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INTRODUÇÃO A ESPECTROMETRIA DE MASSAS

• Espectrometria de massas: técnica analítica que separa e mede a relação massa:carga (m/z) de íons, em fase gasosa, produzidos por algum método de ionização.

• Qual o princípio da separação de íons de acordo com a relação m/z? Diferença de trajetórias, em alto vácuo, sob a influência de campos elétricos e/ou magnéticos.

• 2013 celebra o centenário da espectrometria de massas!!!

Pioneiros da espectrometria de massas

J. J.

ThomsonPremio Nobel 1906

Física

F. A. Aston

Premio Nobel 1922Química

H. G. Dehmelt

Premio Nobel 1989Física

W. Paul

Premio Nobel 1989Física

K. Tanaka

Premio Nobel 2002Química

J. Fenn

Premio Nobel 2002Química

INTRODUÇÃO A ESPECTROMETRIA DE MASSAS

• Espectrometria de massas: técnica analítica que separa e mede a relação massa:carga (m/z) de íons, em fase gasosa, produzidos por algum método de ionização.

• Qual o princípio da separação de íons de acordo com a relação m/z? Diferença de trajetórias, em alto vácuo, sob a influência de campos elétricos e/ou magnéticos.

• Espectro de massas registram abundancia relativa de íons em função de m/z.

Aplicações

Determinação de massa molecular com elevada exatidão e distinção entre composição química pela massa molecular.

Aplicações: determinação de massa molecular com elevada exatidão de materiais poliméricos e biomoléculas

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Aplicações e características da EM

• Algumas aplicações da EM:(a) determinação de massa molecular com elevada exatidão, inclusive de biomoléculas e materiais poliméricos;(b) identificação de substancias, mesmo em misturas complexas;(c) informação estrutural: conectividade dos átomos numa molécula; informações termoquímicas;(d) análise e padrões isotópicos.

• Algumas características importantes da EM: (i) técnica qualitativa e quantitativa, capaz de analisar misturas complexas; (ii) alta sensibilidade; (iii) universal e específica; (iv) técnica rápida.

• Thomson: unidade de m/z (Dalton/carga do elétron)

• Massa média (ou química) = massa calculada usando uma média ponderada sobre a abundancia isotópica.

• Massa nominal: massa calculada usando como número inteiro a massa do isótopo principal, p.ex. CH4 = 16 u.

• Massa exata: massa calculada usando o valor da massa do isótopo principal, p.ex. 12C1H3

79Br = 93,941011 u.

• m/z = grandeza abstrata sem unidades, ou em unidades de Th.

• Espectro de massas = registro de abundância iônica em função de m/z.

• Pico base ≡≡≡≡ sinal do íon mais abundante.

• Pico isotópico ≡≡≡≡ sinal devido a outros isótopos da mesma composição química.

• Abundancia relativa = abundancia normalizada com relação ao pico base.

• Intensidade relativa = razão entre a intensidade do pico e o pico base.

• Intensidade percentual = (Ii/ΣΣΣΣ Ij).

• Introdução de amostra.

• Ionização da amostra.

• Separação dos íons de acordo com a relação m/z.

• Detecção e quantificação dos íons.

• Unidade de processamento de dados.

Componentes de um espectrômetro de massas

Energia dos elétrons = energia cinética resultante da aceleração por uma diferença de potencial (V)

½ mv2 = e××××V

Ionização: energia do elétron deve ser superior a energia de ionização da molécula

Ionização por elétrons de um hidrocarboneto: energia do elétron é suficiente para causar ionização da molécula e promover a fragmentação de M+••••

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Ionização por elétrons de outro isômero C7H16: fragmentação extensa de M+•••• auxiliada pela estabilidade dos fragmentos iônicos produzidos

Espectros de massas por ionização por elétrons de sistemas inorgânicos com padrões isotópicos característicos:

a) caso do S8 (32S e 34S);

b) complexo de Cr (50Cr, 52Cr, 53Cr, 54Cr)

Energia eletrônica e espectrometria de massas: Eficiência de ionização a várias energias: máximo ~ 70 eV

Espectros de massas de uma β-lactama a duas energias eletrônicas diferentes: maior fragmentação a 70 eV

Ionização química

• Ionização produzida por uma reação química provocada por um gás ionizado.

