Espectrômetro de Plásmons de Superfície no Infravermelho ... · biológicas em tempo real, operando em λ = 0,9751 µm, que permite ... de Medidas no Modo de ... pela variação

i

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE TECNOLOGIA E GEOCINCIAS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ENGENHARIA ELTRICA

Espectrmetro de Plsmons de Superfcie no

Infravermelho para o Desenvolvimento de Biossensores

Por

Daniel Ferreira da Ponte

Dissertao submetida ao Programa de Ps-Graduao em Engenharia Eltrica da Universidade Federal de Pernambuco como parte dos requisitos para a obteno do grau de

Mestre em Engenharia Eltrica

Orientador: Eduardo Fontana,PhD

Co-Orientador: Elio Meneses-Pacheco,Dr. rer. nat.

Recife, Setembro de 2003

Daniel Ferreira da Ponte, 2003

P813 Ponte, Daniel Ferreira da

Espectrmetro de plsmons de superfcie no infravermelho

para o desenvolvimento de biosensores / Daniel Ferreira da Ponte. Recife: O Autor, 2003.

xv, 121 f. : il., fig., tabs., grfs. Inclui bibliografia e anexos. Dissertao (Mestrado) Universidade Federal de

Pernambuco. CTG. Depto. de Engenharia Eletrnica e Sistemas.rea de Fotnica.

1.Fotnica. 2. Plsmons de superfcie. 3. Biossensores. I.

Ttulo. 535 CDD (22 ed.) UFPE/BCTG/2004-35

iii

Dedico esta dissertao a minha me, Rita

Albuquerque Ferreira da Ponte e Meu Pai, Jos Jacinto Ferreira

da Ponte, pelo exemplo de trabalho e responsabilidade que

souberam transmitir para mim durante toda minha vida.

iv

Agradecimentos

Agradeo a Deus pela sua presena invisvel em tudo que existe no universo e por seu filho, Jesus Cristo, que morrendo por ns nos ensinou a ser humildes e compreender a grandeza do Pai.

Agradeo aos meus pais, Jose Jacinto Ferreira da Ponte e Rita Albuquerque F. Ponte, pela oportunidade de existir e contribuir em toda a minha vida para realizao dos meus objetivos. Agradeo ao meu orientador Prof. Eduardo Fontana pela realizao deste trabalho, contando com sua experincia e disponibilidade, contribuindo de forma singular para minha formao como mestre.

Agradeo ao meu co-orientador Prof. Elio Meneses-Pacheco pelas suas sugestes,

crticas e disponibilidade de estar sempre presente em todas as fases deste trabalho, contribuindo para essa realizao.

Agradeo minha noiva Graciete Dias da Silva pela pacincia em suportar a minha

ausncia enquanto me dedicava a este trabalho. Agradeo aos Professores: Antnio Jernimo Belfort de Oliveira, Hlio Magalhes, Joaquim Ferreira Martins Filho, Frederico Dias Nunes que contriburam para minha formao acadmica.

Agradeo aos meus amigos: Carlos Henrique Duarte, Neide Shinohara, Isnaldo J. S. Colho, Srgio Campello Oliveira, Jos Paulo Gonalves de Oliveira, Carmelo Jos Albanez Bastos Filho, Luciana Reginaldo Soares, Haroldo Vital do Carmo, Ulysses Roberto Chaves Vitor, Vitor Paulo, Reinaldo Golmia, Severino(Biu) da oficina do Dep.de Fsica, que de forma direta ou indireta contriburam para essa realizao. Agradeo Capes pelo apoio financeiro.

Acredito que[...] os universos abertos pela cincia so muito mais excitantes do que o mistrio que resulta da ignorncia G. Hesslow

v

Resumo da Dissertao apresentada UFPE como parte dos requisitos necessrios

Para a obteno do grau de Mestre em Engenharia Eltrica

ESPECTRMETRO DE PLSMONS DE SUPERFCIE NO

INFRAVERMELHO PARA O DESENVOLVIMENTO DE

BIOSSENSORES


Setembro /2003

Orientador:Eduardo Fontana, PhD Co-orientador:Elio Meneses-Pacheco, Dr.rer. nat. rea de Concentrao:Fotnica Palavras-chave:Biossensores, Plsmons de Superfcie, RPS, Infravermelho Nmero de Pginas:121

O desenvolvimento de sensores baseados em oscilaes de plsmons de superfcie

(PS) em metais, fundamenta-se na alta sensibilidade dessas oscilaes pequenas flutuaes

nas propriedades pticas do meio adjacente superfcie metlica. tambm possvel atravs

da caracterizao dessas oscilaes determinar propriedades pticas e espessuras de filmes

finos depositados sobre o metal, bem como a topografia da superfcie metlica em escala

sub-micromtrica. Alm dessas aplicaes, essa tcnica tem sido empregada no

desenvolvimento de sensores biolgicos capazes de detectar, quantificar e monitorar em

tempo real a interao entre molculas de antgenos e anticorpos nas proximidades de uma

superfcie metlica. Neste trabalho, foi montado inicialmente um reflectmetro piloto no

visvel usando um laser de HeNe adaptado para monitorao e caracterizao da cintica de

reaes biolgicas em meios aquosos. Com base em resultados publicados na literatura,

onde mostrou-se teoricamente que um ganho na sensibilidade da ressonncia de plsmons de

superfcie (RPS) de um fator de 10 poderia ser obtido atravs da utilizao de luz no

infravermelho ( 1 m), foi implementado um sistema de monitorao de reaes

biolgicas em tempo real, operando em = 0,9751 m, que permite monitorar um conjunto

de 25 clulas de reao. Com esse sistema foi possvel obter as primeiras medidas

registradas na literatura de RPS em = 0,9751m e estabelecer a metodologia de utilizao

do sistema para o desenvolvimento de biosensores de alta sensibilidade.

vi

Abstrtact of Dissertation presented to UFPE as a partial fulfillment of the

Requirements for the degree of Master in Eletrical Engineering.

INFRARED SURFACE PLASMON SPECTROMETER FOR

THE DEVELOPMENT OF BIOSENSOR


September/ 2003

Supervisor:Eduardo Fontana, PhD. Area of Concentration: Photonics Keywords:Surface Plasmons, SPR, Biosensor, Infrared Number of Pages: 121

The development of sensors based on surface plasmon oscillations (SP) in metals is

based on the high sensitivity of these oscillations to small fluctuations in the optical

properties of the medium adjacent to the metallic surface. It is also possible through the

characterization of these oscillations to determine optical properties and thicknesses of thin

films deposited on the metal, as well as the topography of the metallic surface in sub-

micrometer scale. Besides these applications, this technique has been used for the

development of biological sensors capable to detect, quantify and monitor, in real time, the

interaction between antigen and antibody molecules nearby a metallic surface. In this work,

we first developed a pilot spectrometer in the visible region using a HeNe laser to observe

and characterize the kinetics of biological reactions in aqueous media. Based on theoretical

results published in the literature, that show a sensitivity increase in the surface plasmon

resonance (SPR) by factor a of 10 through the use of light in the IR ( 1 m), we

implemented an optical system at = 0,9751 m for real-time monitoring of 25 reaction

cells. Through this system it was possible to obtain the first measurements of SPR at

=0,9751 m ever reported in the literature and to establish the methodology of using this

system for the development of high sensitivity biosensores.

vii

Sumrio

1. Introduo...........................................................................................................................1

2. Construo de um Reflectmetro e sua Aplicao na Caracterizao ptica de

Materiais................................................................................................................................4

2.1 Introduo....................................................................................................................4

2.2. Mtodo do Desvio Mnimo.........................................................................................4

2.3 Determinao da Preciso do Mtodo do Desvio Mnimo..........................................6

2.4 Configurao do Reflectmetro...................................................................................8

2.5 Caracterizao do Reflectmetro: Medio Precisa de ndice de Refrao...............12

2.6 Mtodo das Correes Diferenciais...........................................................................15

2.7 Mtodo Algbrico......................................................................................................18

2.8 Resultados e Discusso..............................................................................................22

2.9 Concluses e Perspectivas.........................................................................................23 3. Plsmons de Superfcie....................................................................................................24

3.1 Introduo.................................................................................................................24

3.2 Modelo Clssico da Resposta em Freqncia da Permissividade Eltrica

de Meios Materiais...........................................................................................................24

3.3 Condies de Existncia de Oscilaes de Plsmons de Superfcie..........................32

3.3.1. Transmisso Total: ngulo de Brewster........................................................37

3.3.2. Confinamento na Interface: Plsmons de Superfcie......................................37

3.4 Tcnicas de Observao de Ressonncia de Plsmons de Superfcie........................38

3.4.1 Configurao de Otto......................................................................................39

3.4.2 Configurao de Kretschmann........................................................................40 4. Princpios de Imunologia e o Emprego de RPS na Deteco da Reao

Antgeno-Anticorpo.............................................................................................................44

4.1 Introduo..................................................................................................................44

4.2 Princpios Bsicos de Imunologia..............................................................................44

4.3 Estrutura das Molculas de Anticorpo.......................................................................47

4.4 Tcnicas de Deteco da Reao Antgeno-Anticorpo.............................................48

4.4.1 Radioimunoensaio...........................................................................................49

4.4.2 Elisa.................................................................................................................51

4.5 RPS Aplicada na Caracterizao de Reaes Antgeno-Anticorpo...........................52

viii

5. Espectrmetro de RPS em l=632,8nm e seu Emprego na Caracterizao da

Reao Antgeno/Anticorpo................................................................................................55

5.1 Sistema ptico............................................................................................................55

