Embed Size (px)
Citation preview
ESTADO DO PARANÁSECRETARIA DA AGRICULTURA E DO ABASTECIMENTO - SEABDEPARTAMENTO DE FISCALIZAÇÃO E DEFESA AGROPECUÁRIA – DEFISDIVISÃO DEFESA SANITÁRIA VEGETAL - DDSVDIVISÃO DE FISCALIZAÇÃO DE INSUMOS E SERVIÇOS AGRÍCOLAS - DFICENTRO DE DIAGNÓSTICO MARCOS ENRIETTI - CDME
Nota Técnica
Monitoramento do fluxo gênico entre
lavouras de milho transgênico e não
transgênico na região Oeste do
Paraná
METODOLOGIA, RESULTADOS E CONCLUSÕES
Paraná 2010
SILMAR PIRES BÜRERChefe do Departamento de Fiscalização e Defesa Agropecuária – DEFIS
ADRIANO RIESEMBERGChefe da Divisão de Fiscalização da Produção e Comércio de Insumos e de Serviços Agrícolas – DFI
GILMAR PAIOLAChefe da Divisão de Defesa Sanitária Vegetal – DDSV
MARA ELIZA GASINO JOINEAUChefe da Divisão Centro de Diagnóstico Marcos Enrietti - CDME_____________________________________________________Equipe Técnica:Engenheiro Agrônomo MARCELO SILVACoordenação TécnicaSecretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEABDepartamento de Fiscalização e Defesa Agropecuária - DEFIS
Engenheira Agrônoma LOSANI PEROTTICoordenação Técnica RegionalSecretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEABDepartamento de Fiscalização e Defesa Agropecuária - DEFIS
Engenheiro Agrônomo ARLEI MACEDAProcedimentos Laboratoriais pelo Método Imunoensaio de Fluxo Lateral Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento – SEAB/DEFISCentro de Diagnóstico Marcos Enriette - CDME
Biólogo GILLES FERMENTPesquisador em Biossegurança Ministério do Desenvolvimento Agrário - MDANúcleo de Estudos Agrários e Desenvolvimento Rural - NEAD
Bióloga ANA PAULA GORI PALKAProcedimentos Laboratoriais pelo Método PCR-rtInstituto Tecnológico do Paraná - TECPARDivisão de Ensaios e Análises Tecnológicas – DETEC
Biólogo EDUARDO CÉSAR SANTOSProcedimentos Laboratoriais pelo Método PCR-rtInstituto Tecnológico do Paraná - TECPARDivisão de Ensaios e Análises Tecnológicas – DETEC
Farmacêutica Bioquímica MARIA LENITA DE ROSSOProcedimentos Laboratoriais pelo Método PCR-rtInstituto Tecnológico do Paraná - TECPARDivisão de Ensaios e Análises Tecnológicas – DETEC
3
Engenheiro Agrônomo RALPH RABELO ANDRADEPlanejamento Estatístico e Análise de DadosSecretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEABDepartamento de Fiscalização e Defesa Agropecuária - DEFIS
Engenheiro Agrônomo OSVALDO DE CASTRO OLSENResponsável Técnico do Laboratório de Análise de Sementes - CLASPARSecretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento – SEAB
Engenheiro Agrônomo MILTON SATOSHI MATSUSHITAGeoprocessamento de Imagens Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEABGeoprocessamento - EMATER
Administradora NELMA PEREIRA CUNHA HAGEMAIERGeoprocessamento de ImagensSecretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEABGeoprocessamento - EMATER
Engenheira Agrônoma MARGORETH DEMARCHIEstatísticas da Produção de MilhoSecretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEABDepartamento de Economia Rural - DERAL
Engenheira Agrônoma JOSÉ ALCIR DE OLIVEIRAProcedimentos de CampoSecretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEABDepartamento de Fiscalização e Defesa Agropecuária - DEFIS
Engenheiro Agrônomo LEONI ZAGOProcedimentos de CampoSecretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEABDepartamento de Fiscalização e Defesa Agropecuária - DEFIS
Engenheira Agrônoma MARY MIEKO TATEIWA SUGUIYProcedimentos de CampoSecretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEABDepartamento de Fiscalização e Defesa Agropecuária - DEFIS
Engenheiro Agrônomo AMÉRICO NOBURO ONAKAProcedimentos de CampoSecretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento - SEABDepartamento de Fiscalização e Defesa Agropecuária - DEFIS
4
CONTEÚDO
CONTEÚDO...................................................................................... 4
1. RESUMO .................................................................................... 6
2. METODOLOGIA ........................................................................... 8
2.1 Arranjo padrão das lavouras selecionadas para o monitoramento..82.2 Fase I: estágio vegetativo..............................................................................10
a) Amostragem.........................................................................................................10b) Análises laboratoriais .......................................................................................12
2.3 Fase II – estágio reprodutivo........................................................................15a) Amostragem.........................................................................................................15b) Preparo das amostras (laboratório) ...........................................................19c) Imunoensaio de fluxo lateral (IFL) .............................................................24d) Polimerase Chain Reaction – real time (PCR-rt) ...................................24
3. RESULTADOS ............................................................................25
3.1 Município de Farol, PR..........................................................................................253.2 Município de Boa Esperança, PR.....................................................................273.3 Município de Juranda, PR ....................................................................................31
4. CONCLUSÃO..............................................................................38
5. ANEXOS....................................................................................40
Anexo I...............................................................................................................................41Termo de Coleta de Amostra - Fase I................................................................41
Anexo II .............................................................................................................................42Procedimento Operacional Padrão Técnicas de Diagnóstico (Folhas) ...42
Anexo III ...........................................................................................................................43Laudo Oficial - Fase I ...............................................................................................43
