacos alteram a biodisponibilidade
intracelular de Ca2+
no cardiomiócito determinando o grau de força de contração muscular.
Entretanto, o Ca+2
participa de outros processos fisiológicos, incluindo a transcrição gênica e
proliferação celular (3-6)
.
Embora os efitos farmacológicos dos cardiotônicos estejam bem descritos na
literatura, não estão bem elucidados os efeitos desses fármacos sobre a morfologia cardíaca de
corações normais ou hipertrofiados pelo treinamento físico (TF)
Considerando que o treinamento físico (TF) promove efeitos benéficos ao coração
(por exemplo: melhora do débito cardíaco e controle do sistema nervoso autônomo, e
aumento do tamanho das células e número de mitocôndrias), é provável que a administração
crônica de cardiotônico ou BCC durante o TF intervalado (TFI) de alta intensidade, promova
alterações funcionais e morfológicas no músculo cardíaco, afetando o desempenho físico.
Portanto, o objetivo desse estudo foi avaliar os possíveis efeitos da administração crônica de
verapamil ou digoxina, sobre a morfologia e função cardíaca de ratos submetidos ao TFI de
alta intensidade.
METODOLOGIA
Animais e grupos experimentais
Foram utilizados 48 ratos Wistar machos (idade: 60 dias), obtidos do biotério central
da Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT, Sinop, MT, Brasil). Os animais foram
mantidos em gaiolas coletivas de polipropileno (4 animais/gaiola), em ambiente com
58
temperatura controlada (24 ± 2ºC) e ciclo artificial claro-escuro de 12h/12h, e foram
alimentados com ração comercial (3,5 kcal/g em 26% proteína, 3% lipídeos, 54%
carboidratos e 17% outros; Labina; Purina, Paulínia, SP, Brazil) e água ad libitum. Esta dieta
padrão segue as recomendações sobre as necessidades nutricionais de animais de laboratório
(7) e garante tanto o bem-estar dos animais como a confiabilidade dos resultados
experimentais. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da
Universidade Federal de Mato Grosso (CEPA – UFMT) (protocolo nº: 23108.019254/11-0) e
foi conduzido de acordo com as normas estabelecidas no "Guide for the Care and Use of
Laboratory Animals", na Lei 11.794/2008, e Princípios Éticos na Experimentação Animal do
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
Os ratos foram aleatoriamente distribuídos em seis grupos (N=8/grupo): controle (C),
treinado (T), digoxina (DIGO), verapamil (VERA), treinado com digoxina (TDIGO) e
treinado com verapamil (TVERA). As doses de digoxina (Pharlab Indústria Farmacêutica,
Lagoa da Prata-MG) e verapamil foram de 30,0 µg/kg/dia e 5,0 mg/kg/dia, respectivamente,
e foram administrada via gavagem, uma vez ao dia, durante todo o período experimental,
incluindo a fase de adaptação e treinamento (75 dias). A concentração de digoxina
estabelecida em nosso estudo baseou-se nos trabalhos de Wang et al. (1)
e Manunta et al. (8)
os
quais utilizaram 32µg/kg/dia e 30µg/kg/dia. Para garantir as mesmas condições
experimentais, os grupos C e T também foram submetidos ao procedimento de gavagem,
porém, receberam apenas solução fisiológica. O peso corporal (PC) e consumo de ração (CR)
dos animais foram continuamente monitorados durante todo período experimental.
Protocolo de treinamento físico intervalado de alta intensidade
Inicialmente, todos os grupos treinados (T, TDIGO e TVERA) foram submetidos a um
protocolo de adaptação à esteira, com duração de uma semana (velocidade de 10m/mim, 15
minutos por dia). Em seguida, os grupos foram submetidos a um teste de esforço máximo
(TEM) em esteira rolante, conforme protocolo descrito por Manchado et al. (9)
. O TEM foi
novamente realizado após 30 dias do início do treinamento para ajuste das cargas de
exercício. Após o pré-teste, os grupos T, TVERA e TDIGO foram submetidos a um
programa de TFI em esteira rolante (8 minutos em velocidade correspondente à 80% da
Vmáx e 2 minutos em velocidade correspondente à 20% da Vmáx), conforme protocolo
adaptado de Kemi et al.(10)
. O programa de treinamento teve duração de 60 dias (60
59
minutos/dia). O TFI tem sido proposto como uma estratégia adequada para promover
respostas benéficas sobre a função e hipertrofia cardíaca (11)
.
