Estudo da Incorporação de Subunidades Durante a Montagem ... · "There must be no barriers for freedom of inquiry. There is no place for dogma in science. The scientist is free,

UNIVERSIDADE DO ALGARVE Faculdade de Ciências e Tecnologia LICENCIATURA EM BIOQUÍMICA

Relatório de Estágio

Estudo da Incorporação de Subunidades Durante a Montagem do Proteassoma 20S

Autor: António José L. Marques Orientador: Prof. Doutora Paula C. Ramos

Faro, Dezembro 2001

"There must be no barriers for freedom of inquiry.

There is no place for dogma in science. The

scientist is free, and must be free to ask any

question, to doubt any assertion, to seek for any

evidence, to correct any errors."

Robert Oppenheimer

Agradecimentos 3

Agradecimentos

No final destes cinco anos de licenciatura quero expressar o meu mais profundo agradecimento, e sabendo que a retribuição de forma alguma será alcançada, ...

... a todo o corpo docente do curso de Bioquímica pelos conhecimentos e experiências transmitidos, não só a nível profissional como pessoal e em especial à Professora Doutora Paula Ramos, minha orientadora de estágio, pela oportunidade que me apresentou ao aceitar-me como orientando e iniciar assim a minha passagem pelo mundo da ciência e investigação.

... a toda a minha família, em especial aos meus Pais por todo o seu

amor, dedicação e esforço, não só no tempo da minha passagem pela Universidade, mas durante todo o tempo anterior. Também por toda a educação que, na sua forma simples de a transmitirem, me levaram a ser o eu de hoje. E não me poderia esquecer do gosto pela incessante busca por conhecimento e novas experiências que desde cedo me incutiram.

... à Bárbara, por toda a sua amizade e amor e por ser ela própria em

todas as alturas. Por tudo o que me deu e transmitiu ao longo destes dois anos, por todas as experiências e momentos partilhados.

... a todos os meus amigos que, perto ou longe, me apoiaram ao longo

destes cinco anos de passagem por esta academia, sempre com a sua incondicional amizade, nos momentos melhores e piores, com a força que só um verdadeiro amigo pode dar.

... à Professora Doutora Deborah Power, pela disponibilidade mostrada

quanto à utilização do seu equipamento. ... ao Professor Doutor Jurgen Dohmen, pelas ideias e conhecimentos

transmitidos, para além das estirpes de levedura por ele construídas, sem as quais este trabalho estaria muito mais dificultado.

... ao Markus London, pela amável cedência da estirpe JD305. ... à Fundação para a Ciência e Tecnologia pela bolsa cedida. ... a todos os outros não mencionados que, directa ou indirectamente,

contribuiram para a conclusão da minha licenciatura. O meu obrigado a todos vocês... Independentemente da proximidade ou

distância, as recordações ficarão para sempre...

Abreviaturas 4

Abreviaturas Ab - Anticorpo, do inglês Antibody

Ag - Antigénio, do inglês Antigene

Ala - Alanina, do inglês Alanine

Asp - Aspartato, do inglês Aspartate

ATP - Adenosina-5’-Trifosfato, do inglês Adenosine-5’-TriPhosphate

bicina - NN-Bis-(2-hidroxietil)-glicina

bisacrilamida - N’,N’ – metilenobisacrilamida

bp - Par de bases, do inglês base pair

BSA - Albumina de Soro Bovino, do inglês Bovine Serum Albumin

CBB - Azul de Coomassie, do inglês Coomassie Brilliant Blue

CE - Extracto Cru, do inglês Crude Extract

Cys - Cisteína, do inglês Cysteine

Da - Unidade de massa molecular, correspondente à massa do átomo

de hidrogénio

DCE - Extracto Cru Dessalinizado, do inglês Desalted Crude Extract

DNA - Ácido Desoxirribonuleico, do inglês Desoxirribonucleic Acid

DMSO - Dimetilsulfóxido

DTT - Ditiotreitol

EDTA - Ácido EtilenoDiaminoTetraAcético

FLAG - Epítopo composto pela sequência de aminoácidos DYKDDDDK

FT - Fracção não ligada, do inglês Flow Through

Glu - Glutamato, do inglês Glutamate

Gly - Glicina, do inglês Glycine

ha - Antigénio composto pela sequência de aminoácidos

YPYDVPDYA

HEPES - N-(2-Hidroxietil)piperazina-N’-(2-ácido etanosulfónico)

Hidrolase Ntn - Hidrolases Nucleófilas de Terminal N, do inglês N terminal

nucleophile hidrolase

His - Histidina, do inglês Histidine

IgG - Imunoglobulina G

LB - Meio de cultura Luria-Brot

Abreviaturas 5

LB-Amp - Meio de cultura LB com Ampicilina

Leu - Leucina, do inglês Leucine

LiAc - Acetato de Lítio, do inglês Lithium Acetate

log - Logarítmo de base 10

Lys - Lisina, do inglês Lysine

MOPS - 3-[N-Morpholino]Propane-Sulfonic Acid

MW - Massa molecular, do inglês Molecular Weight

NaCl - Cloreto de Sódio, do alemão NatriumChlorid

OD600nm - Densidade óptica a 600 nm, do inglês Optical Density

PEG - Polietilenoglicol

PCR - do inglês, Polymerase Chain Reaction

PSA - Persulfato de Amónio

PVDF - Fluoreto de polivinilideno, do inglês Polyvinylidene Fluoride

RNase - Hidrolase de Ácido Ribonucleico, do inglês Ribonucleic Acid

Hidrolase

rpm - Unidade de rotação, correspondente a uma rotação por minuto

SB - Tampão amostra desnaturante, do inglês Sample Buffer

SD - Meio de cultura mínimo para levedura

SDS - Dodecil Sulfato de Sódio, do inglês Sodium Dodecyl Sulfate

Ser - Serina, do inglês Serine

SN - Tampão amostra nativo, do inglês Sample Buffer for Natives

Thr - Treonina, do inglês Threonine

TEMED - N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina Tris - Tris-(hidroximetil)-aminometano

Ub - Ubiquitina

Ura - Uracilo, do inglês Uracil

UV - Ultravioleta

V0 - Volume nulo

Ve - Volume de eluição

Vt - Volume total

YPD - Meio de cultura completo para levedura, do inglês Yeast extract,

Peptone, Dextrose

Resumo 6

Resumo

A via de degradação proteica dependente de ubiquitina/proteassoma é

responsável pela maior parte da proteólise não lisossomal em células

eucariotas, que inclui a degradação de proteínas com semi-vida curta, proteínas

mal formadas, factores de transcrição, reguladores celulares, geração de

péptidos antigénicos e proteínas afectadas pelo efeito de vários tipos de stress.

Em eucariotas, o proteassoma 20S é caracterizado por possuir 14

subunidades diferentes na sua constituição, sete α e sete β, organizadas em

quatro anéis heptaméricos na forma α7β7β7α7.

Apesar da estrutura cristalina do proteassoma 20S estar resolvida e de os

passos finais na montagem deste complexo estarem caracterizados, pouco se

sabe sobre os passos iniciais deste processo. Com o objectivo de alargar o

conhecimento científico existente sobre a biogénese do proteassoma, foram

feitos estudos utilizando estirpes da levedura Saccharomyces cerevisiae com as

subunidades α7/Prs1p e β4/Pre1p e o factor de maturação Ump1p marcados

com epítopos detectáveis imunoquimicamente.

Observou-se que cádmio e choque térmico interferem no crescimento das

culturas mas não provocam aumento na expressão proteica do proteassoma

nem interferem na sua actividade catalítica. A delecção da subunidade α3/Y13

afecta a actividade quimotríptica do proteassoma 20S, e também interfere com a

distribuição normal da subunidade Prs1p ao longo do processo de montagem.

A comparação da distribuição das subunidades β4/Pre1p e α7/Prs1p em

complexos proteassomais indicou-nos que a β4/Pre1p parece ser incorporada

nos complexos pre-proteassomais numa fase mais tardia em relação à

α7/Prs1p, sugerindo que a α7/Prs1p é uma subunidade envolvida nos passos

iniciais da montagem do proteassoma 20S in vivo.

Abstract 7

ABSTRACT

The ubiquitin/proteasome pathway is responsible for most of the non

lysossomal proteolysis in eukaryotic cells, including degradation of short-lived

and abnormal proteins, transcription factors, cellular regulators, peptidic antigen

generation and proteins affected by several kinds of stress.

The eukaryotic 20S proteasome is characterized by the presence of 14

different subunits, seven α-type and seven β-type, organized in four heptameric

rings with the arrangement α7β7β7α7.

Although the crystal structure of the 20S proteasome is known and the

final steps in its assembly are characterized, little is known about the initial steps

of this process. In order to understand better the proteasome biogenesis, several

studies, using yeast strains with the subunits α7/Prs1p and β4/Pre1p and the

maturation factor Ump1p tagged for immunological detection were performed.

It was observed that cadmium and heat shock interfere in cell culture grow

but do not increase protein expression of the proteasome nor interfere with its

catalytic activity. In spite of that, the chymotryptic-like activity is altered by the

deletion of the α3/Y13 subunit, such deletion also influences the wild type

distribution of subunit Prs1p during the assembly process.

Comparison of the distribution of the subunits β4/Pre1p and α7/Prs1p in

different assembly complexes showed that the β4/Pre1p seems to be included in

the pre-proteasomal complexes in a later stage than α7/Prs1p, suggesting that

α7/Prs1 can be a subunit involved in earlier assembly steps of the proteasome in

vivo.

Índice 8

Índice

Agradecimentos 3 Sinónimos e Acrónimos 4 Resumo 6 Abstract 7 1. Introdução 12 1.1 – Prespectiva Histórica 12 1.2 – Ubiquitina em Levedura 13 1.2.1 – Enzima de Activação de Ubiquitina (E1) 16 1.2.2 – Enzimas de Conjugação de Ubiquitina (E2) 16 1.2.3 – Enzimas de Ligação Ubiquitina-Proteína (E3) 17 1.3 – Estrutura do Proteassoma 17 1.3.1 - Estrutura Cristalina do Proteassoma 20S da Arqueobactéria

Thermoplasma acidophilum

18

1.3.2 – Estrutura Cristalina do Proteassoma 20S de S. cerevisiae 19 1.4 – Identificação dos Centros Catalíticos 20 1.5 – Montagem do Proteassoma 20S 22 1.5.1 – Montagem do Proteassoma 20S em Thermoplasma 22 1.5.2 – Montagem do Proteassoma 20S em Rhodococcus 23 1.5.3 – Montagem do Proteassoma 20S em Eucariotas 23 1.5.4 – Propeptídios no Proteassoma 20S 26 1.6 – Objectivo 27 2. Materiais e Métodos 28 2.1 – Material Biológico 28 2. 2 – Métodos 28 2.2.1 – Cultura de células de E. coli 28 2.2.2 – Cultura de Células de S. cerevisiae 29

2.2.3 – Marcação da Subunidade α7/Prs1p do Proteassoma com o Epítopo ha 30 2.2.3.1 – Produção de Células Competentes de E. coli (JM105) 30 2.2.3.2 – Transformação de Células Competentes de E. coli (JM105) 31 2.2.3.3 – Purificação de DNA Plasmídico 32

Índice 9

2.2.3.4 – Linearização do Plasmídio pCR8 para Integração em Levedura 33 2.2.3.5 – Produção e Transformação de Células Competentes de Levedura 33 2.2.3.6 – Polymerase Chain Reaction (PCR) 35 2.2.4 – Extractos Proteicos 36 2.2.4.1 – Extracção por Maceração das Células 36 2.2.4.2 – Extracção com Esferas de Vidro 37 2.2.5 – Quantificação Proteica 37 2.2.6 – Cromatografia de Filtração em Gel 39 2.2.6.1 – Cromatografia de Filtração em Gel em Superose 6 40 2.2.6.2 – Cromatografia de Filtração em Gel para Dessalinização 41 2.2.6.2.1 – Cromatografia de Filtração em Gel em PD-10 42 2.2.7 – Electroforese de Biomoléculas 42 2.2.7.1 – Electroforese de Ácidos Nucleicos em Géis de Agarose 43 2.2.7.2 – Electroforese de Proteínas em Géis de Poliacrilamida