5.2 Sistema Integrado Prisma-Placa Multiclulas............................................................56

5.3 Formulao Terica da Reflectncia do Sistema Prisma-Substrato Metalizado........59

5.4 Observao Experimental do Efeito de RPS..............................................................62

5.5 Caracterizao em Tempo Real de Reaes Imunolgicas por RPS..........................65

6. Espectrmetro de RPS em l = 975,1nm............................................................................71

6.1 Justificativa.................................................................................................................71

6.2 Sistema ptico com Feixe Colimado........................................................................ 78

6.2.1 Descrio do Sistema ptico...........................................................................78

6.2.2 Dificuldades de Realizao de Medidas no Modo de Varredura

Angular.....................................................................................................................80

6.2.3 Resultados Experimentais no Ar e na gua....................................................81

6.3 Sistema ptico com Feixe Focalizado.......................................................................87

6.3.1 Descrio da Montagem..................................................................................88

6.3.2 Dificuldades em Realizar as Medidas na Montagem Focalizada....................92

6.3.3 Resultados Experimentais no Ar.....................................................................93

6.3.4 Resultados Experimentais do Efeito de RPS na

Configurao SF2-BK7-Cr-Au-gua pura...............................................................95

6.4. Metodologia de Posicionamento para Observao da Cintica

de RPS com Feixe Focalizado..........................................................................................98

6.4.1 Metodologia de Posicionamento.....................................................................98

6.4.2 Posicionamento do Feixe na Clula Central....................................................99

6.4.3 Metodologia para Observao da Cintica de Reaes no

Sistema Focalizado.................................................................................................111

7. Concluses e Perpectivas...............................................................................................113

Referncias Bibliogficas...................................................................................................116

Apndice: Clculo de d ....................................................................................................119

ix

Lista de Figuras Fig.2.1 Ilustrao do desvio de um feixe de luz atravs de um prisma.............................5

Fig 2.2 Curva do ngulo de desvio do feixe refratado de um prisma para n=1,52 e

=60o.....................................................................................................................6

Fig 2.3 Configurao do reflectmetro ptico: P-polarizador; BS-divisor de feixe;

S1-feixe incidente; S2-feixe de referncia; S3-feixe refletido pelo prisma;

D1-fotodetector do sinal; fotodetector da referncia.............................................9

Fig.2.4 Calibrao do parafuso micromtrico.................................................................10

Fig 2.5 Dependncia da variao relativa do ngulo de giro do prisma com o

deslocamento do parafuso micromtrico.............................................................11

Fig.2.6 Diagrama do caminho do feixe de luz no interior do prisma. Algumas

reflexes foram omitidas para simplificar o diagrama........................................13

Fig.2.7 Curva Terica da Reflectncia Para = `=60o e n=1,52....................................14

Fig.2.8 Dependncia angular da funo reflectncia (linha slida) aps o ajuste

aos pontos medidos experimentalmente (crculos) para n=1,515 e

=59,89................................................................................................................17

Fig.2.9 Detalhamento das curvas da Fig.6 na regio em torno do ngulo de

Brewster...............................................................................................................18

Fig.2.10 Curva de interseco das funes f(n) e g(n) para os pontos

C=29,02 e B =42,54...........................................................................................20

Fig.2.11 Determinao do ngulo crtico da curva de reflectncia....................................21

x

Fig.2.12 Interpolao da reflectncia em torno do ngulo de Brewster atravs

da funo Spline do Mathcad..............................................................................22

Fig.3.1 Distribuio de cargas em um tomo sob a ao de um campo eltrico

externo.................................................................................................................25

Fig.3.2 Dependncia espectral das permissividades complexas dos metais ouro,

cobre, prata e alumnio[17]..................................................................................31

Fig.3.3 Geometria para determinao da condio de existncia de uma oscilao

confinada a uma interface planar.........................................................................32

Fig.3.4 Configurao de Otto para excitao de RPS......................................................39

Fig.3.5 Efeito produzido pela variao da espessura da camada de ar entre o

prisma e o metal na configurao de Otto Para = 632,8nm e os valores

de n e ilustrados na Tabela 3.1 .........................................................................40

Fig.3.6 Configurao de Kretschmann para excitao de PS..........................................41

Fig.3.7 Efeito produzido pela variao do parmetro dk na configurao de

Kretschmann em = 632,8nm com n e ilustrados na Tabela 3.1...................42

Fig.4.1 Representao simplificada de uma molcula de anticorpo................................47

Fig.4.2 Aspecto de uma molcula de anticorpo...............................................................48

Fig.4.3 Teste radioimunoensaio para um soro contendo antgenos.................................49

Fig.4.4 Ensaio competitivo entre antgenos marcados e no marcados. a) Reao

competitiva de antgenos do soro e antgenos marcados com soluo pura de

anticorpos especficos. b) Formao de precipitado antgino-anticorpo em

soluo..................................................................................................................50

xi

Fig.4.5 Reao antgeno-anticorpo no teste Elisa. a) Imobilizao de antgenos nas

paredes da clula de reao. b) Reao entre anticorpos presentes no soro e

antgenos imobilizados........................................................................................51

Fig.4.6 Reao enzimtica para quantificao de anticorpo. a) Adio de anticorpo

Anti-imoglobulina a uma soluo resultante da reao antgenos-anticorpos.

b) Revelao das enzimas atravs de uma soluo cromognica........................52

Fig.4.7 Configurao de Kretschmann para observao de RPS....................................53

Fig.4.8 Princpio de imunosensores em RPS...................................................................54

Fig.5.1 Sistema usado para investigar RPS em = 632,8 nm.........................................56

Fig.5.2 Fotografia da placa multiclulas..........................................................................57

Fig.5.3 Detalhamento da forma de montagem do sistema integrado...............................58

Fig.5.4 Fotografia do sistema integrado(prisma/substrato/placa multiclulas)

afixado no estgio de rotao atravs do suporte acrlico..................................58

Fig.5.5 Detalhe do sistema prisma-filme-clula..............................................................60

Fig.5.6 Grfico terico (linha contnua) e experimental (crculos ligados) da

refletncia no ar n(ar)=1 e (Au)= -5,5-1,9j.e d(Au)=56,6nm.........................63

Fig.5.7 Grfico terico Eq.5.4(linha contnua) e experimental(crculos ligados)

da refletncia para uma soluo de PBS com n(632,8nm)=1,333.......................65

Fig.5.8 Cintica da reao IgG/anti-IgG para uma soluo com concentrao

final(PBS+Anti-IgG) de 10g/mL e (PBS+IgG) de 10g/mL............................67

xii

Fig.5.9 Variao relativa da reflectncia em funo do filme orgnico de ndice

de refrao n=1,5[20] formada sobre o filme metlico de espessura

do=56,6nm e permissividade................................................................................69

Fig.5.10 Deslocamento da curva de RPS para uma camada protica................................70

Fig.6.1 Figura da estrutura prisma-metal-meio externo...................................................72

Fig.6.2 Curva de ressonncia (a) em funo de kx representada no espao kx

(b) em funo de ...............................................................................................73

Fig.6.3 Dependncia espectral obtida na ref.[7] da meia-largura reduzida da RPS

para filmes de ouro, cobre, prata e alumnio na configurao metal-ar de

Kretschmann em prisma SF2...............................................................................75

Fig.6.4 Dependncia espectral obtida na ref.[7] da meia-largura reduzida da RPS

para filmes de ouro, cobre, prata e alumnio na configurao metal-gua de

Kretschmann em prisma SF2...............................................................................76

Fig.6.5 Dependncia espectral de RPS obtida na ref.[7] em filmes de ouro,

prata, cobre e alumnio na configurao SF2-metal-gua...................................77

Fig.6.6 Dependncia espectral de RPS obtida na ref.[7] em filmes de ouro,

prata, cobre e alumnio na configurao BK7-metal-gua.................................78

Fig.6.7 Montagem experimental mecnica para laser Infravermelho.............................79

Fig.6.8 Macroclula usada para medir RPS em gua no Infravermelho.........................81

Fig.6.9 RPS na configurao de prisma de acoplamento de Kretschmann para

a estrutura multicamada SF2-BK7-Cr(3nm)-Au(57nm)-ar em = 975,1nm.

Os pontos representam a medida experimental e a linha contnua, a curva

terica obtida para os parmetros do filme de ouro indicados na Tabela 6.1......83

xiii

Fig.6.10 Grfico comparativo entre a medida experimental de RPS para a estrutura

SF2-BK7-Cr-Au-ar em = 975,1 nm e no vermelho( = 630-680 nm)........... 84

Fig.6.11 Curva experimental de RPS na configurao de Kretschmann para a

estrutura SF2-BK7-Cr-Au-gua pura em =975,1 nm........................................85

Fig.6.12 Curva terica da variao relativa da reflectncia em funo da espessura

de uma camada orgnica hipottica de espessura d (n=1,5) formada sobre

o filme de ouro....................................................................................................87

Fig.6.13 Espectrmetro de RPS em =975,1nm, no modo focalizado.............................89

Fig.6.14 Distribuio de luz irradiada pelo laser de Infravermelho.