Ao término do período experimental todos os grupos treinados (T, TVERA e TDIGO)
e não treinados (C, VERA e DIGO) foram submetidos ao TEM, para examinar os possíveis
efeitos das variáveis independentes (treinamento e drogas) sobre o desempenho físico.
Determinação de lactato sanguíneo
Para avaliar a eficácia do protocolo de TFI, foi determinada a concentração de lactato
sanguíneo, imediatamente após o TEM, utilizando lactímetro portátil (Roche Diagnostics
GMBH, Alemanha). Para cada teste foi coletada uma gota de sangue da extremidade da cauda
do animal.
Dados anatômicos e perfil nutricional
Dois dias após o término do período experimental, os animais (em estado de jejum -
12 horas) foram anestesiados com cloridrato de cetamina (50mg/kg) e cloridrato de xilazina
(1mg/kg) e eutanasiados por decapitação. O coração foi imediatamente retirado da cavidade
torácica e lavado com solução fisiológica. Os dois ventrículos [direito (VD) e esquerdo (VE)]
foram separados dos átrios e coletados para análise morfológica. Além disso, foram
coletados e pesados os músculos sóleo e extensor longo dos dedos (EDL), e a gordura
corporal. Todas as amostras foram pesadas em balança analítica (Shimadzu, Alemanha). O
peso dos músculos e da gordura corporal foram normalizados pelo peso corporal final (g/g).
Fragmentos do VE foram colocados em solução de cloreto de potássio (KCL) para que
o ciclo cardíaco fosse interrompido em diástole; foram medidas a espessura da parede do VE
(EPVE) e o diâmetro interno do VE (DIVE) com o auxílio de um paquímetro de aço inox
(Jomarca, China). Em seguida, o VE foi colocado em solução de fixador para posterior análise
histológica.
Análise bioquímica
Para a análise bioquímica, as amostras de sangue foram coletadas em tubos Falcon,
centrifugadas a 3000 rpm (centrífuga CentriBio, São Paulo, SP, Brasil) por dez minutos e
armazenadas em freezer à -80º C. As concentrações séricas de creatinina, colesterol total,
60
triglicérides, lipoproteína de alta densidade (hight density lipoproteín - HDL), lipoproteína de
baixa densidade (light density lipoprotein - LDL), lipoproteína de muito baixa densidade
(very light density lipoprotein- VLDL), transaminase glutâmica oxalacética (TGO),
transaminase glutâmica pirúvica (TGP) e proteínas totais foram determinadas utilizando-se
kits específicos (BIOCLIN®, Belo Horizonte, MG, Brasil) e analisadas pelo método
enzimático colorimétrico automatizado (Technicon, RA-XTTM
System, Global Medical
Instrumentation, Minessota, USA).
Análise Histológica
Após ser fixado em paraformaldeído 10% tamponado, o VE foi submetido ao
processamento para a análise histológica, com cortes de três µm e coloração PAS (ácido
periódico + reativo de Schiff) com a solução de metanilyellow.
Para a análise histológica foi utilizado um microscópio ótico (lente de 20x), acoplado a
um computador. Foram selecionados quatro campos da região endocárdica-miocárdica (aprox.
200 células) de cada animal, na qual foram mensurados a área total do campo (µm2), o
diâmetro da área celular de cada cardiomiócito, e a área nuclear dos cardiomiócitos. Além
disso, foram contados os números de cardiomiócitos e capilares.
Análise Estatística
Os dados foram expressos em média ± DP. A comparação dos grupos experimentais
foi realizada pela ANOVA ou Kruskal Wallis para o esquema de dois fatores independentes
(droga e treinamento), complementada com teste de comparações múltiplas de Bonferroni ou
Dunn. O nível de significância α foi de P < 0,05.
61
RESULTADOS
A Tabela 1 apresenta as características somáticas e consumo de ração dos grupos
experimentais. Não houve diferença significante (p>0,05) entre os grupos para as variáveis,
peso corporal (inicial e final) e consumo de ração, indicando que a administração crônica de
digoxina ou de verapamil durante o TF não afetaram o crescimento somático dos animais.
Tabela 1. Características somáticas e consumo alimentar dos grupos experimentais.
