Espectrometria de Massas e Proteomica

Espectrometria de massas e protemica

Diogo Ribeiro Demartini

Espectrometria de massas e protemica BCM13042 - Fundamentos de Anlises de Protenas (2011/2)

Dr. Diogo Ribeiro Demartini | [email protected]

Laboratrio de Protenas Txicas

Centro de Biotecnologia e Departamento de Biofsica - UFRGS



1. Espectrometria de massas a) Histrico; b) Fundamentos bsicos; c) Componentes e tipos de equipamentos; d) Tipos de ionizao; e) Tipos de fragmentao; f) Deteco;

2. Protemica

a) Preparo de amostras (2D, 1D, GeLC, HPLC, etc...); b) Abordagens (Botton Up & Top Down, fosfo, PTM); c) Fragmentao de peptdeos; d) Protemica quantitativa;

Introduo



1.a - Histrico

Prof. Charley Staats



Medida da relao massa/carga de um on

Diferentes de outras tcnicas, MS no envolve uma regio especfica do espectro eletromagntico;

massa/carga (m/z): massa do on / carga do on 1 unidade de massa atmica = 1 Da = 1/12 massa 12C. 1 kDa = 1000 amu

1.b - Fundamentos bsicos



0

2000

4000

6000

8000

Coun

ts

2840 2845 2850 2855

Mass (m/z)

Resolution = 14200

Resolution = 4500

Resolution =18100

1.b - Fundamentos bsicos

Prof. Charley Staats



1.c Componentes e tipos de equipamentos

IONIZAO DETECO ANLISE

Electron Ionization (EI)

Chemical Ionization (CI/APCI)

Photo-ionization (APPI)

Electrospray (ESI)

Matrix-assisted Laser Desorption (MALDI) Field Desorption (FD)

Plasma Desorption (PD)

Fast atom bombardment (FAB)

High-temperature Plasma (ICP

Sector Mass Analyzers (Magnetic and Electrostatic) Quadrupole Analyzers

Ion Traps

Ion Cyclotron Resonance

Time-of-Flight

Adaptado de Villanova University

MCP Microchannel Plate Detectors

http://www.rmjordan.com/jpegs/40mmmcp.jpg



Aebersold R, Mann M. 2003. Mass spectrometry-based proteomics. Nature 422, 198-207.

A MONTAGEM DO EQUIPAMENTO FEITA ATRAVS DA COMBINAO DOS COMPONENTES





IONIZAO DETECO ANLISE

MALDI

ESI

DESI

TOF

Q

Qq

QQQ

LTQ

SELDI



1.d- Tipos de ionizao MALDI (dessoro)

MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization)

The technique which we now know as matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) was developed simultaneously in two laboratories in 1987. The first report of high mass ions (above m/z 10,000) was a paper presented by Koichi Tanaka of the Shimadzu Corporation (Kyoto, Japan) at the Second Japan-China Joint Symposium on Mass Spectrometry, held September 15-18, 1987 in Takarazuka, Japan. Using a pulsed N2 laser (337 nm) and a time-of-flight mass spectrometer equipped with a coaxial reflectron, they recorded molecular ions at m/z 34,529 from carboxypeptidase-A dissolved in a slurry of glycerol and an ultra-fine metal powder. In addition, they reported a mass spectrum of lysozyme (MW 14,307) containing multimeric ions up to the pentamer recorded at m/z 71,736. At the same time, Michael Karas and Franz Hillenkamp from the University of Muenster (Germany) had developed a matrix-assisted technique using a frequency-quadrupled (266 nm) Q-switched Nd:YAG laser to desorb intact molecular ions from proteins dissolved in matrix solution containing nicotinic acid. Their first high mass results were reported at the International Mass Spectrometry Conference (IMSC) in Bordeaux, France in August 1988, and included molecular ions for bovine serum albumin observed in their mass spectrum at m/z 66,750. Results from both of these groups were first published in 1988, followed by a number of other reports by Hillenkamp and Karas for proteins with molecular weights in excess of 100 kDa. Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida, Y; Yoshida, T., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2 (1988) 151-153. Karas, M.; Hillenkamp, F., Anal. Chem. 60 (1988) 2299-2301 Skoog. Principles of Intrumental Analysis. 1998. 5th Ed.




