Estudo da caspase-3 e da dismútase Estudo da caspase-3 e da dismútase do superóxido no córtex supra-renal do superóxido no córtex supra-renal

após administração crónica de após administração crónica de ACTHACTH

Aplicação de bombas osmóticas intra-peritoneais: efeito de 3 dosagens de ACTH na secreção de

corticosterona

Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

Laboratório de Biologia Celular e Molecular

Fátima Leal Seabra(Orientador: Prof. Doutor Henrique Almeida)

Objectivos do estudoObjectivos do estudo Objectivos gerais:

Aplicação de técnicas laboratoriais leccionadas durante as aulas de Biologia Celular e Molecular

Dar a conhecer a vivência laboratorial Estimular a curiosidade no domínio da investigação

Objectivo específico: Pesquisa da expressão de MnSOD e do factor

apoptótico caspase-3, por imunocitoquímica, em animais tratados com ACTH

RazõesRazões Pesquisa de MnSOD:

Verificou-se que a administração aguda de ACTH aumenta a sua expressão, mas desconhece-se o efeito da administração crónica

Colateralmente, Tendo-se observado que a supressão de ACTH

aumenta a expressão de caspase-3, indagou-se se a sua administração crónica a diminui.

Introdução-ÍndiceIntrodução-Índice

A Glândula supra-renal

Radicais livres e dismútase do superóxido

A caspase-3

A glândula supra-renal A glândula supra-renal (GSR)(GSR)

www.emc.maricopa.edu

cai.md.chula.ac.th

Ultra-estrutura das células do Córtex de GSR

A hormona A hormona adrenocorticotróficaadrenocorticotrófica

A hormona adrenocorticotrófica (ACTH) é o maior estimulante da secreção das hormonas adrenocorticais, nomeadamente dos glicocorticóides (corticosterona e cortisol)

www.aafp.org/

Fontes e consequências Fontes e consequências dos radicais livresdos radicais livres

222 OH;O

2Fe;Cu

Fontes endógenas:

•Cadeia respiratória

•Reacções enzímicas

•Reacções de autooxidação

Fontes exógenas:

•Fumo do tabaco

•Poluentes

•Luz UV

•Radiações ionizantes

•Xenobióticos

Produção de Produção de radicais livresradicais livres

Metais de transição

OH

Peroxidação lipídicaModificações nas

bases de DNA

Alterações proteicas

Lesão dos tecidosLesão dos tecidos Antioxidantes in health disease,

IS Young et al, J Clin Pathol 2001, 54:176-186 (adaptação)

Defesas dos Defesas dos antioxidantesantioxidantes

222 OH;O

2Fe;Cu

Produção de Produção de radicais livresradicais livres

Metais de transição

OH

Lesão dos tecidosLesão dos tecidos

Enzimas antioxidantes:

•dismútase dodismútase do superóxidosuperóxido

•catálase

•peroxídase da glutationa

Proteínas que se ligam aos metais:

•transferrina

•ferritina

•lactoferrina

Mecanismos de reparaçãoAntioxidantes in health disease,

IS Young et al, J Clin Pathol 2001, 54:176-186 (adaptação)

Outras substâncias:

•fases lipídicas:

tocoferóis

ubiquitinol

carotenóides

flavonóides

•fases aquosas

•ascorbato

•urato

•glutationa

A dismútase do A dismútase do superóxido, SODsuperóxido, SOD Há 3 isoformas:

Intracelulares SOD cobre-zinco (CuZnSOD)

Massa molecular de 32 kDa Homodímero Encontrada em organelos e no citoplasma

SOD manganésio (MnSOD) Massa molecular de 40 kDa Homotetrâmero Presente em mitocôndrias, nomeadamente de GSR Distingue-se da CuZnSOD pois não é inibida com cianeto

OHOHO glutationadaperoxídaseoucatálase

MnSOD2222

A dismútase do A dismútase do superóxido, SODsuperóxido, SOD

Extracelular SOD extracelular (EC-SOD)

Massa molecular de 135kDa Tetrâmero Contém um átomo de Zn e Cu em cada subunidade Sintetizada em alguns tipos de células: - células endoteliais

- fibroblastos

A caspase-3A caspase-3 Membro de uma família de proteases, com

resíduos de cisteína (C) no seu local catalítico e que clivam proteínas-substrato no extremo carboxílico de resíduos de ácido aspártico (Asp).

“executora” da morte celular programada - apoptose

www.rcsb.org/pdb/newsletter/2004q3/caspases.gif

A caspase-3A caspase-3

The Cell A Molecular Approach,Third Edition, Geoffrey M Cooper et al

Lesões nas mitocôndrias

Libertação do citocromo c e de moléculas pró-apoptóticas

(Smac/Diablo)

Citocromo c induz a formação do apoptossoma

(Apaf-1 e Caspase-9)

Activação de uma via de caspases pela caspase-9

Activação da caspase-3

Nota: Smac/ Diablo promovem a apoptose interferindo com a acção dos IAPs que são inibidores das caspases

A caspase-3A caspase-3Célula Normal

Célula apoptótica

Molecular Cell Biology, Fourth edition, Lodish et al

medidacte.timone.univ-mrs.fr/.../ apoptose.html

Métodos - ÍndiceMétodos - Índice

Introdução de bombas osmóticas

Colheita e processamento de glândulas supra-renais:

Microscopia de luz (imunocitoquímica) Microscopia electrónica

Introdução de Bombas Introdução de Bombas OsmóticasOsmóticas

Ratos machos Wistar 3 meses de idade Peso ~262g

Bombas osmóticas Alzet®, com Soro fisiológico (SF) ACTH com concentração de 1mg/1mL

Introdução de Bombas Introdução de Bombas OsmóticasOsmóticas Anestesia com Sevorane® a

5% em mistura oxigénio:ar de 1:2

Laparotomia mediana inferior

Introdução das bombas na cavidade peritoneal

Sutura da parede abdominalAplicação de Bombas Osmóticas intraperitoniais: Estudo do efeito de endotoxina na microestrutura da glândula supra-renal do rato, Michel Sapateiro Luís, 2003

Recolha das supra-renais e Recolha das supra-renais e preparação para microscopiapreparação para microscopia Ao fim de 7 dias sacrificaram-se os animais por

decapitação

Microscopia ópticaMicroscopia óptica Fixaram-se porções de glândula supra-renal em formol Incluíram-se em parafina Fizeram-se cortes com micrótomo e colocaram-se estes em

lâminas com poli-L-lisina

Microscopia electrónicaMicroscopia electrónica Fixaram-se porções de glândula supra-renal com

glutaraldeído a 2,5% em tampão cacodilato Inclusão em EPON Fizeram-se cortes ultrafinos que se colocaram em grelhas e

se coraram para observar no microscópio electrónico

Imunocitoquímica da Imunocitoquímica da MnSODMnSOD1. Desparafinação dos cortes

2. Hidratação

3. Bloqueio da peroxídase endógena com a 3%

4. Bloqueio com BSA 2% em TBS

5. Incubação com Anti-MnSOD (anticorpo I de coelho) durante 24h

6. Incubação com anticorpo II, anti-coelho biotinilado durante 30 min

7. Adicionou-se o complexo ABC (Streptavidina Peroxídase)

8. Revelação com DAB

9. Contraste com Hematoxilina + Eosina

10. Mantagem com Entellan

11. Observação a microscopia de luz

22OH

Imunocitoquímica da Imunocitoquímica da Caspase-3Caspase-31. Desparafinação

2. Hidratação

3. Colocar os cortes em tampão de citrato até entrar em ebulição

4. Baixar a temperatura

5. Inibição da peroxídase endógena por adição a 3%

6. Bloqueou-se com BSA 5% em TBS-T

7. Adicionou-se anticorpo I de coelho durante 24h

8. Incubação 30 min com anticorpo II, anti-coelho, biotinilado

9. Incubação com complexo ABC

10. Revelação com DAB

11. Contraste com hematoxilina e eosina

12. Montagem com Entellan

13. Observação a microscopia de luz

22OH

Resultados -ÍndiceResultados -Índice

Microscopia electrónica

Microscopia óptica Cortes semi-finos Imunocitoquímica da SOD Imunocitoquímica da caspase-3

Microscopia ópticaMicroscopia ópticaCortes semi-finosCortes semi-finos

ZG da GSR no animal controlo ZG na GSR no animal tratado com ACTH

Resultados Resultados Microscopia electrónicaMicroscopia electrónica

Inclusões lipídicas

mitocôndrias

GSR em que foi administrado soro fisiológico (SF) no animal

GSR em que foi administrado ACTH

no animal

heterocromatina

nucléolo REL

Microscopia óptica Microscopia óptica Imunocitoquímica da MnSODImunocitoquímica da MnSOD

Cápsula

ZG

ZF

ZR

medula

córtex

GSR do animal em que houve administração de ACTH

Microscopia óptica Microscopia óptica Imunocitoquímica da MnSODImunocitoquímica da MnSOD

ZF da GSR no controlo (SF) ZF da GSR no animal tratado com ACTH

Microscopia ópticaMicroscopia ópticaImunocitoquímica da Imunocitoquímica da caspase-3caspase-3

Cápsula, ZG e ZF da GSR no animal controlo (SF)

ZF da GSR no animal em o ACTH foi administrado

cápsula

ZG

ZF

ConclusõesConclusões A introdução de bombas osmóticas é tecnicamente fácil

É necessário aumentar o número de animais para confirmar os dados observados;

A administração de ACTH não altera a localização da expressão de MnSOD relativamente ao controlo e em ambos os casos há uma intensidade de marcação importante;

A marcação da caspase-3 ocorreu em núcleos e citoplasma da ZF/ZR após administração crónica de ACTH. É possível que tal resulte de:

Activação de processos apoptóticos, ainda sem expressão morfológica;

Activação de uma via de sinalização não associada a morte celular, em que a caspase-3 parece estar também envolvida

BibliografiaBibliografia[1] R.E. Kramer, W.E. Rainey; B, Funkenstein, A. Doee; E. R. Simpson, M.R. Waterman, Induction of syntisis of mitochondrial

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AgradecimentosAgradecimentos Prof. Doutor Henrique Almeida

Drªs Liliana Matos e Adriana Rodrigues

D. Maria Amélia Ferreira e D. Elisa Galvão

FimFim