C
N = 7
DIGO
N = 6
VERA
N = 7
T
N = 8
TDIGO
N = 7
TVERA
N = 8
PCI (g) 245 ± 22 229 ± 28 217 ± 39 242 ± 18 215 ± 39 206 ± 32
PCF (g) 369 ± 23 374 ± 23 370 ± 33 373 ± 22 351 ± 42 320 ± 35
Consumo
ração (g) 23,3 ± 0,2 23,8 ± 1,6 24,1 ± 0,7 25,8 ± 0,2 24,5 ± 1,5 23,2 ± 1,1
Valores expressos em média ± DP; C: controle; T: treinado; DIGO: digoxina; TDIGO: treinado+digoxina;
VERA: verapamil; TVERA: treinado+ verapamil; PCI: peso corporal inicial; PCF: peso corporal final; Anova;
Bonferroni.
A relação GOR/PCF foi significantemente (p<0,05) menor (-26,8%) no grupo TDIGO
em relação ao grupo DIGO, menor no grupo TVERA (-28,7%) em relação ao grupo VERA.
Por outro lado, a relação VE/PCF foi estatisticamente maior (+17,9%) no grupo TVERA
comparado ao grupo VERA. Não houve diferença significante (p>0,05) nas relações VD/PCF,
EDL/PCF, SOL/PCF e EPVE entre os grupos. Os grupos T (+54,5%), TDIGO (+88,9%) e
TVERA (56,9%) apresentaram valores de DIVE estatisticamente (p<0,05) maiores,
comparados ao grupo C. O grupo TDIGO foi estatisticamente maior (+53,1%) de que o grupo
DIGO.
Tabela 2. Relações entre gordura corporal, músculo cardíaco e esquelético com o peso corporal final, espessura
da parede e diâmetro interno do ventrículo esquerdo. C
N = 7
DIGO
N = 6
VERA
N = 7
T
N = 8
TDIGO
N = 7
TVERA
N = 8
Gor/PCF 39,4 ± 3,9 42,4 ± 6,5 41,0 ± 5,8 35,4 ± 6,4 31,0 ± 3,6# 29,2 ± 3,6+
VE/PCF 1,92 ± 0,05 2,10 ± 0,21 2,01 ± 0,11 2,12 ± 0,06 2,29 ± 0,19 2,37 ± 0,19+
VD/PCF 0,565 ± 0,067 0,602 ± 0,073 0,603 ± 0,06 0,634 ± 0,06 0,660 ± 0,08 0,684 ± 0,099
EDL/PCF 0,484 ± 0,038 0,493 ± 0,040 0,461 ± 0,02 0,526 ± 0,05 0,499 ± 0,04 0,500 ± 0,036
SOL/PCF 0,613 ± 0,066 0,563 ± 0,016 0,595 ± 0,04 0,630 ± 0,07 0,635 ± 0,05 0,614 ± 0,05
EPVE 0,291± 0,033 0,308±0,016 0,282±0,05 0,341±0,05 0,297±0,07 0,323 ± 0,04
DIVE 0,244±0,065 0,301±0,046 0,294±0,037 0,377±0,080* 0,461±0,12*# 0,383±0,075*
Valores expressos em média ± DV; GOR: gordura corporal; PCF: peso corporal final; VE: ventrículo esquerdo;
VD: ventrículo Direito; EDL: extensor longo dos dedos; Sol: sóleo; EPVE: espessura da parede do ventrículo
esquerdo; DIVE: diâmetro interno do ventrículo esquerdo.* vs C; # vs DIGO; + vs VERA; Kruskal Wallis e
Dunn, p<0,05.
62
O TEF foi utilizado para comprovar a eficácia do TF. A Figura 1A e 1B demonstra
que todos os grupos treinados aumentaram o tempo total (+ 65%) e a distância total percorrida
(+120%) do momento pré para o pós-teste. No entanto, este aumento foi similar (p>0,05)
entre os grupos em todos os momentos, sugerindo que as drogas utilizadas não afetaram o
desempenho físico.
Figura 1. Teste de esforço em ratos treinados (T); Treinado+digoxina (TDIGO) e Treinado+verapamil
(TVERA), antes do treinamento intervalado (T0) após 30 dias (T30) e após 60 dias (T60). Em A: tempo total de
teste (min). Em B: distância total percorrida (m). Dados expressos em média e as barras representam o erro
padrão da média.
20
25
30
35
40
45
50 T
TVERA
TDIGO
T0 T30 T60
Te
mp
o t
ota
l (m
in)
T0 T30 T60400
600
800
1000
1200
1400
1600 T
TVERA
TDIGO
Dis
tân
cia
(m
)
A
B
63
A Figura 2 representa a concentração plasmática de lactato (Figura 2) imediatamente
após o TEM, no momento pós-treinamento. O grupo T apresentou um valor estatisticamente
menor (-65%) de lactato, comparado ao grupo C. Além disso, uma menor concentração de
lactato, embora não significante (p>0,05), foi observada nos grupos TDIGO e TVERA, em
relação aos grupos DIGO e VERA, respectivamente.
