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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
ESTUDO DA IMOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS DE
Saccharomyces cerevisiae EM GEL DE ALGINATO DE CÁLCIO
NO PROCESSO DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
MESTRANDO: Eng.Químico Márcio de Andrade Batista
ORIENTADOR: Prof. PhD. Luís Cláudio Oliveira Lopes
Co-Orientador: Prof. Dr. Eloízio Júlio Ribeiro
UBERLÂNDIA – MG
AGOSTO – 2005
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química
ESTUDO DA IMOBILIZAÇÃO DE CÉLULAS DE Saccharomyces cerevisiae EM GEL DE ALGINATO DE CÁLCIO NO PROCESSO DE
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
Márcio de Andrade Batista
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre emEngenharia Química, Área de concentração emDesenvolvimento de Processos Químicos.
Uberlândia2005
FICHA CATALOGRÁFICA
Elaborada pelo Sistema de Bibliotecas da UFU / Setor de Catalogação e Classificação
B333e Batista, Márcio de Andrade, 1974- Estudo da imobilização de células de Saccharomyces cerevisiae em gel de alginato de cálcio no processo de fermentação alcoólica / Márcio de An- drade Batista. - Uberlândia, 2005. 114f. : il. Orientador: Luís Cláudio Oliveira Lopes. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Uberlândia, Progra- ma de Pós-Graduação em Engenharia Química. Inclui bibliografia. 1. Álcool - Teses. 2. Fermentação - Teses. I. Lopes, Luís Cláudio Oli-veira. II. Universidade Federal de Uberlândia. Programa de Pós-Gradua-ção em Engenharia Química. III. Título.
CDU: 662.754
AGRADECIMENTOS
A realização de uma dissertação de mestrado constitui-se uma tarefa de tal magnitude, que se torna impossível realizá-la sem a ajuda de outras pessoas e gostaria de certificar que as mesmas soubessem de meu apreço.
Agradeço ao Deus Jeová, que em sua onisciência, onipotência e onipresença tem guiado meus caminhos;
Aos meus irmãos Mauri Andrade, Maurílio Andrade e Maércio Andradepela ajuda econômica nos “duros” anos de graduação e que sem eles, esse mestrado não seria possível;
A mimha irmã Márcia Andrade pelo apóio constante e por acreditar em meu trabalho;
Ao hialotecnista Gentil pela confecção das “células” usadas nos ensaios experimentais;
Ao Prof. Dr. Luís Cláudio, que com paciência mostrou como as equações diferenciais podem ser “poderosas” na solução de problemas de Engenharia;
Ao Prof. Dr. Eloízio, Prof. Dr. Damasceno, Prof. Dr. Marcos Barroso, Prof. Dr. Adilson, Prof. Dr. Moilton e Prof. Dr. Sílvio Silvério da Silva. Professores que não só compreendem a ciência, mas também são capazes de explicá-la;
A técnica química Roberta, pela vidraria utilizada;
Ao Doutorando Cláudio “Mezenga” pelo treinamento no software Global Lab .
À empresa Torre - Materiais para panificação, pela doação do fermento utilizado nos ensaios fermentativos;
À Capes, pelo apoio financeiro;
A todos aqueles que embora não citados, contribuíram de maneira direta ou indireta nesse trabalho.
Recebam meus melhores agradecimentos.
“Se ensinarmos a todo mundo, inclusive a estudantes de segundo grau, os hábitos do pensamento cético, eles provavelmente não vão restringir o seu ceticismo aos UFOS, aos comerciais de aspirina e as mentes canalizadas de 35 mil anos de idade.Talvez comecem a fazer perguntas incômodas sobre as instituições econômicas, sociais, políticas ou religiosas.Talvez desafiem as opiniões de quem está no poder. Então o que aconteceria conosco?”
Carl Sagan
“Não devemos acreditar nos muitos que dizem que só as pessoas livres devem ser educadas, deveríamos antes acreditar nos filósofos que dizem que apenas as pessoas educadas são livres.”
Epicteto, Filósofo e ex-escravo romano.
“Sucesso: 1% inspiração e 99% transpiração.”
Thomas Edison (1847-1931)
“Ubi dubiun ibi libertas”
Provérbio latino
i
CONTEÚDO
LISTA DE FIGURAS......................................................................................................... iiiLISTA DE TABELAS........................................................................................................ viLISTA DE ABREVIATURAS........................................................................................... viiLISTA DE SIMBOLOS..................................................................................................... viiiRESUMO........................................................................................................................... xABSTRACT....................................................................................................................... xi
CAPÍTULO 01 - INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVAS.................................................. 1
1.1- O etanol e seu potencial de utilização........................................................................ 11.2- Bioprocessos conduzidos em células imobilizadas..................................................... 41.3- Objetivos...................................................................................................................... 71.4- Estrutura da dissertação............................................................................................... 7
CAPÍTULO 02 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................... 9
2.1- Introdução.................................................................................................................... 92.1.1- Microganismo: Saccharomyces cerevisiae.................................................... 92.1.2 - Cinética de fermentação................................................................................ 12
2.2 - Meios de cultura......................................................................................................... 142.2.1- Aspectos de assepsia e desinfecção............................................................... 15
2.3 - Rendimentos em processos fermentativos................................................................. 162.4 - Fluxograma simplificado do processo de produção de etanol.................................... 172.5 - Descrição ilustrativa do processo industrial de produção de etanol........................... 182.6 - Imobilização celular................................................................................................... 182.7 - Coeficiente de partição............................................................................................... 212.8 - Projeto de experimentos............................................................................................. 24
2.8.1- Aplicação da função desirability em bioprocessos....................................... 262.9- Modelagem e simulação.............................................................................................. 29
CAPÍTULO 03 - MATERIAIS E MÉTODOS................................................................... 32
3.1- Microrganismo e preparo do inóculo........................................................................... 323.2- Técnicas utilizadas nos ensaios................................................................................... 33
3.2.1- Métodos analíticos........................................................................................ 333.2.2- Procedimentos experimentais........................................................................ 34
3.3- Planejamento de experimentos.................................................................................... 373.3.1- Planejamento varredura................................................................................. 373.3.2- Planejamento tipo fatorial composto central................................................. 393.3.3- Investigação da função desirability em bioprocessos................................... 40
CAPÍTULO 04 - RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................ 42
4.1-Avaliação dos diferentes tipos de fermento biológico.................................................. 424.2-Avaliação das distribuições dos diâmetros dos pellets obtidos.................................... 424.3-Avaliação do planejamento fatorial completo dois níveis do tipo 23.......................... 444.4-Planejamento do tipo 24................................................................................................ 484.5-Planejamento composto central do tipo 34-1................................................................. 544.6-Aspectos introdutórios para a modelagem do Fermentador......................................... 65
CAPÍTULO 05-CONCLUSÕES........................................................................................ 75
ii
CAPÍTULO 06-SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS.................................... 78
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................ 79
APÊNDICES....................................................................................................................... 84
Apêndice A - Curvas de Calibração........................................................................ 85Apêndice B - Resultados dos Ensaios de Fermentação Realizados........................ 86
iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 01- Representação da síntese bioquímica do microrganismo Escherichia coli para a conversão de glicose a etanol................................................................................... 4
Figura 02- Fluxograma simplificado para a produção de etanol com
levedura imobilizada........................................................................................................... 6
Figura 03- Representação esquemática das estruturas tipicas
da levedura Saccharomyces cerevisiae............................................................................... 10
Figura 04- Microfotografia com as diversas fases de crescimento
da levedura Saccharomyces cerevisiae............................................................................... 10
Figura 05- Representação das diversas fases de crescimento
da levedura Saccharomyces cerevisiae............................................................................... 11
Figura 06- Etapas de redução da glicose a etanol............................................................... 14
Figura 07- Fermentação contaminada com cultura de lactobacilos e formação de espuma................................................................................................................................ 16
Figura 08- Fluxograma simplificado do processo de produção
de etanol.............................................................................................................................. 17
Figura 09- Métodos de imobilização celular....................................................................... 20
Figura 10- Características e tipos de suporte, utilizados nas diversas técnicas de imobilização........................................................................................................................ 21
Figura 11- Métodos básicos de imobilização.................................................................... 21
Figura 12- Representação esquemática do pellet com a entrada do substrato e saída do produto................................................................................................................................ 23
Figura 13- Reator utilizado nos ensaios fermentativos....................................................... 35
Figura 14- Equipamento utilizado na imobilização e confecção dos pellets...................... 36
Figura 15- Amostra representativa dos pellets de alginato de cálcio obtidos e o padrão de medida (diâmetro externo de15mm) usado no software Global Lab®........................... 37
Figura 16-“Ponteiras” usadas para obtenção dos pellets de diferentes diâmetros e padrão de medida (diâmetro externo de15mm).............................................................................. 37
Figura 17- Processamento de imagens dos pellets: (a) imagem processada; (b) determinação dos diâmetros de cada partícula; (c) avaliação do número de partículas para determinação do raio médio do conjunto de partículas............................................... 37
Figura 18- Diagrama de dispersão dos pontos do planejamento gerado............................ 38
iv
Figura 19- Perfis de concentração de etanol, glicose e células livres para o fermento
tipo A................................................................................................................................... 43
Figura 20- Perfis de concentração de etanol, glicose e células livres para o fermento
tipo B .................................................................................................................................. 43
Figura 21- Representação dos efeitos para o planejamento 23............................................ 46
Figura 22- Gráfico das médias marginais obtidas no planejamento 23............................... 46
Figura 23- Diagrama de Pareto das variáveis mais significativas, com nível de confiança de 95% ............................................................................................................... 47
Figura 24- Superfícies de resposta de obtidas no planejamento de varredura.................... 48
Figura 25- Análise de Pareto para a fração 24 do planejamento composto central com limite de confiança de 90%................................................................................................. 50
Figura 26- Perfis para valores preditos e desirability para o planejamento 24................... 51
Figura 27- Distribuição dos resíduos em função dos valores normais para o planejamento 24................................................................................................................... 52
Figura 28- Distribuição dos resíduos em função valor predito para o planejmento 24....... 53
Figura 29- Médias marginais para o panejamento 24 com nível de confiança de 90%....... 53
Figura 30- Resíduos para o planejamento 34-1 com nível de significância de 90%............. 54
Figura 31- Distribuição do valor predito versus valor observado para o planejamento
34-1....................................................................................................................................... 56
Figura 32- Análise de Pareto para o planejamento 34-1 com limite de confiança de 90%. Efeitos dos fatores: Lineares(L), Quadráticos (Q)……………………………………….. 56
Figura 33- Perfis para valores preditos otimizados e desirability para o planejamento
34-1 (desirability global igual a 1)....................................................................................... 57
Figura 34- Curvas de nível para desirability do planejamento 34-1: Valores ótimos com ajuste spline......................................................................................................................... 58
Figura 35- Região de máximo rendimento como função das concentrações de cloreto de cálcio e alginato de sódio no planejamento 34-1.................................................................. 59
Figura 36- Cinética e produtividade de fermentação do melhor ensaio obtido................... 62
Figura 37- Relação percentual entre concentração de células livres e células imobilizadas........................................................................................................................ 63
Figura 38- Partículas de alginato de cálcio com células imobilizadas: (a) Pellet do tipo A; (b) Pellet do tipo B............................................................................ 64
v
Figura 39- Comportamento estacionário de uma partícula com 5 pontos de colocação
internos, polinômio de Jacobi com 1, 1 , Sh=100, 2,0 e =[1(+), 10(x), 100( )].................................................................................................................................
2
67
Figura 40- Comportamento estacionário de uma partícula com 5 pontos de colocação
internos, polinômio de Jacobi com 1, 1 . Sh=100, 2,0 , =100 e =[0(+), 10(x), 25( ),100( )].........................................................................................
2
2 68
Figura 41- Comportamento estacionário de uma partícula com inibição pelo produto de forma não competitiva utilizando 5 pontos de colocação internos, polinômios de Jacobi
com 1, 1 , 2,0 , Sh=100, =100 e 23 =[0(+), 10(x),
25( ),100( )]...................................................................................................................... 71
vi
LISTAS DE TABELAS
Tabela 01- Propriedades termodinâmicas da gasolina e do etanol..................................... 2
Tabela 02- Rendimento ótimo de fermentação de leveduras em condições
anaeróbicas.......................................................................................................................... 13
Tabela 03- Composição do meio de cultura semi- sintético............................................... 15
Tabela 04- Produtos da fermentação alcoólica, em g/100g de glicose metabolizada, para diferentes rendimentos fermentativos em células livres............................................. 16Tabela 05- Classificação dos modelos cinéticos................................................................. 29
Tabela 06- Modelos cinéticos sem inibição........................................................................ 30
Tabela 07- Modelos cinéticos com inibição pelo substrato................................................ 30
Tabela 08- Modelos cinéticos com inibição pelo produto.................................................. 31
Tabela 09- Lista de Reagentes e Materiais utilizados nos ensaios de fermentação............ 32
Tabela 10- Composição do meio de cultura sintético........................................................ 33
Tabela 11- Fatores e níveis do planejamento fatorial tipo varredura................................. 39
Tabela 12- Matriz do planejamento experimental fatorial completo 23 com fatores e níveis codificados............................................................................................................... 39
Tabela 13- Fatores e níveis do planejamento composto central......................................... 40
Tabela 14- Matriz do planejamento experimental fatorial composto central 34-1
contendo fatores e níveis codificados................................................................................ 41Tabela 15- Avaliação estatística entre os fermentos biológicos disponíveis no mercado............................................................................................................................... 42Tabela 16- Raios médios para partículas confeccionadas nas 5 faixas analisadas com o software de processamento de imagens.............................................................................. 44Tabela 17- Planejamento 23 e a resposta obtida nos ensaios............................................ 45
Tabela 18 -Planejamento 24 e a resposta obtida nos ensaios............................................ 50
Tabela 19- Planejamento 34-1 e a resposta obtida nos ensaios.......................................... 54
Tabela 20- Propriedades físicas e aparentes do alginato de cálcio..................................... 61
Tabela 21- Características aparentes das partículas investigadas....................................... 64
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
RSM Response Surface Methodology-
AIE Agência Internacional de Energia
RMI Instituto Rocky Mountain
EUA Estados Unidos da América
RON Research Octane Number
MON Motor Octane Number
Co Company
SINAFERM Simpósio Nacional de Bioprocessos
SHEB Simpósio Nacional de Hidrólise Enzimática de Biomassas
NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotídio
TQM Total Quality Managemente
JIT Just in Time,
PCC Planejamento composto central
ISO International Organization for Standardization
HPLC Comatografia Líquida de Alta Resolução
viii
LISTA DE SÍMBOLOS
S Concentração de substrato S0 Concentração de substrato inicial P Concentração de produto X Concentração celular CO2 Dióxido de carbono Mg+2 Íon magnésio H2O Água(NH4)2SO4 Sulfato de amônio KH2PO4 Dihidrogenofosfato de potássio Na2HPO4 Monohidrogenofosfato de sódio MgSO4.7H2O Sulfato de Magnésio heptahidratado Al(NO3)3 Nitrato de alumínio
PiK Coeficiente de partição da espécie química i
iGC Concentração da espécie química i no interior da matriz
iFC Concentração da espécie química i no interior do fluido adjacente(r0) Taxa de reação por unidade de volume da partícula Cs Gradiente de concentração de substrato na superfície da partícula CSb Concentração de substrato na fase bulk Cx Concentração celular CS Concentração de substrato na superfície da partícula De Coeficiente de difusão efetivo K2 Parâmetro da equação de Monod Km Parâmetro da equação de Monod
X Valor médio Desvio padrão
T Valor desejado (L) Limite inferior (U) Limite superior S’, t’ Parâmetros que definem a variação da taxa de desejabilidade nm Nanômetrorpm Rotações por minuto
Coeficiente de rotabilidade
SR Taxa de transformação do substrato por unidade de volume na partícula
r Posição radial no pellet
R Raio do pellet (Superfície da partícula)kL Constantes de inibição (Monod)D Coeficiente de difusividade
2 Módulo de Thiele
2 Parâmetro de inibição
pD Difusividade do etanol na partícula
efR Taxa efetiva de crescimento celular no exterior da partícula Concentração inicial de células livres
ix
Cgf Concentração de glicose no fluido Ccd Concentração de células CL Concentração celular no leito Kp, Km , n Constantes de processo mef Concentração de etanol no interior da partícula V Volume do reator
max Velocidade específica máxima
efm.
Quantidade de etanol gerada no interior da partícula
gfm.
Quantidade de glicose consumida no interior da partícula
Lk Coeficientes de transferência de massa nas vizinhanças externas à partícula ' Proporcionalidade
x
RESUMO
Este trabalho tem como objetivo central o oferecimento de uma contribuição para o
desenvolvimento de tecnologias alternativas na produção de etanol pela via biotecnológica.
Nessa direção, apresenta-se um estudo sobre as condições para a imobilização da levedura
Saccharomyces cerevisiae em alginato de cálcio e abordam-se aspectos de estabilidade de
pellets em um bioreator agitado a fim de investigar fatores importantes na operação de
biorreatores com células imobilizadas.
A metodologia da superfície de resposta (RSM), usando um projeto estatístico de
varredura e um planejamento composto central, aliada a função desirability, foram usados
para avaliar a eficiência das partículas na fermentação alcoólica e otimizar as condições de
imobilização. Utilizou-se um bioreator do tipo batelada com agitação mecânica e capacidade
volumétrica de 2 litros com controle de temperatura para o acompanhamento da concentração
celular livre e imobilizada, concentração de etanol e de glicose em intervalos de 2 horas
durante todo o ensaio.
Os resultados para a faixa experimental explorada indicam que o procedimento
sugerido leva a partículas suficientemente robustas no que diz respeito à imobilização. O
tratamento das partículas com Al(NO3)3 resultou em pellets com satisfatória estabilidade
mecânica e ótima atividade metabólica para a produção de etanol, atingindo valores de
conversão de até 94% do rendimento Pasteur.
Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae, Fermentação, Etanol, Imobilização.
xi
ABSTRACT
This work aims to offer a contribution for the development of an economic technology
for ethanol production by the biotechnological approach. In this direction, it investigates the
conditions for Saccharomyces cerevisiae cells immobilization in calcium alginate and
addresses the operational stability aspects of a stirred batch bioreactor in order to deal with
important factors in the immobilized cell bioreactor operation.
A Response Surface Methodology (RSM), using a statistical screening design and a
central composite design, allied with a desirability function analysis, were used to evaluate the
fermentation efficiency of the pellets and to optimize the cells immobilization conditions. A 2
liters stirred batch bioreactor with temperature control was used to monitor the free and
immobilized cell concentrations, ethanol and glucose concentrations were sampled at each 2
hours during the duration of the fermentation process.
