ESTUDO DA EXPRESSÃO IMUNO- HISTOQUÍMICA DE SOX2, … · À minha turma de mestrado e doutorado, Manoela, Thais, Malu, Luciana, Vivi, Andréia, Tiago, Luiz, Nice e Laura, com a amizade

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MARCELO ANDERSON BARBOSA NASCIMENTO

ESTUDO DA EXPRESSÃO IMUNO-

HISTOQUÍMICA DE SOX2, FGF-10 E WNT-1 EM

LESÕES ODONTOGÊNICAS EPITELIAIS

BENIGNAS

NATAL-RN

2018

1

MARCELO ANDERSON BARBOSA NASCIMENTO

ESTUDO DA EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE SOX2, FGF-10

E WNT-1 EM LESÕES ODONTOGÊNICAS EPITELIAIS BENIGNAS

NATAL/RN

2018

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

ESTUDO DA EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE SOX2, FGF-10 E WNT-1

EM LESÕES ODONTOGÊNICAS EPITELIAIS BENIGNAS

NATAL/RN

2018

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande

do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do

Título de Doutor em Patologia Oral.

Doutorando: Marcelo Anderson Barbosa Nascimento

Orientadora: Profª. Drª. Lélia Batista de Souza

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Dedicatória

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Aos meus pais, Joaquim Marcelino (in memoriam) e Luiza Maria, pela vida e pela educação que me fez alcançar além do que eu sonhava.

Às minhas irmãs, Aninha e Iara, que sonham comigo apesar da distância.

Ao meu irmão Marcieudo, pela amizade e apoio.

Ao meu sobrinho, Enzo, por encher meus dias de alegria e esperança.

A Kleyber, parceiro paciente nestes anos.

A todos os meus professores, do “pré-escolar” até agora, vocês são minha inspiração.

“A verdadeira alegria vem da harmonia profunda entre as pessoas, que todos experimentam no seu coração e que nos faz sentir a beleza de estar juntos, de apoiar-se mutuamente no

caminho da vida.”

Jorge Mario Bergoglio

8

Agradecimentos

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Àquele que me feriu de Amor, que me constrói quando me desfaço, que me

faz ir avante quando temo sair do lugar, minha constante e eterna gratidão.

À minha orientadora, Profª Drª Lélia Batista de Souza, pela desmedida

paciência comigo durante esses anos de Pós-Graduação, aproveito para pedir

perdão pela minha falta de dedicação. E agradeço pela sua dedicação de

vida em favor da Odontologia e pesquisa científica.

Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral Prof.

Dr. Leão Pereira Pinto, Profª Drª Roseana de Almeida Freitas, Profª Drª

Hébel Cavalcante Galvão, Profª Drª Lélia Maria Guedes Queiroz, Prof Dr

Antônio de Lisboa Lopes Costa, Profª Drª Ana Myriam Costa de Medeiros,

Profª Drª Márcia Cristina da Costa Miguel, Profª Drª Érika Janine Dantas

da Silveira, Profª Drª Patrícia Teixeira de Oliveira, Prof Dr Carlos Augusto

Galvão Barbosa que por caminhos interessantes nos encontram… e neste

encontro, desenterram-nos, nos dá polimento, põe-nos no presente. Aos

poucos lapidam-nos, aos toques, com jeito, a um olhar atento para nos

tornar de uma pedra rústica à uma pedra polida, preciosa.

Profª Drª Karuza, Prof Fábio Wildson, Profª Ivana, Profª Patrícia

Teixeira, Prof Gustavo, Prof Manoel, Prof Cassiano, Prof Pedro Paulo,

Prof Dácio, Prof Alberto, Prof Cícero, Profª Rejane, Profª Jovanka, Profª

Juacema, Profª Raquel, Profª Aparecida, Profª Maria Alice, obrigado pela

inspiração, pelo apoio e incentivo, tenham a certeza que se estou aqui foi

para tentar ser o professor que vocês são para mim.

À minha turma de mestrado e doutorado, Manoela, Thais, Malu, Luciana,

Vivi, Andréia, Tiago, Luiz, Nice e Laura, com a amizade que foi sendo

construída com vocês o caminho foi mais leve e prazeroso.

Aos meus irmãos de orientação, Keila, Adriana, Jamile, Vilson, Leorik,

Dáurea, obrigado pelo apoio intelectual e pela cumplicidade.

10

À Denise (amor meu), e demais xuxus, Ana Luiza, Rose, Melka (mestra),

Clarissa, Bárbara, Natália, pela imensa contribuição no início e ao longo de

nossa jornada patológica.

Aos demais colegas, Cyntia, Maiara, Stefânia, Joabe, Emeline, Felipe,

Fernanda, Jadson, Eduardo, Emília, Salomão, Rafaela, Luiz Arthur,

Amanda, Mara, Hugo, Jefferson, Marianna, Patrícia, Rodrigo, Thalita e

Angélica, obrigado pelas conversas, conselhos, risadas, ensino e companhia

carinhosa.

Aos meus coordenadores da Escola Técnica Potiguar, Disraeli e Lidiane, e

demais colegas e professores, obrigado pela confiança e compreensão durante

este período.

À Gracinha, Lourdinha, Hévio, Sandrinha e Ricardo, pelo auxílio e

dedicação desmedida para conosco.

À minha família pelo apoio e torcida.

À Fernanda Duarte, minha amiga-mana pela sua e amizade, confiança,

irmandade e tremenda paciência em meu auxílio. À Karlla Luah pela

amizade e por aguentar minhas loucuras.

Aos meus amigos (me perdoem se alguém não for citado) Filipe, Tiago, Jean

(juntos formamos aquele quarteto), Hudson, Dani (amada), Luis Carlos,

Carla Paiva, Henrique, Alberto, Carla Costa, Vanessa do Carmo, Suelanne,

Joelia, Rafael, Moniquinha, Derson, Tati (pqna), Gustavo e Ana Sampaio,

Genianny, Rafaela Nobrega, Giselle, Janaides, Belinha, Mienda e Andrew

(pela ajuda na pesquisa) que deposito meu amor e que me retribuem da

mesma forma, como gostaria de abraçá-los e agradecer por acreditarem em

mim.

Aos meus pacientes e alunos, pela confiança e compreensão.

11

Ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral – PPGPO e a

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela disponibilidade de

infraestruturas de material e de recursos humanos.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

pelo auxílio financeiro na minha formação e desenvolvimento deste

trabalho.

12

Para vir ao que não sabes – hás de ir por onde não sabes.

Para vir a saber tudo – não queiras saber algo em nada.

João da Cruz.

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Resumo

14

RESUMO

Os dentes desenvolvem-se a partir de interações sequenciais entre o epitélio e o mesênquima

derivado da crista neural em diferentes estágios de histodiferenciação e morfodiferenciação.

Ao final da odontogênese, espera-se que as estruturas que participaram da formação destes

tecidos desapareçam ou permaneçam quiescentes. Não é incomum que os remanescentes

epiteliais da odontogênese originem lesões, como cistos e tumores odontogênicos. No

desenvolvimento dentário precoce, a manutenção das células-tronco é regulada por uma série

de fatores de transcrição específicos, que inclui OCT-4, SOX-2, Nanog, Stat-3 e c-Myc e

diversos outros genes Homeobox e vias de transcrição (SHH, Wnt/β-catenina, FGF, BMP)

contribuem para o destino e diferenciação celular. No entanto, há a participação destes genes

e vias na patogênese de vários tipos de tumores. O objetivo do presente estudo foi avaliar a

imunoexpressão de SOX2, FGF-10 e Wnt-1 em uma série de casos de lesões odontogênicas e

alguns espécimes de germes dentários. A amostra consistiu de 20 Ceratocistos Odontogênicos

(CO), 20 Ameloblastomas sólidos (AM), 20 Tumores odontogênicos adenomatoides (TOA),

10 Tumores odontogênico epitelial calcificante (TOEC) e 05 casos de germes dentários

usados comparativamente. A imunoexpressão foi avaliada de acordo com o percentual de

células epiteliais imunomarcadas e intensidade de células positivas resultando na pontuação

de imunomarcação total (PIT) que variou de 0 a 7. A análise da imunoexpressão da SOX2

revelou positividade na maioria dos casos das lesões estudadas. A pontuação de

imunomarcação para SOX2 revelou haver diferença estatisticamente significativa entre os

grupos de lesões estudadas, com maior frequência em CO e TOEC (p <0,001). Após o

pareamento, observou-se diferença significativa entre AM e CO, AM e TOEC, CO e TOA,

CO e TOEC e, TOA e TOEC (p <0,05). A análise da imunoexpressão da FGF-10 e Wnt-1

revelou positividade em todos os casos das lesões estudadas, mas sem diferença

estatisticamente significativa entre os grupos de lesões estudadas (p = 0,628). Houve

diferença significativa em relação aos escores de positividade para Wnt-1 (p <0,001) com

maior frequência em CO e TOA. Após o pareamento, observou-se existir diferença

estatisticamente significativa entre AM e CO, AM e TOEC, CO e TOEC e, TOA e TOEC (p

<0,05). O padrão de expressão de SOX2, FGF-10 e Wnt-1, em germes dentários e nas lesões

odontogênicas aqui avaliadas, confirma a participação destas vias na odontogênese e também

no desenvolvimento das lesões odontogênicas.

Palavras-chave: Células-tronco, Lesões Odontogênicas Epiteliais Benignas; Imuno-

histoquímica; SOX2; FGF10; Wnt-1.

15

Abstract

16

ABSTRACT

Dental development occurs from sequential interactions between the epithelium and the

mesenchyme derived from the neural crest at different stages of histodifferentiation and

morphodifferentiation. At the end of tooth development, the structures that participated in the

formation of these tissues are expected to disappear or remain quiescent. It is not uncommon

that the epithelial remnants of the tooth development originate lesions such as odontogenic

cysts and tumors. In early tooth development, stem cell maintenance is regulated by specific

transcription factors, which includes OCT-4, SOX-2, Nanog, Stat-3 and c-Myc and several

other Homeobox genes and transcription pathways (SHH, Wnt/β-catenin, FGF, BMP)

contribute to cell fate and differentiation. However, there is involvement of these genes and

pathways in the pathogenesis of several types of tumors. The aim of the present study was to

evaluate the immunoexpression of SOX2, FGF-10 and Wnt-1 in a case series of odontogenic

lesions and some specimens of dental germs. The sample consisted of 20 Odontogenic

Keratocysts (OK), 20 solid ameloblastomas (AM), 20 adenomatoid odontogenic tumors

(AOT), 10 calcifying epithelial odontogenic tumors (CEOT) and 5 dental gerns for

comparison. Immunoexpression was evaluated according to the percentage of immunostained

epithelial cells and intensity of the positive cells resulting in total immunostaining score (PIT)

ranging from 0 to 7. The analysis of SOX2 immunoexpression revealed positivity in most

cases of the lesions studied. The immunostaining score for SOX2 revealed a statistically

significant difference between the groups of lesions studied, with a higher frequency in OK

and CEOT (p < 0.001). After pairing, we observed a significant difference between AM and

OK, AM and CEOT, OK and AOT, OK and CEOT, and AOT and CEOT (p <0.05). Analysis

of the FGF-10 and Wnt-1 immunoexpression revealed positivity in all cases of the lesions

studied, with no statistically significant difference between the groups of lesions studied (p =

0.628). There was a significant difference in relation to the positivity scores for Wnt-1 (p

<0.001) with higher frequency in OK and AOT. After pairing, there was a statistically

significant difference between AM and OK, AM and CEOT, OK and CEOT and, AOT and

CEOT (p <0.05). The expression pattern of SOX2, FGF-10 and Wnt-1 in dental germs and

odontogenic lesions evaluated here confirms the participation of these pathways in the tooth

development as well as in the development of odontogenic lesions.

Keywords: Stem cells, Benign Odontogenic Epithelial Lesions; Immunohistochemistry;

SOX2; FGF10; Wnt-1.

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Lista de Ilustrações

18

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Fotomicrografia evidenciando a fraca marcação nuclear de SOX2 em

Ameloblastoma com evidente marcação em vasos sanguíneos no estroma

(Panoramic Viewer, Advance).........................................................................70

Figura 2. Fotomicrografia evidenciando a fraca marcação nuclear e citoplasmática de

SOX2 em Tumor Odontogênico Epitelial Calcificante (Panoramic Viewer,

Advance)..........................................................................................................70

Figura 3. Fotomicrografia evidenciando a fraca marcação citoplasmática de SOX2 em

Tumor Odontogênico Epitelial Calcificante com escassa marcação no material

amiloide e anéis de Liesegang (Panoramic Viewer, Advance)........................71

Figura 4. Fotomicrografia evidenciando a fraca marcação citoplasmática de SOX2 em

Tumor Odontogênico Adenomatoide (Panoramic Viewer, Advance).............71

Figura 5. Fotomicrografia evidenciando marcação nuclear de SOX2 em Ceratocisto

Odontogênico (Panoramic Viewer, Advance).................................................72

Figura 6. Fotomicrografia evidenciando a marcação nuclear e citoplasmática de SOX2

em germe dentário na fase de campânula (Panoramic Viewer, Advance)......72

Figura 7. Fotomicrografia evidenciando a marcação citoplasmática de FGF-10 em

Ameloblastoma (Panoramic Viewer, Advance)..............................................73

Figura 8. Fotomicrografia evidenciando marcação nuclear e citoplasmática de FGF-10

em Tumor odontogênico epitelial calcificante (Panoramic Viewer,

Advance)..........................................................................................................73

Figura 9. Fotomicrografia evidenciando marcação citoplasmática de FGF-10 em Tumor

odontogênico adenomatoide (Panoramic Viewer, Advance)...........................74

Figura 10. Fotomicrografia evidenciando a marcação de FGF-10 em Ceratocisto

Odontogênico, com evidente marcação em vasos sanguíneos no estroma


19

Figura 11. Fotomicrografia evidenciando a marcação nuclear e citoplasmática de FGF-10

em germe dentário na fase de campânula (Panoramic Viewer, Advance).......75

Figura 12. Fotomicrografia evidenciando a moderada marcação citoplasmática de Wnt-1

em Ameloblastoma com evidente marcação em vasos sanguíneos no estroma


Figura 13. Fotomicrografia evidenciando a fraca marcação citoplasmática de Wnt-1 em

Tumor Odontogênico Epitelial Calcificante com escassa marcação no material

amilóide (Panoramic Viewer, Advance)..........................................................76

Figura 14. Fotomicrografia evidenciando a marcação citoplasmática de Wnt-1 em Tumor

odontogênico adenomatoide (Panoramic Viewer, Advance)...........................76

Figura 15. Fotomicrografia evidenciando a marcação citoplasmática de Wnt-1 em

Ceratocisto Odontogênico com evidência em suprabasal e superficial


Figura 16. Fotomicrografia evidenciando a marcação nuclear e citoplasmática de Wnt-1

em germe dentário na fase de campânula, com fraca marcação nas regiões das

alças cervicais (Panoramic Viewer, Advance).................................................77

Figura 17. Fotomicrografia evidenciando a marcação nuclear de SOX2

predominantemente na camada basal e suprabasal em mucosa oral subjacente

a área do parênquima de um caso de Ameloblastoma (Panoramic Viewer,

Advance)..........................................................................................................78

20

Lista de Quadro e Tabelas

21

LISTA DE QUADROS E TABELAS

QUADRO

Quadro 1 Especificidade, clone, fabricante, diluição e incubação..................................56

TABELAS

Tabela 1. Distribuição absoluta e relativa dos casos de acordo com a pontuação de

imunomarcação total (PIT) para SOX-2 no parênquima das lesões

odontogênicas estudadas. Natal – RN, 2018……………………………...62

Tabela 2. Distribuição absoluta e relativa dos casos acordo com os escores de

positividade para SOX-2 no parênquima das lesões odontogênicas estudadas.

