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FFI0772 – Planejamento de Moléculas BioativasAula Prática 03: Ensaio Virtual – Prof. Rafael V. C. Guido/Prof. Adriano D. Andricopulo

ENSAIO VIRTUAL E A IDENTIFICAÇÃO

DE MOLÉCULAS BIOATIVAS 1. Introdução A fantástica evolução da Química Medicinal nas últimas décadas foi acompanhada por avanços científicos significativos que levaram a descoberta de fármacos com notáveis aplicações terapêuticas. A enorme exigência de produtividade imposta pelos níveis de investimento em pesquisa e desenvolvimento (P&D) levou as maiores companhias farmacêuticas do mundo a adotar a inovação como estratégia principal de reorganização empresarial. Esse cenário resultou em uma revolução no processo de descoberta e desenvolvimento de novos fármacos e, naturalmente, no fortalecimento da Química Medicinal moderna como centro desse processo.

No paradigma atual de planejamento de fármacos destaca-se o constate investimento em novas tecnologias envolvendo a quimio- e bioinformática para aumentar a eficiência do processo de descoberta de novas entidades químicas (NCEs, do inglês, new chemical entities). Um exemplo marcante desses investimentos é a triagem automatizada em larga escala (HTS, do inglês, high-throughput screening). Aliado a constate evolução da química orgânica sintética, representada pelos avanços da química combinatória, o HTS surgiu com a promessa de um método eficiente e robusto para a identificação de novas moléculas bioativas. Contudo, a expectativa inicial não foi contemplada da maneira esperada, devido, principalmente, aos altos custos inerentes ao processo (totalmente automatizado) e aos altos índices de falso-positivos (i.e., compostos agregantes que apresentavam atividade biológica nos ensaios HTS, mas não nos ensaios posteriores de otimização). Esse cenário propiciou o desenvolvimento de novos métodos, como o ensaio virtual (VS, do inglês, virtual screening). Essa estratégia surgiu como alternativa para a identificação de novos ligantes bioativos, ganhando importante espaço nos programas de P&D de fármacos.

Por definição, o VS envolve a análise in silico de grandes bases de dados de compostos com a finalidade de identificar moléculas que possam ser obtidas comercialmente ou por síntese orgânica, para avaliação in vitro da atividade biológica. O processo de VS envolve uma série de etapas com diferentes níveis de complexidade, os quais serão abordados de modo objetivo nas próximas seções, visando-se o estabelecimento dos princípios e fundamentos envolvidos nas diferentes fases do processo (Figura 1).

Figura 1. Esquema geral do processo de VS. (A) Alvo molecular. (B) Base de dados de compostos. (C) Método computacional para a identificação de candidatos a moléculas bioativas (hits). (D) Ensaio experimental para identificação de moléculas bioativas.

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2. Estratégias de VS A VS pode ser realizada em dois cenários distintos: (i) baseado nas informações sobre o alvo-receptor (SBVS, do inglês, structure-based virtual screening) e (ii) baseado na estrutura de uma molécula bioativa (LBVS, do inglês, ligand-based virtual screening). A escolha da estratégia dependerá do objetivo e disponibilidade de informações sobre o sistema biológico em estudo, ou seja, caso a estrutura 3D do alvo molecular de interesse seja conhecida, a estratégia de SBVS é atrativa para identificar pequenas moléculas que apresentem complementaridade estereoquímica e eletrônica com os resíduos de aminoácidos que formam o sítio de ligação na proteína-alvo. Por outro lado, caso a informação estrutural sobre o alvo-receptor não esteja disponível, pode-se aplicar os métodos de LBVS para explorar o espaço químico-biológico definido pela molécula bioativa, e assim identificar novos compostos que apresentem estruturas similares ou características farmacofóricas atrativas para o processo de P&D de fármacos. Independentemente da estratégia adotada, alguns parâmetros importantes devem ser observados no planejamento e execução do experimento de VS. Entre eles, destaca-se:

Disponibilidade de um bioensaio padronizado para avaliação precisa e reprodutiva das propriedades biológicas dos compostos selecionadas no VS;

A classificação e os critérios de seleção devem ser realizados de modo claro e padronizados para que sejam úteis na identificação de compostos bioativos, e paralelamente, evitem a seleção de compostos falso-positivos;

Os compostos selecionados devem estar fisicamente disponíveis, em quantidade apropriada e pureza elevada (> 95%) para os ensaios in vitro.