The results in the explored experimental range indicate that the proposed methodology
leads up to a sufficiently robust immobilization procedure. The pellets treated with Al(NO3)3
presented a great deal of stability and metabolic activity for ethanol production, reaching
conversion of up to 94% of the Pasteur yield.
Keywords: Saccharomyces cerevisiae, Fermentation, Ethanol, Immobilization.
CAPÍTULO 01 – INTRODUÇÃO
1.1-O etanol e seu potencial de utilização
Nas últimas décadas o etanol tem ocupado um lugar de destaque e de grande
importância tecnológica, firmando-se como um produto estratégico economicamente. Tem
alto valor estratégico devido à proposta promissora como combustível alternativo ao petróleo,
que segundo estudiosos tem um tempo de vida estimado em 50 anos. Outro aspecto a ser
destacado é sua utilização como intermediário na síntese de biodiesel, durante a etapa de
transesterificação. Biodiesel é um combustível biodegradável derivado de fontes renováveis
como óleos vegetais (mamona, dendê, girassol e babaçu) e gorduras animais, que pela ação de
um catalisador, reagem com o etanol. Tecnicamente o biodiesel substitui total ou parcialmente
o diesel de petróleo em motores ciclodiesel de caminhões, tratores e automóveis e também é
indicado para a geração de energia. Pode ser utilizado puro ou misturado ao diesel tradicional
em diversas proporções. A mistura de 2% de biodiesel ao diesel de petróleo é chamada de B2
e assim sucessivamente, até o biodiesel puro, denominado B100.
Segundo a Agência Internacional de Energia (AIE), o mercado de biocombustíveis
dominará 30% do mercado mundial em 2020. Este setor tem crescido 20% ao ano, apontando
o Brasil como um dos potenciais produtores de energia alternativa ao petróleo para as
próximas décadas.
O mercado de biocombustíveis representa apenas 2% do mercado global e o comércio
internacional soma R$5 bilhões/ano. Neste contexto, o Brasil exportou 2 bilhões de litros de
etanol e o consumo interno foi de 15 bilhões de litros, mostrando assim que existe ainda um
grande mercado a ser explorado e desenvolvido.
O programa brasileiro Proálcool, segundo o Ministério da Ciência e Tecnologia, o
programa foi uma resposta à crise do petróleo na década de 80 e uma alternativa para o
controle flutuante dos preços do açúcar no mercado internacional e colocou o Brasil como o
maior produtor de mundial de etanol por via biotecnológica em 1980 e conforme relata
GOLDEMBERG et al.,(1994), as propriedades do etanol como combustível levaram as
empresas automobilísticas, ao desenvolvimento de motores a álcool e também motores de
mistura álcool/gasolina para os sistemas carburados e atualmente para todos os motores com
sistema de injeção eletrônica.
Na década de 80, 90% dos motores dos carros eram a álcool e o custo de produção do
barril de etanol atingiu valores de cerca de 100 dólares. Investimentos significativos estão
2
sendo realizados na modernização de tecnologias de produção mais eficientes, atraindo a
atenção de investidores estrangeiros que importam o etanol brasileiro para diversas aplicações
industriais, entre elas a sua utilização na indústria de bebidas e como aditivo à gasolina.
Segundo GOLDEMBERG (1994), o etanol é um excelente combustível automotivo,
apresenta índice de octanagem superior ao da gasolina e tem uma pressão de vapor inferior,
resultando em menores emissões evaporativas. Isso o torna atrativo ambientalmente, tendo em
vista o protocolo de Kyoto e o compromisso firmado pelos países mais industrializados com a
United Nations Framework Climate Change Convention, onde os mesmos se comprometem
a reduzir suas emissões de CO2 na atmosfera.
De acordo com o Instituto Rocky Mountain (RMI , 2005), o etanol é uma das únicas
fontes alternativas de energia que podem competir de maneira equiparada ao petroleo, ainda
que o mesmo fosse vendido a menos da metade do preço atual e segundo o mesmo instituto, a
economia gerada nos EUA, na identificação de um substituto para o petroleo seria da ordem
de U$70 bilhoes / ano, alem de reduzir as emissões de carbono do pais em 26%.
Na Tabela 1 tem-se a comparação entre as propriedades termodinâmicas do etanol e da
gasolina.
Tabela 1- Propriedades termodinâmicas da gasolina e do etanol (GOLDEMBERG,1994)
Propriedades Físicas Gasolina Etanol
Calor específico 34900 kJ/kg 26700 kJ/kg
Número de octano (RON/MON)* 91/80 109/98
Calor latente de vaporização 376 a 502 903
Temperatura de ignição 220 oC 420 oC
Razão estequiométrica - Ar / Combustível 14,5 9 * RON –Research Octane Number MON-Motor Octane Number
Outra possibilidade para o uso de etanol é a sua utilização como intermediário na
produção de hidrogênio para células combustíveis para automóveis e como fonte de energia
elétrica para processos (SILVA , 2003). O uso do etanol como intermediário pode viabilizar a
aplicação do hidrogênio como combustível (SCHMIDT, 2004) e ainda apresentar vantagens
ambientais, pois o hidrogênio não emite nenhum tipo de poluição ou gases que contribuam
para o efeito estufa.
Processos para a produção de etanol a partir de cana-de-açúcar são bem documentados
e discutidos na literatura. Nos Estados Unidos e Europa, o etanol é obtido a partir de milho e
outros amiláceos que podem servir como fonte de matéria-prima barata e renovável (LIMA ,
3
2002), mas do ponto de vista econômico, o produto americano custa até três vezes mais que o
etanol brasileiro, embora seja beneficiado por subsídios do governo americano para se tornar
competitivo.
Atualmente existem tecnologias disponíveis para a conversão de materiais
lignocelulósicos em etanol, mas DORRY (2001) afirma que embora cientificamente possível,
esta técnica ainda é inviável economicamente, devido a dificuldade de ruptura do complexo
lignina-hemicelulose-celulose (CARVALHO, 2000).
Estudos para se obter um fungo (gênero Trichoderma) para a obtenção de etanol a
partir da glicose resultante da degradação da celulose estão em desenvolvimento (DORRY et
al., 2001).
Com o desenvolvimento da biotecnologia e da genética, varias técnicas de
manipulação gênica tem tentado desenvolver microrganismos que sejam capazes de fermentar
uma ampla gama de açúcares. A Escherichia coli é capaz de fermentar uma grande gama de
açúcares, mas gera produtos de pouco valor agregado, o que a princípio desestimula o seu
uso, devido ao aspecto econômico (LIMA, 2002).
INGRAN et al. (1991), citado por LIMA (2002), afirmam que foram obtidos
recombinantes de Escherichia coli que possuem o gene pdc e adh de Zymomonas mobilis,
(que é um microrganismo referenciado na literatura para produção de etanol) permitindo que
o metabolismo do piruvato durante a fermentação seja desviado da síntese de uma mistura de
ácidos orgânicos para a produção de etanol com eficiência de conversão superior a 95% do
rendimento teórico máximo.
Na Figura 1, apresenta-se a representação da síntese bioquímica da Escherichia coli
para conversão de glicose a etanol, mostrando como a Escherichia Coli pode sintetizar as
unidades estruturais bioquímicas para a formação das proteínas, polissacarídeos, lipídeos e
ácidos nucléicos, bem como todas as estruturas celulares, quando cultivadas em meio
contendo glicose, sulfato de amônio e outros sais inorgânicos, conforme citado por
PELCZAR et al. (2004).
As leveduras foram os primeiros organismos encontrados capazes de crescer na
ausência de oxigênio e segundo TAKAHASHI et al. (2002), a levedura Saccharomyces
cerevisiae é o microrganismo mais freqüentemente utilizado na produção de etanol, embora
não seja capaz de fermentar pentoses.
4
Figura 1 - Representação da síntese bioquímica do microrganismo Escherichia coli para a conversão de glicose a etanol (PELCZAR et al., 2004).
1.2 - Bioprocessos conduzidos com células imobilizadas
Tão importante quanto à escolha do microrganismo adequado para a fermentação é a
escolha do processo para a condução do bioprocesso. A literatura tem registrado inúmeros
modelos de bioreatores para a produção biotecnológica de etanol e atualmente o uso de
células livres é o método mais empregado.
Segundo FREEMAN e LILY (1998), citados por CARVALHO (2000), a imobilização
de células viáveis apresenta grande potencial para aplicações em conversões ou sínteses que
envolvam sistemas multienzimáticos complexos, nos quais a presença de passos que requerem
provisão de energia ou uso de cofatores seja comum, uma vez que a regeneração desses
compostos ocorre de forma natural.
Um inconveniente dos processos tradicionais é a necessidade de se inocular um
número elevado de células, assim a imobilização pode-se mostrar uma alternativa eficiente
para esse problema. CASSIOLA (2001), afirma que Saccharomyces cerevisiae imobilizada
em crisotila (resíduo da indústria de cerâmica) mostrou ser um excelente biocatalisador no
processo de produção de etanol, aumentando o rendimento do processo em cerca de 26 % em
relação ao sistema com células livres. BRODELIUS e VANDAMME (1987), citados por
CARVALHO (2000), destacam que a condução de bioprocessos com o emprego de células
imobilizadas tem vantagens em relação aos processos fermentativos tradicionais, como a
utilização de altas densidades celulares por unidade de volume do reator, e como destacam
5
CASSIOLA (2001) e VASCONCELOS (1998) resulta em maior produtividade e rendimento
fermentativo.
A bibliografia especializada tem citado o uso de reatores para a produção de etanol e
os mais diversos rendimentos foram obtidos usando-se diferentes suportes como, por
exemplo, a crisotila, géis (como o alginato de cálcio) e o próprio bagaço de cana.
VASCONCELOS (1998) propôs o uso de reatores batelada simples e reator contínuo
para a fermentação alcoólica com leveduras imobilizadas em colmos de cana-de-açúcar e
obteve eficiência fermentativa de 86,40% no processo contínuo e FREGONESI (1998)
destaca que a utilização de sistemas contínuos, empregando-se reatores tubulares, pode
reduzir seu custo de produção, com um rendimento superior em relação ao sistema de células
livres.
RIGO (2001) conduziu fermentações alcoólicas em sistema batelada com células
imobilizadas em crisotila e teve aumento de até 27% na velocidade inicial de conversão de
açúcares a etanol e nas fermentações contínuas, com a presença de crisotila em seu leito,
ocorreu aumento da produção de etanol nas diversas taxas de diluição investigadas.
WENDHAUSEN JUNIOR (1998), utilizando sistemas em regime batelada e contínuo,
conduzidos com células imobilizadas em crisotila, afirmou que obteve de (25 a 30)% de
produção de etanol em relação ao sistema de células livres e o sistema operacional mostrou
estabilidade em relação à produtividade e estrutura do recheio.
No Japão, pelo menos um processo que utiliza levedura imobilizada em gel alginato de
cálcio em reatores de leito fluidizado, foi desenvolvido em escala piloto pela Kyowa Hakko
Kogyo Co. (BORZANI et al., 2001) e (FERREIRA, 1986). Seu fluxograma simplificado é
apresentado na Figura 2. Os autores afirmam que a planta produzindo 12 m3/dia operou por 6
meses sem perda da estabilidade. A produtividade do sistema foi de 20g de etanol/L.h com
uma concentração de etanol no caldo fermentado de 68 g/L e rendimento da fermentação de
aproximadamente 95% do valor teórico. Os resultados indicam que os valores de
produtividade em etanol e de rendimento da fermentação são superiores aos processos de
produção de etanol operando em batelada (Melle-Boinot).
6
Figura 2 – Fluxograma simplificado para a produção de etanol com levedura imobilizada(BORZANI et al., 2001).
WENDHAUSEN JUNIOR (1998) afirmou que os biocatalisadores apresentam como
vantagens à não geração de resíduos de alta toxidade, sendo portanto, ecologicamente corretos
e principalmente, atuam sob condições “suaves”, operando com pH entre 4 e 8, com
temperaturas entre 200C e 400C e na condição de pressão ambiente.
Embora a imobilização de células viáveis seja uma metodologia recomendada em
processos biotecnológicos para o aumento nas taxas de produtividade de produtos de
interesse, o método de imobilização deve ser suficientemente ameno para preservar a
atividade e viabilidade celular (BATISTA et al., 1999).
ALVA (1997) destacou o estresse do microambiente sobre a atividade enzimática da
levedura e afirma que as barreiras difusionais impostas pela matriz sólida e a condição de
empacotamento das células são os principais responsáveis pelas mudanças metabólicas.
A literatura especializada tem citado que o aprisionamento de microrganismos por um
gel é a técnica de imobilização mais utilizada. Dentre os principais estão o alginato de cálcio e
k-carragenana. Outra técnica consiste uma adsorção celular no próprio bagaço de cana-de-
açúcar.
A proposta deste trabalho teve como objetivo apresentar uma contribuição para o
desenvolvimento de metodologias para processos fermentativos, bem como a escolha de um
suporte que alie compatibilidade biológica, resistência mecânica e difusão. A vantagem
principal de investigar a fermentação com a utilização de células imobilizadas deve-se ao fato
de que naqueles sistemas, as células estão fisicamente aprisionadas dentro de uma matriz e
7
assim possuem melhor retenção e uma grande área superfícial para uma operação eficiente. A
imobilização de células permite o reuso de biomassa, melhora a estabilidade e diminui a
contaminação do produto. Entretanto, os bioreatores operando com células imobilizadas em
que as partículas não são fixas apresentam um grau mais elevado de dificuldade no projeto e
operação, principalmente devido à necessidade de agitação mecânica, a prevenção de
sedimentação ou quebra da partícula, e do necessário cuidado na operação para que os danos
nas partículas sejam minimizados.
Existe assim a necessidade de estudos que justifiquem a escolha adequada de suportes
para imobilização e o desenvolvimento de modelos teóricos que possibilitem a simulação
computacional e otimização de processos biotecnológicos.
1.3 – OBJETIVOS
Os objetivos principais desse trabalho podem ser divididos em :
GERAL:
Estudar a imobilização de células de Saccharomyces cerevisiae em gel alginato de cálcio no
processo de fermentação alcoólica.
ESPECÍFICOS:
Verificar as condições de imobilização de células Saccharomyces cerevisiae em suporte de
gel de alginato de cálcio usando técnicas estatísticas;
Propor um modelo matemático que considere os pellets em um bioreator de mistura;
Analisar o comportamento do reator bioquímico operando em batelada e com células
imobilizadas para obtenção de etanol;
Avaliar a produção de etanol com a melhor condição de imobilização definida através de
planejamentos fatoriais.
1.4 – ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO
Essa dissertação foi dividida em 06 capítulos, além das referências bibliograficas,
com a estrutura apresentada a seguir. No Capítulo 01 apresenta-se uma abordagem sobre a
importância dos estudos de imobilização celular para a produção de etanol e as principais
realizações de diversos pesquisadores na área.
8
O Capítulo 02 apresenta uma revisão da literatura sobre os diversos microrganismos
estudados para a produção de etanol, os processos pertinentes e ilustra os aspectos principais
do processo com um fluxograma de uma unidade produtora de etanol e açúcar.
O Capítulo 03 aborda as principais técnicas e metodologias desenvolvidas na
realização da dissertação, apresenta a utilização do software Global Lab® no tratamento de
imagens de pellets para a discriminação de tamanhos necessária ao planejamento
experimental proposto.
O Capítulo 04 apresenta os resultados e as discussões deste trabalho. As conclusões
são apresentadas no Capítulo 05 e sugestões para trabalhos futuros, como por exemplo, o
desenvolvimento de reatores para operação contínua, são propostas no Capítulo 06. O
Apêndice B apresenta as Tabelas (B1 até B25) com os resultados experimentais obtidos nos
experimentos realizados e o Apêndice A as curvas de calibração utilizadas durante os ensaios
fermentativos.
Alguns resultados desse trabalho foram publicados em congressos científicos. Citam-
se: (a) SINAFERM-2005 (XV Simpósio Nacional de Bioprocessos, Recife, Pernambuco),
título do trabalho Study of an immobilized cell bioreactor for alcohol production e (b) SHEB-
2005 (Simpósio Nacional de Hidrólise Enzimática de Biomassas, Maringá, Paraná), título do
trabalho: Avaliação das Condições de Confecção de Pellets de Alginato para a Imobilização
de Leveduras em Processos Biotecnológicos.
9
CAPÍTULO 02 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1- Introdução
Esse capítulo apresenta uma revisão dos aspectos centrais da utilização da levedura
Saccharomyces cerevisiae na produção de etanol. A produção de etanol pela via química não
é discutida nessa dissertação. É de interesse nessa revisão, a apresentação do estado da arte da
produção de etanol pela via biotecnológica. Para fins de clareza, define-se processo
biotecnológico como aquele que objetiva a utilização de sistemas celulares para obtenção de
produtos ou desenvolvimento de processos industriais (BORZANI et al., 2001).
Os processos biotecnológicos possuem origem bastante antiga, entretanto, nas últimas
décadas têm despontado como área estratégica por muitos países, incluindo o Brasil. Essa
grande importância estratégica tem despertado e catalisado o crescimento de várias
possibilidades de aplicação.
2.1.1 - Microrganismo: Saccharomyces cerevisiae
De maneira geral, leveduras são fungos unicelulares pertencentes a um grande grupo
heterogêneo de organismos eucarióticos. A levedura Saccharomyces cerevisiae é tipicamente
gemulante e suas cepas são utilizadas no processo de fermentação para produção de bebidas
alcoólicas e combustíveis como o etanol, são em geral de forma elipsoidal, com dimensões
características de 6 a 8 de comprimento por 5m m de largura (PELCZAR et al., 2004).
Na Figura 03 tem-se a representação esquemática das estruturas típicas da levedura
Saccharomyces cerevisiae e suas principais organelas. Reproduzem-se assexuadamente por
brotamento e durante o processo, o núcleo divide-se por “estrangulamento” onde uma parte
dele entra no broto juntamente com outras organelas. A conexão citoplasmática é lacrada pela
confecção de novo material de parede celular.
As Figuras 4 e 5, mostram como é o desenvolvimento e reprodução da célula livre da
levedura Saccharomyces cerevisiae e assim pode-se fazer uma suposição do que acontece no
interior do microambiente.
10
Figura 03 – Representação esquemática das estruturas típicas da leveduraSaccharomyces cerevisiae.
Figura 04 – Microfotografia com as diversas fases de crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae (PELCZAR et al., 2004).