Essa distribuio corresponde a uma cintura do feixe de 1 cm...........................89

Fig.6.15 Interface grfica para medir a distribuio de luz refletida do prisma do

espectrmetro......................................................................................................90

Fig.6.16 Interface grfica para monitorar o pixel da curva de RPS..................................91

Fig.6.17 Posicionamento do foco do feixe na extremidade superior do prisma...............91

Fig.6.18 Focalizao do feixe Infravermelho na superfcie do prisma.............................92

Fig.6.19 Foto da RPS no ar na montagem da Fig.6.11 a) com polarizador no visvel b)

com polarizador no Infravermelho......................................................................94

Fig.6.20 Deslocamento angular da imagem refletida atravs da linha de

ressonncia para a estrutura SF2-BK7-Metal-Ar em =975,1 nm......................94

Fig.6.21 Curva de RPS para ouro exposto ao ar ambiente, obtida com

sensor de imagem................................................................................................95

xiv

Fig.6.22 Foto de linha de RPS na configurao SF2-BK7-Cr-Au-gua pura com

polarizador no visvel(a) e no infravermelho(b)..................................................96

Fig.6.23 Deslocamento angular da imagem refletida do prisma atravs da linha

de RPS na configurao SF2-BK7-Cr-Au-gua pura..........................................96

Fig.6.24 Curva de RPS obtida com sensor de imagem na configurao

SF2-BK7-Cr-Au-gua pura..................................................................................97

Fig.6.25 Posicionamento do feixe na regio central da face superior

do prisma (Ponto D)...........................................................................................100

Fig.6.26 Geometria para determinao do reposicionamento aps rotao

do prisma...........................................................................................................103

Fig.6.27 Deslocamento do prisma para reposicionamento do feixe................................105

Fig.6.28 Grfico da curva x' da Eq.(6.22) e da curva polinomial x'()

da Eq.(6.23)......................................................................................................106

Fig.6.29 Configurao para determinao da correo da posio do prisma

devido a espessura do substrato.........................................................................107

Fig.6.30 Grfico da curva x"da Eq.(6.23) e da curva polinomial x"()

da Eq.(6.25)........................................................................................................109

Fig.6.31 Geometria para varredura do feixe nas clulas de reao.................................110

Fig.6.32 Mapa de posicionamento do feixe nas clulas..................................................110

Fig.6.33 Foto dos transladadores para posicionamento do prisma..................................111

Fig.6.34 Poro da tela da interface grfica onde exibida a curva de RPS..................112

xv

Lista de Tabelas

Tabela.2.1 Caractersticas do sistema.................................................................................10

Tabela.2.2 Procedimento de interao pelo mtodo de correo diferencial.....................16

Tabela.2.3 Resumo dos resultados experimentais..............................................................23

Tabela.3.1 Parmetros pticos dos elementos do sistema no vermelho para.....................41

Tabela.5.1 Resultados comparativos tericos, ajuste de curva, e experimental

para ngulo de ressonncia no ar......................................................................63

Tabela.5.2 Protocolo para observao experimental de reao IgG/ anti-IgG...................66

Tabela.6.1 Resultados tericos e experimentais obtidos no ar em =975,1 nm.................82

Tabela.6.2 Resultados terico e experimental obtidos no Infravermelho para a

configurao SF2-BK7-Cr-Au-gua pura.........................................................85

Tabela.6.3 Valores de alguns parmetros do sistema ptico............................................106

Captulo 1


1

1. Introduo

O estudo das ondas eletromagnticas e a sua interao com a matria tem sido

largamente empregada para caracterizao de materiais. A possibilidade de extrair

parmetros pticos atravs de medidas de espalhamento, reflectividade e transmissividade

nesses materiais proporcionou o desenvolvimento de diversas tcnicas de espectroscopia.

A ressonncia de plsmons de superfcie (RPS) [1] um fenmeno cujo princpio

fsico possibilita a caracterizao de materiais atravs da medio da reflectncia e a partir

da sua funo caracterstica determinar propriedades pticas e estruturais de interfaces,

incluindo medio da permissividade complexa de metais [2], espessuras de filmes finos[2],

bem como a topografia da interface em escala sub-micromtrica [3]. Alm dessas

aplicaes, essa tcnica tem sido empregada no desenvolvimento de sensores biolgicos

capazes de detectar, quantificar e monitorar em tempo real a interao entre molculas de

antgenos e anticorpos nas proximidades de uma superfcie metlica [4].

Pesquisadores como Otto [5] e Kretschmann [6] propuseram tcnicas de observao

do efeito de RPS. Otto props o uso de um prisma de vidro com uma das faces posicionada

nas proximidades de uma superfcie metlica de forma a excitar a oscilao de plsmons de

superfcie (PS), caracterstica do efeito, na interface metal-ar. Kretschmann por sua vez,

utilizou um prisma de acoplamento com uma das faces coberta com um filme metlico, onde

a oscilao de PS ocorreria na interface exposta do metal. Esse segundo mtodo tem sido o

mais utilizado no desenvolvimento de sensores baseados em RPS, uma vez que aquele

proposto por Otto exige um controle preciso do espaamento entre as superfcies do prisma

e do metal.

Esta dissertao tem como objetivo implementar um espectrmetro de plsmons de

superfcie, baseado na configurao de Kretschmann, para o desenvolvimento de sensores

biolgicos. O espectrmetro opera em um comprimento de onda fixo, com a componente do

vetor de onda do feixe de luz incidente paralela a superfcie sendo o parmetro de varredura

no sistema de medio. Assim, quando nos referimos a espectrmetro neste trabalho,

Espectrmetro de Plsmons de Superfcie no Infravermelho para o Desenvolvimento Biossensores


2

estamos de fato nos referindo ao espectro de vetores de onda associado linha de absoro

contida no efeito de RPS.

Como parte inicial do desenvolvimento do trabalho, montamos uma primeira verso

de um reflectmetro utilizando um laser de HeNe e caracterizamos o sistema quanto a sua

preciso atravs de medidas de reflectncia em um prisma de vidro BK7. Desenvolvemos

dois mtodos alternativos de anlise para determinao simultnea de dois parmetros

caractersticos do prisma: o ndice de refrao e um ngulo interno. Essa fase do trabalho

compreendeu tambm uma discusso da preciso obtida com o emprego desses mtodos

luz de tcnicas de medio convencionais.

Na segunda etapa do trabalho adaptamos o reflectmetro para caracterizao e

monitorao de reaes biolgicas em tempo real atravs da tcnica de RPS. Os trabalhos

desenvolvidos nessa etapa incluram a observao do fenmeno de RPS em filmes de ouro

em contato com o ar e com solues biolgicas. Para isso foi fabricada uma placa composta

de vrias clulas de reao e implementado um sistema de aquisio de dados para

monitorao em tempo real da cintica de reaes biolgicas do tipo antgeno-anticorpo. Os

trabalhos nessa etapa incluram tambm o desenvolvimento de protocolos de imobilizao

de antgenos em filmes de ouro.

A largura de linha da curva de RPS representa um importante parmetro na

quantificao da sensibilidade de sensores biolgicos. Esta sensibilidade aumenta medida

que a linha se torna mais estreita. Resultados publicados na literatura mostram que a largura

de linha diminui substancialmente para comprimentos de onda no infravermelho. Por

exemplo, um ganho de sensibilidade da ordem de 10 pode ser obtido se o comprimento da

luz incidente for aumentado de 632,8nm para 1m [7]. Esse resultado motivou o

desenvolvimento de um espectrmetro baseado em RPS, operando com diodo laser em =

975,1nm na etapa final do trabalho desenvolvido nesta dissertao. O sistema foi

desenvolvido de forma a ser compacto e verstil, pois sua configurao permite extrair

medidas de RPS por varredura do ngulo de incidncia ou,

Captulo 1


3

de forma mais rpida e eficiente, atravs de uma nica medida da distribuio de luz

refletida, quando o feixe de luz focalizado em um ponto da superfcie sob teste.

Com esse novo arranjo experimental foi possvel observar RPS em filmes de ouro

expostos ao ar e solues aquosas em = 975,1nm. O efeito foi caracterizado atravs de

medidas no modo de varredura angular e no modo focalizado de operao do espectrmetro.

Nessa ltima configurao foi possvel registrar de uma s vez todo o espectro do efeito de

RPS, identificado como uma linha escura contida na distribuio de luz refletida da

superfcie. Essa talvez represente a primeira observao experimental da imagem associada

ao efeito de RPS em = 975,1nm registrada na literatura. Como parte final de construo

do sistema, foi desenvolvida toda a metodologia de operao e protocolos necessrios para

utilizao do espectrmetro infravermelho no desenvolvimento de sensores biolgicos

baseados em RPS.

O presente trabalho est organizado em sete captulos e um apndice. No captulo 2,

apresentamos uma primeira verso de reflectmetro operando com laser de HeNe, onde

demonstramos a preciso de determinao simultnea de dois parmetros de um elemento

ptico, utilizando um prisma BK7 como amostra. No captulo 3 so discutidos os princpios

fsicos associados s oscilaes de plsmons de superfcie em interfaces. As tcnicas

experimentais de observao do efeito de RPS so tambm descritas nesse captulo. No

captulo 4, apresentamos uma breve descrio das tcnicas convencionais de imunoensaio

para deteco de antgenos ou anticorpos em meios biolgicos e o princpio de utilizao do

efeito de RPS na caracterizao em tempo real da cintica de reaes envolvendo a interao

dessas macromolculas. No captulo 5 apresentamos uma primeira verso do espectrmetro

operando em = 632,8nm que utilizada para observao experimental da cintica da

reao de um sistema modelo tendo a imunoglobulina G (IgG) e o anti-IgG como

molculas interagentes. O captulo 6 descreve a implementao do espectrmetro de

plsmons de superfcie operando em = 975,1 nm para aplicaes biolgicas e finalmente

no captulo 7 so apresentadas as concluses e propostas para futuros trabalhos.