Laser

placa M

A

TRASFERNCIA DE ENERGIA ENTRE A MATRIZ E O ANALTO

AMBOS VOOAM!!




http://bioms.chem.uu.nl/index.php/education/open-access-master-courses




on [M+H]+ Menos sensvel a contaminantes Sensibilidade: fentomol Anlise high-troughput (rpido e relativamente fcil)



1.d- Tipos de ionizao ESI (fase gasosa)

Mtodo adequado para anlise de molculas termolbeis, como protenas. O processo de ionizao das molculas ocorre pela nebulizao de gotculas (nanolitros) de uma soluo em um campo eltrico intenso, formando gotculas altamente carregadas. Quando o solvente evapora, formam-se ons moleculares de simples ou mltiplas cargas. Podem ser formados ons (-) ou (+), de acordo com o campo elctrico aplicado. No modo positivo, observam-se adutos alcalinos (protonados) dos analitos e no modo negativo, os ons so desprotonados

(M + nH)n+




1- formao de microgotculas; 2- evaporao do solvente (gs)- rompimento do limite de Rayleigh; 3- ionizao (formas multicarregadas) (M+nH)n+; 4- entrada no espectrmetro

Modo positivo (protonados) Modo negativo (deprotonados)




-Automatizao;

-Acoplamento a sistemas cromatogrficos;

-Gerao de ons multicarregados;



Electron Ionization (EI) bombardeamento; fragmentao excessiva;

Chemical Ionization (CI/APCI) tranferncia de prtons atravs do uso de gs (CH4)

Photo-ionization (APPI) ioniza o que ESI no consegue. Desorption-electrospray ionization (DESI) combinaod

MALDI e ESI (incidncia de laser e spray, em uma matriz sobre uma placa NO inerte)

Fast atom bombardment (FAB)- molculas lbeis. High-temperature Plasma (ICP) fluxos na ordem de 50

mL/min!!!!

1.d- Tipos de ionizao demais tipos de ionizao



1.d- Tipos de ionizao comparativo

http://www.chem.agilent.com/en-US



Por que fragmentar? Como fragmentar? Como analisar? Como DETECAR?

1.e- Tipos de FRAGMENTAO

CID: COLLISION INDUCED DISSOCIATION COLISO FSICA ENTRE O ON PRECURSOR E UM GS (Ar, He, N2);

EDT: ELECTRON TRANSFER DISSOCIATION REAGENTE ANINICO TRANSFERE ENERGIA PARA O PEPTDEO POSITIVO;

ECD: ELECTRON CAPTURE DISSOCIATION CONVERSO DO PEPTDEO IONIZADO PARA UMA FORMA RADICALAR

INFRARED MULTHIPHOTON DISSOCIATION ABSORO DE FTONS



1.f- Deteco

MCP: U$ 20.000,00 Do tamanho de uma moeda de UM REAL!!!



Tecido de origem Tratamento necessrio resposta biolgica; Remoo de contaminantes; Digesto das protenas a peptdeos;

2.a- Protemica Preparo de amostras



2.a- Protemica Preparo de amostras -digesto

Reduzir as protenas a peptdeos; Expor ao mximo os stios de clivagem (reduo com DTT seguida de alquilao) Digesto por enzimas (geralmente tripsina, alta especificidae (Arg/Lis)

O PREPARO DAS AMOSTRAS PONTO CRTICO DE QUALQUER EXPERIMENTO PROTEMICO

Anal Bioanal Chem (2007) 389:9911002



Remoo de contaminantes Detergentes, sais, acares, etc... O espectrmetro NO sabe

que estamos trabalhando com peptdeos

Enriquecimento de peptdeos de interesse, modificados ou no Enriquecimento de peptdeos fosforilados, atrvs do uso de

cromatografias de afinidade por metal imobilizao (Fe, Ti, Ga);

Pr-fracionamento das amostras para anlise

Eletroforese uni ou bi-dimensional, cromatrografias diversas. Associao de cromatrografias de troca catinica forte, com fase reversa: MuDPIT