• Gás reagente, p.ex. CH4

CH4+•••• + CH4 →→→→ CH5

+ + CH3••••

• CH5+ é um ácido de Brønsted muito forte em fase gasosa: ionização suave

com formação de MH+ e fragmentos eventuais

M + CH5+ →→→→ MH+ + CH4

• Outros reagentes: isobutano, C4H10, NH3

C4H10 + e- →→→→ C4H9+ + H•••• + 2 e-

NH3+•••• + NH3 →→→→ NH4

+ + NH2••••

• Transferência de próton depende da afinidade protônica relativa entre o substrato neutro e a base conjugada do ácido

M + H+ →→→→ MH+ AP (M) = - ∆∆∆∆Ho

AP (CH4) = 543,5 kJ mol-1

AP (C4H8, isobuteno ou Me2C=CH2) = 802,1 kJ mol-1

AP (NH3) = 853,6 kJ mol-1

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Comparação de espectros de massa

obtidos por ionização eletrônica e por ionização

química (método suave de ionização)

• Analito depositado numa “matriz” orgânica, que possui absorção intensa no λλλλ do laser (λλλλ= 337 nm para laser de N2);

• Dessorção por um laser pulsado (ns) de alta intensidade;

• Matrizes típicas: ácido 2,5-dihidroxibenzóico; ácido 3,5-dimetóxi-4-hidroxicinámico; ácido 5-clorosalicílico;

• Espectro resultante inclui íons (M+H)+, e outros com prótons adicionais, retirados da matriz.

MALDI

Espectro de massas MALDIde poli-metil metacrilato <M> = 7100 Da

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Positive-ion (a) and negative-

ion (b) MALDI mass spectra of CS-D tetra with pmg.

Polysulfated-Derived Oligosaccharides

Aplicações de MALDI

• Identificação de proteínas de elevada massa molecular ( > 100.000 Da).

• Espectros apresentam proteínas grandes com íons [M+H]+, [M+2H]2+, e [M+3H]3+.

• Proteínas pequenas apresentam espectros apenas com [M+H]+.

• Alta sensibilidade.

• Espectros de polímeros sintéticos.

• Imagem por espectrometria de massas!!

IMS allows for distinction of different molecular species of β-amyloid plaques in an Alzheimer's disease model.

Seeley E H , and Caprioli R M PNAS 2008;105:18126-18131

©2008 by National Academy of Sciences

Métodos de ionização a pressão atmosférica

• APCI: ionização química a pressão atmosférica.

• APPI: ionização química por fotoionização.

• ESI: electrospray

• DESI: electrospray por dessorção

• DART: (direct analysis in real time).

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APCI (atmospheric pressure chemical ionization)

Formação de íons em APCI (atmospheric pressure chemical ionization)

Aplicações de APCI

Tipo de amostras

• Substancias de polaridade e massa molecular mediana: PAH, PCB, ácidos graxos, esteroides, ftalatos,...

• Substancias sem sítios ácidos ou básicos.

• Substancias contendo heteroátomos: uréias, carbamatos, ..

• Substancias a serem evitadas: substancias instáveis a temperaturas mais altas, massa molecular elevada,...

Exemplos de espectros obtidos por APCI no modo

positivo e no modo negativo

Positive APCI spectra of n-octane in synthetic air at30 °C, Vcone 1 V and at different n-octane concentrations of (a) 6ppm, (b) 30 ppm, (c) 65 ppm, (d) 90 ppm, and (e) 150 ppm

APPI (atmospheric pressure photoionization)

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Espectro de massas obtido no modo negativo por

APPI

Espectro de massas de íons positivos obtido por APPI de petróleo venezuelano (cortesia do “líder imortal” HC)

Comparação entre métodos de ionização: exemplo da cafeína

Comparação entre métodos de ionização: exemplo da budesonida (anti-inflamatório)