Captulo 2


4

2. Construo de um Reflectmetro e sua Aplicao na Caracterizao ptica de Materiais 2.1 Introduo

O preciso conhecimento do ndice de refrao de uma substncia necessrio

em diversos setores da atividade cientfica e industrial, como por exemplo, no controle

de qualidade do processo de fabricao de vidros, fibras pticas, plsticos, componentes

semicondutores e outros materiais [8]. O uso de estruturas prismticas tem sido

freqentemente utilizado para determinao de ndice de refrao de materiais com

aplicaes, por exemplo, na determinao do grau de pureza da gua e do teor de

acar, sal e de outros solutos em meios aquosos [9]. Diversas tcnicas tm sido

propostas na literatura para medio precisa do ndice de refrao, incluindo a medio

direta do ngulo de Brewster [10], tcnicas interferomtricas [11], mtodos baseados em

efeitos de difrao [12], bem como efeitos relacionados refrao da luz transmitida

pelo material. Neste captulo pretende-se inicialmente apresentar o princpio do mtodo

do desvio mnimo, que representa uma das tcnicas para determinao do ndice de

refrao, fazendo em seguida uma anlise da preciso dos resultados que podem ser

obtidos com essa tcnica. Descrevemos em seguida a implementao de uma montagem

piloto de um reflectmetro operando com laser de HeNe para realizar medidas de

reflectncia de prismas de vidro. Mostramos atravs de uma formulao terica e

numrica dos resultados, que possvel determinar simultaneamente o ndice de

refrao e o ngulo interno do prisma, com preciso semelhante quela obtida atravs

do mtodo do desvio mnimo.

2.2. Mtodo do Desvio Mnimo Nesse mtodo o material a ser analisado moldado na geometria de um prisma

com ngulo interno , conforme ilustrado na Fig.2.1. Um feixe incidente

monocromtico sofre um desvio ao atravessar a amostra. O desvio entre o feixe

refratado do prisma e o feixe incidente uma funo do ngulo de incidncia , do

comprimento de onda e do ngulo .

Matematicamente o ngulo de desvio pode ser posto na forma [13]

Espectrmetro de Plsmons de Superficie no Infravermelho para o Desenvolvimento de Biossensores

Daniel Fer

+= ]cossen)sen)([(sensen 2/1221 iii n , (2.1) onde i o ngulo que o feixe incidente faz com a normal e n o ndice de refrao do prisma.

A determinao do desvio exige um prvio conhecimento do ngulo interno

do prisma . A funo expressa pela Eq.(2.1) mostrada na Fig.2.2 para 52.1=n e 060= . Nesse grfico pode-se observar um valor mnimo para m= no ngulo de

incidncia m= . Este valor mnimo pode se obtido da condio

0=

dd . (2.2)

Utilizando a Eq.(2.1) na Eq.(2.2) resulta

)2/sen(]2/)sen[(

+= mn . (2.3)

Pela Eq.(2.3) o ndice de refrao dependente do ngulo interno do prisma e do

valor do desvio mnimo. A preciso no valor do ndice de refrao depende da preciso

no valores de e m , ou seja n=n( , m ).

feixe incidente feixe refratado

prisma

Fig.2.1 Ilustrao do desvio de um feixe de luz atravs de um prisma.

reira da Ponte 5

Captulo 2


6

2.3 Determinao da Preciso do Mtodo do Desvio Mnimo

A anlise da propagao do erro de medio de parmetros de uma funo feita

para uma funo genrica,

),...,,( 321 nxxxxfF = . (2.4)

Pelo mtodo do desvio quadrtico cada ix da funo contribui com um desvio

padro

ii

F xF

= , (2.5)

55

57

59

61

63

65

67

69

40 45 50 55 60 65 70 75 80

ngulo de Incidncia (graus)

ng

ulo

de D

esvi

o (g

raus

)

m

m

Fig.2.2 Curva do ngulo de desvio do feixe refratado de um prisma para

n=1,52 e =600.



7

onde i o desvio padro mdio associado ao erro de medio do parmetro xi. Assim

considerando a contribuio das incertezas de todos os parmetros, o desvio mdio

quadrtico da funo assume a forma,

22

22

2

2

21

2

1

2 ...... NN

F xf

xf

xf

++

+

= . (2.6)

Aplicando a Eq.(2.6) para a funo ),( mn , obtm-se o erro de medio do

ndice de refrao que pode ser posto na forma

2/12

221 )( +=n , (2.7)

onde

mm +=

)2/sen(]2/)cos[(

21

1 , (2.8)

=)2/(sen)2/sen(

21

22m . (2.9)

Nas Eqs.(2.8) e (2.9) os termos m e so os erros nas medidas de m e

respectivamente. Por exemplo, para um prisma com ndice de refrao 5,1=n e 060= , a Eq.(2.3) fornece 18,37=m para esses parmetros. Admitindo um erro na

medio angular tal que m , a Eq.(2.7) com auxlio das Eqs.(2.8) e (2.9) fornece

mnn = . Ou seja, o erro relativo de determinao do ndice de refrao

aproximadamente igual quele associado a medio angular. Portanto, a determinao

precisa do ndice de refrao depender de quo preciso for medido o desvio m . O

mtodo acima apresentado conhecido como mtodo clssico de determinao do

Captulo 2


8

ndice de refrao e a partir dele outros mtodos alternativos foram implementados para

determinar esse parmetro em materiais com estruturas prismticas. Tcnicas como

medio direta do ngulo de Brewster, usando um laser e uma cmera de CCD permite

determinar o ndice de refrao da ordem de aproximadamente uma ou duas casas

decimais [10], por outro lado usando o espectrmetro goniomtrico de Gaertner que

combina o mtodo do desvio mnimo com medidas interferomtricas [11] permite medir

ndice de refrao de materiais slicos, em formato prismtico e no comprimento de

onda de 193nm, da ordem de aproximadamente seis casas decimais. Contudo esse

mtodo utiliza motores de passo micromtricos e uma montagem bastante sofisticada e

dispendiosa de difcil realizao prtica. Na seo seguinte apresentamos a construo

de um reflectmetro, objetivando inicialmente a determinao do ndice de refrao e

do ngulo interno de um prisma, e a longo prazo para realizao dos estudos e

aplicaes do efeito de ressonncia de plsmons de superfcie tratados nesta dissertao.

2.4 Configurao do Reflectmetro

Com objetivo de realizar estudos e aplicaes do fenmeno de RPS foi montado

um reflectmetro com o qual foi possvel caracterizar um material no formato

prismtico, extraindo o ndice de refrao e ngulo interno do prisma. A Fig.2.3 ilustra a

configurao do reflectmetro. Um laser de HeNe )nm8,632( = de 5mW polarizado

na direo paralela ao plano de incidncia atravs do polarizador P. O feixe dividido

nas componentes S1 e S2 atravs do divisor de feixe BS. O feixe S1 incide sobre o

prisma equiltero de vidro crown BK7 (Melles Griot, Irvine, Califrnia - EUA) com

arestas de 60mm, e valores nominais para o ngulo interno e ndice de refrao = 60o

3 arcmin e n(=632,8nm) = 1,515 0,001, respectivamente. O prisma est fixado,

atravs de um suporte, a um estgio de rotao que pode girar nos sentidos horrio e

anti-horrio atravs de um parafuso micromtrico. Dois fotodetectores de silcio, D1 e

D2 so usados para medir as intensidades do feixe refletido pelo prisma S3 e do feixe de

referncia S2. Os sinais gerados pelos fotodetectores D1 e D2 so coletados em dois

canais de um conversor analgico-digital DAS-16, 100 kHz (Keithley Instruments,

Cleveland, Ohio - EUA) alojado em um dos slots de um IBM-PC 486.


Um software desenvolvido no ambiente quickbasic utilizado para

processamento e gravao dos dados. Para minimizar rudo, cada medida obtida da

mdia de 1000 amostras da razo entre o sinal S3 e a referncia S2. Para obter a

reflectncia do prisma, que corresponde razo S3/S1, mede-se a razo S1/S2 antes de

cada seqncia de medidas que independente de flutuaes no nvel de potncia do

laser. A partir dessa medida, a reflectncia interna da face superior do prisma dada

por

13

2/12/3

SS

SSSSR == . (2.10)

Uma calibrao entre a variao relativa de deslocamento l do parafuso

micromtrico e a variao relativa do ngulo de giro do prisma foi obtida variando-

se o ngulo entre os feixes S1 e S2, mantendo o prisma sempre perpendicular ao feixe

S1, conforme ilustrado na Fig.2.4.

S1S3

S2HeNe

P

BS

D1

D2

Fig 2.3 Configurao do reflectmetro ptico: P-polarizador; BS-divisor de feixe; S1-

feixe incidente, S2-feixe de referncia; S3-feixe refletido pelo prisma; D1-fotodetector

do sinal; D2-fotodetector da referncia.


9

A curva de calibrao representada na Fig.2.5 foi obtida relacionando-se a

variao 01 = em funo do deslocamento l do parafuso micromtrico. A

curva fornece uma inclinao /l = 1,288o/mm. O intervalo mximo de variao do

Captulo 2


10

parafuso de 10mm, com resoluo de 10 m. O suporte de giro do prisma

permite, aps atingido um intervalo completo de 10 mm, o reposicionamento do

parafuso, gerando assim uma rotao contnua do prisma em uma faixa angular

arbitrria.

O sistema atual tem uma incerteza de leitura na posio do parafuso estimada em

2,5 m ( 0,19 arcmin). Aps essa calibrao o divisor BS foi mantido numa posio

fixa para realizao das medidas. A Tabela 2.1 sumariza os parmetros caractersticos

do sistema.

Tabela 2.1 Caractersticas do sistema ptico Varredura do Espectrmetro do ER 10mm

Passo por volta do parafuso do ER 0,5mm

Sub-divises por volta do ER 50

Resoluo do parafuso do ER 10m

Incerteza 2,5m

Potncia do laser 5mw

Comprimento de onda, 632,8nm

nBK7 1,5150,001

*ER- Estgio de Rotao

1l

0l

0 1

S1

S2S

Fig.2.4 Calibrao do parafuso micromtrico.