2.a- Protemica Preparo de amostras fosfopeptdeos

Proteomics 2009, 9, 14511468

MOMENTO BIOQUMICO



2.a- Protemica Preparo de amostras - Overview



Gel-1D

Gel-2D

Cromatografia multidimensional




1D 2D




mM

NaC

l

1000 500 100

A 280

/mL

100 50 0

% A

CN

100 50 0

% A

CN

100 50 0

% A

CN

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2.a- Protemica Preparo de amostras - MudPIT



2.b- Protemica Abordagens Botton upe Top down

http://en.wikipedia.org/wiki/Bottom-up_proteomics



Peptide fingerprint ou impresso digital de peptdeos: protenas so identificadas com base no tamanho dos peptdeos resultantes da hidrlise com tripsina,

comparando-se o espectro de massa real com o terico, obtido a partir dos bancos de dados de protenas.

1529 1 478 1529.7 0.1 164 1529.73 0.01 25 1529.734 0.001 4 1529.7348 0.0001 2

Massa/carga Mass Tolerance (Da) # Hits in Database

Quanto maior a exatido da medida de massas, maior a segurana na identificao da protena (hits) que originou os peptdeos

trpticos.

2.c- Protemica Resoluo e analisadores



1 MS-Setor magntico: os ons moleculares so focalizados, formando um feixe, so acelerados atravs de um campo magntico, sendo defletidos (desviados) de acordo com as massas dos ons

2.c- Protemica Analisadores



2- Quadrupolo: quatro eletrodos longos ou no, com cargas opostas e paralelas


+ + - -



2.c- Protemica Analisadores (quadrupolo)




3- Ion trap: literalmente, armadilha de ons.



2.c- Protemica Analisadores (ion trap)

- Transmisso em feixes; - Armazenamento temporrio dos ons;




TOF

TOF/TOF

TEMPO DE VO DEPENDE DA ENERGIA CINTICA

DeVmt .

221

=

3- TOF: time of flight



2.c- Protemica Analisadores (TOF)



2.c- Protemica Analisadores (TOF)

Rpido Fcil de usar Resoluco moderada Molculas grandes ( 70 kDa)



2.c- Protemica MS/MS e fragmentaco de peptdeos

PEPTDEO

PEPTDEO PROTONADO




Quando um peptdeo analisado por MS/MS, a fragmentao gera uma famlia de fragmentos peptdicos com massas que vo diferir uma da outra em valores que correspondem a um on b, permitindo a identificao de cada aminocido.

Sequenciamento de novo de protenas




A sequncia obtida pela anlise dos ons de uma srie pode ser confirmada pela determinao da sequncia feita a partir da srie complementar de ons, no caso do exemplo, os ons y.



Espectro MS/MS do peptdeo trptico GLSDGEWQQVLNVWGK.

AA Codes Mono. AA Codes Mono.

Gly G 57.021464 Asp D 115.02694

Ala A 71.037114 Gln Q 128.05858

Ser S 87.032029 Lys K 128.09496

Pro P 97.052764 Glu E 129.04259

Val V 99.068414 Met M 131.04048

Thr T 101.04768 His H 137.05891

Cys C 103.00919 Phe F 147.06841

Leu L 113.08406 Arg R 156.10111

Ile I 113.08406 CMC 161.01467

Asn N 114.04293 Tyr Y 163.06333

- - - Trp W 186.07931



2.d- Protemica e a anlise de dados



Comparao de massas reais obtidas no equipamento, com massas teoricas;