O processo de VS inclui a preparação prévia do alvo receptor (SBVS) ou do ligante bioativo (LBVS) e, paralelamente, a organização da base de dados de compostos. Uma vez preparado e organizado os pré-requisitos básicos, realiza-se o VS, e posteriormente, analisa-se os resultados para a seleção e aquisição dos candidatos a moléculas bioativas. 3. Organização de base de dados de compostos Um grande número de base de dados contendo milhares, ou até milhões, de moléculas estão disponíveis para a realização de VS. Geralmente, diversas empresas que comercializam compostos organizam seu repertório de moléculas em base de dados que podem ser adquiridas ou consultadas livremente. Entre as diversas bases de dados disponíveis, destaca-se a “ZINC database” (http://zinc.docking.org). Essa base de dados organizada por pesquisadores da UCSF nos Estados Unidos reúne mais de 20 milhões de moléculas do catálogo de várias empresas. Além disso, essa base de dados é direcionada principalmente ao VS, oferecendo ao usuário diversos métodos de pesquisa, subconjuntos de moléculas pré-selecionadas de acordo com propriedades físico-químicas e ferramentas para personalização de subconjuntos de acordo com os critérios do usuário. Uma das principais vantagens da ZINC, além de todas as funcionalidades e facilidades para o usuário, reside no fato que ela é de acesso livre e gratuito. Devido a sua organização e qualidade, diversas companhias possuem seus catálogos disponíveis na ZINC.

Um aspecto estratégico nas campanhas de VS é a aplicação de filtros moleculares capazes de diminuir o número extremamente elevado de compostos em base de dados. Nesse contexto, compostos que apresentam propriedades líder-similar (do inglês, lead-like) ou fármaco-similar (do inglês, drug-like) são comumente desejados para compor a base de dados para o VS. Esses subconjuntos de compostos já se encontram pré-selecionados na ZINC, facilitando assim a aquisição das moléculas de interesse. De um modo geral, as principais diferenças entre compostos líderes e fármacos estão no tamanho e complexidade das estruturas, características estas decorrente das várias modificações moleculares a que são submetidos os compostos-líderes até se converterem em NCEs com aplicações terapêuticas. Portanto, para os estudos de VS, moléculas menores e mais simples são priorizadas para compor a base de dados, uma vez que diversas modificações serão realizadas na estrutura moléculas dos ligantes bioativos identificados (do inglês, hits) durante os estudos de SAR para otimização de propriedades múltiplas.

Um dos filtros moleculares amplamente empregados para a organização de base de dados é conhecido como “regra dos 5”. Esse conceito, estabelecido por Lipinski e colaboradores, indica os parâmetros e limites que uma molécula deve possuir para apresentar biodisponibilidade quando administrada

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por via oral. Os estudos realizados por Lipinski e colaboradores consistiram em análises estatísticas padronizadas e significativas que indicaram que os fármacos administrados por via oral apresentavam:

Massa molecular < 500 CLogP < 5 Número de átomos doadores de ligação de hidrogênio < 5 Número de átomos aceptores de ligação de hidrogênio < 10

Essas propriedades podem ser facilmente calculadas em programas de análise de moléculas e

utilizadas para a filtragem de base de dados para VS. Outros protocolos de filtragem são meramente variações simples da regra dos 5, que restringem ainda mais os limites previamente descritos, como é o caso dos filtros para seleção de compostos com características fragmento similar (do inglês, fragment-like) ou utilizam outras propriedades moleculares para selecionar moléculas para a base de dados (e.g., superfície polar acessível, número de ligações rotacionáveis, etc) 4. Docagem molecular

Uma das principais ferramentas empregadas nos estudos de VS é a docagem molecular (do inglês, molecular docking), ou simplesmente docagem. Esse método consiste, de forma geral, na predição do modo de ligação de pequenas moléculas (e.g., inibidores, agonistas, antagonistas) no sítio de ligação de macromoléculas alvo (e.g., enzimas, receptores, DNA) com subsequente avaliação e classificação dos modos de ligação propostos. A Figura 2 apresenta um esquema geral do processo de docagem molecular.

Figura 2. Componentes e etapas envolvidos no processo de docagem molecular.

O processo de docagem molecular pode ser dividido em duas etapas fundamentais. A primeira envolve a determinação do modo de ligação e a segunda, a predição da afinidade do ligante pelo sítio de interação. Para a identificação do modo de ligação de novos ligantes, os programas utilizam diferentes métodos de amostragem que atribuem flexibilidade às moléculas. Os métodos de amostragem podem ser classificados em três categorias principais: (i) métodos sistemáticos (e.g., construção incremental, amostragem conformacional); (ii) métodos aleatórios ou estocásticos (e.g., Monte Carlo, algoritmo genético) e (iii) métodos de simulação (e.g., dinâmica molecular e minimização de energia).

