ESTRUTURA DE MEMBRANAS DE POLÍMEROS … · Materiais poliméricos bioabsorvíveis de maior aplicação nas áreas de saúde são aqueles ... com características semelhantes as da

CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA E CIÊNCIA DOS MATERIAIS, 14., 2000, São Pedro - SP. Anais 57401

ESTRUTURA DE MEMBRANAS DE POLÍMEROS BIOABSORVÍVEIS

Barbanti, S.H. ; Zavaglia, C.A.C. ; Duek, E.A.R.

Depto. Eng. de Materiais (DEMA) - Faculdade Eng. Mecânica (FEM)

Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP

Cidade Universitária - CP 6122 - Campinas - S.P. - Brasil.

E-mail: [email protected] ; [email protected]

Dentre as atuais aplicações dos biomateriais a utilização de polímeros

bioabsorvíveis como suporte para cultura de células destaca-se como alternativa para

tratamento de lesões e perda de tecidos. O objetivo principal desse trabalho foi estudar

a degradação in vitro de estruturas tridimensionais de polímeros bioabsorvíveis. Foram

confeccionadas estruturas densas e porosas de poli(L-ácido lático) (PLLA) e poli(ácido

lático-co-ácido glicólico) (PLGA) e submetidas a degradação em meio de cultura HAM-

F10. Os resultados morfológicos indicam que as propriedades do material, como

porosidade, estão diretamente relacionadas com processo de síntese e que são alteradas

durante a degradação. As análises térmicas de DSC indicam que materiais preparados

com PLLA são semicristalinos e PLGA amorfos. Dessa forma, pelas análises realizadas,

as estruturas apresentam estabilidade térmica e morfologia adequada para a sua

utilização como suporte para cultura de condrócitos.

Abstract

Polyesters based on lactic and glycolic acid have proved safe for humans as suture

materials and are know to be biodegradable. They are now used or being developed for

many medical applications such as drug carriers in controlled drug release systems, as

orthopaedic implants or as support for cells culture. The aim of this study was synthesis,

degradation in vitro and characterization of dense and porous membranes of poly(L-

lactic acid) and poly(lactic acid-co-glycolic acid), a bioresorbable material. PLLA

membranes were obtained by casting of polymer solution in chloroform. For in vitro

study, samples were immersed in HAM-F10 cultured medium (37oC) for 2 weeks.

Degradation process was characterized by DSC (Differential Scanning Calorimetry) and

Scanning Electron Microscopy. DSC results showed that PLLA samples are


semicrystallines and PLGA samples are amorphous. It was verified an increase in the

crystallinity degree for PLLA samples in function of degradation time and this is more

evident for dense membranes. Micrographies observed by SEM showed that the salt

addition provoked a porous material, and that the morphology of dense and porous

membranes of PLGA changed during the degradation process while PLLA membranes

remained unchanged. We can conclude that the prepared scaffolds present thermal

stability and morphology appropriated to be use as support for condrocites culture.

1. Introdução

O uso dos polímeros na medicina é antigo e tem se destacado em pesquisas e

aplicações nas últimas décadas. Polímeros tradicionais, como nylon, PMMA,

polietileno, e outros são utilizados como biomateriais em diversas aplicações como

dispositivos protéticos permanentes, como por exemplo, as lentes intra-oculares

artificiais, cateteres vasculares, e outros. As pesquisas nessa área continuam e visão

primordialmente a otimização, estabilidade e desempenho desses materiais in vivo.

(GRIFFITH, 2000)

Aplicações no qual o implante deva ser temporário sugere uma outra

característica no desenvolvimento de materiais: a de que possa ser degradado pelos

fluidos orgânicos e reabsorvidos pelo corpo sem nenhum efeito nocivo ao doente. Com

essas características tem-se os poli(α-hidróxi ácidos), representante de uma classe de

poliésteres sintéticos biodegradáveis, bioabsorvíveis e que satisfazem as condições de

um biomaterial.

Os polímeros biodegradáveis sofrem cisões hidrolíticas na cadeia principal

originando produtos na forma de oligômeros (ou monômeros) solúveis e não tóxicos. A

literatura (LI, 1999) tem mostrado que polímeros da classe dos poli(α-hidróxi ácidos)

apresentam excelente biocompatibilidade tanto na forma não degradada, como dos

produtos e subprodutos de degradação. A degradação poderá prosseguir por um

processo biologicamente ativo (por enzimas dos fluidos orgânicos) ou pela clivagem

hidrolítica passiva.