Das Figuras 04 e 05 observa-se que tanto o estado vegetativo haplóide como os
20 m
Saccharomyces cerevisiaecom células vegetativas (1)
Ascósporos comarranjo tetraédrico
Saccharomyces cerevisiae comcélulas em brotamento (2)
11
diplóides podem estar presentes. A cariogamia precede um estágio de multiplicação
vegetativa diplóide e a meiose precede um estágio de multiplicação vegetativa haplóide com
formação de ascósporos.
Figura 05 – Representação das diversas fases de crescimento da levedura Saccharomyces cerevisiae (PELCZAR et al., 2004).
Em termos de atividade biológica de microrganismos, VALLERO (1999), utilizando
células livres e imobilizadas em reator anaeróbio, constatou que as células aderidas aos
Ascósporos com arranjo tetraédrico (3)
Saccharomyces cerevisiae comcélulas em brotamento (2) Saccharomyces cerevisiae
com células vegetativas (1)
Plasmogamia
12
diversos suportes utilizados tiveram menor atividade biológica que as células livres, embora
essa diferença não fosse significativa. Nesse mesmo trabalho, o autor afirma que tanto a
porosidade como a espessura do biofilme influenciaram na velocidade global de consumo de
substrato.
ALCAZAR (2000), estudando a atividade da levedura Saccharomyces cerevisiae sob
diferentes condições de estresse e o efeito do aprisionamento em gel alginato de cálcio, relata
que, além de exibirem maiores teores de glicogênio, as células imobilizadas apresentam uma
menor sensibilidade tanto ao estresse salino quanto ao estresse alcoólico durante a
fermentação, pois a matriz de alginato no sistema de fermentação contribui na tolerância ao
etanol.
MARQUES (2001), utilizando uma cultura mista de microrganismo Saccharomyces
cerevisiae e Zymomonas mobilis imobilizadas em siltito, destaca que a levedura
Saccharomyces cerevisiae apresentou melhor aderência e fixação ao suporte, resultando em
melhores desempenhos na fermentação contínua e em batelada.
De acordo com MARCONDES (2002), quando os nutrientes são deficientes, as
leveduras entram em meiose para formarem esporos haplóides, os quais germinam quando as
condições tornam-se mais favoráveis. Ainda de acordo com esse autor, para um processo
fermentativo recomenda-se que as leveduras sejam selecionadas conforme os seguintes
critérios:
Fermentação altamente produtiva;
Alto rendimento em etanol;
Tolerância ao etanol;
Ótima tolerância a baixo pH;
Alta tolerância na faixa de temperatura do processo;
Alta tolerância a contaminação.
A utilização dos critérios propostos por MARCONDES (2002) permite destacar as
leveduras Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces fragilis como as mais adequadas para
utilização, sendo que a levedura Saccharomyces cerevisiae ocupa lugar de maior atratividade.
2.1.2- Cinética de fermentação
A reação de produção do etanol é bem documentada na literatura e é expressa como:
13
célulasGlicose S + Nutrientes Etanol P + Células X +Produtos
e apresenta um taxa de conversão teórica de glicose em etanol, segundo MAIORELLA
(1994), expressa por:
1,0g de Glicose 0,511g de Etanol
A princípio, a estequiometria da reação mostra que toda a glicose é consumida e é
convertida em etanol, com rendimento teórico de 0,511g de etanol para cada 1g de glicose.
No entanto, conforme relatam LIMA (2002) e MARCONDES (2002), ocorrem, durante a
síntese, reações secundárias, resultando na redução do rendimento teórico, conhecido com
rendimento Pasteur, que demonstra que no processo, o rendimento máximo real é de 95%. Em
laboratório, o rendimento obtido é de 64,33L de etanol / 100 kg de sacarose e não é atingido
nas destilarias industriais. Obviamente o controle de temperatura e demais condições de
processo são mais facilmente controladas em laboratório do que em escala industrial. Em
destilarias que operam bem tecnicamente e em adequadas condições de funcionamento tem-se
obtido cerca de 61 L de etanol/100 kg de sacarose em um processo bem conduzido.
Na Tabela 02, pode-se verificar quais são os subprodutos gerados durante a fermentação.
Tabela 02 - Rendimento ótimo de fermentação de leveduras em condições anaeróbicas, (LIMA, 2002) e (MARCONDES, 2002)
Produtos Massa (g) de Produto /100 g de Glicose
Etanol 48,4Dióxido de carbono 46,6Glicerol 3,3Ácido succínico 0,6Massa de células 1,2
A bioconversão da glicose em etanol é representada pela Figura 06, conforme citado
por PELCZAR et al. (2004). A glicose é convertida em piruvato pela glicólise, e o piruvato é
convertido em etanol e CO2 em um processo com duas etapas. Na primeira etapa o piruvato
sofre a descarboxilação em uma reação irreversível catalisada pelo piruvato descarboxilase.
Essa reação é uma descarboxilação simples e não envolve a oxidação do piruvato. A enzima
piruvato descarboxilase requer Mg+2 e tem uma coenzima firmemente ligada, a tiamina
pirofosfato, que segundo RAHN (1952), citado por MARCONDES et al. (2002), age
14
aumentando a tolerância da levedura ao etanol. Na segunda etapa, por ação da enzima álcool
desidrogenase, o acetaldeído é reduzido a etanol, com o NADH derivado da atividade da
enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase fornecendo o poder redutor. Assim, em vez de
lactato, os produtos finais da fermentação alcoólica são o etanol e o CO2, (LEHNINGER et
al., 2002).
Destaca-se ainda que a levedura Saccharomyces cerevisiae é um aeróbio facultativo,
ou seja, em aerobiose, parte da glicose é transformada em biomassa, CO2 e H2O e em
anaerobiose, a maior parte é convertida em etanol e CO2, processo esse chamado de
fermentação.
Figura 06 – Etapas de redução da glicose a etanol (PELCZAR et al., 2004).
2.2- Meios de cultura
A preparação de meio de cultura semi-sintético visa identificar e selecionar os mais
importantes nutrientes de forma a se estabelecer um processo fermentativo adequado.
FERREIRA (1998), simulando a fermentação alcoólica usando glicose com fonte de carbono,
recomenda a seguinte composição, citada na Tabela 03.
15
Tabela 03 – Composição do meio de cultura semi-sintético (FERREIRA,1998)
Nutrição mineral Concentração em (g/L)
(NH4)2SO4 1,2KH2PO4 2,4Na2HPO4 1,2Glicose variável*MgSO4.H2O 0,3Extrato de levedura 3,0*conforme planejamento experimental.
2.2.1-Aspectos de assepsia e desinfecção
Contaminação biológica e efeitos de infecções podem ser observados em praticamente
todos os processos biotecnológicos. Em geral, os processos contínuos apresentam uma
dificuldade extra, pois é difícil localizar a fonte de contaminação e quando isso acontece todo
o sistema fica comprometido.
GAVA (2004) afirma que o pH relativamente baixo (2 - 4,5) do meio de fermentação
inibe a ação de microrganismos contaminantes e ERGUN(2000) afirma que o pH ideal para a
fermentação alcoólica é de 4,5.
A Figura 07 apresenta uma fermentação tipicamente contaminada com lactobacilos,
onde se pode observar a formação de espuma nos frascos indicados com setas. Ressalta-se
ainda que essa espuma exerce uma influência significativa na homogeneização do meio de
cultura e ainda exige a presença de antiespumantes.
ANGELIS et al. (2001) destacam que a presença de bactérias floculantes, como o
Lactobacillus fermentun, pode causar o assentamento de células de levedura no fundo das
dornas e perdas de células nas centrífugas, já que essas bactérias são contaminantes triviais
das fermentações alcoólicas industriais e conseqüentemente levam a uma diminuição do
rendimento e produtividade do etanol. Outro aspecto importante desse trabalho, é que, na
faixa de pH entre 2 e 5, a floculação é próxima de zero, quando a concentração de
Lactobacillus fermentun foi de 1,38g/L para cada 65,4 g/L de Saccharomyces cerevisiae.
16
Figura 07 - Fermentação contaminada com cultura de lactobacilos e formação de espuma (FERMENTEC, 2005).
2.3- Rendimentos de processos fermentativos
Sabe-se que parte do açúcar presente no meio fermentativo é consumido pela levedura
para sua manutenção, reprodução e às vezes quando o ambiente fermentativo torna-se
agressivo, a mesma consome o substrato de maneira acentuada, não para geração de produtos,
mas sim para sua proteção e manutenção.
A literatura tem avaliado que 5% do açúcar do meio fermentativo é metabolizado para
gerar subprodutos, diminuindo, conseqüentemente, o rendimento da fermentação. Na Tabela
04 apresenta-se os diversos rendimentos encontrados na literatura, bem como os produtos
obtidos durante a fermentação alcoólica.
Tabela 04 - Produtos da fermentação alcoólica, em g/100g de glicose metabolizada, para diferentes rendimentos fermentativos em células livres (BORZANI et al., 2001)
Produto de fermentação
Pasteur95%
JACKMAN (1987) (90-95)%
BASSO et al., (1996) (85-92)%
Etanol 48,5 45 - 49 43 – 47 CO2 46,4 43 – 47 41 – 45 Glicerol 3,3 2 – 5 3 – 6 Ácido succínico 0,6 0,5 – 1,5 0,3 – 1,2 Ácido acético ––– 0 – 1,4 0,1 – 0,7 Óleo fúsel ––– 0,2 – 0,6 –––Butilenoglicol ––– 0,2 – 0,6 –––Biomassa(massa seca) ––– 0,7 – 1,7 1 - 2
17
Segundo STUPIELLO (1984), até 1975, o processo fermentativo tinha
aproximadamente 63% de taxa de conversão para 100 g de açúcar total. Com a incorporação
de leveduras selecionadas, melhor qualidade do mosto, controle da nutrição e de temperatura
do processo, as fermentações em batelada ganharam produtividades fermentativas, chegando
a ciclos completos de 5 a 8 horas e com rendimentos fermentativos de até 92%.
2.4 - Fluxograma simplificado do processo de produção de etanol
A Figura 08 apresenta um fluxograma simplificado para a produção de etanol,
representando apenas as etapas envolvidas no processo fermentativo. É importante ressaltar
que existem vários tipos de usinas e destilarias, destacando as seguintes categorias:
Usinas autônomas: processam a cana-de-açúcar para a produção de vários
tipos de açúcar;
Destilarias autônomas: processam a cana-de-açúcar para a produção de álcool
(hidratado ou anidro);
Destilarias anexas: são unidades próximas as usinas de açúcar que são
capazes de produzir açúcar e álcool hidratado ou anidro.
Figura 08 – Fluxograma simplificado para a produção de etanol (UDOP, 2005).
18
2.5- Descrição ilustrativa do processo industrial de produção de etanol
Os procedimentos básicos de um processo industrial específico para produção de
etanol podem ser descritos pelas seguintes etapas: limpeza da carga de cana-de-açúcar; corte e
desfibrilamento (preparação para a extração do caldo); separação do caldo e bagaço. Esse
caldo que é chamado de caldo misto, é enviado aos aquecedores e depois para um decantador,
onde são separadas as impurezas, obtendo-se o caldo clarificado.
Após resfriamento do caldo clarificado em um trocador de calor, envia-se o mesmo
para o processo fermentativo, onde é adicionada a cultura de leveduras.
A suspensão (caldo + levedura) é incubada em dornas de fermentação por até 8 horas,
obtendo-se um produto intermediário chamado vinho. Após essa etapa, o vinho é
centrifugado, separando-se as leveduras, que são denominadas de leite de levedura, que será
usado em novas fermentações.
O produto centrifugado é chamado de vinho delevedurado (contém até 8% de álcool) e
o etanol (produto final) é separado deste por destilação. Para cada 1L de etanol processado
são gerados 13L de vinhaça e esta é enviada para tratamento para se minimizar impactos
ambientais. Após o término da destilação, obtem-se o álcool hidratado, que é armazenado em
tanques e posteriormente distribuído.
2.6- Imobilização celular
De modo geral, a imobilização celular consiste em “aprisionar” um microrganismo em
determinada matriz chamada suporte (bagaço de cana-de-açúcar, géis como o alginato e
pectina, siltito e crisotila, que é um resíduo da indústria produtora de cerâmica).
Em processos biotecnológicos, a imobilização celular tem-se mostrado uma técnica
promissora, pois permite a operação de fermentação em condições de alta densidade celular,
além de evitar o washout de células durante operações com altas vazões de alimentação e
possibilitar a reutilização das células em sistemas em batelada e contínuo. Em processos de
produção de etanol, por exemplo, existe a possibilidade de ganhos, evitando-se a etapa de
centrifugação e conseqüentemente a economia de energia.
Segundo CARVALHO (2000), a utilização da técnica tem sido recomendada uma vez
que possibilita a obtenção de elevadas concentrações celulares por unidade de volume do
reator, maximiza a fração de meio fermentativo descarregada ao final de cada batelada,
facilita a reutilização dos biocatalisadores, minimiza tempos “mortos” e custos de separação e
confere maior estabilidade às células.
19
O aprisionamento em gel de alginato de cálcio é a técnica mais amplamente utilizada
para a imobilização de células viáveis. O alginato é um polissacarídeo presente em todas as
“algas marrons”, embora poucas espécies sejam comercialmente importantes (CARVALHO,
2000). A gelificação do alginato ocorre rapidamente na presença de íons cálcio sem alterações
drásticas de temperatura, pH e pressão osmótica, o que permite preservar a atividade e a
viabilidade dos microrganismos imobilizados. Além disso, o alginato é um material barato e
facilmente encontrado (BATISTA et al., 1999).
ORIVE et al. (2002) afirmam que a pureza do alginato também é um fator de
biocompatibilidade de microesferas e tem uma influência direta no processo fermentativo.
Outro fator importante que viabiliza a utilização da técnica de imobilização em alginato é a
possibilidade do preparo de grandes quantidades de pellets de maneira fácil e relativamente
rápida.
WENDHAUSEN JUNIOR (1998) apresenta como vantagens do uso de células
imobilizadas:
Processamento através de regime multienzimático;
Maior densidade celular por volume de reator;
Facilidade de separação do meio reacional;
Possibilidade de operar em sistema contínuo com maior controle sobre a
permanência das células dentro do reator;
Utilização de altas taxas de diluição sem possibilidade de eluição do
biocatalisador;
Redução da fase de adaptação do microrganismo (fase lag);
Maior conversão;
Menor inibição pelos produtos formados;
Menor tempo reacional;
Controle do crescimento da biomassa.
COX e NELSON (2002) destacam a importância de sistemas imobilizados e suas
vantagens, como por exemplo, a possibilidade de percolamento de um leito fixo com o meio
fermentativo e a coleta do produto de interesse no efluente.
WENDHAUSEN JUNIOR (1998) descreve os mais diversos métodos de imobilização
de biocatalisadores que tem sido relatados na literatura, e encontram-se destacados na Figura
09.
20
ADSORÇÃO LIGAÇÃO IÔNICA LIGAÇÃO COVALENTE
LIGAÇÃO A SUPORTE SÓLIDO
LIGAÇÃO COVALENTE
RETICULAÇÃO
GEL MICROCÁPSULAS FIBRA
APRISIONAMENTO
FORMAS DE IMOBILIZAÇÃO
Figura 9 - Métodos de imobilização celular (WENDHAUSEN JUNIOR, 1998).
O mais popular método de aprisionamento é o que utiliza matrizes de gel, sendo que
os géis de cálcio são os mais utilizados devido a sua resistência ao ataque por microrganismos
ou enzimas. Um aspecto negativo do método de aprisionamento deve-se as limitações
difusionais do substrato e produto na matriz de gel, que necessitam de estudos mais
detalhados para aperfeiçoamento da metodologia de imobilização celular.
Segundo MATTIASSON (1982), citado por WENDHAUSEN JUNIOR (1998), o
método de reticulação ou ligação cruzada baseia-se na ligação covalente entre moléculas do
biocatalisador, criando aglomerados, através de um agente ligante, como por exemplo,
glutaraldeído. Os microrganismos têm uma tendência natural de aderência sobre superfícies
sólidas, e esse, é o principio da imobilização por adsorção.
FERREIRA (1986) afirma que os problemas mais evidentes relacionados à utilização
da técnica de imobilização de leveduras em gel são:
Vida útil do conjunto suporte / levedura;
Retirada do CO2 produzido na fermentação alcoólica;
Retirada de energia do sistema.
CARVALHO (2000), estudando a imobilização de Candida guilliermondii FTI 20037
em gel de alginato de sódio, verificou que as variações nos parâmetros de imobilização
exerceram influências sobre a estabilidade química do suporte e sobre a capacidade
fermentativa das células imobilizadas, mostrando que estudos no sentido de desenvolver
metodologias e planejamento para técnica de imobilização devem ser estimulados e
desenvolvidos.
Nas Figuras 10 e 11, pode-se observar os tipos de forças de atração e as diversas
formas de imobilização.
21
Forças eletrostáticas Reagente Bifuncional Membrana com microporos
Matriz porosa Fase líquida Canal insolúvel
Figura 10- Características e tipos de suporte utilizados nas diversas técnicas de imobilização,(KOURKOUTAS et al., 2003).
Adsorção em uma superfície Ligação eletrostática em
uma superfície
Ligação covalente em uma superfície
Aprisionamento em matrizporosa
Floculação natural ou agregação
Floculação artificial ou Ligação cruzada
MicroencapsulaçãoMicroencapsulação
interfacial
Contenção entre membrana com microporos
Figura 11- Métodos básicos de imobilização (KOURKOUTAS et al., 2003).
2.7- Coeficiente de partição
A estrutura cinética em uma reação envolvendo células imobilizadas em suportes
inertes pode ser atribuída em parte a mudanças nas concentrações das espécies químicas e a
efeitos locais devido ao efeito de partição e efeito difusional, onde a partição está ligada ao
equilíbrio de fases entre a partícula de gel e o fluido que a envolve. E o efeito difusional está
22
relacionado à resistência a transferência de massa das espécies químicas que difundem no gel,
segundo YAMANÉ et al. (1981), citados por FERREIRA (1986) e GUBULIN (1986).
O efeito de partição aparece devido a uma distribuição desigual da concentração de
solutos na superfície de contato entre a matriz e o fluido adjacente, em geral expresso por uma
constante de equilíbrio definida como coeficiente de partição, Kp, (FERREIRA,1986).
Em equilíbrio termodinâmico tem-se que:
iGPi
iF
CK
C(1)
onde:
PiK ..............Coeficiente de partição da espécie química i;
iGC .............Concentração da espécie química i no interior da matriz;
iFC .............Concentração da espécie química i no interior do fluido adjacente
(solução externa á partícula gelatinosa).