Dani

Para medio da dependncia angular da funo reflectncia foi adotado o

seguinte procedimento. Inicialmente o prisma posicionado de forma que a sua face

frontal fique alinhada perpendicularmente direo do feixe S1, ilustrado na Fig. 2.3

Todo posicionamento angular feito a partir desse ponto de referncia inicial, com o

estgio sendo rotacionado no sentido horrio da Fig.2.3. Para cada ngulo de rotao o

detector D1 posicionado de forma a sempre estar perpendicular ao feixe S3 da Fig.2.3.

Quando o parafuso atinge o seu limite mximo de varredura, o fotodetector D1

retirado de posio de forma a permitir que o raio transmitido S3 atinja a superfcie da

mesa ptica.

ngu

para

trav

futu

fim

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0

2

4

6

8

10 (g ra us)

l(m m )

Fig.2.5 Dependncia da variao relativa do ngulo de giro do prisma com o deslocamento l do parafuso micromtrico.

el Ferreira da Ponte 11

A posio do feixe sobre a mesa marcada. Essa posio representa o ltimo

lo medido. Em seguida o parafuso destravado e girado no sentido anti-horrio

sua posio inicial. Com o cuidado de evitar o efeito de histerese o parafuso

ado novamente movendo o prisma sempre na mesma direo. Em implementaes

ras do reflectmetro esse problema ser evitado pela utilizao de um parafuso sem

acionado por um motor de passo controlado por computador.

Captulo 2


12

Na seo 2.5 o objetivo demonstrar a viabilidade de medio do ndice de refrao

com o reflectmetro. demonstrada a seguir a viabilidade de medio simultnea do

ndice de refrao e de um ngulo interno do prisma com o reflectmetro.

2.5 Caracterizao do Reflectmetro: Medio Precisa de ndice de Refrao

A trajetria do feixe no interior do prisma est ilustrada na Fig.2.6. Algumas

reflexes foram omitidas para no sobrecarregar a figura. Admite-se que o prisma tenha

ngulo entre as faces 1 e 2 e ' entre as faces 2 e 3. O emprego da formulao de

Fresnel para polarizao no plano de incidncia, conforme a indicado na Fig.2.6, a

reflectncia R=S3/S1 pode ser expressa na forma [13]

( ) ( ) ( ) 2 ' = rTTR , (2.11)

com

( ) ( )[ ]( )[ ]{ }22/1 222

2/1 222

sencos

sencos4

xnxn

xnxnxT+

, (2.12)

representando a funo transmitncia associada a face 1 ou 3 e com

( ) ( )[ ]( )[ ]

cossen1

cossen12/1 22

2/1 22

+

=nn

nnr , (2.13)

representando a refletividade da face 2, onde

= , (2.14)


Dani

=

nsensen 1 . (2.15)

a lei

em

face

valo

nos

valo

simp

post

.

n

face 1

S1 S3

face 3

''

'

Fig 2.6. Diagrama do caminho do feixe de luz no interior do prisma. Algumas reflexes foram omitidas para simplificar o diagrama.

el Ferreira da Ponte 13

A Eq.(2.14) obtida diretamente da geometria da Fig.2.6 a Eq.(2.15) representa

de Snell da refrao do feixe S1 na face 1.

A reflectncia dada pela Eq.(2.13) tem duas regies caractersticas importantes

torno do ngulo de Brewster e do ngulo crtico associados ao feixe incidente na

2. importante observar que as localizaes desses parmetros so sensveis aos

res de n e , de acordo com as Eqs.(2.14) e (2.15). Uma vez que o prisma estudado

experimentos equiltero satisfazendo a ' , e dado que a funo T(x) tem um

r praticamente unitrio que pouco varia com o argumento x, os clculos podem ser

lificados assumindo-se a condio ' . Nessa aproximao a Eq.(2.11) pode ser

a na forma

Captulo 2


14

( ) ( ) 2 = rTR . (2.16)

Um grfico de )(R est ilustrado na Fig.2.7 para n= 1,52 e =600 . Nele

possvel identificar o ngulo crtico c a partir do qual ocorre reflexo interna total na

face superior do prisma e o ngulo de Brewster B no qual ocorre transmisso total

nessa face.

Mostraremos a seguir dois mtodos alternativos para obteno dos parmetros n

e . O primeiro mtodo utiliza a medio da reflectncia para extrao dos parmetros a

partir do mtodo das correo diferenciais. O segundo, que denominamos de mtodo

algbrico permite obter esses parmetros a partir da medio precisa dos ngulos C e

B.

Reflectividade

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

20 30 40 50ngulo de incidncia externa

c B

Fig.2.7 Curva terica da reflectncia para =`=600 e n=1,52.



15

2.6 Mtodo das Correes Diferenciais

O mtodo das correes diferenciais permite ajustar os parmetros caractersticos

do prisma, n e , at que eles atinjam valores que minimizem o erro mdio quadrtico

entre as curva terica e experimental. Esse mtodo uma extenso do mtodo dos

mnimos quadrticos para mais de um parmetro. Nele os N valores medidos da

reflectncia 23 SS , representados pelos pontos experimentais (i,Yi ), i {1,N} so

utilizados para o ajuste dos parmetros n e da reflectncia Ri R(n,,i) de forma a

minimizar o erro quadrtico,

( )=

N

iii RY

1

2 . (2.17)

A minimizao da Eq.(2.17) fornece o sistema de duas equaes[25]

( )

=

+

=== nRYRR

nRn

nR iN

iii

N

i

iiN

i

i

111

2

, (2.18)

( )

=

+

===

i

N

iii

N

i

iN

i

ii RYRRnRnR

11

2

1 . (2.19)

Nessas expresses n e representam as correes diferenciais nos parmetros

n e a partir de estimativas iniciais para esses parmetros.

Um procedimento iterativo foi implementado no ambiente Mathcad para o

clculo das solues das Eqs.(2.18) e (2.19) a partir de estimativas iniciais do ngulo

interno e ndice de refrao do prisma, obtidos das especificaes do fabricante. O

procedimento de iterao interrompido quando as correes tornam-se inferiores ao

parmetro de erro definido no programa, cujo cdigo est mostrado na Tabela 2.2.

Captulo 2

D

Tabela 2.2 Procedimento de interao pelo mtodo das correes diferenciais

e

c

t

o

u

s

i

f

p

e

A

X0 a b,( ) 2

20

xa

b

A x0 x1,( ) 10

N 1

i

f2 x0 x1, mi 0,,( ) mi 1,( )f2 x0 d+ x1, mi 0,,( ) f2 x0 x1, mi 0,,( )

d

=

0

N 1

i

f2 x0 x1, mi 0,,( ) mi 1,( )f2 x0 x1 d+, mi 0,,( ) f2 x0 x1, mi 0,,( )

d

=

x x +

1 0.001>while

0 0.001>while

x

:=

dAA a b,( ) dAB a b,( )

aniel Ferreira da Ponte 16

O grfico da Fig.2.8 ilustra a comparao entre a curva medida

xperimentalmente e aquela obtida aps o ajuste de parmetros pelo mtodo das

orrees diferenciais. Os dados experimentais antes de serem processados pelo mtodo

iveram de ser corrigidos quanto a possveis fontes de erros. Uma delas proveniente de

feixe gaussiano do laser de HeNe ter uma pequena divergncia angular, o que fornece

ma contribuio no nula para a reflectncia no ngulo de Brewster. Duas outras fontes

o uma componente no nula de polarizao na direo perpendicular ao plano de

ncidncia devido a no perfeio do polarizador, e a corrente no nula de escuro do

otodetector. Esse efeito foi corrigido, subtraindo a reflectncia residual observada na

osio de reflectncia mnima. Aps o tratamento dos dados, o programa ajusta a curva

fornece os parmetros procurados. Para essa curva foram obtidos n=1,515 e =59,89

Fig.2.9 ilustra em mais detalhe a Fig.2.8 na regio em torno do ngulo de Brewster.

A a b,( )dAB a b,( ) dBB a b,( )

:=



17

Um exame de ambas as figuras ilustra o excelente grau de ajuste entre a curva

terica e os pontos experimentais. Vale observar que para essas medidas os valores de

reflectncia foram obtidos a intervalos regulares espaados de cerca de 0,644.

Reflectncia

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 10 20 30 40 50 60 (graus)

Fig.2.8. Dependncia angular da funo reflectncia (linha slida) aps o ajuste aos pontos medidos experimentalmente (losangulos) para 515.1=n e 89.59= .

Captulo 2


18

2.7 Mtodo Algbrico

O mtodo algbrico uma forma alternativa de determinar o ndice de refrao e

o ngulo interno do prisma. Nessa tcnica necessrio obter com preciso o ngulo de

Brewster e o ngulo crtico da curva de reflectncia e a partir desses valores determinar

os dois parmetros de interesse. No entanto o problema no tem uma soluo analtica

fechada devido a interdependncia dos parmetros, imposta pela refrao na face 1 do

prisma. Para obteno dos parmetros considere-se a Eq.(2.14). Tomando a funo

seno em ambos os lados desta equao e utilizando a relao trigonomtrica podemos

express-la na forma

Reflectncia

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0,035

20 30 40 50 60 (graus)

Fig.2.9 Detalhamento das curvas da Fig.2.8 na regio em torno do ngulo de Brewster.



