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Universidade de Aveiro
2017
Departamento de Biologia
Elsa Maria Carvalheiro Dias
Caraterização da toxicidade de carbamatos in vivo e desenvolvimento de um biossensor para controlo alimentar
Universidade de Aveiro
2017
Departamento de Biologia
Elsa Maria Carvalheiro Dias
Caraterização da toxicidade de carbamatos in vivo e desenvolvimento de um biossensor para controlo alimentar
Tese apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em Biologia, realizada sob a orientação científica da Professora Doutora Maria de Lourdes Gomes Pereira, Professora Associada com Agregação do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro e da Professora Doutora Simone Barreira Morais, Professora Adjunta do Laboratório de Química e Biologia do Instituto Superior de Engenharia do Porto.
Apoio financeiro dos projetos: CICECO-Aveiro Institute of Materials, POCI-01-0145-FEDER-007679; Refª. FCT UID/CTM/50011/2013, financiado por fundos nacionais FCT/MEC e cofinanciado pelo FEDER, em parceria com PT2020; Operação NORTE-01-0145-FEDER-000011–Qualidade e Segurança Alimentar-uma abordagem (nano)tecnológica e UID/QUI/50006/2013–POCI/01/0145/FEDER/007265; Bolsa de doutoramento concedida pela FCT, Refª. SFRH/BD/110102/2015 e do FSE no âmbito do III Quadro Comunitário de Apoio.
Dedico este trabalho ao meu filho.
o júri
presidente Prof. Doutor Aníbal Guimarães da Costa Professor Catedrático do Departamento de Engenharia Civil da Universidade de Aveiro.
Profª. Doutora Marlene Maria Tourais de Barros Professora Associada com Agregação do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Católica Portuguesa.
Prof. Doutor António José Arsénia Nogueira Professor Associado com Agregação do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro.
Profª. Doutora Maria do Carmo da Silva Pereira Professora Auxiliar da Faculdade de Engenharia Química da Universidade do Porto.
Profª. Doutora Simone Barreira Morais Professora Adjunta do Laboratório de Química e Biologia do Instituto Superior de Engenharia do Porto.
Prof. Doutor Elmano José Cruz Ramalheira Professora Auxiliar Convidado do Departamento de Ciência Médicas da Universidade de Aveiro.
agradecimentos
Agradeço à Professora Doutora Maria de Lourdes Gomes Pereira, do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro e à Professora Doutora Simone Barreira Morais do Laboratório de Química e Biologia do Instituto Superior de Engenharia do Porto (ISEP), pela orientação científica, apoio, disponibilidade, paciência, amizade e por acreditarem no meu trabalho. Agradeço ao Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro, em especial às colegas Catarina Domingues e Mariana Gomes e a todos os colegas do Laboratório de Histologia e do Grupo de Reações e Análises Químicas (GRAQ), do ISEP, pela ajuda, apoio, conhecimentos transmitidos e pela amizade. Agradeço ao Dr. Elmano Ramalheira, Diretor do Serviço de Patologia Clínica do Centro Hospitalar Baixo Vouga (CHBV), pela disponibilização de todos os meios necessários à realização dos estudos hematológicos e bioquímicos. Agradeço às empresas Horiba ABX, SAS Portugal e Siemens Healthcare Diagnostics Portugal, pela cedência de reagentes para as análises hematológicas e bioquímicas, respetivamente. Agradeço aos Laboratórios Associados CICECO-Aveiro Institute of Materials da Universidade de Aveiro e REQUIMTE do ISEP, pelo financiamento do trabalho. Agradeço à minha família e amigos pelo apoio.
palavras-chave
Carbamatos, ratos, histopatologia, biossensores enzimáticos.
resumo
Os carbamatos são um grupo de pesticidas amplamente usados na agricultura, embora sendo benéficos na melhoria da produção, apresentam toxicidade para os organismos não alvo. Dada a dispersão dos respetivos resíduos na água, no solo, no ar e nos alimentos, estes pesticidas representam um potencial risco para a saúde humana. O presente trabalho propõe a caraterização da toxicidade in vivo de dois pesticidas da classe dos carbamatos, o tiodicarbe e o aminocarbe, em ratos machos Wistar e o desenvolvimento de um biossensor enzimático para a deteção de resíduos destes carbamatos em laranjas. Para a caraterização toxicológica, os animais foram expostos oralmente aos pesticidas referidos, em doses subletais de 10, 20 e 40 mg kg
-1 do seu peso corporal, durante 30 dias para o tiodicarbe
e 14 dias para o aminocarbe. A avaliação toxicológica foi efetuada através da observação dos sinais de toxicidade, da monitorização do peso corporal, de análises hematológicas, bioquímicas, imunológicas e histológicas. Os resultados obtidos mostraram alterações no sangue dos ratos expostos a esses carbamatos e lesões degenerativas em vários órgãos e tecidos, enfatizando os possíveis riscos para a saúde. No desenvolvimento do biossensor enzimático foram testados o grafeno e os nanotubos de carbono como nanomateriais de construção e a enzima lacase extraída do fungo Trametes versicolor, como elemento enzimático. Foram otimizados os parâmetros voltamétricos e o tempo de incubação da enzima. O biossensor foi aplicado na deteção dos carbamatos em amostras de laranjas. A avaliação do biossensor foi efetuada usando métodos eletroquímicos como a voltametria cíclica e voltametria de onda quadrada. Os resultados obtidos demonstraram que o grafeno, os nanotubos de carbono e a lacase são excelentes materiais para a construção do biossensor, proporcionando boa sensibilidade e limites de deteção e de quantificação aceitáveis. Obtiveram-se bons valores de recuperação, indicando que o biossensor desenvolvido poderá constituir uma nova abordagem no âmbito do controlo alimentar. Em conclusão, salienta-se a interdisciplinaridade deste estudo que permitiu uma visão global da toxicidade do tiodicarbe e do aminocarbe em pequenos roedores, com possíveis implicações para a saúde pública. Este trabalho demonstra ainda a importância do desenvolvimento de biossensores para a pesquisa de resíduos em citrinos, representando uma mais valia no contexto da segurança alimentar.
keywords
Carbamates, rats, histopathology, enzimatic biosensors.
abstract
Carbamates are a group of pesticides extensively used in agriculture, being beneficial in improving the production, even though they have toxicity to non-target organisms. Due to the dispersion of the respective residues into the water, soil, air and food, these pesticides pose a potential risk to human health. This research aims the characterization of in vivo toxicity of two pesticides of the carbamates class, thiodicarb and aminocarb, in male Wistar rats. The development of an enzyme biosensor for the detection of residues of these carbamates in oranges is another goal. For toxicological characterization, animals were exposed orally to those pesticides in sublethal doses of 10, 20 and 40 mg kg
-1 of body weight for
30 days for thiodicarb and 14 days for aminocarb. The toxicological evaluation was performed by observation of toxic signs, monitoring of body weight, hematological, biochemical, immunological and histopathological studies. The results showed deleterious changes in the blood of rats exposed to these carbamates and degenerative lesions in various organs and tissues, emphasizing the potential health risks. Graphene and carbon nanotubes were tested as building element nanomaterials for the development of an enzymatic biosensor; laccase from Trametes versicolor was the selected enzyme. Voltammetric parameters and the incubation time of enzyme were optimized. The developed biosensor was applied for the detection of carbamates in samples of oranges. The evaluation of the biosensor´s performance was achieved using the electrochemical methods, namely cyclic voltammetry and square wave voltammetry. The results showed that graphene, carbon nanotubes and laccase are excellent materials for the construction of the biosensor, providing good sensitivity and acceptable limits of detection and quantification. Good recovery values were obtained, indicating that the biosensor can constitute a novel approach for food safety assessment. As a conclusion, it is worth to mention the interdisciplinary approach used in this study that allowed to characterize the toxicity of thiodicarb and aminocarb in small rodents, with possible implications for public health. This research also showed the importance of the development of biosensors for the detection of pesticide residues in fruits, representing an interesting contribution for the food safety area.
i
Índice
Lista de figuras ................................................................................................................................... iv
Lista de 33333tabelas ........................................................................................................................ vii
Lista de abreviaturas ........................................................................................................................ viii
Lista de símbolos ................................................................................................................................. x
CAPÍTULO I ...................................................................................................................................... 1
ENQUADRAMENTO ................................................................................................................... 1
1. Enquadramento .......................................................................................................................... 3
1.1. Organização da tese ............................................................................................................. 4
1.2. Objetivos ............................................................................................................................. 5
CAPÍTULO II .................................................................................................................................... 7
INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 7
1. Carbamatos ................................................................................................................................. 9
1.1. Tiodicarbe.......................................................................................................................... 11
1.2. Aminocarbe ....................................................................................................................... 12
2. Toxicologia dos carbamatos ..................................................................................................... 13
3. Efeitos dos carbamatos na saúde .............................................................................................. 15
4. Resíduos de pesticidas e a legislação ....................................................................................... 19
5. Biossensores enzimáticos ......................................................................................................... 22
5.1. Lacase ................................................................................................................................ 24
5.2. Nanomateriais.................................................................................................................... 27
5.2.1. Grafeno ........................................................................................................................... 27
5.2.2. Nanotubos de carbono .................................................................................................... 29
6. Análise de carbamatos por biossensores enzimáticos .............................................................. 30
CAPÍTULO III ................................................................................................................................. 39
MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................... 39
1. Estudos in vivo da toxicidade do tiodicarbe e do aminocarbe .................................................. 41
1.1. Reagentes e soluções ......................................................................................................... 41
ii
1.2. Animais e protocolo de exposição aos pesticidas.............................................................. 41
1.3. Monitorização dos sinais de toxicidade e do peso corporal .............................................. 42
1.4. Sacrifício dos animais e colheita de órgãos ....................................................................... 42
1.5. Determinação de parâmetros hematológicos, bioquímicos e imunológicos...................... 43
1.5.1. Análises hematológicas .................................................................................................. 44
1.5.2. Análises bioquímicas ...................................................................................................... 44
1.5.3.Análises imunológicas ..................................................................................................... 44
1.6. Análise histológica ............................................................................................................ 45
1.7. Análise estatística .............................................................................................................. 45
2. Desenvolvimento do biossensor enzimático ............................................................................ 46
2.1. Reagentes e soluções ......................................................................................................... 46
2.2. Instrumentação .................................................................................................................. 47
2.3. Modificação do elétrodo de carbono vítreo ....................................................................... 48
2.4. Imobilização da lacase ...................................................................................................... 48
2.5. Otimização dos parâmetros voltamétricos ........................................................................ 49
2.6. Otimização do tempo de incubação da lacase ................................................................... 49
2.7. Quantificação dos pesticidas ............................................................................................. 50
2.8. Aplicação do biossensor a amostras de laranja ................................................................. 52
CAPÍTULO IV ................................................................................................................................. 53
RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................. 53
1. Estudos in vivo da toxicidade do tiodicarbe em ratos .............................................................. 55
1.1. Monitorização dos sinais de toxicidade, do peso corporal e dos órgãos ........................... 55
1.2. Análises hematológicas ..................................................................................................... 56
1.3. Análises bioquímicas ......................................................................................................... 57
1.4. Análises imunológicas ....................................................................................................... 59
1.5. Análise histológica ............................................................................................................ 60
2. Estudos in vivo da toxicidade do aminocarbe em ratos ............................................................ 64
iii
2.1. Monitorização dos sinais de toxicidade, do peso corporal e dos órgãos ........................... 64
2.2. Análises hematológicas ..................................................................................................... 65
2.3. Análises bioquímicas ......................................................................................................... 67
2.4. Análise histológica ............................................................................................................ 69
3. Construção do biossensor enzimático ...................................................................................... 70
3.1. Modificação do elétrodo de carbono vítreo ....................................................................... 71
3.2. Imobilização da enzima lacase .......................................................................................... 74
4. Otimização dos parâmetros voltamétricos ............................................................................... 78
5. Otimização do tempo de incubação da lacase .......................................................................... 81
6. Quantificação dos pesticidas .................................................................................................... 83
6.1. Tiodicarbe.......................................................................................................................... 83
6.2. Aminocarbe ....................................................................................................................... 85
7. Aplicação do biossensor a amostras de laranja ........................................................................ 87
CAPÍTULO V .................................................................................................................................. 89
CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS .......................................................................... 89
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................. 95
iv
Lista de figuras
Figura 1: Estrutura química geral de um carbamato............................................................ 11
Figura 2: Estrutura molecular do tiodicarbe. ....................................................................... 12
Figura 3: Estrutura molecular do aminocarbe. .................................................................... 13
Figura 4: Estrutura do grafeno. Adaptado de [113]. ............................................................ 28
Figura 5: Estrutura dos nanotubos de carbono. Adaptado de [123]. ................................... 29
Figura 6: Peso corporal dos animais do grupo controlo e dos grupos expostos ao tiodicarbe
desde o início do estudo, incluindo o período de aclimatização. ........................................ 56
Figura 7: Resultado da citometria de fluxo realizada no sangue dos ratos, após 30 dias de
exposição ao tiodicarbe: (a) gráfico do marcador NKR-P1A+ do grupo controlo e (b) do
grupo C. ............................................................................................................................... 59
Figura 8: Cortes histológicos dos vários órgãos de ratos expostos ao tiodicarbe: (a) fígado
do grupo controlo e (b) do grupo C, apresentando hemorragia e vacuolização difusa (*); (c)
rim do grupo controlo e (d) do grupo C, apresentando vacuolização e degenerescência
celular (*); (e) baço do grupo controlo e (f) do grupo C, apresentando notória acumulação
de ferro (*). Coloração H & E. Ampliação original 100x. .................................................. 61
Figura 9: Cortes histológicos de testículo e do timo de ratos expostos ao tiodicarbe: (a)
testículo do grupo controlo e (b) do grupo C, apresentando hemorragias (*); timo do grupo
controlo (c) e (d) do grupo C, presentando perda celular no cortex. Coloração H & E.
Ampliação original 100x. .................................................................................................... 62
Figura 10: Peso corporal dos animais do grupo controlo e dos grupos expostos ao
aminocarbe........................................................................................................................... 64
Figura 11: Cortes histológicos do fígado e do rim de ratos expostos ao aminocarbe: (a)
fígado do grupo controlo e (b) do grupo C, apresentando hemorragia e vacuolização difusa;
v
(c) rim do grupo controlo e (d) do grupo C, com evidência de hemorragias; Coloração H &
E. Ampliação original 100x. ................................................................................................ 69
Figura 12: Voltamogramas por CV(a) e por SWV (b) em AMP 5,83×10-5
M, obtidos com
GCE (linha azul) e GCE/Gr (linha vermelha), em meio tampão BR, pH 5,0, com f = 50 Hz,
a = 40 mV e ∆Es = 4 mV. ................................................................................................... 71
Figura 13: Voltamogramas cíclicos da oxidação e redução de AMP 5,83×10-5
M, obtidos
com o elétrodo GCE (linha azul) em meio tampão BR, pH 5,0, com f = 50 Hz, a = 40 mV,
∆Es = 4 mV, gama de potencial 5,0 a -0,4 V, com deposições de Gr, com os volumes de
3µL (linha azul clara), 6µL (linha cinzenta), 9µL(linha verde) e 12 µL (linha vermelha). 72
Figura 14: Voltamogramas obtidos por SWV da redução de AMP 5,83×10-5
usando o GCE
(linha azul) e do GCE/CNT (linha vermelha) em meio tampão BR, pH 5,0, com f = 50 Hz,
a = 40 mV, ∆Es = 4 mV. ..................................................................................................... 74
Figura 15: Voltamogramas por SWV da redução do AMP 5,83×10-5
M, em meio tampão
BR, pH 5,0, f = 50 Hz, a = 40mV, ∆Es = 4mV, obtidos do GCE (linha azul), GCE/Gr
(linha vermelha) GCE/Gr/Lac (linha verde). ....................................................................... 75
Figura 16: Voltamogramas por SWV da redução do AMP 5,83×10-5
M, em meio tampão
BR, pH 5,0, com f = 50 Hz, a = 40 mV, ∆Es = 4 mV, GCE/CNT (linha azul),
GCE/CNT/Lac (linha vermelha). ........................................................................................ 76
Figura 17: Primeira etapa do processo de oxidação do AMP com formação de imino-
quinona. Adaptado de [45]. ................................................................................................. 77
Figura 18: Segunda etapa do processo de oxidação do AMP, em que a imino-quinona
formada na primeira etapa e por libertação de amónia forma p-benzoquinona e esta é
convertida em p-hidroquinona. Adaptado de [45]. .............................................................. 77
Figura 19: Variação da corrente do pico de redução do AMP 5,83x10-5
M (em meio tampão
BR, pH 5,0, com a = 40 mV, ∆Es = 4 mV) e com frequência (10 a 100 Hz) obtido com o
GCE/CNT/Lac. .................................................................................................................... 78
vi
Figura 20: Variação da corrente do pico de redução do AMP 5,83x10-5
M (em meio tampão
BR, pH 5,0, com f = 50 Hz e ∆Es = 4mV) com a amplitude (10 a 100 mV), obtido com o
GCE/CNT/Lac. .................................................................................................................... 79
Figura 21: Variação da corrente do pico de redução do AMP 5,83x10-5
M (em meio tampão
BR, pH 5,0, com f = 50 Hz, a = 40 mV e com incremento de potencial (1 a 10 mV) obtido
com o GCE/CNT/Lac. ......................................................................................................... 80
Figura 22: Voltamogramas do GCE/CNT/Lac obtidos com vários tempos de contato do
elétrodo com o substrato AMP 5,83x10-5
M, em meio tampão BR, pH 5,0, f = 50 Hz, a =
40 mV, ∆Es = 4 mV. Tempos: 0, 15, 30, 45 e 60 min., linha preta, verde, azul, azul claro,
vermelha, respetivamente. ................................................................................................... 82
Figura 23: (a) Voltamogramas obtidos por SWV com o GCE/CNT/Lac na presença de
AMP 5,83x10-5
M em meio tampão BR, pH 5,0, para concentrações de tiodicarbe na gama
de 2,82-14,1 µM. (b) Curva analítica obtida a partir da percentagem de inibição enzimática
e a concentração de tiodicarbe para o GCE/CNT/Lac. ........................................................ 84
Figura 24: (a) Voltamogramas obtidos por SWV com o GCE/CNT/Lac, na presença de
AMP 5,83x10-5
M em meio tampão BR, pH 5,0 para concentrações de aminocarbe na
gama de 4,8-24,0 µM. (b) Curva analítica obtida a partir da percentagem de inibição
enzimática e a concentração de aminocarbe para o GCE/CNT/Lac. ................................... 86
vii
Lista de tabelas
Tabela 1: Classificação dos pesticidas segundo a LD50 em ratos (mg kg-1
peso corporal).
Adaptado de [22]. ................................................................................................................ 14
Tabela 2: Exemplos representativos dos efeitos tóxicos de alguns carbamatos em ratos. .. 18
Tabela 3: Reagentes químicos usados no desenvolvimento do biosensor enzimático,
respetivas fórmulas químicas, origem e grau de pureza. ..................................................... 47
Tabela 4: Parâmetros bioquímicos (média ± SD) determinados no soro dos ratos do grupo
controlo e dos grupos expostos ao tiodicarbe. ..................................................................... 57
Tabela 5: Parâmetros hematológicos determinados no sangue dos ratos do grupo controlo e
dos ratos expostos ao aminocarbe. ...................................................................................... 65
Tabela 6: Parâmetros bioquímicos (média ± SD) determinados no soro dos ratos do grupo
controlo e dos grupos expostos ao aminocarbe. .................................................................. 67
Tabela 7: Valores da intensidade de corrente do pico e os respetivos tempos de incubação
do GCE/CNT/Lac. ............................................................................................................... 81
viii
Lista de abreviaturas
AChE Acetilcolinesterase
ALP Fosfatase alcalina
ALT Alanina aminotransferase
AMP Aminofenol
AST Aspartato aminotransferase
AuNPs Nanopartículas de ouro
BChE Butirilcolinesterase
BR Tampão Britton-Robinson
CE Eletroforese capilar
CHBV Centro Hospitalar Baixo Vouga
CICECO Aveiro Institute of Materials
CNT Nanotubos de carbono
Codex Codex Alimentarius Commission
Col T Colesterol total
Cr Creatinina
CV Voltametria cíclica
DGADR Direção Geral de Agricultura e Desenvolvimento Rural
DMF Dimetilformamida
DNA Ácido desoxirribonucleico
ED Disruptores endócrinos
EDTA K3 Ácido etilenodiamino tetracético, tripotássico
EFSA Autoridade Europeia para a Segurança Alimentar
EU União Europeia
FAO Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação
GC Cromatografia gasosa
GCE Elétrodo de carbono vítreo
GGT Gama glutamil transpeptidase
Gr Grafeno
GRAQ Grupo de Reações de Análises Químicas
HDL Lipoproteína de alta densidade
ix
HE Hematoxilina e eosina
HPLC Cromatografia líquida de alta resolução
Lac Lacase
LC Cromatografia líquida
LD50 Dose letal média
LDH Desidrogenase lática
LDL Lipoproteína de baixa densidade
LOD Limite de deteção
LOQ Limite de quantificação
MO Medula óssea
MRLs Limites máximos de resíduos
MS Espectrometria de massa
MWCNT Nanotubos de parede múltipla
NK "natural killer cell" célula naturalmente citotóxica
OMS Organização Mundial de Saúde
PT Proteínas totais
QuEChERS Rápido, fácil, económico, efetivo, robusto e seguro
REQUIMTE Rede de Química e Tecnologia
RNA Ácido ribonucleico
ROS Espécies reativas de oxigénio
SWCNT Nanotubos de parede simples
SWV Voltametria de onda quadrada
TA Temperatura ambiente
Tg Triglicerideos
Ur Ureia
US EPA Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos
ZnO NPs Nanopartículas de óxido de zinco
x
Lista de símbolos
% IR percentagem de inibição enzimática
∆Es incremento de potencial
a amplitude de aplicação do pulso de potencial
E potencial
Ef potencial final
Ei potencial inicial
Epa potencial do pico anódico
Epc potencial do pico catódico
f frequência de aplicação do pulso de potencial
I intensidade de corrente
Io intensidade da corrente base
Ipa intensidade de corrente do pico anódico
Ipc intensidade de corrente do pico catódico
ºC graus Celcius
pH potencial hidrogeniónico
% Rec percentagem de recuperação
rpm rotações por minuto
SD desvio padrão
V volt
média
CAPÍTULO I
ENQUADRAMENTO
______________________________________________________________________EQUADRAMENTO
3
1. Enquadramento
Em Portugal, os pesticidas (produtos fitofarmacêuticos) são essencialmente utilizados na
agricultura para garantir a elevada produtividade. Embora a sua comercialização só seja
permitida através de autorização de venda pela Direção Geral de Agricultura e
Desenvolvimento Rural (DGADR), o seu uso continua a ser indiscriminado sendo a classe
dos carbamatos uma das mais usadas. A toxicidade destes compostos não é restrita aos
organismos alvo; a exposição a resíduos nos alimentos pode provocar efeitos adversos na
saúde humana. Neste sentido, é de extrema importância caraterizar os efeitos tóxicos, razão
pela qual uma parte deste trabalho é dedicada ao estudo dos efeitos toxicológicos dos
carbamatos.