INCROPERA (2002) afirma que para mecanismos de difusão dos líquidos em sólidos
não existem teorias gerais disponíveis e apenas resultados limitados são encontrados na
literatura.
De acordo com a lei da conservação de massa, a taxa na qual a massa de uma
determinada espécie entra em um volume de controle menos a taxa na qual a massa da espécie
deixa o volume de controle deve ser igual a taxa na qual a massa da espécie é armazenada no
mesmo volume de controle.
Tomando um pellet como volume de controle, de acordo com a Figura 12, tem-se que
o balanço de massa correspondente à entrada de substrato A é dado pela Equação 2:
23
Figura 12- Representação esquemática do pellet com a entrada do substrato e saída do
produto.
A, entra A, gerado A, sai A, armazenadoFluxo de Massa Fluxo de Massa -Fluxo de Massa Fluxo de MassadMA
dt
(2)
Para o caso de coordenadas esféricas tem-se que:
2 *2 2 2 2
1 1 1 sinr sin r sin
A A AAB AB AB A
Ax x xD r D D N
r r r t
C
(3)
HANDRIKOVÁ (1996), utilizando alginato de cálcio como suporte, propôs o modelo
descrito pela Equação 4 para coeficiente de difusão efetivo, baseado na cinética de Monod. O
modelo proposto baseia-se na dependência entre a taxa de reação por unidade de volume da
partícula (r0), em regime isotérmico e a partícula homogênea:
03 e s
r R
D dCr
R dr(4)
O gradiente de concentração de substrato Cs na superfície da partícula é obtido
resolvendo-se a equação reação-difusão abaixo:
24
2
22
2 0S S Se X
m S
d C dC CD K C
dr r dr K C (5)
Com suas condições de contorno:
0 0S
S s
dCr
drr R C C b
(6)
CSb ---- Concentração de substrato na fase bulkCx ---- Concentração celularCS ---- Concentração de substrato na superfície da partícula De ---- Coeficiente de difusão efetivo K2 ---- Parâmetro da equação de Monod Km ---- Parâmetro da equação de Monod
Resolvendo-se as Equações (5-6) tem-se o modelo para o cálculo do coeficiente de
difusão efetivo em alginato de cálcio, Equação 7 (HANDRIKOVÁ, 1996):
0S Sb S P
P P
V dC V dCr
V dt V dtb (7)
HANDRIKOVÁ (1996) afirma que na concentração de 100mM de glicose, a 300C e
utilizando um reator batelada o De (coeficiente de difusão efetivo) é de 2,9.10-10 m2s-1.
2.8- Projeto de experimentos
A ferramenta estatística de planejamento de experimentos e superfícies de resposta,
RSM (Response Surface Methodology), não é nova, ela foi proposta por Box nos anos de
1950 e apresenta as mais diversas possibilidades de aplicações, como por exemplo, a redução
do teor de oxigênio dissolvido em cervejas e otimização de processos de fermentação.
Com o desenvolvimento da tecnologia e novas propostas para as ferramentas da
qualidade como TQM (Total Quality Managemente) e JIT (Just in Time), a técnica de
planejamento de experimentos ganhou destaque com a implementação da metodologia Six-
Sigma, que é mais uma filosofia de trabalho do que uma simples técnica matemática. Segundo
25
essa metodologia, todos os processos operando no “estado” Six-Sigma geram apenas 3,4
defeitos por milhão de ensaios (NETO, 2001).
Em geral, o planejamento composto central (PCC) deve ser utilizado quando se deseja
verificar a existência de uma curvatura da função objetivo, ou seja, quando se deseja verificar
a existência de termos não lineares no modelo de regressão. Esse tipo de planejamento
consiste de uma parte referente ao planejamento fatorial 2k, com nF corridas, 2k corridas
axiais ou estrela e nC corridas centrais (CALLADO et al., 2001).
Quatro diferentes modelos podem ser testados seqüencialmente no planejamento
composto central:
Somente termos lineares dos efeitos principais;
Termos lineares e quadráticos dos efeitos principais;
Termos lineares dos efeitos principais e interações de segunda ordem;
Termos lineares e quadráticos dos efeitos principais e interações de segunda ordem.
A técnica de planejamento visa mostrar como os fatores (variáveis envolvidas no
processo) podem influenciar determinada resposta, como por exemplo, a produtividade. A
função que descreve essa influência é chamada de superfície de resposta (NETO et al., 2001).
Segundo MONTGOMERY e CALLADO (2001), quando as variáveis criticas não são
conhecidas é necessário aplicar um experimento varredura (o screen experiment), que visa
exatamente determinar quais são as variáveis mais importantes e que resultam em um melhor
desempenho do processo.
O planejamento, nesse aspecto, tem se apresentado como uma poderosa ferramenta de
análise, possibilitando o conhecimento do “melhor” caminho a ser investigado durante a
realização dos ensaios, para se evitar o estudo de “regiões” que não são relevantes na
investigação pretendida.
Como em procedimentos experimentais nem sempre é possível realizar a repetição de
ensaios, devido ao fator custo operacional e tempo, necessita-se do desenvolvimento de
ferramentas estatísticas de reconhecimento de anomalias nos resultados. O teste de Grubbs,
reconhecido pela International Organization for Standardization (ISO), é uma dessas
ferramentas. Ele admite a distribuição normal e compara a norma, medida em desvio padrão,
do valor duvidoso em relação à média do conjunto de valores. Assim, o valor duvidoso é
incluído no cálculo da média e do desvio padrão (NETO et al., 2001).
A expressão para o cálculo do teste é dada pela Equação 8, onde Xa é o valor anômalo
26
do ensaio , X o valor médio dos ensaios e o desvio padrão. Se o valor do teste for maior
que o limite crítico tabelado, então o valor duvidoso é considerado anômalo.
(8)aX XG
Segundo NETO et al. (2001), uma das vantagens dos planejamentos compostos
centrais é que, por serem formados com três partes distintas, pode-se construí-los
seqüencialmente, conforme a necessidade. Se a análise estiver acontecendo em uma região da
superfície de resposta em que a curvatura não é importante, então não se precisa de um
modelo quadrático, e pode-se ter uma análise significativa com apenas a parte fatorial do
planejamento, com a qual pode-se ajustar um modelo linear e em seguida deslocar-se para a
região de interesse da superfície de resposta. Usando-se os ensaios dos pontos centrais pode-
se testar a significância da curvatura e se esta se mostrar significativa, pode-se completar o
planejamento com os pontos axiais.
2.8.1- Aplicação da função desirability em bioprocessos
A quantidade de fatores envolvidos no desempenho de bioprocessos e os respectivos
efeitos da interação entre os mesmos, tornam a análise e a otimização de processos um
procedimento complexo. Quando o número de fatores significativos em um processo é igual
ou superior a três não é mais possível a sobreposição das curvas de nível para todas as
respostas estudadas afim de se visualizar a região de ótimo e mesmo quando, apenas dois
fatores são significativos, a otimização simultânea de todos os fatores só é possível se a região
tida como ótima dos níveis dos dois fatores for a mesma para todas as respostas estudadas. É
evidente que a medida que o número de fatores aumenta, a análise torna-se ainda mais difícil
de ser realizada.
Segundo NETO (2001), um problema de otimização com várias respostas Y1 , Y2 ,..,
Yn , para o qual existe um modelo baseado no mesmo conjunto de fatores codificados X1 , X2
,..., Xn, consiste em identificar os níveis dos fatores que produzirão o conjunto de respostas
mais adequadas. Dessa forma, se o número de fatores significativos Xi gerar um modelo
ajustado, e ainda, se o número de respostas Yi não for superior a 2, pode-se sobrepor as
superfícies de resposta e localizar a região de ótimo por inspeção visual. A otimização de uma
27
resposta poderá ser realizada por técnicas de programação matemática se as demais respostas
estiverem sujeitas a determinadas restrições impostas para cada processo específico.
Para que todos os fatores operem simultaneamente em seus níveis otimizados, pode-se
aplicar a metodologia de otimização simultânea proposta por DERRINGER et al. (1980). A
metodologia consiste em transformar cada resposta Yi em uma função, que se define função
de desejabilidade (desirability) di , com valores restritos ao intervalo [0,1], conforme:
di = 1 A resposta Yi está no seu valor desejável;
i0,80 d < 1 A resposta Yi está excelente;
i0,63 d < 0,80 A resposta Yi está adequada;
i0,40 d < 0,63 A resposta Yi está aceitável, mas pobre;
i0,30 d < 0,40 A resposta Yi está no limite de aceitabilidade;
i0 d < 0,30 A resposta Yi está fora da faixa adequada;
As funções de desejabilidade para todas as respostas são combinadas em uma função
chamada desejabilidade global (D), que é a média geométrica das m desejabilidades
individuais e é dada pela Equação (1) (STEUER, 1999).
1 2 . . . .mmD d d d (9)
A otimização simultânea das várias respostas se reduz a maximização da
desejabilidade global (D). Dessa maneira, a otimização está condicionada em se determinar
quais são os di que levam ao D global máximo. Dessa forma, todas as vezes em que um valor
de di estiver fora da faixa adequada, a desejabilidade global será anulada, independentemente
dos valores das demais respostas.
De acordo com MONTGOMERY e CALLADO (2001), as funções individuais de
desejabilidade são estruturadas como:
Maximização: para que um valor desejado ótimo T seja máximo para uma resposta Y,
tem-se uma função desejabilidade definida conforme a Equação (10), onde L é o
menor valor aceitável para a resposta.
28
'
0 se
se
1 se
S
Y L
Y Ld
T L
Y T
L Y T (10)
Minimização: para que um valor desejado ótimo T seja mínimo para uma resposta Y,
tem-se uma função desejabilidade definida conforme a Equação (11), onde U é o
maior valor aceitável para a resposta Y.
'
1 se
se
0 se
t
T Y
U Yd T
U T
Y U
Y U (11)
Função bilateral: a função bilateral de desejabilidade é aquela em que o valor desejado
T está localizado entre o limite inferior (L) e o limite superior (U) e é definida segundo
a Equação (12).
'
'
0 se
se
se
0 se
S
t
Y L
Y LL Y T
T Ld
U YT Y U
U T
Y U
(12)
Nas Equações (10)- (12), S’ e t’ são os parâmetros que definem a variação da taxa de
desejabilidade com a resposta. Variando-se S’ e t’, pode-se acelerar ou retardar a
desejabilidade e atribuir diferentes valores aos diversos níveis de resposta. Valores altos de S
e t, farão com que a desejabilidade decresça rapidamente, tornando-se muito baixa exceto
quando Y está perto do valor ótimo. Valores baixos de S’ e t’ farão com que a resposta tenha
uma variação mais ampla sem que a desejabilidade seja diminuída (NETO, 2001). A escolha
dos parâmetros S’ e t’ é determinada de acordo com a prioridade que se atribui a cada resposta
29
di. Assim, a taxa de variação ou queda da desejabilidade não precisam ser simétricas em torno
de T.
De acordo com NETO (2001) depois de se identificar o conjunto de condições que
maximizem ou minimizem a desejabilidade global, é necessário analisar o comportamento
individual de cada uma das respostas e verificar se as mesmas estão em regiões tecnicamente
possíveis e com suas restrições perfeitamente atendidas.
A variação dos parâmetros S’ e t’ gera um conjunto de soluções otimizadas e a própria
variação entre essas soluções indica o quanto é robusta a condição experimental avaliada.
Assim, se as soluções forem insensíveis a variação de S’ e t’, o procedimento experimental
está bem posto.
2.9 -Modelagem e simulação
Poucos trabalhos na literatura mostram o uso de modelos matemáticos para prever
taxas de difusão de substratos e produtos em células imobilizadas, considerando que a
principal desvantagem no procedimento de imobilização é a limitação imposta pelos
processos difusivos nos pellets (BRODELIUS e VANDAMME, (1987), citados por
CARVALHO, 2000).
SILVA (2001), utilizando fermentação alcoólica contínua e extrativa e trabalhando
com modelos empíricos, afirma que conseguiu uma conversão de 99,2% dos açúcares (glicose
e sacarose) do meio de alimentação e uma produtividade de 21,0 g/(h L).
Existem diversos modelos para determinação de parâmetros cinéticos para
fermentação na literatura. Segundo BAILEY et al. (1986), os modelos cinéticos podem ser
descritos segundo a Tabela 05 abaixo:
Tabela 05 – Classificação dos modelos cinéticos (BAILEY et al.,1986)
Modelos Cinéticos
Tipos Características
Não-estruturados e não-segregados Células são consideradas como solutos.
Estruturados e não-segregados Células são indivíduos múltiplos componentes,com composição média semelhante.
Não-estruturados e segregados Células são seres individuais distintos, masdescritos por um único componente.
Estruturados e segregados Células são seres individuais distintos, masdescritos por múltiplos componentes.
30
Segundo BIROL (1998), são citados na literatura 11 equações de modelos cinéticos,
conforme as Tabelas 06, 07 e 08.
Tabela 06 – Modelos cinéticos sem inibição (BIROL, 1998)
ModelodX
dt
dS
dt
dP
dt
Monod maxsx
SX
K S maxsp
Sq X
K S / /
1 1
x s p s
dX dP
Y dt Y dt
Moser max
n
nsx
SX
K S max
n
nsp
Sq X
K S / /
1 1
x s p s
dX dP
Y dt Y dt
Teisse max 1 expsx
SX
K max 1 expsp
Sq X
K / /
1 1
x s p s
dX dP
Y dt Y dt
Tabela 07 – Modelos cinéticos com inibição pelo substrato (BIROL, 1998)
Autor dX
dt
dS
dt
dP
dt
Noack m a x
1 s x
s x
SX
K S
S K
m a x,
,
1 S P
I P
Sq X
K SS K
/ /
1 1
x s p s
dX dP
Y dt Y dt
Aiba max,
expsx I S
S SX
K S K max, ,
expS P I P
S Sq X
K S K / /
1 1
x s p s
dX dP
Y dt Y dt
Luong max,max
exp 1n
sx S
S SX
K S S max, ,
exp 1n
S P P
S Sq X
K S S max / /
1 1
x s p s
dX dP
Y dt Y dt
Segundo BIROL (1998), os modelos de Monod e Hinshelwood foram os mais
adequados para a simulação no sistema batelada utilizando células de Saccharomyces
cerevisiae em alginato, mas esse fato foi função de faixas muito estreitas de concentração de
substrato.
31
Tabela 08 – Modelos cinéticos com inibição pelo produto (BIROL, 1998)
AutordX
dt
dS
dt
dP
dt
Levenspiel maxmax
1n
sx x
S PX
K S P max, ,max
1n
S P P
S Pq X
K S P/ /
1 1
x s p s
dX dP
Y dt Y dt
Aiba max exp pssx
SK P X
K S max ,,
exp PPS P
Sq K P X
K S / /
1 1
x s p s
dX dP
Y dt Y dt
Jerusalimsky ,max
,
I px
sx I px
KSX
K S K P,
max, ,
I px
S P I PP
KSq X
K S K P/ /
1 1
x s p s
dX dP
Y dt Y dt
Ghose-Tyagi max,max
1x
PX
Pmax
,max
1p
Pq X
P / /
1 1
x s p s
dX dP
Y dt Y dt
Hinshelwood max 1 pxsx
SK P X
K S max ,,
1 PPS P
Sq K P X
K S / /
1 1
x s p s
dX dP
Y dt Y dt
32
CAPÍTULO 03 – MATERIAIS E MÉTODOS
3.1-Microrganismo e preparo do inóculo
O microrganismo utilizado nessa dissertação foi a levedura Saccharomyces cerevisiae,
na sua forma liofilizada e produzida pela empresa Mauri do Brasil. A cepa da levedura
utilizada foi a Y904 que é destinada para a produção de etanol. Para a sua utilização, a mesma
foi hidratada segundo metodologia proposta por FERREIRA (1998), onde a massa de
fermento é adicionada a um balão de 0,100 L que tem seu volume preenchido com água
destilada. Em seguida, essa solução celular é transferida para um Erlenmeyer de 0,250 L e
levada para um incubador rotativo a uma temperatura aproximada de 25oC por 2 horas. Após
a hidratação, os inóculos são preparados para a imobilização em gel alginato de cálcio,
segundo as condições do planejamento estatístico proposto.
Os reagentes e materiais utilizados nas análises e na preparação do meio de cultura
foram os produtos analíticos (PA) apresentados na Tabela 09.
Tabela 09 - Lista de Reagentes e Materiais utilizados nos ensaios de fermentação
Reagentes e Materiais
Reagentes Materiais
Ágar malte Pipeta de 1mL / Volumétrica Kitassato de 2000 mLÁgua destilada Pipeta de 5 mL / Volumétrica Erlenmeyer de 2000mLAlginato de sódio Pipeta de 10 mL/Volumétrica Erlenmeyer de 500mLCloreto de cálcio Pipeta de 50 mL/Volumétrica Erlenmeyer de 250mLCitrato de potássio Pipeta de 10 mL Erlenmeyer de 125 mLCél. de Saccharomyces cerevisiae Pipeta de 50 mL Erlenmeyer de 50mLGlicose Bastão de vidro Provetas de 500 mLSulfato de amônio Tubo Folin Wu Provetas de 100 mLSulfato de magnésio heptahidratado Mangueiras Tubos de Centrifuga Dihidrogenofosfato de potássio Luvas assépticas Paquímetro de precisãoMonohidrogenofosfato de sódio Tocas assépticas Papel alumínioNitrato de alumínio Algodão PapelAzul de metileno Gaze Tubos de Vortex Sulfato cúprico Pêra Álcool hidratado Dicromato de potássio Termômetro digital Luvas de amiantoEtanol Válvulas globo Tubos de ensaios Sal de Seignette Pissete Agulhas cirúrgicas
O meio de cultura sintético foi preparado segundo FERREIRA (1998) e é apresentado
33
na Tabela 10. Destaca-se que o mesmo não sofreu nenhum tipo de processo de esterilização
ou processo asséptico e apenas seu pH foi ajustado para 4,5 conforme relatado por ERGUN
(1999).
Tabela 10 – Composição do meio de cultura sintético (FERREIRA, 1998)
Nutrição mineral Concentração( g/L)
(NH4)2SO4 1,2KH2PO4 2,4Na2HPO4 1,2Glicose variável*MgSO4.H2O 0,3Extrato de levedura 3,0
*Conforme planejamento experimental.
3.2- Técnicas utilizadas nos ensaios
3.2.1-Métodos analíticos
A concentração celular do inóculo foi determinada em espectrofotômetro a 650nm a
partir da suspensão de células devidamente diluída em água destilada. Uma curva de
calibração foi estabelecida para correlacionar o peso seco (g/L) de células livres e
imobilizadas com a absorbância a 650nm. A determinação da concentração celular (células
livres) no meio fermentativo, ao longo de todos os ensaios, foi realizada através da mesma
técnica.