2.2.7.2.1 – Electroforese de Proteínas em Condições Desnaturantes

44 45

2.2.7.2.2 – Electroforese de Proteínas em Condições Nativas 47 2.2.8 – Detecção de Polipéptidos em Géis de Poliacrilamida 48 2.2.8.1 – Coloracão de Proteínas com Azul de Coomassie 48 2.2.8.2 – Coloração de Proteínas com Prata 49 2.2.9 – “Immunoblot” 50 2.2.9.1 – Electrotransferência de Proteínas 51 2.2.9.2 – Fixação das Proteínas à Membrana de PVDF 52 2.2.9.3 – Bloqueamento da Membrana de PVDF 53 2.2.9.4 – Incubação com Anticorpos 55 2.2.9.5 – Revelação do “Immunoblot” 56 2.2.10 – Cromatografia de Metalo-Afinidade 57 2.2.11 – Medição da Actividade Quimotríptica do Proteassoma 59 3. Resultados 60 3.1 – Efeito do Cádmio e do Choque Térmico no Crescimento de S.

cerevisiae e na Expressão da Subunidade Proteassomal α7/Prs1p

60

Índice 10

3.2 – Marcação da Subunidade α7/Prs1p com o Epítopo ha 63

3.2.1 – Estratégia Usada para a Marcação da Subunidade α7/Prs1p com ha 63

3.2.2 – Análise da Linearização do Plasmídio pCR8 65 3.2.3 – Análise da Integração por PCR e Immunoblot 65

3.2.4 – Observação do Fenótipo da Estirpe Mutante (Y13∆) sob Choque

Térmico

66

3.3 – Presença de Várias Subunidades Proteassomais ao Longo das Fracções

Obtidas por Filtração em Gel

66 3.3.1 – Análise da Actividade Quimotríptica em JD183 e AM1 66 3.3.2 – Presença de Várias Subunidades Marcadas ao Longo do Padrão de

Separação por Filtração em Gel

68

3.4. – Análise de Complexos Contendo a Subunidade β4/Pre1p e o factor de

maturação Ump1p

69

3.5 – Análise de complexos proteassomais contendo β4/Pre1p, α7/Prs1p e

Ump1p

71

3.5 – Purificação de Complexos contendo α7/Prs1pFLAG-6His 73

4 – Discussão 75 4.1 - Efeito do Cádmio e do Choque Térmico no Crescimento de S.

cerevisiae e na Expressão da Subunidade Proteassomal α7/Prs1p

75

4.1.1 – O Cádmio Influencia o Crescimento Celular em Levedura 75 4.1.2 – O Cádmio e Choque Térmico não Afectam os Níveis de Expressão

nem a Actividade Quimotríptica do Proteassoma

76

4.2 – Marcação da Subunidade α7/Prs1p com o Epítopo ha 76

4.2.1 – Verificação da Linearização do pCR8 por Cla I 76 4.2.2 – Verificação da Integração por PCR e Immunoblot 77

4.2.3 – A Estirpe Mutante JD305 (Y13∆) é Sensível a Stress Provocado por

Choque Térmico

77

4.3 – Existem Diferenças na Distribuição das Várias Subunidades ao Longo de

Complexos Separados por Exclusão Molecular

78

4.3.1 – A Estirpe Mutante AM1 Apresenta uma Actividade Catalítica

Semelhante à Estirpe Selvagem no Proteassoma 26S, mas mais

Índice 11

Reduzida no Proteassoma 20S 79

4.3.2 – A Subunidade α7/Prs1p Está Presente ao Longo de Todas as

Fracções Obtidas por Filtração em Gel

79

4.3.3 – A Delecção da Subunidade α3/Y13 Provoca Alterações na Distribuição

da Subunidade α7/Prs1p

82

4.4 – Purificação de Complexo contendo α7Prs1pFLAG-6His 83

5 – Conclusões 85 6 – Perspectiva Futura 86 7 – Bibliografia 87 8 – Anexos 96

Introdução 12

1 – Introdução 1.1 – Perspectiva Histórica O lisossoma tem sido considerado como o local de “despejo” da célula

pela sua capacidade de degradar proteínas, devido ao grande número de

proteases não específicas presentes, e de digerir outros compostos não

necessários. No entanto, como este processo de degradação não é específico

(Bohley et al., 1992) não era previsível que fosse responsável pela degradação

selectiva de proteínas, requisito necessário ao mecanismo de regulação celular.

Em 1980 foi isolada e caracterizada uma endopeptidase que, devido à

existência de várias subunidades na sua composição, foi designada por

complexo proteolítico multicatalítico (“multicatalytic protease complex”). Este

complexo, de elevada massa molecular, com cerca de 700 kDa, possui várias

actividades proteolíticas, nomeadamente actividade tríptica, quimotríptica e pós-

acídica (Wilk e Orlowski, 1980, 1983; Orlowski e Wilk, 1981). Aproximadamente

na mesma altura, foi também descoberto um complexo proteolítico alcalino

existente no músculo da carpa, com cerca de 600 kDa, com 15 nm de

comprimento e 10 nm de diâmetro, composto por quatro anéis (Hase et al.,

1980). Complexos proteolíticos de massa molecular elevada foram, também,

descritos noutros tipos de células como eritrócitos (Edmunds e Pennington,

1982) e células do músculo esquelético de rato (Dahlmann et al., 1983). Em

1984 foi descoberto um mesmo complexo semelhante em levedura (Achstetter

et al., 1984). Após o reconhecimento da sua função nas diversas espécies, esta

protease multicatalítica passou a ser denominada por proteassoma (Arrigo et al.,

1988).

No final dos anos oitenta, a identificação de um complexo maior contendo

o núcleo proteolítico previamente identificado, levou à distinção dos dois

complexos com base na sua constante de sedimentação: o proteassoma 26S e

o proteassoma 20S (Hough et al., 1987; Eytan et al., 1989; Discoll e Goldberg,

1990).

Introdução 13

A associação do proteassoma com a via proteolítica dependente da

ubiquitina teve início em 1986 com a descoberta de uma protease dependente

de ATP que degradava lisozima ubiquitilada (Hough et al., 1986). No ano

seguinte foi identificada esta protease como sendo o proteassoma 26S (Hough

et al., 1987). Heinemeyer et al., 1991 demonstrou que mutações no

proteassoma que originavam uma actividade quimotríptica baixa levava à

acumulação de proteínas ubiquitiladas na célula, demonstrando claramente a

participação do proteassoma no sistema proteolítico dependente de ubiquitina.

Desde a degradação de proteínas com semi-vida curta, proteínas com

erros de síntese ou desnaturadas, degradação de factores de transcrição,

geração de péptidos antigénicos para serem apresentados pela classe I do

complexo MHC (“major histocompatibility complex”), regulação do ciclo celular,

envolvimento no controlo de qualidade das proteínas no retículo endoplasmático,

muitas foram as funções já associadas a este complexo multicatalítico que é o

proteassoma.

1.2 – Ubiquitina em Levedura

A ubiquitina (Ub) é uma proteína com 76 resíduos de aminoácidos,

altamente conservada (entre levedura e mamíferos existe apenas uma diferença

de três resíduos de aminoácidos) e presente em todas as células eucariotas

(Özkaynak et al., 1987; Hershko et al., 1998) (figura 1).

Figura 1 – Representação esquemática da estrutura terciária da ubiquitina de levedura, determinada por cristalografia de raio-X a 1,8 Å de resolução. Destaque para o resíduo Lys48 (amarelo) e Gly76 (azul). Baseado na estrutura da Ub determinada por Vijay-Kumar et al., 1987

Introdução 14

A Ub está associada ao principal sistema proteolítico extra-lisossomal

presente nas células eucariotas (a via proteolítica dependente de

Ub/proteassoma). Esta via está envolvida na regulação da divisão e ciclo celular,

diferenciação e desenvolvimento, mecanismos de resposta celular a stress e

modeladores extracelulares, modulação de receptores da superfície membranar,

canais iónicos e mecanismos de secreção, reparação genómica a nível dos

ácidos desoxirribonucleicos (DNA) e biogénese de organelos (Hilt e Wolf, 2000).

A Ub, no seu estado livre, não possui qualquer actividade enzimática e,

quando ligada de forma covalente a outras proteínas, funciona como marcador,

seleccionando as proteínas para destruição pelo proteassoma 26S

(Hochstrasser, 1996; Smith, 1996; Pickart, 1997).

As proteínas-substrato que sofrem ubiquitilação são proteínas com erros

de síntese ou estruturalmente deformadas. No entanto, são também marcados

para degradação reguladores celulares, muitos dos quais com tempos de semi-

vida curtos, em resposta a sinais específicos ou em determinados passos do

ciclo celular.

A degradação de uma proteína pelo mecanismo proteolítico dependente

de Ub/proteassoma pode ser resumida em dois passos. O primeiro envolve a

ligação de várias moléculas de Ub ao substrato. O segundo leva ao

reconhecimento e degradação da proteína marcada pelo proteassoma 26S (Hilt

e Wolf, 2000).

A conjugação da Ub à proteína com vista a ser degradada é feita em três

passos: inicialmente a Ub é activada no seu terminal carboxílico (resíduo de

glicina (-Gly)) pelo enzima de activação de Ub, E1. Seguidamente, um dos

enzimas de conjugação de Ub (E2), transfere a Ub activada para um dos

enzimas do grupo E3, enzimas de ligação de Ub que, por sua vez, selecciona a

proteína a degradar através da interacção com um sinal de degradação

existente na proteína alvo. A conjugação da Ub à proteína substrato é efectuada

por este grupo de enzimas, que catalisam o último passo da conjugação, a

ligação Ub-proteína alvo. Forma-se então uma ligação isopeptídica entre o grupo

Introdução 15

carboxílico activado do terminal C da Ub e o grupo ε-NH2 de um resíduo de lisina

(Lys) existente na proteína alvo. Sucedem-se vários passos de enlongamento da

cadeia de Ub, com a ligação de um certo número destas proteínas à Ub já ligada

à proteína alvo. O crescimento desta cadeia poliubiquitilada é efectuado pela

ligação de outras Ub activadas ao resíduo Lys48 da Ub que lhes precede (figura

2).

Estas cadeias de poli-Ub ligadas à proteína alvo formam um conjunto

que é reconhecido por um ou mais constituintes da partícula reguladora 19S do

proteassoma (Pickart et al., 1997) e iniciar assim o processo de degradação por

parte deste.

Figura 2 – Mecanismo de conjugação da Ub à proteína a degradar. Activação da Ub pela E1, transporte até à proteína alvo ligada à E3 pela E2, conjugação da Ub à proteína alvo pela E3, formação da cadeia de poli-Ub e reconhecimento e degradação da proteína alvo pelo proteassoma. As Ub, através de isopeptidases, são libertadas e recicladas, podendo ser utilizadas novamente após activação (estrutura do proteassoma 26S adaptada de Voges et al., 1999).

Introdução 16

Na levedura, a Ub é codificada por quatro genes, UBI1, UBI2, UBI3 e

UBI4. Os três primeiros codificam formas precursoras de Ub que, após a

tradução, são rapidamente processadas para formar Ub livre em condições

normais de crescimento (Hochstrasser, 1996). O quarto gene, UBI4, é apenas

expresso em condições de stress e é constituído por cinco repetições da

sequência que codifica para uma molécula de Ub.

1.2.1 – Enzima de Activação de Ubiquitina (E1) O enzima de activação de ubiquitina é essencial para o correcto

funcionamento da via proteolítica dependente de Ub/proteassoma e mesmo para

a viabilidade das células, uma vez que a delecção do gene de S. cerevisiae,

UBA1, que codifica para este enzima de 114 kDa conduz à morte das células

(McGrath et al., 1991).

O E1 é fosforilado e aparenta ter como única função a catálise das

modificações necessárias à activação das moléculas de Ub. O enzima hidrolisa

ATP durante a formação de um éster de tiol entre o grupo carboxílico da glicina

(Gly76) terminal da Ub e um resíduo de cisteína do enzima, dando origem a uma

ligação tioéster E1-Ub de alta energia (McGrath et al., 1991).

1.2.2 – Enzimas de Conjugação de Ubiquitina (E2) No genoma de S. cerevisiae foram detectados treze genes que codificam

enzimas de conjugação de Ub. Estes enzimas caracterizam-se pela presença de

um domínio conservado de aproximadamente 150 resíduos de aminoácidos, o

domínio de conjugação de Ub (domínio UBC). Na região central deste domínio

encontra-se o resíduo de Cys necessário para a ligação tioéster com a Ub

(Jentsch et al., 1990).

Alguns destes enzimas apresentam domínios diferentes entre si, que

poderão estar relacionados com a especificidade para o substrato e para o

enzima E3 que lhe corresponde (Jentsch, 1992).

Introdução 17

Uma das principais funções até agora atribuídas a este conjunto de

enzimas é o transporte e transferência da Ub activada para o complexo E3-

substrato.

1.2.3 – Enzimas de Ligação Ubiquitina-Proteína (E3) Apesar de se aceitar que os enzimas do conjunto E3 têm uma forte

participação no reconhecimento de substratos (as proteínas para degradar) o

nível de conhecimento sobre estes enzimas é ainda muito baixo (Peters et al.,

1998). Uma das maiores dificuldades na identificação e caracterização de novos

enzimas desta família deve-se ao facto da existência de baixa homologia entre

diferentes tipos de E3, bem como os diferentes tipos de funcionamento destes

enzimas (Hershko e Ciechanover, 1998).