A contaminação dos alimentos por resíduos de pesticidas é uma preocupação de saúde
pública, estando as autoridades fiscalizadoras responsáveis pelo controlo de qualidade.
Este controlo é realizado usualmente com recurso a técnicas convencionais dispendiosas e
morosas. Assim, o desenvolvimento de metodologias de análise alternativas constitui um
desafio, sendo os biossensores enzimáticos ferramentas electroanalíticas com enorme
potencial para aplicação à área do controlo de qualidade e em particular na segurança
alimentar.
O presente trabalho, realizado no âmbito da tese do Programa Doutoral em Biologia, com a
especialização em Biologia Celular, foi desenvolvido no Laboratório de Histologia Animal
do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro e no Grupo de Reações de
Análises Químicas (GRAQ) do Instituto Superior de Engenharia do Porto (ISEP), com
ligação aos Laboratórios Associados CICECO - Aveiro Institute of Materials e ao
REQUIMTE (Rede de Química e Tecnologia), respetivamente. Teve ainda a colaboração
do Serviço de Patologia Clínica do Centro Hospitalar Baixo Vouga (CHBV), Aveiro.
Parte dos resultados obtidos já foram publicados, tal como se indica a seguir:
Morais, S.; Dias, E.; Pereira, M. L. (2012) Carbamates: Human Exposure and
Health Effects. In The Impact of Pesticides, Milan Jakanovic (ed), Academy
Publish, USA, 21-38.
ENQUADRAMENTO_____________________________________________________________________
4
Dias, E.; Gomes, M.; Domingues, C.; Ramalheira, E.; Morais, S.; Pereira, M. L.
(2013) Subacute effects of the thiodicarb pesticide on target organs of male wistar
rats: biochemical, histological and flow cytometry studies. Journal of Toxicology
and Environmental Health, Part A, 76, 533–539.
Dias, E.; Morais, S.; Ramalheira, E.; Pereira, M. L. (2014) Characterization of the
toxicological effects of aminocarb on rats: haematological, biochemical and
histological analyses. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A, 77,
849–855.
Dias, E.; Costa, F.; Morais, S.; Pereira, M. L. (2015) A Review on the Assessment
of the Potential Adverse Health Impacts of Carbamate Pesticides. In Public Health,
David Claborn (ed), Intech, Croacia, 197-212.
1.1. Organização da tese
A presente tese está organizada em cinco capítulos, onde o primeiro enquadra e apresenta
os objetivos do trabalho. O segundo capítulo faz uma abordagem aos pesticidas da classe
de carbamatos, com particular atenção para a sua toxicidade, o modo de ação e os efeitos
na saúde. Aborda também a legislação na União Europeia (EU) para os resíduos destes
compostos e os biossensores eletroquímicos como metodologia de análise de resíduos de
carbamatos, nomeadamente os enzimáticos, modificados com nanomateriais. O terceiro
capítulo descreve os materiais e métodos usados neste trabalho. O quarto apresenta os
resultados e a sua discussão em duas partes: a primeira apresenta os resultados obtidos nos
estudos de toxicidade in vivo com o tiodicarbe e com o aminocarbe, e na segunda parte são
apresentados os resultados obtidos com o desenvolvimento do biossensor enzimático. O
quinto capítulo apresenta as conclusões deste trabalho, bem como as perspetivas futuras.
______________________________________________________________________EQUADRAMENTO
5
1.2. Objetivos
Este trabalho teve os seguintes objetivos gerais:
estudar a toxicidade, em ratos machos Wistar, de dois pesticidas da classe dos
carbamatos, o tiodicarbe e o aminocarbe;
desenvolver e aplicar um biossensor enzimático para a deteção de resíduos de
carbamatos em laranjas.
Os objetivos específicos foram os seguintes:
o caraterizar os efeitos subletais do tiodicarbe através do estudo dos
parâmetros hematológicos e bioquímicos em amostras de sangue, da
imunofenotipagem dos linfócitos em amostras de sangue e de medula óssea
e da histologia dos órgãos;
o caraterizar os efeitos subletais do aminocarbe através da determinação dos
parâmetros hematológicos e bioquímicos em amostras de sangue e da
histologia dos órgãos;
o otimizar a configuração do biossensor enzimático recorrendo à lacase e aos
nanomateriais, o grafeno e os nanotubos de carbono;
o otimizar os parâmetros voltamétricos para a deteção do tiodicarbe e do
aminocarbe, determinar as curvas de calibração, os limites de deteção e de
quantificação;
o validar e aplicar a metodologia desenvolvida na determinação e
quantificação de resíduos do tiodicarbe e do aminocarbe em amostras de
laranja.
CAPÍTULO II
INTRODUÇÃO
_________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO
9
1. Carbamatos
Os pesticidas são considerados como um dos principais fatores envolvidos na
contaminação ambiental em todo o mundo[1]
. São amplamente utilizados para controlo de
pragas na agricultura, na jardinagem, nas habitações e no tratamento do solo[2]
. Neste
âmbito são usados para controlar doenças, destruir ervas daninhas, insetos e outros
organismos e obter elevados rendimentos na agricultura[3, 4]
.
Existem cerca de 3000 produtos comerciais e mais de 800 ingredientes ativos, em mais de
100 classes de substâncias[1,5,6]
. A utilização dos pesticidas sintéticos, nomeadamente os
carbamatos, cresceu enormemente no século passado, a partir dos anos 60, tendo
aumentado drasticamente nos últimos anos (cerca de 93%) como consequência do aumento
populacional e da produção agrícola[7,8]
.
O consumo de pesticidas em todo o mundo é cerca de dois milhões de toneladas anuais,
sendo o Brasil o grande consumidor destes químicos, responsável por cerca de 20% do
consumo mundial[8,9].
Na Europa, e segundo a Eurostat, foram consumidos em 2013 (dados mais recentes), no
conjunto dos 28 países, 360.000 toneladas de pesticidas. A Espanha teve um consumo de
19,5%, a França 18,7%, a Itália 13,8% e a Alemanha 12,3%. Estes quatro países figuram
sempre entre os de maior consumo em todos os diferentes grupos de produtos químicos,
divididos em fungicidas e bactericidas, herbicidas, inseticidas, moluscicidas, reguladores
do crescimento de plantas e outros produtos protetores[10]
.
Em Portugal, e segundo os dados DGADR, o consumo de produtos fitofarmacêuticos
durante o ano de 2010 totalizou quase 14000 toneladas, expressos em substância ativa. No
seu conjunto, fungicidas, herbicidas e fumigantes do solo corresponderam a 94% do total
de produtos fitofarmacêuticos vendidos. Os fungicidas representaram cerca de 69% do
total das vendas, os herbicidas cerca de 15% e os inseticidas/acaricidas aproximadamente
3%. No final de 2010, estavam titulados com autorização de venda em Portugal 871
produtos fitofarmacêuticos, com base em 216 substâncias ativas[11]
.
Os carbamatos são o grupo de pesticidas orgânicos sintéticos mais comummente aplicados
na agricultura. Constituem uma classe versátil de compostos usados como inseticidas,
INTRODUÇÃO____________________________________________________________________
10
miticidas, fungicidas, nematocidas, acaricidas, moluscicidas, inibidores de rebentos ou
herbicidas[2, 3,12,13, 14, 15]
.
São usados anualmente em grande escala por todo o mundo, tanto para fins agrícolas como
não agrícolas[2, 12, 16, 17]
. Devido ao seu modo de ação e eficácia, a aplicação destes
compostos é uma das melhores opções atualmente oferecidas para o controlo de pragas na
agricultura. Podem também ser usados em áreas públicas, em habitações, na jardinagem,
como drogas terapêuticas (ex: tratamento da doença de Alzheimer) e como fármacos no
domínio da medicina veterinária[16, 18, 19]
. Contudo, a sua toxicidade tem levantado sérias
preocupações na segurança alimentar e na saúde ambiental, dado que a contaminação pode
resultar do tratamento, da contaminação cruzada ou do uso impróprio. Neste contexto, os
frutos, vegetais e outros produtos agrícolas apresentam maior probabilidade de serem
contaminados por estes compostos[2, 20]
.
Os carbamatos são moléculas relativamente simples, caraterizados por serem esteres de
ácido carbâmico (NH2COOH), em que os grupos OH e NH2 se encontram funcionalizados, na
forma de ésteres e amidas, respetivamente[19]
.
A sua função está relacionada com a estrutura molecular. Quimicamente a estrutura básica
é comum (Figura 1): derivam todos do ácido carbâmico e são conhecidas três classes[2, 13]
:
a) os derivados de éster;
b) aqueles com a estrutura geral R1NHC (O) OR2, em que R1 e R2 são radicais
aromáticos e/ou alifáticos;
c) aqueles que contêm um grupo benzimidazol.
Os inseticidas possuem tipicamente o radical carbamato N substituído por um éster
aromático ou grupo oxime. A sua toxicidade está relacionada com a capacidade de inibir a
acetilcolinesterase (AChE) e formar potenciais mutagénicos como os N-
nitrosocarbamatos[2, 12, 21]
.
_________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO
11
Figura 1: Estrutura química geral de um carbamato.
De uma forma geral, os carbamatos apresentam baixa toxicidade em mamíferos.
Apresentam um tempo de semi-vida curto e são menos persistentes no meio ambiente, logo
menos bioacumulativos do que outras classes de pesticidas. São rapidamente
metabolizados e excretados[2, 22, 23]
. No entanto, não deixam de constituir um perigo para a
saúde humana e para o ambiente, podendo apresentar extrema toxicidade para os humanos
quando em contato direto com o ingrediente ativo[2, 24, 25]
.
A exposição humana a estes compostos pode ocorrer através de múltiplas formas, a nível
habitacional, ocupacional (durante a produção ou a aplicação dos produtos), ou através do
consumo de água ou de alimentos contaminados[24]
. Os carbamatos, por serem perigosos
para o ambiente e para a saúde humana, estão incluídos na lista de poluentes prioritários
pela United States, Environmental Protection Agency (US EPA), um dos órgãos
internacionais de controlo ambiental mais importante[2, 26, 27]
. Da vasta lista de carbamatos
disponíveis contam-se o tiodicarb e o aminocarbe, os quais foram usados neste estudo.
1.1. Tiodicarbe
O tiodicarbe (dimetil N,N'-[tiobis [(metilimino) carboniloxi]] bis (etanimidotioato; CAS
59669-26-0) é um carbamato inseticida de origem sintética, da classe dos pesticidas N-
metil carbamato, de fórmula química C10H18N4O4S3 (MM 354,5 g mol-1
) e cuja estrutura
molecular é apresentada na Figura 2[28]
. É um inseticida de amplo espectro de atividade,
altamente eficaz no controlo de pragas, sendo usado extensivamente para proteção das
culturas agrícolas[29]
, nomeadamente, o algodão, o milho e a soja. Contudo, é também
utilizado mas de forma mais restrita em vegetais folhosos, couves e plantas ornamentais.
INTRODUÇÃO____________________________________________________________________
12
Apresenta uma ação sobre lesmas, lepidópteros, controlando as larvas em diferentes
estágios, bem como os respetivos ovos. É também um moluscicida sistémico[3]
. Uma outra
caraterística deste produto é que possui longa atividade residual[30]
.
Figura 2: Estrutura molecular do tiodicarbe.
O tiodicarbe é um pó branco cristalino, de odor sulfuroso, estável em condições de luz
ambiental. Apresenta o ponto de fusão de 172,6ºC e densidade 1,44 g/cm3 a 20ºC. A sua
solubilidade em água é de 35 mg L-1
a 25ºC, o tempo de semi-vida é cerca de 2 dias em
solos arenosos e as suas partículas podem-se depositar com chuva e com o pó. A fotólise e
a hidrólise participam na eliminação deste composto nos sistemas terrestres. No entanto, o
produto da degradação biológica e química, o metomil, é mais persistente que o composto
de origem, permanecendo no solo durante 7 dias[31, 32]
.
Este carbamato é conhecido comercialmente pelas seguintes designações: Larvin®,
Securex®
, Souverain®, Semevin
®, Futur
®, Relark
®, Genesis
®, Judge
®, Skipper
®[28].
1.2. Aminocarbe
O aminocarbe (4-dimetilamino-3-metil-N-carbamato; CAS 2032-59-9) é também um
pesticida da classe dos N-metil carbamato. A fórmula molecular é C11H16N2O2 (MM
208,26 g mol-1
) e a sua estrutura molecular está representada na Figura 3. É largamente
utilizado na agricultura como inseticida, fungicida e herbicida no tratamento de cereais
armazenados, frutas e legumes, a fim de controlar uma série de pragas de insetos como os
lepidópteros e os coleópteros[12, 17, 33]
.
_________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO
13
Figura 3: Estrutura molecular do aminocarbe.
O aminocarbe apresenta-se sob a forma de cristais brancos, com solubilidade de 915 mg l-1
a 20º C. É fortemente instável em meio alcalino e a semi-vida é de 6 dias.
O aminocarbe é comercialmente conhecido por Matacil®[34, 35]
.
2. Toxicologia dos carbamatos
A classificação toxicológica dos pesticidas, segundo a Organização Mundial de Saúde
(OMS), pretende distinguir entre as diversas formas de cada pesticida, na medida em que
se baseia na toxicidade do composto e nas suas formulações. A classificação estabelece,
principalmente, a toxicidade aguda oral e cutânea em ratos.
A toxicidade dos carbamatos é variável, desde altamente tóxico a ligeiramente tóxico ou
praticamente não tóxico[2]
. Alguns carbamatos, como o aldicarbe em que a dose letal média
(LD50) oral é de 0,3 a 0,9 mg kg-1
, o carbofurano (LD50 oral é de 8 mg kg-1
) e o carbaril
(LD50 oral é de 12,5 mg kg-1
) são classificados como altamente tóxicos. Outros, como o
propoxur (LD50 oral é de 68-94 mg kg-1
e a cutânea é > 2000 mg kg-1
) são considerados
moderadamente tóxicos. Os benzimidazoles são considerados como tendo baixa
toxicidade[19]
.
INTRODUÇÃO____________________________________________________________________
14
A Tabela 1 apresenta os critérios recomendados pela OMS (2010), para a classificação da
toxicidade dos pesticidas (sólidos e líquidos) e as respetivas LD50 para a exposição oral e
cutânea em ratos.
Tabela 1: Classificação dos pesticidas segundo a LD50 em ratos (mg kg-1
peso corporal). Adaptado de [22].
Classe Descrição Oral Cutânea
sólidos líquidos sólidos líquidos
Ia extremamente tóxico ≤ 5 ≤ 20 ≤ 10 ≤ 40
Ib altamente tóxico 5 - 50 20 - 200 10 - 100 40 - 400
II moderadamente tóxico 50 - 500 200 - 2000 100 - 1000 400 - 4000
III levemente tóxico > 500 > 2000 > 1000 > 4000
U não tóxico > 5000
O grau de toxicidade dos carbamatos está diretamente relacionado com o potencial tóxico
da substância ativa (o tipo de carbamato), da dose, do grau de contaminação, do tempo de
duração, da frequência e da via de exposição, bem como da via de absorção e do
metabolismo. Os carbamatos podem ser absorvidos através das mucosas e da pele[2, 16, 22]
.
O mecanismo toxicológico dos carbamatos, exceto o dos herbicidas, envolve a
carbamilação do local ativo da AChE que conduz à inativação desta enzima, a qual tem um
papel importante no sistema nervoso dos seres humanos e de outras espécies animais. Os
carbamatos são frequentemente designados de anti-colinesterases, dado que atuam por
inibição da atividade da AChE, enzima responsável pela hidrólise da acetilcolina[20, 23]
.
Na presença de inibidores, AChE torna-se progressivamente inibida, sendo incapaz de
hidrolisar a acetilcolina em colina e ácido acético. Por conseguinte, a acetilcolina acumula-
se nas sinapses e junções nervosas[21, 36]
, causando disfunção simpática, parassimpática,
com consequente estimulação contínua das fibras colinérgicas ao longo de todo o sistema
nervoso. O efeito é equivalente à estimulação excessiva das terminações nervosas,
suprimindo a transmissão contínua dos impulsos nervosos entre as células nervosas, e entre
os nervos e as células musculares, alterando o normal funcionamento neurológico dos seres
humanos[2, 16, 20, 37]
.
_________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO
15
A presença da AChE em insetos, aves, peixes e em todos os mamíferos, torna esta classe
de pesticidas bastante tóxica para os organismos não alvo, pois quando a transmissão dos
impulsos nervosos é bloqueada, estes seres vivos perdem o controlo sobre os músculos
respiratórios, sufocam e acabam por morrer[3, 21, 38]
.
O tiodicarbe e o aminocarbe são pesticidas inibidores da atividade da AChE[3, 142]
. O
tiodicarbe é classificado pela US EPA (1998) e pela OMS (2010) na categoria toxicológica
de classe II, que significa ser moderadamente tóxico[29]
, sendo a LD50 para ratos, por via
oral, no estado sólido, de 46,5 mg kg-1
para machos e 39,1 mg kg-1
para fémeas[2, 16, 22, 39]
.
Relativamente ao aminocarbe, poucos estudos existem sobre a sua toxicidade aguda ou
crónica. No entanto, sabe-se que a LD50 em ratos é na ordem de 30-40 mg kg-1
de peso
corporal, sendo considerado altamente tóxico (LD50 < 50 mg kg-1
)[2]
.
3. Efeitos dos carbamatos na saúde
A relação entre a exposição a carbamatos e os possíveis efeitos na saúde tem sido
intensamente estudada nas últimas décadas, sendo os efeitos indesejados reconhecidos
como um problema de saúde pública[40]
.
Como já foi referido, os carbamatos são menos persistentes no ambiente resultando em
menor bioacumulação e biomagnificação na cadeia alimentar[24]
. No entanto, não deixam
de ser considerados perigosos para o ambiente e para a saúde humana[2, 13, 15, 16, 41, 42]
.
A aplicação indiscriminada de carbamatos resulta na excessiva presença de resíduos nos
diferentes compartimentos ambientais (ar, solo, água), contaminando toda a cadeia
alimentar[43]
. Assim, o ser humano pode ser afetado por estas substâncias, através das vias
oral, nasal e cutânea[13, 41, 44]
, sendo a via cutânea e/ou nasal a principal via de contato na
exposição ocupacional. A exposição envolvendo a população em geral ocorrer
principalmente devido à ingestão de água e alimentos contaminados[21, 24]
.
INTRODUÇÃO____________________________________________________________________
16
Os efeitos adversos dos carbamatos na saúde humana estão descritos como afetando
diferentes tecidos, órgãos, sistemas e funções. Vários estudos referem a alteração das
funções respiratória, renal, hepática, cardíaca, neurológica, reprodutora e de
desenvolvimento, imunológica e metabólica em seres humanos e em animais[3, 16, 30, 44, 45]
.
Em particular, a exposição a carbamatos durante períodos críticos da vida, como por
exemplo na gravidez, poderá induzir a anomalias na saúde materna e fetal. Na infância,
haverá um aumento do risco de efeitos adversos, dado que as crianças são mais sensíveis
fisiologicamente que os adultos[23]
.
Geralmente, além de toxicidade hepática, os carbamatos são referidos como tendo efeitos
nocivos na saúde reprodutiva, o que se manifesta em alterações da espermatogénese e
redução da qualidade espermática[16]
.
Substâncias exógenas ou misturas que interferem com a regulação hormonal do indivíduo
são designadas por disruptores endócrinos (ED) e podem ocasionar problemas para o
desenvolvimento fetal, reprodução e comportamento sexual de animais e de seres
humanos[2, 46]
.
Alguns carbamatos estão incluídos na lista de químicos ED pela OMS (2010)[16, 42]
; o
tiodicarbe e o aminocarbe estão na lista do universo dos químicos potencialmente ED,
elaborado pela US EPA (2012)[47]
.