A concentração de células imobilizadas foi quantificada a cada intervalo de 2 horas,
recolhendo-se uma amostra composta por 5 pellets de alginato do fermentador e colocando-os
na presença de uma solução de citrato de potássio 4% (p/v), onde os mesmos foram
dissolvidos e centrifugados a 10.000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante da centrifugação foi
descartado e o material sólido contido no frasco da centrífuga foi colocado em suspensão e
diluído com água destilada em balão de 0,025L. Após essa etapa, a solução obtida foi levada
ao espectrofotômetro e teve sua leitura realizada em cubeta de vidro a 650nm para
determinação da concentração de células.
Para a quantificação do etanol, foi utilizado o método do dicromato de potássio, onde
uma amostra do meio de cultura foi centrifugada a 10.000 rpm e o sobrenadante foi levado ao
34
balão de destilação junto com uma alíquota de 0,075L de água destilada. Uma nova amostra
foi recolhida do destilado e adicionou-se 0,002L de dicromato de potássio à mesma. A
solução amostra/dicromato foi aquecida em banho a 600C por 30 minutos em um tubo Folin
Wu. Após o aquecimento, deixou-se o material em repouso à temperatura ambiente para
resfriamento, quando uma amostra foi coletada para análise em espectrofotômetro operando a
600nm (FERREIRA , 1998).
A determinação de açúcares redutores (glicose), foi determinada pelo método de
Eynol-Lane modificado, segundo citado por FERREIRA (1986). O método baseia-se na
titulação da amostra a ser analisada com uma solução de sulfato cúprico e uma solução
alcalina do sal de Seignette, usando o azul de metileno com indicador. Destaca-se que a
titulação foi realizada à quente.
Além das análises de concentração de células, etanol e glicose, avaliou-se o raio médio
dos pellets com o software de processamento de imagens Global Lab®.
3.2.2- Procedimentos Experimentais
a) Seleção do fermento para ensaios de fermentação
Sabe-se que existem diferentes tipos de fermento biológico no mercado e esses
fermentos visam atender as mais diversas aplicações (desde as grandes usinas produtoras de
álcool até as pequenas panificadoras).
Na impossibilidade de se trabalhar com culturas puras e/ou geneticamente modificadas
para maximização de eficiência, foi realizado um ensaio estatístico (quadruplicata) do tipo:
Único fator (tipo de fermento);
Única resposta (concentração máxima de etanol produzida).
A partir das análises realizadas, determinou-se um intervalo de confiança para a
verificação da existência de diferenças significativas entre as médias dos ensaios e
conseqüentemente, a existência da diferença entre os vários tipos de fermento investigados.
Os ensaios foram realizados em reator de mistura da marca New Brunswick, modelo
MultiGen, com volume útil de 2L (Figura 14), operando em regime descontínuo.
35
Figura 13 - Reator utilizado nos ensaios fermentativos.
b) Técnicas de imobilização da levedura Saccharomyces cerevisiae em alginato de cálcio
O inóculo obtido foi imobilizado em gel alginato de cálcio previamente preparado
segundo proposto pelos planejamentos experimentais, onde os fatores estudados em uma
etapa de varredura foram: concentração de alginato de sódio, concentração de cloreto de
cálcio e tempo de cura, conforme metodologia apresentada por CARVALHO (2000). Os
pellets foram obtidos pelo gotejamento do alginato de sódio em solução de cloreto de cálcio
nas concentrações propostas no planejamento (0,1M, 0,15M e 0,2M). As partículas com as
células imobilizadas foram mantidas em solução de cloreto de cálcio a 4oC durante 0, 12 e
24h e após esse período, lavadas com água destilada e usadas nas fermentações.
Na realização do planejamento fatorial fracionado, o tempo de cura em todos os
ensaios foi mantido em torno de 30 minutos e as partículas foram tratadas com Al(NO3)3 por
5 minutos conforme proposto por ROCCA et al. (1995).
c) Preparação dos pellets de alginato de cálcio
A obtenção de pellets com diâmetro padronizado conforme a necessidade exigida pelo
planejamento foi realizada com a utilização de procedimentos diferenciados de gotejamento
do alginato de sódio em solução de cloreto de cálcio utilizando-se o sistema experimental
apresentado na Figura 14. A avaliação das dimensões das particulas produzidas foi efetuada
36
com o software de processamento de imagens Global Lab®. Esse software faz a digitalização
da imagem, possibilitando a avaliação do número de pellets e apresentando o raio médio
equivalente de cada pellet. A confecção de pellets para uma escala industrial pode seguir
procedimento sugerido por BRANDENBERG (1998).
Figura 14 – Equipamento utilizado na imobilização e confecção dos pellets.
A Figura 15 apresenta uma amostra representativa dos pellets obtidos pelo
procedimento de preparação utilizando a técnica de gotejamento com “ponteiras”
selecionadas (Figura 16) para fornecerem os diferentes diâmetros exigidos pelo planejamento
experimental.
Figura 15 – Amostra representativa dos pellets de alginato de cálcio obtidos e o padrão de medida (diâmetro externo de15mm) usado no software Global Lab®.
37
Figura 16 – “Ponteiras” usadas para obtenção dos pellets de diferentes diâmetros e padrão de medida (diâmetro externo de15mm).
A Figura 17 apresenta imagens de pellets analisadas pelo software de varredura e
tratamento de imagens. Para avaliação dos diâmetros, o software converte o diâmetro do
padrão em pixels e através de comparação, determina o diâmetro médio das imagens
selecionadas. Após essa análise, o software de tratamento de imagens fornece os raios médios
dos pellets, possibilitando, assim, a avaliação do desvio padrão para os raios calculados.
(a) (b) (c) Figura 17 – Processamento de imagens dos pellets: (a) imagem processada; (b) determinaçãodos diâmetros de cada partícula; (c) avaliação do número de partículas para determinação do
raio médio do conjunto de partículas.
3.3-Planejamento de Experimento
3.3.1 – Planejamento Varredura
A técnica de varredura (Screen experiment) é uma técnica usada para verificar quais
variáveis são importantes para descrever um processo (CALLADO et al., 2003). NETO et al.
(2001) afirmam que não existe uma técnica para se determinar quais os níveis e fatores que
são mais significativos no processo e que essa escolha é feita empiricamente segundo
38
características de cada processo, assim esse planejamento visou identificar os parâmetros mais
importantes para a maximização da fermentação alcoólica.
Segundo CALLADO et al. (2003), o algoritmo de Piepel e Snee pode ser utilizado
para se encontrar os vértices e os centróides da região de estudo e suas restrições. Nos ensaios
propostos, o algoritmo utilizado considerou cada restrição escrita na forma linear, onde cada
restrição representa uma linha através da região experimental e para cada restrição, avalia-se
se a restrição é atendida ou não. Se isso não acontece, novos vértices são calculados,
definindo assim uma nova região experimental, que é atualizada à medida que nova restrição
é analisada. Após a definição da região final do planejamento, os centróides dos lados são
calculados e representam os pontos do planejamento que são utilizados para o estudo
experimental (Figura 18).
Figura 18 –Diagrama de dispersão dos pontos do planejamento gerado.
As restrições definidas para os ensaios realizados, são:
1 (% p/v) concentração de alginato de sódio 2 (% p/v)
0,1 M concentração de cloreto de cálcio 0,3M
0 h tempo de cura 24h
A Tabela 11 apresenta os fatores e os diferentes níveis estudados no planejamento do tipo
39
varredura e a Tabela 12 (contendo os fatores e níveis codificados) apresenta um esquema
do planejamento fatorial completo 23, que foi utilizado para se avaliar os efeitos
principais e as interações entre as variáveis (concentração de alginato de sódio,
concentração de cloreto de cálcio e tempo de cura) na região de estudo.
Tabela 11 - Fatores e níveis do planejamento fatorial tipo varredura
NÍVEISFATORES
-1 0 +1
Concentração de alginato de sódio (% p/v) 1 1,5 2Concentração de cloreto de cálcio (M) 0,1 0,15 0,2Tempo de cura (h) 0 12 24
nível superior: +1; nível inferior: -1 ; nível central: 0
Tabela 12 - Matriz do planejamento experimental fatorial completo 23 com fatores e níveis codificados
Ensaios Concentração de cloreto
Concentração de alginato
Tempo decura
1 - 1 -1 - 1
2 +1 - 1 - 1
3 - 1 +1 - 1
4 +1 +1 - 1
5 - 1 - 1 +1
6 +1 - 1 +1
7 - 1 +1 +1
8 +1 +1 +1
3.3.2- Planejamento tipo fatorial composto central
Nesse planejamento procurou-se verificar a influência dos diâmetros dos pellets no
processo fermentativo e caso exista, um valor que maximize a eficiência do processo
fermentativo. Nas Tabelas 13 e 14, tem-se os fatores e níveis do planejamento composto
central e a matriz do planejamento composto central 34-1 contendo os fatores e níveis
40
codificados, respectivamente.
Tabela 13 - Fatores e níveis do planejamento composto central
NÍVEISFATORES
- -1 0 +1 +
Concentração de alginato de sódio (% p/v) 2,0 2,2 2,5 2,8 3,0Concentração de cloreto de cálcio (M) 0,05 0,10 0,18 0,26 0,30Concentração de glicose (g/L) 30,00 41,35 65,00 88,65 100,00Diâmetro do pellet (mm) 3,1 3,5 4,2 4,9 5,2
nível superior: +1; nível inferior: -1 ; nível central: 0 e níveis : + =1,48 e - =-1,48
A Tabela 14 apresenta o planejamento proposto do tipo 34-1. Destaca-se que os 16
primeiros ensaios representam um planejamento do tipo 24. Assim, a maneira como foi
estruturado a seqüência de ensios permitiu avaliar, após os primeiros 16 ensaios, se o
diâmetro era um fator estatisticamente significativo no processo operando em regime
batelada. Caso a conclusão fosse positiva, o planejamento proposto seria executado e em caso
negativo ter-se-ía que definir um novo fator.
Na fração do planejamento composto central pode-se verificar se existe interação entre
o diâmetro e outros fatores e se ela é significativa ou não, no nível de confiança estudado.
3.3.3- Investigação da função desirability em bioprocessos
A função de desejabilidade permite otimizar simultanemente os níveis de fatores de
interesse para a maximização do rendimento da fermentação. O modelo adotado foi o de
maximização com valor s’=1 (Equação 10). Utilizando-se os dados experimentais obtidos
para todos os ensaios com 40 níveis simulados, pode-se avaliar a desejabilidade global dos
ensaios realizados. Nesse caso tem-se uma combinação 40x40x40 para o experimento
varredura e uma combinação 40x40x40x40 para o planejamento composto central.
41
Tabela 14 - Matriz do planejamento experimental fatorial composto central 34-1 contendofatores e níveis codificados
EnsaioConcentração de
Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet (mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)
1 - 1 - 1 - 1 - 1
2 +1 - 1 - 1 - 1
3 - 1 +1 - 1 - 1
4 +1 +1 - 1 - 1
5 - 1 - 1 +1 - 1
6 +1 - 1 +1 - 1
7 - 1 +1 +1 - 1
8 +1 +1 +1 - 1
9 - 1 - 1 - 1 +1
10 +1 - 1 - 1 +1
11 - 1 +1 - 1 +1
12 +1 +1 - 1 +1
13 - 1 - 1 +1 +1
14 +1 - 1 +1 +1
15 - 1 +1 +1 +1
16 +1 +1 +1 +1
17 0 0 0 0
18 - 0 0 0
19 + 0 0 0
20 0 - 0 0
21 0 + 0 0
22 0 0 - 0
23 0 0 + 0
24 0 0 0 -
25 0 0 0 +
42
CAPÍTULO 04 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1- Avaliação dos diferentes tipos de fermento biológico
Dois diferentes tipos de fermentos biológicos disponíveis no mercado foram avaliados
estatisticamente com o objetivo de se determinar qual apresentava melhor rendimento
fermentativo e condições de operacionalidade adequada.
A Tabela 15 apresenta os resultados do desempenho fermentativo de dois tipos de
fermentos disponíveis e utilizando o meio de cultura proposto por FERREIRA (1998) com
glicose como fonte de carbono. Os resultados foram expressos em concentração de etanol e
em rendimento Pasteur.
Tabela 15 – Avaliação estatística entre os fermentos biológicos disponíveis no mercado
Fermento (A) Fermento (B) d = XA - XBEnsaios
Fermentativos (1) Etanolg/L
RendimentoPasteur
Etanolg/L
RendimentoPasteur
Etanolg/L
RendimentoPasteur
1 22,55 92,97 17,50 72,14 5,05 20,832 22,31 92,00 17,53 72,27 4,79 19,733 22,94 94,45 16,96 69,93 4,98 24,524 22,50 92,78 17,56 72,42 4,94 20,36
Média 22,58 93,05 17,39 71,69 4,94 21,36
Desvio Padrão 0,277 1,023 0,286 1,179 0,111 2,154
Graus de Liberdade 3 3 3 3 3 3
(1)- Concentração de etanol (Pf em g/L) ao término de 04 horas de fermentação com S0 = 50g/L e X0=10g/L(A)- Fermento biológico seco instantâneo: Massa doce (B)- Fermento biológico fresco instantâneo
Após avaliação estatística, utilizando o teste t-student, obtivemos um tcalculado
=2,83x10-7, contra um valor tabelado de 614. Pode-se afirmar então, com nível de confiança
de 95%, que existe uma diferença na média dos resultados, concluindo portanto que o
fermento A é mais eficiente que o fermento B e essa eficiência encontra-se na ordem de 20%
de superioridade.
Essa é uma informação significativa, pois todos os ensaios são dependentes desse
resultado e influem diretamente na resposta do planejamento, comprovando que a escolha do
43
microrganismo a ser utilizado tem impacto direto sobre a produtividade e eficiência
fermentativa. Dados cinéticos dessa avaliação, encontram-se nas Figuras 19 e 20,
respectivamente.
Figura 19 – Perfis de concentração de etanol, glicose e células livres para o fermento tipo A.
Figura 20- Perfis de concentração de etanol, glicose e células livres para o fermento tipo B.
4.2- Avaliação das distribuições dos diâmetros dos pellets obtidos
A Tabela 16 apresenta os raios médios obtidos durante os ensaios e calculados pelo
software de processamento de imagens com médias indicadas em negrito. Os resultados
mostram que não houve dispersão significativa dos raios obtidos, validando assim a proposta
do planejamento e do procedimento experimental de confecção dos pellets.
44
Tabela 16 –Raios médios para partículas confeccionadas nas 5 faixas analisadascom software de processamento de imagens
Raios médios obtidos ( mm )
R1 R2 R3 R4 R5
1,5 2,3 1,7 2,1 2,51,5 2,3 1,7 2,1 2,51,5 2,3 1,7 2,1 2,51,5 2,3 1,7 2,1 2,61,5 2,3 1,6 2,1 2,51,5 2,3 1,7 2,1 2,51,5 2,3 1,7 2,1 2,51,6 2,3 1,7 2,1 2,61,6 2,3 1,7 2,1 2,61,6 2,6 1,7 2,2 2,61,6 2,6 1,7 2,2 2,61,6 2,6 1,7 2,2 2,61,6 2,6 1,7 2,2 2,61,6 2,6 1,7 2,2 2,61,6 2,6 1,7 2,2 2,61,6 2,6 1,7 2,2 2,61,6 2,6 1,8 2,2 2,61,6 2,3 1,7 2,2 2,61,6 2,3 1,8 2,2 2,61,6 2,7 1,7 2,2 2,71,6 2,7 1,8 2,2 2,71,6 2,7 1,8 2,2 2,71,6 2,5 1,8 2,2 2,71,6 2,5 1,8 2,2 2,71,6 2,5 1,8 2,2 2,61,6 2,3 1,8 2,2 2,61,7 2,7 1,8 2,3 2,7
Valores médios dos raios1,57 2,47 1,72 2,16 2,59
4.3- Avaliação do planejamento fatorial completo a dois níveis do tipo 23
A realização desse planejamento tem como objetivo a verificação dos fatores mais
importantes no fenômeno de imobilização e visa a identificação de quais fatores são mais
significativos na melhoria do processo fermentativo.Trata-se, então, de um planejamento que
tem um caráter de varredura, pois o mesmo não é capaz de identificar pontos de máximo,
mínimo ou sela, se eles existirem, o que a princípio é uma limitação para uma possível
otimização ou minimização local. O planejamento utilizou como resposta a concentração de
etanol ao final de 5 horas de batelada e uma concentração inicial de 30g/L de glicose.
45
A Tabela 17 apresenta os fatores e níveis estudados e a resposta obtida em cada
ensaio com uma correlação superior a 0,98, ou seja, o modelo é capaz de explicar a
variabilidade dos ensaios em 98% dos casos (R2= 98,32%). É possível observar que as
restrições estudadas mostraram que a região delimitada por um cubo, são as regiões onde os
estudos a dois níveis devem ser executados, comprovando a eficiência do algoritmo de Piepel.
Tabela 17 – Planejamento 23 e a resposta obtida nos ensaios
Ensaios Concentraçãode cloreto
Concentraçãode alginato
Tempo de cura
Concentraçãode Etanol
RendimentoPasteur (%)
1 - 1 - 1 - 1 13,2 90,42 +1 - 1 - 1 14,0 95,93 - 1 +1 - 1 12,4 84,94 +1 +1 - 1 12,1 82,95 - 1 - 1 +1 13,1 89,86 +1 - 1 +1 12,3 90,47 - 1 +1 +1 12,2 83,48 +1 +1 +1 9,5 65,1
A Figura 22 apresenta o comportamento das médias marginais dos ensaios realizados.
Pode-se observar o não paralelismo das curvas de cloreto de cálcio operando nos níveis -1 e
+1 (0,1M e 0,2M, respectivamente), representando os possíveis efeitos de interação entre o
cloreto de cálcio e o tempo de cura, tendo em vista que o processo de gelificação do alginato
ocorre devido a troca iônica entre os íons sódio e cloreto durante a imobilização.
Pode-se observar que a alteração de nível para o cloreto de cálcio apresenta importante
efeito na resposta estudada. Na Figura 21, os valores entre parênteses são as faixas previstas
para o modelo, calculadas pelo software Statistica 6.0®. A concentração de etanol é dada pela
equação 13.