Natal – RN, 2018………………………………..………………………….62

Tabela 3. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística

KW e significância estatística (p) para os escores de positividade para SOX2

em relação aos grupos de lesões odontogênicas estudadas. Natal – RN,

2018............………………………….………………………….………….63

Tabela 4. Avaliação da imunoexpressão de SOX2 de acordo com as lesões. Natal –

RN, 2018..………………………………………….……………………….63

Tabela 5. Distribuição dos casos de acordo com a pontuação de imunomarcação total

(PIT) para FGF-10 no parênquima das lesões odontogênicas estudadas. Natal

– RN, 2018.....................................................................................................64


positividade para FGF-10 no parênquima das lesões odontogênicas

estudadas. Natal – RN, 2018. ……………………………..………………..65


KW e significância estatística (p) para os escores de positividade para FGF-

10 em relação aos grupos de lesões odontogênicas estudadas. Natal – RN,

2018.....................................………………………………………………..65

22

Tabela 8. Distribuição dos casos de acordo com a pontuação de imunomarcação total

(PIT) paraWnt-1 no parênquima das lesões odontogênicas estudadas. Natal –

RN, 2018........................................................................................................66


positividade para Wnt-1 no parênquima das lesões odontogênicas estudadas.

Natal – RN, 2018.....................................…………………………………..67


KW e significância estatística (p) para os escores de positividade para Wnt-1

em relação aos grupos de lesões odontogênicas estudadas. Natal – RN,

2018.............................................…………………………………………..67

Tabela 11. Avaliação da imunoexpressão de Wnt-1 de acordo com as lesões. Natal –

RN, 2018.....................................…………………………………………..68

Tabela 12. Tamanho da amostra, comparação, coeficiente de correlação de Spearman (r)

e significância estatística (p) para os escores de positividade para SOX2,

FGF-10 e Wnt-1 em relação aos grupos de lesões odontogênicas estudadas.

Natal – RN, 2018...........................................................................................69

23

Abreviaturas e Siglas

24

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

AM Ameloblastoma

APC Do inglês Adenomatous Polyposis Coli

BIO Do inglês Bromoindirubin oxime

BMI-1 Do inglês B-cell-specific moloney murine leukemia virus integration

site 1

BMP Do inglês Bone morphogenetic protein

BRAF Do inglês v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1

BSA Do inglês Bovine Serum Albumin

CES Células-tronco embrionárias

c-MYC Do inglês myelocytomatosis oncogene

CNS Conselho Nacional de Saúde

CO Ceratocisto Odontogênico

DAB Diaminobenzidina

DKK1 Do inglês Dickkopf-related protein 1 precursor

DLX Do inglês Distal-less homeobox

DNA Do inglês desoxyribonucleic acid

Dvl Do inglês dishevelled segment polarity protein 1

EGF Do inglês epidermal growth factor

Erk Cinases reguladas por sinal extracelular

FGF Do inglês Fibroblast growth factor

FGFR Receptor de Fibroblast growth factor

FoxP1 Do inglês Forkhead box P1

GSK3β Glicogênio Sintase Quinase 3β

hESC Células-tronco embrionárias humanas

HMG Do inglês High mobility group

HoxB4 Do inglês Homeobox B4

IRX Do inglês Iroquois homeobox

ISL Do inglês insulin I gene

25

Klf4 Factor de Krüppel

LEF Do inglês Lymphoid enhancer-binding factor

LRP5/6 Do inglês Low-density lipoprotein receptor-related protein 5 e 6

MAPK Do inglês mitogen-activated protein kinase

Msx Do inglês Msh homeobox

Nanog Do inglês Nanog homeobox

OCT4 Fator de transcrição de ligação Octamer 4

OMS OrganizaçãoMudial da Saúde

OSX Do inglês Osterix

p63 Do inglês tumor protein p63

Pax Do inglês Paired box

PBS Do inglês phosphate buffered saline

PCP Do inglês Planar Cell Polarity

PIT Pontuação de imunomarcação total

Pitx2 Do inglês pituitary homeobox 2

PTCH Do inglês Protein patched homolog

RNA Do inglês ribonucleic acid

RTK Do inglês Receptor tyrosine kinases

RUNX Do inglês Runt-related transcription factor

Sca-1 Do inglês Stem cells antigen-1

SHH Do inglês Sonic Hedgehog

shRNA Do inglês short hairpin RNA

SISNEP Sistema Nacional de Ética em pesquisa

Smad Do inglês Sma and Mad related proteins

SMO Do inglês Smoothened

SNC Sistema nervoso central

SOX2 Região de determinação do sexo Y-box2

SPSS Do inglês Statistical Package for the Social Sciences

Sry Do inglês sex-determining region Y

26

Stat-3 Transdutor de sinal e ativador da transcrição 3

TBX Do inglês T-box

TCF Fator de células T

TGF Fator de crescimento tumoral

TOs Tumores odontogênicos

TOA Tumor odontogênico adenomatoide

TOEC Tumor odontogênico epitelial calcificante

UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Wif1 Do inglês Wnt inhibitory factor 1

Wnt Do inglês Wingless-related integration site

27

Sumário

28

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 31

2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 34

2.1 ODONTOGÊNESE ........................................................................................................ 34

2.2 CÉLULAS-TRONCO E ODONTOGÊNESE ................................................................ 36

2.3 FATOR DE TRANSCRIÇÃO SOX2 ............................................................................. 38

2.4 FGF-10 ............................................................................................................................ 41

2.5 WNT-1 ............................................................................................................................ 43

2.6 CÉLULAS-TRONCO E LESÕES ODONTOGÊNICAS .............................................. 45

2.7 AMELOBLASTOMA .................................................................................................... 46

2.8 TUMOR ODONTOGÊNICO EPITELIAL CALCIFICANTE ...................................... 48

2.9 TUMOR ODONTOGÊNICO ADENOMATOIDE ........................................................ 49

2.10 CERATOCISTO ODONTOGÊNICO .......................................................................... 50

3 PROPOSIÇÃO .................................................................................................................... 53

4 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................................... 55

4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS ........................................................................................ 55

4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO ............................................................................ 55

4.3 POPULAÇÃO ................................................................................................................ 55

4.4 AMOSTRA ..................................................................................................................... 55

4.5 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DA AMOSTRA ............................................................... 56

4.5.1 Critérios de inclusão............................................................................................... 56

4.5.2 Critérios de exclusão .............................................................................................. 56

4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO .......................................................................................... 56

4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO ........................................................................... 57

4.8 ANÁLISE DO PERFIL IMUNO-HISTOQUÍMICO ..................................................... 58

4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................. 59

5 RESULTADOS .................................................................................................................... 61

29

5.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA ......................................................................................... 61

5.2 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS ............................................................... 62

5.2.1 Análise da imunoexpressão de SOX-2 .................................................................. 62

5.2.2 Análise da imunoexpressão de FGF-10 ................................................................ 66

5.2.3 Análise da imunoexpressão de Wnt-1................................................................... 68

5.2.4 Correlação das imunoexpressões de SOX2, FGF-10 e Wnt-1 ............................ 70

6 DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 82

7 CONCLUSÕES .................................................................................................................... 90

8 REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 92

ANEXO .................................................................................................................................. 101

30

Introdução

31

1 INTRODUÇÃO

Os dentes desenvolvem-se a partir de interações sequenciais entre o epitélio e o

mesênquima derivado da crista neural em um processo denominado de odontogênese, que

possui diferentes estágios de histodiferenciação e morfodiferenciação. O tamanho, forma,

estrutura dos dentes e também a posição dos dentes são determinados por genes associados a

interações e processos principais, presentes na região durante o desenvolvimento e maturação

dentária (NANCI, 2013; LI; PARADA; CHAI, 2017). Estes genes também são reguladores

centrais do desenvolvimento e estão associados às interações entre as células. Ao final da

odontogênese, ocorre uma desagregação das estruturas epiteliais que participaram na

formação dos tecidos dentários e espera-se que, com o desenvolvimento, essas células

desapareçam ou permaneçam quiescentes (ISHIKAWA et al., 2017). Durante esse processo

não é incomum que os remanescentes epiteliais da odontogênese originem lesões, como cistos

e tumores odontogênicos (AGARWAL et al., 2016; JIANG et al., 2016).

As lesões odontogênicas constituem um grupo heterogêneo de patologias que

acometem os maxilares, com origem a partir dos remanescentes epiteliais ou mesenquimais da

embriogênese dentária. Essas lesões podem variar de cistos a neoplasias verdadeiras, que por

vezes exibem manifestações clínicas variadas. Os cistos odontogênicos são patologias

relativamente frequentes na prática odontológica, sendo que os mais prevalentes são os cistos

residuais, dentígero e o Ceratocisto odontogênico (CO) (DE SOUZA et al., 2010). Essas

lesões geralmente apresentam uma evolução lenta e benigna. Entretanto, alguns cistos podem

atingir um tamanho significativo se não forem diagnosticados e tratados de forma apropriada,

resultando em importantes transtornos para os pacientes (SELVAMANI; DONOGHUE;

BASANDI, 2012).

As neoplasias derivadas dos tecidos epiteliais, ectomesenquimais ou mesenquimais

que dão origem aos dentes são denominadas de tumores odontogênicos. Algumas dessas

lesões podem apresentar um comportamento maligno, enquanto que outras possuem uma

evolução tão benigna, que parecem representar apenas malformações semelhantes a um tumor

(hamartomas) (RAMOS et al., 2013). O Ameloblastoma é uma neoplasia benigna que se

desenvolve a partir de elementos celulares epiteliais odontogênicos; caracterizado por

crescimento lento, localmente invasivo e se infiltrar entre as trabéculas ósseas, apresentando

altas taxas de recorrência (CHAUDHARY et al., 2011). O Tumor odontogênico

adenomatoide (TOA) é uma lesão de origem epitelial odontogênica evidenciando padrões

arquiteturais variados em meio a um escasso estroma de tecido conjuntivo maduro. É um

32

tumor benigno, indolente, de crescimento lento, limitado e tratado por excisão local e raras

recorrências (BASKARAN et al., 2011). O Tumor odontogênico epitelial calcificante (TOEC)

é um tumor benigno raro, de comportamento localmente invasivo, que representa menos de

1% de todos os tumores odontogênicos (EL-NAGGAR et al., 2017).

A regulação de células-tronco é fundamental para a homeostase e função dos tecidos.

Distúrbios na sua regulação pode levar à proliferação excessiva de células e muitos tumores

são originados e/ou mantidos por células-tronco tumorais. Marcadores de células-tronco são

expressos em muitas células tumorais e estão envolvidos em várias etapas de formação de

tumores. Nos tumores odontogênicos, a contribuição de células-tronco dentárias para a

geração de tumores odontogênicos ainda não é bem conhecida (SARKAR;

HOCHEDLINGER, 2013; MIRAN; MITSIADIS; PAGELLA, 2016).

No desenvolvimento dentário precoce, a manutenção das células-tronco é regulada por

uma série de fatores de transcrição específicos, que inclui OCT-4, SOX-2, Nanog, Stat-3 e c-

Myc (RAMANATHAN et al., 2018). E diversos outros genes Homeobox e vias de transcrição

(SHH, Wnt/β-catenina, FGF, BMP) contribuem para diferenciação celular. Porém, em

diversos tipos de tumores há a participação destes genes e vias em sua patogênese (HUANG;

THESLEFF, 2013; SURYADEVA; KHAN, 2015; PUTHIYAVEETIL et al., 2016). E a analise

destes genes se faz importante no estudo da patogênese de cistos e tumores odontogênicos,

considerando que estes se originam de alterações que podem ocorrer nestas vias durante a

odontogênese.

Tendo em vista os escassos estudos acerca da participação dos fatores de

pluripotência, e das vias de transcrição relacionadas a estes fatores na patogênese das lesões

odontogênicas, o objetivo de nosso estudo foi avaliar a imunoexpressão de SOX2, FGF-10 e

Wnt-1 em uma série de casos de Ceratocisto Odontogênico, Ameloblastoma, Tumor

odontogênico adenomatoide e Tumor odontogênico epitelial calcificante além de alguns

germes dentários para efeito comparativo, visando fornecer subsídios para a melhor

compreensão da participação destas proteínas no desenvolvimento e comportamento biológico

das lesões odontogênicas estudadas.

33

Revisão de Literatura

34

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 ODONTOGÊNESE

A odontogênese tem início no embrião, entre a sexta e a sétima semana de vida intra-

uterina, quando células epiteliais invaginam para o ectomesênquima e começam a sofrer uma

condensação dividindo-se em dois processos: um direcionado para a região anterior,

recebendo a denominação de lâmina vestibular e outro direcionado mais profundamente (para

lingual ou palatina) conhecido como lâmina dentária. É nesta última que ocorre uma contínua

e progressiva histodiferenciação das células epiteliais e do ectomesênquima adjacente dando

origem aos germes dentários e futuros dentes (NANCI, 2013).

Os dentes desenvolvem-se a partir de interações sequenciais entre o epitélio e o

mesênquima derivado da crista neural. O primeiro sinal morfológico do desenvolvimento

dentário é um espessamento epitelial no primeiro arco branquial evidente na 6ª semana de

vida embrionária. Em seguida, assume progressivamente as fases de botão, capuz e

campânula. Os nós de esmalte primários aparecem no epitélio interno do órgão do esmalte no

estágio inicial da fase de capuz, mas desaparecem no estágio final. Posteriormente, as células

epiteliais se diferenciam em ameloblastos e os odontoblastos diferenciam-se a partir das

células mesenquimais da papila dental. Concomitantemente, fatores de crescimento que são

vitais ao desenvolvimento durante a embriogênese, como o Fator de Crescimento de

Fribroblasto (FGF), o Fator de Crescimento Epidérmico (EGF), Fator de Crescimento

Transformante (TGF) e Proteínas Ósseas Morfogenéticas (BMP), também estão presentes na

odontogênese e desempenham papéis críticos na regulação do desenvolvimento dentário e

direcionam a coordenação precisa da diferenciação celular, crescimento, migração, indução,

fusão e desintegração (KAWASAKI et al., 2015).

O tamanho, forma, estrutura dos dentes e também a posição dos dentes são

determinados por genes associados a interações e processos principais presentes na região

durante o desenvolvimento e maturação dentária. Estes genes também são reguladores

centrais do desenvolvimento e estão associados às interações entre as células. As vias incluem

genes que codificam os sinais reais, seus receptores, mediadores das vias de sinalização e

fatores de transcrição. Dentre estes, os genes Homeobox são genes reguladores que codificam

proteínas nucleares que atuam como fatores de transcrição e regulam aspectos da

35

morfogênese e diferenciação celular durante o desenvolvimento embrionário normal

(RAMANATHAN et al., 2018).

O gene homeobox de segmento muscular (Msx) no mesênquima dentário,

especificamente o Msx-1 e Msx-2, são induzidos por BMP e participam da regulação do ciclo

celular das células mesenquimais dentárias e posteriormente pela inibição da expressão de

BMP-2 e BMP-4 durante a fase de capuz. A família gênica que apresenta uma estrutura de

ligação ao DNA chamada de paired box (Pax), também funciona como fator de transcrição

presente no mesênquima. O fator de transcrição Pax-9 regula a expressão de moléculas

mesenquimais odontogênicas e a mutação neste gene pode causar agenesia dentária. O gene

Sonic Hedgehog (Shh), expresso na primeira fase da morfogênese, regula as células da papila

dentária e o tamanho do dente, e a regulação deste gene pode ser controlada pelo FGF. A via

de sinalização de Wnt/β-catenina se faz presente ao longo do epitélio e no mesênquima

odontogênico durante o desenvolvimento dentário e participa no processo de diferenciação

dos odontoblastos (THESLEFF, 2006; HUANG; THESLEFF, 2013; SURYADEVA; KHAN,

2015; PUTHIYAVEETIL et al., 2016).