Desde a introdução do termo "disruptor endócrino" em 1993, foram listados 91 pesticidas
como possíveis químicos ED pelas agências europeias: Environment Agency of England
and Wales, German Environment Agency, European Union Community Strategy for EDs, e
Oslo and Paris Commission and the World Wildlife Fund[18]
.
Os carbamatos têm a capacidade de atuar no sistema endócrino, interferindo na interação
das hormonas naturais com seus recetores, na sua síntese ou na remoção das mesmas da
circulação. Os ED podem também influenciar a secreção, o transporte, a eliminação ou o
metabolismo das hormonas endógenas e/ou dos seus recetores nucleares[8, 16]
.
Consequentemente, a exposição a ED pode causar efeitos na saúde, incluindo interferência
no sistema reprodutor, causando alterações ao longo da vida, incluindo puberdade precoce,
infertilidade, abortos espontâneos, carcinoma testicular e mamário. Estão descritos outros
efeitos como a alteração da função da tiróide, obesidade e diabetes[16, 18, 38, 48, 49, 50]
.
_________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO
17
Como o fígado é o principal órgão envolvido no metabolismo de várias drogas e químicos,
incluindo os carbamatos, este órgão é o alvo comum da toxicidade destes pesticidas[44]
.
Exposições subcrónicas aos carbamatos induzem hepato-nefrotoxicidade, demonstrada por
estudos onde se verificou o aumento dos níveis das enzima hepáticas e dos níveis da ureia
e da creatinina no soro de ratos Wistar. Estando o stress oxidativo envolvido na génese de
várias patologias, nomeadamente hepáticas e renais[51]
.
Também os etil-carbamatos mais recentemente sintetizados, como o etil 4-bromofenil
carbamato (LQM 919) e o etil 4-clorofenil carbamato (LQM 996), que estão associados a
baixa toxicidade oral, (LD50 300-2000 mg kg-1
) e cutânea (LD50 > 5000 mg kg-1
), em altas
doses causam manifestações no sistema nervoso central e danos hepáticos em ratos[19]
.
Vários carbamatos são classificados como prováveis ou possíveis carcinogénicos e
mutagénicos em humanos, [2, 14]
. Deste modo, tem surgido uma grande incidência no
aumento das doenças e muitos tipos de cancro podem ser atribuídos parcialmente às
alterações fisiológicas do DNA[17]
, relacionados com a exposição ocupacional[2, 52]
.
O tiodicarbe foi classificado como pertencente ao grupo B2, como provável carcinogénico
humano[19, 53]
. A classificação do grupo B2 é baseado em dados estatísticos em que existe
um aumento de tumores em ratos de ambos os sexos e significativo aumento estatístico de
células tumorais testiculares em ratos[19]
.
O aminocarbe está descrito como podendo causar efeitos no sistema imunitário[17]
. A sua
toxicidade deve-se à capacidade de atuar como inibidor da AChE e a formação de
potenciais mutagénicos, tais como N-nitrosocarbamatos[12]
.
Outra preocupação sobre o potencial impacto dos carbamatos na saúde é a sua associação
com outros pesticidas, podendo constatar-se efeitos de sinergismo. No entanto, nem todas
as misturas de pesticidas com estruturas químicas semelhantes causam efeitos aditivos.
Assim, se atuam em vários locais, podem induzir diferentes efeitos tóxicos. Algumas
misturas têm o potencial de induzir uma maior toxicidade, do que a que seria previsível,
com base na toxicidade individual (sinergismo)[52]
.
INTRODUÇÃO____________________________________________________________________
18
A contribuição dos estudos de experimentais com pequenos roedores é relevante para
entender o impacto dos carbamatos na saúde pública. Com base nestas experiências,
especialmente mamíferos, já se evidenciaram os efeitos toxicológicos de uma vasta gama
de carbamatos[16]
. Os ratos e ratinhos geneticamente modificados são o modelo ideal,
amplamente adequados para os estudos de patologias humanas e da toxicidade dos
químicos[54]
.
Os carbamatos, pirimicarbe, carbaril, carbendazim, carbofurano e carbosulfano estão entre
os carbamatos mais estudados em modelos animais. A Tabela 2 apresenta alguns dos
efeitos tóxicos destes carbamatos em ratos.
Tabela 2: Exemplos representativos dos efeitos tóxicos de alguns carbamatos em ratos.
Carbamato
Dose
(mg kg-1
do
peso
corporal/dia)
Período de
estudo
(dias)
Via de
administração
Órgão
ou
tecido
Resultados Referências
Pirimicarbe 10,7 30 oral fígado
soro
alterações dos marcadores
oxidativos no fígado e no
soro; alteração do
metabolismo da glucose, dos
lípidos e das proteínas.
[54]
Carbaril mistura com
clorpirifos 90 oral
fígado
rins
urina
sem alterações
histopatológicas; alteração das
enzimas mitocondriais.
[55]
Carbendazim
150
300
600
15 oral
sangue
materno
fetos
aumento da mortalidade fetal,
malformações nos fetos e
toxicidade materna.
[56]
Carbofurano
0,2
0,4
0,8
35 oral fígado
cérebro
toxicidade hepática e efeitos
clastogénicos. [57]
Carbosulfano
0,5
1
2
4
15 oral cérebro
alterações na neurogénese, na
sinaptogénese e na
mielinização. [58]
_________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO
19
Nos estudos assinalados, a via oral foi considerada a via preferencial de administração do
pesticida, sendo os órgãos mais estudados o fígado, o rim e o cérebro.
De salientar a importância do estudo com o carbendazim em ratos, onde foram referidos os
efeitos tóxicos na embriogénese[56]
. Este estudo revelou a diminuição do número de fetos
vivos e o aumento da mortalidade fetal, malformações externas, viscerais e esqueléticas
nos fetos e toxicidade materna geral, com aumento dos níveis de colesterol, triglicerídeos,
glucose, proteínas totais, creatinina e ainda a redução dos níveis de estradiol e de
progesterona. Os autores do estudo assinalado concluíram que a exposição de animais em
gestação ao carbendazim induz toxicidade materna e alterações no desenvolvimento dos
respetivos fetos.
De uma forma geral, os estudos hepatotóxicos mostram alteração no metabolismo normal
da glucose, dos lípidos e das proteínas, com aumento das enzimas do fígado (AST, ALT e
LDH), bem como alteração nos marcadores de stress oxidativo, por aumento da produção
de espécies reativas de oxigénio (ROS) e alteração da atividade das enzimas associadas ao
mecanismo de defesa antioxidante.
No cérebro, a toxicidade do carbosulfano[58]
afetou a neurogénese e o desenvolvimento
cerebral. Também foi demonstrado a alteração na capacidade sensorial e na coordenação
motora.
4. Resíduos de pesticidas e a legislação
Como já foi referido, a utilização de carbamatos, para além dos benefícios na agricultura
apresentam também graves consequências para o ambiente e para a saúde humana. A
permanência dos pesticidas ou dos produtos originados da sua degradação ou do seu
metabolismo, faz com que se formem resíduos no meio ambiente, contaminando as águas
subterrâneas e de superfície, o solo, a atmosfera, a agricultura e toda a cadeia alimentar[59]
,
causando numerosos problemas nos ecossistemas e na saúde humana[3, 8, 12, 16, 21, 60, 61]
.
A contaminação dos alimentos pode resultar do tratamento, bem como das condições tais
como o uso indevido de pesticidas, resíduos de anteriores tratamentos do solo e
contaminação cruzada, particularmente durante a colheita. Devido à sua elevada
solubilidade em água, os resíduos de carbamatos encontram-se distribuídos em alimentos,
INTRODUÇÃO____________________________________________________________________
20
como frutas e derivados[2]
. Deste modo, os consumidores podem estar expostos a mais do
que um pesticida por dia[37]
.
A regulamentação internacional é muito restrita, verificando-se uma vigilância cada vez
mais apertada para regulamentar a presença de resíduos de pesticidas nos alimentos. A
avaliação do risco para os consumidores, resultante da ingestão de produtos alimentares
contaminados com pesticidas é efetuada pela European Food Safety Authority (EFSA), a
qual antecede o estabelecimento comunitário dos limites máximos de resíduos (MRLs)
para pesticidas pela autoridade de referência mundial, a Codex Alimentarius Commission
(Codex). O Codex foi estabelecido em 1963 pela Food and Agriculture Organization of the
United Nations (FAO) e pela OMS para harmonizar normas, diretrizes e códigos de prática
internacionais na área alimentar[62]
. Os MRLs representam a concentração máxima de
resíduo de pesticida, expressa em mg kg-1
, legalmente permitida em diferentes produtos
alimentares e rações para animais. Assim, uma vez estabelecidos estes parâmetros, deverão
ser criteriosamente respeitados pelos agentes económicos envolvidos no processo de
produção e comercialização dos produtos agrícolas, devendo cumprir rigorosamente os
intervalos de segurança, definidos em função dos MRLs indicados para cada pesticida.
A EU definiu diretivas para os resíduos de pesticidas em frutos e vegetais. Assim, no que
diz respeito às preocupações com a saúde, o Regulamento CE nº 396/2005 introduz
alterações na Diretiva Europeia 91/414/CEE e define o quadro legal para o estabelecimento
de MRLs de pesticidas no interior ou à superfície dos géneros alimentícios, encontrando-se
listados no seu Anexo I (Regulamento, EU n.º 212/2013). Mais precisamente nos anexos II
e III constam os MRLs harmonizados a nível da Comunidade Europeia. No anexo IV está
disponível a lista de substâncias ativas para as quais não é necessário estabelecer MRLs[2,
63].
Diferentes abordagens são apresentadas pela EU para a regulamentação dos MRLs de
todos os pesticidas, sendo o limite máximo de 0,1 µg L-1
para pesticidas individuais e de
0,5 µg L-1
para misturas de pesticidas. Excetuam-se aldrin, dieldrin, heptacloro, óxido de
heptacloro, cujo limite individual é de 0,03 µg L-1[38]
. Tipicamente, os MRLs para
carbamatos variam entre 0,01 e 0,05 mg kg-1
, dependendo do produto e do pesticida. Caso
_________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO
21
o pesticida não se encontre explicitamente mencionado em nenhum dos anexos é fixado
um MRL padrão de 0,01 mg kg-1[2, 64]
.
Em Portugal, os MRLs existentes são estabelecidos por Decreto Lei e publicados em
Diário da República com base na legislação da EU. O Decreto Lei número 86/2006 de 23
de Maio transpõe parcialmente, para a ordem jurídica nacional, as Diretivas nº 2005/46/CE
de 8 de Julho, a 2005/48/CE de 23 de Agosto, e a 2005/70/CE de 20 de Outubro, na parte
em que alteram a Diretiva nº 86/363/CEE de 24 de Julho, que fixa os teores máximos de
resíduos de pesticidas à superfície e no interior dos cereais, géneros alimentícios de origem
animal e vegetal[65]
.
Numerosos estudos mostram que os resíduos de pesticidas nos produtos alimentares
excedem os MRLs, especialmente nos países em desenvolvimento. A título de exemplo
refira-se a presença de resíduos de diclorvos em amostras de leite na província do México,
acima do estabelecido por Lei (0,0051 e 0,0203 mg kg-1
)[66]
. No Kumasi, Ghana, amostras
de tomate e pimenta também excediam os MRLs[54]
.
Na Europa, em 2008, mais de 5% dos produtos alimentares continham níveis de resíduos
de carbamatos que excediam os limites máximos permitidos pela EU[21]
.
Segundo a Diretiva 2004/115/CE da Comissão de 15 de dezembro de 2004, da EU, é
fixado para o tiodicarbe e o seu metabolito, o metomil, em vários frutos frescos, secos e
não cozidos, congelados sem adição de açúcar e frutos de casca rija, o MRL que varia entre
0,05 e 1 mg kg-1
. No caso específico de laranjas (frutos estudados neste trabalho), o valor é
de 0,5 mg kg-1[67, 68]
. Para o aminocarbe não está fixado o MRL, logo considera-se o valor
padrão de 0,01 mg kg-1
.
INTRODUÇÃO____________________________________________________________________
22
5. Biossensores enzimáticos
Um biossensor é, geralmente, definido como um dispositivo analítico que converte uma
resposta biológica num sinal detetável que pode ser processado e quantificado[69, 70]
. Os
biossensores são capazes de fornecer informação analítica seletiva quantitativa e semi-
quantitativa, usando um elemento biológico de reconhecimento[71]
. São construídos com
base na interação desse elemento (exemplo: enzima, DNA/RNA, anticorpo, peptídeos,
microrganismo, tecidos)[70]
com o analito de interesse (exemplo: substrato da enzima,
DNA/RNA complementar, antigénio) e o elemento transdutor (exemplo: eletroquímico,
piezoelétrico), que converte o evento de bio-reconhecimento num sinal mensurável. A
intensidade do sinal gerada é direta ou inversamente proporcional à concentração do
analito[2, 72, 73, 74, 75, 76, 77]
.
Nas últimas duas décadas tem-se verificado um enorme desenvolvimento no campo dos
biossensores. São considerados uma ferramenta chave para a implementação das novas
diretivas da EU para os resíduos de pesticidas, dada a alta sensibilidade e seletividade, bem
como a possibilidade de monitorização no local e em tempo real[45, 78]
.
O primeiro biossensor enzimático foi descrito por Clark e Lyons em 1962, que
imobilizaram a glucose oxidase à superfície de um elétrodo amperométrico de oxigénio.
Desde então, foram desenvolvidos numerosos biossensores para a determinação de
centenas de analitos, nomeadamente para o controlo da qualidade alimentar[77]
.
O bioreconhecimento baseado em enzimas é um dos mais usuais. As enzimas fornecem
excelente seletividade para os substratos alvo e exibem alta atividade catalítica[72]
. Podem
ser combinados com uma variedade de transdutores, como a amperometria, potenciometria
ou condutimetria[79]
. Quando o elemento de bioreconhecimento é uma enzima, denomina-
se biossensor enzimático e normalmente faz uso da atividade enzimática como sinal
analítico. O princípio baseia-se na medição dos produtos gerados pela catálise da enzima
ou pela inibição da ação enzimática, na qual a sua atividade é medida antes e após a
inibição, estando a percentagem de inibição relacionada com a concentração do agente
inibidor[3, 5, 38, 71, 80]
.
_________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO
23
As etapas de construção do biossensor baseado na inibição enzimática incluem a
determinação inicial dessa atividade, seguida de incubação do biossensor na solução que
contem o pesticida e finalmente a medição da atividade residual (atividade após a
exposição do biossensor ao pesticida)[5]
.
Os biossensores enzimáticos usados na deteção de resíduos de carbamatos em alimentos
apresentam várias vantagens em relação às técnicas analíticas convencionais, como o baixo
custo, a sensibilidade analítica, a alta especificidade em misturas complexas, com baixos
limites de deteção, curto tempo de análise, a simplicidade de operação, a análise sem
necessidade de intenso pré-tratamento da amostra e a possibilidade da construção de
dispositivos portáteis[2, 3, 61, 71, 79, 80, 81, 82, 83]
.
Na construção de biossensores enzimáticos, a imobilização da enzima é uma etapa muito
importante na conceção do biossensor e é a chave para a sua especificidade e desempenho
global[81]
, como a boa operacionalidade, a estabilidade de armazenamento, a alta
sensibilidade e seletividade, o curto tempo de resposta e a alta reprodutividade[77]
.
Recentemente, o desenvolvimento de biossensores enzimáticos com recurso a
nanomateriais melhorou as propriedades dos biossensores, nomeadamente ao que se refere
à sensibilidade atingida[38]
. Os nanomateriais de carbono têm sido largamente usados nos
biossensores, devido ao seu alto desempenho, comparado com os tradicionais materiais de
carbono. Os nanomateriais aumentam o sinal, reduzem o tempo de resposta e aumentam a
estabilidade e a sensibilidade[71, 84, 85]
. Estes materiais apresentam excecionais propriedades
como a alta condutividade, a grande área de superfície, a boa funcionalidade química e a
biocompatibilidade. A ação eletrocatalítica dos nanomateriais diminui o sobrepotencial
associado aos compostos eletroativos, minimizando os interferentes presentes na amostra
[75]. Os dois elementos mais importantes desta nova geração de materiais são, sem dúvida,
o grafeno (Gr) e os nanotubos de carbono (CNT)[86]
.
No desenvolvimento do biossensor enzimático proposto na presente investigação utilizou-
se a lacase (Lac) como elemento enzimático e o Gr e os CNT como nanomateriais na
construção do biossensor.
INTRODUÇÃO____________________________________________________________________
24
5.1. Lacase
Nos últimos anos e graças às excelentes vantagens, a imobilização de biomoléculas,
especialmente a imobilização de enzimas nos elétrodos, como elemento de
bioreconhecimento, tem sido uma alternativa promissora para a deteção de resíduos de
carbamatos[45]
. Estas enzimas oferecem várias vantagens como sendo a alta sensibilidade
devido à catálise, o pequeno tamanho com grande superfície, a capacidade de facilitar a
transferência de eletrões, a rápida resposta e a facilidade de operação[20, 87]
.
Muitas enzimas têm sido usadas na construção de biossensores para a deteção de resíduos
de carbamatos, nomeadamente a AChE, a butirilcolinesterase (BChE)[79]
, a urease
[5], a
fosfatase ácida e alcalina, a tirosinase, a hidrolase, a aldeído dehidrogenase e outras. São
estudas pela sua capacidade de permitir detetar estes compostos na água e noutras matrizes
como o solo, alimentos e bebidas[38, 59, 71, 72, 80]
. A determinação de resíduos de pesticidas
pelos biossensores enzimáticos, baseada na inibição enzimática, alcança usualmente
limites de deteção baixos, na ordem do µmol L-1
a nmol L-1[79]
.
A AChE é a enzima mais frequentemente usada no desenvolvimento de biossensores
enzimáticos para a identificação e quantificação dos carbamatos[5, 14, 82, 87]
, embora nos
últimos anos, tenham sido usadas outras enzimas como a Lac.
A Lac (EC 1.10.3.2, p-difenol: oxidoredutase dioxigénio)[88]
é uma glicoproteína dimérica
ou tetramérica do grande grupo de enzimas oxidase multi-cobre[89]
, também denominada
oxidase azul[90]
. Estas enzimas foram descritas pela primeira vez por Yoshida (1883) e
caraterizadas como um metal contendo oxidase por Bertrand em 1985[89]
. Encontram-se em
plantas, procariotas, insetos, bactérias e fungos[42, 74, 91, 92, 93, 94, 95]
.
A Lac possui quatro átomos de cobre, monómeros distribuídos em três locais redox[96]
, que
catalisam a redução de quatro eletrões de oxigénio a água; realiza simultaneamente a
oxidação do substrato[91, 92, 95]
. Os quatro átomos de cobre têm um papel importante no
mecanismo catalítico da enzima. São distribuídos em diferentes locais de ligação e são
classificados em três tipos (T1, T2 e T3), de acordo com as suas características de
ressonância de spin do eletrão, espectroscopia específica e caraterísticas funcionais[90]
. O
_________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO
25
T1 é o local onde a enzima é responsável pela ligação e oxidação do substrato, o qual
confere a típica cor azul da enzima. Os locais T2 e T3 estão envolvidos no transporte de
eletrões, na ligação da molécula de oxigénio e são os locais onde ocorre a redução do
oxigénio a duas moléculas de água. Embora os centros de cobre sejam similares para todas
as Lac de fungos, são observadas diferenças significativas nas propriedades
termodinâmicas e cinéticas, em função do microrganismo de origem[94, 95, 97, 98]
.
A Lac do fungo Trametes versicolor (bolor branco) é uma proteína globular com cerca de
500 aminoácidos[90]
. Foi descrita como um atrativo biocatalisador para aplicações
eletroquímicas, dado que apresenta alto potencial redox e boa estabilidade[46]
. Para a
deteção dos carbamatos estudados neste trabalho utilizou-se a Lac do fungo atrás referido,
tendo sido imobilizada no GCE após a sua modificação com nanomateriais.
A Lac possui a propriedade de oxidante, capaz de oxidar uma variedade de compostos
orgânicos e inorgânicos, particularmente fenóis[90, 99]
como orto-, meta- e para-difenóis,
fenol, aminofenóis, diamina aril, aminas aromáticas, ascorbato e outros[42, 46, 88, 92, 93, 94, 95,
100]. A especificidade pelos polifenóis varia dependendo da origem da enzima. Assim, Lac
de diferentes fungos oxidam diferentes moléculas polifenólicas com diferentes velocidades
de reação[74]
. Neste trabalho foi usado o aminofenol (AMP) como substrato para a Lac.
As Lac apresentam diversas aplicações, nomeadamente na agricultura, na indústria
alimentar, têxtil, farmacêutica, petroquímica, em análises biomédicas (análise de drogas),
na monitorização ambiental (controlo da poluição), na despoluição de efluentes, na
modificação dos materiais lignocelulósicos, na síntese orgânica (produção de etanol) e na
construção de biossensores[91, 95, 99]
. Têm sido ainda usadas como ferramenta para o
diagnóstico médico, agentes de limpeza na purificação de águas, como catalisadores no
fabrico de fármacos antitumorais e até como ingrediente em cosmética.
A degradação da enzima mediada por pesticidas apresenta duas vantagens; primeiro, a
reação de degradação ocorre sob condições relativamente suaves e em segundo, a taxa de
reação é mais rápida do que se fosse realizada por microrganismos[99].
INTRODUÇÃO____________________________________________________________________
26
A maior vantagem da imobilização da Lac, como o elemento de bioreconhecimento no
biossensor é a ligação covalente, a qual pode contribuir para a alta estabilidade, podendo
resistir a condições extremas e a reagentes químicos[92, 96]
.