19

( )[ ]{ }+= cossensensen1sen 2/1 22nn

. (2.20)

Na condio de ngulo crtico, observada experimentalmente para = c, tem-se

c= logo pela lei de Snell

nc /1sen = , (2.21)

e a Eq.(2.20) fornece ( )nfsen ,onde

( ) ( )[ ] ( ){ }2/1 22/1 222 1sensen1 += nnnnf cc . (2.22)

Por outro lado no ngulo de Brewster, observado experimentalmente para

= B, tem-se = B com

( ) 2/12 11sen+

=n

B , (2.23)

( ) 2/12 1cos += nn

B , (2.24)

e a Eq.(2.20) fornece ( )ngsen onde

( ) ( )( )[ ]

+

+=

nn

nng BB

2/1 22

2/12

sensen1

1 . (2.25)

Um procedimento numrico foi implementado com o emprego da funo

embutida root no ambiente Mathcad para determinao da raiz da equao

( ) ( ) 0= ngnf , a partir do valor de n especificado pelo fabricante. Obtido o valor de n

Captulo 2


20

a Eq.(2.22) ou a Eq.(2.25) utilizada para obteno de . A Fig.2.10 ilustra as

dependncias em n das funes f e g, para um dado par de valores c e B, obtidos

experimentalmente. Como podemos observar, para uma faixa de valores de ndice de

refrao fisicamente realizvel h apenas uma interseo entre as duas curvas, no

havendo portanto ambigidade na soluo.

A determinao precisa dos parmetros c e B no to direta. Na regio em

torno do ngulo crtico, a mudana de declividade da curva de reflectncia no to

abrupta conforme previsto teoricamente devido a pequena divergncia do feixe

gaussiano do laser. Dessa forma a funo exibe um joelho que torna difcil a

determinao da localizao exata do ngulo c . Devido a isso utilizou-se uma funo

0,82

0,83

0,84

0,85

0,86

0,87

0,88

0,89

0,9

0,91

0,92

1,35 1,4 1,45 1,5 1,55 1,6 1,65

ndice de refrao n

g (n)

f (n)

Fig.2.10 Curva de interseco das funes )(nf e

)(ng para 02,29=c e 54,42=B .



21

de interpolao do aplicativo do Mathcad para representar a funo reflectncia em

torno do ngulo crtico. A partir da interseo das duas retas tangentes s regies antes e

depois do ngulo crtico o ngulo c foi obtido. Esse procedimento est ilustrado na

Fig.2.11.

Na regio do ngulo de Brewster o ponto mnimo tem tambm uma incerteza,

conforme ilustrado na Fig.2.12. Assim implementamos tambm um procedimento de

interpolao com uma funo spline do Mathcad para a partir dela determinar o ponto

de mnimo B com melhor preciso.

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

28,8 28,85 28,9 28,95 29 29,05 29,1 29,15 29,2

(graus)

Reflectncia

Fig.2.11 Regio em torno do ngulo crtico da curva de reflectncia.

Captulo 2

Reflectncia

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,014

0,016

0,018

0,02

35 38 41 44 47 50 53 56 (graus)

Fig.2.12. Interpolao da reflectncia em torno do ngulo de Brewsteratravs da funo Spline do Mathcad.


22

2.8 Resultados e Discusso

Foram realizadas vrias seqncias de medidas de reflectncia utilizando a

montagem da Fig.2.3. Os resultados obtidos foram analisados atravs do mtodo das

correes diferenciais e pelo mtodo algbrico. Para o mtodo algbrico foram

realizadas medidas com duas resolues angulares para verificao do efeito na preciso

dos resultados. A Tabela 2.3 apresenta um conjunto de trs resultados obtidos

experimentalmente e os valores nominais fornecidos pelo fabricante. A resoluo

angular entre os pontos para o mtodo das correes diferenciais e para o mtodo

algbrico I 0.644 Graus, e para o mtodo algbrico II 0,01288 graus.



23

Tabela 2.3 Resumo dos resultados experimentais Parmetro A B C D

n 1,5150,001 1,5160,005 1,520,05 1,5120,005

6000,050 59,900,10 60020 6000,20

A- Especificao do fabricante, B- Mtodo das correes diferenciais, C-Mtodo

algbrico I, D- Mtodo algbrico II.

Na Tabela 2.3 pode-se perceber uma maior incerteza usando o mtodo algbrico

I justamente pela dificuldade de determinao precisa dos ngulos c e B. Para uma

menor resoluo, como no mtodo algbrico II, a preciso da medida melhorou

sensivelmente. Outro fator importante a ser observado a incerteza obtida com o

mtodo da correo diferencial que foi de aproximadamente n/n 5 103 mesmo

com o emprego de uma resoluo da ordem de = 0,6o 102 rad. De acordo com as

Eqs.(2.8) e (2.9) a resoluo angular forneceria uma incerteza n/n 1,3 102 se a

medida fosse realizada atravs do mtodo do desvio mnimo. Isso indica que a medio

da curva de reflectncia e extrao dos parmetros pelo mtodo das correes

diferenciais resulta em uma preciso cerca de 4 vezes maior em relao quela obtida

com o mtodo do desvio mnimo.

2.9 Concluses e Perspectivas

Nesse captulo apresentamos a montagem de um reflectmetro e o seu uso na

medio do ndice de refrao e do ngulo interno de materiais em formato prismtico.

A proposta dessa montagem apresentar uma forma alternativa e simples para

determinao desses parmetros, bem como realizar a etapa inicial de investigao do

fenmeno de RPS. Nessa montagem foi possvel constatar as dificuldades de realizao

desse tipo de medida e propor duas tcnicas alternativas para determinar os parmetros

envolvidos. A preciso dos valores medidos foi comparvel ou melhor do que aquele

obtido atravs de tcnicas convencionais.

Captulo 3


24

3. Plsmons de Superfcie 3.1 Introduo

Plsmons de superfcie (PS) so oscilaes eletromagnticas confinadas

interface entre um metal e um meio transparente. A primeira observao do efeito de

Ressonncia de Plsmons de Superfcie(RPS) foi realizada por Turbadar [14] em

filmes de prata. O autor, no entanto, no atribuiu o efeito existncia de uma oscilao

confinada superfcie do metal. A excitao de plsmons de superfcie foi primeiro

reconhecida por Otto [5], que props o acoplamento de luz oscilao atravs de um

prisma de vidro com uma das faces separada da superfcie metlica de uma distncia da

ordem de um comprimento de onda. Outra proposta de observao do efeito foi sugerida

por Kretschmann [6], que utilizou um prisma de acoplamento com uma face coberta com

um filme fino de prata.

Neste captulo apresentamos um estudo detalhado de como se manifesta a

oscilao de plsmon de superfcie em metais, que o efeito fundamental investigado

neste trabalho.

3.2 Modelo Clssico da Resposta em Freqncia da Permissividade Eltrica de Meios Materiais

Compreender o princpio de interao da luz com a matria fundamental para o

entendimento de diversos fenmenos fsicos como a reflexo, a transmisso e a

propagao da luz em meios materiais. Aqui, apresentamos o modelo clssico proposto

por Drude-Lorentz [15] que considera a matria do ponto de vista eltrico como formada

por cargas livres e cargas ligadas. Com base nesse modelo possvel determinar a

permissividade eltrica ( ) ou alternativamente a condutividade eltrica ( ) . Inicialmente, iremos modelar o meio material [16], como formado por um mar de

tomos, cuja distribuio de cargas est ilustrada na Fig.3.1 e sujeitos a aplicao de um

campo eltrico externo E!

. Assume-se que cada tomo seja composto por um ncleo de

Espectrmetro de Plsmons de Superfcie no Infravermelho para o Desenvolvimento de Biossensores


25

massa M e carga Zq e por Z eltrons, cada um com carga q e massa m, com alguns

desses eltrons podendo ser livres ou ligados ao ncleo do tomo. O vetor posio da i-

sima carga do sistema pode ser posto na forma

ieqii rRR!!! += , (3.1)

onde i = 0,1, 2, ...Z, iR!

o vetor posio da i-sima carga, com posio de equilbrio

eqiR!

, deslocamento relativo ir! , com i =0 representando o ndice associado ao ncleo e

os Z ndices restantes associados aos eltrons do tomo.

Para um conjunto de cargas discretas como ilustrado na Fig.3.1 o momento de

dipolo eltrico da forma

=

=Z

iii Rq

0

!!p . (3.2)

1R

2R3R

iRzR

MqZ

eltrons

E

ncleo

Fig.3.1 Distribuio de cargas em um tomo sob a ao de um campo eltrico externo.

Captulo 3


26

Considerando que cada tomo do material seja no-polar, na ausncia de um

campo eltrico externo 0=p!