Em alguns casos de E3, o substrato tem uma interacção directa com o

enzima, enquanto que noutros casos, essa interacção é efectuada via uma

molécula adaptadora. O método de transferência da Ub activada para a proteína

alvo também varia consoante a E3 em causa, podendo haver a transferência da

ligação tioéster da E2 directamente para a E3 e daí para o substrato ou a ligase

participar apenas como ajudante na transferência da Ub da E2 directamente

para o substrato, ocorrendo neste caso a formação de um complexo E3-E2-

substrato (Hershko e Ciechanover, 1998).

A definição de enzima E3 pode então ser apresentada como a de um

enzima que liga, directa ou indirectamente, um substrato específico e promove a

transferência da Ub, directa ou indirectamente, de um intermediário tioéster para

uma ligação amida com proteínas ou cadeias poli-Ub.

1.3 – Estrutura do Proteassoma O proteassoma 26S é composto por um núcleo proteolítico, o

proteassoma 20S e por dois complexos regulatórios, os complexos 19S, também

designados por PA700 (Peters et al., 1993). Pensa-se que estes complexos

Introdução 18

regulatórios, dependentes de ATP, estão envolvidos no reconhecimento das

cadeias de poli-Ub ligadas a proteínas para degradação e no desenrolamento e

translocação dos substratos para o interior da câmara catalítica localizada no

proteassoma 20S (Tanaka et al., 1997; Seeger et al., 1997). Os complexos 19S

podem ser substituídos por outros complexos activadores da proteólise,

independentes de ATP, os complexos PA28 (Chu-Ping et al., 1992).

1.3.1 - Estrutura Cristalina do Proteassoma 20S da Arqueobactéria Thermoplasma acidophilum

Imagens obtidas por microscopia electrónica do proteassoma 20S de

arqueobactérias (Hegerl et al., 1991) e de eucariotas (Baumeister et al., 1988)

são praticamente indistinguíveis. Ambas mostram uma partícula cilíndrica com

aproximadamente 150 Å de comprimento e 110 Å de diâmetro.

Ao contrário dos eucariotas, as arqueobactérias possuem um

proteassoma composto por apenas duas subunidades diferentes, denominadas

por α e β (Dahlmann et al., 1989), com elevada homologia da sua estrutura

primária e terciária, organizadas num complexo com quatro anéis, cada qual

com sete subunidades e em que os dois anéis formados por subunidades β se

encontram entre os dois anéis formados por subunidades α (Grziwa et al., 1991)

(figura 3).

A estrutura cristalina do proteassoma de T. acidophilum veio, ainda,

demonstrar que os anéis formam um complexo cujo interior é dividido em três

compartimentos: duas antecâmaras e uma câmara central (Jap et al., 1993;

Löwe et al., 1995).

Figura 3 – Estrutura cristalina do proteassoma de T. acidophilum. A vermelho estão representadas as subunidades β entre as subunidades α, a azul (Löwe et al, 1995).

Introdução 19

1.3.2 – Estrutura Cristalina do Proteassoma 20S de S. cerevisiae

Na levedura S. cerevisiae, as subunidades α e β presentes divergiram

das que se encontram em arqueobactérias dando origem a sete formas

diferentes para cada um dos tipos. A estrutura α7β7β7α7 mantém-se, ocupando

agora, cada uma das catorze subunidades diferentes, uma posição específica e

dando origem a uma simetria do tipo C2, como observado na sua estrutura

cristalina (Groll et al., 1997) (figura 4).

A estrutura tridimensional de proteassomas de mamíferos não é ainda

conhecida embora a topologia exacta das subunidades vizinhas em cada anel

do proteassoma humano tenha sido elucidada utilizando métodos de

“crosslinking”, e à excepção da subunidade β7 que se encontra na posição de β2

o rearranjo das subunidades é idêntico ao encontrado para o proteassoma de

levedura (Kopp et al., 1997). No entanto, três das subunidades β podem ser

substituídas por outras subunidades induzidas por citoquinas, introduzindo assim

o funcionamento do proteassoma no sistema imunitário.

A entrada para o canal central do proteassoma 20S de levedura está

obstruída por uma rede formada pelos resíduos pertencentes ao terminal N de

cada subunidade α (figura 5).

Figura 4 – Estrutura cristalina do proteassoma 20S de S. cerevisiae. Em tons de azul são apresentadas as subunidades α e em tons de verde as subunidades β (Groll et al., 1997).

Introdução 20

No caso das arqueobactérias, esta rede não é tão complexa como nos

eucariotas, podendo ser esta uma justificação para a existência de activadores

nos eucariotas e não nos procariotas.

Um aspecto interessante da estrutura das subunidades α do proteassoma

20S de S. cerevisiae está no tamanho dos terminais C, que se encontram na

periferia da molécula. Algumas subunidades β também possuem longos teminais

carboxílicos que por sua vez interagem com outras subunidades vizinhas e são

o factor determinante para a posição específica das subunidades na estrutura

(Groll et al., 1997).

1.4 – Identificação dos Centros Catalíticos Estudos efectuados usando mutagénese dirigida (Seemüller et al., 1995;

Seemüller et al., 1995) e co-cristalografia das subunidades β de Thermoplasma

com inibidores mostraram que o resíduo de treonina (Thr1) é o nucleófilo

necessário para iniciar a hidrólise de ligações peptídicas. A substituição deste

resíduo por alanina (Ala) origina proteassomas inactivos (Seemüller et al., 1995).

Esta função do Thr1 como centro catalítico formado por um único resíduo

colocou o proteassoma numa nova família de proteínas designada por

Figura 5 – Entrada do canal central do proteassoma 20S de T. acidophilum (esquerda, (Löwe et al.,

1995)) e do proteassoma 20S de S. cerevisiae (direita, (Groll et al., 1997)).

Introdução 21

hidrolases nucleófilas do terminal N (hidrolases Ntn) (Brannigan et al., 1995).

Outros resíduos que se revelaram essenciais para a actividade catalítica do

proteassoma no Thermoplasma foram o resíduo de glutamato 17 (Glu17), o

resíduo de aspartato 166 (Asp166) e o resíduo de lisina 33 (Lys33) (Seemüller et

al., 1995).

Em levedura, nos três pares de subunidades β com actividade catalítica,

estão presentes os mesmos resíduos considerados essenciais no

Thermoplasma, com excepção do Glu17 que se encontra substituído por um

resíduo de aspartato. Na zona envolvente ao centro catalítico situam-se os

resíduos de Lys33, Asp17, Ser129 e Asp166 que formam um sistema de ligações de

hidrogénio e pontes salinas que levam à polarização do carbono do grupo

carbonilo da ligação peptídica a ser clivada, facilitando assim o ataque

nucleofílico do Thr1 (Ditzel et al., 1998). A actividade peptidásica do

proteassoma 20S foi testada utilizando como substrato vários péptidos sintéticos

cuja degradação originava um produto fluorogénico, permitindo a caracterização

da especificidade das diferentes subunidades catalíticas. Assim, à subunidade

β1/Pre3p corresponde a actividade pós-acídica, a subunidade β2/Pup1p

apresenta actividade tríptica e a actividade quimotríptica é catalisada pela

subunidade β5/Pre2p (Chen et al., 1996; Arendt et al., 1997; Heinemeyer et al.,

1997). A integridade dos sítios catalíticos é sensível a alterações

conformacionais nas suas regiões mais próximas já que mutações noutras

subunidades β que não as três catalíticas e mesmo em subunidades α, apesar

da distância, levam a uma quebra na actividade de proteólise (Heinemeyer et al.,

1991; Hilt et al., 1993; Chen et al., 1996), ficando em aberto a participação das

outras subunidades proteassomais na degradação de substratos. Foi ainda

sugerida a hipótese de cooperatividade entre as subunidades catalíticas perante

um mesmo substrato (Djaballah et al., 1992; Stein et al., 1996).

A degradação de substratos proteicos pelo proteassoma 20S resulta

numa mistura de fragmentos com cerca de 3 a 30 resíduos de aminoácidos

(Wenzel et al., 1994; Niedermann et al., 1997).

Introdução 22

1.5 – Montagem do Proteassoma 20S A montagem e maturação do proteassoma 20S em eucariotas, requer

uma coordenação precisa de eventos de forma que as 14 subunidades

diferentes encontrem a sua localização correcta no complexo activo constituído

por 28 subunidades (Schmidt et al., 1997; Gerards et al., 1998).

As subunidades β do complexo proteassomal em arqueobactérias

(Thermoplasma) (Zwickl et al., 1992), eubactérias (Rhodococcus) (Zühl et al.,

1997) e eucariotas são sintetisadas na forma de precursores cataliticamente

inactivos, com uma sequência de aminoácidos no terminal N (propeptídio) cuja

clivagem torna as subunidades activas.

1.5.1 – Montagem do Proteassoma 20S em Thermoplasma

A expressão, em separado, das subunidades α e β do proteassoma de

Thermoplasma, em E. coli, mostrou que apenas a primeira tem a capacidade

de formar uma estrutura polimérica na forma de um anel duplo com sete

monómeros cada (Zwickl et al., 1992, 1994). Quanto às subunidades β, não

houve qualquer tipo de oligomerização, nem maturação das suas proformas. A

expressão de subunidades β sem o propeptídio respectivo, na ausência de

subunidades α, revelou-as inactivas cataliticamente. No entanto, co-expressão

dos monómeros α e β deu origem a proteassomas funcionais,

independentemente da presença ou ausência dos propeptídios. Estes resultados

sugeriram que um anel α poderá servir de local de ligação das subunidades β e

que, alterações conformacionais nas subunidades β, originadas pela ligação

destas ao anel α, permitam a junção de duas metades do proteassoma,

montadas separadamente, e levem à degradação dos propeptídios tornando as

subunidades β cataliticamente activas.

Introdução 23

1.5.2 – Montagem do Proteassoma 20S em Rhodococcus O proteassoma 20S de eubactéria Rhodococcus erythropolis possui na

sua constituição duas subunidades α e duas β diferentes, com grande homologia

entre elas, organizadas na estrutura α7β7β7α7, característica do proteassoma

20S (Tanamura et al., 1995).

A expressão de qualquer das combinações possíveis entre as

subunidades α e β do proteassoma 20S de Rhodococcus em E. coli originou

proteassomas funcionais, sem a necessidade de qualquer cofactor adicional

(Zühl et al., 1997). A expressão das subunidades α sem as β, contrariamente ao

que se observou para as subunidades de Thermoplasma, não levou à

oligomerização, permanecendo as subunidades na sua forma monomérica,

sugerindo que os primeiros complexos deste proteassoma 20S são formados

por heterodímeros α/β (Zühl et al., 1997).

Apesar da formação de proteassomas funcionais não necessitar do

propeptídio das subunidades β (mais longos que o das subunidades β de

Thermoplasma), a sua ausência torna a biogénese um processo mais moroso. A

adição do propeptídio em trans leva a uma aceleração do processo, o que

sugere que a autólise do propeptídio é um dos passos limitantes na formação do

proteassoma 20S (Hilt e Wolf, 2000). A utilização de mutantes com deficiências

no processamento dos propeptídios permitiu a caracterização do proteassoma

nesta fase da montagem, revelando uma estrutura com aproximadamente 100

kDa adicionais, relativamente ao 20S processado, correspondentes aos 14

propeptídios. A estrutura foi observada ao microscópio electrónico revelando que

os propeptídios ocupam a cavidade central e podendo estender-se até às duas

antecâmaras (Mayr et al., 1998).

1.5.3 – Montagem do Proteassoma 20S em Eucariotas

Introdução 24

A montagem do proteassoma 20S em eucariotas é um processo ainda

pouco conhecido.

Três subunidades α de origem humana foram expressas individualmente

em E. coli, e apenas a subunidade α7/HsC8 revelou a formação de um anel

duplo semelhante ao obtido em Thermoplasma (Gerards et al., 1997). As

subunidades α6/HsC2 e α1/Pros27 não apresentaram qualquer tipo de

oligomerização quando expressas individualmente, mas foram incorporadas nos

anéis formados quando coexpressas com α7/HsC8. A incorporação não se

mostrou dependente de qualquer tipo de interacção α7/α6 ou α7/α1 uma vez

que a composição das estruturas obtidas foi bastante heterogénia (Gerards et

al., 1998).