Inúmeros biossensores contendo a Lac imobilizada foram já desenvolvidos para
imunoensaios, com vista à determinação de glucose, de aminas aromáticas e de compostos
fenólicos[99]
, constituindo um método rápido com alta sensibilidade, boa reprodutibilidade
e baixo custo[91, 92]
.
A imobilização da enzima é uma etapa crítica na construção de um biossensor, dado que o
biocatalisador deverá permanecer ativo para executar eficientemente o bioreconhecimento
do substrato, cuja funcionalização não covalente é a melhor maneira de preservar a
integridade biológica[42]
.
O método de imobilização influencia não só a atividade, a estabilidade e a sensibilidade,
como também o tempo de resposta[5]
.
Fatores como a exatidão das medições, a reprodutibilidade e o tempo de vida operacional
são drasticamente influenciados pela estabilidade da enzima. A estratégia de imobilização
deve assegurar maior sensibilidade e estabilidade do biossensor. A escolha do método mais
apropriado depende da natureza da enzima, do transdutor e do modo de deteção[77]
.
As enzimas podem ser imobilizadas numa variedade de suportes e métodos. Os métodos de
imobilização da Lac em biossensores são os seguintes: adsorção, encapsulamento e
aprisionamento, ligação covalente, ligação covalente cruzada e por afinidade[20, 72, 76, 77, 78,
80, 82, 91, 92]. De uma forma geral estes métodos podem ser classificados como meios de
imobilização físicos, onde existe fraca interação entre o suporte e a enzima e meios de
imobilização químicos, onde são formadas ligações covalentes com as enzimas[76, 92]
.
Os métodos físicos de aprisionamento retêm a enzima no interior dos poros de uma fibra
oca, ou inserido na fibra ou ainda no interior de uma matriz de gel insolúvel. Os métodos
químicos incluem a anexação da enzima numa matriz por ligações covalentes, por ligações
covalentes cruzadas entre a enzima e a matriz, e a ligação cruzada por reagentes
multifuncionais[90]
.
_________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO
27
No desenvolvimento de biossensores, as biomoléculas podem ser imobilizadas com
materiais nanoestruturados, como o Gr e os CNT, por adsorção, ligação covalente ou
aprisionamento[77]
. Neste trabalho foi usado a adsorção como método de imobilização da
Lac sobre o Gr e os CNT.
A Lac foi selecionada para este estudo não só pelas vantagens já referidas, mas também
porque apresenta alta atividade enzimática na oxidação do tiodicarbe[99]
.
5.2. Nanomateriais
Nas últimas décadas, os nanomateriais têm sido intensivamente usados para melhorar as
propriedades eletroanalíticas dos sensores e biossensores, nomeadamente associados com
biomoléculas[70]
. Pretende-se como objetivo aumentar a resposta do transdutor e melhorar
as matrizes de imobilização para o bioreceptor, aumentando a sensibilidade e a
seletividade. Para além disso, os nanomateriais podem produzir um efeito sinergético entre
a atividade catalítica, condutividade e biocompatibilidade, acelerando a transdução do
sinal, mas também podem amplificar o sinal correspondente ao evento de
bioreconhecimento, tendo como resultado o aumento da sensibilidade do biossensor[101]
.
Vários nanomateriais, incluindo nanopartículas de metal e de liga metálica, nanopartículas
magnéticas, nanopartículas de ouro (AuNPs), nanofibras de carbono, CNT e Gr têm sido
usados com esses objetivos[9, 102]
.
5.2.1. Grafeno
O Gr foi preparado pela primeira vez em 2004 por K. S. Novoselov e A. K. Geim[72, 103]
e
desde aí o uso do Gr tem atraído forte interesse científico e tecnológico. É um material
promissor para várias aplicações, como eletrónicas, de armazenamento e conversão de
energia em baterias, em células de combustível, em células solares[104]
, e numa nova
dimensão na biociência e na biotecnologia, nomeadamente em investigações com
biossensores eletroquímicos[105]
.
INTRODUÇÃO____________________________________________________________________
28
O Gr é o material mais fino do universo, é flexível, mais duro que o diamante, e a
condutividade elétrica à TA é mais eficiente que qualquer outro material[106]
.
A estrutura básica do Gr é uma folha de átomos de carbono em camada bidimensional,
com a configuração hexagonal dos átomos ligados por ligações sp2, altamente estáveis
(Figura 4). Estas ligações e a configuração dos eletrões são a razão das extraordinárias e
únicas propriedades elétricas, óticas, mecânicas, térmicas e eletroquímicas[106, 107, 108, 109, 110,
111, 112], as quais incluem a grande área de superfície (teoricamente 2630 m
2/g para uma
única camada de Gr), a excelente resistência mecânica[104]
, a alta flexibilidade mecânica[43]
,
a excecional condutividade térmica e elétrica (a taxa de mobilidade dos eletrões excede
200000 cm2 V s
-1 à TA)
[103] e apresentam ainda boa biocompatibilidade
[72, 81, 108, 113, 114, 115].
Figura 4: Estrutura do grafeno. Adaptado de [113].
A excelente capacidade para promover a transferência de eletrões torna o Gr extremamente
atrativo para a construção de biossensores baseados em enzimas (promove a transferência
de eletrões entre o substrato e a enzima)[4, 104, 105, 109, 110, 116]
. Para além disso, tem a
vantagem de não conter impurezas metálicas e ser um material económico e de fácil
aquisição[84, 103, 114, 117]
. A sua grande área de superfície é útil no aumento da quantidade de
moléculas das enzimas imobilizadas e a excelente condutividade são favoráveis para a
condução de eletrões e biomoléculas. Os biossensores químicos baseados no Gr são
referenciados como tendo alta sensibilidade, resultado do baixo ruído eletrónico provocado
pelo efeito térmico[103]
, baixa resistência elétrica e picos redox bem definidos[106, 116, 118]
.
_________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO
29
5.2.2. Nanotubos de carbono
Outro material nanoestruturado muito promissor para a desenvolvimento de biossensores
enzimáticos são os CNT[20,
119]
. Eles foram descobertos por Iijima, em 1991, e tem atraído
o interesse em diversos campos da química analítica[120, 121, 122]
.
Os CNT são folhas de carbono de estrutura cilíndrica, de uma ou múltiplas paredes, numa
estrutura semelhante a favos de mel, com diâmetro na escala nanométrica e unidades de
carbono sp2 hexagonais, altamente estáveis (Figura 5)
[75, 122, 123].
Figura 5: Estrutura dos nanotubos de carbono. Adaptado de [123].
O diâmetro dos CNT varia entre frações de nanómetros e dezenas de nanómetros e o
comprimento de alguns micrómetros até vários centímetros, com ambas as extremidades,
normalmente revestidas por estruturas de tipo fulereno[72, 121]
.
Existem basicamente dois grupos de CNT, os de parede simples (SWCNT), formados por
lâminas de folhas de carbono (estrutura hexagonal) no interior do cilindro, com 1 a 2 nm
de diâmetro, ou os de parede múltipla (MWCNT), compostos por cilindros concêntricos de
carbono, estes apresentam o diâmetro de 2 a 50 nm, com espaço entre camadas de 0,34
nm[72, 93, 119, 121, 122,
124]
.
As propriedades mecânicas, físicas, químicas, eletrónicas, térmicas e de adsorção dos CNT
são únicas, apresentam excelente condutividade elétrica e térmica, boa estabilidade
química e térmica, alta elasticidade, força mecânica e boa biocompatibilidade, podendo ser
aplicados para a deteção sensível dos carbamatos[78, 119, 120, 123, 124, 128]
.
INTRODUÇÃO____________________________________________________________________
30
Geralmente, fornecem alta sensibilidade, baixos limites de deteção e rápida transferência
cinética de eletrões, o que os torna muito atrativos para a aplicação a biossensores
eletroquímicos[42, 121, 124]
, para além de outras propriedades como uma ampla janela de
potencial, baixo custo, superfície química rica, baixa corrente e inércia química[125]
.
Os CNT, para além de serem um material muito usado em eletroanálise e eletrocatálise,
também têm demonstrado excelente desempenho em células de combustível e em
membranas de polímero[104]
. Têm sido usados para a deteção de diferentes analitos, como
catecolaminas, homocisteína, compostos nitroaromáticos, NADH, aminoácidos e proteínas,
ácido úrico e estrogénios, organofosfatos e na construção de biossensores enzimáticos com
glucose, frutose, colesterol, lactato, fenóis e catecois, peróxido de hidrogénio, AChE, DNA
e ainda em imunossensores.
A incorporação de CNT, oferece a vantagem de ser de rápida e fácil a modificação do
elétrodo[122]
. As propriedades típicas dos CNT, como a alta condutividade elétrica, a
grande área superficial e a presença de grupos funcionais que permitem a sua interação
com as enzimas, oferecem um excelente suporte para a sua imobilização[78]
.
6. Análise de carbamatos por biossensores enzimáticos
A análise dos níveis de resíduos de carbamatos no ambiente e em produtos alimentares tem
uma importância extrema, uma vez que a bioacumulação e o uso abusivo dos carbamatos, a
longo prazo podem provocar sérios riscos para a saúde humana[5, 76, 126]
. A determinação
dos resíduos de pesticidas e/ou dos produtos da sua degradação (que por vezes são mais
tóxicos do que os seus precursores) no ambiente e em géneros alimentícios, exige a
utilização de métodos analíticos seletivos e muito sensíveis[5]
, capazes de determinar estes
compostos em níveis de concentração iguais ou inferiores aos MRLs estabelecidos pelas
organizações internacionais[16]
.
_________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO
31
Os carbamatos têm sido analisados por várias técnicas e a vários níveis, nomeadamente a
nível ambiental (exemplo: na água, no solo, nos sedimentos e nas lamas); de segurança
alimentar (exemplo: em frutas, legumes e pescado) e ao nível toxicológico particularmente
na saúde ocupacional (exemplo: fluidos e tecidos)[2]
.
A nível de segurança alimentar, a determinação de resíduos de carbamatos nos géneros
alimentícios sobretudo em frutos e vegetais tem sido efetuada por técnicas analíticas tais
como a cromatografia líquida de alta resolução (HPLC), a cromatografia gasosa (GC) ou
líquida (LC), acopladas à espectrometria de massa (MS)[127]
e a eletroforese capilar (CE)[6]
.
Estas técnicas analíticas são seletivas, apresentam baixos limites de deteção e são capazes
de separar, identificar e quantificar as espécies químicas presentes na amostra por meio de
detetores específicos[2, 3, 5, 21, 72, 126]
.
As técnicas cromatográficas são utilizadas oficialmente como métodos de referência para
as análises alimentares, embora apresentem algumas desvantagens. Neste âmbito são
métodos complexos[79]
que necessitam de grande volume de amostra, para além da
morosidade nas etapas iniciais de preparação da amostra[76]
, utilizam maior quantidade de
reagentes (solventes orgânicos tóxicos), necessitam de equipamentos analíticos
especializados e dispendiosos, o que inviabiliza a sua aplicação em análises imediatas e de
rotina. Por estas razões não são adequados para aplicação em larga escala e em campo[2, 3, 8,
12, 14, 38, 59, 72, 75, 81].
Face ao acima exposto têm sido realizados muitos estudos com vista ao desenvolvimento
de métodos de análise alternativos, que sejam relativamente simples, rápidos, sensíveis,
fiáveis, económicos e amigos do ambiente, de modo a monitorizar os resíduos de
carbamatos[8, 12, 20]
.
Os métodos eletroquímicos podem ser essa alternativa. Apresentam vantagens em relação
aos métodos convencionais. De uma forma geral, são mais adequados para a análise de
rotina, pela simplicidade instrumental, não requerem técnicas elaboradas na preparação da
amostra[76]
, tem custo moderado, alta sensibilidade, boa seletividade, e com resultados num
curto espaço de tempo, mesmo em ensaios in loco[8, 128, 129, 130]
. Para além disso, estes
métodos permitem elucidar o processo e o mecanismo de oxidação e redução dos
pesticidas.
INTRODUÇÃO____________________________________________________________________
32
Os principais métodos eletroquímicos são a voltametria, a amperometria, a potenciometria
e a condutimetria[59]
. Podem ser aplicados na deteção de substâncias tóxicas, na
agricultura, na indústria alimentar e em análises ambientais e ainda no diagnóstico de
doenças[131]
.
A informação obtida a partir de métodos eletroquímicos está relacionada com a superfície
do elétrodo. A escolha do elétrodo de trabalho depende do comportamento redox do analito
alvo, das correntes residuais obtidas no intervalo de potencial avaliado, da janela de
potencial de trabalho, da condutividade elétrica, da reprodutibilidade da superfície, das
propriedades mecânicas, do custo de fabrico e da disponibilidade[59]
.
Os materiais mais frequentemente usados para construção de elétrodos sólidos, dado o seu
baixo custo, a boa transferência cinética dos eletrões e a biocompatibilidade, são o
carbono, a platina, o ouro e a prata[124]
.
O elétrodo de carbono vítreo (GCE) é muito usado nos estudos de oxidação dos
carbamatos, tendo sido já aplicado para determinar o aminocarbe, com limites de deteção
de 30 mg L-1[59]
. O GCE foi o tipo de elétrodo escolhido para o desenvolvimento do
biossensor enzimático proposto neste trabalho e os métodos eletroquímicos usados foram a
voltametria cíclica (CV) e a voltametria de onda quadrada (SWV).
Vários são os trabalhos publicados sobre a análise de carbamatos usando biossensores
enzimáticos. No entanto, pouco se conhece sobre a análise dos pesticidas selecionados para
este trabalho.
Moccelini et al.[3]
escreveram um biossensor baseado em ouro e em monocamada auto-
organizada de L-cisteína (Au-alfalfa sprout-SAMs), o qual foi aplicado para a determinação
de tiodicarbe em amostras de vegetais.
A metodologia desenvolvida foi comparada com a análise por HPLC. Concluiu-se que a
metodologia proposta foi aplicada com sucesso, não houve diferenças significativas entre
os resultados obtidos pelo biossensor e pelo método cromatográfico (método de
referência), apresentando boa linearidade, estabilidade, ausência de etapa de derivatização,
baixo custo e rápida resposta de análise.
_________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO
33
Também para a determinação do tiodicarbe Lima et al.[76]
desenvolveram um biossensor
para amostras de frutas frescas e vegetais, baseado na pequi oxidase polifenol, imobilizada
em quitosano e com ligação cruzada com o cloreto cianúrico. Estes autores compararam a
resposta do biossensor com o método cromatográfico HPLC, tendo obtido um bom
desempenho deste na deteção do carbamato.
Existem diversas publicações que referem a análise de outros carbamatos, usando
biossensores enzimáticos, sobretudo com a imobilização da AChE no elétrodo.
Liu et al.[82]
modificaram o GCE com material compósito (Gr reduzido, AuNPs e ácido 3-
carboxi-fenilborónico) no desenvolvimento de um biossensor enzimático à base de AChE,
capaz de quantificar pesticidas da classe dos carbamatos e dos organofosforados.
O dispositivo foi construído em quatro camadas, imobilizadas por gotejamento: (1) Gr
reduzido disperso em matriz de quitosano, (2) suspensão coloidal de AuNPs, (3) solução
do ácido 3-carboxi-fenilborónico e (4) solução da enzima AChE.
Os valores de LOD obtidos para o carbofurano (0,005 mg kg-1
), o isoprocarbe (0,05 mg kg-
1), o clorpirifos (0,01 mg kg
-1) e para o malatião (0,05 mg kg
-1) indicaram que este
dispositivo pode ser utilizado para a quantificação destes pesticidas em matrizes
ambientais complexas.
Foi constatado a alta estabilidade do dispositivo (redução de 10% da resposta inicial para
um período de 30 dias), atribuída à provável esterificação entre os grupos do ácido
borónico e às glicoproteínas da enzima.
Outros autores como Cesarino et al.[78]
desenvolveram um biossensor amperométrico para
determinar o carbaril e o metomil em frutas e vegetais (maçãs, brócolos e repolho),
baseado na AChE imobilizada na estrutura core-shell de CNT e polianilina. AChE foi
imobilizada sobre o elétrodo modificado por gotejamento.
A sensibilidade obtida com o biossensor desenvolvido foi de LOD 1,4×10-6
M para o
carbaril e para o metomil de 9,5×10-7
M.
Nos ensaios de recuperação obteve-se para as amostras de maçã, artificialmente
contaminadas com carbaril (9,9-29,7 µM), valores que variaram entre 97,3 e 103,4%.
INTRODUÇÃO____________________________________________________________________
34
Os resultados foram similares aos obtidos por HPLC. O biossensor foi construído sem a
necessidade de qualquer mediador redox ou reagente para a ligação cruzada, o que
representa um importante avanço no desenvolvimento de biossensores enzimáticos.
Utilizando também um biossensor à base de AChE, Zamfir et al.[83]
quantificaram
neostigmina e eserina, dois importantes carbamatos com ação terapêutica. Neste caso, a
enzima foi imobilizada por gotejamento na superfície de elétrodos de pasta de carbono. Os
biossensores foram construídos pelo método sol-gel, empregando um líquido iónico
composto por tetratiofulvaleno e tetracianoquinodimetano.
A sensibilidade do método obtida para a neostigmina (LOD 3,0×10-10
M) e a eserina (LOD
2,60×10-11
M) foi a maior referida na literatura até ao presente momento.
Foram ainda realizados ensaios de recuperação, obtendo-se para a neostigmina uma
variação entre 78,0 e 103,2% e para a eserina entre 85,8 e 114,4%, em águas naturais.
Xue et al.[132]
propuseram uma estratégia inovadora para imobilizar a AChE sobre o GCE
por adsorção não-covalente. O GCE foi modificado com MWCNT, seguido de uma
camada à base de fibroína de seda (polímero natural, extraído do casulo do bicho da seda,
com alta resistência mecânica, estabilidade térmica e biocompatibilidade) e posterior
imobilização enzimática.
Obtiveram um LOQ para o metil-paratião de 5,0×10-7
M e para o carbaril de 6,0×10-8
M.
Os ensaios de recuperação em amostras de alface e de repolho variaram entre 97,6 e
101,3% para contaminações de 3,80×10-5
M.
Estudaram ainda a estabilidade do biossensor, e constataram que após quatro semanas de
armazenamento, o biossensor ainda exibia 80% do valor inicial da resposta, sugerindo que
a matriz de fibroína é um microambiente biocompatível para preservar a atividade
biológica da AChE.
A modificação da superfície do GCE com camada híbrida de MWCNT e Gr foi usada por
Sun et al.[81]
Este biossensor foi utilizado para quantificar o carbaril. A imobilização de
AChE foi realizada por gotejamento sobre o elétrodo modificado.
O carbaril foi quantificado com um LOD de 0,13 ng mL-1
. Nos ensaios de recuperação foi
obtido para o repolho 93,1-97,1%, para o crisântemo 92,3-105,0%, para o alho francês
_________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO
35
106,0-107,0% e para a couve 95,3-106,0%, em níveis de concentração variando entre 10 e
100 ng mL-1
.
A construção deste biossensor enzimático mostrou baixo limite de deteção, alta
sensibilidade, boa estabilidade e aceitável reprodutividade.
Outros autores como Cancino et al.[133]
imobilizaram AChE sobre elétrodo de ouro
modificado com SAM mista, composta de ácido 11-mercaptoundecanóico e 2-
mercaptoetanol. A mistura desses alcanotióis apresenta uma série de vantagens que
superam as apresentadas por dispositivos construídos com apenas uma dessas substâncias:
facilidade para formação de filmes finos, boa aderência, alta permeabilidade,
biocompatibilidade, resistência mecânica, suscetibilidade para modificações químicas e
transferência de carga facilitada.
O biossensor em questão permitiu a oxidação de acetiltiocolina em 0,31 V vs. Ag/AgCl/Cl-
sat, sem a necessidade de qualquer mediador redox.
O LOD e o LOQ para o carbaril foram de 3,45×10-10
M e 1,15×10-9
M, respetivamente.
Quanto à estabilidade do biossensor, num estudo comparativo entre 50 diferentes medidas
realizadas ao longo de 15 dias, constatou-se 75% do seu desempenho inicial, indicando que
a SAM mista também apresenta biocompatibilidade para a imobilização e conservação da
atividade enzimática.
Foi desenvolvido um biossensor com AChE por Wang, et al.[112]
baseado em
nanopartículas de óxido de zinco (ZnO NPs), sintetizadas a partir de Gr carboxílico, para
deteção de clorpirifos e carbofurano.
Este biossensor demonstrou excelente condutividade, catálise e biocompatibilidade,
apresentando um LOD de 5,0×10-14
M para o clorpirifos e de 5,2×10-13
M para o
carbofurano.
O biossensor apresentou várias vantagens, como boa sensibilidade, estabilidade,
reprodutibilidade e baixo custo, provando ser uma promissora ferramenta para análise de
inibidores enzimáticos.
INTRODUÇÃO____________________________________________________________________
36
Ye et al.[134] construíram um biossensor enzimático estável e de alta sensibilidade, baseado
em quitosano e MWNTs, com eficiente imobilização da AChE no GCE, para a rápida
determinação de carbamatos (metomil, aldicarbe, carbaril e fenobucarbe). A AChE foi
imobilizada por técnica de automontagem de camada sobre camada.
O estudo indicou que a inibição dos carbamatos foi proporcional à concentração dos
pesticidas, no intervalo de 10-10
g L-1
a 10-3
g L-1
, com LOD para o metomil acima de 10-12
g L-1
e para os outros de 10-11
g L-1
.