Anexo IV ............................................................................................................................44Termo de Coleta de Amostra – Fase II .............................................................44
Anexo V..............................................................................................................................45Procedimento Operacional Padrão Técnicas de Diagnóstico (Sementes)..........................................................................................................................................45
Anexo VI ............................................................................................................................46Relatório de Ensaios - TECPAR .............................................................................46
Anexo VII ..........................................................................................................................47Laudo Oficial - Município de Farol .......................................................................47
Anexo VIII.........................................................................................................................48IFL - Município de Farol..........................................................................................48
Anexo IX ............................................................................................................................49Laudo Oficial - Município de Boa Esperança....................................................49
Anexo X..............................................................................................................................50IFL - Município de Boa Esperança .......................................................................50
Anexo XI ............................................................................................................................51Laudo Oficial - Município de Juranda .................................................................51
5
Anexo XII ..........................................................................................................................52IFL - Município de Juranda .....................................................................................52
Anexo XIII.........................................................................................................................53Curvas de PCR-rt - Arranjo de Juranda ............................................................53
6
1. RESUMO
A edição da Resolução Normativa nº 04 de 16 de agosto de 2007,
aprovada por maioria dos membros da Comissão Técnica Nacional de
Biossegurança (CTNBio), levou os técnicos da Secretaria de Estado da
Agricultura e do Abastecimento do Paraná (SEAB) a verificar a campo a
viabilidade da chamada coexistência entre lavouras de milho transgênico
(GM) e não transgênico (não - GM).
De fato, essa Resolução estipula que, “para permitir a coexistência, a
distância entre uma lavoura comercial de milho geneticamente modificado
e outra de milho não geneticamente modificado, localizada em área
vizinha, deve ser igual ou superior a 100 (cem) metros ou,
alternativamente, 20 (vinte) metros, desde que acrescida de bordadura
com, no mínimo, 10 (dez) fileiras de plantas de milho convencional de
porte e ciclo vegetativo similar ao milho geneticamente modificado”.
Nesse contexto, no primeiro semestre do ano de 2009, agricultores
de milho do oeste paranaense aceitaram participar voluntariamente do
monitoramento descrito nesta nota técnica.
O método aplicado consistiu em localizar arranjos específicos de
lavouras de milho transgênico e não transgênico que, cultivadas lado a
lado, apresentam possibilidades de polinização cruzada apesar do respeito
às distâncias de isolamento estabelecidas pela Resolução nº 04.
As ações de monitoramento estão agrupadas em duas fases
distintas. A FASE I, executada nos meses de fevereiro e março de 2009
consistiu da identificação, georreferenciamento, coleta e análise
laboratorial de amostras fiscais compostas de plantas de milho em estágio
vegetativo. Essa fase teve como objetivo assegurar a natureza genética
das lavouras monitoradas (GM e não - GM). A FASE II teve como objetivo
a detecção e quantificação do fluxo gênico por polinização cruzada entre
os dois tipos de lavouras. Para tanto, nos meses de maio e junho de 2009,
foram coletadas espigas de milho e os grãos analisados tanto por técnicas
imunocromatográficas quanto pela reação da polimerização em cadeia em
7
tempo real (PCR-rt), técnica esta que permite a quantificação do fluxo dos
transgenes.
Esta Nota Técnica apresenta os dados conclusivos do
monitoramento, expressando quantitativamente os níveis de
contaminação de lavouras de milho não - GM por pólen de milho GM. Traz
assim a sustentação aos apontamentos descritos em documento anterior.
Os dados confirmam que a Resolução Normativa nº 04 não é
suficiente para assegurar a proteção da integridade do patrimônio
genética prevista no Art. 225 da Constituição Federal de 1988.
8
2. METODOLOGIA
O método coordenado e executado pelos técnicos da Secretaria de
Estado da Agricultura e do Abastecimento do Paraná teve como objetivo
principal avaliar, a campo, a polinização de lavouras de milho não - GM
por pólen oriundo de lavouras de milho GM, cultivadas imediatamente
lado a lado, respeitado o isolamento espacial disposto pela Resolução
Normativa 04/CTNBio. Divididos em duas fases distintas, os trabalhos
tiveram início no primeiro semestre de 2009, quando a primeira safra de
milho transgênico foi efetivamente semeada no Estado. Na ocasião,
buscou-se por um arranjo padrão que viabilizasse a aplicação do método
proposto.
2.1 Arranjo padrão das lavouras selecionadas para o
monitoramento
Os arranjos foram padronizados de modo que as lavouras de milho
não - GM monitoradas estivessem localizadas ao lado de uma única
lavoura de milho GM. Aplicou-se uma distância de pelo menos 30(trinta)
metros entre as diferentes lavouras, complementados por uma barreira de
isolamento de pelo menos 20(vinte) fileiras de milho não - GM, localizadas
ás margens da própria lavoura monitorada (Foto 01).
Foto 01 – Juranda, PR, março de 2009
Lavoura de milho GM (esquerda) imediatamente ao lado de uma lavoura não - GM
(direita)
9
Todos os arranjos selecionados apresentavam alto potencial de
inter-polinização dada sua época de semeadura e similaridade de ciclo
reprodutivo (Foto 02).