Em mamíferos foram descritos intermediários 13-16S (Frentzel et al.,

1994) e 15S (Yang et al., 1995), proteoliticamente inactivos e que exibiam

padrões de subunidades diferentes do encontrado no proteassoma 20S. Estes

complexos apresentavam todas as subunidades α mas estavam em falta

algumas subunidades β e as presentes apresentavam-se ainda na forma

precursora (Frentzel et al., 1994). O complexo 15S foi descrito como precursor

da maturação do proteassoma 20S (Yang et al., 1995). A forma 13S, de 300

kDa, foi identificada como meio proteassoma contendo subunidades β não

processadas. A forma 16S possuía uma massa total de 600 kDa (Schmidtke et

al., 1997).

Apesar das semelhanças de constituição dos dois complexos 16S e 20S,

a diferença no factor de sedimentação pode dever-se a diferenças

conformacionais entre os dois complexos que, por arranjos estruturais

posteriores e assistidos por chaperones, leva à maturação do complexo 16S em

proteassoma 20S (Schmidtke et al., 1997).

Em rato, foram também foram encontrados estes complexos contendo

todas as subunidades α e um conjunto de subunidades β (β2, β3 e β4), o que

compromete a hipótese de os complexos percursores serem formados por

dímeros α/β como na eubactéria Rhodococcus (Zühl et al., 1997). De notar que

Introdução 25

estas subunidades β não estabelecem contacto directo com as subunidades β

correspondentes do anel β simétrico. A entrada das restantes subunidades β

aparenta ser um processo rápido, uma vez que só foram encontradas em

complexos com um curto tempo de existência (Nandi et al., 1997). As

subunidades β5, β6 e β7 possuem extensões no terminal C direccionadas para

o anel β oposto (Groll et al., 1997) que poderão servir para aumentar a

especificidade do posicionamento na junção de dois meios proteassomas.

A montagem correcta de dois complexos correspondentes a meio

proteassoma depende de um factor adicional, o Ump1p (Ramos et al., 1998).

Este factor encontra-se presente em complexos precursores que se julgam

corresponder a metades proteassomais e é enclausurado quando duas dessas

estruturas se juntam para formar a partícula 20S. Após a maturação das

subunidades β o Ump1p é degradado tornando-se o primeiro substrato do

complexo (figura 6). Este factor não é essencial para a maturação proteassomal

como verificado pela viabilidade celular de células cujo gene UMP1 foi

delectado, mas em sua ausência, o processo de maturação e montagem do

proteassoma é ineficiente resultando na acumulação de precursores

proteassomais e na reduzida actividade catalítica dos proteassomas formados

(Ramos et al., 1998).

~15S – Complexo Ump1p Estruturas intermediárias proteassoma 20S

Figura 6 – Modelo da função do Ump1p na maturação do proteassoma 20S. Dois complexos 15S (A) contendo o factor Ump1p unem-se (1) para dar origem a uma estrutura intermediária (B) onde ocorrem arranjos conformacionais que conduzem à autocatálise dos propeptídios (2) tornando assim as subunidades proteolíticas activas (C). Esta activação permite a degradação de substratos, incluindo o próprio Ump1p (3) , com o proteassoma 20S a atingir a sua forma funcional (D); adaptado de Ramos et al., 1998

Introdução 26

1.5.4 – Propeptídios no Proteassoma 20S

À semelhança de outras proteinases, os propeptídios das subunidades β

catalíticas do proteassoma 20S aparentam ter uma função inibitória das mesmas

de modo a impedir a função proteolítica prematura das subunidades. Além disso,

é possível que funcionem como ajudantes na obtenção do enrolamento e

posicionamento correctos das subunidades na estrutura.

A delecção do propeptídio da subunidade β5/Pre2p em levedura verificou-

se ser letal (Chen et al., 1996). A coexpressão da subunidade β5/Pre2p com a

subunidade β5/Pre2p mutante à qual faltava o propeptídio mostrou não haver

incorporação da última na estrutura proteassomal, provando assim a

necessidade do propeptídio de 75 resíduos para a correcta incorporação desta

subunidade. A adição do propeptídio na forma trans compensou plenamente a

falta do mesmo na subunidade β5 mutada (Chen et al., 1996).

A função do propeptídio da subunidade β5/Pre2p foi salientada pela

descoberta do factor adicional Ump1p na montagem do proteassoma (Ramos et

al., 1998). No entanto, apesar da presença deste propeptídio ser essencial

(fornecido em trans ou na subunidade não processada) em presença de Ump1p,

quando o gene codificante para este factor foi delectado, o propeptídio tornou-se

dispensável, dando origem a células viáveis (Ramos et al., 1998). Estes

resultados excluem a hipótese da necessidade do propeptídio da subunidade

β5/Pre2p para a introdução desta subunidade na estrutura e, no entanto,

mostram-no essencial na presença do factor Ump1p, sugerindo uma interacção

entre este e o propeptídio, que promove alterações conformacionais necessárias

para a correcta maturação do proteassoma 20S em levedura (Ramos et al.,

1998).

Os propeptídios das subunidades β1/Pre3p, β2/Pup1p e β7/Pre4p não

são essenciais para a viabilidade celular (Jäger et al., 1999). No entanto, foram

encontradas anormalidades no processamento da subunidade β5/Pre2p na

ausência destes propeptídios, demonstrando assim que o processo de

maturação é afectado (Arendt et al., 1999). A expressão do propeptídio da

Introdução 27

subunidade β2/Pup1p na forma trans quando esta é expressa sem ele diminuiu

os defeitos de processamento (Jäger et al., 1999).

A análise dos propeptídios da subunidade β5/Pre2p das várias espécies

estudadas permite observar que existe grande uniformidade no seu tamanho,

em contraste com a diversividade da sua sequência primária, o que leva a

suspeitar de uma co-evolução entre estes e os vários homólogos de Ump1p

encontrados em eucariotas (Hilt e Wolf, 2000).

As diferentes contribuições dos propeptídios das várias subunidades β

para a montagem e maturação proteassomais reflecte a conjugação e

interdependência do processamento dos propeptídios.

1.6 – Objectivo Este trabalho de conclusão de licenciatura em Bioquímica teve como

objectivo científico aumentar o conhecimento actual sobre a montagem do

proteassoma 20S, um dos elementos chave do principal processo de

degradação selectiva na célula, a via de degradação dependente de

ubiquitina/proteassoma, em S. cerevisiae, nomeadamente ao nível dos

complexos precursores da montagem, através da identificação e caracterização

dos mesmos.

Materiais e Métodos 28

2 – Materiais e Métodos 2.1 – Material Biológico A realização deste trabalho envolveu a utilização de várias estirpes de

Saccharomyces cerevisiae (levedura de padeiro) e Escherichia coli, com

características específicas, como descrito na Tabela I.

Tabela I – Material biológico utilizado, com destaque para as suas características genómicas

relevantes;

Estirpes de S. cerevisiae Estirpe Genótipo relevante Fonte Comentário

JD47-13C MATa his3-∆200 leu2-3, 112 lys2-801 trp1-∆63 ura3-52 Dohmen J Dohmen et al., 1995

JD125 MATa PRE1-ha::YIplac 211 Dohmen J derivada de JD47-13C

JD127 MATa UMP1-ha::Ylplac128 PRE1-ha::Ylplac211 Dohmen J derivada de JD47-13C

JD129 MATa UMP1-ha::YIplac 128 Dohmen J derivada de JD47-13C

JD183 MATa PRS1-ha::YIplac211 Ramos P derivada de JD47-13C JD184 MATa PRS1-FLAG-6his::YIplac211 Ramos P derivada de JD47-13C JD228 MATa PRS1-FLAG-6His Ramos P derivada de JD47-13C JD305

AM1

MATa Y13∆::HIS3

MATa Y13∆::HIS3 PRS1-ha::YIplac211

London M

Este trabalho

derivada de JD47-13C

derivada de JD305

Estirpes de E. coli Estirpe Genótipo relevante Fonte JM105 end A1, thi, rps L, sbc B15, hsd R4, ∆ (lac-proAB),[F’,

traD 36, proAB, lac IqZ ∆M15]

Yanisch et al., 1985

2. 2 – Métodos 2.2.1 – Cultura de células de E. coli

Um óptimo desenvolvimento das células ocorre quando estas se

encontram num meio que contenha todos os nutrientes necessários. No caso de

meios selectivos, devem conter ou excluir a substância de selecção.


As culturas de E. coli foram efectuadas em meio Luria-Brot (LB) contendo

0,5% (m/v) extracto de levedura (GIBCOBRL), 1% (m/v) Bacto-Triptona (DIFCO)

e 0,5% (m/v) NaCl. O meio selectivo com ampicilina (LB-Amp) foi obtido

adicionando 0,12% (m/v) deste antibiótico. Os meios sólidos foram conseguidos

pelo acréscimo de 2% (m/v) de agar. Os meios foram esterilizados no autoclave

a 120 ºC, 0,2 MPa, durante 20 minutos. A solução stock de ampicilina (150mM)

foi esterilizada através de um filtro de 0,2 µm.

As células foram plaqueadas a partir de um stock em 15% (v/v) de glicerol

armazenado a –80 ºC, retirando-se, com um palito estéril, uma pequena

quantidade e espalhando-se ao longo da placa de forma a obter colónias

isoladas. As culturas líquidas foram obtidas pela inoculação de uma determinada

quantidade de meio líquido, normalmente 5 mL, com uma colónia proveniente de

uma placa contendo meio sólido. Todo o procedimento foi efectuado em redor

de uma chama de bico de Bunsen de forma a manter as condições estéreis.

As células foram deixadas a crescer numa incubadora (Orbital Incubator

SI50 – STUART SCIENTIFIC) a 37 ºC, durante a noite. No caso de culturas em

meio líquido foi mantida agitação orbital de 200 rpm.

2.2.2 – Cultura de Células de S. cerevisiae

As estirpes de levedura utilizadas neste trabalho derivam da estirpe JD47-

13C cujo genótipo se encontra descrito na Tabela I. Estas células são

auxotróficas para os aminoácidos histidina, leucina, lisina, triptofano e para o

uracilo, isto é, só crescem em meios contendo estes aminoácidos uma vez que

genes que codificam para enzimas das vias de síntese destes compostos se

encontram mutados.

As estirpes JD47-13C, JD305 e JD228 foram cultivadas em meio

completo YPD (1% (m/v) de extracto de levedura, 2% (m/v) de peptona, 2%

(m/v) de glucose (MERCK)). O meio YPD sólido foi obtido pela adição de 2%

(m/v) de agar antes da esterilização da solução, em autoclave, nas condições

acima mencionadas.


O meio mínimo é composto por 2% (m/v) de glucose, 0,25% (m/v) de SD

(DIFCO), 0,002% (m/v) de adenina, 0,004% (m/v) de uracilo, 0,002% (m/v) de

arginina, 0,001% (m/v) de histidina, 0,006% (m/v) de isoleucina, 0,006% (m/v) de

leucina, 0,004% (m/v) de lisina, 0,001% (m/v) de metionina, 0,006% (m/v) de

fenilalanina, 0,005% (m/v) de treonina e 0,004% (m/v) de triptofano. No caso de

meios selectivos foi excluído o composto de selecção. No caso de meios sólidos,

preparou-se uma solução de 2% (m/v) de agar e, no seu estado líquido,

adicionaram-se os restantes componentes do meio, devidamente estéreis, nas

concentrações respectivas.

As estirpes JD129, JD183, JD184 e AM1 foram cultivadas em meio SD-

Ura (meio mínimo sem uracilo). A estirpe JD125 foi cultivada em meio SD-Leu

(meio mínimo sem leucina). A estirpe JD127 foi cultivada em meio SD-Ura-Leu

(meio mínimo com exclusão de leucina e uracilo).

A inoculação dos meios sólido e líquido realizou-se de modo semelhante

ao descrito para E. coli.

As células foram colhidas quando apresentavam densidade óptica a

600 nm (OD600nm) de 1,0, 3,0 ou 6,0 ± 0,2 através de centrifugação a 3000 g,

4 ºC, durante 5 minutos. Os sedimentos foram lavados uma vez com água, para

eliminar resíduos do meio de cultura.

As células cujos extractos proteicos se destinaram à análise e purificação

de complexos proteasomais foram ressuspensas em 2 mL de tampão de

extracção por grama de massa fresca e congeladas em azoto líquido sendo

depois armazenadas a –80 ºC até serem utilizadas.

2.2.3 – Marcação da Subunidade α7/Prs1p do Proteassoma com o Epítopo

ha em JD305 2.2.3.1 – Produção de Células Competentes de E. coli (JM105) A obtenção de células competentes de E. coli, ou seja, células com a

capacidade de receber material genético, nomeadamente plasmídios, e de o


replicar durante a sua multiplicação, realizou-se de acordo com uma variante do

método desenvolvido por Cohen et al. (1972).