A expressão de FGF, durante a morfogênese dentária, está associada a eventos de

iniciação que induzem a expressão de outros genes estimulando a proliferação celular no

epitélio. O aumento da expressão de FGF-10, que pode ser induzida pela via Wnt/β-Catenina,

mantém um compartimento de células-tronco que forneceria células epiteliais ao epitélio

dentário interno, que podem sofrer diferenciação em células do estrato intermediário ou em

ameloblastos. A diminuição ou ausência da expressão de FGF-10 interrompe a formação da

coroa e leva ao desenvolvimento da raiz (ENNES et al., 2012; AURREKOETXEA et al.,

2016).

O desenvolvimento das raízes dentárias é direcionado pela bainha epitelial de Hertwig

e durante o desenvolvimento dentário inicial, as interações recíprocas e sequenciais entre o

epitélio e o mesênquima levam à formação de dentina radicular, cemento e tecidos

periodontais. As principais vias de sinalização envolvidas nesses processos são as vias Tgfβ /

Bmp, Wnt, Fgf e Shh, que funcionam conjuntamente com múltiplos fatores de transcrição

para mediar as interações que orientam o desenvolvimento da raiz (LI; PARADA; CHAI,

2017).

36

Ao final da odontogênese, ocorre uma desagregação das estruturas epiteliais que

participaram na formação dos tecidos dentários e espera-se que, com o desenvolvimento,

essas células desapareçam ou permaneçam quiescentes (ISHIKAWA et al., 2017). Durante

esse processo não é incomum que os remanescentes epiteliais da odontogênese originem

lesões, como cistos e tumores odontogênicos. O espectro do comportamento biológico destas

lesões é amplo, onde podemos encontrar proliferações hamartomatosas, tumores benignos não

agressivos, tumores benignos agressivos e tumores malignos, por vezes com capacidade

metastática (AGARWAL et al., 2016; JIANG et al., 2016).

2.2 CÉLULAS-TRONCO E ODONTOGÊNESE

Mesmo após a odontogênese, ainda há células-tronco nos tecidos dentários. Células-

tronco mesenquimais humanas podem ser isoladas de dentes decíduos e permanentes e são

capazes de regenerar tecidos dentários específicos e se diferenciar em outros tecidos

(RODRÍGUEZ-LOZANO et al, 2011). As células-tronco têm o potencial de se desenvolver

em vários tipos de células diferentes no corpo durante a embriogênese e desenvolvimento

humano. Além disso, em muitos tecidos servem como um sistema de reposição celular,

dividindo-se para reabastecer outras células. Quando uma célula-tronco se divide, cada célula

tem potencial para permanecer uma célula-tronco ou se diferenciar em outro tipo de célula

com uma função mais especializada. Embora várias moléculas tenham sido implicadas na

biologia das células-tronco ao longo dos últimos anos, os modos de ação e comportamento

biológico destas moléculas permanecem incompletamente compreendidos (SARKAR;

HOCHEDLINGER, 2013).

Os dentes exibem diversas formas de reparo em resposta a danos e as células-tronco da

polpa dentária fornecem uma fonte de células para substituir as danificadas e facilitar o reparo

(MIRAN; MITSIADIS; PAGELLA, 2016). As células-tronco estão presentes em várias partes

do dente decíduo ou permanente, como o ligamento periodontal, polpa, folículo, as raízes em

crescimento, assim como em mucosa oral, e desempenham papéis dinâmicos no

desenvolvimento e suporte dos dentes. As células-tronco mesenquimais da polpa de dentes

decíduos esfoliados podem ser obtidas com facilidade, tornando-as uma fonte de células-

tronco autólogas para uso potencial na restauração de tecido pulpar vital removido devido à

infecção, na regeneração do ligamento perdido na doença periodontal e na geração de

37

estruturas dentárias parciais ou completas para formar implantes biológicos (JUURI et al.,

2013b; ABDUWELI et al., 2014; ORSINI et al., 2015; SHARPE, 2016).

Um nicho de células-tronco é definido como o microambiente em que estas células

estão situadas nos tecidos e órgãos. A interação com diversos tipos de células pode regular a

diferenciação celular nestes nichos. Assim, no desenvolvimento embrionário precoce, a

manutenção das células-tronco e o destino das células é regulada por uma série de fatores de

transcrição específicos, que inclui o fator de transcrição de ligação Octamer 4 (OCT-4), a

região de determinação do sexo Y-box2 (SOX-2), a proteína homeobox Nanog, o transdutor

de sinal e ativador da transcrição 3 (Stat-3) e alguns outros fatores, por exemplo, c-Myc e

factor de Krüppel (Klf4) (RAMANATHAN et al., 2018).

Alguns estudos avaliaram o padrão de expressão dos fatores de transcrição de células-

tronco pluripotentes, tais como o Oct-4, SOX2, Nanog e Stat-3, bem como o seu potencial

envolvimento na regulação dos nichos de células-tronco em vários estágios da morfogênese

inicial in situ de dentes humanos. De um modo geral, observou-se que todos os fatores de

transcrição analisados estavam ativos durante a morfogênese fetal dos dentes humanos.

Portanto, a inter-relação entre esses fatores de transcrição é complexa e está relacionada à

formação do nicho de células-tronco e que regulam a diferenciação em ameloblastos e

odontoblastos (ZHANG et al., 2012; CUNHA et al., 2013).

Juuri et al. (2013b) avaliaram germes dentários em distintas fases do

desenvolvimento, obtidos a partir de mamíferos e répteis. Foi observado que a expressão de

SOX-2 apresentava um padrão similar em células dentárias epiteliais, assim como no epitélio

oral em todas as espécies, e em cortes histológicos sucessivos da lâmina dentária em

mamíferos e répteis. As células do epitélio dental positivas para SOX-2 apresentavam

competência para formação de dentes sucessores e que esse fator de transcrição pode ser um

marcador de células epiteliais odontogênicas progenitoras que não finalizaram seu processo

de diferenciação. Após a supressão condicional de SOX2 em ratos, observou-se o crescimento

anormal do epitélio responsável pela formação dos molares posteriores, o epitélio oral foi

marcadamente hiperplásico e a lâmina dental apresentou-se alongada.

38

2.3 FATOR DE TRANSCRIÇÃO SOX2

Durante o desenvolvimento, regulação, destino, decisão e diferenciação de células-

tronco progenitoras o gene SRY (região Y determinante do sexo) - box 2 (SOX2) e seus

fatores de transcrição desempenham inúmeras funções. Proteínas Sox se ligam a regiões no

DNA e podem formar complexos com outros fatores de transcrição, que são regulados em

vários níveis e agem de uma forma dose-dependente. Vinte genes Sox que compartilham um

domínio DNA altamente conservado HMG (do inglês High mobility group) foram

identificados. O domínio de HMG medeia a ligação no DNA e foi originalmente identificado

no gene do fator determinante testicular Sry (região determinante de sexo Y) em mamíferos.

Com base nas semelhanças no domínio HMG, genes Sox são divididos em subgrupos de A a

H. Os membros do mesmo subgrupo compartilham propriedades bioquímicas semelhantes e

têm funções sobrepostas e redundantes (JUURI et al., 2013b).

A proteína SOX2 foi conhecida inicialmente por regular a autorrenovação de células-

tronco embrionárias em ratos e humanos (CES). É também importante para a manutenção de

células-tronco em vários tecidos adultos, incluindo o cérebro e traqueia e é um dos principais

fatores de transcrição para o estabelecimento de células-tronco pluripotentes induzidas.

Recentemente, a amplificação do gene de SOX2 tem sido associada com o desenvolvimento

de carcinoma de células escamosas em vários sítios tais como o pulmão e o esôfago. Esses

diferentes papéis para SOX2 envolvem complicadas redes de regulação que consistem em

microRNAs, quinases e moléculas de sinalização. Embora os níveis de SOX2 sejam

modulados transcricionalmente e translacionalmente, a modificação pós-translacional também

é importante para as várias funções do SOX2. Em diversos casos de neoplasias malignas,

altos níveis de SOX2 estão correlacionados com pior prognóstico e aumento da proliferação

de células-tronco tumorais. Portanto, SOX2 pode ser potencialmente explorada como uma

nova via terapêutica para o tratamento de câncer (LIU et al. 2013). SOX2, juntamente com

Oct4 e Nanog, mantem a célula em estado de célula-tronco; estes genes são induzidos por

diversos fatores como FGF, β-catenina, Erk ½ e Smad 2 e 3. Porém, outros fatores (BMP,

Wnt) induzem estas células a diferenciação. São reconhecidos 20 tipos de genes Sox que

foram descobertos em ratos e humanos (SCHEPERS; TEASDALE; KOOPMAN, 2002;

SARKAR; HOCHEDLINGER, 2013).

Em sua maioria, cada gene possui funções específicas, porém, diferentes fatores Sox

podem ter diferentes funções biológicas em um mesmo domínio de ligação no DNA.

39

Seletividade de genes-alvo por diferentes fatores Sox pode ser alcançado através de afinidade

diferencial para determinadas sequências flanqueadoras próximas aos locais de consenso Sox,

ou através de homo ou heterodimerização entre proteínas Sox, modificações pós-

translacionais de fatores Sox, ou interação com outros co-fatores. Esta versatilidade molecular

pode assim explicar porque os mesmos fatores Sox podem desempenhar papéis moleculares e

funcionais muito diferentes em contextos biológicos distintos (WEGNER, 2010).

A expressão de SOX2 é regulada e modulada extra e intracelularmente. Sinais

extracelulares pertencentes às principais vias de sinalização pode positiva ou negativamente

controlar os níveis de expressão SOX2. Por exemplo, a expressão de SOX2 é induzida pela

sinalização Wnt nas células da papila gustativa em desenvolvimento, enquanto que a

superexpressão de SOX2 em osteoblastos leva à inibição da via de sinalização Wnt canônica.

SOX2 também suprime a diferenciação dos osteoblastos, pela inibição de genes Adenomatous

Polyposis Coli (APC) e Glicogênio Sintase Quinase (GSK3ß), que são reguladores negativos da

via Wnt. Além disso, a sinalização FGF está associada à regulação SOX2: sinalização FGF

regula negativamente SOX2 durante o desenvolvimento do intestino anterior, enquanto que

em progenitores osteoblastos, FGF regula positivamente SOX2 (JUURI et al., 2013b).

O estudo de Seo et al. (2011) mostrou que essas múltiplas funções da SOX2 são

codificadas em domínios distintos. A função de autorrenovação de SOX2 é dependente da sua

atividade de transcrição e requer tanto a sua ligação com o DNA, assim como a ativação de

regiões C-terminais, enquanto apenas a terceira região de transativação C-terminal é

necessária para a ligação com β-catenina, interferindo na transcrição induzida por Wnt. Os

resultados deste estudo com relação a análise de expressão gênica em osteoblastos que não

expressam SOX2 apoiam fortemente a noção de que SOX2 contribui para a manutenção das

células-tronco, o gene SOX2 inibe a diferenciação através da diminuição da sinalização Wnt

por mecanismos trancricionais e pós-transcricionais, e que os fatores APC e GSK3β, que são

reguladores negativos da via Wnt, são alvos diretos de SOX2 em osteoblastos. Vários genes,

tais como o FoxP1 e BMI-1, estão associados com a manutenção das células em um estado de

não diferenciação e encontram-se regulados negativamente com a inativação de SOX2.

As mutações nos componentes da via Wnt, como APC e β-catenina que participam da

sinalização tecidual constitutiva, estão causalmente ligadas ao desenvolvimento de muitos

tipos de câncer. A expressão do gene Sox também é desregulada em uma ampla variedade de

cânceres humanos e há evidências de que os fatores SOX afetem a tumorigênese modulando a

40

atividade da β-catenina e a expressão de genes-alvo de Wnt oncogênicos, como Ciclina-D1 e

c-Myc (BASU-ROY et al.,2012; KORMISH; SINNER; ZORN, 2010).

Banerjee et al. (2016) estudaram a expressão de SOX2 e Oct-4 em folículos dentários,

cisto radicular, cisto dentigero, ceratocisto odontogênico, ameloblastoma, tumor odontogênico

adenomatoide e carcinoma ameloblástico. Os resultados mostraram a presença de células com

perfil de células-tronco nos tecidos normais e de lesões odontogênicas. SOX2 foi o fator mais

consistente e confiável na detecção de células-tronco. As expressões destes fatores nas

células-tronco são mantidas após a transformação tumoral e, provavelmente, sugerem que não

há alteração fenotípica das células-tronco na progressão do estado embrionário normal para o

seu componente tumoral. A quantificação e a localização indicam o provável papel das

células na patogênese das lesões.

Para que ocorra a manutenção de uma neoplasia se faz necessário um reservatório de

células com capacidade de autorrenovação, denominadas de células-tronco tumorais. Basu-

Roy et al. (2012) avaliaram a expressão de SOX2 em linhagens de células de osteossarcoma

em ratos e humanos e observaram uma alta expressão deste gene, assim como em amostras

tumorais. Células de osteossarcoma têm a capacidade aumentada de crescimento em

suspensão e organizam-se em aglomerados denominados de osteoesferas, que exibem alta

expressão de SOX2 e o marcador de células-tronco, Sca-1. A depleção de SOX2 por shRNAs

nas células derivadas de osteossarcoma de roedores reduz drasticamente suas propriedades

transformadoras in vitro e sua capacidade para formar tumores. Células com depleção de

SOX2 perdem a capacidade de formar osteoesferas e diferenciaram-se em osteoblastos

maduros, que exibem uma diminuição da expressão do gene Sca-1 e aumento da via de

sinalização Wnt. Portanto, SOX2 é necessária para a proliferação e autorrenovação de células

em osteossarcoma e antagoniza a ação pró-diferenciação de Wnt, suportando a ideia da ação

de supressão tumoral da via Wnt.

A sinalização Wnt/β-catenina regula o destino celular durante o desenvolvimento de

órgãos e a manutenção do tecido pós-natal, mas sua contribuição para a especificação de

diferentes linhagens epiteliais de pulmão ainda é incerta. Para esclarecer esta questão,

Hashimoto et al. (2012) utilizaram uma abordagem com recombinase Cre (Cre)-LoxP para

ativar a sinalização canônica Wnt ectópica no desenvolvimento endodérmico de pulmão.

Observou-se que a ativação Wnt dentro da endoderme distal de pulmão permitiu o

desenvolvimento normal do epitélio alveolar, mas levou à perda de epitélio bronquiolar e

41

ectasia de vias aéreas distais, levando a expressão ectópica de um fator estimulador linfóide e

um fator de células T (LEF e TCF, respectivamente) e ausência do gene SRY (região Y

determinante do sexo) - box 2 (SOX2) e expressão da proteína p63 (p63) em derivados

proximais. A perda condicional de SOX2 nas vias aéreas resultou em defeitos na

diferenciação epitelial juntamente com a ativação ectópica da via canônica Wnt. Estes dados

sugerem que Wnt regula negativamente um programa de sinalização dependente de SOX2,

necessária para a progressão do desenvolvimento da linhagem bronquiolar.

2.4 FGF-10

A família de proteínas de sinalização de fator de crescimento de fibroblastos (FGF)

inclui 22 membros que foram identificados com base na homologia de sequência de DNA.

Dezoito destes FGFs funcionam como ligantes que interagem com quatro receptores tirosina

quinases (RTKs) em camundongos e humanos. Os quatro FGFs restantes (FGF 11-14) são

proteínas intracelulares que não interagem com os receptores de FGF (FGFRs). Uma quinta

proteína semelhante a FGFR (FGFRL1) também foi identificada que carece de um domínio de

tirosina quinase intracelular e provavelmente regula negativamente os FGFRs ao interagir

com os ligantes. A sinalização FGF, comumente estudada em organismos que vão desde

cnidários até humanos, age pleiotropicamente durante a embriogênese, por possuir

propriedade de determinar mais de uma característica fenotípica, e também regula múltiplas

funções homeostáticas e reparadoras em adultos. Além disso, a ativação patológica das

FGFRs está presente em muitas doenças congênitas e câncer. Várias estratégias terapêuticas

estão atualmente sendo desenvolvidas para modular a sinalização de FGFR em várias

patologias. Compreender os mecanismos que governam a sinalização de FGF é, portanto,

importante para apreciar muitos aspectos da biologia do FGF e seu papel nas patologias

(BREWER; MAZOT; SORIANO, 2016).