Foto 02 – Juranda, PR, março de 2009
Detalhe das inflorescências: Flor emitindo pólen GM (esquerda) ao lado de uma lavoura
não - GM apta a ser polinizada (direita)
Os arranjos foram selecionados de modo que houvesse uma única
fonte de pólen transgênico. A foto 03 demonstra uma lavoura de milho
não - GM, ao fundo, isolada por uma lavoura de trigo. A lavoura de milho
GM não aparece nesta imagem e situa-se ao lado oposto do apresentado.
Foto 03 – Boa Esperança, PR, março de 2009
10
Selecionados os arranjos, foi dado início aos procedimentos
descritos nas denominadas Fase I e Fase II do monitoramento.
2.2 Fase I: estágio vegetativo
Essa fase teve como finalidade identificar a presença da proteína
transgênica nas lavouras de milho GM, assim como sua ausência nas
lavouras de milho não - GM. Aplicada em todos os arranjos essa fase
aferiu a veracidade das informações prestadas pelos agricultores,
garantindo a qualidade do experimento. Executada nos meses de
fevereiro e março de 2009, a etapa constituiu-se da coleta de amostras
oficiais e posterior análise laboratorial de plantas de milho (estágio
vegetativo), sendo concluída pela emissão de laudo oficial.
a) AmostragemPara coleta do material que compôs a amostra, técnicos da SEAB
realizaram o caminhamento apresentado na Figura 01. Ao longo do
caminhamento foram coletadas 50 (cinqüenta) plantas de milho
selecionadas aleatoriamente, em distribuição uniforme. As amostras
descritas nessa fase foram coletadas em todos os arranjos, tanto das
lavouras de milho GM quanto das lavouras de milho não - GM.
Figura 1 - Modelo de caminhamento para coleta de amostras conforme a área da
lavoura
a) Áreas até 20 ha b) Áreas entre 20 e 60 ha
11
Uma vez coletadas, foram acondicionadas em sacos plásticos
lacrados e enviadas ao Centro de Diagnóstico Marcos Enrietti –
CDME/SEAB para devida análise. A foto 04 representa uma amostra
composta por cinqüenta folhas de milho. Testes realizados sobre o
material atestam que lavouras de milho GM foram cultivadas
imediatamente ao lado de lavouras de milho não – GM.
Foto 04 – Amostra Fase I
Cada amostra foi anexada a um termo de coleta constando do
detalhamento do material amostrado (Foto 05 e Anexo I).
Foto 05 – Termo de coleta de amostra
12
b) Análises laboratoriaisRealizadas pelo Centro de Diagnóstico Marcos Enriette – CDME,
divisão integrante do Departamento de Fiscalização e Defesa Agropecuária
– DEFIS/SEAB, as análises executadas na Fase I, basearam-se na
detecção da proteína CRY1Ab proveniente da inserção de DNA exógeno
em amostras de tecidos vegetais de milho. Através da técnica de
imunoensaio de fluxo lateral (IFL) foi possível atestar a natureza genética
das lavouras selecionadas para o monitoramento. A rotina técnica está
registrada no Procedimento Operacional Padrão: Técnicas de Diagnóstico
(Folhas) - SEAB/DEFIS/CDME (Anexo II), e consta dos seguintes passos:
Organizar e identificar as amostras a serem processadas, conforme
POP n.º UGQ/DVP/NEM/013;
Abrir os sacos plásticos contendo as amostras que devem ficar
armazenadas em geladeira de 2 a 10°C até o processamento;
Tomar o terço mediano das folhas (mínimo 10 e máximo 100
folhas), cortar com tesoura e passar para o copo do processador
(Foto 06);
Triturar na velocidade máxima, até que todo o tecido vegetal tenha
se transformado em pequenos fragmentos, pulsar se necessário;
Foto 06 – Detalhe dos procedimentos laboratoriais Fase I
13
Retirar a lâmina do processador e passar o triturado para o copo de
200 ml que corresponda à amostra;
Com auxílio de uma pinça, tomar 0,5 g de massa em uma balança
de precisão e passar para um copo de 50 ml;
Com pipeta colocar 10 ml de água de torneira em um Becker de 100
ml e então adicionar o conteúdo de 0,5 g;
Agitar vigorosamente e aguardar por 5 minutos, tempo para a
extração das proteínas (Foto 07);
Foto 07 – Detalhe dos procedimentos laboratoriais Fase I
Com a pipeta de Pasteur transferir 0,5 ml da suspensão, evitando
detritos, para o tubo de eppendorf;
Inserir a região almofadada da fita no tubo de eppendorf, na posição
vertical (Foto 08);
Aguardar 5 minutos e realizar a leitura;
Interpretar o resultado, conforme o manual de instrução do kit;
Colocar a fita em uma bandeja plástica com papel toalha, deixar
secar e arquivar juntamente com o laudo (Foto 09);
14
Foto 08 – Imunoensaios de Fluxo Lateral - Fase I
Todo o material utilizado foi lavado com detergente e água em
abundância na extração de uma amostra para outra. Após lavagem foi
passado pano com álcool. Os kits foram mantidos em geladeira a uma
temperatura de 2 a 4ºC.
Ao final das análises descritas foi emitido Laudo Oficial atestando a
presença ou ausência da proteína transgênica em cada amostra
assegurando a continuidade do experimento (Anexo III).