Todo o procedimento foi executado utilizando material e soluções

estéreis, previamente colocados a 4 ºC.

Inocularam-se 5 mL de LB com as células de E. coli (JM105) e deixou-se

a crescer a 37 ºC durante a noite. Mediu-se a OD600nm desta cultura e procedeu-

se à diluição necessária para começar uma nova cultura de 100 mL com

OD600nm=0,2. Quando a cultura atingiu a OD600nm=0,6 colocou-se o frasco em

gelo e agitou-se suavemente para garantir um arrefecimento rápido. Colheram-

se as células a 3840 g (JA-14 – Beckman), durante 10 minutos, a 4 ºC.

Ressuspendeu-se o sedimento por agitação, em gelo, em 20 mL de TfB I (30

mM de acetato de potássio, 50 mM de cloreto de manganésio (MERCK), 100mM

de cloreto de potássio, 10mM de cloreto de cálcio e 15% (v/v) de glicerol).

Repetiu-se a centrifugação e, da mesma forma, ressuspendeu-se o sedimento

em 4 mL de TfB II (10mM de Na-MOPS a pH 7, 75mM de cloreto de cálcio,

10mM de cloreto de potássio e 15% (v/v) de glicerol). A suspensão foi dividida

em alíquotas de 100 µL, congeladas em azoto líquido e armazenadas a –80 ºC.

2.2.3.2 – Transformação de Células Competentes de E. coli (JM105) Com este processo pretendeu-se introduzir o plasmídio pCR8 (figura 7)

nas células JM105 de modo que, durante a sua multiplicação possa ocorrer

amplificação do plasmídio que posteriormente pode ser extraído e purificado.

Assim, utilizando uma pequena quantidade de um plasmídio purificado é

possível produzir grandes quantidades desse mesmo material.

Removeu-se uma alíquota de 100 µL de células competentes de E. coli

(JM105) armazenadas a –80 ºC e colocou-se em gelo até descongelar.

Adicionou-se 10 µL do plasmídio pCR8 e manteve-se o tubo em gelo durante 30

minutos. Para facilitar a entrada do plasmídio nas células, induziu-se um choque

térmico colocando as células num banho a 42 ºC, durante 5 minutos. As células

foram então diluídas em 1 mL de meio LB e deixadas a crescer durante 1 hora, a


37 ºC, tendo sido, de seguida, centrifugadas durante 30 segundos a 16100 g

(Ependorff Centifuge 5145D). Removeu-se cerca de 0,75 mL do sobrenadante,

ressuspendeu-se o sedimento no sobrenadante restante e plaqueou-se em meio

sólido selectivo, LB-Amp. Incubou-se a placa a 37 ºC, durante a noite.

O plasmídio usado, pCR8 (figura 7), contém um gene que promove

resistência ao antibiótico ampicilina (AmpR). Deste modo, apenas as células que

foram transformadas conseguem crescer no meio de crescimento selectivo.

2.2.3.3 – Purificação de DNA Plasmídico A extracção e purificação do plasmídio pCR8 realizou-se com o auxílio do

QIAPREP SPIN MINIPREP KIT (QIAGEN), seguindo-se todo o protocolo

recomendado pelo fabricante (QIAGEN, 1998).

Inocularam-se 5 mL de meio LB-Amp com uma colónia de JM105

transformada com pCR8 e deixou-se a crescer, durante a noite a 37 ºC.

Colheram-se as células numa centrífuga Eppendorf a 4500 g e ressuspendeu-se

o sedimento em tampão P1 com RNase. Adicionaram-se 250 µL de tampão P2 e

agitou-se o eppendorf por inversão até a solução se aparentar viscosa e

ligeiramente translúcida. Adicionaram-se 350 µL de tampão N3 e agitou-se

Figura 7 – Mapa do plasmídio pCR8 amplificado em E. coli, e utilizado para transformar células competentes de levedura; HA – epítopo (YPYDVPDYA) CYC1 – terminador do citocromo c URA3 – via de síntese do uracilo AmpR – resistência à ampicilina Ori – Origem da replicação

4612 bp

AmpR


rapidamente, por inversão, 6 vezes. Centrifugou-se a 10400 g, durante 10

minutos, e transferiu-se o sobrenadante para a coluna QIAprep, montada num

tubo de colheita de 2 mL. Centrifugou-se o conjunto durante 1 minuto e

desprezou-se o volume eluído. Lavou-se a coluna com 0,5 mL de tampão PB e

repetiu-se o passo de centrifugação, novamente desprezando o volume eluído.

Adicionou-se 0,75 mL de tampão PE à coluna e repetiu-se a centrifugação, mais

uma vez desprezando o volume eluído. Centrifugou-se novamente para eliminar

quaisquer resíduos de tampão PE ainda existentes na coluna. Colocou-se a

coluna num eppendorf limpo e eluiu-se o pasmídio da coluna pela adição de 50

µL de tampão EB (10mM Tris, pH 8,5), esperando cerca de 1 minuto antes de

voltar a centrifugar.

2.2.3.4 – Linearização do Plasmídio pCR8 para Integração em Levedura

O único sítio de restrição para o enzima Cla I (AT/CGAT) existente no

plasmídio pCR8 encontra-se dentro da região do gene PRS1 inserida neste

plasmídio, sendo portanto possível linearizar o DNA recorrendo a este enzima.

A 5 µL da solução de DNA plasmídio purificado anteriormente adicionou-

se 2 µL de tampão (tampão H, ROCHE), 1 µL de Cla I (ROCHE) e 12 µL de

água. Agitou-se ligeiramente a solução para a homogeneizar e colocou-se num

banho a 37 ºC, durante 2 horas. O sucesso da digestão foi verificado por

electroforese em gel de agarose.

2.2.3.5 – Produção e Transformação de Células Competentes de Levedura A produção de células competentes de levedura tem como objectivo obter

células com a capacidade de interiorizarem material genético que não o seu e,

dependendo do material genético inserido, promoverem a sua integração ou

simplesmente iniciarem a transcrição deste.

Foram usados dois métodos diferentes para promover a competência e

transformação das células. O primeiro tem a vantagem de separar os passos de


indução de competência e transformação, permitindo assim o armazenamento

de células competentes para transformações futuras (Dohmen et al., 1991). No

entanto, é um processo mais demorado que o segundo (Agatep et al., 1998,

Gietz et al., 1994), em que a indução de competência e transformação são

efectuadas de um modo consecutivo.

Na realização do primeiro processo foi preparada uma cultura de 10 mL

de células (JD305) em meio completo (YPD) até atingir uma OD600nm

aproximadamente de 0,6. Centrifugou-se a 3000 g, durante 5 minutos, a 4 ºC, e

lavou-se o sedimento em 5 mL de solução A (1M de sorbitol (KOSH-LIGHT),

10mM de bicina (BDH CHEMICALS), 3% (v/v) de etilenoglicol (MERCK), 5%

(v/v) de DMSO (RIEDEL), pH 8,35). Voltou-se a centrifugar e ressuspendeu-se o

sedimento em 0,2 mL de solução A. A suspensão foi então congelada a –80 ºC.

Para a transformação adicionaram-se 5 µL do plasmídio pCR8 anteriormente

purificado e digerido com Cla I e agitou-se num vortex à velocidade máxima, a

37 ºC, durante 5 minutos. Adicionou-se 1 mL de solução B (40% ((m/v) de

polietilenoglicol 1000 (SIGMA), 200 mM de bicina, pH 8,35) e resuspendeu-se

por inversão. As células foram, então, incubadas durante 1 hora, a 30 ºC.

Centrifugou-se a suspensão a 800 g, durante 5 minutos à temperatura ambiente

e lavaram-se as células com 1 mL de solução C (150 mM de NaCl, 10 mM de

bicina, pH 8,35). Centrifugou-se de novo a suspensão e ressuspendeu-se o

sedimento em 200 µL de solução C. As células em suspensão foram plaqueadas

em meio sólido SD-Ura a fim de seleccionar as células transformadas. A placa

foi colocada a 30 ºC, durante 3 dias. Das colónias obtidas seleccionaram-se oito

que foram cultivadas numa nova placa SD-Ura para obenção de colónias

isoladas.

O segundo processo de indução de competência e transformação foi

realizado utilizando 10 mL de uma cultura de células JD305 crescidas em YPD,

durante a noite. Centrifugou-se a suspensão e lavaram-se as células com 1 mL

de água. Centrifugou-se de novo e ressuspendeu-se o sedimento em 1 mL de

100 mM de acetato de lítio (LiAc), incubou-se a 30 ºC, durante 5 minutos. A

cultura foi centrifugada a 16000 g, durante 1 minuto e adicionou-se ao


sedimento, por esta ordem, 240 µL de 50% ((m/v) de PEG 3350, 36 µL de 1 M

de LiAc, 5 µL de “calf thymus” DNA, 5 µL de pCR8 purificado e linearizado como

descrito anteriormente e 60 µL de água. Agitou-se a mistura com a ajuda de um

vortex na velocidade máxima, durante 1 minuto e provocou-se de imediato um

choque térmico num banho a 42 ºC, durante 20 minutos. Centrifugou-se durante

15 segundos, a 16000 g, e removeu-se o sobrenadante com a ajuda de uma

micropipeta. Ressuspendeu-se em 200 µL de água e plaqueou-se a suspensão

em meio sólido selectivo SD-Ura, tendo-se deixado a crescer a 30 ºC durante 3

dias. As colónias visíveis foram marcadas e de novo plaqueadas em SD-Ura. Só

as células que sofreram recombinação homóloga e, portanto, possuem o

plasmídio pCR8 integrado no seu genoma têm capacidade de se desenvolverem

em meio sem uracilo, uma vez que possuem o gene URA3 que codifica para um

enzima da via biossintética do uracilo.

2.2.3.6 – Polymerase Chain Reaction (PCR)

A técnica de PCR permite a amplificação selectiva de material genético.

Uma das vantagens apresentadas por esta técnica reside no facto de necessitar

de uma baixa concentração de moléculas “molde” para efectuar a amplificação.

Neste estudo, esta técnica foi aplicada para amplificar uma parte do

plasmídio inserido em levedura e assim verificar a sua integração. Foi

desenhado um oligonucleótido contendo a sequência do início da ORF (“open

reading frame”) de PRS1, e portanto, fora do fragmento do gene PRS1

(5’∆ PRS1) clonado no plasmídeo pCR8 (5’-

GCGCATATGACATCAATTGGTACTGGT-3’) e um oligonucleótido contendo

uma sequência presente no terminador do citicromo c (CYC1) existente no

plasmídio introduzido (5’-GCCTTCGAGCGTCCAAAAACCTTC-3’). Deste modo,

só no caso de ter havido uma integração correcta se iria obter produto de PCR.

Foram removidas células das colónias a testar a partir de uma cultura em

meio sólido, para além de células de JD47-13C (estirpe não marcada) utilizada

como controlo negativo e de células de JD183, controlo positivo, e colocadas no


fundo de tubos de PCR de 0,2 mL. Seguidamente, provocou-se a ruptura da

membrana celular por exposição a microondas, durante 2 minutos, a 700 Watts

de potência. Fez-se uma solução contendo 20 µL do tampão de polimerase

(ROCHE), 8 µL de cloreto de magnésio a 25mM, 8 µL de uma solução a 10 mM

de nucleótidos, 4 µL de cada oligonucleótido, 156 µL de água estéril e 1 µL de

polimerase (Expand High Fidelity PCR System, ROCHE). A cada tubo contendo

as células foram adicionados 25 µL desta solução. A amplificação foi feita num

termociclador (Personal Cycler, BIOMETRA) com o seguinte programa:

Passo Descrição Tempo (segundos)

Temperatura (ºC)

1 150 94

2 desnaturação 30 94

3 annealing 60 54

4 enlongamento 90 72

5 300 72

2.2.4 – Extractos Proteicos

2.2.4.1 – Extracção por Maceração das Células As pastilhas de células no tampão de extracção desejado (tampão 26S

(50mM Tris, 5mM cloreto de magnésio, 2mM ATP (BOEHRINGER MANNHEIM),

1mM DTT (ACROS), 15% (v/v) glicerol, pH 7,5) ou tampão MA (50mM Tris-HCl,

15% (v/v) glicerol, 5mM cloreto de magnésio, pH7,5)), previamente congeladas e

armazenadas a –80 ºC foram transferidas para um almofariz contendo azoto

líquido e com o auxílio do pilão procedeu-se à sua maceração, renovando o

azoto líquido de modo a nunca deixar o homogenato descongelar. Depois da

completa maceração e redução das células a um pó muito fino, deixou-se o

homogenato descongelar e adicionaram-se inibidores de proteases (Complete,

MINI, EDTA Free – BOEHRINGER MANNHEIM) a partir de uma solução sete

33 ciclos


vezes concentrada, em tampão de extracção, para uma concentração final de

uma vez. Centrifugou-se o extracto a 31200 g (JA 18.1), durante 10 minutos, a 4

ºC. Desprezou-se o sedimento e centrifugou-se o sobrenadante a 60000 g, na

ultracentrífuga de bancada TLA-100.4 (BECKMAN TLX), durante 30 minutos, a 2

ºC. Desprezou-se o sedimento e congelou-se o sobrenadante, correspondente

ao extracto cru (CE), em azoto líquido.