. Sob essa condio, utilizando a Eq.(3.1) com 0!! =ir na

Eq.(3.2), temos

=

=Z

ieqieq RqRZq

100

!!,

ou equivalentemente

=

=Z

ieqieq RZ

R1

01 !! . (3.3)

Aplicando-se um campo eltrico na direo x, da forma,

xxa

"!EE = (3.4)

e admitindo-se que o sistema de tomos seja isotrpico, a equao de movimento para

cada carga do sistema pode ser posta na forma[15]

( )eqiiiiiiiiii RRmRmqRm

!!#!!##! = 2E , (3.5) onde m0 = M, mi = m (i=,1,2,...,Z), q0 = Zq, qi = q (i=1,2,...,Z) e com i e i

representando a constante de amortecimento e freqncia natural de oscilao da i-sima

carga do sistema, respectivamente. Com base na Eq.(3.1) e nas relaes rRi ##!##! = e ii rR #

!#! = ,

tem-se,

iiiiiiiii rmrmqrm!#!!##! 2= E . (3.6)

Definindo ( )iiii zyxr ,,=

! , a Eq.(3.6) gera as trs equaes diferenciais

iiiixi

ii xxm

qx 2 = ### E , (3.7)

iiiii yyy2 = ### , (3.8)

iiiii zzz2 = ### . (3.9)



27

As Eqs.(3.8) e (3.9) exibem a forma geral

0'" 2 =++ SSS ii , (3.10)

que para o caso ii >> , tem como soluo geral

( ) ( )iit tAetS i += cos2/ , (3.11)

com A e i representando a amplitude e fase, determinadas a partir da condio inicial

para a funo S. Esse ltimo resultado mostra que na ausncia de um campo eltrico

aplicado nas direes y e z, as componentes de deslocamento representadas por S(t)

tendem ao valor de equilbrio nulo. Assumindo-se que o campo externo seja senoidal na

freqncia , i.e.,

)Re( tjxx eE=E , (3.12)

no regime permanente senoidal, tem-se

)Re( tjii eXx= , (3.13a)

yi = zi=0. (3.13b)

Substituindo-se as Eqs.(3.12) e (3.13a) na Eq.(3.7) resulta em

( ) xi22iii

i EjmqX

/

+= . (3.14)

Com base na Eq.(3.2) e Eq.(3.3), o momento de dipolo do tomo pode ser posto na forma

=

=Z

iirqrZq

10

!!!p . (3.15)

Captulo 3


28

No regime permanente, as componentes do momento de dipolo induzido pelo campo externo so dadas por ( ) 00,Re === zytjxx ep p ,p p , e usando as Eqs.(3.14) e (3.15) obtm-se

( )( ) ( ) x

Z

i ii

ix Ej

mqj

MZqp

+

++

= =1

22

2

022

0

2

/

/ . (3.16)

Admitindo-se que haja N tomos por unidade de volume, o vetor polarizao em regime permanente pode ser escrito na forma

pNP !!

= . (3.17)

Utilizando-se a Eq.(3.17) na relao constitutiva

PEED!!!!

+== 0 (3.18) obtm-se

( )( ) ( )= ++++=

Z

i ii

i

jmNq

jMZqN

122

02

022

0

02

0

//1

. (3.19)

Consideremos que em cada tomo do material existam K grupos de eltrons, com

cada grupo composto de fj eltrons exibindo mesma freqncia natural j e constante de

amortecimento j. Nessas condies,

=

=K

jj Zf

1

e a Eq.(3.19) pode ser escrita na forma



29

( ) ( )= +

++

+=

K

j jj

jr jj 1

22

2

022

0

20

01 , (3.20)

com

( )0

220

M

ZqN , (3.21)

0

22

mNqf j

j . (3.22)

Para o caso de metais, admite-se que o K-simo grupo de eltrons seja composto

de cargas livres com constante de amortecimento K, e com freqncia de ressonncia K

= 0. Considerando que a freqncia de ressonncia 0 do ncleo do tomo ocorre

geralmente em baixas freqncias, na regio espectral que vai do infravermelho at o

ultravioleta tem-se >> 0. Estando as freqncias de ressonncia de eltrons ligados

geralmente localizadas na regio do ultravioleta distante, tal que j >> , a Eq.(3.20)

pode ser simplificada para a forma

K

prr j

= 2

2

0 , (3.23)

onde

=

+

1

12

2

2

20

0 1K

j

jr

j

(3.24)

representa uma permissividade relativa, associada ao background de contribuies do

ncleo e dos eltrons ligados e que longe das ressonncias do material varia

monotonicamente com a freqncia, podendo ser prxima de 1 dependendo da regio

espectral considerada [16]. Na Eq.(3.23) define-se a freqncia de plasma, diretamente

da Eq.(3.22) com j = K, ou seja,

0

22

mNqfK

p . (3.25)

Captulo 3


30

Admitindo a hiptese simplificadora r0 1 na Eq.(3.23), vlida para um gs de

eltrons livres, e definindo-se K, a permissividade relativa de metais assume a forma

simples

=

jp

r 2

2

1 . (3.26)

A permissividade relativa do material pode ser decomposta em partes real e

imaginria na forma

"' = jr . (3.27)

Da Eq.(3.26), para o caso de um metal modelado como um gs de eltrons,

22

21'

+

= p , (3.28)

+

= 22

2" p . (3.29)

Para o caso >> , o que sempre satisfeito na maioria dos metais, essas expresses

podem ser simplificadas para

2

21'

p (3.30)

3

2"

= p (3.31)

A Eq.(3.30) mostra que a parte real da permissividade relativa torna-se negativa

para p



31

oscilaes de plsmons de superfcie em metais, como ser discutido na Seco

seguinte. A freqncia de plasma em metais, caracterizados por uma alta densidade de

eltrons livres, situa-se geralmente na regio do espectro entre o azul e o ultravioleta,

como evidencia a Eq.(3.25). Para o caso real, a regio de mudana de sinal da parte real

da permissividade relativa de metais influenciada pelas vrias ressonncias no

material.

Os grficos da Fig.3.2 ilustram as dependncias espectrais das partes real e

imaginria da permissividade de alguns metais nobres, medidas experimentalmente [17].

Como podemos observar, a parte real da permissividade desses metais negativa na

regio entre o visvel e o infravermelho, com o alumnio sendo o nico metal exibindo '

< 0 at a regio do ultravioleta.

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

0,4 0,6 0,8 1 1,2

Ouro

( m)

'

"

"10

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

0,4 0,6 0,8 1 1,2

Cobre

( m)

'

"

"10

-90

-80

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

0,3 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3

Prata

( m)

"

'

"10

-140

-120

-100

-80

-60

-40

-20

0

0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Alumnio

( m)

"

'

Fig.3.2 Dependncia espectral das permissividades complexas dos metais ouro, cobre, prata e alumnio [17].

Captulo 3


32

3.3 Condies de existncia de oscilaes de plsmons de superfcie

Na seco anterior, foi feito um breve estudo da dependncia espectral da

permissividade de metais que exibem a caracterstica principal para observao de

oscilaes de plsmons de superfcie, qual seja, a existncia de uma regio espectral

onde a parte real da permissividade relativa negativa. Nesta seco aplicaremos os

resultados obtidos para satisfazer as condies impostas. Para isso consideramos a

interface planar entre dois meios com permissividades relativas 1 e 2 , conforme

ilustrado na Fig.3.3. Quer-se determinar a condio necessria e suficiente para

existncia de uma oscilao confinada interface, caracterstica da oscilao de

plsmons de superfcie. O problema pode ser modelado impondo-se a condio de

inexistncia de reflexo na interface, a partir da incidncia de uma onda plana no meio 1,

indicado na Fig.3.3 [16]. Essa inexistncia de reflexo pode levar ao fenmeno de

transmisso total na interface ou existncia de uma oscilao confinada interface.

O

O problema pode ser resolvido separadamente para os casos de polarizao

perpendicular e paralela ao plano de incidncia. Os campos de uma onda plana

eletromagntica podem ser expressos na forma [18],

1

2

11E

iH1

22E

iH2

1K

2K

Fig.3.3. Geometria para determinao da condio de existncia de uma oscilao confinada a uma interface planar.



33

)( trKjii eEE

=!!!!

(3.32a)

0

)(

= iiiEKH!!

(3.32b)

onde, iK!

o vetor de onda no meio i na freqncia e r! o vetor posio. No sistema

de coordenadas da Fig.3.3, o vetor de onda e o vetor posio podem ser decompostos nas

formas,

zixxi akakK +=!

, (3.33)

zx azaxr +=

!. (3.34)

Dado que

ii kK = 0 , (3.35)

com ck /0 = , a Eq.(3.33) fornece

iix kkk 20

22 =+ (3.36)

Para ondas TE, definidas como tendo polarizao perpendicular ao plano de

incidncia, os campos podem ser escritos como

Meio 1:

)(1

1)0,1,0( zkxkj xeAE +=!

, (3.37a)

)(

10

111

1),0,( zkxkjx xekkAEKH +=

=!!

!. (3.37b)

Captulo 3


34

Meio 2:

)(2

2)0,1,0( zkxkj xeBE +=!

, (3.37c)

)(

20

222

2),0,( zkxkjx xekkBEKH +=

=!!

!, (3.37d)

onde A e B so as amplitudes dos campos eltricos nos meios 1 e 2, respectivamente.

Aplicando-se as condies de contorno em 0=z , i.e.,

=

00!

!

!

!!

HEn , (3.38)

com n! correspondendo ao vetor unitrio normal interface, obtm-se

0= BA ,

021 =+ BkAk .

A forma matricial desse sistema de duas equaes da forma

=

0011

21 BA

kk.

Para que esse sistema admita soluo no trivial necessrio impor a condio

011

det21

=

kk

,

o que fornece 21 kk = . Da Eq.(3.36) essa condio s pode ser satisfeita se

21 = . (3.39)



35

A Eq.(3.39) implica na inexistncia de meios com propriedades pticas distintas

na Fig.3.3, o que corresponde a situao trivial de propagao de uma onda TE em um

meio homogneo.

Para ondas TM, i.e., com polarizao no plano de incidncia, os campos podem

ser expressos como

Meio 1:

)(

111),0,( zkxkjx xekkAE

+=!

(3.40a)

)(

0

201

0

111

1)0,1,0( zkxkj xekAEKH +

=

=!!

! (3.40b)

Meio 2:

)(22

2),0,( zkxkjx xekkBE+=

! (3.40c)

)(

0

202

0

222

2)0,1,0( zkxkj xekBEKH +

=

=!!

! (3.40d)

Aplicando-se a Eq.(3.38) na interface z=0, obtemos as relaes

021 = AkAk ,

021 = BB .

Em forma matricial,

=

00

21

21

BAkk

.