A análise filogenética sugere que 22 genes FGF podem ser organizados em sete

subfamílias que contenham dois a quatro membros. Os genes da subfamília Fgf1, Fgf4, Fgf7,

Fgf8 e Fgf9 codificam FGFs canônicos que são secretados, que se ligam e ativam FGFRs

tendo a heparina como cofator. Os membros da subfamília Fgf15/19 codificam FGFs

endócrinos, que se ligam e ativam FGFRs com a proteína da família Klotho como cofator. Os

genes da subfamília Fgf11 codificam FGFs intracelulares, que são proteínas não-sinalizadoras

42

que servem como cofactores para canais de sódio e outras moléculas. Ambos, ligantes e

receptores de FGF, podem se localizar no núcleo celular onde realizam funções de sinalização

que podem ser independentes da atividade de receptor tirosina quinase. FGF1 no núcleo

estimula a síntese de DNA independente de FGFR e FGF2 está associada com a proliferação

de células de glioma. Ainda não é claro se FGFs têm funções de transcrição direta ou exercem

sua atividade no núcleo através de interações com outras moléculas (ORNITZ; ITOH, 2015).

Muitas proteínas de FGF que são secretadas em condições fisiológicas, existem

principalmente como proteína instáveis e sua estabilidade relacionada ao ligante esteja

associada à sua atividade biológica, restringindo-a ao tecido vizinho em que é secretada,

regulando o potencial de sinalização ao restringir o tempo de produção da sinalização. O

sulfato de heparina também influencia o turnover e na estabilidade da estrutura proteica da

maioria de FGFs parácrinos em condições fisiológicas (FGF1-4 / 6-9 / 16-18 / 20/22), com

exceção do FGF10, cuja rápida degradação é independente da presença de heparina

(MIKOLAJCZAK, 2016).

A sinalização do FGF é um componente crítico de genes que regulam o

desenvolvimento durante a embriogênese, determinando a manutenção de populações de

células progenitoras, diferenciação e morfogênese. Vários ligantes de FGF são expressos no

desenvolvimento pulmonar, incluindo Fgf7, Fgf8, Fgf9, Fgf10 e Fgf18. Destes, apenas o

FGF10 é absolutamente necessário para a formação inicial do pulmão. O Fgf10 é

dinamicamente expresso no mesênquima submesotelial em locais onde serão formados brotos

pulmonares futuros. Ele atua sobre o epitélio que expressa Fgfr2b para induzir crescimento de

brotos, provocando uma resposta quimiotáctica e de migração, mantendo as células epiteliais

distais em um estado indiferenciado (VOLCKAERT; DE LANGHE, 2015).

Várias evidências apontam para a importância do papel do FGF durante o

desenvolvimento dentário. A expressão de FGF se restringe inicialmente à banda epitelial

primária e persiste até o início do estágio de broto. Um papel importante deste fator é sua

participação na diferenciação de ameloblastos, como o FGF4 e FGF9, presentes no epitélio

interno órgão do esmalte (PUTHIYAVEETIL et al., 2016).

A sinalização de FGF10 no mesênquima dentário desempenha um papel fundamental

no controle da transição do estágio de formação da coroa para a raiz através da regulação da

formação de HERS durante o desenvolvimento. A ausência da expressão de Fgf10 no

43

mesênquima dentário próximo a alça cervical é necessária para o início da formação de raízes

em molares e a persistência da expressão de Fgf10 é necessária para o crescimento contínuo

de coroas em molares. O aumento da expressão de Fgf10 no estágio de transição de coroa

para raiz pode levar à inibição da formação de HERS. Portanto, sugere-se que Fgf10 controla

a troca entre a formação da coroa e da raiz durante o desenvolvimento dentário ao regular as

interações epitélio e mesênquima (LI; PARADA; CHAI, 2017).

Aurrekoetxea et al. (2016) estudaram a expressão de genes Fgf em amostras de

molares após hiperativação da via Wnt/β-catenina e observaram que alguns membros da

família FGFs, como Fgf4 ou Fgf10, são essenciais para a proliferação celular e para a

formação correta de cúspides dentárias. A expressão de Fgf9 aumentou ligeiramente em

molares tratados por 48h com reagente de Bromoindirubin oxime (BIO), que é um inibidor de

Glicogênio Sintase Quinase (GSK-3) que está relacionado com diversos processos

fisiológicos como a síntese de glicogênio, diferenciação e determinação celular fetal,

proliferação e motilidade celular. No entanto, a expressão de Fgf4 e Fgf10 aumentou

acentuadamente. A mudança de expressão mais importante foi observada para Fgf4, que

normalmente era restrita aos nós de esmalte em amostras controle e cuja presença estendeu-se

ao longo do epitélio dentário interno em amostras tratadas com BIO. A expressão de Fgf10

também foi regulada positivamente, mas esse aumento foi restringido à região mesenquimal.

2.5 WNT-1

A sinalização Wnt representa uma de várias vias, incluindo Notch-Delta, Hedgehog,

TGF-β e BMP, que estão implicadas nos processos de desenvolvimento. Cada uma dessas

vias de sinalização é conservada em sua evolução e genérica em sua atividade.

Fundamentalmente, Wnts são fatores estimuladores do crescimento e induzem à proliferação

celular por controlar o ciclo celular em vários pontos. Diferentemente de outros fatores de

crescimento, a sinalização Wnt possui a capacidade de dar forma aos tecidos em crescimento,

regular a pluripotência das células-tronco e atuar no processo como fator de crescimento

direcional durante a diferenciação celular na embriogênese e reparo tecidual (NUSSE;

CLEVERS, 2017).

Existem 19 genes Wnt identificados no genoma humano e as proteínas secretadas são

glicosiladas que, geralmente, atuam localmente de forma parácrina ou autócrica, ligando-se à

44

célula alvo que expressa um receptor Frizzled, formando um complexo com o co-receptor

LRP5/6 (proteína relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade 5/6). Isso

desencadeia a ativação de Disheveled (Dvl) e desfaz um complexo composto por GSK3β,

APC e Axin. Em um modelo em que a via é simplificada nos estados "ativado e não ativado",

o fator de transcrição β-catenina é continuamente degradado pelo complexo GSK3β / APC /

Axin, quando os ligantes Wnt estão ausentes, e a via é inativa. Na presença de ligantes Wnt

ligados aos seus receptores, não ocorre a degradação de β-catenina e esta torna-se livre para

translocar para o núcleo e ocorrer a combinação com fatores de transcrição TCF / LEF para

iniciar a transcrição de genes alvo Wnt (JANSSON; KIM; CHENG, 2015).

Comumente, a via Wnt é dividida em sinalização dependente de β-catenina (canônica),

como citado anteriormente, e independente (não canônica). As vias não canônicas são a

Planar Cell Polarity (PCP), responsável pela reorganização do citoesqueleto e a Wnt

dependente de Cálcio (Wnt/Ca+), que ativam genes envolvidos na migração e destino celular.

A via canônica é ativada pelos ligantes Wnt1, 2, 3, 3A, 8A, 8B, 10A e 10B; a via não

canônica Wnt/Ca+ é ativa por Wnt4, 5B, 6, 7, 7B e 11 enquanto a via PCP é ativada por

Wnt5A e 11 (KATOH; KATOK, 2017).

O gene Wnt1 é altamente expresso em ratos no tubo neural dorsal antes da emigração

da crista neural e tem múltiplos papéis no início do desenvolvimento do mesencéfalo. A

inativação do gene Wnt1 em camundongos resulta na perda de toda a região do mesencéfalo.

A expressão ectópica de Wnt1 ao longo do Sistema Nervoso Central (SNC) sob o controle do

amplificador HoxB4 aumenta dramaticamente a mitogênese, a proliferação e o crescimento

excessivo do mesencéfalo sem alterar o padrão de formação do SNC. Além disso, quando

Wnt1 foi expresso ectopicamente sob o controle do promotor endógeno engrailed 1 em ratos

En1Wnt1

, a formação do padrão no mesencéfalo foi mantida, mas o aumento da região dorso-

caudal foi observado (LEWIS et al., 2013).

O estado de pluripotência das células-tronco embrionárias humanas (hESC) é

caracterizado e mantido pela expressão dos fatores de transcrição Oct4, Nanog e Sox2, que

podem ser inativados pelo padrão de outros fatores e vias como FGF e Wnt (SARKAR;

HOCHEDLINGER, 2013). O perfil de expressão de RNA em uma linhagem de hESC

mostrou que essas células expressam RNA para cada um dos 19 genes Wnt e, além disso,

expressam todos os seus respectivos receptores. Cada gene possui funções especificas na

manutenção de células-tronco ou em sua diferenciação. Por exemplo, Wnt1 está relacionado

45

com a manutenção de células-tronco neurais, mas também está envolvido na diferenciação de

células-tronco mesenquimais, pois a indução da expressão de Wnt-1 em pré-adipócitos leva a

inibição da adipogênese (ROOS et al., 2000; CAMP et al., 2014; LIEN; FUCHS, 2014).

De acordo com Gaete e Tucker (2013) a ativação da via Wnt / β-catenina em órgãos

dentários de cobra, promove mudanças na proliferação e no padrão molecular da lâmina

dentária, resultando em perda do surgimento organizado de germes dentários. Esses resultados

sugerem que os componentes epiteliais são críticos para o arranjo de órgãos que se

desenvolvem em sequência e destacam o papel da sinalização Wnt / β-catenina em tais

processos.

Além de participar da embriogênese e da determinação tecidual, a via sinalização Wnt

também tem sido fortemente associada ao câncer, onde em casos de câncer gastrointestinal,

leucemias e melanomas esta via, seja no aumento da expressão de Wnt ou pela ausência de

seus reguladores, contribui para o desenvolvimento tumoral (ZHAN; RINDTORFF;

BOUTROS, 2017).

2.6 CÉLULAS-TRONCO E LESÕES ODONTOGÊNICAS

Sabe-se que tumores odontogênicos são derivados de tecidos relacionados com o

germe dentário em desenvolvimento, mas o papel das células-tronco na patogênese destes

tumores não é bem estabelecido e são escassos os estudos com marcadores moleculares para

identificar células-tronco (JUURI et al.,2013a). Compreender os mecanismos celulares e

moleculares subjacentes à autorrenovação e diferenciação, das células-tronco epiteliais e

progenitoras dentais, é essencial para o desenvolvimento de novas terapias regenerativas e

desvendar a patogênese dos tumores odontogênicos (KETTUNEN et al., 2000; CUNHA et

al.,2013; GARG et al., 2015).

Estudos imuno-histoquímicos confirmam a presença de proteínas FGF, BMP, β-

catenina e Wnt em diversos tumores odontogênicos (SIRIWARDENA et al., 2009; ALVES

PEREIRA et al., 2010; HAKIM et al., 2011; NASCIMENTO et al., 2017). Estes fatores

podem agir de forma sinérgica para manutenção de um perfil de célula-tronco somática ou

induzir a diferenciação celular nestes tumores (SARKAR; HOCHEDLINGER, 2013).

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1368837508000882

46

Juuri et al. (2013a) procuraram explorar se a expressão de SOX2 também está

associada com a formação de ameloblastoma. As estruturas epiteliais do ameloblastoma se

assemelham a alça cervical vestibular do incisivo de rato, onde foram detectadas células

tronco SOX2+. Além disso, em ameloblastoma, a produção de células semelhantes a pré-

ameloblastos é semelhante e contínuo como no incisivo de rato. Neste estudo, verificaram que

SOX2 foi expressa no epitélio do tumor em dois padrões diferentes de ameloblastoma, o

folicular e plexiforme. A expressão SOX2 localizava-se nas camadas epiteliais organizadas

em paliçada de ilhas epiteliais, bem como nas células semelhantes ao retículo estrelado do

órgão do esmalte. O mesênquima circundante foi principalmente negativo para SOX2. Uma

vez que ameloblastoma ocorre frequentemente na região do 3º molar inferior, foi realizada em

ratos a fragmentação da lâmina dentária que liga o 3º molar ao segundo molar por cortes

histológicos. Curiosamente, a expressão intensa de SOX2 foi detectada nos fragmentos da

lâmina dentária e na região posterior do 3º molar, que é o local para o desenvolvimento de um

quarto molar. A lâmina dentária de um primeiro molar humano também expressou SOX2. As

células epiteliais que cobrem parte da raiz do dente, denominada bainha epitelial de Hertwig e

os restos epiteliais de Malassez, também têm sido sugeridos como possíveis origens de

ameloblastoma, mas não foi observada expressão de SOX2 nestas células epiteliais.

Entretanto, alguns estudos genéticos e imuno-histoquímicos apontam uma menor

expressão do fator SOX2 em ameloblastoma e maior imunorreatividade em Ceratocisto

odontogênico e Carcinoma Ameloblástico (LEI et al., 2014; HEIKINHEIMO et al., 2015;

BANERJEE et al., 2016).

2.7 AMELOBLASTOMA

O Ameloblastoma é uma neoplasia benigna que se desenvolve a partir de elementos

celulares epiteliais odontogênicos; é considerado um dos tumores mais frequentemente

encontrado nos ossos maxilares, sendo caracterizado por exibir crescimento lento, localmente

invasivo e que pode se infiltrar entre as trabéculas ósseas, apresentando altas taxas de

recorrência (KUMAMOTO; OOYA, 2008; CHAUDHARY et al., 2011). Esses tumores

podem surgir a partir de restos epiteliais da lâmina dentária e de um órgão do esmalte em

desenvolvimento. Acomete principalmente adultos na terceira e quinta década de vida, sem

predileção por sexo e corresponde de 10% a 30% de todos os tumores odontogênico afetando

47

principalmente a região posterior da mandíbula (CHAUDHARY et al., 2011; LEE; KIM,

2013).

De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), o ameloblastoma contém

epitélio odontogênico e estroma fibroso sem envolvimento do ectomesênquima, apresentando

quatro variantes clínico-patológicas: o ameloblastoma sólido/multicístico, unicístico e

periférico/extraósseo e metastático (EL-NAGGAR et al., 2017; FREGNANI et al., 2010).

O aumento de volume representa o sintoma clínico mais comum e radiograficamente

esses tumores são caracterizados como lesões expansivas, radiolúcidas, uni ou multiloculares,

podendo apresentar erosão, rompimento das corticais ósseas, além de reabsorção das raízes

dos elementos dentários adjacentes (WAKOH et al., 2011; RICCI et al., 2012).

O Ameloblastoma sólido é o tipo clínico-patológico mais comum, com

comportamento localmente agressivo. Histopatologicamente, pode apresentar diversos

padrões como: folicular, plexiforme, de células granulares, células basais e acantomatoso.

Estes padrões, no entanto, não interferem quanto ao tratamento estabelecido (HUNASGI et

al., 2013).

O tipo folicular apresenta ninhos com células periféricas, semelhantes a ameloblastos,

que podem estar organizadas em paliçada, com polaridade invertida centralmente as células

são organizadas frouxamente semelhantes ao retículo estrelado do órgão do esmalte (LEE;

KIM, 2013).

No tipo plexiforme, o epitélio odontogênico apresenta-se em forma de cordões

anastomosados exibindo células cúbicas ou colunares, semelhantes a ameloblastos e células

centrais frouxamente arranjadas (CASTRO-SILVA et al., 2012; LEE; KIM, 2013).