Etanol = 12,35 – 0,575*(Tempo de cura) – 0,375*(Conc.Cloreto) – 0,8*(Conc.Alginato)+
–0,5*(Tempo*Conc.Cloreto) – 0,375*(Conc.Cloreto*Conc.Alginato)
( 13 )
Outro ponto de destaque é o tempo de cura, pois se percebe pela Figura 21, que ao se
deslocar o tempo de cura de 24h para 0h, obtém-se uma melhoria na resposta, fato esse que
apresenta um diferencial para execução de processos industriais, onde o fator tempo de
46
execução é primordial.
Figura 21 – Representação dos efeitos para o planejamento 23.
Figura 22 – Gráfico das médias marginais obtidas no planejamento 23.
Na Figura 23, tem-se o diagrama de Pareto, onde os efeitos principais e de interação
entre as variáveis são observados.
47
Figura 23- Diagrama de Pareto das variáveis mais significativas, com nível de confiança de 95% (números próximos às barras do diagrama são os valores do teste t-student)
O diagrama da Figura 23 mostra os fatores que mais influênciaram nos ensaios e que
têm maior significância estatística. A concentração de alginato foi o fator que apresentou
maior significância estatística, com nível de confiança de 95%, provavelmente devido ao fato
de que a sua concentração influi na transferência de massa na partícula. O segundo fator mais
importante foi o tempo de cura, provavelmente devido ao fato de que a cura possui efeito na
difusão de massa na matriz de gel e esse efeito aumenta com o tempo de cura. A interação
entre cloreto de cálcio e tempo de cura também foi significativa no intervalo de confiança
estudado. Esses resultados apresentam concordância com afirmações da literatura
(CARVALHO, 2001) pois são os fatores responsáveis pelo formação e gelificação do
alginato, conseqüentemente respondem pela eficiência do processo.
A concentração de cloreto de cálcio e o tempo de cura das esferas também foram
fatores significativos ao serem analisados com um nível de confiança de 95%. Destaca-se
também, que a interação entre os fatores, tempo de cura e concentração de cloreto, teve uma
contribuição importante, no mesmo nível de confiança estudado, conforme dados
apresentados na forma de diagrama de Pareto da Figura 23.
As superfícies de resposta apresentadas na Figura 24 mostram também uma
maximização da resposta, operando-se nas concentrações de alginato igual a 1% (p/v),
concentração de cloreto 0,2M e tempo de cura 0h. Cabe ressaltar que nem sempre a proposta
estatística corresponde á realidade física, pois o alginato não opera continuamente para o
inferior e se assim o fosse, o sistema tenderia a se comportar como sistema de células livres e
certamente a diminuição excessiva de alginato comprometeria a capacidade de retenção
48
celular do pellet.
Figura 24 – Superfícies de resposta de obtidas no planejamento de varredura.
Durante os ensaios que operaram na condição de tempo de cura e concentração de
cloreto nos níveis inferiores, foi observado uma perda de estabilidade mecânica do gel. Para
se contornar esse problema, estudos baseados nos trabalhos de ROCCA (1995), que propõe
um tratamento das esferas de gel em solução de Al(NO3)3, em substituição ao tempo de cura
foram realizados e serão apresentados posteriormente nessa dissertação em planejamento
experimental 24 e 34-1.
Os resultados preliminares do planejamento de varredura indicam que há a
necessidade de estudos mais detalhados na região de imobilização. Na próxima seção,
apresenta-se a proposta para um planejamento composto central.
4.4- Planejamento do tipo 24
Para um estudo mais detalhado da região de imobilização, novos experimentos foram
planejados com o objetivo de se investigar o efeito da concentração de glicose, diâmetro de
partícula, concentração de alginato de sódio e da concentração de cloreto de cálcio na
eficiência fermentativa. A análise do desempenho fermentativo no planejamento 23 indicou
que o tempo de cura operando no nível inferior implica em melhor desempenho, mas
apresenta menor estabilidade operacional. Além disso, os ensaios com pellets submetidos ao
tratamento de tempo de cura, apresentaram pellets danificados após 6 horas de operação em
Etanol(g/L
)
Etanol(g/L
)
49
batelada, indicando que o reaproveitamento dos mesmos em bateladas sucessivas seria
inadequado.
Para a investigação de um método alternativo de produção de partículas com melhor
resistência mecânica, buscou-se a produção de pellets tratados com Al(NO3)3 ao invés de
tempo de cura. A técnica de tratamento com Al(NO3)3 foi proposta por ROCCA (1995), que
afirma ter obtido bons resultados substituindo o tempo de cura por um tratamento alternativo
com Al(NO3)3. Segundo ROCCA (1995), pellets produzidos com essa metodologia
apresentam estabilidade operacional por até 70 dias, obtendo produtividade de até 31g/L.h.
Outro aspecto que o autor destaca é que o pellet tratado com Al(NO3)3 apresenta um aumento
médio no diâmetro de 7,5%.
A melhoria nas características mecânicas do pellet tratado com Al(NO3)3 é uma
condição de produção interessante, pois indica a capacidade de reaproveitamento do pellet.
Além disso, devido as propriedades de eficiência fermentativa obtidas, os pellets produzidos
possuem potencial de utilização industrial. Esses fatos estimularam a substituição do
tratamento de tempo de cura pelo tratamento com solução de Al(NO3)3, assim aliando um
processo que apresenta elevado desempenho fermentativo e ainda boa resistência mecânica.
Baseando-se no planejamento varredura efetuado, propôs-se um novo planejamento
experimental, onde o tratamento de tempo de cura foi substituido pelo tratamento das
partículas com solução de Al(NO3)3 e adicionou-se um novo fator, o diâmetro do pellet, na
avaliação do rendimento fermentativo. Em princípio, o estudo do diâmetro como fator do
planejamento tende a mostrar as possíveis limitações, restrições à transferência de massa e
interações competitivas entre os fatores investigados no processo de fermentação de
interesse.
Na Tabela 18, apresentam-se os fatores, níveis e respostas do planejamento 24
investigado. O objetivo do planejamento é encontrar valores de diâmetros que reunam
características desejáveis de difusividade aliadas a propriedades de resistência mecânica.
A análise do gráfico de Pareto do planejamento 24, Figura 25, mostra que existe uma
interação significativa entre o diâmetro do pellet e a concentração de alginato. Além disso,
tem-se que o segundo fator mais importante é a concentração de cloreto de cálcio usada na
imobilização, conforme já observado no planejamento varredura 23. Esse fato deve-se a troca
de íons entre a solução de cloreto de cálcio e alginato de sódio, para a geleificação do pellet
em condições brandas. Destaca-se que os ensaios revelaram uma interação entre o cloreto de
cálcio e o alginato de sódio não observada no planejamento 23.
50
Tabela 18 – Planejamento fatorial tipo 24 e a resposta obtida nos ensaios
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet (mm)
Concentraçãode Alginato de Sódio (% p/v)
Concentraçãode Cloreto de Cálcio (M)
RendimentoPasteur (%)
1 - 1 - 1 -1 -1 89,502 +1 - 1 -1 -1 87,763 - 1 +1 -1 -1 78,154 +1 +1 -1 -1 80,715 - 1 - 1 +1 -1 71,216 +1 - 1 +1 -1 79,577 - 1 +1 +1 -1 85,978 +1 +1 +1 -1 87,449 - 1 - 1 -1 +1 89,8510 +1 - 1 -1 +1 84,7111 - 1 +1 -1 +1 83,6712 +1 +1 -1 +1 82,7113 - 1 - 1 +1 +1 80,4314 +1 - 1 +1 +1 84,6315 - 1 +1 +1 +1 92,7516 +1 +1 +1 +1 89,62
Novamente destaca-se que não é possível avaliar o efeito das variáveis de forma
independente, e no planejamento 24, onde a interação (alginato x cloreto) foi observada, tem-
se que fazer uma consideração do efeito associado ao diâmetro do pellet, pois partículas
maiores podem apresentar um processo de geleificação diferente daquele existente nas
menores partículas.
Figura 25 – Análise de Pareto para a fração 24 do planejamento composto central com limitede confiança de 90%.
51
Com a determinação dos fatores mais significativos, torna-se necessário avaliar a
região experimental definida para o planejamento. Essa análise foi implementada através da
função desirability (função desejabilidade) e encontra-se detalhada na Figura 26. Ao se
avaliar a função desirability com 40 ensaios de simulação tem-se os valores que maximizam
a resposta dentro da faixa experimental proposta. Pela Figura 26, pode-se observar a “direção”
do ótimo que o planejamento sugere. O valor máximo da desirability para o planejamento 24
efetuado é de 0,975, com valores ótimos nos extremos superiores da região investigada nos
experimentos. Este resultado indica que a faixa escolhida para o experimento 24 não permite a
identificação das condições ótimas para o experimento no interior da região de busca, pois
planejamentos em 2 níveis não conseguem verificar essa situação.
Figura 26 – Perfis para valores preditos e desirability para o planejamento 24 (desirabilityglobal de 97,55%).
A Figura 27 apresenta a distribuição dos resíduos em relação ao modelo descrevendo o
rendimento percentual na equação 14,
52
Rendimento(%)=84,29+0,8350*D+1,7538*C+1,0112*G*A-0,9800*G*C+4,1575*D*A+
+1,1512*A*C (14)
Onde D representa o diâmetro do pellet, G a concentração de glicose, A a concentração de
alginato e C a concentração de cloreto. Da Figura 27 pode-se concluir que os resíduos seguem
a distribuição normal e que 90% dos resíduos padronizados estão dentro do intervalo do nível
superior (+1) e nível inferior (–1). Caso isso não ocorresse, ter-se-ia a presença de outliers.
Figura 27 – Distribuição dos resíduos em função dos valores normais para o planejamento 24.
A Figura 28 apresenta a distribuição dos resíduos em função dos valores preditos.
Pode-se observar que os resíduos não apresentam tendência, o que caracteriza variância dos
erros constante.
A Figura 29 apresenta as médias marginais do planejamento 24, onde pode-se notar a
interação dos fatores operando no nível inferior (-1) e superior (+1). Esta observação pode ser
avaliada, a partir das inclinações das retas nos diagramas. Observa-se que quando as retas
possuem inclinações próximas, a interação entre as variaveis não é significativa no nível de
significância estudado e, no entanto, o cruzamento das mesma mostra uma forte interação
entre os fatores.
53
Figura 28 – Distribuição dos resíduos em função valor predito para o planejmento 24.
Figura 29 –Médias marginais para o panejamento 24 com nível de confiança de 90%.
Como o planejamento 34-1 foi estruturado, tem-se a possibilidade de se estudar o
54
processo em duas etapas. Assim, ao se observar a disposição dos fatores na Tabela 18,
concluí-se que os 16 ensaios realizados podem ser os mesmos ensaios usados para construir
um planejamento do tipo 34-1 (planejamento composto central). Na próxima seção, avalia-se o
planejamento composto central complementando os experimentos da Tabela 18 de forma a
atender as exigências do planejamento composto central do tipo 34-1 com =1,48.
4.5- Planejamento composto central do tipo 34-1
Na Tabela 19 apresentam-se os fatores, níveis e respostas do planejamento 34-1
investigado. O objetivo do planejamento é aumentar a região de análise realizada no
planejamento 24, ampliando-se o planejamento com experimentos axiais de rotabilidade
=1,48 de forma a possibilitar a verificação dos termos quadráticos no modelo de regressão.
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
Resíduo
-3,0
-2,5
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Val
or N
orm
al E
sper
ado
,01
,05
,15
,35
,55
,75
,95
,99
Ren
dim
ento
Figura 30 – Resíduos para o planejamento 34-1 com nível de significância de 90%.
A Figura 30 indica que os resíduos para o modelo seguem aproximadamente a
distribuição normal, caso isso não ocorresse, ter-se-ia a presença de outliers e seria então
necessário à aplicação de teste para o reconhecimento da(s) anomalia(s) apresentada(s) nos
resultados (por exemplo o teste de Grubbs). No caso em análise, não se identificou nenhum
outlier segundo a metodologia six-sigma. A Figura 31, entretanto, mostra que a utilização dos
55
pontos axiais para a ampliação da área experimental a ser estuda revelou que o modelo para a
região de estudo ampliada não representa de maneira satisfatória (quando comparado com o
modelo obtido para o planejamento 24) o comportamento experimental, apresentando uma
correlação/ajuste estatístico de aproximadamente 80%. Obviamente é uma redução
significativa no nível de confiança, mas é necessário considerar que a região experimental
ampliada possibilita que dois novos níveis de operação sejam acrescentados, totalizando
assim uma proposta experimental para cinco níveis de operação. A adição dos níveis + e -
na proposta do planejamento implica que é necessário confeccionar cinco diâmetros diferentes
para a realização dos ensaios, além dos cinco níveis de operação para os novos fatores.
Tabela 19 – Planejamento fatorial tipo 34-1 e a resposta obtida nos ensaios
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet (mm)
Concentraçãode Alginato de Sódio (% p/v)
Concentraçãode Cloreto de Cálcio (M)
RendimentoPasteur (%)
1 - 1 - 1 -1 -1 89,502 +1 - 1 -1 -1 87,763 - 1 +1 -1 -1 78,154 +1 +1 -1 -1 80,715 - 1 - 1 +1 -1 71,216 +1 - 1 +1 -1 79,577 - 1 +1 +1 -1 85,978 +1 +1 +1 -1 87,449 - 1 - 1 -1 +1 89,8510 +1 - 1 -1 +1 84,7111 - 1 +1 -1 +1 83,6712 +1 +1 -1 +1 82,7113 - 1 - 1 +1 +1 80,4314 +1 - 1 +1 +1 84,6315 - 1 +1 +1 +1 92,7516 +1 +1 +1 +1 89,6217 0 0 0 0 87,5518 - 0 0 0 93,1319 + 0 0 0 93,3420 0 - 0 0 93,9321 0 + 0 0 81,2422 0 0 - 0 86,0323 0 0 + 0 73,4024 0 0 0 - 77,7525 0 0 0 + 85,14
56
65 70 75 80 85 90 95 100
Valor Observado
70
72
74
76
78
80
82
84
86
88
90
92
94
96
Val
or
Pre
dit
o
Figura 31 – Distribuição do valor predito versus valor observado para o planejamento 34-1.
-1,03631
1,069359
1,217404
-1,41317
-1,90491
2,068884
2,283642
-2,488
4,396402
p=,1
Gl icose (L) x Cloreto (L)
Gl icose (L) x Alginato (L)
Alg inato (L) x Cloreto (L)
Alginato (L)
Cloreto (Q)
Gl icose (Q)
Cloreto (L)
Alginato (Q)
Diâm etro (L) x Alginato (L)
Figura 32 - Análise de Pareto para o planejamento 34-1 com limite de confiança de 90%. Efeitos dos fatores: Lineares(L), Quadráticos (Q).
57
O Diagrama de Pareto da Figura 32 confirma o fato de que não é possível avaliar o efeito
das variáveis (fatores) de forma independente (a ação isolada de cada fator sem os devidos efeitos
de interação).
A interação diâmetro do pellet x concentração de alginato de sódio foi observada
como a mais importante e significativa para o nível de confiança de 90%. Outros fatores
também tiveram significância estatística com seus termos lineares e quadráticos, como é
possível observar na análise de Pareto.
É interessante destacar que todos fatores avaliados como principais e identificados no
planejamento varredura (screen) mostraram-se novamente importantes e significativos
estatisticamente.
As interações obtidas e fatores isolados abaixo do nível de confiança proposto foram
desconsiderados para análise, a fim de se reduzir o número de termos expressivos na
avaliação dos resíduos indicados nas Figuras 30 e 31.
Glicose
60,000
94,010
110,00
Diâmetro Alginato Cloreto Desirability
0,
,5
1,
71,2
1082
,570
93,9
30
Re
nd
ime
nto
(%
)
-1,48 1,48
1,0000
-1,48 1,48 -1,48 1,48 -1,48 1,48
De
sir
ab
ilit
y
Figura 33 – Perfis para valores preditos otimizados e desirability para o planejamento 34-1
(desirability global igual a 1).
Com a análise de Pareto, e portanto conhecendo-se os fatores mais significativos, foi
58
realizada a avaliação da região experimental definida para o planejamento composto central.
Com o objetivo de se encontrar os valores que maximizem os fatores envolvidos utilizou-se a
investigação da função desirability (função desejabilidade), com 40 ensaios de simulação,
para a faixa de interesse. O resultado da análise encontra-se na Figura 33 que permite
identificar os níveis dos fatores investigados que produzem máximo rendimento fermentativo
na faixa investigada para os experimentos, ou seja, o ponto de máxima desirability que situa-
se aproximadamente nos níveis de glicose, diâmetro, alginato de cálcio e cloreto de cálcio
produzindo a resposta mais desejável para o rendimento e indicadas por desirability global 1
na Figura 33.
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
-2,0-1,5
-1,0-0,5
0,00,5
1,01,5
2,0
Glicose
-2,0-1,5-1,0-0,50,00,51,01,52,0
Diâ
met
ro
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
-2,0-1,5
-1,0-0,5
0,00,5
1,01,5
2,0
Glicose
-2,0-1,5-1,0-0,50,00,51,01,52,0
Alg
inat
o
1 0,8 0,6 0,4 0,20
-2,0-1,5
-1,0-0,5
0,00,5
1,01,5
2,0
Diâmetro
-2,0-1,5-1,0-0,50,00,51,01,52,0
Alg
inat
o
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
-2,0-1,5
-1,0-0,5
0,00,5
1,01,5
2,0
Glicose
-2,0-1,5-1,0-0,50,00,51,01,52,0
Clo
reto
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
-2,0-1,5
-1,0-0,5
0,00,5
1,01,5
2,0
Diâmetro
-2,0-1,5-1,0-0,50,00,51,01,52,0
Clo
reto
1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
-2,0-1,5
-1,0-0,5
0,00,5
1,01,5
2,0
Alginato
-2,0-1,5-1,0-0,50,00,51,01,52,0
Clo
reto
Figura 34 – Curvas de nível para desirability do planejamento 34-1: Valores ótimos comajuste spline.
A Figura 34 mostra as diversas curvas de nível obtidas para a função desirability onde
é possível verificar as regiões que levam aos valores ótimos de desirability. As combinações
dos fatores mais importantes foram apresentadas em função do valor da desirability global
para uma melhor visualização das regiões de interesse. Dessa maneira, é possível fazer
inferências rápidas as diversas análises disponíveis como, por exemplo, verificar a região de
59
desirability igual a 1 para os fatores concentração de cloreto de cálcio e concentração de
alginato de cálcio, conforme indicado pela seta na Figura 34.
80 70 60
Figura 35 – Região de máximo rendimento como função das concentrações de cloreto de cálcio e alginato de sódio no planejamento 34-1.