Foto 09 – Testes realizados
15
2.3 Fase II – estágio reprodutivoDiferentemente da fase anterior, a Fase II consistiu exclusivamente
da coleta e análise de sementes de milho provenientes das lavouras de
milho não - GM. Aplicada sobre os arranjos selecionados, seus resultados
permitiram conclusões acerca da fecundação destas lavouras por pólen de
milho GM. Importante destacar que os arranjos foram selecionados de
modo que houvesse uma única lavoura de milho GM como fonte de pólen.
A identidade genética dos arranjos foi comprovada pelos procedimentos
descritos na Fase I.
a) AmostragemExecutada nos meses de maio e junho de 2009, a amostragem
consistiu da coleta de espigas de milho da lavoura não - GM. Para tanto,
técnicos da SEAB retornaram aos arranjos selecionados e procederam do
modo que segue:
Com auxílio de trena, fitas sinalizadoras, mapas e GPS, foram
delimitadas faixas paralelas entre si e distantes 10-25 (Isolamento), 30,
60, 90 e 120 metros da margem da lavoura de milho GM. Definido o
mosaico, iniciou-se a coleta de amostras (Fotos 10 e 11).
Foto 10 – Juranda, PR, maio de 2009
Lavoura de milho GM (esquerda) imediatamente ao lado de uma lavoura não - GM
(direita). As amostradas foram retiradas da lavoura à direita em faixas paralelas e
distantes 25, 30, 60, 90 e 120 metros da lavoura de milho GM
16
As amostras receberam uma designação de origem conforme sua
localização e repetição. Logo, a quarta repetição de uma amostra coletada
a 60 (sessenta) metros da margem da lavoura de milho GM recebeu a
denominação L4-60; A segunda repetição de uma amostra coletada na
faixa de isolamento (10-25 metros) recebeu a denominação de L2-I, e
assim sucessivamente. Cada faixa de distância contou com 10 (dez)
repetições.
Foto 11 – Técnico da SEAB/DEFIS realizando a amostragem
Cada amostra foi constituída por uma única espiga de milho. Sua posição
foi rigorosamente georreferenciada, procedimento que assegurou o
desenvolvimento de mapas temáticos (Fotos 12, 13).
Foto 12 – Espiga de milho da lavoura não - GM
17
Foto 13 – Georreferenciamento
As amostras foram acondicionadas em caixas de papelão específicas
para a coleta de sementes sendo devidamente identificadas e lacradas
pelos técnicos (Fotos 14 e 15).
Foto 14 – Detalhe da amostra
As amostras coletadas foram anexadas a um documento fiscal
identificando a origem do material, nome do agricultor, variedade
cultivada, assegurando rigor ao procedimento aplicado (Anexo IV).
18
Foto 15 – Detalhe da amostra coletada
Ao final da coleta, tomadas as coordenadas geográficas, obtivemos
a mapa demonstrado na figura 02.
Figura 2 – Exemplo de mapa temático, Juranda, PR
Na figura acima o desenho ao centro (verde) representa as duas
lavouras vicinais, sendo a parte superior a lavoura de milho GM e a
!!
! !!
!
!
!
!!
!! !
! !
!
!
! !!
!
!
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
! ! ! ! ! ! ! !
!!
!!
!
!
!
!
!!
!
!!
! !
!
!
!
!
!
!
!
!!!
!!!!
!!
!!!!!!
!!
!!
!
!! ! ! ! !
!!
10-25 m (I)
30 m
60 m
90 m
120 m
19
inferior a lavoura de milho não – GM, na qual foram realizadas as coletas.
Do lado direito vemos uma detalhamento das amostras realizadas. As
linhas paralelas (horizontais) representam as distâncias de 10-25 (I), 30,
60, 90 e 120 metros contados a partir da borda da lavoura GM. Em cada
linha foram aplicadas 10 (dez) repetições, totalizando 50 amostras.
b) Preparo das amostras (laboratório)
As amostras uma vez coletadas foram encaminhadas para o Centro
de Diagnóstico Marcos Enriette CDME/SEAB, onde se procedeu ao preparo
do material para posteriores análises.
Foto 16 – Recebimento da amostra
Identificadas e organizadas, o trabalho teve início com a conferência
do material e posterior abertura das caixas (Fotos 16 e 17).
20
Foto 17 – Rompimento do lacre
Cada amostra, constante de uma única espiga, possui sua origem
geográfica devidamente identificada. No caso em questão trata-se da
oitava repetição da faixa de isolamento L8-I (Foto 19).
Foto 18 – Conferência do material
21
Foto 19 – Exemplo de amostra recebida pelo laboratório
Todas as espigas foram limpas com pano embebido por álcool.
Assim que secas, foram debulhadas manualmente (Foto 20).
Foto 20 – Detalhe do preparo da amostra
22
Assim que debulhado, o material foi pesado em balança de precisão
sendo contada a quantidade de sementes. Ao final, tomou-se a média dos
referidos índices apontados (Foto 21).
Foto 21 – Pesagem do material debulhado
Todo o material foi depositado em triturador com suporte (copo) de
vidro (Foto 22).
Foto 22 – Material antes da trituração
23
O material foi triturado (Foto 23). Ao final de cada procedimento
todo o equipamento utilizado foi submerso em solução de hipoclorito de
sódio (0,5%) permanecendo por uma hora e lavado, em seguida, com
detergente e água em abundância (Foto 24). Assim que secos, os
equipamentos foram tratados com álcool.