Este método foi o utilizado para a maioria das extracções efectuadas uma

vez que se obtém extractos com uma elevada concentração proteica e, quando

foi necessário extrair proteínas a partir de uma grande quantidade de células.

2.2.4.2 – Extracção com Esferas de Vidro Este método de extracção foi aplicado quando foram necessárias

pequenas quantidades de proteína, não sendo por isso a análise afectada pelo

baixo rendimento de extracção conseguido com este método.

A um sedimento de células colhidas, com um volume aproximado de 200

µL, foi adicionado igual volume de esferas de vidro e tampão de lise (50mM de

HEPES, 1mM de EDTA, 1% (v/v) de Triton X-100). A mistura foi deixada em gelo

durante pelo menos 1 minuto. Depois de arrefecida, a mistura foi agitada no

vortex à velocidade máxima durante 30 segundos e de novo colocada em gelo

durante 30 segundos. O extracto foi centrifugado a 40600 g (JA 18.1). O

sobrenadante obtido corresponde ao extracto proteico (CE) a analisar.

2.2.5 – Quantificação Proteica


As concentrações de proteínas foram determinadas através o método de

Bradford. Este método colorimétrico utiliza como corante o Coomassie Brilliant

Blue G-250 (CBB G-250) (figura 8) que, devido à sua carga negativa se liga aos

resíduos básicos na proteína e, em solução acídica, sofre uma alteração do seu

máximo de absorção de 465 nm (apresenta cor vermelha) para 595 nm

(apresenta cor azul) quando a ligação ocorre (Robyt et al., 1990), apresentando

assim diferenças de cor em resposta a diferentes concentrações proteicas

(Bradford, 1976).

Uma das grandes vantagens deste método, para além da sua

sensibilidade (0 – 20 µg de proteína), é a sua baixa susceptibilidade a

interferência por outras substâncias. Além disso, devido à similaridade nas

curvas de resposta, uma grande gama de proteínas padrão pode ser utilizada

para a calibração (Robyt et al., 1990). No presente trabalho a proteína padrão

utilizada foi a albumina de soro bovino (BSA). Partindo-se de uma solução stock

de BSA a 0,5 mg/mL foram feitas diluições em água para obter soluções com 2,5

µg, 5,0 µg, 10 µg, 15 µg e 20 µg de BSA, num volume total de 800 µL. A estas

soluções foram adicionados 200 µL do reagente corante BioRad Protein Assay

(BIO-RAD).

As amostras a quantificar, em triplicado, foram diluídas em água, para um

volume total de 800 µL, de modo que a sua quantidade total de proteína se

CH2

N

C2H5

CH3 CH3

NaO3S

NH

OC2H2

N

C2H5

CH2

SO3-

Figura 8 – Molécula do corante CBB G-250, com destaque para o seu grupo carregado negativamente que forma ligações iónicas com os grupos amina carregados positivamente das proteínas;


situasse entre 0 e 20 µg. A estes tubos foram adicionados 200 µL de reagente

corante.

Os tubos foram agitados de modo a homogeneizar a solução e, após

cinco minutos de reacção à temperatura ambiente, foi medida a sua absorvância

a 595nm usando cuvettes de plástico de 1 mL, com 1 cm de comprimento óptico,

e tomando como branco uma solução de 800 µL de água e 200 µL de reagente

corante.

2.2.6 – Cromatografia de Filtração em Gel A expressão filtração em gel, ou exclusão molecular, é utilizada para

descrever a separação de moléculas de diversos tamanhos através grânulos

constituídos por compostos orgânicos poliméricos com a capacidade de

estabelecer uma rede tridimensional de poros que lhes confere propriedade de

crivo molecular (Wilson et al., 2000).

O princípio desta técnica baseia-se no facto de que moléculas com

diferentes tamanhos demoram tempos diferentes a atravessarem uma coluna

constituída por grânulos de gel em equilíbrio com uma fase móvel. Moléculas

grandes, que são excluídas dos poros, passam por fora dos grânulos do gel e

são as primeiras a serem eluídas, enquanto que moléculas mais pequenas, que

podem penetrar nos poros dos grânulos, passam mais devagar, sendo assim

retardado o seu volume de eluição (Wilson et al., 2000). As moléculas de uma

amostra são portanto eluídas seguido uma ordem decrescente do seu tamanho

molecular.

Tendo em consideração as diferenças entre o tamanho dos poros no gel

e os diferentes tamanhos das moléculas, torna-se interessante a observação da

existência de uma relação linear entre os logarítmos das duas variáveis (Glick,

1970), tornando-se possível, por exemplo, com a utilização do mesmo gel,

determinar a massa molecular de moléculas, tendo por base o tempo de eluição

de outras moléculas cuja massa molecular (Mr) seja conhecida, por comparação

0

0

VVtVVeKav −

−=


de um parâmetro de eluição de volume (Kav) da molécula de interesse com Kav

obtido para as moléculas aplicadas na calibração, segundo a fórmula

em que Ve corresponde ao volume de eluição da substância, Vt o volume total

do gel e V0 o “void volume” (volume nulo) da coluna.

2.2.6.1 – Cromatografia de Filtração em Gel em Superose 6

A coluna Superose 6 (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) é composta

por um gel de polímeros de agarose com partículas na ordem dos 13 µm, e é

específica para separações de moléculas na ordem dos 5 aos 5000 kDa.

Apresenta uma altura de 30 cm e 1 cm de diâmetro, para um volume total (Vt) de

23,56 mL. Tem um V0 de 7,77 mL e o gel garante uma separação funcional para

um fluxo de eluente a exercer uma pressão máxima de 1,5 MPa.

A separação de complexos proteassomais foi realizada de acordo com o

método descrito por Ramos at al. (1998). Extractos proteicos foram fraccionados

com o auxílio da coluna Superose 6 acoplada a um ÄKTA-FPLC (AMERSHAM

PHARMACIA BIOTECH), controlado pelo software Unicorn v3.21. O gel foi

equilibrado em tampão 26S previamente filtrado e desgasificado sob vácuo. A

equilibração do gel foi efectuada pela passagem de, aproximadamente, duas

vezes o Vt da coluna em tampão, sendo o primeiro volume bombeado a 0,2

mL/minuto e o segundo a 0,3 mL/minuto. Injectaram-se, com o auxílio de um

loop apropriado, 200 µL de CE (preparado como mencionado na secção 2.2.4.1)

de cada estirpe a analisar, contendo 1 mg de proteína. A separação foi

executada com um fluxo de eluente (tampão 26S) de 0,3 mL/minuto,

encontrando-se o eluente, a coluna e o colector de fracções numa câmara fria a

aproximadamente 4 ºC. O perfil de eluição das proteínas foi monitorizado a

280nm e foram colhidas fracções de 0,6 mL.

A separação de complexos proteassomais purificados por cromatografia

de metalo-afinidade realizou-se de acordo com o procedimento acima descrito,


mas com a utilização, como tampão de equilibração do gel e eluente, o tampão

Co2+ (20mM de Tris, 5mM de cloreto de magnésio, 100mM de NaCl, 15% (v/v)

de glicerol, pH 8,0).

A calibração da coluna foi realizada utilizando as seguintes proteínas:

citocromo c, aldolase, catalase e tiroglobulina. O “void volume” (V0) foi

determinado com o azul de dextrano. Calculou-se o Kav para cada uma das

proteínas marcadoras, tabela II. O gráfico Kav em função do logarítmo da massa

molecular dos marcadores encontra-se na figura 9.

Tabela II – Proteínas utilizadas para a calibração da coluna SUPEROSE 6;

Proteína Mr (kDa)

log Mr Ve Kav

Citocromo C 13,0 4,11 19,7 0,753

Aldolase 158 5,20 14,9 0,449

Catalase 232 5,37 14,4 0,417

Tiroglobulina 669 5,83 11,3 0,224

2.2.6.2 – Cromatografia de Filtração em Gel para Dessalinização

Uma outra aplicação da filtração em gel, e tirando partido da exclusão

molecular dos géis, é a dessalinização de amostras, nomeadamente de

extractos proteicos. Pode também ser aplicada para trocas de tampão dos

Figura 9 – Calibração da coluna Superose 6, obtida pela regressão linear dos pontos de Kav contra os logarítmos da massa molecular, para cada proteína

y = -0,2998x + 1,9975R2 = 0,9878

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

4,00 4,50 5,00 5,50 6,00

log Mr

Kav


extractos ou soluções proteicas. As moléculas de elevado Mr são eluídas com o

volume nulo da coluna enquanto moléculas de baixo Mr são distribuídas entre a

fase estacionária, sendo eluídas num volume mais elevado. Na dessalinização

de amostras proteicas, a porosidade do gel é escolhida de modo a excluir as

proteínas sendo eluídas com o volume nulo da coluna, sendo assim separadas

de moléculas pequenas como sais (Janson et al., 1998).

2.2.6.2.1 – Cromatografia de Filtração em Gel em PD-10

As colunas PD-10 (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) contem como

enchimento o Sephadex G-25 M, um polímero de dextrano, e são especialmente

preparadas para dessalinização e/ou troca de tampão de amostras. Este tipo de

colunas apresenta uma altura de 5 cm e tem um volume de gel de 9,1 mL.

O gel foi equilibrado com 25 mL de tampão Co2+. Foram colocados 2,5 mL

de amostra no topo do gel e desprezou-se o eluente. Depois da saída deste,

adicionaram-se 3,5 mL de tampão Co2+ e recolheu-se o eluente, o extracto

dessalinizado (DCE). O procedimento foi realizado a 4 ºC.

2.2.7 – Electroforese de Biomoléculas As moléculas biológicas, nomeadamente proteínas e ácidos nucleicos,

devido às características individuais dos seus monómeros, são providas de

carga eléctrica. Esta carga é condicionada pelo meio em que as moléculas se

encontram (fisiológico ou não), nomeadamente pela concentração de iões H+

(Plummer, 1987). A electroforese utiliza esta propriedade para promover a

separação das moléculas ao longo de um meio sólido, fazendo uso do princípio

que uma partícula carregada electricamente, sob o efeito de uma diferença de

potencial, se move no sentido do polo de carga contrária à sua.

Esta é uma técnica de grande importância para a separação de moléculas

biológicas uma vez que, para além de ser extremamente sensível a pequenas

diferenças na carga da molécula, normalmente não afecta a estrutura nativa da

mesma (Robyt et al., 1990).


O meio de suporte utilizado na electroforese varia de acordo com as

necessidades de separação e com as características das moléculas a serem

separadas, no entanto, deverá ser o mais quimicamente inerte possível, de

modo a não interferir na migração (Robyt et al., 1990).

2.2.7.1 – Electroforese de Ácidos Nucleicos em Géis de Agarose A agarose, a fracção polissacarídica neutra do agar, é composta por um

polímero linear de D-galactopiranose com uma ligação β-1→4 a 3,6-anidro-L-

galactopiranose que, por sua vez está ligada na forma α-1→3 ao próximo

resíduo de D-galactopiranose (Robyt et al., 1990).

Dependendo da concentração de agarose utilizada, os poros formados

por este polímero são maiores ou menores. A baixas concentrações de agarose,

o gel formado tem a capacidade de separar moléculas de grandes dimensões,

como DNA (Maniatis et al., 1983).

Uma das vantagens no uso deste polímero reside no facto de não

necessitar de qualquer tipo de agentes interligantes ou iniciadores da

polimerização, evitando assim qualquer interferência destes com as moléculas a

separar.

As amostras de DNA foram adicionadas de solução de aplicação

contendo dois corantes (0,042% (m/v) azul de bromofenol (SIGMA) e 0,042%

(m/v) xilenocianol) para verificação da evolução da electroforese e 2,5% (v/v)

Ficoll (tipo 400) para aumentar a densidade das amostras.