A Figura 35 apresenta a região de máximo rendimento fermentativo para as faixas de
concentrações de cloreto de cálcio e alginato de cálcio investigadas, confirmando a região já
indicada na análise de desirability. Outro aspecto a ser destacado é que o algoritmo de Pipel
utilizado para projetar o experimento varredura (screen) foi capaz de propor uma região
inicial consistente para a realização dos experimentos, uma vez que a investigação posterior
indicou a existência de máximo rendimento fermentativo na região experimental estudada e
sob as condições propostas.
A avaliação da Figura 33 mostra um aspecto interessante para a glicose, pois este fator
não tem ponto máximo e mínimo no interior da região investigada, possui um ponto chamado
de ponto de sela. Além disso, pode verificar na Figura 33 que a concentração elevada de
alginato de sódio influi de maneira direta nos mecanismos de transferência de massa e
difusividade do pellet e a partir dessa informação é possível especular-se que essa influencia
também aconteça no coeficiente de partição das esferas e nesse caso, estudos mais detalhados
devam ser realizados com o objetivo de se obter uma melhor compreensão desses
60
mecanismos, e por fim viabilizar o desenvolvimento de modelos matemáticos que descrevam
o comportamento de difusividade e transferência de massa no interior do gel.
Em uma avaliação de eficiência fermentativa para os experimentos realizados,
observa-se que o aumento do diâmetro do pellet reduziu a eficiência fermentativa,
excetuando-se naqueles sistemas operando no nível superior de concentração de alginato de
cálcio, onde tal aumento no diâmetro leva a uma elevação no desempenho fermentativo. Esse
fato pode está relacionado ao efeito de interação entre diâmetro do pellet e concentração de
alginato na obtenção das respostas dos ensaios, conforme apresentado na Figura 32. De outra
forma, a avaliação do efeito da concentração de alginato de sódio na eficiência fermentativa
indica que para as partículas desenvolvidas nos níveis superiores de diâmetros tem os seus
rendimentos fermentativos superiores na faixa de ensaios investigada. Essa observação não é
intuitiva, uma vez que uma mesma massa de partículas de menores diâmetros possui maior
área superficial total disponível a transferência de massa do que aquela com maiores
diâmetros. É fato que, na análise realizada, outros efeitos importantes merecem uma maior
investigação, tal como o efeito da fluidodinâmica de mistura e suspensão mecância dos pellets
no meio agitado, uma vez que partículas maiores tendem a se depositar mais facilmente na
parte inferior do bioreator.
Segundo os resultados apresentados na Tabela 19, tem-se que o melhor rendimento
obtido foi da ordem de 93,93% em relação ao rendimento Pasteur. Esse valor apresenta um
desempenho significativo e mostra que a proposta de imobilização é promissora do ponto de
vista técnico e operacional, apresentando-se como uma alternativa competitiva e eficaz.
LUONG(1985) citado por BORZANI et al., 2001, utilizando células de Zymomonas
mobilis imobilizadas em partículas de gel hidrofílico de K-carragenana e operando em leito
fluidizado, com glicose como substrato afirma que na concentração de glicose igual a 10g/L,
os efeitos difusivos eram desprezíveis se o diâmetro da partícula fosse igual ou menor que
1mm, com concentração celular no suporte/matriz igual a 27,6g/L. Nessas condições
operacionais a velocidade reacional se igualava a velocidade máxima possível. Por outro
lado, partículas que apresentavam concentração celular igual a 27,6g/L possuíam a velocidade
reacional máxima possível inferior e o mesmo ainda afirma que nessa situação, partículas
maiores que 3mm de diâmetro tem desempenho inferior.
FERREIRA (1986), utilizando Saccharomyces cerevisiae imobilizada em carragenato,
com esferas em torno de 4mm de diâmetro e utilizando a glicose como substrato, afirma que
os valores do coeficiente de partição independem das concentrações de etanol e glicose no
meio e que o efeito mais pronunciado é obtido em função da concentração de microrganismos
61
no gel (Massa de microganismo / Massa de gel = 0,13). Dessa maneira é válido considerar se
o diâmetro e a concentração celular tem um efeito de interação significativo ou não, pois
segundo o autor o coeficiente de partição para o etanol tende a 1 , ou seja a concentração
dentro do gel e no leito tem o mesmo valor, enquanto que para a glicose o coeficiente fica em
torno de 0,73. Pelos resultados obtidos, acredita-se que existe uma condição de imobilização
que otimiza esses valores e que diâmetros maiores realmente dificultam a transferência de
massa, se considerados isoladamente, mas a interação da concentração do gel e o diâmetro
mostra que valores de diâmetro (4 mm) próximos aos valores relatados por FERREIRA
(1986) tem apresentado bons resultados. Outro aspecto a se destacar nesse trabalho, é que
dada a agitação do sistema, a transferência de massa foi significativamente melhorada,
justificativa essa para a proposição acima.
NAJAFPOUR et al., (2003) utilizando células de Saccharomyces cerevisiae
imobilizadas em alginato de cálcio em reator tipo batelada com concentração de substrato de
50g/L, obteve uma produtividade média de 2,8g/L.h, sendo esse desempenho ligeiramente
superior ao encontrado nos ensaios dessa dissertação, tendo em vista que na melhor condição
partiu-se de uma concentração inicial de glicose de 60g/L e atingindo uma produtividade de
3,2g/L.h. NAJAFPOUR et al., (2003) aponta as seguintes características de imobilização
apresentadas na Tabela 20.
Tabela 20 - Propriedades do alginato de cálcio (NAJAFPOUR et al., 2003)
Características gerais do processo de imobilização
Concentração de alginato (% p/ v) 1,5 2 3 4,5
Diâmetro dos pellets(mm) 5 4,9-5 4,8-4,9 4,5
Expansão do diâmetroapós 72h (%) 50-60 25-30 20-25 Sem expansão
Problemas de difusão Nenhum Nenhum Nenhum Talvez existam
Atividade Celular Ativa Totalmente ativa Totalmente ativa ParcialmenteAtiva
Aparência física Facilmentequebrável
Flexível e forte o suficiente para estabilidade
Flexível e forte Muito forte
Estabilidade Semestabilidade
Boa estabilidade Estável e rígida Muito rígida
62
Pela Tabela 20, relativa aos trabalhos de NAJAFPOUR et al. (2003), observa-se que
concentrações baixas de alginato não tem estabilidade suficiente para condução do processo e
altas concentrações mostram que podem existir problemas relacionados a transferência de
massa. Pouco pode-se concluir a respeito dos diâmetros, pois a faixa de estudos foi
praticamente a mesma em todos os ensaios (Média = 5mm) e para a faixa estudada o autor
afirma que não encontrou problemas de difusividade. Essa faixa também foi estudada no
presente trabalho e é indicada como ótima pela função desejabilidade.
0 2 4 6 8 10-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
Con
cent
raçã
o: G
licos
e /E
tano
l(g/
L)
Tempo (h)
Etanol Glicose
0 2 4 6 8 10
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Con
cent
raçã
o de
cél
ulas
livr
es (
g/L)
Tempo (h)
a) Consumo de glicose e produção de etanol b) Crescimento de células no meio de fermentação
0 2 4 6 8 105
10
15
20
25
30
35
40
45
Con
cent
raçã
o ce
lula
r no
inte
rior
do p
elle
t(g/
L)
Tempo (h)
0 2 4 6 8 10-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Pro
dutiv
idad
e (g
/L)
Tempo (h)
c) Crescimento celular no interior da matriz porosa
d) Produtividade do processo
Figura 36 - Cinética e produtividade de fermentação do melhor ensaio obtido (n0 20, vide Apêndice).
63
A Figura 36 apresenta o desempenho fermentativo obtido no melhor ensaio realizado
no planejamento 34-1, onde se representa graficamente as diversas curvas experimentais
indicadas respectivamente nos gráficos: crescimento de células livres no meio fermentativo,
crescimento celular no interior da matriz, consumo de glicose e produção de etanol.
Pode-se observar que a técnica de imobilização foi eficiente, pois após 10 horas de
fermentação a razão entre células livres / imobilizadas foi de aproximadamente 1,4% e após 8
horas de fermentação foi obtida a produtividade máxima média de 3,0g/L.h, com uma
concentração celular de 42g/L no interior do pellet.
O estudo de imobilização das partículas permite mostrar que nas condições de maior
produtividade, a relação percentual das concentrações de células livres e concentração de
células imobilizadas é uma medida da eficiência de imobilização, assim quanto menor for
esse número, melhor será a imobilização. É também claro que uma imobilização eficiente não
pode levar a um decaimento das características de produtividade associadas ao sistema.
Assim, fator de eficiência de imobilização menor que 2% com níveis de produtividade
superiores a 92% do rendimento Pasteur são altamente significativos para esses sistemas com
partículas imobilizadas em agitação ou em leito fluidizado. Nesse estudo, após 10h de
produção, os níveis de retenção situaram-se sempre da ordem de 1,0% a 1,5%.
Figura 37- Relação percentual entre concentração de células livres e células imobilizadas.
(%)
64
A relação percentual entre células livres e imobilizadas apresentada no gráfico da
Figura 37, mostra que a técnica de imobilização foi eficiente do ponto de vista de retenção
celular, evidenciando dessa maneira que a capacidade de retenção do alginato foi
significamente melhorada com a utilização do Al(NO3)3.
A Figura 38 apresenta as partículas utilizadas nos experimentos. A Figura 38a
apresenta as partículas sem o tratamento de Al(NO3)3 representando partículas do tipo A após
5h de utilização, enquanto a Figura 38b apresenta as partículas do tipo B coletadas durante
uma fermentação para determinação da concentração média de células no interior das
mesmas.
Figura 38 – Partículas de alginato de cálcio com células imobilizadas: (a) Pellet do tipo A; (b) Pellet do tipo B.
A Tabela 21 apresenta uma breve comparação das características principais das
partículas do tipo A (preparadas com tempo de cura) e do tipo B (preparadas com a utilização
de Al(NO3)3) observadas nas faixas de experimentos realizadas.
Tabela 21 – Características aparentes das partículas investigadas
Características Pellet A Pellet B
Estabilidade mecânica Pouco estável Muito estável Problemas de difusão Não observado PequenoAtividade celular Ativa AtivaAparência Alongada após uso Flexível e forte Diâmetro Investigado 4mm (3,5-4,9)mm
65
As características de estabilidade mecânica das partículas e as aparências das mesmas
foram avaliadas conforme segue: pellet do tipo A: avaliação após 5h de fermentação em
bioreator agitado operando em batelada; pellet do tipo B após 10h de fermentação sob as
mesmas condições de agitação. As Figuras 38a e 38b, ilustram as diferenças de características
aparentes das partículas. A avaliacão da atividade celular deu-se pelo acompanhamento da
produção de etanol desses sistemas, enquanto as características de difusão foram avaliadas
para níveis de agitação e diâmetros distintos para as partículas e a diferença comparadas a
produção do sistema para uma condição de células livres. Nesse sentido, para uma melhor
aprofundamento dessa análise um estudo de partição para o sistema de fermentação deve ser
feito.
Na próxima seção apresentam-se alguns aspectos desenvolvidos na modelagem do
fermentador investigado.
4.6 – Aspectos introdutórios para a modelagem do fermentador.
A cinética de transformação para um sistema com células imobilizadas é diferente
daquela resultante de células livre. Existem vários efeitos que contribuem para essas
diferenças sendo a modificação de ação metabólica e a existência de efeitos de resistência à
transferência de massa os fatores mais importantes dessa diferença. O balanço de massa para
o substrato dentro de uma partícula esférica pode ser escrito na forma unidimensional
conforme:
SRdr
dSDr
dr
d
r2
2
1(15)
Onde é a taxa de transformação do substrato por unidade de volume na partícula.SR
As condições de contorno para o problema são dadas por:
Em:
r=0, 0dr
dS
r=R, )( SSkdrdS
D oL (16)
66
Onde:
S Substrato consumidoS0 Substrato inicial r Posição radial no pelletR Raio do pellet (Superfície da partícula) kL Constantes de inibição (Monod) D Coeficiente de difusividade
Escrevendo o modelo com variáveis adimensionalizadas:
oS
S (17)
R
r (18)
Tem-se o modelo adimensional e com D constante,
o
d d R Rd d DS
22
2
1 (19)
As condições de contorno na forma adimensional são,
Em 0 , 0d
d (20)
Em 1, )1()1( ShD
Rk
d
d L (21)
A simulação computacional desse modelo é simples e pode ser feita utilizando uma
metodologia de discretização acoplada a um algoritmo para solução de sistemas de equações
não lineares. Nesse trabalho utilizou-se a técnica de colocação ortogonal com polinômios de
Jacobi (VILLADSEN e MICHELSEN, 1978) em um ambiente Scilab. A investigação
preliminar utilizou-se uma cinética do tipo Michaelis-Menten dada pela expressão de taxa:
67
xS
m
kC SR
K S (22)
A dificuldade de se medir a concentração de glicose (S) dentro da partícula fez com
que se escolhesse uma abordagem paramétrica de investigação preliminar onde investiga-se o
efeito dos parâmetros que descrevem o modelo. Nesse aspecto, busca-se valores que
possibilitem compreender o efeito a ser verificado experimentalmente em trabalhos futuros. O
sistema investigado, comm
o
K
S e vários valores de módulo de Thiele,
mDK
KCR22 ,
apresenta o comportamento descrito na Figura 39. Merece destaque o fato de que como a
concentração de células aumenta com o tempo, a exploração do comportamento desse sistema
para uma faixa de valores do módulo de Thiele permite esboçar o comportamento que esse
modelo descreve para o comportamento do sistema. De forma análoga, o raio da partícula
possui influência quadrática nesse comportamento.
Figura 39 - Comportamento estacionário de uma partícula com 5 pontos de colocação
internos, polinômio de Jacobi com 1, 1 , Sh=100, 2,0 e =[1(+), 10(x), 100(o)].
2
68
O módulo de Thiele apresenta explicitamente, para uma partícula esférica com raio
fixo, uma proporcionalidade direta com a concentração de células, indicando assim que
durante a operação do sistema o comportamento qualitativo que se espera no tempo seja algo
similar ao resultado mostrado na Figura 39, considerando comportamento estacionário com
três níveis de concentração de células na partícula. Pode-se, também, investigar o efeito da
resistência externa à transferência de massa. Nesse trabalho, procurou-se minimizar esses
efeitos com uma agitação eficiente no sistema.
O sistema operando com células imobilizadas apresenta menores problemas em
relação a inibição pelo substrato. Mesmo assim, estudos do metabolismo das células
imobilizadas e avaliação dos mecanismos difusivos no interior de uma partícula num processo
de fermentação com células imobilizadas merecem ainda a atenção futura. Procurando
explorar os efeitos que tal descrição de modelo pode apresentar, faz-se na Figura 40 uma
análise com uma cinética com inibição pelo substrato e expressão de taxa dada por:
imS KSSK
kCSR
/1 (23)
Figura 40 - Comportamento estacionário de uma partícula com 5 pontos de colocação
internos, polinômio de Jacobi com 1, 1 . Sh=100, 2,0 , =100 e =[0(+),10(x), 25( ),100( ))].
22
69
A simulação para elevados níveis de módulos de Thiele faz com que o efeito de
inibição pelo substrato seja entendido à medida que o parâmetro de inibição
i
o
K
S2 aumenta, ou seja, com o aumento da inibição têm-se a esperada redução na queda de
concentração do substrato dentro da partícula. É fato também que com o crescimento celular,
os mecanismos difusivos se alteram e considerar que o coeficiente de difusividade interno é
constante pode não representar bem a realidade. De acordo com FERREIRA (1986), os
coeficientes de partição em partículas de gel contendo Saccharomyces cerevisiae são funções
da concentração celular, e possuem a tendência de redução com o aumento da concentração
de células no interior da partícula.
A consideração de uma cinética com inibição pelo produto segue mesmos padrões da
inibição pelo substrato e fornece uma expressão do tipo das Equações 24 e 25 para inibição
não competitiva e competitiva, respectivamente.
1 /Sm i
kCxSR
K S P K (24)
/Sm m I
kCxSR
K S K K P (25)
No caso da inibição pelo substrato, exige-se que o balanço de massa para o produto
também seja feito na partícula. Assim, o modelo descrevendo o sistema tem a forma:
SRdr
dSDr
dr
d
r2
21
e Sp Rdr
dPDr
dr
d
r2
21
(26)
Onde é a difusividade do etanol na partícula. Escrevendo o sistema na formaadimensionalizada, com:
pD
oS
P eD
Dp , têm-se:
o
d d R Rd d DS
22
2
1 e
o
d d R Rd d DS
22
2
1 1
(27)
70
As condições de contorno na forma adimensional são,
Em 0 , 0d
de 0
dd
(28)
Em 1, )1()1( ShD
Rk
d
d L (29)
e )()( ooL Sh
DRk
dd
(30)
ondeo
oo S
P.
Somando-se as equações dos modelos pode-se mostrar que:
1o (31)
Isso permite que modelo seja resolvido apenas substituindo na expressão da taxa e resolve-
se o balanço de massa para o substrato. A resolução desse sistema para o caso em que a
concentração do produto na fase líquida é nula, I
o
K
S3 é investigada numa faixa inibitória
de 0 a 100 e 1 . A Figura 41 apresenta o comportamento para o substrato.
71
Figura 41- Comportamento estacionário de uma partícula com inibição pelo produto de forma não competitiva utilizando 5 pontos de colocação internos, polinômios de Jacobi com
1, 1 , 2,0 , Sh=100, =100 e 23 =[0(+), 10(x), 25( ),100( )].
A análise apresentada não considera casos em que a difusividade é função da
concentração. Entretanto, essa consideração pode ser facilmente implementada nos sistemas
investigados nessa seção se tal comportamento constitutivo for conhecido.
Da avaliação preliminar do comportamento estacionário da concentração de substrato
dentro de uma partícula esférica pode-se inferir que o comportamento quando o número de
células precisa também ser considerado não é de todo simples para uma descrição transiente.