A etapa de predição da afinidade relativa de ligantes pelo sítio de ligação da macromolécula é realizada através de funções de pontuação (do inglês, scoring functions), que são desenvolvidas para avaliar e classificar os modos de ligação propostos na etapa anterior. Basicamente, as funções de pontuação podem ser agrupadas em três classes: (i) campos de força, baseados geralmente em métodos de mecânica molecular, capazes de quantificar a energia proveniente das interações ligante-receptor (e.g., G-score e D-score, implementados no pacote de programas SYBYL; Amber, implementado no programa Autodock; GOLDscore, implementado no programa GOLD); (ii) empíricas, com base no ajuste teórico de equações (regressão linear) que reproduzem dados experimentais (e.g., LigScore PLP, LUDI, F-Score, ChemScore e X-score); (iii) com base no conhecimento, que são funções que utilizam dados estatísticos dos potenciais de pares atômicos de interação, os quais são derivados de conjuntos de dados provenientes de complexos cristalográficos entre ligantes e proteínas (e.g., PMF e DrugScore).

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5. Ensaio virtual baseado na estrutura do alvo receptor (SBVS) O SBVS é caracterizado pela disponibilidade de informações 3D sobre o alvo molecular. A estrutura do alvo molecular pode ser adquirida do banco de dados de proteínas (PDB, do inglês, protein data bank) ou através da aquisição de dados cristalográficos ou de ressonância magnética nuclear (RMN) coletados em laboratórios especializados. Além disso, para os alvos moleculares que não possuem estrutura 3D definida por métodos experimentais, modelos robustos e de alta qualidade gerados por modelagem por homologia podem ser utilizados nos estudos de SBVS. Independente da origem dos dados, alguns parâmetros importantes devem ser avaliados antes de se utilizar a estrutura 3D para o SBVS. Por exemplo, no caso das estruturas cristalográficas, aspectos de qualidade estrutural como resolução, fatores Rfator e Rlivre e fator B (fator de temperatura) devem ser inspecionados e avaliados para a utilização nos estudos de SBVS. Em geral, estruturas de alta resolução (< 2 Å) apresentam erros menores, sendo mais atrativas para o emprego em SBVS. Contudo, este não é o único parâmetro que deve ser observado. A mobilidade conformacional de proteínas assume função importante nos processos de reconhecimento molecular. Portanto, a análise estrutural da mesma proteína obtida em complexo com diferentes ligantes ou em condições de cristalização distintas, oferece a oportunidade de se conhecer melhor a liberdade conformacional do alvo biológico e assim selecionar a conformação mais representativa, ou adequada, para o caso em estudo. Outro fator importante relacionado às mudanças conformacionais reside no fato que os resíduos de aminoácidos podem adotar diferentes rotâmeros estruturais. Nessa situação, a comparação estrutural de diversos complexos cristalográficos do alvo com ligantes diferentes auxiliam significativamente para a identificação dos possíveis rotâmeros e seleção daquele mais adequado para o caso em estudo. Finalmente, características químicas, como estado de protonação, tautomerismo, e rotação de ângulos diedros, devem ser avaliados para que se possa reproduzir o ambiente químico mais favorável para o processo de reconhecimento molecular e interação fármaco-receptor. Uma vez preparada a estrutura do alvo receptor, passa-se para a escolha do método de docagem molecular. Dentre os mais de 30 programas disponíveis, deve-se optar por aquele mais apropriado para o caso em estudo, entretanto, essa não é uma tarefa trivial, pois os programas diferem significativamente nas estratégias empregadas para a amostragem do sítio e nos métodos de pontuação dos modos de interação ligante-proteína gerados. Uma estratégia que auxilia na identificação do programa mais adequado consiste em utilizar moléculas que possuam propriedade biológica conhecida frente ao alvo molecular, bem como o modo de ligação elucidado. Com base nessas informações, realiza-se a docagem molecular do ligante conhecido com os programas disponíveis e em seguida, avalia-se entre os métodos testados aquele capaz de fornecer energia de interação e modo de ligação mais próximos dos dados observados experimentalmente.