Rastreamento contra bancos de dados; MASCOT: socore SEQUEST: Xcorr

Escores diferentes para um hit; Nmero de peptdeos nicos que identificam uma

protena

2.d- Protemica e a anlise de dados



QUANTIFICATION BASED ON NUMBER OF ACQUIRED MS2 SPECTRA

MS

m/z

inte

nsity

Nano-LC

Time (min)

inte

nsity

m/z

MS2

Spectra 1 Peptide 1

Spectra 2 Peptide 2

Spectra 3 Peptide 3



Nano-LC

Time (min)

inte

nsity

5-10 scans/second

60 min acquisition time 36,000 acquired spectra/hour

MS MS2



Spectrum 1 Peptide 1



MELSPRAAEL TNLFESRIRN FYANFQVDEI GRVVSVGDGI AQVYGLNEIQ AGEMVLFANG VKGMALNLEN ENVGIVVFGG DTAIKEGDLV KRTGSIVDVP AGKAMLGRVV DAMGVPIDGR GALSDHEQRR VEVKAPGILE RKSVHEPMQT GLKAVDSLVP IGRGQRELLI GDRQTGKTTI AIDTILNQKQ INSRATSESE TMYCVYVAIG QKRSTVGQLI QTLEEANALE YSILVAATAS DPAPLQFLAP YSGCAMGEYF RDNGMHALII YDDLSKQAVA YRQMSLLLRR PPGREAFPGD VFYLHSRLLE RAAKRSDQTG AGSLTALPVI ETQAGDVSAY IPTNVISITD GQICLETELF YRGIRPAINV GLSVSRVGSA AQLKAMKQVC GSSKLELAQY REVAAFAQFG SDLDAATQAL LNRGARLTEV PKQPQYAPLP IEKQILVIYA AVNGFCDRMP LDRISQYEKA IPNSVKPELL QALKGGLTNE RKMEPDAFLK ERALALI ATPase alpha subunit : gi 140325074

AAELTNLFES

HIGH CONFIDENCE MATHING CRITERIA ATPase alpha subunit : gi 140325074 - PROTEIN PROBABILITY: >95% - Minimun of 2 unique non-overlapping peptides - Xcorr: +1; 1.5 +2: 2.0 +3: 2.5

DNGMHALIIYDDLSKQAVAY TGSIVDVPAGKAMLG

SEQUEST algorithms ScaffoldTM algorithms

MS2



2.e- Protemica quantitativa

Label-free: livre de marcao Labelled:

iTRAQ

marcao isotpica (18O)

Slide Number 1Introduo1.a - Histrico1.b - Fundamentos bsicos1.b - Fundamentos bsicos1.c Componentes e tipos de equipamentos1.c Componentes e tipos de equipamentos1.c Componentes e tipos de equipamentos1.d- Tipos de ionizao MALDI (dessoro)1.d- Tipos de ionizao MALDI (dessoro)1.d- Tipos de ionizao MALDI (dessoro)1.d- Tipos de ionizao MALDI (dessoro)1.d- Tipos de ionizao ESI (fase gasosa)1.d- Tipos de ionizao ESI (fase gasosa)1.d- Tipos de ionizao ESI (fase gasosa)1.d- Tipos de ionizao demais tipos de ionizao1.d- Tipos de ionizao comparativo1.e- Tipos de FRAGMENTAO1.f- Deteco2.a- Protemica Preparo de amostras2.a- Protemica Preparo de amostras -digesto2.a- Protemica Preparo de amostras2.a- Protemica Preparo de amostras fosfopeptdeos2.a- Protemica Preparo de amostras - Overview 2.a- Protemica Preparo de amostras 2.a- Protemica Preparo de amostras 2.a- Protemica Preparo de amostras - MudPIT 2.b- Protemica Abordagens Botton upe Top down2.c- Protemica Resoluo e analisadores2.c- Protemica Analisadores2.c- Protemica Analisadores2.c- Protemica Analisadores (quadrupolo)2.c- Protemica Analisadores (quadrupolo)2.c- Protemica Analisadores2.c- Protemica Analisadores (ion trap)2.c- Protemica Analisadores 2.c- Protemica Analisadores (TOF) 2.c- Protemica Analisadores (TOF) 2.c- Protemica MS/MS e fragmentaco de peptdeos2.c- Protemica MS/MS e fragmentaco de peptdeos2.c- Protemica MS/MS e fragmentaco de peptdeos2.c- Protemica MS/MS e fragmentaco de peptdeos2.c- Protemica MS/MS e fragmentaco de peptdeosSlide Number 442.d- Protemica e a anlise de dados2.d- Protemica e a anlise de dadosSlide Number 47Slide Number 48Slide Number 492.e- Protemica quantitativa

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