Captulo 3


36

Semelhantemente anlise anterior, para a existncia de soluo no trivial impe-se a condio

0det21

21 =

kk,

o que fornece

2112 kk = . (3.41)

Usando as Eq.(3.36) e Eq.(3.41) obtm-se

( ) ( )222021212022 xx kkkk = .

Aps algumas manipulaes algbricas essa ltima expresso pode ser posta na forma,

21

210

+

= kkx . (3.42)

Usando as Eq.(3.36) e Eq.(3.42) obtm-se

21

21

01 += kk , (3.43)

21

22

02 += kk . (3.44)

As Eqs.(3.42) a (3.44) expressam as condies que devem ser obedecidas para

existncia de transmisso total ou confinamento na interface, como examinado a seguir.



37

3.3.1. Transmisso total: ngulo de Brewster

Consideremos a situao mais simples na qual ambos os meios sejam

transparentes, exibindo assim um valor positivo da permissividade relativa. Nessas

condies os parmetros definidos pelas Eqs.(3.42) a (3.46) so todos reais e a soluo

do problema corresponde transmisso total da onda incidente no meio 1 atravs da

interface, sem ocorrncia de reflexo. Essa condio ocorre para um ngulo de

incidncia 1=B que pode ser obtido, a partir da geometria mostrada na Fig.3.3, da

condio

11 k

ktgtg xB == ,

e das Eqs.(3.42) e (3.43) obtm-se

1

2=Btg ,

ou equivalentemente

1

2nntg B = (3.45)

onde ni (i = 1, 2) o ndice de refrao do meio i. A Eq.(3.45) define portanto o ngulo

de Brewster para uma onda TM incidente no meio 1, que totalmente transmitida para o

meio 2.

3.3.2. Confinamento na interface: plsmons de superfcie A condio obtida anteriormente no fornece uma onda confinada pois

restringimos a situao para dois meios transparentes. possvel obter uma onda que

seja evanescente em ambos os lados da interface e que se propague paralelamente

mesma se impormos que os parmetros k1 e k2 sejam imaginrios puros e que kx seja um

nmero real. Das Eqs.(3.43) e (3.44) a condio de obtermos nmeros imaginrios puros

pode ser satisfeita se 1 e 2 forem nmeros reais tal que

Captulo 3


38

021



39

tambm uma onda evanescente em um metal e sob condies de acoplamento crtico

possvel transferir toda energia do feixe incidente para a oscilao conforme examinado

a seguir.

3.4.1 Configurao de Otto

A configurao proposta por Otto para excitao de plsmons de superfcie

ilustrada na Fig.3.4. Como possvel observar nessa figura, um filme metlico

posicionado a uma certa distncia d de uma das faces do prisma.

necessrio que o meio transparente entre o metal e o prisma tenha ndice de refrao

menor que o do prisma, permitindo que a onda incidente, na face superior do prisma

como ilustrado na Fig.3.4, possa sofrer reflexo interna total, criando assim uma onda

evanescente no meio transparente. Sob condies crticas, quando o vetor de onda no

interior do prisma dado por

Portanto, sob condies crticas, quando o vetor de onda no interior do prisma dado por

= sen01knkx (3.50)

atingir o valor PSx kk = , possvel observar uma forte absoro de luz pela oscilao.

prisma

d

Substrato

metalx

z

Fig.3.4. Configurao de Otto para excitao de RPS

Captulo 3


40

O grau de absoro depende do espaamento d entre o prisma e o metal, e o valor tpico

desse gap da ordem do comprimento de onda do feixe incidente. Na Fig.3.5 so

mostradas trs curvas em =632,8nm tericas para alguns valores de d, para o caso de

um prisma de vidro BK7, cujas constantes pticas esto listadas na Tabela 3.1. O clculo

foi feito com o emprego da formulao de Fresnel para reflectncia de estrutura

mostrada na Fig.3.4[5]

3.4.2 Configurao de Kretschmann

A configurao proposta por Kretschmann ilustrada na Fig.3.6 se baseia no

mesmo princpio da configurao de Otto, a diferena que o filme metlico est em

contato direto com a superfcie do prisma e nessa condio uma onda evanescente

naturalmente criada quando o feixe de entrada incide na face superior do prisma a um

ngulo c> .

Reflectncia

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

30 35 40 45 50 55 60ngulo interno(graus)

d=632.8nm

d=732,8nm

d=832,8nm

Fig.3.5 Efeito produzido pela variao da espessura da camada de ar entre o prisma e o metal na configurao de Otto, para =632,8nm e os valores de n e listados na Tabela 3.1.



41

Nesse caso, a oscilao de plsmon de superfcie ocorrer na interface externa do

metal. A absoro do feixe incidente fortemente dependente da espessura dk do metal

como pode ser visualizado na Fig.3.6. Essas curvas foram calculadas para os parmetros

da Tabela 3.1.

Tabela 3.1 Parmetros pticos utilizados nos clculos das curvas das Figs.(3.5) e (3.7)

(nm) ` `` n

632,8nm -10,333 -1,685 1,515

metalprisma

x

z

kxdk

Fig.3.6 Configurao de Kretschmann para excitao de PS.

Captulo 3

Dan

efei

con

Reflectncia

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

30 40 50 60 70ngulo interno(graus)

dk=60nm

dk=40nm

Fig.3.7 Efeito produzido pela variao do parmetro dK na configurao de Kretschmann em =632,8nm, com e n listados na Tabela 3.1.

iel Ferreira da Ponte 42

Nesta dissertao usaremos a configurao de Kretshmann para aplicao do

to de RPS no desenvolvimento de sensores biolgicos. A reflectncia para essa

figurao dada por[6]

( )( )

2

22312

22312

2exp12exp

djkrrdjkrr

R++

= , (3.51)



43

onde

1221

122112 kk

kkr+= , (3.52)

2332

233223 kk

kkr+= , (3.53)

onde 1 , 2 , 3 , representam as permissividades relativas do prisma, do metal e do meio

externo, respectivamente, e d a espessura do filme metlico.

Como podemos observar das Eqs.(3.51) a (3.53) o efeito de RPS depende dos

parmetros pticos e estruturais dos meios envolvidos. A linha estreita de absoro

ressonante mostrada na Fig.3.7 permite obter com alta preciso os parmetros do filme

metlico[2]. O fato de a absoro ressonante estar localizada numa regio angular

extremamente estreita permite tambm que o efeito seja utilizado para detectar pequenas

variaes da permissividade do meio externo, principio bsico utilizado no

desenvolvimento de sensores biolgicos baseados em RPS.

Captulo 4


44

4. Princpios de Imunologia e o Emprego de RPS na Deteco da Reao Antgeno-Anticorpo 4.1 Introduo

O estudo das reaes imunolgicas vem cada vez mais contribuindo para o

desenvolvimento das cincias biolgicas. As descobertas de agentes causadores de

doenas e a criao de novas vacinas tm evitado muitas catstrofes. As tcnicas de

observao e diagnstico tm evoludo bastante. Contudo essas inovaes vm

acompanhadas de encargos que tornam os exames laboratoriais muito caros. As tcnicas

ELISA(Enzyme-Linked-Immunosobent Assay) e RIA(Radioimunoensaio) so muito

usadas no estudo dessas reaes e tm sido as responsveis pela maioria dos

diagnsticos fornecidos pelos laboratrios nesses ltimos anos [19]. Neste captulo

tratamos de alguns princpios bsicos de imunologia e descrevemos brevemente as

tcnicas comumente usadas para caracterizar reaes entre macromolculas biolgicas.

No final do captulo mostramos qualitativamente como o efeito de RPS utilizado para

monitorar a dinmica de reaes antgeno-anticorpo [20].

4.2 Princpios Bsicos de Imunologia

O termo latim immunis significa encargos e nos leva ao termo imunidade. Na

biologia, o encargo a doena causada por uma variedade de vrus, fungos, bactrias,

protozorios, etc. Historicamente o conceito de imunologia comeou a se desenvolver no

incio do sculo dezoito e sua origem tem sido atribuda usualmente a Edward Jenner,

que descobriu em 1976 que a vacina ou cowpox induzia proteo contra a varola

humana, uma doena geralmente fatal [19]. Jenner deu ao seu processo o nome de

vacinao, termo que ainda hoje descreve a inoculao em indivduos sadios de amostras

enfraquecidas ou atenuadas de agentes causadores de doenas, a fim de obter proteo

contra a enfermidade.

Mesmo diante do sucesso experimental de Jenner, a vacinao contra a varola

levou dois sculos para tornar-se universal [19]. Esse progresso levou a Organizao

Mundial de Sade em 1976 anunciar que a varola tinha sido erradicada [19]. Quando

Jenner introduziu a vacinao, ele no sabia a respeito do agente causador da varola ou



45

dos princpios bsicos da imunologia em geral. Apenas no sculo XIX que Robert Koch

provou que doenas infecciosas eram causadas por microorganismos patognicos, cada

um deles responsvel por uma determinada enfermidade ou patologia [19].

Reconhecemos atualmente que h quatro grandes categorias de microorganismos

causadoras de doenas: vrus, bactrias, fungos e outros organismos relativamente

grandes e complexos, coletivamente chamados de parasitas [19]. As descobertas de

Koch e de outros grandes microbiologistas possibilitaram o desenvolvimento da

microbiologia e o entendimento da vacina de Jenner cujo princpio pde ser estendido

para o tratamento de outras doenas.

Na dcada de 1880, Louis Pasteur projetou uma vacina contra a clera aviria e

desenvolveu uma vacina anti-rbica, que obteve sucesso espetacular em um rapaz

mordido por um co raivoso [19]. Tantos sucessos prticos levaram os microbiologistas

a entenderem melhor o me

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