O ameloblastoma acantomatoso é raro e exibe ninhos sólidos de células epiteliais com

paliçada periférica e metaplasia de células escamosas na porção central; o ameloblastoma de

células granulares também é uma variante rara, em que as células tumorais localizadas na

porção central das ilhas tumorais apresentam citoplasma granular eosinofílico e células

periféricas que se assemelham a ameloblastos (LEE; KIM, 2013). O padrão de células basais,

é o tipo menos comum sendo composto por ninhos de células basalóides uniformes, não

apresentando retículo estrelado na porção central dos ninhos e as células periféricas tendem a

ser cúbicas em vez de colunares (HIROTA et al.,2005).

48

O ameloblastoma unicístico exibe um comportamento menos agressivo que o tipo

sólido e apresenta características clínicas, radiográficas semelhantes a um cisto. O exame

histopatológico mostra epitélio ameloblastomatoso, revestindo uma cavidade cística, em que

as células epiteliais proliferam, com ou sem crescimento luminal por vezes

mural (CHAUDHARY et al, 2011; RICCI et al, 2012; LEE; KIM, 2013).

O padrão desmoplásico foi considerado como subtipo histopatológico do

Ameloblatoma sólido pela OMS, em sua última classificação, sendo caracterizado por

pequenos ninhos e cordões de epitélio odontogênico comprimidos em um estroma

densamente colagenizado (PHILIPSEN, REICHART, 2004; FULCO et al, 2010; RICCI et al,

2012; EL-NAGGAR et al., 2017). Em virtude da capacidade do ameloblastoma se infiltrar

pelas trabéculas ósseas, o tratamento preferencial do tumor é cirúrgico, visando menores

riscos de recidivas e melhores prognósticos (GUNAWARDHANA et al., 2011; HERTOG et

al, 2011).

2.8 TUMOR ODONTOGÊNICO EPITELIAL CALCIFICANTE

O tumor odontogênico epitelial calcificante (TOEC) é um tumor benigno raro, de

comportamento localmente invasivo, que representa menos de 1% de todos os tumores

odontogênicos (EL-NAGGAR et al., 2017). É também conhecido como Tumor de Pindborg e

localiza-se nos ossos maxilares com predileção pela região posterior de mandíbula, podendo

ter localização extra-óssea ou intra-óssea, sendo esta última mais frequente. Quando

localizados no tecido gengival, são menos agressivos do que os intraósseos (CHRCANOVIC;

GOMEZ, 2017).

O TOEC cresce causando expansão da cortical óssea (SLOOTWEG, 2006) e ao exame

radiográfico, mostra área radioluscente unilocular ou multilocular, contendo massas

radiopacas que aumentam de tamanho e radiopacidade com o tempo (DEBONI et al., 2006).

As características histopatológicas do TOEC incluem proliferação de células epiteliais

poliédricas organizadas em ilhotas e lençóis dispersos em estroma abundante e eosinofílico.

As células neoplásicas apresentam bordas citoplasmáticas bem definidas, pontes intercelulares

evidentes e núcleos frequentemente pleomórficos, apesar de exibirem raras mitoses. As

células tumorais produzem material amiloide, homogêneo e eosinofílico, que pode tornar-se

49

calcificado na forma de anéis concêntricos denominados de anéis de Liesegang. A verdadeira

natureza do material amiloide é ainda incerta (TAKATA; SLOOTWEG, 2005).

Devido às características apresentadas pelos casos de TOECs intraósseos ou de

localização periférica, torna-se evidente que outras fontes, além do epitélio reduzido do órgão

do esmalte, devem ser consideradas quando se discute a histogênese da lesão. A localização

periférica sugere a possibilidade de que o tumor se origine de restos da lâmina dentária ou de

células basais do epitélio oral (SLOOTWEG, 2006).

O prognóstico para a maioria dos casos de TOEC é considerado bom, com pequenas

taxas de recidiva e baixíssimas chances de transformação maligna. Há relatos de TOEC com

comportamento mais agressivo, em que foi verificada tumefação dolorosa, com rápido

crescimento da massa tumoral, ruptura da cortical, compressão do nervo alveolar inferior e

infecção secundária (DEBONI et al., 2006).

2.9 TUMOR ODONTOGÊNICO ADENOMATOIDE

O tumor odontogênico adenomatoide (TOA) é uma lesão de origem epitelial

odontogênica composta de epitélio odontogênico evidenciando padrões arquiteturais variados

em meio a um escasso estroma de tecido conjuntivo maduro (BASKARAN et al., 2011).

Muitas vezes é inicialmente diagnosticado, radiograficamente, como cisto odontogênico e

representa cerca de 1% a 9% de todos os tumores odontogênicos (LEE; KIM, 2013;

PHILIPSEN et al., 2007).

O TOA pode se apresentar como uma lesão única com predileção em pacientes do

sexo feminino, na segunda década de vida e no sextante anterior da maxila, podendo ser

sobrepostos a cistos dentígeros ou a dentes não erupcionados, geralmente associados aos

caninos permanentes. Além disso, os casos mostram opacidades dispersas (flocos) dentro de

uma radiolucência unilocular (RICK, 2004; ROBINSON; VINCENT, 2012).

Existem três variantes do TOA: a variante folicular (73%) está associada a um dente

impactado e deslocado, sendo confundido radiograficamente como um cisto dentigero; a

extrafolicular (24%) imita um cisto radicular ao redor do ápice de um dente; e a variante

periférica (3%) apresenta-se como um defeito do osso periodontal ou crescimento ectópico.

Na reavaliação da origem e patogênese do TOA, parece que este tumor, ou hamartoma, é

50

derivado do epitélio odontogênico do complexo da lâmina dentária ou de seus remanescentes

(CHINDASOMBATJAROEN et al., 2012).

Histopatologicamente, a maioria dos casos apresenta um padrão de crescimento

predominantemente sólido ou uma proporção semelhante de padrões sólido e cribriforme.

Material amorfo eosinofílico e espaços semelhantes a ductos são observados em 90% a 100%

dos casos. Estruturas enoveladas e áreas semelhantes ao tumor odontogênico epitelial

calcificante também podem ser encontradas. Quantidades variáveis de material calcificado são

observadas na maioria dos TOAs, enquanto que osteodentina e hialinização perivascular

raramente estão presentes (DE MATOS et al., 2012). O TOA é um tumor benigno, indolente,

de crescimento lento, limitado e por isso, é tratado por excisão local e as recorrências são

extremamente raras (EL-NAGGAR et al., 2017).

2.10 CERATOCISTO ODONTOGÊNICO

O Ceratocisto Odontogênico é uma forma distinta de cisto odontogênico de

desenvolvimento que merece atenção especial devido às suas características histopatológicas,

ao seu comportamento clínico agressivo e a sua alta taxa de recidiva (MYOUNG et al., 2001;

SHEAR, 2003; NEVILLE et al., 2016). Essa lesão pode ser relacionada com a síndrome do

carcinoma nevóide basocelular, também denominada de síndrome de Gorlin (FIGUEROA et

al., 2010; HAKIM et al., 2011).

Acredita-se que o Ceratocisto odontogênico origina-se a partir de remanescentes da

lâmina dentária (TSUKAMOTO et al., 2001), embora alguns autores apontem como origem

as células da camada basal do epitélio oral adjacente à lesão ou ainda, a partir da proliferação

de pequenos harmatomas epiteliais do epitélio gengival (AMORIM et al., 2003;

STOELINGA, 2003; MENON, 2015; JIANG et al, 2016).

Geralmente essa lesão é assintomática, porém quando atinge grandes extensões,

apresenta sintomatologia dolorosa (NEVILLE et al., 2016). Estudos epidemiológicos revelam

que o ceratocisto odontogênico constitui o terceiro tipo mais comum de cisto odontogênico,

com frequências entre 1,3% e 21,5% (MOSQUEDA-TAYLOR et al., 2002; JONES; CRAIG;

FRANKLIN, 2006; GROSSMANN et al., 2007; DE SOUZA et al., 2010). Apresenta

predileção pelo sexo masculino, acometendo indivíduos entre a segunda e terceira década de

51

vida (SHEAR, 2003; NEVILLE et al., 2016). Em relação ao sítio anatômico de 61,5% a

76,5% dos casos ocorrem em mandíbula, sendo a região posterior e o ramo ascendente as

áreas mais comumente afetadas (GONZÁLEZ-ALVA et al., 2008; TORTORICI et al., 2008;

DE SOUZA et al., 2010).

Histopatologicamente, o ceratocisto odontogênico exibe um revestimento epitelial

bastante típico, com 5 a 8 camadas de células, cuja camada basal apresenta células colunares

ou cúbicas dispostas em paliçada, muitas vezes com hipercromatismo nuclear e camada

superficial paraceratinizada e corrugada. A interface epitélio-conjuntivo frequentemente é

plana e frequentemente há destacamento do revestimento epitelial. A cápsula de tecido

conjuntivo é relativamente delgada, friável e bem vascularizada, geralmente sem infiltrado

inflamatório (NEVILLE et al., 2016). Em alguns casos, podem ser observadas a presença de

ilhas de epitélio odontogênico e pequenos cistos satélites (EL-NAGGAR et al., 2017;

NEVILLE et al., 2016).

O ceratocisto odontogênico apresenta um mecanismo de crescimento diferenciado que

pode estar relacionado a fatores desconhecidos, inerentes ao próprio epitélio ou à atividade

enzimática na cápsula fibrosa (LI et al., 1996; NEVILLE et al., 2016). Alguns estudos,

avaliando marcadores de proliferação celular como o PCNA (Antígeno Nuclear de

Proliferação Celular) e Ki-67, têm demonstrado uma imunoexpressão elevada para ambos os

marcadores, sugerindo que o comportamento mais agressivo do ceratocisto pode estar

relacionado à sua elevada atividade proliferativa (KIM et al., 2003; GURGEL et al., 2008).

Portanto, reconhecendo a importância da presença de WNT, FGF, e SOX durante o

processo de manutenção da pluripotência, renovação celular e diferenciação celular durante a

odontogênese, se faz necessário pesquisas que evidenciem o papel destes fatores nas diversas

lesões que possuem origem do aparato odontogênico a fim de elucidar a natureza e os

divergentes comportamentos biológicos de lesões odontogênicas.

52

Proposição

53

3 PROPOSIÇÃO

As células-tronco são fundamentais para homeostase dos tecidos e pesquisas têm

demonstrado a sua participação no processo de formação de dentes. Distúrbios na sua

regulação podem levar à proliferação excessiva de células, culminando na formação de cistos

e tumores. Sabendo-se que as lesões odontogênicas se originam a partir de remanescentes da

embriogênese dentária, nos propomos a avaliar a participação de células com fenótipo de

pluripotência em lesões epiteliais odontogênicas benignas, através da expressão imuno-

histoquímica do fator de transcrição SOX2, como marcador celular de pluripotência e dos

fatores Wnt e FGF-10 que atuam, respectivamente, como indutor e inibidor da SOX2 em

diversos processos biológicos e patológicos. Pretende-se também, correlacionar o padrão de

imunoexpressão dos fatores estudados com os comportamentos biológicos variados das lesões

constantes do estudo.

54

Material e Métodos

55

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

A presente pesquisa foi registrada no sistema da Base Nacional de Registros de

Pesquisas envolvendo Seres Humanos (Plataforma Brasil) e de acordo com as Diretrizes e

Normas Regulamentadoras de Pesquisas Envolvendo Seres Humanos (Resolução CNS

446/2012), submetida à análise de seu conteúdo pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte e aprovado sob o número de parecer

031235/2016.

O presente trabalho foi executado a partir de espécimes teciduais, emblocados em

parafina, pertencentes ao arquivo do Serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de

Patologia Oral do Departamento de Odontologia da UFRN.

4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO

Esta pesquisa consistiu em uma análise descritiva e comparativa da expressão imuno-

histoquímica de SOX2, Wnt-1 e FGF-10 em espécimes de lesões odontogênicas benignas de

origem epitelial e germes dentários.

4.3 POPULAÇÃO

Do total de casos registrados e diagnosticados nos arquivos do Serviço de Anatomia

Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte/UFRN, foram selecionados os casos de lesões odontogênicas

que constituíram a amostra da presente pesquisa.

4.4 AMOSTRA

A amostra foi constituída por 20 casos de ameloblastoma do tipo sólido, 20 casos de

tumor odontogênico adenomatoide, 10 casos de tumor odontogênico epitelial calcificante e 20

casos de ceratocisto odontogênico isolado, todos emblocados em parafina, diagnosticados no

serviço anteriormente citado. Também, selecionou-se 05 casos de germes dentários em

diversas fases de desenvolvimento, principalmente na fase de campânula, para efeito

comparativo do estudo.

56

4.5 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DA AMOSTRA

4.5.1 Critérios de inclusão

Foram selecionados 20 casos de ameloblastomas, 20 casos de tumor odontogênico

adenomatoide, 10 casos de tumor odontogênico epitelial calcificante e 20 casos de

ceratocistos odontogênicos que, conforme informações contidas nas fichas de

requisição de biópsias, não foram submetidos ao processo de descalcificação;

Foram selecionados e incluídos no estudo os casos das referidas lesões cujos blocos do

material incluído em parafina se apresentaram em boas condições de armazenamento e

continham material suficiente para o estudo pretendido;

Foram incluídos no estudo, 5 germes dentários para efeito comparativo, provenientes

de remoção por indicação ortodôntica.

4.5.2 Critérios de exclusão

Foram excluídos do estudo, todos os casos das lesões selecionadas que tenham sido

submetidas ao processo de descalcificação, o que poderá acarretar perda de

antigenicidade do material;

Foram excluídos do estudo, todos os espécimes de ameloblastomas cujos dados clínicos,

radiográficos e macroscópicos constantes nos arquivos não satisfaçam os requisitos para

que fosse seguramente estabelecido o tipo clínico-patológico;

Casos de CO secundariamente inflamados;

Foram excluídos do estudo os casos cujos blocos não se apresentem com material em

boas condições de armazenamento e contenham material insuficiente para os estudos

pretendidos.

4.6 ESTUDO MORFOLÓGICO

Para o estudo morfológico, foram utilizadas lâminas com cortes de 5μm de espessura

do material incluído em blocos de parafina, corados pela técnica da Hematoxilina/ Eosina,

arquivadas no serviço de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral da UFRN e

examinadas à microscopia de luz, sendo realizada uma análise descritiva dos aspectos

histopatológicos observados nas lesões objeto da presente pesquisa.

57

4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO

Do material emblocado em parafina foram obtidos cortes de 3μm de espessura e

estendidos em lâminas de vidro previamente limpas e preparadas com adesivo à base de

organosilano (3-aminopropyltriethoxi-silano, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA). O

material foi posteriormente submetido aos anticorpos anti-SOX2, anti-FGF-10 e anti-Wnt-1

(Quadro 1).

A coloração imuno-histoquímica para SOX2 foi realizada em cortes histológicos de 3

μm de espessura das lesões estudadas e dos germes dentários, utilizando o sistema de

detecção ADVANCETM

HRP (Dako, Nort America Inc., Carpinteria,CA, USA). Os cortes

foram submetidos a recuperação antigênica em solução de TrylogyTM

(Cell Marque). A

atividade da peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação com 3% de peróxido de

hidrogênio, durante 15 minutos. As lâminas foram incubadas com anticorpo policlonal anti-

humano/rato SOX2 (Y-17, Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA, EUA) a 4 °C

overnight com concentração de 1:40, seguido por três lavagens suaves com tampão e

posteriormente coradas durante 5 min com 3'3 diaminobenzidina (DAB). Os cortes

histológicos foram contracorados com Hematoxilina de Mayer. Células-tronco embrionárias

foram utilizadas como controle positivo para SOX2 (WANG et al., 2009).