Foto 23 – Material triturado
Foto 24 – Detalhe da limpeza dos equipamentos
24
Foto 25 – Amostra finalizada
Finalizada a trituração, o material foi acondicionado em saco plástico
devidamente identificado, estando pronto para as futuras análises (Foto
25).
c) Imunoensaio de fluxo lateral (IFL)
Realizadas pelo Centro de Diagnóstico Marcos Enriette – CDME, as
análises executadas nesta etapa basearam-se na detecção de proteínas
transgênicas específicas para o evento MON-810, proveniente da inserção
de DNA exógeno. A rotina técnica está registrada no Procedimento
Operacional Padrão: Técnicas de Diagnóstico (Sementes) -
SEAB/DEFIS/CDME (Anexo V).
d) Polimerase Chain Reaction – real time (PCR-rt)
Realizado pela Divisão de Análises e Ensaios Tecnológicos do
Laboratório de Alimentos, divisão vinculada ao Instituto Tecnológico do
Paraná - DETEC/TECPAR, os resultados constam no Relatório de Ensaios
nº 09010080, tendo seus procedimentos indicados no anexo VI.
25
3. RESULTADOS
Serão apresentados os resultados específicos obtidos das análises
realizadas com as amostras de sementes coletadas em distintos locais.
3.1 Município de Farol, PR
As identidades genéticas de ambas as lavouras (sendo uma plantada
com milho não GM e uma com milho GM) e o isolamento delas em relação
a outras lavouras de milho transgênico1 foram asseguradas com a
realização da FASE I conforme metodologia descrita no item 1.2 dessa
Nota Técnica.
Foto 26 – Farol, PR, março de 2009
Entretanto, o presente caso apresenta particularidade em relação à
metodologia seguida no que diz respeito à FASE II.
Os técnicos da SEAB tomaram iniciativas visando realizar a FASE II
coletando as 40 amostras apenas em duas fileiras de milho da lavoura
identificada como não transgênica na FASE I.
Para tanto, foram selecionadas fileiras situadas a partir de uma
distância de 30 (trinta) metros da bordadura da lavoura de milho GM,
1 A presença de lavouras de milho transgênico na vizinhança das lavouras monitoradas poderia representar uma fonte de poluição genética e influir sobre os resultados desse estudo. Essa possibilidade foi então rigorosamente descartada na seleção dos arranjos, conforme descrito no item 1.1 dessa Nota Técnica.
26
assegurando assim coleta de espigas que poderiam conter grãos oriundos
de cruzamentos com milho GM, em coerência com o objetivo do
monitoramento.
Os resultados brutos das análises laboratoriais por fitas de
Imunoensaio de Fluxo Lateral (IFL) estão disponíveis nos anexos VII e
VIII.
A tabela seguinte mostra o número e a porcentagem de espigas de
milho coletadas que foram reagentes ou não ao teste de IFL:
Tabela 01 – Resultados por IFL, Farol, PR
Número de amostras (espigas)
Reagente Não reagente
Amostras com proteína transgênica 23 17
Amostras com proteína transgênica (%) 57,5 42,5
Assim, 23 espigas de milho oriundas de lavoura identificada como
não transgênicas durante a fase vegetativa (conforme metodologia da
FASE I) foram reagentes ao teste de IFL, acusando assim a fertilização por
pólen transgênico e produção da toxina CRY1Ab.
O georeferenciamento dos pontos de amostragem juntado aos
resultados obtidos por testes de IFL (cor vermelha para reagente e cor
azul para não reagente) resultou na Figura 03.
27
Figura 03 – Resultados (IFL) para o arranjo de Farol, PR
A disposição das amostras reagentes à toxina CRY1Ab apontam a
ocorrência de fluxo gênico em 23 casos. Cabe destacar que as duas
fileiras amostradas seguem curvas de nível do local.
3.2 Município de Boa Esperança, PR
O arranjo de Boa Esperança constituiu-se de lavouras de milho GM e
milho não GM2 semeadas lado a lado e separadas apenas por um cordão
de isolamento de 15(quinze) fileiras de milho não – GM com espaçamento
entrelinhas de 0,80 metros. Na foto 27 podemos observar a proximidade
entre as lavouras, a faixa de isolamento e a ausência de outras fontes de
pólen de milho GM.
2
As características genéticas de ambas as lavouras (sendo uma plantada com milho não GM e uma com milho GM) e o isolamento delas em relação a outras lavouras de milho transgênico foram asseguradas com a realização da FASE I conforme metodologia descrita no item 1.2 dessa Nota Técnica.
28
Foto 27 – Boa Esperança, PR, março de 2009
Frente a esse arranjo, foi somada a faixa de isolamento presente
mais 20 (vinte) metros localizados dentro da lavoura de milho não – GM.
Assim, nesse experimento a faixa de isolamento foi equivalente a 33,6
metros constituídos de 34 fileiras de milho não - GM.
A amostragem da FASE II ocorreu conforme metodologia descrita no
item 1.3. A figura 03 representa um croqui experimental dos 50 pontos de
amostragem.
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
BOA ESPERANÇA
! ! ! ! ! ! ! ! !
!!!!!!!!!!
!!!
!!
! ! ! !!
!!!!!!!!
!!
!
! ! ! ! !
!!!!!
!
! ! ! ! ! ! ! ! !