Conclui-se que este biossensor enzimático também pode ser uma alternativa e uma nova
ferramenta para a análise de resíduos de pesticidas no meio ambiente ou nos alimentos.
A enzima Lac também tem sido usada na construção de biossensores enzimáticos para a
deteção de carbamatos mas de forma mais limitada.
Para detetar metomil em extratos vegetais, Fernandes et al.[88]
produziram um biossensor
sensível, utilizando transdutores de carbono cerâmico modificados com Lac do fungo
Aspergillus oryzae pelo método sol-gel. Como substrato utilizou-se a esculetina.
O procedimento permitiu quantificar o metomil em cenoura, repolho, alface, pimentão,
batata e tomate, com ensaios de recuperação que variaram entre 98,0 e 104,2%, para
contaminações de 5,0×10-7
a 1,0 ×10-6
M. Os valores de recuperação foram similares aos
obtidos por HPLC, sugerindo a alta sensibilidade e a precisão do método.
O dispositivo também apresentou elevada estabilidade, tendo sido avaliada em 450
determinações, realizadas ao longo de 60 dias, sem o efeito da matriz das amostras.
Zapp et al.[135]
também desenvolveram um biossensor enzimático para a determinação de
metomil, com a enzima Lac (Aspergillus oryzae). Esta foi imobilizada em matriz condutora
composta de nanopartículas de platina e do líquido iónico tetrafluorborato de 1-butil-3-
metilimidazol, suportados em montmorilonita. Estes autores usaram a dopamina como
substrato fenólico.
O metomil foi quantificado com o LOD de 2,35×10-7
M. Na análise do pesticida em tomate
(2,70×10-6
a 7,50×10-6
M e em cenoura (1,39×10-6
a 4,05×10-6
M) os valores obtidos nos
ensaios de recuperação foram de 85,7-105,9% para o tomate e de 99,6-100,2% para a
cenoura.
_________________________________________________________________________ INTRODUÇÃO
37
Estes resultados foram consistentes com os obtidos por HPLC, mostrando um satisfatório
intervalo de linearidade e limite de deteção, boa estabilidade, rápida resposta e ainda boa
repetibilidade e reprodutibilidade. Este método permitiu analisar o metomil na presença de
potenciais interferentes, como o ácido ascórbico, o ácido benzóico, o ditiocarbamato, a
glucose e o cloreto de sódio.
Oliveira, et al.[45]
desenvolveram um biossensor baseado em polifenoloxidases (lacase e
tirosinase), AuNPs e quitosano por eletrodeposição de um filme híbrido de Gr para deteção
de quatro carbamatos: hidrocloro formetanato (FMT), carbaril, propoxur e ziram em
citrinos (laranja, tangerina e limão).
Obtiveram baixos LOD (1,68×10-9
a 2,15×10-7
mg kg-1
), alta precisão, boa sensibilidade,
repetibilidade, reprodutibilidade e estabilidade. Por estas razões, este biossensor foi
proposto como uma promissora ferramenta para controlo alimentar.
Para a quantificação de FMT, Ribeiro, et al.[46]
construíram um biossensor enzimático. Este
biossensor eletroquímico foi baseado na eletrodeposição de AuNPs e Lac. A Lac foi
imobilizada por ligação cruzada, via gluteraldeído.
O biossensor foi aplicado com sucesso em mangas e uvas. O LOD foi de 9,5×10-8
M. Os
valores de recuperação, para cinco níveis testados, variaram entre 95,5% para as uvas e
108,6% para as mangas.
Obtiveram boa sensibilidade, linearidade, precisão, repetibilidade, reprodutibilidade e
estabilidade. Concluíram que o biossensor desenvolvido pode ser um dispositivo adequado
para testar a conformidade dos MRLs em frutos e vegetais.
CAPÍTULO III
MATERIAL E MÉTODOS
_________________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS
41
1. Estudos in vivo da toxicidade do tiodicarbe e do aminocarbe
1.1. Reagentes e soluções
Para o estudo da toxicidade dos pesticidas em ratos, foram usados dois pesticidas da classe
dos carbamatos, o tiodicarbe (99,9%) e o aminocarbe (99,9%), adquiridos à Fluka (Sigma-
Aldrich, Portugal). Foram preparadas 3 soluções de cada um dos pesticidas em água
destilada, nas concentrações de 10, 20 e 40 mg kg-1
do peso corporal dos animais,
correspondentes a 20, 40 e 80% da LD50.
Os valores de LD50 para o tiodicarbe e para o aminocarbe em ratos machos são de 46,5 mg
kg-1
e de 30-40 mg kg-1
do peso corporal, respetivamente.
Os reagentes utilizados para as análises hematológicas e bioquímicas foram gentilmente
cedidos pela Horiba ABX, SAS Portugal e pela Siemens Healthcare Diagnostics Portugal,
respetivamente.
Os marcadores imunológicos utilizados para a realização dos estudos por citometria de
fluxo foram adquiridos à Becton Dickinson Portugal.
1.2. Animais e protocolo de exposição aos pesticidas
Para o presente estudo foram usados ratos machos adultos Wistar (Rattus norvegicus), com
cerca de 3 meses de idade e peso corporal variando entre 450 e 470 g. Os animais foram
adquiridos ao biotério de Harlan S.L. Barcelona, Espanha.
Todos os procedimentos experimentais seguiram as recomendações para animais de
laboratório de acordo com a regulamentação N. 86/609/CEE-24/11/92.
Os ratos (n=20) foram divididos em quatro grupos e mantidos em caixas transparentes de
polipropileno, com ração e água ad libitum, durante 5 dias com vista à aclimatização. Estes
foram mantidos no biotério do Departamento de Biologia da Universidade de Aveiro,
numa câmara climatizada à temperatura de 21 ± 2ºC, humidade relativa entre 55±10% e
ciclos de luz/dia de 12h.
Após o período de aclimatização no ambiente acima referido, aos grupos tratamento (A, B
e C), foi administrado o tiodicarb por via oral na água de beber, nas concentrações de 10,
MATERIAL E MÈTODOS_________________________________________________________________
42
20 e 40 mg kg-1
do peso corporal, respetivamente; o grupo controlo (grupo D), recebeu
apenas água, o estudo teve a duração de durante 30 dias.
Para o estudo da toxicidade com o aminocarbe o protocolo experimental foi igual, tendo
sido administrado o pesticida na mesma doseq durante 14 dias.
1.3. Monitorização dos sinais de toxicidade e do peso corporal
Após o início do tratamento dos ratos com os pesticidas referidos, observou-se diariamente
os sinais clínicos de toxicidade, em dois períodos do dia (no início da manhã e ao fim da
tarde).
Antes do início do estudo todos os animais foram pesados individualmente e durante o
período de estudo efetuou-se a pesagem semanal, de forma a detetar a variação no peso
corporal dos animais.
A percentagem de peso corporal foi calculada pela seguinte fórmula:
% Pc = [( Pf Pi ) Pi] 100
onde:
= média aritmética
Pc = peso corporal
Pi = peso corporal inicial
Pf = peso corporal final
1.4. Sacrifício dos animais e colheita de órgãos
No fim da exposição aos pesticidas (30 dias de exposição ao tiodicarbe e 7 dias ao
aminocarbe), os ratos foram anestesiados e sacrificados por deslocação cervical. Além do
registo do peso corporal de todos os animais efetuou-se a colheita e pesagem dos seguintes
órgãos: fígado, rins, baço, timo, epidídimo, testículo e medula óssea (MO), tendo sido
utilizada uma balança analítica de precisão da Gravimeta.
_________________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS
43
A percentagem do peso relativo dos órgãos de cada animal foi calculada pela seguinte
fórmula:
% Po = Po/Pc
onde:
Po = peso órgão
Pc = peso corporal
Acresce que foram extraídas amostras de MO do fémur de animais do grupo C. Após o
corte numa das extremidades do osso, foi inserido uma agulha (25G) com solução de PBS
(pH 7,4) e 0,5% BSA (albumina), de forma a remover a medula. Esta foi recolhida para um
tubo cónico de 50 mL, centrifugada durante 5 min. a 3000 rpm. Procedeu-se à remoção do
sobrenadante e o pellet foi ressuspendido com 1mL de PBS e 0,5% de BSA. A suspensão
celular foi filtrada utilizando um tubo BD Falcon de 12x75 mm com um filtro de 35 µm;
foi novamente centrifugado durante 5 min. a 3000 rpm; o sobrenadante foi removido e o
pellet ressuspendendido em 1ml de PBS e 0,5% de BSA, tendo seguido o protocolo de
marcação celular descrito no ponto 1.5.3.
1.5. Determinação de parâmetros hematológicos, bioquímicos e imunológicos
Durante o período do estudo foram efetuadas colheitas de sangue venoso aos animais, com
vista à determinação de parâmetros hematológicos (hemograma), bioquímicos e
imunológicos. Estas análises foram realizadas no Serviço de Patologia Clínica do CHBV,
Aveiro, onde foram gentilmente postos à disposição os analisadores e respetivos reagentes.
Para o efeito realizaram-se colheitas de sangue a todos os grupos de animais, antes da
administração da solução dos pesticidas e após o início do tratamento, com 10 dias de
intervalo para o estudo do tiodicarbe e 7 dias de intervalo para o estudo do aminocarbe.
As amostras de sangue foram obtidas a partir da veia caudal dos ratos, tendo sido utilizados
tubos de colheita estéreis contendo como anticoagulante o ácido etilenodiamino tetracético,
tripotássico (EDTA K3) e seringas de 1 mL e respetiva agulha (descartáveis).
MATERIAL E MÈTODOS_________________________________________________________________
44
1.5.1. Análises hematológicas
A partir das amostras de sangue de todos os grupos de animais em estudo, tal como
referido no ponto anterior, efetuou-se a determinação dos parâmetros hematológicos:
número de leucócitos e de eritrócitos, valor da hemoglobina, hematócrito, volume globular
médio, hemoglobina corpuscular média e número de plaquetas. Para o efeito, o sangue foi
homogeneizado e pipetado diretamente no equipamento analisador Pentra DX120, da
Horiba ABX, SAS Portugal, tendo os resultados sido processados automaticamente.
1.5.2. Análises bioquímicas
Foram realizadas várias análises bioquímicas em amostras de sangue no sentido de avaliar
a função de vários órgãos, foram determinados os seguintes parâmetros: acetilcolinesterase
(AChE), alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), fosfatase
alcalina (ALP), gama glutamil-transpeptidase (GGT), creatinina (Cr), ureia (Ur), proteínas
totais (PT), colesterol total (Col T), triglicerídeos (Tg), lipoproteína de alta densidade
(HDL) e lipoproteína de baixa densidade (LDL).
Após a recolha do sangue, este foi centrifugado a 3000 rpm, durante 10 min. e o
sobrenadante (soro) foi separado e analisado automaticamente pelo equipamento
Dimension RXL da Siemens Healthcare Diagnostics Portugal, usando como metodologia
de análise a fotocolorimetria.
1.5.3.Análises imunológicas
Os potenciais efeitos imunotóxicos do tiodicarbe nas subpopulações linfocitárias foram
avaliados no sangue e na MO do grupo C, recorrendo à imunofenotipagem por citometria
de fluxo. Estas análises foram realizadas no equipamento FACSCalibur, existente no
laboratório do Serviço de Patologia Clínica do CHBV, Aveiro.
Assim, foram usados os marcadores CD3+, CD3
+NK-P1A
+, NKR-P1A
+, CD45RA
+,
disponíveis no kit comercial da Becton Dickinson Portugal. Estes marcadores foram
_________________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS
45
adicionados diretamente às amostras de sangue e de MO. Posteriormente todas as amostras
foram agitadas e incubadas à TA durante 15 min. Seguiu-se a lise das células com BD
Pharm Lyse (diluído 1/10), incubando mais 15 min. à TA e depois foram centrifugados a
1500 rpm durante 5 min. O sobrenadante foi retirado e foi adicionado 2 mL de FACSFlow.
Esta mistura foi novamente centrifugada (1500 rpm durante 5 min.). Aspirou-se o
sobrenadante e adicionou-se 500 uL de FACSFlow. A preparação foi agitada e pipetada
diretamente no equipamento.
1.6. Análise histológica
Para o estudo histopatológico foram utilizados fragmentos de fígado, rins, baço, timo,
testículo e epidídimo acima referidos, os quais foram fixados em solução de Bouin, durante
24h e desidratados em concentrações crescentes de álcool. De seguida, esses fragmentos
foram mergulhados em benzol. Após este procedimento, procedeu-se à impregnação e
inclusão das amostras em parafina (ponto de fusão 42-44ºC e 52-58ºC, respetivamente).
Efetuaram-se cortes com uma espessura de 3-5 µm, num micrótomo Leitz modelo 1512.
Estes foram mantidos na estufa a 40ºC durante 2 dias. De seguida, procedeu-se à
desparafinação e re-hidratação, para posterior coloração com hematoxilina e eosina (HE).
Efetuou-se nova desidratação em álcool a 95º e 100º e o clareamento em xilol. As
preparações foram montadas em meio Eukitt® e colocadas na estufa a 40ºC para secagem.
Por último, as lâminas foram observadas e fotografadas ao microscópio ótico (Olympus
modelo BX41TF) com sistema fotográfico acoplado.
1.7. Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. Para a análise estatística foi
utilizada uma análise de variância de um fator (ANOVA) para comparar os grupos
expostos aos pesticidas com os respetivos grupos controlo. Os valores de P < 0,05 foram
considerados estatisticamente significativos.
MATERIAL E MÈTODOS_________________________________________________________________
46
2. Desenvolvimento do biossensor enzimático
Tal como atrás se referiu, estes procedimentos experimentais decorreram no Laboratório
GRAQ do REQUIMTE/ISEP.
2.1. Reagentes e soluções
A Tabela 3 apresenta a lista dos reagentes usados, respetiva fórmula química, o fornecedor
(origem) e a pureza analítica.
Na construção do biossensor foi usado o Gr e os CNT como nanomateriais. Foram
preparadas duas soluções. A solução de Gr foi obtida dissolvendo 1 mg de pó em 3 mL de
dimetilformamida (DMF). Os CNT foram dissolvidos também com DMF na concentração
de 1 mg L-1
.
As misturas foram colocadas em banho de ultrassons (03350-Quimis, Sonorex Digital 10P,
Bandeline), durante 10 min. para o Gr e 30 min. para CNT, de modo a auxiliar a formação
das suspensões de forma homogénea.
Os carbamatos, tiodicarbe e aminocarbe, foram dissolvidos em acetonitrilo, na
concentração 0,001 M.
O tampão Britton-Robinson (BR) 0,04 mol L-1
, com pH 5,0 foi preparado com ácido
acético, ácido fosfórico e ácido bórico[136]
. Este tampão foi usado como suporte eletrolítico
para preparação da solução de AMP e para a dissolução da Lac.
A medição do pH das soluções foi realizada no equipamento Crison, pH Meter GLP 22,
tendo sido ajustado com a quantidade apropriada de uma solução mãe de hidróxido de
sódio (NaOH) 1,0 mol L-1
.
Os reagentes foram pesados numa balança analítica (modelo New classic MS, Mettler
Toledo) cuja precisão é de ± 0,01 mg.
Todas as soluções foram preparadas com água ultrapura (p=18,2 MΩ/cm) obtida no
equipamento Simplicity 185 (Millipore, Molsheim, França).
A solução de AMP foi sempre preparada antes do seu uso, na concentração 5,83×10-5
M.
Os ensaios decorreram à TA (~ 20ºC).
_________________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS
47
Tabela 3: Reagentes químicos usados no desenvolvimento do biosensor enzimático, respetivas
fórmulas químicas, origem e grau de pureza.
Reagente Fórmula química Fornecedor Pureza
4-aminofenol C6H7NO Sigma 99%
Acetonitrilo C2H3CN VWR Chemicals 99.8%
Ácido acético CH3COOH Merck 99.7%
Ácido bórico H3BO3 VWR Chemicals 99.5%
Ácido fosfórico H3PO4 Panreac 85%
Aminocarbe C11H16N2O2 Sigma-Aldrich ≥ 98 %
Dimetilformamida C3H7ON Sigma-Aldrich 99.8%
Etanol C2H6O Carlo Erba 99,5%
Grafeno Sigma-Aldrich 99%
Hidróxido de sódio NaOH Emsure 99 %
Lacase Sigma-Aldrich 0,5 U mg-1
Nanotubos de carbono DropSens (Espanha) 95%
Tiodicarbe C10H18N4O4S3 Sigma-Aldrich ≥ 98%
2.2. Instrumentação
Todos os ensaios eletroquímicos de CV e de SWV foram realizados no
potenciostato/galvanostato Autolab PGSTAT-30 (Eco Chemie, Ultrecht, Holanda),
controlado pelo software GPES versão 4.9 (General Purpose Electrochemical System,
Metrohm-Eco Chemie).
Utilizou-se um sistema convencional de três elétrodos na célula eletroquímica: um elétrodo
de carbono vítreo (GCE) (0,071 mm2, Metrohm, Holanda) como elétrodo de trabalho, o
elétrodo Ag/AgCl/KCl- (3,0 mol L
-1) em meio de KCl saturado como referência e um
elétrodo de platina como elétrodo auxiliar.
Os GCE foram cuidadosamente polidos previamente com uma suspensão de alumina 0,3
µm e posteriormente com uma granulometria menor (0,05 µm), (ambas da Gravimetra,
Espanha). Em seguida, os elétrodos foram limpos com a ajuda do banho de ultrassons,
mergulhados em água ultrapura, seguido do etanol e por fim novamente em água destilada
ultrapura, durante 3 min. cada.
MATERIAL E MÈTODOS_________________________________________________________________
48
2.3. Modificação do elétrodo de carbono vítreo
Após o polimento e a limpeza do elétrodo procedeu-se à sua modificação com os
nanomateriais. Inicialmente o elétrodo de trabalho foi modificado com Gr, tendo sido
testado a quantidade de Gr a depositar na sua superfície. Foi avaliado por CV, usando 10
mL da solução de AMP 5,83×10-5
M em tampão BR, a pH 5,0, na gama de potencial 0,5 a
-0,4 V. Testaram-se volumes de 3, 6, 9 e 12 µL de Gr.
A eletrodeposição do Gr foi efetuada por adição sucessiva de 3 µL, entre cada adição,
procedeu-se à secagem do elétrodo com a ajuda de uma lâmpada de infravermelhos.
Numa fase posterior, o elétrodo de trabalho foi modificado com CNT. Procedeu-se à
eletrodeposição de 2 µL de CNT na superfície do elétrodo e secagem, tal como referido no
período anterior.
2.4. Imobilização da lacase
Após a modificação do elétrodo de trabalho com os nanomateriais, foi efetuada a
imobilização da Lac Trametes versicolor na superfície do GCE por gotejamento. Para o
efeito, foram depositados 5 µL de Lac numa concentração de 12,4 mg mL-1
em tampão
BR, a pH 5,0. O elétrodo construído foi seco à TA durante cerca de 1 h.
O desempenho do biossensor e a otimização analítica foram avaliados usando 10 mL da
solução 5,83×10-5
mol L-1
de AMP em tampão BR 0,04 M, a pH 5,0 como substrato
(mediador redox), numa gama de potencial entre 0,5 e -0,4 V e velocidade de varrimento
de 50 mV/s. A célula eletroquímica foi protegida da luz durante os ensaios.
_________________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS
49
2.5. Otimização dos parâmetros voltamétricos
De forma a obter maior sensibilidade analítica foram estudados os parâmetros
voltamétricos da SWV, isto é, a frequência (f), a amplitude de potencial (a) e o incremento
de potencial (∆Es). Estes parâmetros, para além de fornecerem as condições adequadas
para o procedimento eletroanalítico, possibilitam a obtenção de informações sobre a
cinética e o mecanismo redox envolvido. Acresce que também influenciam a sensibilidade
e a seletividade dos procedimentos eletroquímicos.
A avaliação da resposta foi baseada no valor máximo da intensidade da corrente do pico
(Ip), deslocamento do potencial do pico (Ep) e na alteração da largura da meia-altura
(∆Ep/2), e ainda na estabilidade do sinal após a catálise enzimática.
Para a análise dos parâmetros voltamétricos, o elétrodo de trabalho foi imerso na solução
eletrolítica, fazendo variar a frequência entre 10 e 100 Hz, a amplitude entre 10 e 100 mV
e o incremento de potencial entre 1 e 10 mV.
2.6. Otimização do tempo de incubação da lacase
Considerando que a inibição e o processo catalítico da Lac estão diretamente relacionados
com o pH (este afeta o mecanismo de protonação envolvido na reação eletroquímica), com
a concentração de enzima (o processo de inibição está diretamente relacionado com a
atividade cinética da enzima), com o uso de tampão e substrato apropriados[44]
, e ainda
com o tempo de incubação da enzima. Assim, foi estudada a melhor resposta da enzima
(tempo de incubação), usando as condições otimizadas anteriormente.
As medições foram realizadas por CV e SWV a vários tempos de contacto da enzima com
o substrato AMP (0, 15, 30, 45 min., e posteriormente de 5 em 5 min. até aos 80 min).
MATERIAL E MÈTODOS_________________________________________________________________
50
2.7. Quantificação dos pesticidas
Após a otimização das condições experimentais foram construídas as curvas analíticas em
eletrólito de suporte pela adição de padrão do pesticida na célula eletroquímica. Os
pesticidas foram quantificados com base na inibição da reação catalítica do substrato AMP,
desempenhada pela enzima Lac.