Como exemplos de polímeros pertencentes à classe dos poli(α-hidróxi ácidos)

temos principalmente materiais derivados dos monômeros: ácido lático e ácido

glicólico. Atualmente são materiais comuns no uso cirúrgicos e podem ser representados


através da fórmula estrutural conforme a figura 1. Outros exemplos de polímeros

pertencentes à classe de poliésteres sintéticos são: poli(dioxanona) (PD), poli(ε-

caprolactona) (PCL), poli(β-hidróxibutirato) (PHB), e copolímeros destes.

No caso do ácido lático, a quiralidade do carbono α permite sintetizar compostos

enantiômeros, dando origem à uma família de polímeros: poli(D- ácido lático) (PDLA),

poli(L-ácido lático) (PLLA) e poli(D,L-ácido lático) em diferentes proporções. No caso

do poli(ácido glicólico)(PGA) não é possível a síntese de composto enantioméricos

devido a ausência de centros quirais. Neste trabalho enfocamos nosso estudo nos

materiais: poli(L-ácido lático) e no copolímeros de ácido lático e ácido glicólico, o

poli(ácido lático-co-ácido glicólico).

Materiais poliméricos bioabsorvíveis de maior aplicação nas áreas de saúde são aqueles

que quando degradados geram monômeros com as características dos ácidos do Ciclo de

Krebs. No ciclo, a degradação segue o processo de oxidação à ácido lático (para o PLA)

que por sua vez é convertido em ácido pirúvico (para PLA e PGA). Na presença da

acetil coenzima A ocorre a liberação de CO2 e consequentemente a decomposição em

citrato. Este citrato será então incorporado no ciclo dos ácidos tricarboxílicos,

resultando na eliminação, novamente de CO2 e de H2O (HOLLINGER, 1888)

Em se tratando do tempo de degradação, a taxa de hidrólise é influenciada por

vários fatores que variam desde a formulação do material (composição química e

estrutural) até o local de implante. Além do local de implante as diferenças na taxa de

degradação entre os polímeros bioabsorvíveis são atribuídas às diferenças no acesso da

água à ligação éster. Este acesso é relacionado diretamente com a hidrofobicidade dos

monômeros, a cristalinidade do material e as dimensões da amostra. O efeito

plastificante da água durante o processo de degradação conduz a alterações

morfológicas do material. A degradação é caracterizada geralmente pela perda de

massa, diminuição de Mw ou em muitos casos pelo empobrecimentos das suas

propriedades mecânicas, como a resistência à tensão. (GRIZZIA et al., 1995)

A cristalinidade de materiais bioabsorvíveis como o poli(ácido lático) tem sido

estudada e avaliada nas últimas duas décadas. Durante a degradação, a maior

susceptibilidade do ataque às ligações ésteres das regiões amorfas fazem aumentar o

percentual relativo de cristalinidade do material. Partículas cristalinas de PLA são

observadas em implantes in vivo mesmo após longos períodos de experimentação.

(VERT et al., 1994)


Os implantes de polímeros apresentam grande potencial de uso, pois são,

geralmente, fáceis de produzir, manusear e com características mecânicas semelhantes

aos materiais biológicos. Devido as propriedades de biodegradação e bioabsorção novas

aplicações tem sido propostas. Fundamentalmente qualquer trabalho terapêutico em

implantes, liberação controlada de drogas ou mimetização de funções visa à

aproximação da estrutura sintética com a orgânica original. Idealmente a melhor terapia

é aquela em que o tecido, ou órgão, volte a desempenhar suas funções normais. Embora

muitos dispositivos protéticos artificiais estejam disponíveis para substituir tecidos,

como as próteses de junções (joelho, cotovelo), válvulas do coração, etc., poucos desses

dispositivos sintéticos podem substituir completamente todas as funções do tecido

original. Em situações clínicas mais severas somente o transplante do órgão retoma as

atividades orgânicas.

A técnica consiste no desenvolvimento de estruturas tridimensionais de

polímeros bioabsorvíveis utilizados como suporte para o crescimento celular. As fontes

são os materiais biológicos (tecidos) do próprio paciente, ou tecidos estrangeiros, e

estruturas tridimensionais sintéticas. A forma/estrutura e a composição dos materiais

utilizados como suporte estimulam e induzem o crescimento e a diferenciação celular.