Abordando-se o reator de mistura investigado (e considerado em mistura perfeita), pode-se
escrever o balanço de células, etanol e glicose conforme seguem:
Balanço de células livres no fermentador:
efL R
dt
dC , (32) LC (0)
72
onde é a taxa efetiva de crescimento celular no exterior da partícula com células
imobilizadas e
efR
a concentração inicial de células livres (<<1 g/L). Uma expressão
para para uma cinética tipo Monod pode ser dada por: efR
ncdpL
gfm
gfef CKC
CK
CR max , (33)
Assim, tem-se:
ncdpL
gfm
gfL CKCCK
C
dt
dC max
(34)
onde;
Cgf Concentração de glicose no fluido Ccd Concentração de células CL Concentração celular no leito Kp, Km , n. Constantes de processo mef Concentração de etanol no interior da partícula V Volume do reator
max Velocidade específica máxima
Na Equação 34, a primeira parcela é resultante do crescimento celular das células
livres e a segunda parcela origina-se do desprendimento da própria partícula, sendo e n
constantes que dependem fundamentalmente do processo utilizado para a confecção da
partícula e da operação do fermentador (resistência a estresse, etc.). Pelos resultados
experimentais apresentados nesse estudo, que não reutilizou partículas em fermentações
subseqüentes, a contribuição do número de células por desagregação de partículas pode ser
negligenciada, mantidos os níveis operacionais conforme investigado.
pK
A avaliação do comportamento do substrato e produto para o sistema pode ser descrita
pelos balanços:
Balanço de Etanol:
efLgfm
gfcP
ef mVCCK
CY
dt
VdC .max/ ; 0)0(efC (35)
73
onde é a quantidade de etanol, gerada no interior da partícula, e que foi transferido para a
fase bulk do fermentador. Esse termo pode ser descrito conforme comumente feito na
literatura de transferência de massa, nesse caso, é proporcional a , ou seja
.
efm.
efm.
o(P P )
ef om (P P.
' )
Balanço de Glicose:
gfLgfm
gfcS
gf mVCCK
CY
dt
VdC .max/ ; goef CC )0( (36)
onde é a quantidade de glicose consumida no interior da partícula, e que foi retirada da
fase bulk do fermentador, nesse caso
gfm.
.' ( )gf gfm C S , C ogf S .
Evidentemente o modelo pode ser facilmente ajustado para considerar expressões
cinéticas de fermentação de glicose com Saccharomyces cerevisiae mais complexas. Os
balanços dentro da partícula podem ser expressos por:
Balanço dentro da Partícula
SRdr
dSDr
dr
d
rt
S 22
1 (37)
Sp Rdr
dPDr
dr
d
rt
P 22
1 (38)
Onde eS P são as concentrações de glicose e etanol no interior da partícula. As condições de
contorno para caso de coeficientes de transferência de massa nas vizinhanças externas à
partícula dadas por , são descritas por: Lk
Em r=0, 0dtdP
drdS
(39)
Em r=R, )( SSkdrdS
D oL e )( PPkdrdP
D oLp (40)
74
O conjunto de equações descrevendo o modelo desse sistema, embora não seja
simples, ainda é tratável de um ponto de vista numérico, necessitando, entretanto, de
parâmetros cinéticos, de operação e internos à partícula. A simulação e validação do modelo
proposto, bem como a avaliação dos resultados experimentais, serão deixadas como sugestão
de continuidade desse trabalho.
75
CAPÍTULO 05 – CONCLUSÕES
O uso de técnicas estatísticas para a condução dos ensaios, apresentou-se como uma
ferramenta robusta para a avaliação do processo fermentativo, permitindo a avaliação de
fatores que não são observáveis ou mensuráveis diretamente para sistemas complexos e as
interações entre eles.
Dos resultados obtidos pode-se concluir que:
A concentração de alginato de sódio influi diretamente no rendimento fermentativo,
como demonstrado no planejamento Screen. O ensaio realizado na condição em que a
concentração de alginato, o tempo de cura e a concentração de cloreto operaram nos
níveis: 1%, 0h, 0,2M , respectivamente, produziram o melhor rendimento observado,
embora com pellets pouco estáveis.
A alteração da concentração de cloreto de cálcio influi no rendimento fermentativo, de
forma não isolada e sim combinada com o tempo de cura. O aumento da concentração
de cloreto indica que em tempos de cura relativamente curtos, existe a necessidade de
saturação da solução de cloreto. Nos experimentos do planejamento 23, verificou-se
que as partículas eram afetadas demasiadamente para os níveis de concentração de
glicose investigados, mesmo para elevadas concentrações de cloreto de cálcio e
tempos de cura de 24 horas. Essa constatação levou a mudança no procedimento de
preparação das partículas com a adoção de Al(NO3)3, que levou a partículas de maior
resistência mecânica e com eficiente imobilização de células no seu interior, mesmo
para partículas com 4,9mm de diâmetro e sob condições de suspensão mantida com
agitação mecânica.
O alginato de sódio mostrou-se isoladamente importante ou em interação com outros
fatores estudados e até mesmo em interações quadráticas, como mostrado no
planejamento composto central.
A matriz de gel é robusta à concentração de glicose e etanol no meio. O gráfico das
médias marginais mostra que a glicose não teve atuação significativa no processo no
intervalo de confiança estudado.
A técnica de gotejamento do alginato de sódio mostrou-se satisfatória para a produção
76
de pellets com elevado grau de esfericidade.
Não foi estudado o tipo de empacotamento da célula no interior no pellet, mas pode-se
inferir que ele não foi agressivo para o microrganismo, em virtude da taxa de
crescimento celular verificada no pellet após a sua solubilização.
A função desirability (desejabilidade) para a fração 24 teve seu alvo global de 97,55%,
mostrando que a escolha das variáveis independentes para otimizar o rendimento
fermentativo foi adequado, de outra forma, o planejamento composto central tipo 34-1
teve sua alvo global de 100%, mostrando que a ampliação da faixa investigada para as
variáveis independentes levou ao aperfeiçoamento da região experimental. A faixa de
concentração de glicose com maior desirability acontece próximos aos extremos do
planejamento, indicando que a avaliação de uma faixa mais ampla pode ser importante
para esse estudo.
As avaliações conduzidas com a função valor desejado mostram que a região
investigada captura um ponto de ótimo rendimento. Dentre os experimentos
realizados, esse ponto é próximo aos valores de concentração de glicose igual a 65g/L,
concentração de alginato igual a 2,2%, a concentração de cloreto igual a 0,26M e o
diâmetro do pellet igual a 5,2mm.
Analisando a formação do pellet como uma mistura de três componentes e utilizando o
algoritmo de Piepel e Snee, com as devidas restrições, foi possível construir e projetar
um planejamento estatístico bem posto e avaliar quais foram os fatores mais
significativos e que impactaram no processo fermentativo.
A alteração da concentração de alginato influi no rendimento fermentativo
diretamente. Os fenômenos de transferência de massa e difusividade estão fortemente
ligados à concentração de alginato de sódio usada para confecção das esferas.
O tratamento das partículas com Al(NO3)3 contribuiu para melhoria de estabilidade do
pellet estudado e de sua resistência mecânica, garantindo uma melhor capacidade de
retenção celular em comparação aos pellets obtidos e tratados com tempo de cura. A
imobilização das células nas condições investigadas manteve grau elevado de
77
atividade celular, o que constitui em fator promissor da utilização industrial desses
pellets na produção de etanol.
A investigação do sistema nas condições estabelecidas pelos planejamentos de
experimentos confirmam que o uso de técnicas estatísticas para a condução dos
ensaios permite a avaliação de fatores que não são observáveis ou mensuráveis
diretamente para sistemas complexos e as interações entre eles.
78
CAPÍTULO 06 – SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Ampliar a faixa de concentração de glicose para valores acima de 100 g/L e verificar,
se existe ação inibitória para o microrganismo, problemas relativos a transferência de
massa e difusividade no gel.
Determinar a faixa de concentração ótima de Al(NO3)3 que proporciona pellets com
características adequadas de baixa resistência à transferência de massa com elevada
resistência mecânica.
Desenvolver técnicas analíticas compatíveis com a precisão necessária a uma maior
fundamentação experimental do fenômeno de fermentação com células imobilizadas.
Nesse aspecto, a utilização da cromatografia de alta resolução (HPLC) para o cálculo
do coeficiente de partição do etanol e da glicose pode ser uma contribuição valiosa.
Otimizar as condições de operação de um bioreator em sistema batelada.
Analisar as condições de imobilização em bioreatores operando em sistema contínuo
em regimes de leito fixo e fluidizado.
Avaliar outros tipos de suporte para a investigação da imobilização.
Desenvolver experimentos para medida de parâmetros de transferência de massa para
o sistema partícula-fermentador.
Validar modelo e simular os diversos esquemas de bioreator descritos nesse texto.
79
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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84
Apêndices
85
Apêndice A
1 - Curvas de Calibração
As curvas de calibração para a quantificação da concentração de etanol e celular foram
elaboradas utilizando-se o software Origin 7.0®. O teste estatístico utilizado para sua
validação foi o teste t-Student, com resultados apresentados na Tabela A1, onde a absorbância
(ABS) é correlacionada à concentração celular e de etanol conforme metodologia apresentada
por NETO et al. (2001).
Tabela A1 – Curvas de calibração para concentração celular e de etanol
Concentração celular
ABS = -9,023x10-4 +0,0437x[concentração (g/L)]
Correlação Desvio Padrão Número de amostras (N) t0,999 0,009 7 <0,0001
Concentração de etanol
ABS = 0,011 +0,031x[concentração (g/L)]
Correlação Desvio Padrão Número de amostras (N) t0,996 0,007 6 <0,0001
86
Apêndice B
1- Resultados dos Ensaios de Fermentação Realizados
Tabela B1 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 01
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet (mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)1 41,35 3,5 2,2 0,1
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentraçãode Células
Imobilizadas (g/L)
02468
1012
06,25
12,1617,95____________
41,3525,2410,20
0____________
00,02720,06530,2893____________
8,111,3617,1626,68____________
Tabela B2 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 02
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)2 88,65 3,5 2,2 0,1
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentraçãode Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 88,65 0 8,12 5,56 76,25 0,02610 11,784 13,25 60,01 0,06432 17,256 20,12 42,15 0,2791 25,658 25,10 21,36 0,50400 40,39
10 37,73 4,30 0,5850 46,3112 ____ ____ ____ ____
87
Tabela B3 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 03
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)3 41,35 4,9 2,2 0,1
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentraçãode Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 41,35 0 8,12 4,58 29,24 0,04789 10,894 10,69 16,20 0,06532 16,256 15,67 3,51 0,5873 27,988 ____ ____ ____ ____
10 ____ ____ ____ ____12 ____ ____ ____ ____
Tabela B4 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 04
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)4 88,65 4,9 2,2 0,1
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentraçãode Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 88,65 0 8,12 3,69 77,12 0,02320 10,164 11,25 57,26 0,05522 16,106 17,04 44,15 0,2893 27,608 25,12 22,33 0,50380 36,40
10 29,59 5,30 1,026 49,3412 34,70 0,71 1,4121 53,12
88
Tabela B5 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 05
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)5 41,35 3,5 2,8 0,1
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentração de Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 41,35 0 8,12 2,36 31,00 0,02611 11,004 6,72 19,03 0,07513 16,996 9,11 11,1 0,2997 26,898 10,23 4,09 0,5200 38,25
10 14,28 0,66 0,5800 41,3312 ____ ____ ____ ____
Tabela B6 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 06
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)6 88,65 3,5 2,8 0,1
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentração de Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 88,65 0 8,12 6,8 66,21 0,02720 12,464 11,01 55,09 0,06532 18,366 17,21 41,19 0,2893 24,788 28,12 24,26 0,50380 35,25
10 31,54 9,25 0,5800 42,4312 34,21 0 0,9923 49,65
89
Tabela B7 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 07
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet (mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)7 41,35 4,9 2,8 0,1
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentração de Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 41,35 0 8,12 4,10 29,23 0,02680 11,774 6,75 16,20 0,06342 16,756 11,24 9,77 0,2689 27,118 15,02 3,35 0,5134 33,13
10 17,24 0 0,9685 40,2412 ____ ____ ____ ____
Tabela B8 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 08
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)8 88,65 4,9 2,8 0,1
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentraçãode Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 88,65 0 8,12 3,12 76,25 0,02517 9,314 6,65 60,01 0,06223 14,986 14,56 42,15 0,2961 23,648 23,61 21,36 0,52650 32,41
10 31,04 4,30 0,5678 42,3112 37,6 0 1,0030 45,97
90
Tabela B9 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 09
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet (mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)9 41,35 3,5 2,2 0,26
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentração de Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 41,35 0 8,12 8,1 19,89 0,02915 10,984 15,4 11,24 0,06262 16,946 18,2 0 0,2762 22,528 ____ ____ ____ ____
10 ____ ____ ____ ____12 ____ ____ ____ ____
Tabela B10 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 10
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)10 88,65 3,5 2,2 0,26
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentração de Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 88,65 0 8,12 1,45 66,25 0,02496 12,264 12,11 55,01 0,06312 19,006 19,26 43,15 0,2743 25,788 31,51 11,16 0,5920 39,55
10 36,4 0,60 0,5911 41,2312 ____ ____ ____ ____
91
Tabela B11 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 11
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet (mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)11 41,35 4,9 2,2 0,26
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentraçãode Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 41,35 0 8,12 1,1 27,24 0,02817 13,344 9,23 12,20 0,06966 20,126 10,17 3,1 0,3025 29,518 16,78 0 0,49985 31,24
10 ____ ____ ____ ____12 ____ ____ ____ ____
Tabela B12 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 12
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)12 88,65 4,9 2,2 0,26
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentraçãode Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 88,65 0 8,12 4,3 69,20 0,02986 11,514 9,21 57,01 0,06345 17,196 16,12 43,15 0,3000 25,918 27,1 19,98 0,5975 38,95
10 31,04 9,12 0,6104 44,3912 35,56 1,22 1,1253 47,32
92
Tabela B13 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 13
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)13 41,35 3,5 2,8 0,26
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentração de Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 41,35 0 8,12 2,54 28,72 0,02699 8,34 8,59 14,03 0,05932 19,146 11,23 7,16 0,2811 24,238 16,13 5,6 0,57280 26,25
10 ____ ____ ____ ____12 ____ ____ ____ ____
Tabela B14 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 14
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet (mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)14 88,65 3,5 2,8 0,26
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentraçãode Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 88,65 0 8,12 5,85 68,25 0,02520 13,254 11,26 54,01 0,06592 17,126 17,45 47,31 0,2943 27,638 23,2 23,16 0,5180 40,44
10 29,41 16,31 0,5750 45,3012 31,06 7,52 0,6500 49,3214 36,39 1,11 1,3012 49,11
93
Tabela B15 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 15
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)15 41,35 4,9 2,8 0,26
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentraçãoce Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 41,35 0 8,12 3,9 25,24 0,02719 11,234 12,6 10,20 0,06585 16,136 18,6 5,63 0,2800 21,688 ____ ____ ____ ____
10 ____ ____ ____ ____12 ____ ____ ____ ____
Tabela B16 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 16
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)16 88,65 4,9 2,8 0,26
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentração de Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 88,65 0 8,12 3,1 76,25 0,02310 10,944 8,5 60,01 0,05532 17,456 17,4 42,15 0,2993 25,368 26,1 21,36 0,5280 38,44
10 29,3 4,30 0,6100 41,3112 38,53 0 1,0500 52,32
94
Tabela B17 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 17
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)17 65 4,2 2,5 0,18
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentraçãode Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 65 0 8,12 3,45 33,41 0,02729 13,024 11,62 20,84 0,06542 19,146 25,69 10,12 0,27226 28,668 27,6 2,70 0,55886 39,55
10 ____ ____ ____ ____12 ____ ____ ____ ____
Tabela B18 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 18
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)18 30 4,2 2,5 0,18
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentraçãode Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 30 0 8,12 3,21 22,11 0,03020 12,364 13,51 0,11 0,09512 17,126 ____ ____ ____ ____8 ____ ____ ____ ____
10 ____ ____ ____ ____12 ____ ____ ____ ____
95
Tabela B19- Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 19
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)19 100 4,2 2,5 0,18
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentração de Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 100 0 8,12 3,54 80,01 0,02729 10,944 12,59 72,15 0,06530 17,146 17,56 63,03 0,2356 24,698 27,6 44,17 0,5000 36,44
10 31,94 29,30 0,5622 39,3712 27,61 19,12 0,6529 44,3114 37,25 8,59 0,9564 49,2216 45,27 1,66 1,60982 52,24
Tabela B20 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 20
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)20 65 3,1 2,5 0,18
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentraçãode Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 65 0 8,12 1,05 49,01 0,02785 12,324 8,69 32,82 0,06409 19,106 17,69 12,43 0,2762 23,588 26,11 6,56 0,5168 41,65
10 29,61 2,11 0,5600 42,1012 ____ ____ ____ ____
96
Tabela B21 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 21
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)21 65 5,2 2,5 0,18
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentraçãode Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 65 0 8,12 0,98 41,01 0,02320 13,004 6,13 30,82 0,06329 16,996 19,5 12,43 0,2863 28,568 20,2 7,56 0,5022 39,45
10 23,4 2,71 0,5150 44,4312 25,61 0,95 1,1548 46,31
Tabela B22 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 22
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)22 65 4,2 2 0,18
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentração de Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 65 0 8,12 3,1 38,06 0,02633 12,364 8,6 29,82 0,06522 16,166 25,4 10,43 0,2988 25,688 27,12 0,33 0,5301 41,45
10 ____ ____ ____ ____12 ____ ____ ____ ____
97
Tabela B23 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 23
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração deCloreto de Cálcio
(M)23 65 4,2 3 0,18
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentração de Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 65 0 8,12 4,9 52,25 0,02990 9,364 7,9 30,82 0,07032 14,166 15,63 16,43 0,3193 21,688 19,21 10,56 0,56380 36,45
10 20,89 5,62 0,64890 43,1312 21,04 0,6 1,2569 45,4214 23,14 0 1,6589 47,44
Tabela B24 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 24
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)24 65 4,2 2,5 0,05
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentraçãode Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 65 0 8,12 3,4 49,21 0,03129 11,744 8,9 36,82 0,07219 17,586 13,45 17,43 0,31052 25,688 20,2 6,56 0,58964 38,41
10 24,51 0 0,69982 41,3312 ____ ____ ____ ____
98
Tabela B25 - Resultado da cinética de fermentação – Ensaio 25
Ensaio Concentração de Glicose (g/L)
Diâmetro do Pellet(mm)
Concentração de Alginato de Sódio
(% p/v)
Concentração de Cloreto de Cálcio
(M)25 65 4,2 2,5 0,3
Tempo (h) Concentração de Etanol (g/L)
Concentração de Glicose (g/L)
Concentração de Células Livres (g/L)
Concentração de Células
Imobilizadas (g/L)
0 0 65 0 8,12 0,56 42,12 0,0242 12,464 5,1 31,25 0,0593 19,136 9,33 19,63 0,3193 28,678 15,28 12,51 0,5838 39,41
10 19,78 8,91 0,7100 41,3712 21,07 4,18 0,9988 47,2414 26,84 0,41 1,2358 49,86