Figura 2. Concentração plasmática de lactato após o teste de esforço máximo no momento pós-treinamento. (N
= 8 por grupo). Controle (C), digoxina (DIGO), verapamil (VERA) treinado (T), treinado + digoxina (TDIGO),
treinado + verapamil (TVERA). Valores expressos em média ± DP. * vs C; Kruskal Wallis e Dunn, p< 0,05.
A Tabela 3 apresenta os parâmetros bioquímicos dos grupos experimentais. Houve aumento
significante (p<0,05) nos níveis de colesterol total (+31,7%) e LDL (+48,9%) no grupo
TDIGO comparado ao grupo DIGO. Nenhuma diferença significante (p>0,05) foi observada
nos demais parâmetros entre todos os grupos.
Tabela 3. Efeitos da administração de digoxina e verapamil sobre parâmetros bioquímicos séricos de animais
submetidos ao treinamento físico intervalado
C DIGO VERA T TDIGO TVERA
Creatinina 0,56 ± 0,06 0,45 ± 0,10 0,49 ± 0,03 0,54 ± 0,03 0,52 ± 0,06 0,51 ± 0,16
Colesterol 98 ± 13 82 ± 11 89 ± 12 94 ± 16 108 ± 13* 102 ± 15
Triglicérides 73 ± 13 61 ± 13 73 ± 16 63 ± 20 61 ± 7 76 ± 28
HDL 26 ± 3,2 23 ± 2,6 23 ± 2,4 25 ± 3,7 26 ± 2,5 24 ± 1,7
VLDL 14,6 ± 2,7 12,0 ± 2,5 14,5 ± 3,3 12,5 ± 3,9 12,1 ± 1,5 15,4 ± 5,6
LDL 57 ± 11 47 ± 9 51 ± 9 57 ± 11 70 ± 13* 63 ± 11
TGO 186 ± 49 176 ± 22 197 ± 30 238 ± 45 234 ± 48 198 ± 36
TGP 61 ± 7 55 ± 8 63 ± 5 72 ± 8 68 ± 11 60 ± 9
Proteínas totais 6,45 ± 0,23 6,45 ± 0,2 6,60 ± 0,18 6,33 ± 0,25 6,41 ± 0,22 6,47 ± 0,34
Valores expressos em média ± DP; C: controle; T: treinado; DIGO: digoxina; TDIGO: treinado+digoxina;
VERA: verapamil; TVERA: treinado+ verapamil; HDL: lipoproteína de alta densidade; VLDL: lipoproteína de
muito baixa densidade; LDL: lipoproteína de baixa densidade; TGO: transaminase glutâmica oxalacética; TGP:
transaminase glutâmica pirúvica; * p<0,05 vs DIGO; Kruskal Wallis e Dunn.
C DIGO VERA T TDIGO TVERA0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
*
* versus C
La
cta
to (
mm
ol /
L)
64
As Figuras 3 e 4 representam os dados histológicos dos grupos experimentais. O
número de capilares foi estatisticamente (p<0,05) menor (-29,8%) no grupo TDIGO em
relação ao grupo T (Figura 3A); no entanto a relação capilares/área (Figura 3B) não
apresentou diferença significativa (p>0,05) entre os grupos. Não houve diferença significante
(p>0,05) na área nuclear entre os grupos (Figura 3C); no entanto, a relação área do
núcleo/cardiomiócito foi significantemente menor nos grupos VERA (-19,4%) e T (-28,5%),
comparados ao grupo C (Figura 3E). Adicionalmente, a área do cardiomiócito foi
estatisticamente maior nos grupos VERA (+21,5%) e T (+22,5%), comparados ao grupo C
(Figura 3D).
Figura 3. Dados histológicos do ventrículo esquerdo de ratos controles (C); digoxina (DIGO); verapamil
(VERA); treinado (T), treinado+digoxina (TDIGO), treinado+verapamil (TVERA). A: número de capilares; B:
relação capilares/área; C: área nuclear (μm)2; D: área do cardiomiócito (μm)
2; E: relação núcleo/área
cardiomiócito. Dados expressos em média e DP, * vs C; # vs T. Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn, p<0,05.