Os desafios atuais estão relacionados no projeto e processamento dessas estruturas

tridimensionais de modo que o tecido formado seja o desejado, que a função original

seja restabelecida e que o procedimento seja reprodutível e de baixos custos.

(VACANTI et al., 1996).

Em se tratando da regeneração de tecidos, seja através do recrutamento de

células de tecido vizinho sadio, ou através de transplante de células sadias, é necessária

a existência de um substrato que sirva como suporte para o crescimento celular. Este

suporte pode ser de material reabsorvível, o qual desaparece à medida que o tecido se

regenere, ou de um material bioinerte, com características semelhantes as da matriz

extracelular.

A influencia da morfologia do material é relatada na literatura e diversas técnicas

têm sido utilizadas na preparação de estruturas porosas ou densas de PLA e PLGA com

aplicações na Engenharia de Tecidos. Os esforços de engenharia de tecido estão sendo

empreendidos atualmente para tipos específicos de tecido e as aplicações terapêuticas

em seres humanos começaram a ser avaliadas nos últimos anos. Diversos autores

relatam experimentos que visam à reprodução total ou parcial de estruturas anatômicas


em aplicações e terapias de reconstrução, como por exemplo: reconstrução da

cartilagem na região nasal (PUELACHER et al.,1994), crescimento de condrócitos em

estruturas no formato de uma orelha humana (CAO et al., 1997), mamilo feminino

(CAO et al., 1998), válvulas e dutos urológicos (ATALA, 2000) e outros.

Compreender como a morfologia dos polímeros bioabsorvíveis se altera ao longo

da cultura de células representa um avanço no entendimento da interação entre o

material sintético e o crescimento e diferenciação celular.

A seguir é apresentada a metodologia utilizada neste trabalho e resultados

obtidos.

2. Metodologia - Materiais e Métodos

Para síntese das estruturas tridimensionais utilizou-se poli (L-ácido lático) (PLLA)

(Mw = 100 000) e poli(ácido lático-co-ácido glicólico) (50:50) (PLGA 50/50), ambos na

forma de pellets, fornecidos pela PURAC (Groninger – Holanda).

2.1. Síntese dos Suportes Tridimensionais: Foram confeccionados 2 tipos de

estruturas: Membranas Densas, Membranas Porosas

O procedimento a seguir foi realizado separadamente para ambos os materiais:

Membranas Densas: dissolveu-se o polímero sob agitação, em cloreto de metileno

(H2CCl2) (MERCK) na concentração 10% (w / v). A solução foi em seguida vertida

sobre placas de vidro, limpas e secas com etanol para evaporação do solvente.

Membranas Porosas: foram preparadas de modo análogo às densas, com o mesmo

solvente e mesma concentração em porcentagem em massa. Incluiu-se após a dissolução

do polímero, citrato trissódico di-hidratado (C6H5Na3O7.2H2O) (MERCK) com uma

granulometria do sal previamente estabelecida por um sistema de peneiras que

permitiram reter partículas na faixa de 180 a 250 µm. Após a secagem, as membranas

porosas foram lavadas, sob agitação, em água destilada por aproximadamente 20 horas,

e em seguida em álcool etílico por mais 2 horas. O etanol foi seco à temperatura

ambiente e as membranas submetidas a vácuo.

Para padronização do processo de evaporação do solvente, placas de vidro

contendo as soluções de polímero foram acondicionadas em uma cuba saturada de

solvente, conectadas à uma linha de ar comprimido (seco e filtrado por um sistema de


sílica e lã de vidro) com vazão 0,01 nm3 / h. O controle da espessura pode ser obtido

pela variação da porcentagem em massa da solução polímero–solvente. Devido a

degradabilidade do material, todas as membranas foram acondicionadas em sacos

plásticos e armazenadas num dessecador sob vácuo até o momento da sua utilização.

Estudo da degradação In Vitro: Amostras de ambos os polímeros foram imersas em

meio de cultura HAM-F10 (Nutriente) e mantidas em banho a 37 °C. As análises foram

efetuadas em intervalos de 1 e 2 semanas de degradação (identificadas por: t=1, t=2). Ao

ser retirado o material foi lavado em água destilada, posteriormente em etanol, e seco a

vácuo.