A intensidade da corrente base (Io) foi medida com o biossensor na solução eletrolítica
5,83×10-5
mol L-1
de AMP em 0,04 mol L-1
BR, a pH 5,0 e na ausência do pesticida
(inibidor). Esta resposta inicial corresponde ao sinal do branco (Io). Posteriormente,
adicionou-se 10 µL do padrão de tiodicarbe de concentração 0,001 M ao electrólito e a
solução foi agitada durante 2 min. Seguidamente, foi medida a intensidade de corrente do
novo pico (Ip), registando-se a inibição da reação catalítica. O mesmo procedimento foi
realizado para o aminocarbe.
As curvas analíticas do tiodicarbe e do aminocarbe foram construídas pela capacidade dos
pesticidas inibirem a atividade catalítica da Lac, tomando por base a oxidação do AMP,
utilizado como substrato e mediador redox.
A percentagem de inibição (% IR) foi calculada segundo a fórmula (1):
% IR [1 (Ip/Io)] 100 (1)
Onde:
Io = pico da intensidade de corrente antes da adição do pesticida.
Ip = pico da intensidade de corrente após a adição do pesticida.
_________________________________________________________________MATERIAL E MÉTODOS
51
Os valores de LOD e de LOQ foram calculados conforme indicado nas fórmulas (2) e (3),
respetivamente:
LOD = 3(Sx/y)/b
(2)
LOQ = 10(Sx/y)/b
(3)
Onde:
Sx/y = desvio padrão da regressão linear.
b = declive da curva analítica.
O valor de Sx/y foi calculado a partir da equação 4:
(4)
Onde:
yi = resposta para um determinado nível de concentração.
y = valor correspondente estimado a partir da curva analítica.
ni = número de pontos utilizados na curva analítica.
A exatidão do método foi avaliada por ensaios de recuperação (Rec %), obtida pela relação
entre as concentrações adicionada e recuperada dos carbamatos, conforme indicado na
fórmula (5).
ec % =
100 (5)
MATERIAL E MÈTODOS_________________________________________________________________
52
Os ensaios de recuperação nas amostras de laranjas foram realizados através do método da
adição de padrão, com resultados analisados em triplicado e os valores apresentados como
a média aritmética das medidas.
2.8. Aplicação do biossensor a amostras de laranja
Para a aplicação da metodologia desenvolvida a citrinos, foram adquiridas laranjas num
supermercado local do Porto (Portugal). A extração dos pesticidas foi realizada numa
amostra aleatória de 4 laranjas, utilizando-se o método Quick, Easy, Cheap, Effective,
Rugged and Safe (QUEChERS). A 10 g de homogeneizado de laranja foram adicionados
10 mL de acetonitrilo. Seguidamente, a amostra foi agitada num vortex durante 4 min., à
qual se adicionou o conteúdo de uma saqueta da mistura do sal: 6 g de MgSO4, 1,5 g de
NaCl e 1,5 g de C6H5Na3O7.2H2O (UCT, Bristol, EUA). O referido tubo foi agitado mais
uma vez no vortex durante 1 min. e em seguida centrifugou-se (2.16 Sartorius, Goettingen,
Alemanha) durante 3 min. a 4000 rpm. Após a centrifugação foram retirados 7 mL de
solvente (sobrenadante) e evaporados no Reacti-Therm III (Thermo Scientific, EUA).
Imediatamente antes das eletroanálises, o resíduo foi redissolvido com 5,83×10-5
M de
AMP em tampão BR 0,04 M a pH 5,0.
CAPÍTULO IV
RESULTADOS E DISCUSSÃO
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
55
1. Estudos in vivo da toxicidade do tiodicarbe em ratos
1.1. Monitorização dos sinais de toxicidade, do peso corporal e dos órgãos
No estudo da toxicidade do pesticida tiodicarbe em ratos, observou-se uma taxa de
sobrevivência de 100 %.
Os sinais clínicos de toxicidade de carbamatos em ratos incluem convulsões, espasmos
musculares, dispneia, excesso de salivação, vómitos, lacrimação, hipotermia, tremores e
redução da atividade motora com alteração na marcha[137, 138, 139]
.
Segundo a US EPA, para determinar a toxicidade aguda devem ser monitorizados os
efeitos subletais e letais. Recomenda-se, principalmente, a observação das manifestações
de comportamento anormal, como o aumento da salivação ou a descoordenação muscular
durante o período de estudo[140]
.
Na observação diária dos sinais de toxicidade não foi notado nenhum sinal em nenhum dos
grupos de estudo. Apenas se constatou uma ligeira queda de pêlo no grupo de animais
expostos à dose mais elevada de pesticida (grupo C).
O peso corporal dos animais foi avaliado antes do início da exposição ao tiodicarbe,
procedendo-se posteriormente ao seu controlo semanal.
Durante o período de estudo todos os animais aumentaram de peso de forma relativamente
proporcional. A Figura 6 mostra a variação no peso corporal dos animais ao longo do
presente estudo.
RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________________________
56
Figura 6: Peso corporal dos animais do grupo controlo e dos grupos expostos
ao tiodicarbe desde o início do estudo, incluindo o período de aclimatização.
Ao fim dos 30 dias de estudo, os valores médios de peso dos animais foram de 427 g para
o grupo controlo e para os grupos expostos ao tiodicarbe: grupo A - 436 g; grupo B - 434 g
e grupo C - 426 g).
Não houve diferenças estatisticamente significativas em relação ao peso corporal dos
animais, comparando os grupos expostos ao pesticida com o grupo controlo.
Após o sacrifício procedeu-se à colheita de órgãos (fígado, rim, baço, timo, epidídimo e
testículo) e respetiva pesagem. O cálculo da percentagem da razão peso dos órgãos/peso
corporal não revelou em nenhum órgão, diferenças estatisticamente significativas entre o
grupo controlo e os grupos de tratamento.
A observação macroscópica dos órgãos em todos os animais não revelou qualquer
alteração digna de registo.
1.2. Análises hematológicas
Foram determinados vários parâmetros hematológicos no sangue recolhido aos ratos após
10, 20 e 30 dias de exposição ao tiodicarbe. Os parâmetros determinados foram o número
de leucócitos e de eritrócitos, o valor da hemoglobina, hematócrito, volume globular
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
57
médio, hemoglobina corpuscular média e a contagem do número de plaquetas. Não foi
verificado nenhuma alteração estatisticamente significativa nestes parâmetros, comparando
o grupo controlo com os três grupos de tratamento.
1.3. Análises bioquímicas
A informação sobre os efeitos do tiodicarbe nos parâmetros bioquímicos de pequenos
roedores é escassa. Assim, foram realizadas análises a diversos parâmetros bioquímicos no
soro dos ratos, após 10, 20 e 30 dias de exposição ao tiodicarbe. Os resultados obtidos
estão apresentados na Tabela 4.
Tabela 4: Parâmetros bioquímicos (média ± SD) determinados no soro dos ratos do grupo controlo e dos
grupos expostos ao tiodicarbe.
Parâmetro Grupo 10 dias 20 dias 30 dias
ALT
(U/L)
Controlo 42,7 ± 1,53 40,0 ± 2,0 37,0 ± 3,4
A 48,4 ± 2,3 37,7 ± 3,2 41,6 ± 5,3
B 48,8 ± 8,2 67,3 ± 5,9 69,0 ± 4,7
C 48,0 ± 10,3 43,0 ± 4,6 39,6 ± 4,7
AST
(U/L)
Controlo 98,0 ± 19,1 86,7 ± 10,7 51,0 ± 16,37
A 94,2 ± 11,3 67,7 ± 4,04* 77,0 ± 10,49*
B 93,8 ± 15,8 93,0 ± 29,7 109,6 ± 33,69*
C 94,2 ± 30,4 93,0 ± 23,3 65,0 ± 18,14
ALP
(U/L)
Controlo 20,0 ± 11,3 8,7 ± 6,03 14,3 ± 1,15
A 9,6 ± 5,8 12,0 ± 0,0 12,0 ± 2,00
B 13,2 ± 4,2 10,0 ± 4,2 8,6 ± 3,85*
C 11,8 ± 4,9 9,4 ± 4,3 10,6 ± 6,07
Cr
(mg/dL)
Controlo 0,44 ± 0,2 0,46 ± 0,07 1,64 ± 0,07
A 0,43 ± 0,2 0,49 ± 0,06 0,63 ± 0,06*
B 0,60 ± 19,5 0,50 ± 0,02 0,72 ± 0,24*
C 0,65 ± 0,2 0,54 ± 0,13 1,41 ± 0,39
Ur
(mg/dL)
Controlo 42,80 ± 4,5 29,8 ± 5,97 33,6 ± 0,31
A 38,1 ± 5,8 30,2 ± 2,6 29,06 ± 2,18*
B 37,2 ± 15,2 29,8 ± 2,97 31,2 ± 4,99
C 43,5 ± 7,7 34,6 ± 6,99 39,8 ± 6,23
Col T
(mg/dL)
Controlo 85,7 ± 7,6 75,7 ± 4,9 102,7 ± 10,02
A 93,6 ± 6,5 72,7 ± 3,1 74,6 ± 5,41*
B 87,8 ± 12,2 76,5 ± 13,1 77,4 ± 18,12
C 73,2 ± 4,1* 69,6 ± 5,4 91,2 ± 6,94
PT
(g/dL)
Controlo 7,23 ± 0,06 6,17 ± 0,21 7,7 ± 0,1
A 7,32 ± 0,22 6,23 ± 0,57 7,34 ± 0,09*
B 7,00 ± 3,02 6,2 ± 0,1 7,02 ± 0,31*
C 7,02 ± 0,28 6,36 ± 0,4 7,9 ± 0,32*
*Significativo P<0,05
RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________________________
58
Após 10 dias de exposição dos animais ao pesticida observou-se uma diminuição dos
valores do Col T no grupo sujeito à dose mais elevada (grupo C) (p = 0,02). Contudo, os
restantes parâmetros (AST, ALT, ALP, Cr, Ur, PT) não revelaram diferença estatística
entre o controlo e os restantes grupos expostos.
Ao fim de 20 dias de tratamento, apenas houve um decréscimo da atividade da enzima
AST no grupo A (p = 0,04).
No fim do estudo (30 dias) verificou-se um aumento de AST para os grupos A (p = 0,032)
e B (p = 0,033), diminuição das PT nos grupos A (p = 0,002) e B (0,001), aumento da Cr
nos grupos A (p = 0,001) e B (p = 0,002), diminuição da Ur (p = 0,014) e do Col T (p =
0,001) no grupo A e redução da ALP no grupo B (p = 0,012).
Alterações idênticas nos valores dos parâmetros bioquímicos foram descritas por Satpal e
colaboradores (Satpal et al., 2010[29]
), com a diminuição das PT, Ur e da Cr ao 28º dia de
exposição ao tiodicarbe e aumento da AST ao 7º dia. No entanto, outros autores (AL-
Shinnawy, 2008[141]
), reportou valores elevados de AST, ALT e ALP no soro de ratos
expostos ao tiodicarbe.
Rai et al., 2009[44]
, descreveram o aumento de Col T, quando estudaram o soro de ratos
expostos aos carbamatos carpate e carbofurano. Este parâmetro, no fim do presente estudo,
apresentou valores mais baixos no grupo A comparativamente com o grupo controlo.
Sendo a Ur e a Cr produtos de degradação do metabolismo das proteínas associadas à
função renal[30]
, a alteração destes parâmetros implica alterações na fisiologia deste órgão,
o que foi verificado neste estudo, concluindo-se que o tiodicarbe poderá ter afetado a
função renal dos animais.
Dois outros parâmetros habitualmente usados como indicadores de dano tecidular e
alteração da permeabilidade plasmática, e considerados como biomarcadores de
hepatotoxicidade, são as enzimas ALT e AST[29, 30]
. A elevação da atividade da AST no
presente estudo pode ser indicativa de toxicidade hepática induzida pelo tiodicarbe.
Resultados semelhantes foram reportados por Gbadegesin, et al., 2014[57]
, que observaram
o aumento das enzimas do fígado (AST e ALT), em ratos submetidos ao carbofurano.
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
59
1.4. Análises imunológicas
A citometria de fluxo foi usada para a imunofenotipagem dos linfócitos no sangue
periférico e na MO. Neste estudo as populações linfocitárias foram identificadas pelos
marcadores celulares tais como CD3+, CD3
+NK-P1A
+, NKR-P1A
+, CD45RA
+.
Os resultados obtidos da análise do sangue, após os 30 dias de exposição dos animais ao
tiodicarbe, mostraram diferenças estatisticamente significativas (p = 0,03) entre o grupo
controlo e o grupo C, com o marcador NKR-P1A+, registando-se um aumento do valor
(Figura 7).
Nas amostras de MO, as análises de citometria de fluxo não revelaram diferenças
estatisticamente significativas, entre o grupo controlo e os grupos expostos ao tiodicarbe,
ao fim dos 30 dias e com os marcadores usados.
Figura 7: Resultado da citometria de fluxo realizada no sangue dos ratos, após 30 dias
de exposição ao tiodicarbe: (a) gráfico do marcador NKR-P1A+ do grupo controlo e
(b) do grupo C.
Há várias décadas que os investigadores referem que os pesticidas induzem diferentes
efeitos imunotóxicos em animais de laboratório como os pequenos roedores, com redução
da resposta humoral e ativação da maturação das células B na MO[142]
.
A imunotoxicidade é um efeito adverso direto ou indireto de substâncias sobre o sistema
imune, resultando em supressão ou aumento da resposta imunitária. A imunosupressão
RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________________________
60
pode diminuir a resistência a agentes infeciosos ou a células tumorais. O aumento da
resposta imunitária pode resultar em hipersensibilidade ou em doenças autoimunes[143]
.
Corsini et al., 2013[144]
descreveram os efeitos imunossupressores dos carbamatos, que
podem resultar em repetidas, mais graves ou prolongadas infeções. Um outro efeito
descrito é a diminuição ou inibição da atividade das células natural killer (NK), com
diminuição da apoptose das células do sistema imune. As células NK têm um papel central
no sistema imune contra infeções virais e contra a formação de tumores primários[24]
.
O marcador NKR-P1A+ sinaliza células que expressam antigénios das células de
diferenciação NK maduras e está associado aos mecanismos de defesa por exemplo, no
caso de infeção por bactérias[145]
. O facto dos resultados do presente trabalho evidenciarem
um aumento deste marcador, sugere que houve uma supressão da resposta imunitária
provocada pelo pesticida, conduzindo ao aumento da apoptose acompanhada de depleção
celular e consequentemente imunossupressão, resultando na diminuição das defesas
imunitárias e aumento da suscetibilidade a infeções.
Este facto também foi referido por outros autores aquando do estudo da interação do
carbamato matacil na resposta imunitária humoral de IgM e na resposta imunitária primária
IgG em ratinhos. Estes autores constataram que as doses subletais induziram uma
imunossupressão acentuada na resposta imunitária humoral[146]
.
De igual modo Dhouib, et al., 2014[36]
, estudaram a imunotoxicidade do carbosulfano em
ratos, tendo concluído que este pesticida provoca o aumento dos leucócitos, com
diminuição do marcador celular T-CD8+ e inibição de citoquinas, demonstrando os efeitos
imunotóxicos induzidos por este carbamato.
1.5. Análise histológica
A análise histológica dos órgãos (fígado, rim, baço, testículo e timo) de ratos expostos ao
tiodicarbe revelou alterações degenerativas em todos os grupos quando comparado com o
controlo, tendo-se evidenciado profundas anomalias em função da dose (Figura 8 e 9).
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
61
Figura 8: Cortes histológicos dos vários órgãos de ratos expostos ao tiodicarbe: (a) fígado do grupo
controlo e (b) do grupo C, apresentando hemorragia e vacuolização difusa (*); (c) rim do grupo
controlo e (d) do grupo C, apresentando vacuolização e degenerescência celular (*); (e) baço do
grupo controlo e (f) do grupo C, apresentando notória acumulação de ferro (*). Coloração H & E.
Ampliação original 100x.
b
*
*
c
e
d
a
a
f
*
RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________________________
62
Figura 9: Cortes histológicos de testículo e do timo de ratos expostos ao tiodicarbe: (a)
testículo do grupo controlo e (b) do grupo C, apresentando hemorragias (*); timo do grupo
controlo (c) e (d) do grupo C, presentando perda celular no cortex. Coloração H & E.
Ampliação original 100x.
A nível da histologia hepática observou-se alterações degenerativas tais como hemorragia
e vacuolização difusa em todos os grupos expostos ao carbamato, comparativamente ao
grupo controlo.
Na histologia renal observou-se desorganização estrutural, caraterizada por dano nos
glomérulos e vacuolização no espaço capsular, infiltração e inflamação celular e
degenerescência nas células epiteliais dos túbulos renais.
Desorganização progressiva, com rutura da polpa branca e acentuada acumulação de ferro
na polpa vermelha foi observado na histologia do baço, sendo estas alterações mais
evidentes no grupo C.
As seções histológicas de testículo mostraram redução nas camadas das células
germinativas nos túbulos seminíferos e hemorragia no tecido intersticial. A observação dos
cortes histológicos do timo revelou alterações significativas na sua estrutura, tais como
*
a b
d c
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
63
perda celular no cortex no grupo de ratos expostos à dose mais elevada de tiodicarbe
(grupo C).
As lesões observadas nos vários órgãos foram igualmente descritas por outros autores,
aquando do estudo dos efeitos tóxicos de carbamatos em ratos.
Altug Yavasoglu et al., 2006[40]
descreveram alterações hepáticas, como degenerescência
vacuolar, aumento dos sinusóides, degenerescência nos cordões hepáticos, vacuolização
dos hepatócitos e infiltração mononuclerar, em ratos sujeitos ao pesticida cipermetrina, por
via oral.
Ozden, et al., 2012[147]
e Gbadegsin., et al. 2014[148]
também descreveram alterações
histológicas no fígado e no rim de ratos Wistar, expostos ao carbamato metiocarbe.
As lesões assinaladas no fígado e no rim podem ser consideradas como consequência da
exposição dos ratos ao tiodicarbe, dado que estes órgãos são o alvo de muitos xenobióticos,
tendo em conta o seu papel importante no processo de desintoxicação e eliminação.
As alterações observadas no testículo também poderão estar relacionadas com o efeito do
tiodicarbe sobre o normal funcionamento do órgão, uma vez que este carbamato é um ED,
e que interfere com as hormonas naturais por ligação aos recetores dos estrogénios e dos
androgénios. Esta ligação altera a síntese, o transporte, o metabolismo e a eliminação das
hormonas, provocando alteração na concentração das hormonas naturais no organismo[149]
.
RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________________________
64
2. Estudos in vivo da toxicidade do aminocarbe em ratos
2.1. Monitorização dos sinais de toxicidade, do peso corporal e dos órgãos
No estudo de toxicidade com o pesticida aminocarbe todos os animais sobreviveram até ao
final do estudo. Não foram evidenciados sinais de toxicidade, nos grupos A e B, durante o
período de estudo. No grupo de ratos expostos à dose mais alta (grupo C) observou-se uma
diminuição da atividade motora dos animais, ao fim do primeiro dia de exposição ao
pesticida.
A monitorização do peso corporal foi realizada antes do tratamento com aminocarbe,
seguido de controlo semanal. Foi registado um aumento no peso corporal em todos os
grupos. No entanto, nos grupos de ratos expostos ao aminocarbe, o aumento não foi tão
notório, comparativamente com o grupo controlo (Figura 10).
O peso dos órgãos em estudo não revelou diferenças estatisticamente significativas.
Figura 10: Peso corporal dos animais do grupo controlo e dos grupos
expostos ao aminocarbe.
A falta de aumento de peso corporal nos grupos tratados, comparativamente com o grupo
controlo pode estar relacionada com a redução de apetite e com a diminuição na
mobilidade. Pode-se deduzir que estes fatores associados à consequente redução na procura
de alimento foram induzidos pela ingestão da água com o aminocarbe.
200
220
240
260
280
300
0 1 7 14
Peso corporal (g)
dias
grupo controlo
grupo A
grupo B
grupo C
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
65
2.2. Análises hematológicas
Foram realizadas análises hematológicas ao sangue dos ratos, ao 1º, 7º e 14º dia de estudo.
Os valores dos parâmetros hematológicos do grupo controlo e dos grupos de ratos expostos
ao aminocarbe são apresentados na Tabela 5.
Tabela 5: Parâmetros hematológicos determinados no sangue dos ratos do grupo controlo e dos
ratos expostos ao aminocarbe.