Com relação a expressão de FGF-10, os cortes histológicos de 3 µm de espessura

foram desparafinados e imersos em 3% de peróxido de hidrogênio durante 30 minutos e soro

de cabra a 10% preparado em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 20

minutos. O anticorpo primário policlonal FGF-10 (H-121, Santa Cruz Biotechnology, CA) em

diluição de 1:50, foi aplicado overnight numa câmara húmida a 4 °C. A reatividade do

anticorpo foi posteriormente visualizada com o kit ADVANCETM

HRP (Dako Nort America

Inc, Carpinteria, CA, USA), seguindo as recomendações do fabricante e contracorados com

Hematoxilina de Mayer. Os cortes histológicos foram contracorados com Hematoxilina de

Mayer. Tecido de carcinoma de próstata humana foi utilizado como controle positivo para

FGF-10 (NAKAO et al., 2013).

Para o estudo da expressão de Wnt-1 foram utilizados cortes de 3 µm de espessura

desparafinados e utilizado o anticorpo primário policlonal anti-Wnt-1 (G-19, Santa Cruz

Biotechnology Inc. Santa Cruz CA), com diluição de 1:200. A reatividade do anticorpo foi

posteriormente visualizada com o kit ADVANCETM

HRP (Dako Nort America Inc,

Carpinteria, CA, USA), seguindo as recomendações do fabricante e contracorados com

58

Hematoxilina de Mayer. Extrato de tecido da medula espinhal humana foi utilizado como

controle positivo para Wnt-1 (SONG et al., 2009).

Os controles negativos consistiram na substituição dos anticorpos primários por

albumina de soro bovino a 1% (BSA – Bovine Serum Albumin) em solução tampão.

Especificidade Clone/

Referência Fabricante Diluição

Recuperação

Antigênica* Incubação

SOX2 Y-17 Santa Cruz

Biotechnology 1:40 Trilogy/Pascal

Overnight a

4 °C

Wnt-1 G-19 Santa Cruz

Biotechnology 1:200 Trilogy/Pascal

Overnight a

4 °C

FGF-10 H-121 R&D Systems 1:50 Trilogy/Pascal Overnight a

4 °C

Quadro 1: Especificidade, clone, fabricante, diluição e incubação.

*A recuperação antigênica de cada anticorpo utilizado foi feita de acordo com as

recomendações dos fabricantes e otimizadas no Laboratório de Imuno-histoquímica do

Programa de Pós-graduação em Patologia Oral/UFRN.

4.8 ANÁLISE DO PERFIL IMUNO-HISTOQUÍMICO

Após o processamento dos cortes histológicos, cada espécime foi analisado em sua

totalidade sob microscopia de luz (Olympus CH30, Olympus Japan Co., Tokyo, JPN). As

análises das reações imuno-histoquímicas para SOX2, Wnt-1 e FGF-10 foram feitas por

adaptação dos estudos de Wang et al. (2009) e Halifu et al. (2016). A marcação celular no

núcleo e citoplasma foi considerada como positiva quando apresentasse coloração

acastanhada , sendo avaliada em todo o componente epitelial das lesões constantes do estudo.

A análise da expressão foi feita de forma semi-quantitativa, sendo a expressão dos fatores

estudados determinada de acordo com a intensidade e a porcentagem de células tumorais

imunorreativas; a porcentagem de positividade celular foi categorizada como 0 (≤ 5%), 1 (6-

25%), 2 (26-50%), 3 (5l-75%) e 4 (76-100 %). A intensidade foi classificada como 0 quando

não foram identificadas células positivas; 1, fraco; 2, moderada; e 3, forte.

De acordo com a somatória de intensidade e porcentagem de imunomarcação, obteve-se

a Pontuação de imunomarcação total (PIT), variando de 0 a 7. Os escores finais foram

numerados para cada marcador:

59

SOX2: 1 (soma entre 0-2); 2 (soma entre 3-4); 3 (soma ≥5).

Wnt-1: 1 (soma entre 0-4); 2 (soma de 5); 3 (soma ≥6).

FGF-10: 1 (soma entre 0-3); 2 (soma entre 4-5); 3 (soma ≥6).

4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram digitados originalmente em planilha eletrônica Excel (Microsoft

Windows Vista Home edition®) e posteriormente exportados para o programa Statistical

Package for the Social Sciences (IBM Corp., Armonk, NY, USA), onde foram feitas as

análises.

Considerando a não normalidade e a independência da amostra foram utilizados os

testes de Kruskal-Wallis e de Mann Whitney para avaliar diferenças significativas. Para

verificar a correlação entre as imunoexpressões dos marcadores foi utilizado o teste de

Spearman. Os valores foram considerados estatisticamente significativos quando p<0,05.

60

Resultados

61

5 RESULTADOS

5.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA

A análise microscópica dos casos de Ameloblastomas sólidos revelou proliferação das

células epiteliais em ilhas e cordões que se anastomosavam, e a presença de células periféricas

organizadas em paliçada, hipercromáticas e núcleo com polaridade invertida. Evidenciou-se

que a maioria dos casos constantes de nossa amostra apresentava-se com o padrão

histopatológico plexiforme (60%).

Em oito casos (40%) predominou o padrão folicular, onde as células organizavam-se

em ninhos com células periféricas em paliçada e células centrais organizadas frouxamente

semelhante ao retículo estrelado do órgão do esmalte. Em alguns casos, houve associação do

padrão plexiforme com a variante folicular. O estroma era predominantemente fibroso denso,

por vezes com áreas de densidade variada, com vasos sanguíneos de pequeno calibre

apresentando-se, ocasionalmente congestos.

As características histopatológicas dos casos de TOEC demonstravam proliferação de

células epiteliais poliédricas organizadas em ilhotas e lençóis dispersas em estroma abundante

e eosinofílico. As células neoplásicas apresentaram contornos bem definidos, pontes

intercelulares proeminentes e núcleos frequentemente pleomórficos e hipercromáticos. Foi

evidenciada, também, a presença de material amilóide homogêneo e eosinofílico que, por

vezes, exibia anéis de Liesegang.

Avaliando microscopicamente os casos de COs, observou-se o epitélio cístico de

espessura uniforme exibindo de 6 a 8 camadas de células, com camada superficial de

paraceratina exibindo corrugações. A células da camada basal exibiam hipercromatismo,

núcleos com polaridade invertida e organizavam-se em paliçada. A junção epitélio-conjuntivo

se apresentava plana com destacamento do epitélio em relação ao tecido conjuntivo. A

cápsula de tecido conjuntivo era delgada e por vezes exibia leve a moderado infiltrado

inflamatório mononuclear.

Histopatologicamente, os casos de TOA apresentavam áreas sólidas constituídas por

células epiteliais do parênquima tumoral e escasso estroma. As células neoplásicas eram

predominantemente cúbicas e ovais, exibindo estruturas espiraladas semelhantes a rosetas,

assim como estruturas semelhantes a ductos, circundadas, em sua maioria, por células

62

colunares com núcleo polarizado. Observou-se ainda a presença de estruturas calcificadas. Em

alguns casos, foi evidenciada a presença de cápsula de tecido conjuntivo fibroso denso.

5.2 RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS

Na avaliação da imunoexpressão dos marcadores utilizados em nossa pesquisa

evidenciamos que no parênquima dos casos de Ameloblastoma, as células da camada

periférica ou camada basal não exibiam marcação ou eram predominantemente fracas ou

moderadas, enquanto as células centrais exibiam fraca ou moderada marcação para SOX2. No

estroma, também se evidenciou positividade para todas as moléculas utilizadas na pesquisa,

principalmente em fibroblastos, células endoteliais e células inflamatórias (Fig. 1).

Nos casos de TOEC, a marcação para SOX-2 foi predominantemente nuclear e

citoplasmática e com intensidade de moderada a forte (Fig. 2 e 3 ) enquanto nos casos de

TOA, observou-se de fraca a moderada expressão citoplasmática e, raramente, nuclear

(Fig.4).Avaliando a imunoexpressão para SOX-2 , com intensidade de moderada a forte nas

camadas de células epiteliais nos casos de CO observou-se marcação na camada basal e

parabasal enquanto as células superficiais não exibiam expressão (Fig.,5)

Com relação a expressão para FGF-10, todos os casos de AM foram positivos, com

variação de intensidade entre os casos avaliados, com marcação predominantemente

citoplasmática e, raramente nuclear(Fig.7). Nos casos de TOEC não foram observadas

diferenças na intensidade de expressão no parênquima tumoral (Fig.8). Quando avaliada a

intensidade de imunomarcação para FGF-10 nas células neoplásicas nos casos de TOA

observou-se moderada marcação citoplasmática e, raramente nuclear (Fig.9). Nos casos de

CO, foi evidenciada marcação citoplasmática moderada em todas as camadas epiteliais

(Fig.10).

Todos os casos de AM foram positivos para Wnt-1 com variação de intensidade entre

os casos avaliados com marcação predominantemente citoplasmática (Fig.12). Para os casos

de TOEC evidenciou-se fraca marcação citoplasmática para Wnt-1 no parênquima tumoral

(Fig.13). Quando avaliada a intensidade de imunomarcação para Wnt-1 nas células

neoplásicas nos casos de TOA observou-se moderada marcação citoplasmática e, raramente

nuclear (Fig.14). A marcação para Wnt-1 foi maior e mais intensa na camada superficial e

fraca ou ausente na camada basal e parabasal nos casos de CO (Fig. 15).

63

Nos 05 casos de germes dentários avaliados, utilizados para fins comparativos, a

marcação foi nuclear e citoplasmática nas diferentes células epiteliais e da papila dentária para

todas as proteínas estudadas. A imunoexpressão para SOX-2 exibiu uma marcação nuclear e

citoplasmática na maioria dos casos dos germes dentários (Fig. 6), enquanto a

imunoexpressão de FGF-10 (Fig. 11) e Wnt-1 exibiu marcação tipicamente citoplasmática,

apresentando variações de intensidade de expressão tanto nas estruturas epiteliais quanto

mesenquimais Nos casos em que havia a presença da bainha epitelial de Hertwig, evidenciou-

se menor imunoexpressão para Wnt-1 (Fig. 16).

Também, foi evidenciada marcação nuclear e citoplasmática para SOX2 nas células da

camada basal e parabasal de epitélio de mucosa oral normal, adjacente a fragmentos das

lesões estudadas (Fig. 17).

5.2.1 Análise da imunoexpressão de SOX-2

A análise da imunoexpressão da SOX2 revelou positividade na maioria dos casos das

lesões constantes do estudo. Especificamente no parênquima dos casos de AM, a

imunoexpressão apresentou maior frequência de PIT 2 e 3 (Tabela1) e maior frequência do

escore 1 e 2 (Tabela 2). Os casos de CO exibiram maiores valores com relação às frequências

de PIT 6 e 7, representando 70% dos casos e, com maior frequência de escore 3 (85%). O

teste não paramétrico de Kruskal-Wallis revelou haver diferença estatisticamente significativa

entre os grupos de lesões em relação às medianas dos escores de positividade para SOX2 (p =

<0,001) (Tabela 3). A fim de identificar esta diferença entre as lesões para a imunoexpressão

de SOX2 foi realizado o teste de Mann-Whitney (Tabela 4), que mostrou maior valor de

mediana em CO e TOEC, e revelou existir diferença estatisticamente significativa, entre AM

e CO (p=<0,001), AM e TOEC (p=0,007), CO e TOA (p=<0,001), CO e TOEC (p=<0,001) e TOA e

TOEC (p=0,024).

64

Tabela 01. Distribuição absoluta e relativa dos casos de acordo com a pontuação de

imunomarcação total (PIT) para SOX-2 nas células epiteliais das lesões estudadas. Natal

– RN, 2018.

Grupo

Pontuação de Imunomarcação Total

0

n (%)

1

n (%)

2

n (%)

3

n (%)

4

n (%)

5

n (%)

6

n (%)

7

n (%)

AM 1 (5,0) 2 (10,0) 4 (20,0) 9 (45,0) 1 (5,0) 3 (15,0) 0 (0,0) 0 (0,0)

CO 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (10,0) 0 (0,0) 1 (5,0) 3 (15,0) 8 (40,0) 6 (30,0)

TOA 0 (0,0) 1 (5,0) 7 (35,0) 3 (15,0) 8 (40,0) 0 (0,0) 1 (5,0) 0 (0,0)

TOEC 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (10,0) 2 (20,0) 2 (20,0) 1 (10,0) 4 (40,0) 0 (0,0)

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.

Legenda: AM – Ameloblastoma sólido; CO – Ceratocisto odontogênico; TOA – Tumor odontogênico

adenomatoide; TOEC – Tumor odontogênico epitelial calcificante.

Tabela 02. Distribuição absoluta e relativa dos casos acordo com os escores de positividade

para SOX-2 nas células epiteliais das lesões odontogênicas estudadas. Natal –

RN, 2018.

Grupo

Escores de positividade

1- Soma entre 0 e 2

n (%)

2- Soma entre 3 e 4

n (%)

3- Soma ≥5

n (%)

Total

n (%)

AM 7 (35,0) 10 (50,0) 3 (15,0) 20 (100,0)

CO 2 (10,0) 1 (5,0) 17 (85,0) 20 (100,0)

TOA 8 (40,0) 11 (55,0) 1 (5,0) 20 (100,0)

TOEC 1 (10,0) 4 (40,0) 5 (50,0) 10 (100,0)




65

Tabela 03. Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e significância

estatística (p) para os escores de positividade para SOX2 em relação aos grupos

de lesões odontogênicas estudadas. Natal – RN, 2018.

Grupo n Mediana Q25-Q75 Média dos postos p

AM 20 3,00 2,00 – 3,00 23,25 <0,001*

CO 20 6,00 5,00 – 7,00 53,73

TOA 20 3,00 2,00 – 4,00 26,30

TOEC 10 4,50 3,00 – 6,00 41,95



adenomatoide; TOEC – Tumor odontogênico epitelial Calcificante.

*: Teste de Kruskal-Wallis.


estatística (p) para os escores de positividade para SOX2 em relação aos grupos



AM 20 3,00 2,00 – 3,00 12,40 <0,001*

CO 20 6,00 5,00 – 7,00 28,60

AM 20 3,00 2,00 – 3,00 19,33 0,529*

TOA 20 3,00 2,00 – 4,00 21,68

AM

TOEC

20

10

3,00

4,50

2,00 – 3,00

3,00 – 6,00

12,53

21,45

0,007*

CO

TOA

20

20

6,00

3,00

5,00 – 7,00

2,00 – 4,00

28,35

12,65

<0,001*

CO

TOEC

20

10

6,00

4,50

5,00 – 7,00

3,00 – 6,00

17,78

10,95

0,044*

TOA

TOEC

20

10

3,00

4,50

2,00 – 4,00

3,00 – 6,00

12,98

20,55

0,024*




*: Teste de Mann-Whitney.

66

5.2.2 Análise da imunoexpressão de FGF-10

A análise da imunoexpressão de FGF-10 revelou positividade em todos os casos das

lesões estudadas. Especificamente no componente epitelial dos casos, a imunoexpressão

apresentou maior frequência de PIT 5 a 7 (Tabela 5) e maior frequência do escore 3 (Tabela

6). O teste não paramétrico de Kruskal-Wallis revelou não haver diferença estatisticamente

significativa entre os grupos de lesões em relação às medianas dos escores de positividade

para FGF-10 (p = 0,628) (Tabela 7). A fim de identificar diferenças entre as lesões para a

imunoexpressão de FGF-10 foi realizado o teste de Mann-Whitney, que revelou não existir

diferença estatisticamente significativa após o pareamento entre as lesões (p>0,05).

Tabela 05. Distribuição dos casos de acordo com a pontuação de imunomarcação total (PIT) para

FGF-10 no componente epitelial das lesões odontogênicas estudadas. Natal – RN, 2018.

Grupo


0

n (%)

1

n (%)

2

n (%)

3

n (%)

4

n (%)

5

n (%)

6

n (%)

7

n (%)

AM 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (5,0) 1 (5,0) 4 (20,0) 4 (20,0) 5 (25,0) 5 (25,0)

CO 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (5,0) 3 (15,0) 6 (30,0) 7 (35,0) 3 (15,0)

TOA 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (5,0) 6 (30,0) 10 (50,0) 3 (15,0)

TOEC 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (10,0) 1 (10,0) 7 (70,0) 1 (10,0)




67


para FGF-10 no componente epitelial das lesões odontogênicas estudadas. Natal –

RN, 2018.