2.2. Técnicas de Caracterização

2.2.1 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV): Analisou-se a superfície

superior, inferior e fratura das amostras de PLA e PLGA utilizando-se microscópio

eletrônico modelo JEOL JXA 840A. As amostras foram fraturadas em N2 líquido e

recobertas com Au-Pd com metalizador Sputer Coater BAL-TEC SCD 050.

2.2.2 Calorimetria Diferencial de Varredura (DSC): A caracterização térmica foi

realizada através de dois aquecimentos no intervalo de varredura de 25 a 200 °C (com

taxa 10°C.min-1), sob atmosfera de Hélio. O equipamento utilizado foi o STA 409C da

NETZSCH – Geratebau Gmbh Thermal Analysis.

Para o cálculo do grau de cristalinidade das amostras, considerou-se a relação (CAM et

al., 1995):

%100(%)%100

×∆

∆−∆=H

HHdadeCristalini çãocristalizafusão

onde ∆Hfusão = Entalpia de fusão experimental (J/g);

∆Hcristalização = Entalpia de cristalização experimental (J/g);

∆H 100 % = 93,7 J.g-1 (Entalpia de fusão para um polímero

teoricamente 100% cristalino, ALI et al., 1993).

3. Resultados e Discussão


3.1. DSC - Calorimetria Diferencial de Varredura

A técnica de Calorimetria Diferencial de Varredura foi útil para a caracterização

do material em estudo na determinação de variações da cristalinidade durante o processo

de degradação. Foram realizadas análises de DSC para membranas densas e porosas no

tempo t = 0, t=1 e t=2 semanas.

Tabela 1 - Dados de DSC para amostras de PLLA e PLGA degradadas e não

degradadas.

PLLA Membrana

Densa

Tempo

(semanas)

Tg ( oC ) Tfusão ( oC ) ∆∆∆∆Hfusão ( J/g

)

% Cristalinidade

0 63 178 35 37%

1 57 179 48 52%

2 58 180 72 77%

PLLA Membrana

Porosa

Tempo

(semanas)


)

% C

0 62 178 33 35%

1 61 178 37 39%

2 56 178 41 44%

PLGA Membrana

Densa

Tempo

(semanas)


)

% C

0 48 - - Amorfo


1 46 - - Amorfo

2 47 - - Amorfo

PLGA Membrana

Porosa

Tempo

(semanas)


)

% C

0 49 - - Amorfo

1 48 - - Amorfo

2 47 - - Amorfo

As análises térmicas de DSC confirmam dados da literatura a respeito da

cristalinidade do material. De maneira geral, estruturas de PLLA são semi-cristalinas e

de PLGA são amorfas. (REED e GILDING, 1981).

Pela tabela 1 é possível observarmos que há diferença no comportamento entre

os materiais, PLLA e PLGA, mas não há diferença significativa que diferencie o tipo de

preparação das estruturas. Os valores para as temperaturas de transição vítrea,

cristalização e fusão não apresentaram diferenças em relação à estrutura do material.

Como conclusão preliminar a respeito dos dados fornecidos pela técnica de DSC

podemos afirmar que a metodologia empregada foi padronizada e gerou estruturas

semelhantes em relação às características térmicas.

Valores do grau de cristalinidade apresentados pela tabela 1 demonstram uma

nítida diferença entre as estruturas durante o processo de degradação.

Quando os dados são comparados entre os polímeros é possível verificarmos que

há um aumento no grau de cristalinidade do PLLA e que esse aumento é mais acentuado

em estruturas não porosas.

Quando comparados entre si, o PLGA e o PLLA não alteraram suas

características originais (t=0). O PLLA possui uma fase amorfa e uma cristalina,

identificada pela temperatura de transição vítrea e pela temperatura de fusão,

respectivamente. O PLGA, entretanto, é amorfo e durante o processo de degradação não

apresentou características cristalinas.


O processo de degradação visto pelas fotos sugere um ataque preferencial das

regiões amorfas, sendo gradual e diretamente proporcional com o tempo de degradação

in vitro. Devido a configuração espacial das cadeias poliméricas, as moléculas de água

penetram com maior facilidade nas porções amorfas do material, dando início ao

processo de hidrólise preferencialmente nestas regiões.(DUEK et al. , 1999)

Outro fator a ser considerado em nossos resultados é a pequena variação nos

valores de Tg, explicado pelo efeito plastificante da água.