C DIGO VERA T TDIGO TVERA0
10
20
30
40
50
60
#
# versus T
Nú
me
ro d
e c
ap
ilare
s
C DIGO VERA T TDIGO TVERA0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
Re
laçã
o C
ap
ilare
s x
áre
a
C DIGO VERA T TDIGO TVERA0
5
10
15
20
25
30
35
40
Áre
a n
ucle
ar
(m
2)
C DIGO VERA T TDIGO TVERA0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
**
* versus C
Áre
a d
o m
iócito
(
m2)
C DIGO VERA T TVERA TDIGO0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
**
Re
laçã
o n
úcle
o x
mió
cito
A B
E
C D
TVERA TDIGO
65
As imagens histológicas de tecido do ventrículo esquerdo (Figura 4) demonstram que
os cardiomiócitos estão preservados, com ausência de lesão, dano celular, fibrose, núcleos
centralizados e células endoteliais e capilares aparentemente normais.
Figura 4. Corte transversal da região endocárdica-miocárdica do ventrículo esquerdo. A: controle; B: treinado;
C: Digoxina; D: treinado+digoxina; E: verapamil; F: treinado+verapamil. Observam-se os cardiomiócitos
(asterisco), capilares (setas) e núcleo (círculo). Coloração PAS+ metanilyellow. Aum. 40x.
66
DISCUSSÃO
O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da administração crônica de cardiotônico
ou BCC sobre a morfologia de cardiomiócitos de ratos submetidos ao treinamento físico
intervalado (TFI) de alta intensidade. O TFI promoveu aumento na aptidão física em todos os
grupos treinados (Figura 1 A e B), como corroborado pela redução dos níveis de lactato
sanguíneo no grupo T após o teste de esforço máximo (TEM) (Figura 2). A redução dos
níveis de lactato sanguíneo no grupo T sugere uma adaptação metabólica ao treinamento
físico (por exemplo: menor produção ou aumento na taxa de remoção do lactato). Estes
resultados são consistentes com prévios estudos que também verificaram redução dos níveis
de lactato após teste de esforço em ratos submetidos ao treinamento físico (TF) (12)
. Os
possíveis mecanismos responsáveis pela redução na produção de lactato estão relacionados à
maior oxidação de ácidos graxos e a redução na glicólise anaeróbica e, o aumento da remoção
de lactato deve-se em maior parte a oxidação e o restante, à conversão ao glicogênio (13)
.
Clinicamente, a dosagem de digoxina usualmente empregada é de 0,25 mg para
pacientes com função renal normal. Isso equivale à concentração de 3,57 µg/kg em um
paciente de 70 kg, correspondendo a uma dose 10 vezes menor do que a empregada no
presente estudo (30µg/kg). A dosagem de verapamil utilizada em nosso estudo foi de 5,0
mg/kg, que é a mesma empregada clinicamente para pacientes hipertensos e corrobora com
outros estudos experimentais (14,15)
. Para verificar a possível toxicidade destas drogas nós
avaliamos alguns parâmetros bioquímicos (creatinina, TGO, TGP e proteínas totais) em todos
os grupos experimentais. Uma vez que estes parâmetros não foram alterados após o período
experimental, consideramos que as drogas não causaram prejuízo à função renal ou hepática.
O perfil lipídico sérico (colesterol total e LDL) foi aumentado e a relação GOR/PCF
diminuída em ratos treinados tratados com digoxina. A redução da relação GOR/PCF
provavelmente está relacionada ao um efeito do treinamento físico uma vez que o grupo
TVERA também apresentou redução e o grupo T teve uma tendência em ser menor que o
grupo controle. Os elevados níveis séricos de colesterol e LDL no grupo TDIGO podem estar
relacionados a um efeito metabólico da digoxina durante o treinamento. Em células HepG2
humanas do fígado, a digoxina aumentou a síntese de colesterol por meio do aumento da
atividade e da expressão da 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase, enzima que limita
a taxa de síntese de colesterol (16,17)
. Portanto, é provável que exista um efeito sinérgico da
digoxina e treinamento sobre a taxa de síntese do colesterol. Os possíveis mecanismos
moleculares e celulares que fundamentam estes achados não foram explorados no presente
67
estudo. Nossos achados relacionados à hipertrofia cardíaca mostraram que o TFI de alta
intensidade promoveu aumento na relação VE/PCF, DIVE e área do cardiomiócito que
corrobora com a literatura (18,19)
. Sabe-se que o tipo, a frequência, a intensidade e a duração do
TF promovem diferentes adaptações na função cardíaca e dimensões ventriculares (20,21)
. A
magnitude das adaptações morfológicas cardíacas é dependente dos estímulos hemodinâmicos
(sobrecarga de pressão ou sobrecarga de volume) impostos ao miocárdio durante as sessões
repetidas de exercício. A modificação da relação entre a espessura da parede e o diâmetro do
ventrículo hipertrófico ocorre conforme a lei de Laplace (22)
. O protocolo de exercício
utilizado em nosso estudo foi o modelo intervalado de alta e baixa intensidade de longa
duração caracterizado por sobrecarga de volume promovendo hipertrofia do tipo excêntrica
(DIVE aumentado). Exercícios aeróbios promovem sobrecarga de volume com aumento de
pré-carga sobre o miocárdio, induzindo a hipertrofia excêntrica com a adição de sarcômeros
em série resultando em aumento da câmara cardíaca (19)
.