Parâmetro Grupo 1 dia 7 dias 14 dias
Leucócitos
(106/mm
3)
Controlo 11.6 ± 1.5 11.3 ± 0.4 10.5 ± 0.9
A 11.4 ± 0.8 10.1 ± 0.2 6.3 1.0*
B 11.9 ± 1.8 11.4 ± 0.8 6.9 1.3*
C 11.3 ± 0.1 7.2 ± 0.5* 5.9 0.3*
Eritrócitos
(106/mm
3)
Controlo 7.9 ± 0.2 7.8 ± 0.1 8.7 0.2
A 7.8 ± 0.4 7.7 ± 0.6 7.8 0.5
B 7.7 ± 0.3 7.7 ± 0.4 8.5 0.05
C 7.9 ± 0.1 7.8 ± 0.1 8.4 0.2
Hemoglobina
(g/dL)
Controlo 15.3 ± 0.8 15.1 ± 0.4 15.7 0.6
A 14.8 ± 0.4 15.3 ± 0.8 16.1 0.4
B 15.2 ± 0.3 14.7 ± 0.8 16.6 0.1
C 15.4 ± 0.2 15.2 ± 0.2 16.4 0.7
Hematócrito
(%)
Controlo 47.1 ± 0.6 45.3 ± 0.2 46.0 0.7
A 45.0 ± 1.7 46.0 ± 0.1 46.0 0.8
B 44.8 ± 1.9 43.4 ± 0.5 48.8 0.3
C 46.2 ± 0.9 46.1 ± 0.7 46.6 2.0
Volume Globular Médio
(μm3)
Controlo 58.3 ± 0.9 58.2 ± 0.4 55.0 0.7
A 57.5 ± 0.5 56.1 ± 0.7 54.0 0.5
B 58.5 ± 0.5 57.1 ± 0.3 57.5 0.5
C 59.0 ± 0.4 56 ± 0.8 55.0 1.0
Hemoglobina Corpuscular Média
(pg)
Controlo 19.2 ± 0.6 19.4 ± 0.3 18.75 0.4
A 18.9 ± 0.5 18.4 ± 0.8 19.4 0.3
B 19.8 ± 0.1 19.2 ± 0.2 19.5 0.3
C 19.4 ± 0.1 19.3 ± 0.5 19.4 0.4
Plaquetas
(103/mm
3)
Controlo 664 ± 60 540 ± 82 706 42
A 622 ± 51 710 ± 20 736 17
B 531 ± 23 632 ± 34 734 136
C 468 ± 72 541 ± 31 599 60
*Significativo P < 0,05
RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________________________
66
Ao 1º dia de exposição ao aminocarbe, nenhum parâmetro hematológico apresentou
diferenças estatisticamente significativas, entre os grupos tratados e o grupo controlo.
Após 7 dias de exposição dos ratos ao pesticida, o número total de leucócitos diminuiu
significativamente no grupo C, com redução do número dos neutrófilos e dos monócitos e
aumento do número dos linfócitos.
O mesmo perfil hematológico foi observado após 14 dias em todos os grupos de ratos
expostos ao aminocarbe.
Os restantes parâmetros hematológicos não revelaram diferenças estatisticamente
significativas entre o grupo controlo e os restantes grupos.
São poucos os estudos sobre o efeito dos carbamatos nos parâmetros hematológicos.
O estudo de CeliK, et al.[60]
, refere a alteração do número de leucócitos em ratos tratados
com metil paratião (pesticida da classe dos organofosfatos), durante 28 dias.
Um estudo mais recente de Dhouib, et al.[150]
, onde caraterizaram os efeitos subcrónicos da
exposição do malatião (organofosfato) e do carbosulfano (carbamato), em ratos, durante 30
dias, constataram o aumento significativo do número de linfócitos, nomeadamente das
subpopulações de linfócito T, CD4+, CD8
+, com redução da produção de interleucinas.
Os mesmos autores, num estudo onde verificavam o efeito protetor da N-acetilcisteína
sobre a toxicidade do carbosulfano, também reportaram o aumento do número de
leucócitos, após o tratamento dos ratos durante 30 dias consecutivos com este
carbamato[51]
.
Zari e colaboradores[13]
estudaram o possível efeito terapêutico do extrato de folhas de
oliveira em ratos tratados com carbendazim durante 30 dias. Os resultados deste estudo
também confirmaram o aumento do número de leucócitos, com a diminuição do número de
eritrócitos, do valor da hemoglobina e do hematócrito.
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
67
2.3. Análises bioquímicas
Os resultados dos parâmetros bioquímicos realizados no soro dos ratos do grupo controlo e
dos grupos expostos ao aminocarbe são apresentados na Tabela 6.
Tabela 6: Parâmetros bioquímicos (média ± SD) determinados no soro dos ratos do grupo controlo e dos
grupos expostos ao aminocarbe.
Parâmetro Grupo 1 dia 7 dias 14 dias
AChE
(mg/dL)
Controlo 1.2 ± 0.1 1.1 ± 0.1 1.0 ± 0.3
A 0.9 ±0.1* 0.9 ± 0.1 1.0 ± 0.1
B 0.8 ± 0.2* 1.0 ± 0.2 0.9 ± 0.1
C 0.8 ± 0.1* 0.9 ± 0.2 0.9 ± 0.2
ALT
(U/L)
Controlo 68 ± 10 63 ± 9 69 ± 3
A 72 ± 11 62 ± 10 54 ± 12
B 91±7 68 ± 10 61 ± 11
C 99±10 71 ± 13 78 ± 3
AST
(U/L)
Controlo 104 ± 20 123 ± 2 102 ± 3
A 101 ± 18 80 ± 20 92 ±16
B 88 ± 25 102 ± 11 93 ± 7
C 72 ± 28 99 ± 8 101 ± 2
ALP
(U/L)
Controlo 16 ± 3 14 ± 2 18 ± 2
A 20 ± 5 28 ± 3* 22 ± 8
B 19 ± 8 38 ± 4* 20 ± 3
C 23 ± 5 39 ± 3* 42 ± 4*
Cr
(mg/dL)
Controlo 0.50 ± 0.06 0.50 ± 0.05 0.60 ± 0.02
A 0.60 ± 0.04 0.70 ± 0.02 0.90 ± 0.09*
B 0.60 ± 0.01 1.00 ± 0.08* 1.10 ± 0.09*
C 0.70 ± 0.02 1.10 ± 0.05* 1.20 ± 0.05*
Ur
(mg/dL)
Controlo 26 ± 2 20 ± 2 28 ± 9
A 28 ± 3 31 ± 3 42 ± 5*
B 33 ± 9 44 ± 8* 47 ± 5*
C 34 ± 10 43 ± 4* 56 ± 4*
Col T
(mg/dL)
Controlo 80 ± 16 124 ± 11 112 ± 20
A 92 ± 5 96 ± 9 123 ± 16
B 58 ± 22 95 ± 3 90 ± 12
C 88 ± 16 117 ± 21 84 ± 8
Tg
(mg/dL)
Controlo 121 ± 6 136 ±5 114 ± 5
A 130 ± 17 72 ± 8* 88 ± 8
B 114 ± 11 83 ± 6* 93 ± 4
C 98±10 77 ± 9* 62 ± 7*
PT
(g/dL)
Controlo 6.4 ± 0.2 7.4 ± 0.5 7.1 ± 0.8
A 6.5 ± 0.2 7.5 ± 0.2 8.0 ± 0.2
B 6.1 ± 0.3 9.0 ± 0.8 7.2 ± 0.3
C 8.2±0.2 9.8±0.1 7.1±0.6
*Significativo P < 0,05
RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________________________
68
Após 1 dia de exposição dos ratos ao aminocarbe houve uma redução significativa da
atividade da AChE em todos os grupos tratados.
Os carbamatos são compostos responsáveis pela inibição da atividade da enzima AChE e
da consequente acumulação do neurotransmissor, a acetilcolina, nos terminais nervosos, a
qual transmite sinais entre as células nervosas e as células musculares[37, 147, 151]
.
Determinar a inibição da AChE permite usar este parâmetro como biomarcador dos efeitos
neurotóxicos causados por carbamatos[149]
.
Os resultados obtidos mostram que todos os grupos expostos ao aminocarbe apresentaram
uma diminuição da AChE, resultado do efeito do pesticida sobre o sistema nervoso central.
Wang, et al.[55]
, também constataram a diminuição dos valores da AChE, aquando do
estudo da toxicidade do carbaril em ratos durantes 90 dias. Este facto foi de igual modo
evidenciado por Banji, et al.[58]
, num estudo da toxicidade do carbosulfano em ratos
durante 15 dias.
Após 7 dias de exposição dos ratos ao aminocarbe, a atividade da enzima ALP aumentou
significativamente em todos os grupos tratados, a Ur e a Cr aumentaram no grupo B e C e
os Tg diminuíram em todos os grupos expostos ao pesticida.
No final do estudo, a enzima ALP aumentou no grupo C, a Ur e a Cr aumentaram em todos
os grupos tratados e os Tg diminuíram no grupo C.
Chevalier, G., et al.[152]
reportaram alterações significativas na atividade da ALP no
parênquima pulmonar em ratos, após 24h de exposição à inalação do aminocarbe e o
aumento de PT e da atividade da LDH no soro. Os resultados deste estudo indicam os
efeitos tóxicos do aminocarbe em ratos, o que de igual modo foi demonstrado com os
resultados obtidos.
A LDH é um bom indicador de lesão celular. Contudo, não foi doseada neste estudo, dado
que algumas das nossas amostras de soro estavam hemolisadas.
Outros autores referem o aumento dos níveis de Cr, tal como também se verificou no
presente estudo, quando estudaram os efeitos tóxicos do carbendazim em ratos, durante 15
dias[56]
.
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
69
2.4. Análise histológica
O estudo histológico dos vários órgãos mostrou danos em todos os grupos expostos ao
aminocarbe, comparado com o controlo, com alterações mais evidentes no grupo C, após
14 dias de exposição.
Foram observadas alterações degenerativas nas seções hepáticas, com acumulação de
hepatócitos de reduzido volume no grupo B, focos de hemorragia e vacuolização difusa no
grupo C (Figura 11).
Figura 11: Cortes histológicos do fígado e do rim de ratos expostos ao aminocarbe: (a)
fígado do grupo controlo e (b) do grupo C, apresentando hemorragia e vacuolização difusa;
(c) rim do grupo controlo e (d) do grupo C, com evidência de hemorragias; Coloração H &
E. Ampliação original 100x.
a
c
b
d
RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________________________
70
A histologia das seções renais revelou desorganização na área cortical, incluindo alguns
focos de hemorragia nos grupos expostos ao aminocarbe, com maior evidência no grupo C.
Alterações idênticas foram descritas por Munglang, et al.[153]
, aquando do estudo da
toxicidade do carbamato carbaril em ratos Wistar, durante 30 dias.
Outros autores como Prado-Ochoa et al.[50]
descreveram também degenerescência no
fígado, evidenciando nos hepatócitos leve vacuolização e focos de necrose. Estas
alterações foram descritas aquando do estudo dos carbamatos etil-4-bromofenol e o etil-4-
clorofenil em ratos, nas doses de 300 a 2000 mg kg-1
, administrados durante 14 dias.
Nos restantes órgãos estudados, no presente trabalho, não foram observadas alterações
histológicas dignas de registo. Apenas se constatou a redução dos espermatozoides no
lúmen, no epidídimo dos ratos do grupo C comparativamente com o grupo controlo.
3. Construção do biossensor enzimático
O desenvolvimento de biossensores está a aumentar em todos os setores, nomeadamente
no setor do controlo alimentar. Existem cada vez mais instrumentos analíticos portáteis
simples, rápidos, precisos e de baixo custo para este fim. Os biossensores enzimáticos
constituem a principal classe de biossensores eletroquímicos utilizados para a análise de
alimentos. Como já foi referido, o princípio de funcionamento destes instrumentos consiste
na deteção de inibidores de enzimas, principalmente da classe oxido-redutases (oxidases,
peroxidases, desidrogenases)[154]
.
Tendo em conta que muitos pesticidas são concebidos para inibir a atividade de várias
enzimas, torna-se pertinente aplicar estas enzimas para fins de deteção de resíduos[155]
.
No presente trabalho procedeu-se ao desenvolvimento de um biossensor enzimático usando
como elemento de bioreconhecimento a enzima Lac e recorrendo à modificação de um
GCE com nanomateriais. A atividade enzimática da Lac foi medida na ausência e na
presença do inibidor (os carbamatos) e o grau de inibição foi correlacionado com a
concentração do inibidor[154]
.
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
71
3.1. Modificação do elétrodo de carbono vítreo
A incorporação de nanomateriais na construção de biossensores tem demonstrado a
melhoria no aumento da sensibilidade e no desempenho global dos biossensores,
especialmente com AuNPs, CNT e Gr[91]
. Tem sido referido que o uso de Gr no
desenvolvimento de biossensores eletroquímicos apresenta excelente flexibilidade
mecânica, rápida transferência de eletrões, alta condutividade térmica e boa
biocompatibilidade[45, 105, 106, 107]
. Consequentemente, este foi o primeiro nanomaterial a ser
testado para proceder à preparação do biossensor enzimático.
O comportamento eletroquímico do GCE/Gr foi investigado por CV e por SWV.
As condições de análise foram as seguintes: a f de 50 Hz, a a de 40 mV e o ∆Es de 4 mV,
em tampão BR, a pH 5,0, utilizando o AMP na concentração de 5,83×10-5
M como
substrato, numa gama de potencial de 0,5 a -0,4V.
O comportamento do GCE/Gr sobre o AMP representa o processo redox deste substrato,
com picos bem definidos: o pico anódico, Epa a 0,250 V e o pico catódico, Epc a 0,225 V.
Com a imobilização do Gr sobre o GCE verificou-se um aumento significativo dos valores
de Ip em torno de três vezes mais, traduzindo um incremento de 167% nos valores de Ip
(Figura 12).
(a) (b)
Figura 12: Voltamogramas por CV(a) e por SWV (b) em AMP 5,83×10-5
M, obtidos com GCE (linha
azul) e GCE/Gr (linha vermelha), em meio tampão BR, pH 5,0, com f = 50 Hz, a = 40 mV e ∆Es = 4
mV.
-0.100 0 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 -4
-0.65x10
-4 -0.55x10
-4 -0.45x10
-4 -0.35x10
-4 -0.25x10
-4 -0.15x10
-4 -0.05x10
E / V
i / A
RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________________________
72
De forma a obter a melhor resposta eletroquímica do GCE/Gr relativamente ao substrato
AMP 5,83×10-5
M foram depositados vários volumes (3, 6, 9 e 12 µL) da suspensão de Gr
à superfície do GCE. A adição sucessiva de Gr aumentou progressivamente a corrente do
pico até aos 9 µL e foi verificada a melhoria na reversibilidade do processo, tendo-se
obtido voltamogramas semelhantes com a adição de 9 e 12 µL de Gr (Figura 13).
Figura 13: Voltamogramas cíclicos da oxidação e redução de
AMP 5,83×10-5
M, obtidos com o elétrodo GCE (linha azul) em
meio tampão BR, pH 5,0, com f = 50 Hz, a = 40 mV, ∆Es = 4 mV,
gama de potencial 5,0 a -0,4 V, com deposições de Gr, com os
volumes de 3µL (linha azul clara), 6µL (linha cinzenta), 9µL(linha
verde) e 12 µL (linha vermelha).
Estes dados mostram que a deposição de Gr na superfície do GCE aumenta a Ip, a qual
pode ser atribuída à excelente condutividade elétrica do Gr, que reduz a resistência à
transferência da carga, promovendo a transferência de eletrões, facto semelhante ao
reportado por outros autores[87]
. São vários os autores que referem que a utilização de Gr é
ótima para o desenvolvimento de biossensores enzimáticos com impacto na seletividade e
sensibilidade[96, 103]
.
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
73
Considerando que o aumento do pico observado com a deposição de 9 µL de Gr foi
aproximadamente três vezes maior do que o observado sem Gr, este volume foi o
selecionado como sendo ótimo para o desenvolvimento do biossensor enzimático. A
deposição dos 9 µL foi realizada por três vezes consecutivas de 3 µL cada, com a secagem
do elétrodo entre cada adição.
A modificação com CNT também foi testada, dado que, nos últimos anos, estes
nanomateriais têm sido amplamente usados na construção de diferentes tipos de
biossensores para determinação de pesticidas, de acordo com as suas excelentes
propriedades mecânicas, elétricas, catalíticas e de geometria[4]
.
Os CNT apresentam ainda a vantagem de poderem ser usados como suporte para a
imobilização de enzimas, pela sua elevada área superficial, a forte capacidade de adsorção,
a alta condutividade, o poder de imobilização e a biocompatibilidade. Estas caraterísticas
de condutividade melhoram a transferência entre o centro redox da enzima e a superfície
do elétrodo[45, 46]
.
Com a deposição de CNT sobre o GCE verificou-se um aumento de 600% do valor da
intensidade de corrente de pico de redução (Figura 14). Este aumento demonstra o papel
importante dos CNT na melhoria da cinética de transferência elétrica dos biossensores e
está relacionada com as dimensões nanométricas, a elevada área superficial, a estrutura
eletrónica e os defeitos topológicos nas estruturas dos CNT[42]
.
RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________________________
74
Figura 14: Voltamogramas obtidos por SWV da redução de AMP
5,83×10-5
usando o GCE (linha azul) e do GCE/CNT (linha vermelha) em
meio tampão BR, pH 5,0, com f = 50 Hz, a = 40 mV, ∆Es = 4 mV.
Alguns autores referem que a contribuição positiva dos CNT na atividade eletrocatalítica
de dispositivos eletroquímicos é devido à presença de locais reativos nas extremidades e
nos defeitos topológicos das nanoestruturas[42]
.
Britto et al.[156]
demostraram, por cálculos ab-initio, que a melhoria na transferência
elétrica dos biossensores contendo CNT se deve às curvaturas das estruturas cilíndricas,
que originam mudanças nas bandas de energia e onde a presença de defeitos pentagonais
produz regiões com alta densidade de carga.
3.2. Imobilização da enzima lacase
No desenvolvimento de biossensores já foram testadas várias estratégias de imobilização
de enzimas. A abordagem com maior êxito baseia-se no uso de enzimas imobilizadas ou
incorporadas no elétrodo[46]
. A enzima Lac apresenta um grande potencial biotecnológico,
devido à sua capacidade para oxidar uma ampla gama de substratos, nomeadamente
aminofenóis. Nas últimas duas décadas, tem sido inúmeros os estudos eletrobioquímicos
-0.150 -0.050 0.050 0.150 0.250 0.350 0.450 -3
-0.13x10
-3 -0.11x10
-3 -0.08x10
-3 -0.06x10
-3 -0.03x10
-3 -0.01x10
E / V
i / A
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
75
usando a Lac na construção de biossensores, dado que a Lac é um excelente biocatalisador,
graças à sua alta atividade, seletividade e especificidade, a qual permite executar processos
químicos complexos sob condições experimentais e naturais[92]
.
O bom desempenho do biossensor está dependente do sucesso da imobilização da
enzima[72, 84]
. Como já foi referido, os métodos comuns de imobilização da Lac em
biossensores são o encapsulamento, a adsorção, a ligação covalente e a ligação cruzada[91,
92]. No presente trabalho, a imobilização da enzima Lac no GCE/Gr e no GCE/CNT foi
realizada por adsorção através do gotejamento de 5 µL da solução enzimática (12,4 mg
mL-1
).
Os ensaios foram realizados em tampão BR, a pH 5,0, utilizando AMP 5,83×10-5
M como
substrato. Os perfis voltamétricos da redução do AMP, obtidos por SWV, sobre o
GCE/Gr/Lac e sobre o GCE/CNT/Lac são apresentados nas Figura 15 e Figura 16
respetivamente.
Figura 15: Voltamogramas por SWV da redução do AMP 5,83×10-5
M, em
meio tampão BR, pH 5,0, f = 50 Hz, a = 40mV, ∆Es = 4mV, obtidos do
GCE (linha azul), GCE/Gr (linha vermelha) GCE/Gr/Lac (linha verde).
-0.400 -0.300 -0.200 -0.100 0 0.100 0.200 0.300 0.400 -4 -0.53x10
-4 -0.48x10
-4 -0.43x10
-4 -0.38x10
-4 -0.33x10
-4 -0.28x10
-4 -0.23x10
-4 -0.18x10
-4 -0.13x10
-4 -0.07x10
-4 -0.02x10
E / V
i / A
RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________________________
76
Figura 16: Voltamogramas por SWV da redução do AMP 5,83×10-5
M, em
meio tampão BR, pH 5,0, com f = 50 Hz, a = 40 mV, ∆Es = 4 mV,
GCE/CNT (linha azul), GCE/CNT/Lac (linha vermelha).
O comportamento eletroquímico apresentado nas figuras acima indicadas mostram que a
enzima Lac apresentou elevada atividade para a catálise do processo de oxidação do
substrato AMP, sendo o perfil obtido caraterístico do processo de oxidação-redução da
ação catalítica da enzima Lac exercida sobre o substrato[46]
.
O comportamento eletroquímico do processo de oxidação do substrato corresponde a um
processo redox que ocorre em duas etapas. A primeira é rápida e está relacionada com
formação de um derivado de imino-quinona (Figura 17)[42, 45]
, o qual é representado por um
par redox quase reversível e cujos potenciais de oxidação e redução foram registados em
0,250 V (processo anódico) e -0,05 V (processo catódico), respetivamente.
-0.400 -0.300 -0.200 -0.100 0 0.100 0.200 0.300 0.400 -4 -0.90x10
-4 -0.80x10
-4 -0.70x10
-4 -0.60x10
-4 -0.50x10
-4 -0.40x10
-4 -0.30x10
-4 -0.20x10
-4 -0.10x10
0
E / V
i / A
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
77
OH
NH2
- 2e-
- 2H+
O
NH
4-aminofenol imino-quinona
Figura 17: Primeira etapa do processo de oxidação do AMP com formação de imino-quinona. Adaptado de
[45].
Este composto intermediário (imino-quinona) é facilmente hidrolisado a quinona a pH 5,0.
A segunda etapa eletroquímica é lenta e irreversível e corresponde à conversão da p-
benzoquinona em p-hidroquinona, por um processo envolvendo 2H+ e 2e
- (Figura 18).
É por esta razão que o par redox observado no início do processo de oxidação do AMP foi
suprimido e um novo processo de redução foi observado a -0,05V.
Figura 18: Segunda etapa do processo de oxidação do AMP, em que a imino-quinona formada na primeira
etapa e por libertação de amónia forma p-benzoquinona e esta é convertida em p-hidroquinona. Adaptado de
[45].