3.2. MEV - Microscopia Eletrônica de Varredura

A análise da Microscopia Eletrônica de Varredura permite caracterizar o material

segundo os aspectos morfológicos, relacionando o processo de preparação com a

estrutura-morfologia e consequentemente a biofuncionalidade. Foram realizadas

análises observando-se a morfologia das superfícies superior-inferior e da fratura das

membranas de PLLA e PLGA.

Os dados apresentados refletem um comportamento médio das estruturas

preparadas. Os aumentos e a barra de escala são indicadas na legenda de cada foto.

Membranas Porosas

Foto 1 – PLGA Porosa t=0 Foto 2 – PLLA Porosa t=0

Sup. Superior Fratura



Sup. Superior Fratura


Sup. Superior Sup. Superior

Membranas confeccionadas com adição de sal (fotos 1 e 2) possuem morfologia

semelhante: as superfícies superiores são irregulares e repletas de concavidades. O

material continua a apresentar regiões globulares e aglomeradas, mas agora recobrindo

partículas de aproximadamente 200 µm. O material apresenta ainda pequenas fissuras

nessas superfícies indicando uma região de penetração da água no processo de

dissociação e retirada do sal adicionado na solução polímero-solvente. A fratura da

amostra reafirma a presença e a interconexão de poros em toda a espessura do material

verificando-se ainda que é heterogênea quanto ao seu formato e distribuição. O tamanho

dos poros e sua distribuição variaram conforme a granulometria de sal utilizado

(tamanhos de poros de aproximadamente 200 µm). A análise reafirma também que não

há partículas de sal presentes no material, indicando que o tempo de lavagem foi

adequado.


Durante o processo de degradação as estruturas de PLLA não sofreram

modificações morfológicas significativas (foto 4 e 6). O tamanho dos poros permanece

inalterado. Entretanto as estruturas de PLGA sofrem modificações significativas. A

membrana perde a característica porosa, apesar de manter a superfície irregular (fotos 3

e 5).

Membranas Densas

Foto 7 – PLGA Densa t=0 Foto 8 – PLLA Densa t=0

Fratura Sup. Superior


Fratura Fratura



Sup. Superior Sup. Superior

As micrografias obtidas das amostras de membranas de PLLA e PLGA, sem a

adição de sal, indicam um material denso com superfície superior irregular com

pequenas concavidades (fotos 7 e 8). Membranas de PLLA apresentam morfologia

superficial diferente das de PLGA, isto é: possuem aglomerados que se juntam em toda

a sua extensão. A análise da fratura das estruturas de PLLA (foto 10) confirma a

existência dos aglomerados esféricos que geram concavidades na superfície. A estrutura

interna das membranas (PLLA e PLGA) é compacta.

O processo de degradação é evidenciado morfologicamente para as estruturas de

PLGA, como pode ser observado pelas fotos 9 e 11 e indica que o processo ocorre

principalmente no interior do material, e não na sua superfície. Apesar dos dados de DSC

sugerirem que há degradação das estruturas de PLLA, através do aumento da

porcentagem de cristalinidade, esta não pode ser observada de forma significativa pelo

MEV.

4. Conclusões

A Microscopia Eletrônica de Varredura permitiu a caracterização morfológica do

material inicial e durante o processo de degradação. Através das técnicas foi possível

distinguirmos membranas densas e porosas, tamanho de poros e distribuição do

tamanho de poros. Membranas densas PLLA e PLGA não possuem poros internos, para

período zero de degradação. Membranas de PLLA, ao contrário do PLGA, possui

superfície superior irregular apresentando concavidades ao longo da superfície do

material. Membranas com a adição de sal são porosas internamente. A superfície do

material é densa mas as fraturas indicam majoritariamente poros dentro dos limite da

granulometria preestabelecida.

As análises térmicas de DSC mostram que os materiais são diferentes em relação

a estabilidade térmica e à cristalinidade. Estruturas de PLLA são semi-cristalinas e de

PLGA amorfas. Ambos os materiais possuem temperatura de transição vítrea (Tg)

acima da temperatura corpórea e podem ser utilizadas como suporte para a cultura de

células.


O processo de degradação é mais acentuado morfologicamente nas estruturas de

PLGA, entretanto é evidenciado também no PLLA, através do aumento relativo da

cristalinidade do material.

5. Bibliografia

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Agradecimentos: à FAPESP (Proc. 99/05536-7) pelo suporte financeiro.

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