Nossos achados de VE/PCF, DIVE e área de cardiomiócito indicam que administração
crônica de digoxina não induziu hipertrofia cardíaca. A digoxina é utilizada na insuficiência
cardíaca por aumentar a disponibilidade intracelular de Ca2+
no cardiomiócito aumentando o
grau de força de contração muscular. Além do efeito inotrópico positivo, os cardiotônicos
possuem efeitos neuro-endócrinos, neuro-hormonais e eletrofiológicos que podem interferir
no processo hipertrófico (23)
. Os cardiotônicos não alteram o débito cardíaco em sujeitos
normais, porém, em pacientes com reduzida função sistólica, a digoxina melhora a fração de
ejeção do ventrículo esquerdo aumentando o débito cardíaco em repouso e durante o exercício
(24). Nossos achados corroboram com o trabalho de Aldinger
(25) que também não verificou
hipertrofia cardíaca em pacientes tratados com digoxina e submetidos ao treinamento
intermitente.
Interessantemente, a administração crônica de verapamil promoveu aumento da área
do cardiomiócito. Os BCCs promovem efeito inotrópico negativo e são utilizados como anti-
hipertensivos por diminuírem a pressão sanguínea sistêmica. Contrariamente aos nossos
achados, dados de literatura sugerem que os BCCs podem atenuar o desenvolvimento da
hipertrofia cardíaca em ratos espontaneamente hipertensos (14,15)
. Essa divergência de
resultados pode ser atribuída às condições clínicas dos ratos, uma vez que utilizamos ratos
saudáveis e de acordo com alguns autores, os níveis de verapamil nos tecidos do coração
diferem drasticamente entre ratos normotensos e hipertensos (26,27)
.
Em relação à vascularização, nossos achados não verificaram alterações sobre a
morfologia de vasos sanguíneos induzidos pelo treinamento ou administração de digoxina ou
68
verapamil. Trabalhos têm mostrado que diversas situações como idade, condições clínicas e o
próprio treinamento físico induzem "angiogênese", que é uma expansão da rede capilar pela
formação de novos vasos sanguíneos ao nível dos capilares e arteríolas de resistência (28,29)
.
Em conclusão, nossos achados demonstram que a hipertrofia cardíaca induzida pelo
treinamento físico intervalado de alta intensidade não foi afetada pela administração
concomitante de digoxina ou verapamil.
69
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71
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
De acordo com Wisloff et al. (2001) as adaptações morfológicas e funcionais que
resultam na hipertrofia estão relacionadas com o aumento transitório do Ca2+
intracelular. O
Ca²+
tem papel central na contratilidade cardíaca e nossa hipótese foi que alterações na
condutância ao Ca²+
poderiam afetar diretamente o desempenho físico, bem como, a estrutura
e função do coração.
O treinamento físico intervalado de alta intensidade utilizado nesse estudo promoveu
hipertrofia cardíaca evidenciado nos dados de VE/PCF, diâmetro diastólico do VE e área do
cardiomiócito. Contudo, contrariando nossa hipótese a administração concomitante de
digoxina ou verapamil não afetaram a morfologia cardíaca, a função cardíaca e o desempenho
físico em ratos submetidos ao treinamento físico intervalado.
Como limitações do estudo estão o uso de ratos saudáveis e a falta de dosagem sérica
de digoxina já que as drogas utilizadas no trabalho são prescritas clinicamente em pacientes
cardiopatas o que poderia modificar os resultados.
Como perspectiva para estudos futuros, a determinação da expressão proteica por
Western Blot com amostras que foram coletadas do VE dos ratos pode fornecer melhores
dados para o estudo.
72
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