A etapa final do processo de docagem molecular envolve a visualização e análise dos modos de interação selecionados. Apesar de algumas ferramentas computacionais auxiliarem na interpretação dos resultados, a intuição do químico medicinal é um componente essencial na transformação da informação gerada em conhecimento científico qualificado. Estruturas cristalográficas de receptores alvo em complexo com ligantes podem ser empregadas no processo de validação do modo de interação proposto pelo método de docagem molecular. O cálculo da raiz quadrada do desvio médio (rmsd, do inglês, root mean square deviation) pode ser usado como uma análise comparativa simples e rápida entre o modo de ligação predito da molécula em estudo e a conformação da estrutura cristalina. Essa técnica consiste no cálculo da distância mínima entre átomos correspondentes através da sobreposição estrutural das moléculas investigadas em relação a uma molécula de referência. O valor de rmsd é inversamente proporcional à similaridade entre os modos de interação, ou seja, quanto menor o valor de rmsd maior a semelhança das conformações e, consequentemente, melhor a predição do modo de ligação. Valores de rmsd < 2 Å (diferença entre a conformação predita e experimental) são considerados satisfatórios. A Figura 3 apresenta o modo de ligação predito pelos programas FlexX e GOLD em comparação com os dados experimentais do inibidor do NMDBA da enzima GAPDH de Leishmania mexicana.

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Figura 3. Estrutura cristalográfica do inibidor NMDBA (amarelo) no sítio ativo da GAPDH de L. mexicana (PDB ID 1I32), em comparação com as conformações preditas pelos programas FlexX (verde) e GOLD (magenta).

Visando-se estabelecer padrões mais consistentes na validação dos resultados gerados a partir das funções de pontuação, a pontuação por consenso (do inglês, consensus scoring) tem sido empregada com sucesso na classificação de moléculas promissoras. A pontuação por consenso apresenta como característica a análise e comparação de resultados gerados com diferentes métodos, como base para a seleção de compostos para avaliação biológica. Essa estratégia envolve a avaliação da pontuação do modo de ligação, seguido da combinação dos N primeiros compostos classificados por cada função de pontuação. Dessa forma, uma nova classificação é criada reunindo somente as moléculas mais bem classificadas de cada função, de forma consensual. A caracterização da diversidade química e a inspeção visual do modo de ligação, aliadas a intuição e experiência do químico medicinal, são componentes fundamentais para a seleção final das moléculas para avaliação in vitro frente ao alvo molecular do estudo. A viabilidade sintética de novos análogos e a avaliação preliminar de propriedades são fatores que podem também ser considerados nessa fase.

amarelo

magenta verde

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ROTEIRO DA AULA PRÁTICA Base de Dados de Compostos ZINC

1. Acessar o site da “ZINC database” a. Acessar o endereço http://zinc.docking.org

2. Realizar uma busca na base de dados por moléculas de acordo com as propriedades (Search>Properties):

200 ≤ Molecular Weight ≤ 300 -3 ≤ xLogP ≤ 0 -5 ≤ Net Charge ≤ 5 2 ≤ Rotable bonds ≤ 4 0 ≤ Polar Surface [Å2] ≤ 200 1 ≤ Hydrogen Donors ≤ 5 1 ≤ Hydrogen Acceptors ≤ 5 -400 ≤ Polar Desolvation [kcal/mol] ≤ 1 -100 ≤ Apolar Desolvation [kcal/mol] ≤ 40

a. Pressionar o RUN QUERY (parte superior da janela) b. Analisar os resultados

3. Verificar os subconjuntos da ZINC a. Acessar o menu (“pulldown”) SUBSETS>PROPERTY b. Analisar os subconjuntos disponíveis c. Verificar as características dos subconjuntos “drug-like” e “lead-like”

Base de Dados de Proteínas PDB

1. Acessar o site do “Protein databank” a. acessar o endereço http://www.pdb.org b. Acessar a página referente ao alvo molecular

i. Na parte superior da janela digitar o código “3GVU” no campo “PDB ID or text” ii. Analisar as características do alvo molecular (e.g., método de obtenção, resolução,

grupo espacial, valores de qualidade Rfree e Rfactor, presença de ligante) iii. Para baixar a estrutura no computador deve-se acessar o menu DOWNLOAD

FILES>PDB FILE (TEXT) Visualização do alvo molecular no Pymol

1. Abrir o arquivo 3GVU.pdb no pymol a. Em um shell de comando, executar o comando PYMOL e abrir o arquivo 3GVU.pdb

i. FILE>OPEN>3GVU.pdb ii. Observar a estrutura e analisar o conteúdo do arquivo

2. Observar a célula unitária a. No menu “S” (Show) referente ao objeto 3GVU acessar a opção CELL

3. Identificar o sítio de ligação do inibidor a. No menu “A” (Action) referente ao objeto 3GVU acessar a opção PRESET>LIGAND