Foram preparados géis de 0,8% (m/v) ou 1% (m/v) de agarose, em

tampão TAE (40mM de Tris-HCl, 0,114% (v/v) de ácido acético glacial e 1mM de

EDTA a pH 8,0). A solução de agarose foi aquecida até completa dissolução da

agarose. Após o aquecimento e ainda em estado líquido, foram adicionados

0,05% de brometo de etídio (SIGMA). O brometo de etídio intercala-se nas

bases dos ácidos nucleicos e, neste estado, é fluorescente quando irradiado

com luz Ultravioleta (UV), permitindo assim a visualização dos ácidos nucleicos

no gel. A solução foi colocada numa tina de electroforese horizontal e esperou-


se a completa solidificação da mesma. O gel foi coberto com tampão de

electroforese TAE contendo 0,05% (v/v) de brometo de etídio. As amostras

foram aplicadas e estabeleceu-se uma diferença de potencial de 70 V no

sistema.

2.2.7.2 – Electroforese de Proteínas em Géis de Poliacrilamida Um dos meios sólidos mais usados para a separação de proteínas são

os géis de poliacrilamida. Este tipo de gel, para além de ser quimicamente

inerte, apresenta ainda a vantagem de permitir controlar o tamanho dos seus

poros, levando a que a separação não seja baseada apenas na carga da

proteína mas também na massa molecular e forma da molécula (Voet et al.,

1995). Para além disso, apresenta ainda as vantagens de minimizar a difusão

das proteínas (Robyt et al., 1990), ser facilmente manuseado e ser transparente,

permitindo assim a sua observação sob luz visível e ultravioleta (UV) (Plummer,

1987).

Um gel de poliacrilamida é formado pela polimerização de acrilamida na

presença de um agente de entrecruzamento, geralmente a N’,N’ –

metilenobisacrilamida (bisacrilamida) (Jason et al., 1998). A polimerização é

catalisada pelo persulfato de amónio (PSA) e é iniciada pela N,N,N’,N’-

tetrametiletilenodiamina (TEMED) (figura 10).

Figura 10 – Reacção de polimerização dos monómeros de acrilamida; adaptado de Voet et al., 1995

Acrilamida N,N’-Metilenobisacrilamida


O tamanho dos poros varia consoante a percentagem de acrilamida e

bisacrilamida presentes. Esta percentagem pode ser definida segundo o método

de nomenclatura T e C introduzido por Hjertén (Hjertén, 1962) segundo as

fómulas

em que A e B são as massas, em grama, de acrilamida e bisacrilamida,

respectivamente, e V o volume de água em cm3.

2.2.7.2.1 – Electroforese de Proteínas em Condições Desnaturantes

A separação electroforética realizada em presença de um detergente

aniónico, o dodecilsulfato de sódio (SDS) e de um agente redutor, o 2-

mercaptoetanol permite a separação de polipéptidos de acordo com a sua

massa molecular. O SDS tem a capacidade de formar um forte complexo SDS-

proteína devido às suas características apolares, ligando-se de forma micelar às

regiões apolares da proteína, e ficando a sua zona iónica exposta ao solvente

(Robyt et al., 1990). A ligação do SDS à proteína promove dois efeitos distintos,

a dissociação dos oligómeros proteícos e a disrupção da estrutura secundária da

proteína. Além disso, a saturação da proteína com SDS (1,4 g de SDS por

grama de proteína) leva à camuflagem da carga proteica, passando a migração

no gel a ser totalmente dependente da sua massa molecular (Plummer, 1987). O

uso do 2-mercaptoetanol promove a redução de possíveis pontes dissulfídicas

que ligam resíduos de cisteína inter ou intra subunidades proteicas (Robyt et al.,

1990).

%100)(VBAT ×+

= %)(

100BA

BC+

×=


As amostras foram preparadas para a electroforese desnaturante pela

adição de um tampão amostra desnaturante (SB) 4x concentrado, contendo

320mM de Tris-HCl a pH 6,8, 0,4M de 2-mercaptoetanol, 8% (m/v) de SDS, 15%

(v/v) de glicerol (para aumentar a densidade das amostras) e 0,024% (m/v) de

roxo de m-cresol (como corante de frente de migração). Após a

homogeneização da amostra em tampão SB, as amostras foram colocadas num

banho a 100 ºC durante 5 minutos e aplicadas directamente num gel

desnaturante ou guardadas a –20 ºC, até uso posterior.

Foram utilizados os aparelhos de electroforese vertical Hoefer SE600

(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) e Mini-Protean II (BIO-RAD),

dependendo do número de amostras a analisar e necessidade de resolução.

Foi utilizado um sistema descontínuo de géis, formado por um gel de

concentração e um de resolução. O primeiro, de menor concentração de

acrilamida, visa acumular as proteínas na interface entre os dois géis de modo a

que estas entrem no gel de resolução ao mesmo tempo. O segundo, de maior

concentração de acrilamida, promove a separação de acordo com a massa

molecular das moléculas.

A partir de uma solução de acrilamida/bisacrilamida 30% T, 2,7% C,

preparou-se um gel de resolução 12%T, 1%C contendo 375mM de Tris-HCl a

pH 8,8, 0,1% (m/v) de SDS, 0,1% (m/v) de PSA e 0,033% (v/v) de TEMED. O gel

de resolução foi coberto com água de modo a minimizar a inibição da reacção

de polimerização pelo oxigénio e para facilitar a formação de uma superfície

regular no topo do gel. A polimerização do gel tornou-se evidente pela

observação de uma interface gel-água. Por cima do gel de resolução

polimerizado foi adicionada a solução do gel de concentração com 4% T, 0,36%

C em 125 mM de Tris-HCl a pH 6,8 juntamente com 0,1% (m/v) de SDS, 0,1%

(m/v) de PSA e 0,033% de TEMED. Imediatamente após a adição da solução do

gel de concentração introduziu-se no molde o pente para a formação dos

“poços” para posterior aplicação das amostras. No final da polimerização do gel

de concentração removeu-se o pente e lavaram-se os “poços” para remover

resíduos de acrilamida não polimerizada. As amostras foram aplicadas com uma


seringa de vidro graduada (Hamilton) e o conjunto foi colocado na tina de

electroforese. O tampão de eléctrodo catódico (25mM de Tris, 192mM de glicina

e 0,1% de SDS) foi colocado na tina superior. O tampão anódico, idêntico ao

anterior, mas contendo 100mM acetato de sódio para aumentar a resolução de

polipéptidos de baixa massa molecular (Christy et al., 1989), foi colocado na tina

inferior.

A diferença de potencial aplicada foi de 60 V ou 130 V, conforme se

pretendeu que a separação ocorresse durante a noite ou ao longo do dia,

respectivamente. A corrente foi interrompida quando a frente de migração atingiu

o final do gel.

2.2.7.2.2 – Electroforese de Proteínas em Condições Nativas

As amostras foram preparadas para a electroforese em condições não

desnaturantes, não sendo por isso usado qualquer reagente que pudesse por

em causa a estrutura natural da proteína. O tampão amostra para condições

nativas usado (SN) estava 4x concentrado e era constituído por 200mM de Tris -

HCl pH 6,8, contendo 15% (v/v) de glicerol e 0,25% (m/v) de azul de bromofenol

como corante da frente de migração. Os tubos contendo as fracções a analisar

em SN foram agitados para homogeneizar a solução e de seguida, as amostras

foram aplicadas no gel para separação, uma vez que, se guardados, poderia

haver disrupção das interacções.

A electroforese em condições nativas foi efectuada com sistema Mini-

Protean II (BIO-RAD).

Assim como para a separação em condições desnaturantes, as amostras

foram separadas num sistema descontínuo de géis. No entanto, devido às

dimensões e formas dos complexos proteicos a separar, o poro do gel

resolvente e de concentração foi maior sendo, portanto, utilizada uma menor

concentração de acrilamida/bisacrilamida. Assim, preparou-se um gel de

resolução com 4% T, 0,4% C contendo 2,5% (m/v) de sacarose, em tampão TBE

(90mM de Tris-HCl com pH 8,3 contendo 80mM de ácido bórico e 100mM de


EDTA ), 0,2% (m/v) de PSA e 0,066% (v/v) de TEMED. A solução do gel de

resolução, depois de inserida nos moldes de vidro, foi coberta com água. Após a

polimerização deste gel, foi adicionada a solução do gel de concentração

composta por 2,5% T, 0,23%C, 2,5% (m/v) de sacarose, 50mM de Tris-HCl a pH

6,8, 0,2% (m/v) de PSA e 0,066% (v/v) de TEMED. Foi introduzido o pente para

a formação dos “poços” e as amostras foram aplicadas com a ajuda de uma

seringa de vidro graduada. O conjunto foi montado na tina de electroforese

contendo tampão TBE previamente arrefecido a 4 ºC. O sistema foi colocado em

gelo de modo a manter a baixa temperatura e foi aplicada uma diferença de

potencial de 120V, interrompida quando a frente de migração chegou ao fundo

do gel.

2.2.8 – Detecção de Polipéptidos em Géis de Poliacrilamida As proteínas ou polipéptidos separados electroforeticamente podem ser

visualizados no gel recorrendo a diferentes métodos. Géis contendo amostras

proteicas relativamente concentradas foram analisados pelo método de

coloração que envolve o corante orgânico azul de Coomassie R-250 (CBB R-

250), cujo limite inferior de detecção corresponde a cerca de 50 a 100 ng de

proteína concentrada numa banda (Neuhoff et al., 1985). A detecção de

quantidades inferiores de proteína foi realizada pelo método do nitrato de prata,

que permite uma detecção de níveis de proteína na ordem de 1 a 10 ng (Blum et

al., 1987).

2.2.8.1 – Coloracão de Proteínas com Azul de Coomassie O azul de Coomassie R-250, devido à sua carga negativa, liga-se aos

resíduos básicos das proteínas “aprisionadas” no gel, não exercendo qualquer

interacção com os polímeros do mesmo, tornando-se assim possível remover o

corante não ligado (Vesterberg et al., 1977).


O gel contendo os polipéptidos a analisar foi mergulhado numa solução

de 0,1% (m/v) de CBB R-250, 45% (v/v) de metanol (PRONALAB) e 10% (v/v)

de ácido acético glacial durante aproximadamente duas horas. O corante não

ligado à proteína foi removido através de uma solução de descoloração com

10% (v/v) de metanol e 10% (v/v) de ácido acético glacial, que foi substituída

diversas vezes, até o fundo do gel se apresentar transparente.

2.2.8.2 – Coloração de Proteínas com Prata

Na coloração por prata, os géis são impregnados com o ião solúvel Ag+ e

revelados por tratamento com um agente redutor. As biomoléculas presentes no

gel, neste caso proteínas, promovem a redução do ião a Ag0, insolúvel e visível,

permitindo a visualização das bandas presentes. A deposição inicial de prata

promove a continuação da reacção num processo autocatalítico (PHARMACIA

BIOTECH, 1996) (figura 11).

Durante o processo de coloração por prata, o gel sofre diversos

tratamentos, com funções específicas: fixação, em que o gel é tratado com

ácido, tornando as moléculas no gel insolúveis e impedindo a sua difusão do gel

durante os tratamentos seguintes; pré-tratamento, através da acção de

reagentes que tornam as proteínas mais reactivas à prata e aceleram a sua

redução a Ag0, aumentando a sensibilidade do método; coloração, por um

Figura 11 – Reacção de redução do ião solúvel Ag+ a prata metálica Ag0 através do contacto com biomoléculas, e posterior reacção autocatalítica; adaptado de PHARMACIA BIOTECH, 1996.


tratamento com nitrato de prata, sob condições ácidas para impedir a redução

do ião solúvel; revelação, através da redução do ião de prata a prata metálica, a

pH elevado; paragem, num passo que impede a continuação da redução do ião

ião de prata solúvel ainda existente.

O protocolo utilizado baseou-se no método desenvolvido por Blum et al.

(1987). Os polipéptidos foram fixados com uma solução constituída por 50%

(v/v) de metanol, 12% (v/v) de ácido acético glacial e 0,05% (v/v) de formaldeído

durante 20 minutos. Seguiram-se três lavagens de 10 minutos cada com 50%

(v/v) de etanol e um pré-tratamento, durante 1 minuto, com uma solução de

tiosulfato de sódio (200 mg.L-1). Após três lavagens de 20 segundos cada, com

água destilada, o gel foi incubado com solução corante de nitrato de prata (2

gr.L-1) contendo 0,075% (v/v) de formaldeído, durante 10 minutos. O excesso de

corante foi removido por lavagem do gel com água destilada, duas vezes

durante 20 segundos e as bandas proteicas reveladas até à intensidade

desejada, com uma solução de carbonato de sódio (60 gr.L-1) contendo 0,05%

(v/v) de formaldeído e tiosulfato de sódio (4 mg.L-1). Após atingida a coloração

desejada dos polipéptidos, o gel foi lavado com água destilada, duas vezes,

durante 2 minutos, e mergulhado numa solução de paragem da reacção

contendo 50% (v/v) de metanol e 12% (v/v) de ácido acético glacial, durante 5

minutos. A lavagem final realizou-se durante 20 minutos, com uma solução de

50% (v/v) de metanol. A totalidade do procedimento foi executada à temperatura

ambiente e com agitação.