Grupo


1- Soma entre 0 e 4

n (%)

2- Soma 5

n (%)

3- Soma ≥6

n (%)

Total

n (%)

AM 6 (30,0) 4 (20,0) 10 (50,0) 20 (100,0)

CO 4 (20,0) 6 (30,0) 10 (50,0) 20 (100,0)

TOA 1 (5,0) 6 (30,0) 13 (65,0) 20 (100,0)

TOEC 1 (10,0) 1 (10,0) 8 (80,0) 10 (100,0)





estatística (p) para os escores de positividade para FGF-10 em relação aos grupos


Grupo n Mediana Q25-Q75 Média dos postos P p

AM 20 5,50 4,00 – 6,75 33,10 0,628* >0,05#

CO 20 5,50 5,00 – 6,00 32,70

TOA 20 6,00 5,00 – 6,00 38,38

TOEC 10 6,00 5,75 – 6,00 40,15




*: Teste de Kruskal-Wallis. #: Todos os testes pareados com Mann-Whitney não apresentaram

diferença estatisticamente significativa.

68

5.2.3 Análise da imunoexpressão de Wnt-1

A análise da imunoexpressão da Wnt-1 revelou positividade em todos os casos das

lesões estudadas. Especificamente no parênquima dos casos de AM, a imunoexpressão

apresentou maior frequência de PIT 4 e 5 (Tabela 8) e maior frequência do escore 2 (Tabela

9), representando 70% dos casos. Os casos de CO exibiram maiores valores com relação às

frequências de PIT correspondendo a 6 e 7, representando 70% dos casos. Os grupos com

maior frequência de escore 3 foram o CO (70%) e TOA (60%). O teste não paramétrico de

Kruskal-Wallis revelou haver diferença estatisticamente significativa entre os grupos de

lesões em relação às medianas dos escores de positividade para Wnt-1 (p = <0,001) (Tabela

10), que mostrou maior valor de mediana em CO e TOA. A fim de identificar esta diferença

entre as lesões para a imunoexpressão de Wnt-1 foi realizado o teste de Mann-Whitney, que

revelou existir diferença estatisticamente significativa entre AM e CO (p=0,002), AM e TOEC

(p=0,028), CO e TOEC (p=<0,001) e TOA e TOEC (p=0,005) (Tabela 11).

Tabela 08. Distribuição dos casos de acordo com a pontuação de imunomarcação total (PIT) para

Wnt-1 no componente epitelial das lesões odontogênicas estudadas. Natal – RN, 2018.

Grupo


0

n (%)

1

n (%)

2

n (%)

3

n (%)

4

n (%)

5

n (%)

6

n (%)

7

n (%)

AM 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 2 (10,0) 8 (40,0) 6 (30,0) 3 (15,0) 1 (5,0)

CO 0 (0,0) 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (5,0) 1 (5,0) 4 (20,0) 10 (50,0) 4 (20,0)

TOA 0 (0,0) 0 (0,0) 1 (5,0) 1 (5,0) 5 (25,0) 1 (5,0) 7 (35,0) 5 (25,0)

TOEC 0 (0,0) 0 (0,0) 3 (30,0) 2 (20,0) 3 (30,0) 1 (10,0) 1 (10,0) 0 (0,0)




69


para Wnt-1 no componente epitelial das lesões odontogênicas estudadas. Natal –

RN, 2018.

Grupo


1- Soma entre 0 e 3

n (%)

2- Soma entre 4 e 5

n (%)

3- Soma ≥6

n (%)

Total

n (%)

AM 2 (10,0) 14 (70,0) 4 (20,0) 20 (100,0)

CO 1 (5,0) 5 (25,0) 14 (70,0) 20 (100,0)

TOA 2 (10,0) 6 (30,0) 12 (60,0) 20 (100,0)

TOEC 5 (50,0) 4 (40,0) 1 (10,0) 10 (100,0)





estatística (p) para os escores de positividade para Wnt-1 em relação aos grupos



AM 20 4,50 4,00 – 5,00 29,18 <0,001*

CO 20 6,00 5,00 – 6,00 46,13

TOA 20 6,00 4,00 – 6,75 40,80

TOEC 10 3,50 2,00 – 4,25 16,30




*: Teste de Kruskal-Wallis.

70


estatística (p) para os escores de positividade para Wnt-1 em relação aos grupos



AM 20 4,50 4,00 – 5,00 14,90 0,002*

CO 20 6,00 5,00 – 6,00 26,10

AM 20 4,50 4,00 – 5,00 17,30 0,086*

TOA 20 6,00 4,00 – 6,75 23,70

AM

TOEC

20

10

4,50

3,50

4,00 – 5,00

2,00 – 4,25

17,98

10,55

0,028*

CO

TOA

20

20

6,00

6,00

5,00 – 6,00

4,00 – 6,75

21,55

19,45

0,583*

CO

TOEC

20

10

6,00

3,50

5,00 – 6,00

2,00 – 4,25

19,48

7,55

<0,001*

TOA

TOEC

20

10

6,00

3,50

4,00 – 6,75

2,00 – 4,25

18,65

9,20

0,005*




*: Teste de Mann-Whitney.

5.2.4 Correlação das imunoexpressões de SOX2, FGF-10 e Wnt-1

Foram analisadas possíveis correlações entre os escores de imunopostividade para

SOX2, FGF-10 e Wnt-1 empregando-se o coeficiente de correlação de Spearman (r) para a

amostra total e não sendo encontradas correlações com significância estatística (p=>0,05).

Observou-se que entre SOX2 e Wnt-1 a correlação foi fraca e positiva (r=0,216; p=0,073),

entre SOX2 e FGF-10 a correlação foi fraca e positiva (r=0,053; p=0,666) e entre Wnt-1 e

FGF-10 a correlação foi fraca e negativa (r= -0,012; p=0,924).

Analisando-se separadamente, as correlações dos marcadores nos grupos de lesões

estudadas, foi observada uma correlação fraca e negativa sem significância estatística entre

FGF-10 e Wnt-1 em CO (r= -0,361; p=0,118) e TOEC (r= -0,258; p=0,471). Uma correlação

fraca e positiva sem significância estatística entre FGF-10 e Wnt-1 em AM (r= 0,051;

71

p=0,831) e TOA (r= 0,285; p=0,223). Ao avaliar SOX2 e Wnt-1 em TOEC foi observada uma

correlação positiva moderada (r=0,626; p=0,053), mas sem significância estatística (Tabela

12).

Tabela 12. Tamanho da amostra, comparação, coeficiente de correlação de Spearman (r) e

significância estatística (p) para os escores de positividade para SOX2, FGF-10 e Wnt-1

em relação aos grupos de lesões odontogênicas estudadas. Natal – RN, 2018.

Grupo n Comparação r p

20 SOX2 x FGF-10 0,157 0,508

AM 20 SOX2 x Wnt-1 -0,199 0,401

20 FGF-10 x Wnt-1 0,051 0,831

20 SOX2 x FGF-10 0,273 0,244

CO 20 SOX2 x Wnt-1 0,029 0,902

20 FGF-10 x Wnt-1 -0,361 0,118

20 SOX2 x FGF-10 0,121 0,612

TOA 20 SOX2 x Wnt-1 0,271 0,247

20 FGF-10 x Wnt-1 0,285 0,223

10 SOX2 x FGF-10 -0,091 0,803

TOEC 10 SOX2 x Wnt-1 0,626 0,053

10 FGF-10 x Wnt-1 -0,258 0,471




72

Figura 2. Fotomicrografia evidenciando a fraca marcação nuclear e citoplasmática de SOX2

em Tumor Odontogênico Epitelial Calcificante (Panoramic Viewer, Advance).

Figura 1. Fotomicrografia evidenciando a fraca marcação nuclear de SOX2 em

Ameloblastoma com evidente marcação em vasos sanguíneos no estroma (Panoramic Viewer,

Advance).

73

Figura 3. Fotomicrografia evidenciando a fraca marcação citoplasmática de SOX2 em Tumor

Odontogênico Epitelial Calcificante com escassa marcação no material amilóide e anéis de

Liesegang (Panoramic Viewer, Advance).

Figura 4. Fotomicrografia evidenciando a fraca marcação citoplasmática de SOX2 em Tumor

Odontogênico Adenomatoide (Panoramic Viewer, Advance).

74

Figura 5. Fotomicrografia evidenciando marcação nuclear de SOX2 em Ceratocisto Odontogênico

(Panoramic Viewer, Advance).

Figura 6. Fotomicrografia evidenciando a marcação nuclear e citoplasmática de SOX2 em germe

dentário na fase de campânula (Panoramic Viewer, Advance).

75

Figura 7. Fotomicrografia evidenciando a marcação citoplasmática de FGF-10 em Ameloblastoma


Figura 8. Fotomicrografia evidenciando marcação nuclear e citoplasmática de FGF-10 em Tumor

odontogênico epitelial calcificante (Panoramic Viewer, Advance).

76

Figura 9. Fotomicrografia evidenciando marcação citoplasmática de FGF-10 em Tumor

odontogênico adenomatoide (Panoramic Viewer, Advance).

Figura 10. Fotomicrografia evidenciando a marcação de FGF-10 em Ceratocisto Odontogênico, com

evidente marcação em vasos sanguíneos no estroma (Panoramic Viewer, Advance).

77

Figura 11. Fotomicrografia evidenciando a marcação nuclear e citoplasmática de FGF-10 em

germe dentário na fase de campânula (Panoramic Viewer, Advance).

Figura 12. Fotomicrografia evidenciando a moderada marcação citoplasmática de Wnt-1 em

Ameloblastoma com evidente marcação em vasos sanguíneos no estroma (Panoramic Viewer,

Advance).

78

Figura 13. Fotomicrografia evidenciando a fraca marcação citoplasmática de Wnt-1 em Tumor

Odontogênico Epitelial Calcificante com escassa marcação no material amilóide (Panoramic

Viewer, Advance).

Figura 14. Fotomicrografia evidenciando a marcação citoplasmática de Wnt-1 em Tumor

odontogênico adenomatoide (Panoramic Viewer, Advance).

79

Figura 15. Fotomicrografia evidenciando a marcação citoplasmática de Wnt-1 em Ceratocisto

Odontogênico com evidência em suprabasal e superficial (Panoramic Viewer, Advance).

Figura 16. Fotomicrografia evidenciando a marcação nuclear e citoplasmática de Wnt-1 em

germe dentário na fase de campânula, com fraca marcação nas regiões das alças cervicais


80

Figura 17. Fotomicrografia evidenciando a marcação nuclear de SOX2 predominantemente

na camada basal e suprabasal em mucosa oral subjacente a um caso de Ameloblastoma


81

Discussão

82

6 DISCUSSÃO

As interações epiteliais-mesenquimais, durante a odontogênese, são uma série de

comunicações programadas, sequenciais e recíprocas que dão origem a uma grande variedade

de células e tecidos altamente especializados. As principais vias de sinalização incluem:

BMP, FGF, SHH, WNT e seus respectivos receptores (RAMANATHAN et al., 2018). O gene

Pax9 (Paired box gene 9), atua como um marcador mesenquimal precoce para determinar a

localização exata de formação de germes dentários, que é induzida por Fgf8, mas é regulada

negativamente pelas proteínas BMP2 e BMP4. O fator de transcrição Pitx2 (Paired-like

homeodomain transcription factor 2) é importante na determinação do destino celular na

odontogênese (HUANG; THESLEFF, 2013; SURYADEVA; KHAN, 2015; PUTHIYAVEETIL et

al., 2016).

Durante a odontogênese, as células-tronco (epiteliais e mesenquimais) são essenciais

para a morfogênese dentária. Diversas pesquisas têm utilizado as células-tronco

mesenquimais dentárias por serem facilmente obtidas, enquanto os estudos são escassos com

as células epiteliais odontogênicas por serem perdidas após a conclusão da formação do

esmalte. Ainda na vida adulta, as células-tronco se fazem presentes na polpa dentária e são

importantes para a manutenção e regeneração tecidual (CUNHA et al., 2013; PRIYA te al.,

2015; MIRAN; MITSIADIS; PAGELLA, 2016; SHARPE, 2016;).

Após a formação dos dentes, ocorre uma desagregação das estruturas que participaram

da formação dos tecidos dentários e espera-se que, com o desenvolvimento, essas células

desapareçam ou permaneçam quiescentes (ISHIKAWA et al., 2017). Porém, diversas lesões

podem surgir decorrentes de alterações em remanescentes epiteliais da odontogênese

originando lesões com um comportamento biológico diverso, desde hamartomas a tumores

malignos odontogênicos (AGARWAL et al., 2016; JIANG et al., 2016). Da mesma forma que

a morfogênese dentária não é determinada por um único gene, mas por numerosos fatores

genéticos e epigenéticos, a maioria dos defeitos de desenvolvimento nos dentes geralmente

ocorrem como resultado de mutações em genes que codificam moléculas de sinalização e

fatores de transcrição (SURYADEVA; KHAN, 2015).

A etiologia exata e a patogênese das lesões de origem odontogênica ainda

permanecem incertas e alterações em vários genes e moléculas afetam o desenvolvimento e a

progressão destas lesões. A análise comparativa, entre os mecanismos que ocorrem durante a

odontogênese e nas lesões de origem odontogênicas, é válida pois nos fornece o melhor

83

entendimento da patogênese destas alterações. A capacidade das células destas lesões de

apresentar genes expressos durante a odontogênese é bem conhecida, porém as suas possíveis

alterações genéticas e o padrão de expressão ainda não estão bem elucidados (CUNHA et al.,

2013; HUANG; THESLEFF, 2013; GARG et al., 2015).

O CO possui uma natureza mais agressiva e com altos índices de recorrência

comparado a outros cistos odontogênicos. O AM, apesar de ser uma neoplasia benigna, possui

um comportamento localmente agressivo e diversas alterações genéticas têm sido

evidenciadas neste tumor. O TOA e o TOEC são tumores que, possivelmente possuem a

mesma origem do CO e Ameloblastoma, porém, com comportamentos biológicos indolentes e

formação de tecido mineralizado (REGEZI, 2002; JIANG et al., 2016; CHRCANOVIC;

GOMEZ, 2017). Diversos genes envolvidos na odontogênese estão desregulados e envolvidos

na patogênese destes tumores. Por estes motivos, estas lesões são bastante estudadas e estas

características foram cruciais para nosso estudo comparativo a fim elucidar possíveis

mecanismos que diferem nestas lesões (GARG et al., 2015).

Recentemente, mutações no gene BRAF foram identificadas em uma série de casos de

AM e alterações neste gene contribui para a ativação da sinalização MAPK. Ameloblastoma

benigno e metastatizante apresentam reatividade para SHH e para a proteína SMO

(Smoothened) que é um receptor de ligação à proteína G não clássico que medeia a

sinalização de Sonic Hedgehog (SHH) e é normalmente reprimido por PTCH1 na ausência de

ligantes da via SHH. As mutações SMO foram relatadas entre 16-39% em casos de AMs. A

presença de polimorfismos e as mutações germinativas deletérias em PTCH1 demonstraram

que afetam o risco para o desenvolvimento de AM (SWEENEY et al., 2014; GARG et al.,

2015; JIANG et al., 2016).