!!!!!!!!!!
! !! ! ! ! ! ! ! !
!!!!!!!!!!
! ! ! ! ! !!!!!!
!
Figura 04 – Mapa temático do arranjo de Boa Esperança, PR
Os resultados brutos das análises laboratoriais por fitas de IFL estão
disponíveis nos anexos IX e X.
Faixa de isolamento
Lavoura de milho GM
Lavoura de trigo
Lavoura de milho GM
Lavoura de trigo
Faixa de Isolamento
29
A tabela seguinte mostra o número e a porcentagem de espigas de
milho coletadas que foram reagentes ou não ao teste de IFL:
Tabela 02: Resultados IFL Boa Esperança, PR
Distância da lavoura transgênica (m) 3
Repetições 20 m (isolamento) 30 m 60 m 90 m 120 m
L1 Reagente Reagente
L2 Reagente
L3 Reagente Reagente Reagente Reagente
L4 Reagente Reagente
L5 Reagente Reagente
L6 Reagente Reagente Reagente
L7 Reagente Reagente
L8 Reagente Reagente
L9 Reagente Reagente Reagente
L10 Reagente Reagente
Amostras com proteína
transgênica (%)100 70 30 20 10
Os dados incluídos na parte amarela da tabela dizem respeito às
espigas que apresentaram a toxina CRY1Ab nos seus tecidos, mesmo que
tecnicamente a RN nº 4 tenha sido respeitada.
Esses dados apontam, assim, para um fluxo gênico via fecundação
cruzada em 13 casos4 (ou 32% das amostras) apesar da lavoura de milho
3 O ponto 0 (zero metro) foi referenciado na fileira de milho GM mais próxima à fileira de milho não GM, sendo as paralelas e perpendiculares sistematicamente respeitadas.4 Essas espigas de milho foram identificadas como não transgênicas durante a fase vegetativa, conforme metodologia da FASE I descrita no item 1.2 dessa Nota Técnica.
30
não - GM ter sido isolada espacialmente conforme as recomendações
legais de isolamento da RN nº 4.
Nota-se também que 70% das amostras coletadas imediatamente
após a faixa de isolamento apregoado pela CTNBio mostraram-se
reagentes aos testes de IFL.
O georeferenciamento dos pontos de amostragem juntado aos
resultados obtidos por testes de IFL (cor vermelha para reagente e cor
azul para não reagente) resultou na imagem da Figura 05:
Figura 05 – Resultados (IFL) para o arranjo de Boa Esperança, PR
A disposição das espigas que acusaram polinização cruzada com
milho transgênico confirma o fluxo gênico dos transgenes da lavoura GM,
sendo assegura a existência de uma única fonte de pólen transgênico ao
norte da lavoura de milho não GM.
31
3.3 Município de Juranda, PR
O arranjo de Juranda constituiu de lavouras de milho GM e milho
não GM5 lado a lado, separadas apenas por um carreador de largura de
quatro metros. A lavoura de milho GM fazia frente à face norte da lavoura
de milho não GM.
Foto 28 – Arranjo Juranda, PR, março de 2009
Nesse arranjo, foi considerada a faixa de isolamento os 04 (quatro)
metros limpos do carreador acrescidos de aproximadamente 35 fileiras da
lavoura de milho não GM, o que totaliza 32 metros. Considerou-se
novamente nesse experimento uma faixa de isolamento superior ao
determinado pela RN nº 04, o que permite concluir de forma mais
conservadora e segura que a contaminação ocorre mesmo quando a regra
é cumprida. De fato, é medida acautelatória considerar 4 metros vazios
juntamente com as 35 fileiras (o que equivale a um total de
aproximadamente 32 metros) como sendo mais restritivos para o fluxo
gênico do que os 20 metros vazios acrescidos de 10 linhas estabelecidos
pela RN nº 04.
5
As características genéticas de ambas as lavouras (sendo uma plantada com milho não GM e uma com milho GM) e o isolamento delas em relação a outras lavouras de milho transgênico foram asseguradas com a realização da FASE I conforme metodologia descrita no item 1.2 dessa Nota Técnica.
32
A FASE II ocorreu conforme metodologia descrita no item 1.3 dessa
Nota Técnica, onde pode ser encontrado um croqui experimental dos 50
pontos de amostragem. Os resultados brutos das análises laboratoriais
por fitas de IFL estão disponíveis no anexo XI e XII.
A tabela seguinte mostra o número e a porcentagem de espigas de
milho coletadas que foram reagentes ou não ao teste de IFL.
Tabela 03: Resultados IFL Juranda, PR
Distancia da lavoura transgênica (m) 6
Repetições 25 (isolamento) 30 60 90 120
L1 Reagente Reagente Reagente
L2 Reagente Reagente
L3 Reagente Reagente
L4 Reagente Reagente Reagente Reagente
L5 Reagente ReagenteReagente
L6 Reagente Reagente Reagente Reagente
L7 Reagente
L8
L9 Reagente Reagente
L10 Reagente Reagente
Amostras com proteína
transgênica (%)70 70 50 20 20
Os dados incluídos na parte azul da tabela dizem respeito às espigas
com presença da toxina CRY1Ab nos seus tecidos, sendo que a
amostragem foi feita além das distâncias estabelecidas pela RN nº 04, que
neste caso, também foi respeitada.
6 O ponto 0 (zero metro) foi referenciado na fileira de milho GM mais próxima à fileira de milho não GM, sendo as paralelas e perpendiculares sistematicamente respeitadas.