O pico a -0,05V foi usado como sinal eletroquímico para monitorizar a eficiência do
processo catalítico do sistema enzimático proposto e para a quantificação dos pesticidas.
Os resultados do presente trabalho confirmam resultados de outros autores, nomeadamente
que os CNT são um excelente suporte para a imobilização da Lac, graças às propriedades
eletroquímicas anteriormente referidas[4, 42, 97]
.
+ 2 H+
p-hidroquinona
OH
OH
+ 2e-
O
NH
+ H3O+
O
O
imino-quinona p-benzoquinona
+ NH3(g)
RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________________________
78
Embora se tenham obtido também bons resultados com a eletrodeposição do Gr sobre o
GCE, dado que o processo do AMP foi representado por um par redox bem definido,
optou-se pela deposição por gotejamento de CNT devido à maior sensibilidade obtida.
Acresce ainda que, com a continuação dos ensaios, verificou-se que ocorria a lixiviação da
enzima no GCE/Gr. A mesma ocorrência foi constatada por Ribeiro et al. (2014)[46]
,
quando imobilizaram a Lac no elétrodo de ouro modificado com AuNPs para detetar FMT
em frutos.
4. Otimização dos parâmetros voltamétricos
Os parâmetros que afetam a resposta eletroquímica por SWV (frequência, amplitude e
incremento de potencial) foram avaliados por forma a obter uma maior sensibilidade do
método.
Os ensaios foram realizados com o GCE/CNT/Lac na solução eletrolítica de AMP
5,83×10-5
M em meio de tampão BR a pH 5,0. A resposta foi avaliada com base no valor
máximo obtido para o pico da intensidade de corrente.
Os resultados obtidos para a frequência (f) na gama de 10 a 100 Hz indicam que o aumento
da f provoca o aumento na Ip até 50 Hz; acima deste valor, verifica-se um decréscimo de Ip
com o aumento da f (Figura 19).
Figura 19: Variação da corrente do pico de redução do AMP 5,83x10-5
M (em
meio tampão BR, pH 5,0, com a = 40 mV, ∆Es = 4 mV) e com frequência (10 a
100 Hz) obtido com o GCE/CNT/Lac.
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
79
A aparente reversibilidade do processo redox pode ser alterada pela variação da f. A
corrente do pico aumenta quando aumenta a frequência até 50 Hz, diminuindo a corrente
do pico acima deste valor. O processo quase reversível pode ser confirmado pela relação
obtida da razão entre o pico da corrente e metade dos valores da frequência (Ip/f1/2
), a qual
é exibida pela curva parabólica. De acordo com Komorsky-Lovrić e Lovrić, o valor
máximo da curva é chamado “quasi-reversible maximum” e depende dos valores do
coeficiente de transferência de carga[8]
.
A influência da amplitude (a) no sinal analítico foi estudada no intervalo de 10 a 100 mV,
obtendo-se um aumento dos valores da Ip até à amplitude de 40 mV (Figura 20). Acima
deste valor continuou a haver aumento dos valores da Ip, embora sem contribuição
adicional de sensibilidade para efeitos analíticos.
Estes resultados estão de acordo com a teoria da SWV para sistemas irreversíveis. Ribeiro
et al. (2014)[46]
também referiram a amplitude de 40 mV como a mais adequada para os
ensaios eletroquímicos da quantificação de um carbamato com um biossensor modificado
com Lac.
Figura 20: Variação da corrente do pico de redução do AMP 5,83x10-5
M (em
meio tampão BR, pH 5,0, com f = 50 Hz e ∆Es = 4mV) com a amplitude (10 a
100 mV), obtido com o GCE/CNT/Lac.
-1,40E-05
-1,20E-05
-1,00E-05
-8,00E-06
-6,00E-06
-4,00E-06
-2,00E-06
0,00E+00
0 20 40 60 80 100
I/µ
A
Amplitude (mV)
RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________________________
80
Como a intensidade de corrente é proporcional à velocidade de varrimento, o aumento no
valor do incremento de potencial (ΔEs) pode contribuir, de forma positiva, para a
sensibilidade da técnica analítica. Foi avaliado a variação do ∆Es entre 1 e 10 mV.
Pela Figura 21 pode-se observar um aumento do valor da Ip até 4 mV; acima deste valor
verificou-se a diminuição do valor da Ip, possivelmente devido a limitações cinéticas da
reação.
Figura 21: Variação da corrente do pico de redução do AMP 5,83x10-5
M (em
meio tampão BR, pH 5,0, com f = 50 Hz, a = 40 mV e com incremento de
potencial (1 a 10 mV) obtido com o GCE/CNT/Lac.
Atendendo ao melhor sinal eletroanalítico, os parâmetros voltamétricos de SWV
considerados ótimos foram uma f de 50 Hz, uma a de 40 mV e um ∆Es de 4 mV.
Estes parâmetros foram aplicados para as subsequentes eletroanálises da quantificação do
tiodicarbe e do aminocarbe e para a aplicação do biossensor enzimático a amostras de
laranja.
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
81
5. Otimização do tempo de incubação da lacase
Como o processo de inibição da enzima está diretamente relacionado com a sua atividade
cinética[42]
e, considerando que o pico analítico do substrato (-0,05V) resulta da etapa da
redução da p-benzoquinona em p-hidroquinona e como esta etapa é lenta, condiciona a
velocidade da reação[45]
. Assim, foi otimizado o tempo de incubação para a preparação da
superfície do biossensor. Foram feitas medições eletroquímicas por CV e SWV aos 0, 15,
30, 45 min. e seguidamente de 5 em 5 min. até aos 80 min.
A Tabela 7 mostra os tempos de incubação e os respetivos valores de Ip após o contato do
biossensor enzimático (GCE/CNT/Lac) com o substrato AMP 5,83×10-5
M em meio de
tampão BR, a pH 5,0, com f=50 Hz, a=40 mV, ∆Es=4 mV e na gama de potencial de 5,0 a
-4,0 V.
Tabela 7: Valores da intensidade de corrente do pico e os respetivos
tempos de incubação do GCE/CNT/Lac.
Tempos de incubação (min.) Ip (×10-5
) µA
0 -1,67
15 -2,38
30 -2,46
45 -2,55
50 -2,59
55 -2,56
60 -2,60
65 -2,59
70 -2,62
75 -2,61
80 -2,60
Da análise dos valores da tabela, verifica-se que a intensidade de corrente do pico vai
aumentando com o aumento do tempo de incubação, até 45 min. Para tempos superiores
verifica-se que os valores de Ip permanecem aproximadamente constantes.
RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________________________
82
A Figura 22 mostra os voltamogramas por SWV obtidos neste ensaio para os tempos de
incubação de 0, 15, 30, 45 e 60 min.
Figura 22: Voltamogramas do GCE/CNT/Lac obtidos com vários tempos de
contato do elétrodo com o substrato AMP 5,83x10-5
M, em meio tampão BR,
pH 5,0, f = 50 Hz, a = 40 mV, ∆Es = 4 mV. Tempos: 0, 15, 30, 45 e 60 min.,
linha preta, verde, azul, azul claro, vermelha, respetivamente.
Assim, e atendendo ao sinal eletroquímico, o tempo selecionado para
incubação/estabilização da enzima antes das aplicações analíticas do biossensor construído
(GCE/CNT/Lac) foi de 45 min.
No trabalho de Oliveira, T. et al. (2013)[42]
onde desenvolveram um biossensor enzimático
baseado em MWCNT modificado com Lac para a quantificação de pirimicarbe,
constataram tempos aproximadamente iguais para a incubação da Lac (60 min).
-0.25 -0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0 0.05 0.10 0.15 -4 -0.95x10
-4 -0.90x10
-4 -0.85x10
-4 -0.80x10
-4 -0.75x10
-4 -0.70x10
-4 -0.65x10
-4 -0.60x10
-4 -0.55x10
-4 -0.50x10
-4 -0.45x10
E / V
i / A tempo
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
83
6. Quantificação dos pesticidas
6.1. Tiodicarbe
A deteção dos pesticidas empregando biossensores enzimáticos é realizada devido ao
princípio de inibição da atividade da enzima imobilizada no elétrodo[46]
. Assim, e após a
otimização dos parâmetros voltamétricos, o biossensor desenvolvido GCE/CNT/Lac foi
usado para a quantificação indireta do tiodicarbe usando o pico eletrocatalítico,
correspondente à redução da imino-quinona.
A quantificação foi baseada na capacidade de inibição da reação catalítica do substrato
(5,83×10-5
M de AMP) pelo sistema enzimático, sendo que a corrente de redução medida é
proporcional à concentração de tiodicarbe adicionada à célula eletroquímica.
Inicialmente registou-se a corrente do pico do processo de redução do AMP sobre elétrodo
modificado com Lac em tampão BR, a pH 5,0, sem a presença do tiodicarbe. Em seguida,
foi adicionado à célula eletroquímica, sucessivamente 10 µL da solução de tiodicarbe de
concentração 0,01M, e após homogeneização da solução, foi registada a intensidade de
corrente do pico de cada adição.
Os voltamogramas obtidos para as diferentes concentrações de tiodicarbe (2,82; 5,64; 8,46;
11,3; 14,1 µM) estão representados na Figura 23 a.
Construiu-se uma curva analítica usando a relação entre a percentagem de inibição (% IR)
e a concentração de tiodicarbe (Figura 23 b).
RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________________________
84
(a)
(b)
Figura 23: (a) Voltamogramas obtidos por SWV com o GCE/CNT/Lac
na presença de AMP 5,83x10-5
M em meio tampão BR, pH 5,0, para
concentrações de tiodicarbe na gama de 2,82-14,1 µM. (b) Curva
analítica obtida a partir da percentagem de inibição enzimática e a
concentração de tiodicarbe para o GCE/CNT/Lac.
Foi obtido um coeficiente de correlação de r2 = 0,977. Os resultados indicaram que houve
diminuição da Ip, referente ao processo de redução de AMP, o que confirma que o
tiodicarbe possui a capacidade de inibir a atividade enzimática da Lac.
y = 1,22x + 28,98 R² = 0,977
20
25
30
35
40
45
50
0 5 10 15
%IR
[tiodicarb] µM
-0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0 0.05 0.10 0.15 0.20 -3 -0.28x10
-3 -0.27x10
-3 -0.26x10
-3 -0.25x10
-3 -0.24x10
-0.23x10-3
E / V
i / A
inibição
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
85
A reta da curva analítica foi utilizada para determinar o limite de deteção (LOD) e o limite
de quantificação (LOQ).
Para o tiodicarbe os valores de LOD e LOQ foram de 0,002 mg kg-1
e 0,008 mg kg-1
,
respetivamente.
O MRLs do tiodicarbe para frutas é de 0,05 mg kg-1
, segundo os dados da EU para
MRLs[64]
. Atendendo ao LOD calculado para os resíduos de tiodicarbe nas laranjas e ao
valor de MRLs, o biossensor desenvolvido permite a aplicação deste no controlo da
qualidade de frutas e vegetais.
Não foram encontrados na literatura estudos sobre a quantificação de tiodicarbe baseado
num biossensor modificado com a enzima Lac.
Face aos resultados do presente estudo, o biossensor proposto GCE/CNT/Lac pode ser um
dispositivo alternativo para a deteção de tiodicarbe em frutas, representando este facto um
grande contributo para a segurança alimentar.
6.2. Aminocarbe
O biossensor desenvolvido GCE/CNT/Lac também foi usado para a quantificação do
aminocarbe pelo mesmo processo de inibição da redução do AMP. Após a adição de
aminocarbe à célula eletroquímica contendo a solução padrão de AMP houve diminuição
do valor de Ip; este facto está relacionado com o efeito inibidor do pesticida sobre a
atividade da enzima.
Construiu-se uma curva analítica também com base na % IR e na concentração de
aminocarbe, usando as condições otimizadas.
Foram realizadas medições com 5 concentrações diferentes de aminocarbe (4,8; 9,6; 14,4;
19,2 e 24,0 µM). O coeficiente de correlação foi de r2 = 0,966. A curva analítica obtida
para o aminocarbe e os respetivos voltamogramas das diferentes concentrações estão
representados na
Figura 24.
RESULTADOS E DISCUSSÃO_____________________________________________________________
86
(a)
(b)
Figura 24: (a) Voltamogramas obtidos por SWV com o GCE/CNT/Lac,
na presença de AMP 5,83x10-5
M em meio tampão BR, pH 5,0 para
concentrações de aminocarbe na gama de 4,8-24,0 µM. (b) Curva
analítica obtida a partir da percentagem de inibição enzimática e a
concentração de aminocarbe para o GCE/CNT/Lac.
A reta da curva analítica foi utilizada para determinar o LOD e o LOQ. O LOD encontrado
para o aminocarbe foi de 0,006 mg kg-1
e o LOQ de 0,019 mg kg-1
.
O valor máximo permitido para o aminocarb é de 0,05 mg kg-1
em frutos e vegetais, de
acordo com a regulamentação alimentar e o estabelecido para os MRLs exigido pela EU.
O LOD encontrado para o aminocarbe é inferior a esse valor, logo do biossensor
desenvolvido permite a aplicação e a quantificação de resíduos de aminocarbe em frutas.
y = 1,87x + 2,97 R² = 0,966
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25 30
%IR
[aminocarb] µA
-0.20 -0.15 -0.10 -0.05 0 0.05 0.10 0.15 0.20 -4
-0.98x10
-4 -0.93x10
-4 -0.88x10
-4 -0.83x10
-4 -0.78x10
-4 -0.73x10
-4 -0.68x10
-4 -0.63x10
E / V
i / A
inibição
_____________________________________________________________RESULTADOS E DISCUSSÃO
87
Trabalhos eletroanalíticos com biossensores enzimáticos para a deteção de aminocarbe
ainda são restritos. Até ao momento não se conhecem estudos relacionados com a
determinação de aminocarbe com a utilização de biossensores enzimáticos modificados
com a enzima Lac.
7. Aplicação do biossensor a amostras de laranja
O biossensor desenvolvido (GCE/CNT/Lac) foi aplicado à análise dos pesticidas estudados
(tiodicarbe e aminocarbe) em extrato de laranjas. Utilizou-se QuEChERS como método
para extração, indicado para a aplicação em matrizes alimentares como frutas[157]
. Esta
metodologia é económica, simples, rápida, amiga do ambiente, sem grande consumo de
energia e de solventes, com elevado rendimento na recuperação dos analitos, sendo um dos
principais procedimentos de extração utilizados na análise de alimentos naturais[158, 159]
.
A exatidão da metodologia proposta foi avaliada por ensaios de recuperação realizados a 3
níveis de fortificação, de concentração 1,0-3,0 mg kg-1
, para os dois pesticidas, e pelo
método de adição de padrão. Os dados percentuais de recuperação (Rec %) foram de 99,1
% para o tiodicarbe e 99,8 % para o aminocarbe.
Os resultados exibem valores satisfatórios, indicando que o método eletroanalítico
proposto possui elevada exatidão para a quantificação dos pesticidas estudados.
Estes resultados mostram que a metodologia desenvolvida, aplicando as condições
otimizadas, pode ser útil para a pesquisa de resíduos de pesticidas, nomeadamente na
implementação de programas de segurança alimentar. Salienta-se que o biossensor
desenvolvido pode ser utilizado para análises de carbamatos em campo, devido ao rápido
procedimento de preparação e de aplicação.
CAPÍTULO V
CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS
_________________________________________________CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS
91
Conclusões e perspetivas futuras
Os carbamatos são pesticidas considerados pouco tóxicos para os organismos não alvo.
Contudo, a persistência de resíduos destes compostos nos solos, na água e nos alimentos
pode constituir, mesmo assim, um perigo para a saúde humana. Este facto salienta a
importância da monitorização constante destes resíduos a vários níveis da organização
biológica.
O presente trabalho pretendeu estudar a toxicidade in vivo de dois carbamatos, o tiodicarbe
e o aminocarbe. Foram usados ratos Wistar para que, num curto espaço de tempo, fosse
possível compreender os efeitos tóxicos destes pesticidas. Concluiu-se que ambos os
carbamatos apresentam toxicidade subaguda.
No estudo realizado com o tiodicarbe, os parâmetros hematológicos estudados nos grupos
expostos a este carbamato, não apresentaram alterações estatisticamente significativas
comparativamente com o grupo controlo.
Nos parâmetros bioquímicos verificou-se a redução do Col T nos ratos expostos à dose de
40 mg kg-1
, após 10 dias. Os valores da enzima AST aumentaram nos grupos sujeitos às
doses de 10 e 20 mg kg-1
ao fim de 30 dias de exposição ao pesticida. Os valores da ALP
reduziram no grupo sujeito a 20 mg kg-1
após 30 dias. Os outros parâmetros como o Col T
e a Ur diminuíram no grupo sujeito a 10 mg kg-1
e as PT e a Cr nos grupos tratados com 10
e 20 mg kg-1
, ao fim de 30 dias.
Histologicamente observaram-se danos em múltiplos órgãos (hemorragia e vacuolização
difusa no fígado, desorganização glomerular e degenerescência tubular, perda celular no
cortex do timo e alterações degenerativas no testículo). Estas alterações foram mais
evidentes nos grupos de ratos sujeitos à dose mais elevada (40 mg kg-1
).
O estudo imunológico revelou o aumento dos linfócitos, especialmente os linfócitos T, no
sangue do grupo de ratos sujeitos à dose de 40 mg kg-1
.
No estudo dos parâmetros hematológicos dos animais expostos ao aminocarbe verificou-se
uma redução do número de leucócitos, após 7 dias de exposição no grupo sujeito à dose de
40 mg kg-1
e em todos os grupos após 14 dias.
CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS_________________________________________________
92
O estudo dos parâmetros bioquímicos revelou a diminuição da atividade da AChE em
todos os grupos após 24h de exposição ao aminocarbe e o aumento da ALP após 7 dias. Os
valores da Ur e da Cr aumentaram em todos os grupos no fim do estudo.
Ao nível histológico observaram-se focos de hemorragia no fígado e no rim em todos os
grupos experimentais sujeitos aos carbamatos, com maior evidência nos grupos de ratos
sujeitos à dose mais elevada.
Num trabalho futuro, e uma vez que comprovadamente os pesticidas causam problemas na
saúde humana, seria importante estudar os efeitos in vivo dos carbamatos a nível dos
mecanismos moleculares, dado que estes interferem diretamente com o DNA. Estes
mecanismos são os primeiros a serem ativados nas doenças crónicas no contexto de
carcinogénese e teratogénese[1]
. Neste caso, o período de estudo deveria ser alargado, de
forma a explorar os efeitos crónicos.
Estudar os efeitos protetores das plantas medicinais sobre os efeitos toxicológicos dos
carbamatos, seria outra abordagem interessante.
Este trabalho também permitiu o desenvolvimento de um biossensor enzimático que foi
aplicado com êxito na determinação eletroanalítica do tiodicarbe e do aminocarbe em
amostras de laranjas. Embora estas tenham uma matriz complexa, foi possível detetar e
quantificar os dois carbamatos estudados, devido à sensibilidade e seletividade do
biossensor, às vantagens da SWV e ao método de extração usado (QuEChERS).
O uso de nanomateriais como componentes da plataforma de bioreconhecimento tem
promovido um avanço na eletroquímica, nomeadamente na construção de biossensores.
Estes permitem melhorar as propriedades elétricas, aumentando a eficiência do elétrodo na
transferência do sinal eletroquímico, resultando em boa sensibilidade e especificidade.
No presente trabalho foram usados os CNT e a Lac na construção do biossensor; estes
elementos permitiram obter uma boa sensibilidade do biossensor.
Para o tiodicarbe, o LOD foi de 0,002 mg kg-1
e o LOQ de 0,008 mg kg-1
e para o
aminocarbe um LOD de 0,006 mg kg-1
e LOQ de 0,019 mg kg-1
.
Nos ensaios de recuperação obteve-se 99,1% para o tiodicarbe e 99,8% para o aminocarbe.
_________________________________________________CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS
93
A metodologia de análise desenvolvida com o biossensor enzimático GCE/CNT/Lac foi de
fácil aplicação e com custos reduzidos, tendo-se obtido baixos LOD e LOQ com boa
precisão.
A deteção de resíduos de pesticidas nos alimentos é hoje em dia um objetivo prioritário, de
forma a garantir a segurança e a qualidade dos alimentos, visando a proteção da saúde dos
consumidores. Assim, o biossensor GCE-CNT/Gr/Lac poderá ser uma ferramenta
promissora para a análise do tiodicarbe e do aminocarbe, podendo ser aplicado no controlo
alimentar de resíduos em citrinos, constituindo uma alternativa aos métodos convencionais.
A análise de pesticidas em amostras alimentares continua a constituir um desafio analítico,
pelo que, em trabalhos futuros seria importante continuar os ensaios, testando a
estabilidade do biossensor enzimático e aplicá-lo a outras matrizes alimentares como
legumes.
O desenvolvimento de biossensores com alta sensibilidade e especificidade requerem a
combinação de áreas multidisciplinares, como a química, a bioengenharia, a medicina e
tantas outras. Uma vez que os nanomateriais, nomeadamente os CNT, são um material que
apresenta vantagens na construção de biossensores enzimáticos, será pertinente a futura
aplicação à biomedicina, testando-o por exemplo na deteção de marcadores biológicos de
doenças. Avanços nesta área podem no futuro ser úteis no diagnóstico médico, no
tratamento e monitorização das doenças, no desenvolvimento de métodos de prevenção e
no fabrico de drogas mais eficazes.
95
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