SITES>MESH SURFACE Preparo da estrutura para docagem molecular

1. Carregar a molécula da proteína a. FILE>IMPORT FILE>3GVU.pdb>NO>OK b. Na seção “FILE OF TYPE” selecione “PDB” c. Selecione o arquivo 3GVU.pdb

2. Preparo da estrutura para docagem molecular a. BIOPOLYMER>PREPARE STRUCTURE>ADD HYDROGENS>OK b. Salvar a nova estrutura com os hidrogênios

i. FILE>EXPORT FILE>3GVU_H.pdb>SAVE

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1. o formato do arquivo deve ser PDB, ou seja, Format: PDB ii. Pressionar o botão “seta para baixo” ao lado do X vermelho /MOLECULE>ALL>OK

3. Preparo dos arquivos de entrada para a docagem molecular com o programa Surflex-Dock (SFXC)

a. APPLICATIONS>DOCKING SUITE>DOCK LIGANDS... Uma nova janela denominada Docking irá surgir

i. No campo DOCKING MODE selecionar “Surflex-Dock (SFXC)” ii. No campo FILE NAME preencher com “sitio_GX”, sendo X=1,2,3,4,etc e em

seguida pressionar a tecla DEFINE... e uma nova janela denominada Surflex-Dock – Define SFXC File irá surgir

iii. No campo “Protein Structure” selecionar “PDB”, em seguida pressionar “...” e selecionar o arquivo previamente preparado da proteína com os hidrogênios, ou seja, selecionar o arquivo “3GVU_H.pdb”

iv. Pressionar o botão “Prepare...” para o preparo da estrutura da proteína para a docagem molecular

v. Pressionar o botão “Remove Substructures...” para extrair os ligantes do sítio de ligação da proteína

vi. Na coluna OTHER (coluna central) selecionar as moléculas A/STI1001 e A/STI1002 e pressionar OK.

vii. Pressionar novamente o botão “Remove Substructures...” para extrair as moléculas de água do sítio de ligação da proteína

viii. Na coluna WATER (coluna da direita) selecionar todas as moléculas de água e pressionar OK.

ix. Ao final desse processo pressionar RETURN x. Na seção “Protomol Generation” selecionar “Ligand” (Mol2 File) e carregar o

arquivo “imatinib_xtal.mol2”. em seguida editar os parâmetros: 1. Threshold = 0.5 2. Bloat = 3

xi. Pressionar “Generate” Obs. O sítio de ligação será mapeado por sondas atômicas (e.g., CH4, C=O, N-H) definindo as características físico-químicas do sítio de ligação

xii. Novamente na janela Docking no campo LIGAND SOURCE selecionar “Mol2 File” e em seguida pressione “...” e selecione o arquivo “imatinib.mol2”. Este é o ligante que será utilizado para a docagem molecular no sítio previamente preparado

xiii. No campo Option pressione a função “Surflex-Dock”. Na seção “Results Optimization” > “Allow Protein Movement” assinalar as opções “Hydrogens” e “Heavy Atoms”

xiv. Na seção “Output Options” editar a opção: 1. “Maximum Number of Poses per Ligand” = 10

xv. Na seção “Reference Molecule” selecione a opção “Mol2 file” e carregue o arquivo “imatinib_xtal.mol2”. Pressione OK

xvi. Novamente na janela Docking desmarcar a opção “Perform CScore Calculations” xvii. No campo JOBNAME substitua “DockingRun” por “docking_GX”

xviii. Determinado os arquivos do ligante, da proteína alvo e do sítio de ligação têm-se todos os arquivos necessários para a docagem molecular, portanto, ainda na janela Docking pressione OK e o processo de docagem molecular terá início.

4. Análise dos resultados a. Ao final do processo de docagem uma nova janela denominada

Results Browser irá surgir. Nesta janela pode-se observar a pontuação (Score) da molécula segundo a função de pontuação do programa FlexX, em seguida, selecione “Lig Tbl” e então selecione o arquivo “imatinib_xtal”. Uma tabela contendo informações como ranqueamento, pontuação e valor de rmsd aparecerão para análise. Pressione CLOSE

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b. Para a análise estrutural dos resultados utilizaremos o programa Pymol, para tanto, em um shell de comando, executar o comando PYMOL

Tabela 1. Resultados da docagem molecular com o programa Surflex-Dock

Posição Pontuação (‐log KD)

Valor de RMSD(Å2)

Confôrmero

1 16.02 0.83

2 15.87 0.83

3 15.81 0.83

4 15.68 0.84

5 15.46 0.84

6 15.40 0.84

7 15.35 0.84

8 15.30 0.88

9 14.98 0.88

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