33
Esses dados apontam assim para um fluxo gênico via fecundação
cruzada em 16 casos7 (ou 40% das amostras válidas), mesmo com a
lavoura de milho não – GM tendo sido isolada espacialmente conforme as
recomendações legais de isolamento da RN nº 04.
Nota-se também que 70% das amostras coletadas na faixa de
isolamento imediatamente além da distância mínima estabelecida
legalmente mostraram-se reagentes aos testes de IFL.
Além dos resultados obtidos por testes IFL, uma busca do transgene
responsável pela expressão da toxina CRY1Ab nas espigas que acusavam
contaminação genética foi realizada em cada uma das 50 amostras com o
uso da PCR-rt, ferramenta de biologia molecular.
Nesse caso, o uso da PCR-rt teve dois objetivos principais. Em
primeiro lugar, permitiu confirmar e contrapor, com segurança, os
resultados de fluxo gênico constatados com o uso dos testes de IFL. Além
disto, a PCR-rt fornece informações quantitativas (em porcentagem) sobre
a presença do transgene responsável pela produção do núcleo inseticida
da proteína CRY1Ab.
Os resultados brutos das análises laboratoriais por PCR-rt estão
disponíveis no anexo VI, sendo que no anexo XIII é possível constatar
algumas das dezenas de curvas produzidas.
A Tabela 04 fornece os dados quantitativos da contaminação
genética por fluxo transgênico observados nas espigas de milho coletadas
nas lavouras naturais:
Tabela 04: Resultados PCR-rt Juranda, PR
7 Essas espigas de milho foram coletadas em uma lavoura identificada como não transgênica durante a fase vegetativa, conforme metodologia da FASE I descrita no item 1.2 dessa Nota Técnica..
34
Distancia da lavoura transgênica (m)8
Repetições 25 (isolamento) 30 60 90 120
L1 0,3 <0,1 0,3 nd9 1,3L2 >5,0 0,1 0,5 0,8 0,3L3 0,2 0,4 <0,1 nd ndL4 1,3 >5,0 4,8 4,4 ndL5 0,3 1,8 0,6 nd nc10
L6 0,2 0,9 >5,0 0,9 1,3L7 nd 3,7 0,2 nd ndL8 0,3 nd nd 0,7 1,2L9 0,1 0,3 0,9 1,5 nd
L10 1,9 0,6 nd 0,7 ndAmostras com transgenes (%) 90 90 80 60 40
Proporção detransgenes (%) 0,96 1,29 1,24 0,9 0,46
Os dados incluídos na parte amarela da tabela dizem respeito às
espigas contendo a seqüência genética do transgene Cry1Ab responsável
pela síntese do núcleo inseticida da proteína CRY1Ab, mesmo com a RN nº
04 tendo sido tecnicamente respeitada.
Do ponto de visto qualitativo, esses dados asseguram assim a
ocorrência de um fluxo gênico via fecundação cruzada em 27 casos11 (ou
69,23% das amostras) apesar da lavoura de milho não - GM ter sido
isolada espacialmente conforme as recomendações legais de isolamento
da RN nº 04.
O georeferenciamento dos pontos de amostragem juntado aos
resultados obtidos por testes de PCR-rt (cor vermelha para detecção de
transgene e cor azul para não detecção de transgene) resultou na imagem
representada da figura 06.
8 O ponto 0 (zero metro) foi referenciado na fileira de milho GM mais próxima à fileira de milho não GM, sendo as paralelas e perpendiculares sistematicamente respeitadas.9 Transgene não detectado.10 Teste PCR não conclusivo.11 Essas espigas de milho foram coletadas em uma lavoura identificada como não transgênica durante a fase vegetativa, conforme metodologia da FASE I descrita no item 1.2 dessa Nota Técnica.
35
Figura 06 – Resultados (PCR) para o arranjo de Juranda, PR
Destaca-se que a lavoura de milho GM está localizada ao norte da
lavoura de milho não – GM, sendo assegurada a existência de uma única
fonte de pólen transgênico ao norte da lavoura de milho não - GM.
Adicionalmente, o uso consecutivo de testes de IFL e de PCR nas
amostras coletadas fornece informações sobre a eficiência e a
confiabilidade das fitas de IFL em detectar um fluxo gênico específico. A
tabela 05 justapõe os dados obtidos por testes PCR e testes de IFL.
36
Tabela 05: Índice de coincidência entre os resultados PCR-rt e IFL, Juranda, PR
Distancia da lavoura transgênica (m)
Repetições 25 (isolamento) 30 60 90 120
L1 Reagente Reagente . . Reagente
L2 Reagente. . Reagente . .
L3 Reagente Reagente . . .
L4 Reagente Reagente Reagente Reagente .
L5 . Reagente Reagente . Reagente
L6 Reagente Reagente Reagente Reagente .
L7 . Reagente . . .
L8 . . . .
L9 Reagente . Reagente . .
L10 Reagente Reagente . .
Amostras com proteína
transgênica (%)70 70 50 20 20
Falsos negativos (%) 20 20 30 40 30
Coincidência 80 80 70 60 60
Nessa tabela, a cor vermelha representa os falsos negativos, e a cor
verde indica os casos onde testes de IFL e de PCR apontaram para o
mesmo resultado. A cor branca num único caso se refere a um teste de
PCR-rt não conclusivo.