Durante os estágios iniciais da embriogênese, SOX2 transloca do citoplasma para o

núcleo para impulsionar a transcrição de seus genes-alvo. Porém, a acetilação de SOX2, por

meio do resíduo de lisina k75 conservado, induz a sua exportação nuclear em células-tronco

embrionárias. Além disso, o aumento da acetilação celular leva à redução nos níveis de SOX2

por ubiquitinação e degradação proteossômica, revogando sua capacidade de impulsionar a

transcrição de seus genes -alvo. Por outro lado, o bloqueio da acetilação mantém SOX2 no

núcleo o que leva a manutenção da célula em estado de pluripotência. A exportação nuclear

mediada por acetilação pode ser um mecanismo regulatório comumente usada para muitos

membros da família Sox (BALTUS et al., 2009; YANG et al., 2014). Diversos estudos

84

apontam que SOX2 é regulada positivamente em diversos tipos de tumores (MÜLLER et al.,

2016; REN; ZHANG; JI, 2016) e em lesões odontogênicas (JUURI et al., 2013a;

HEIKINHEIMO et al., 2015; BANERJEE et al., 2016). Os resultados da presente pesquisa

demonstraram que a via de sinalização SOX2 entre o citoplasma e o núcleo pode participar

no desenvolvimento das lesões avaliadas, porém apresentou maior expressão a nível nuclear e

citoplasmático na camada germinativa em CO, seguido do TOEC, e menor imunoexpressão

de SOX2 em TOA e AM com diferença estatisticamente significativa (p<0,001).

Juuri et al. (2013a) compararam a imunoexpressão de SOX2 de cinco casos de AM

com cortes sequenciais da região de formação de terceiros molares de ratos e observou um

padrão de imunomarcação semelhante entre os espécimes tumorais e fragmentos da lâmina

dentária em ratos, propondo que SOX2 contribui para a manutenção de um padrão de células

com características de pluripotência em AM. Os resultados do presente estudo mostraram

resultados diferentes de imunoexpressão de SOX2 em AM, assim como em TOA, com fraca

marcação ou mesmo ausência de expressão, diferentemente do padrão de expressão em CO

que exibiu escore 3 de marcação na maioria dos casos. Estes resultados corroboram o estudo

de Heikinheimo et al. (2015) que avaliou geneticamente 15 casos de AM e 12 de CO e

constataram que SOX2 estava regulada positivamente com significância em CO ao contrário

do evidenciado em AM. Esta diferença está relacionada com o processo de diferenciação das

células epiteliais do ameloblastoma as quais se diferenciam semelhantes aos ameloblastos,

induzida por fatores de transcrição específicos dos dentes. Ao contrário, o CO possui uma

diferenciação semelhante a queratinócitos, pela indução de genes da via SHH, por marcadores

de células-tronco e marcadores de diferenciação em epitélio escamoso terminal.

Bandyopadhyay et al. (2017) realizaram um estudo imuno-histoquímico com SOX2 sendo

evidenciad expressão em todos os casos de CO e negatividade para os AM. Portanto, pode-se

sugerir que SOX2 está relacionada com o desenvolvimento destas lesões, porém em CO e

TOEC esta proteína está presente ativamente e pode estar envolvida em processos de

manutenção da pluripotência, proliferação e diferenciação das células epiteliais.

Diversos fatores, como Wnt-1, podem induzir a diferenciação após a inativação dos

fatores de pluripotência. No presente estudo, foi observado que, em fragmentos de mucosa

oral adjacente, em alguns espécimes da amostra, o SOX2 estava expresso nas camadas basal e

suprabasal e de forma contrária, a expressão de Wnt-1 nestes mesmos espécimes foi

evidenciada nas camadas mais superficiais. Esta observação pode ser confirmada pelos

85

estudos de Slavik et al. (2007) que afirmam que a presença de Wnt-1 em queratinócitos induz

a diferenciação, estando ausente na camada basal. De acordo com Okubbo, Pevny e Hogan

(2006), a expressão de SOX2 na camada basal é esperada visto a sua participação na

manutenção da pluripotência celular necessária para a homeostase tecidual e que a diminuição

de sua expressão é dose-dependente dos fatores que induzem a diferenciação nas camadas

superficiais do epitélio.

Além disso, a sinalização Wnt possui a capacidade de dar forma aos tecidos em

crescimento, regular a pluripotência das células-tronco e também atua como fator de

crescimento direcional durante a diferenciação celular na embriogênese e reparo tecidual

(NUSSE; CLEVERS, 2017). Wnt pode regular negativamente vias de sinalização dependente

de SOX2, necessárias para a progressão do desenvolvimento de uma linhagem bronquiolar

(HASHIMOTO et al., 2012). A inativação do gene Wnt1 em camundongos resulta na perda

de toda a região do mesencéfalo (LEWIS et al., 2013). Na presente pesquisa, todos os casos

de germes dentários e das lesões odontogênicas foram positivos para Wnt-1, principalmente

em CO e TOA, com expressão tipicamente citoplasmática com diferença estatisticamente

significativa (p=<0,001), levando-nos a crer que este fator de transcrição além de participar da

odontogênese, também participa da patogênese destas lesões.

No mesênquima dentário, a sinalização de FGF-10 desempenha um papel fundamental

no controle da transição do estágio de formação da coroa para a raiz, quando ocorre a

diminuição da sua expressão no mesênquima próximo a região onde ocorre a formação inicial

da bainha epitelial de Hertwig, embora sua contínua expressão se faça necessária, no epitélio

odontogênico, para a formação das coroas dentárias (ENNES et al., 2012; LI; PARADA;

CHAI, 2017). Na presente pesquisa, observamos a expressão de FGF-10 em todas as células

epiteliais nos germes dentários assim como no epitélio de todas as lesões estudadas, embora

sem diferença estatisticamente significativa (p=0,628).

Estudos realizados por Nakao et al. (2013) e Matsuda et al. (2017) em culturas de

células derivadas de AM demonstraram que a indução com a proteína recombinante FGF-10

aumenta a proliferação de células tumorais através da via MAPK que, por sua vez, ativa

fatores de transcrição nucleares. Na presente pesquisa, todos os casos de AM foram positivos

para FGF-10, que em sua maioria exibiu escore de imunoexpressão entre 2 e 3, representando

70% dos casos analisados. De forma semelhante, a maioria dos casos de TOA e TOEC exibiu

escore 3 de imunoexpressão de FGF-10, resultados que corroboram os estudos citados

86

anteriormente de que esta proteína participa do processo de desenvolvimento em casos de

AM, assim como em TOA e TOEC.

No presente estudo, evidenciou-se marcação citoplasmática de FGF-10 nos casos de

CO com escore 3 de imunoexpressão, na maioria dos casos, principalmente nas camadas basal

e parabasal, semelhante ao que ocorreu na avaliação da expressão para SOX2, o que pode

indicar a participação destas proteínas na proliferação e diferenciação celular nestas lesões, de

forma similar ao que ocorre na morfogênese dentária onde FGF-10, regulado positivamente

por meio da via Wnt/β-catenina, induz a manutenção e proliferação de células-tronco

(KETTUNEN et al., 2000; HARADA et al., 2002; AURREKOETXEA et al., 2016).

O papel da via Wnt (Wnt3, 6, 10a, 10b) na morfogênese dentária já é bem estabelecido

(HUANG; THESLEFF, 2013), porém são escassos os estudos avaliando o papel de Wnt-1 em

lesões odontogênicas, embora algumas pesquisas discutam a importância de Wnt-1 na

manutenção da pluripotência de células-tronco (ROSS et al., 2000; CAMP et al., 2014). Choi

et al., (2012) observaram que Wnt1 contribui para a tumorigênese ao conferir propriedades de

células-tronco em células tumorais de câncer de pulmão em um modelo animal e que o

bloqueio da sinalização, especificamente de Wnt-1, pode contribuir para o desenvolvimento

de terapias antitumorais mais eficazes, por diminuir a formação de microesferas e do volume

tumoral.

A via Wnt/ β-catenina também participa do processo de proliferação da bainha

epitelial de Hertwig induzindo a diferenciação em cementoblastos e odontoblastos embora

posteriormente, ocorra a expressão de DKK1 (um antagonista da via Wnt canônica) nas

células epiteliais com o objetivo de regular negativamente a expressão de Wnt (HUANG;

THESLEFF, 2013). Nesta pesquisa, alguns casos de germes dentários revelaram uma menor

expressão de Wnt-1 nas células na região da bainha epitelial de Hertwig,. De acordo com Cao

et al. (2015), essa menor expressão de Wnt ocorre pela regulação de DKK1 sendo o aumento

de DKK1 induzido por OSX (Osterix), que é um fator de transcrição necessário durante a

cementogênese uma vez que este induz a diferenciação dos cementoblastos.

Observou-se, também, nos casos de germes dentários constantes da presente pesquisa,

em que se apresentavam em fases tardias do estágio de campânula, persistência da expressão

de Wnt-1 no epitélio odontogênico e fraca imunoexpressão na região de ectomesênquima. Lee

et al. (2015) constataram que a expressão de Wnt/β-catenina na odontogênese é bastante

87

variável entre o epitélio e o ectomesênquima. No início da fase de campânula, a inibição de

Wnt no epitélio, por meio do fator 1 de inibição de Wnt (Wif1), é crucial para a diminuição da

proliferação na região de determinação do nó de esmalte para a formação das cúspides.

Posteriormente, ocorre o aumento da expressão de Wif1 na região do ectomesênquima e a

consequente diminuição da expressão de Wnt. Ao considerar que todos os casos das lesões

constantes da presente pesquisa exibiam imunoexpressão para Wnt-1 no componente epitelial,

este fato sugere que este fator de transcrição participa da patogênese destas lesões e que

possíveis alterações no mecanismo de regulação desta via podem levar ao aumento de sua

sinalização.

Os resultados da presente pesquisa sugerem que a imunoexpressão de Wnt-1 tanto no

citoplasma quanto no núcleo das células epiteliais das lesões avaliadas pode estar participando

do desenvolvimento e progressão destas lesões, embora tenha se apresentado com maior

expressão a nível citoplasmático nas camadas parabasal e superficial em CO, seguido do

TOA, e menor expressão em AM e TOEC com diferença estatisticamente significativa

(p<0,001). Esta consistente imunoexpressão de Wnt-1 em CO, sugere sua importância na

diferenciação celular nestes casos, diferentemente de SOX2 nas camadas basal e parabasal

que, além de estar envolvido nos processos de diferenciação de ceratinócitos, induz a

proliferação e manutenção da pluripotência (OKUBBO; PEVNY; HOGAN, 2006; SLAVIK

et al., 2007; HEIKINHEIMO et al., 2015).

Ao analisar as correlações dos marcadores em cada grupo de lesões constantes da

presente pesquisa, não foi observada correlação entre FGF-10 e Wnt-1 em AM (r= 0,051;

p=0,831) e TOA (r= 0,285; p=0,223). Além disso, essas duas neoplasias que possuem

diferenciação ameloblástica, exibiram menor frequência de imunoexpressão de SOX2,

possivelmente, pela ação de fatores envolvidos na diferenciação de epitélio odontogênico

(PITX2, MSX2, DLX1,2,3,4, ISL1, TBX1, IRX1, RUNX1 e SOX9) que estão mais presentes

nestes tumores (HEIKINHEIMO et al., 2015; BANERJEE et al., 2016)

Também, foi observada uma correlação fraca e negativa sem significância estatística

entre FGF-10 e Wnt-1 em CO (r= -0,361; p=0,118) e TOEC (r= -0,258; p=0,471). De acordo

com alguns autores (HARADA et al., 2002; SLAVIK et al., 2007) maiores níveis de expressão

de FGF-10 são necessários para que ocorra a manutenção da pluripotência em células

epiteliais, pela indução de SOX2, que consequentemente, diminui a expressão de Wnt-1, que

é responsável pela diferenciação celular.

88

Ao considerarmos o comportamento biológico e os índices de recorrência das lesões

estudadas, sabendo-se que o CO apresenta altas taxas de recorrência, isso poderia estar

relacionado a expressão de SOX2, já que na presente pesquisa esta lesão apresentou altas

frequências de imunoexpressão de SOX2. Porém, não podemos afirmar que isto seja um fato

determinante no comportamento biológico do CO pois, as altas taxas de recorrências estão

muitas vezes relacionadas com o tratamento utilizado para esta lesão. Além disso, o AM que é

uma neoplasia e também possui altas taxas de recorrência, apresentou baixa frequência de

imunoexpressão para SOX2 em comparação com o TOEC, que é localmente invasivo e o

TOA que é conhecidamente uma lesão indolente (REGEZI, 2012; LEE; KIM, 2013). Apesar

destas lesões possuírem a mesma origem a partir de epitélio odontogênico, apresentam

comportamentos biológicos diferentes, porém as diferentes imunoexpressões de FGF-10,

Wnt-1 e SOX2, na presente pesquisa, sugerem que as mesmas não têm relação direta com o

comportamento biológico destas lesões.

Apesar dos resultados desta pesquisa não sugerirem relação entre a expressão de

SOX2 e o comportamento biológico das lesões estudadas, no entanto, o estudo de Lee et al.

(2014) em carcinoma de células escamosas demonstrou que este fator pode ser usado como

valor prognóstico, visto que ele está envolvido com o aumento da proliferação celular,

manutenção da pluripotência e quimioresistência.

Estudos imuno-histoquímicos têm utilizado e nomeado o SOX2 como marcador de

células-tronco (BANERJEE et al., 2016; BANDYOPADHYAY et al., 2017), porém após nossos

resultados em lesões odontogênicas epiteliais benignas, entendemos que este marcador

isoladamente não é suficiente para identificar células-tronco tumorais e assim como Müller et

al. (2016) e Lee et al. (2014), podemos denominar SOX2 como um fator de pluripotência e de

autorrenovação celular nestas lesões.

Desta forma, o estudo das vias de transcrição envolvidas no processo de pluripotência

de células-tronco e de seus reguladores em lesões odontogênicas se faz importante para o

melhor entendimento da sua participação no desenvolvimento e comportamento biológico

destas lesões. Consequentemente, o desenvolvimento de novas terapias mais conservadoras

pode surgir como uma alternativa, já que alguns estudos com linhagens celulares de outros

tipos de tumores demostram que o bloqueio da sinalização de Wnt-1 e SOX2 resulta na

diminuição da proliferação e migração celular neoplásica (POLAKOVA; DUSKOVA;

SMAHEL, 2014; CHANG et al., 2015).

89

Conclusões

90

7. CONCLUSÕES

Diante dos resultados obtidos na presente pesquisa, podemos concluir que:

1. As células epiteliais dos casos de AM, TOA, CO e TOEC foram positivas para SOX2,

FGF-10 e Wnt-1 o que sugere a participação destes fatores no desenvolvimento destas

lesões, porém sem evidente relação com os diferentes comportamentos biológicos.

2. Dentre as células epiteliais das lesões avaliadas, foi evidenciado que CO e TOEC

exibiram maior imunoexpressão nuclear e citoplasmática para SOX-2, com diferença

estatística significativa em relação a marcação em AM e TOA, sugerindo que SOX2

está relacionado com as lesões com diferenciação epitelial em comparação com

tumores com diferenciação ameloblástica.

3. As imunoexpressões nuclear para SOX2 e citoplasmática para FGF-10 nas camadas

basal e parabasal dos COs, indicam o papel destes fatores de transcrição na

manutenção da pluripotência, na diferenciação e proliferação desta lesão.

4. Os casos de CO e TOA exibiram maior imunoexpressão de Wnt-1, com diferença

estatística significativa em relação à marcação evidenciada em AM e TOEC. TBM

5. Não houve correlação estatisticamente significativa entre a imunoexpressão de SOX2,

FGF-10 e Wnt-1 nas lesões estudadas.

6. Os casos de germes dentários analisados no presente estudo foram positivos para

SOX2, FGF-10 e Wnt-1, o que confirma a participação destes fatores de transcrição

durante a odontogênese.

91

Referências

92

8. REFERÊNCIAS

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100

Anexo

101

ANEXO

102

103

104

Documents

ESTUDO DA EXPRESSÃO IMUNO- HISTOQUÍMICA DE SOX2, … · À minha turma de mestrado e doutorado, Manoela, Thais, Malu, Luciana, Vivi, Andréia, Tiago, Luiz, Nice e Laura, com a amizade