Os falsos negativos correspondem aos casos onde a detecção da
contaminação genética não foi possível via o uso do teste de IFL. Essa
constatação pode ser o resultado de uma síntese de toxina CRY1Ab em
quantidade inferior ao limite de detecção do teste de IFL, ou por causa de
37
um rigor do técnico na interpretação da fita. Cabe ressaltar que não houve
casos de falsos positivos (a fita acusar contaminação enquanto não há
transgene na espiga analisada). Neste sentido, o uso da fita é um teste
conservador: se positivo há de fato a proteína; se negativo, não
necessariamente a amostra não apresenta a proteína.
Assim, houve coincidência de 70% entre os dados obtidos por PCR-
rt e testes de IFL. No entanto isto não significa que os outros 30% têm
resultados contraditórios. Os resultados indicam que a PCR-rt é mais
eficiente na detecção de presença dos transgenes que as fitas de
imunoensaios. Não houve resultados contraditórios entre os dois métodos.
38
4. CONCLUSÃO
Após a conclusão desse plano de ação intitulado “Plano de
monitoramento do fluxo gênico entre lavouras de milho transgênico e não
transgênico na região Oeste do Paraná” realizado pelos fiscais da SEAB, a
Secretaria disponibiliza as informações seguintes em complemento a Nota
Técnica preliminar, encaminhada aos órgãos responsáveis.
a) No caso das lavouras monitoradas no município de Juranda, os
resultados PCR-rt revelam uma contaminação genética por pólen
transgênico via fecundação cruzada com milhos transgênicos da
lavoura vizinha em 27 das 40 amostras12 localizadas além da
distância de isolamento definida pela RN nº 04.
b) O caso de Juranda revela que o fluxo gênico ocorreu entre milhos
isolados por 4 metros livres de cultivo acrescidos de pelo menos
147 fileiras de milho convencional (linha dos 120 metros no
experimento). Este fluxo gênico ocorreu assim numa situação
que representa 112 fileiras a mais do que solicitado pela RN nº
04.
c) No caso de Juranda constatou-se também que a poluição
genética é quantitativamente alta (média > 1% até os 90 metros
no interior da lavoura, com uma amostra (L4-90) alcançando
4,4%), o que sugere dificuldades no cumprimento do Decreto nº
4.680/2003 relativo à rotulagem dos produtos transgênicos.
d) Os dados qualitativos e quantitativos obtidos por PCR-rt no caso
de Juranda corroboram com a literatura cientifica disponível
sobre fluxo gênico via fecundação cruzada de milho (confere com
12 Num total de 39 resultados conclusivos.
39
dados da revisão dos onze melhores estudos realizada por
Breckling ET AL., 200813).
e) Os dados obtidos por testes IFL nos casos de Farol e Boa
Esperança indicaram 23 e 13 respectivamente, casos de
contaminação genética apesar do respeito técnico das medidas
de isolamento definidas na RN nº 04.
f) A experiência obtida através do uso consecutivo de testes IFL e
PCR-rt sobre as amostras coletadas no caso de Juranda permite
considerar as fitas de IFL como uma ferramenta confiável para
detectar qualitativamente (e semi-quantitativamente) a
ocorrência de fluxo gênico em distâncias de várias dezenas de
metros. Nesse sentido, as lavouras de milho não GM monitoradas
nos municípios de Farol e Boa Esperança podem ser consideradas
como geneticamente contaminadas por transgenes apesar do
respeito técnico às medidas de isolamento definidas na RN nº 04.
13 Breckling, B., Reuter, H., Verhoeven, R. (2008). Implications of GM-crop cultivation at large spatial scales. Proceedings of the GMLS conference 2008 in Bremen. Theorie in der Ökologie 14. Peter Lang, Frankfurt, Basel.
40
5. ANEXOS
I. Termo de Coleta de Amostra – Fase I
II. Procedimento Operacional Padrão – Técnicas de Diagnóstico (Folhas)
III. Laudo Oficial – Fase I
IV.Termo de Coleta de Amostra – Fase II
V. Procedimento Operacional Padrão – Técnicas de Diagnóstico
(Sementes)
VI.Relatório de Ensaios – TECPAR
VII. Laudo Oficial – Município de Farol
VIII. IFL – Município de Farol
IX.Laudo Oficial – Município de Boa Esperança
X. IFL - Município de Boa Esperança
XI.Laudo Oficial – Município de Juranda
XII. IFL - Município de Juranda
XIII. Curvas de PCR-rt – Arranjo de Juranda
41
Anexo I
Termo de Coleta de Amostra - Fase I
42
Anexo II
Procedimento Operacional Padrão Técnicas de Diagnóstico (Folhas)
43
Anexo III
Laudo Oficial - Fase I
44
Anexo IV
Termo de Coleta de Amostra – Fase II
45
Anexo V
Procedimento Operacional Padrão Técnicas de Diagnóstico (Sementes)
46
Anexo VI
Relatório de Ensaios - TECPAR
47
Anexo VII
Laudo Oficial - Município de Farol
48
Anexo VIII
IFL - Município de Farol
49
Anexo IX
Laudo Oficial - Município de Boa Esperança
50
Anexo X
IFL - Município de Boa Esperança
51
Anexo XI
Laudo Oficial - Município de Juranda
52
Anexo XII
IFL - Município de Juranda
53
Anexo XIII
Curvas de PCR-rt - Arranjo de Juranda