2.2.9 – Immunoblot A técnica de immunobloting é extremamente poderosa na identificação de

proteínas separadas numa electroforese em gel de poliacrilamida, sendo mais

sensível que qualquer tipo de corante utilizado directamente nos géis e, para

além disso, é uma técnica que pode ser muito específica na identificação de

determinadas proteínas contra as quais existam anticorpos.


Neste estudo foi aplicada uma técnica de immunoblot que utilizou um

sistema de anticorpos (Abs) primários e anticorpos secundários, ambos

monoclonais, ou seja, com a capacidade de reconhecerem o mesmo antigénio

(Ag). Os primeiros têm a capacidade de reconhecer e formar um complexo Ab-

Ag com um epítopo presente na proteína de interesse, que por sua vez são

reconhecidos pelos Abs secundários (Anti-IgG). Acoplada aos Abs secundários

está uma peroxidase de rábano que tem a capacidade de oxidar certos

substratos, como o luminol, que ficam num estado excitado e decaem por

fosforescência. Esta fosforescência, com emissão de luz visível, pode ser

detectada recorrendo ao uso de uma chapa fotográfica (figura 12).

2.2.9.1 – Electrotransferência de Proteínas Para se proceder a uma correcta análise e tirar completo partido da

capacidade dos anticorpos, as proteínas separadas num gel de poliacrilamida

têm de ser transferidas para um suporte sólido de modo a torná-las mais

acessíveis aos anticorpos.

O processo de transferência das proteínas do gel para a membrana

porosa de fluoreto de polivinilideno (PVDF) (IMMOBILON-P, MILLIPORE) é

efectuado tendo por base a carga intrínseca das proteínas, no caso de

luminol e

amplificador

Figura 12 – Representação esquemática da técnica de immunoblot utilizada. Reconhecimento do epítopo pelo Ab primário (1), seguido do reconhecimento do Ab primário pelo Ab secundário acoplado a uma peroxidase (2) e oxidação de um substrato para emissão de luz (3); adaptado de BOEHRINGER MANNHEIM.

luz

1 2 3


transferência de proteínas separadas por electroforese em condições nativas, ou

na carga negativa dos complexos SDS-proteína, no caso de transferência de

proteínas separadas por electroforese em condições desnaturantes. A aplicação

de um campo eléctrico ao sistema promove a migração das proteínas do gel

para a membrana.

A membrana de PVDF utilizada tem características hidrofóbicas, sendo

por isso necessário, antes da transferência, submergi-la em metanol e equilibrá-

-la em tampão de transferência (25 mM de Tris, 190 mM de glicina, 0,1% (m/v)

de SDS, 20% (v/v) de metanol, pH 8,3). Foi montado um sistema como o

representado na figura 13, tendo o cuidado de eliminar bolhas de ar existentes

entre as partes constituintes, já que estas afectam o sucesso da transferência.

Depois de montado, o sistema foi mergulhado numa tina de transferência,

tendo-se o cuidado de colocar a membrana virada para o ânodo, e o gel para o

cátodo. Aplicou-se uma diferença de potencial de 70V entre os eléctrodos. No

caso de géis de poliacrilamida com 0,75 mm de espessura, a diferença de

potencial foi mantida por 1 hora, enquanto que para géis de poliacrilamida com

1,5 mm de espessura, a transferência foi prolongada até 2 horas.

2.2.9.2 – Fixação das Proteínas à Membrana de PVDF

Placa de suporte Esponja Membrana de PVDF Gel de poliacrilamida 2 folhas de papel 3MM

Figura 13 – Montagem do sistema de transferência


Após a transferência, foi necessário fixar as proteínas à membrana de

PVDF para que estas não se difundissem nos passos seguintes do immunoblot.

Para isso foram testadas três condições de fixação da membrana:

solução de fixação (10% de ácido acético glacial, 25% de isopropanol), 30

minutos num banho a 100 ºC e autoclavagem da membrana durante 20 minutos

(Swerdlow et al., 1986). Amostras correspondentes às fracções 22, 23 e 24

obtidas por filtração em gel (ver secção 2.2.6.1) de um extracto de JD183 foram

separadas por electroforese em gel desnaturante de acrilamida (ver secção

2.2.7.2.1). Fixaram-se as proteínas recorrendo aos métodos acima descritos,

bloqueou-se a membrana, incubou-se com os anticorpos primário e secundário e

revelou-se o immunoblot como descrito, em detalhe, nas secções seguintes.

Pela observação da figura 14 concluiu-se que o melhor método de fixação foi a

fervura durante 30 minutos, uma vez que fornece um sinal mais forte do que o

obtido com a solução de fixação e, no entanto, não leva à perda de sinal como

aconteceu na fixação usando a autoclave.

A B C

22 23 24 22 23 24 22 23 24

Figura 14 – Teste às diferentes condições de fixação das proteínas à membrana. A – Solução de fixação, B – 30 minutos a 100 ºC, C – autoclavagem durante 20 minutos. 22, 23, 24 – fracções colhidas por filtração em gel de um extracto de JD183 e aplicadas para este teste.


2.2.9.3 – Bloqueamento da Membrana de PVDF

Sendo a membrana de PVDF utilizada, especialmente desenhada para a

retenção de proteínas, tornou-se necessário bloquear toda a área da membrana

não ocupada pelas proteínas transferidas uma vez que, sendo os anticorpos

proteínas, poderia haver ligação dos mesmos à membrana e impedir assim a

análise dos resultados.

Para testar as melhores condições de bloqueamento foram empregues

três soluções diferentes para o efeito: 3% (m/v) de BSA em PBST (8,1 mM de

hidrogeno fosfato de sódio, 1,5 mM dihidrogeno fosfato de potássio, 137 mM de

cloreto de sódio, 2,7 mM cloreto de sódio e 0,1% (v/v) Tween-20), 3% (m/v) leite

em pó (RÉGILAIT) em PBST e 3% (m/v) BSA e 3% (m/v) leite em pó em PBST.

Foram aplicadas três séries de 5, 10 e 17 µg de proteína provenientes de um

extracto proteico de JD183 num gel desnaturante de 12%. Após a electroforese,

os polipéptidos foram transferidos para uma membrana PVDF nas condições

definidas em 2.2.9.1. A membrana foi cortada em três e os péptidos fixados à

membrana por fervura, a 100 ºC, durante 30 minutos. Cada membrana foi

incubada com uma solução de bloqueamento diferente com agitação, durante

uma hora. Processou-se o immunoblot como descrito nas secções seguintes

(figura 15).

A B C

5 10 17 5 10 17 5 10 17

Figura 15 – Teste a diferentes condições de bloqueamento da membrana. A – 3% BSA, B – 3% leite em pó, C – 3% BSA e 3% leite em pó. 5, 10, 17 – quantidade de proteína (em µg) aplicada no SDS-PAGE.


Verifica-se que em A o bloqueamento não foi muito eficaz devido à

obtenção de uma grande coloração do “background”. Em C, o bloqueamento foi

eficaz. No entanto, a perda de sinal relativamente às outras condições de

bloqueamento pode indicar que algumas proteínas ficaram inacessíveis aos

anticorpos por este método de bloqueamento. B representa uma situação

intermédia entre A e C, havendo um bloqueio mais eficaz que em A e não se

verificar perda de sinal como em C. Em todo o trabalho apresentado utilizou-se o

bloqueamento com 3% de leite em pó em PBST.

2.2.9.4 – Incubação com Anticorpos Neste estudo foram usados três tipos de anticorpos primários para a

identificação de dois epítopos diferentes. Utilizaram-se dois anticorpos primários

anti-ha, o 16B12 (BABCO) produzido em ratinho, e o anti-ha 3F10 (ROCHE)

produzido em rato, para a detecção do epítopo 2x YPYDVPDYA, existente na

hemaglutinina do vírus da influenza que se encontra presente nas proteínas de

interesse das estirpes JD183, JD127, JD125, JD129 e AM1 e o anticorpo

primário M2 (SIGMA) (anti-FLAG) para a detecção do epítopo DYKDDDDK

presente nas proteínas de interesse das estirpes JD184 e JD228.

Os anticorpos primários foram especificamente detectados com os

seguintes secundários, conjugados com uma peroxidase de rábano: anti-IgG de

ratinho (AM) (SIGMA) específico para os anticorpos produzidos nesta espécie,

conjugado com uma peroxidase de rábano e anti-IgG de rato (AR) (ROCHE)

específico para os anticorpos 3F10.

A incubação da membrana com o anticorpo primário 16B12 foi feita numa

diluição deste 1:2000 enquanto que a diluição utilizada para o 3F10 foi de

1:8000. O anticorpo anti-FLAG foi utilizado numa diluição de 1:1000, em solução

3% (m/v) de leite em pó em PBST. A membrana foi selada juntamente com a

solução contendo o anticorpo e colocada sob agitação, a 4 ºC, durante a noite.

Após duas lavagens de 5 minutos com PBST, duas lavagens de

semelhante tempo com SAIS (1 M de NaCl, 10 mM de hidrogeno fosfato

disódico e 0,5% (v/v) de Tween-20) e novo bloquamento de 15 minutos,


incubou-se com o anticorpo secundário diluído em 3% (m/v) leite em pó em

PBST. O anticorpo secundário anti-rato foi diluído 1:2000. A diluição a usar para

o anticorpo secundário anti-ratinho foi previamente testada em quatro séries de

amostras provenientes de uma separação por filtração em gel de um extracto de

JD127. Como se pode observar na figura 16 a diluição 1:6000 do anticorpo

apresenta uma razão sinal/ruído de fundo maior do que as outras diluições

testadas revelando-se, portanto, a mais adequada.

Após a incubação com o anticorpo secundário durante 4 horas em saco

selado, com agitação, à temperatura ambiente, procedeu-se a duas lavagens

com PBST durante cinco minutos cada, uma lavagem de 10 minutos com SAIS,

três lavagens de cinco minutos com PBST e uma lavagem de 1 minuto em PBS

(8,1 mM de hidrogeno fosfato de sódio, 1,5 mM de dihidrogeno fosfato de

potássio, 137 mM de cloreto de sódio e 2,7 mM de cloreto de potássio).

16 22 26 30 16 22 26 30 16 22 26 30 16 22 26 30

1:2000 1:3000 1:6000 1:12000 Figura 16 – Teste da diluição do anticorpo secundário anti-IgG de ratinho. As frações 16, 22, 26 e 30, obtidas por separação em filtração em gel de extracto de células JD127 foram aplicadas num gel SDS-PAGE de 12%, transferidas para uma membrana PVDF. O immunoblot processou-se como descrito, mas utilizando as diluições de anticorpo secundário mencionadas.


2.2.9.5 – Revelação do Immunoblot Após a incubação da membrana com os anticorpos primário e secundário,

foi possível detectar a localização destes, e consequentemente das proteínas de

interesse, na membrana, através de luminescência, pela adição de um substrato

da peroxidase que, ao ser oxidado (figura 17) e na presença de um activador,

sobe ao extado excitado, decaindo por fosforescência.

Numa câmara escura retirou-se a membrana da solução de lavagem PBS

onde se encontrava e adicionou-se a solução de reacção (100:1 Solução

A:Solução B (BOEHRINGER MANNHEIM)), cerca de 0,125 mL por cm2 de

membrana. Esperou-se 1 minuto e colocou-se a membrana sobre um vidro,

numa cassete de revelação (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH). Cobriu-se a

membrana com uma folha de papel de acetato, tendo o cuidado de eliminar

bolhas de ar. Posicionou-se uma chapa fotográfica (FUJI) sobre a folha de

acetato de modo a ser impressionada pela luz emitida pela oxidação do luminol.

Após o tempo de exposição do filme, este foi removido da cassete de revelação

e colocado numa solução de revelador (SIGMA) até à intensidade desejada,

passado por água e colocado numa solução de fixador (SIGMA) até à

transparência da chapa. Foi novamente passado por água e colocado a secar.

2.2.10 – Cromatografia de Metalo-Afinidade Na cromatografia de metalo-afinidade, um ião metálico, como o Cu2+,

Zn2+, Cd2+, Co2+ ou Ni2+, ligado a um suporte sólido, é utilizado para

selectivamente ligar proteínas através dos grupos imidazole de resíduos de

luz

Figura 17 – Reacão de oxidação do luminol (diacil-hidrazida) pela peroxidase. Adaptado de BOEHRINGER MANNHEIM


histidina, dos grupos tiol de cisteínas ou grupos indol de triptofanos (Porath,

1985). A imobilização da proteína envolve ligações de coordenação com o

metal que têm de ser suficientemente estáveis para reterem as proteínas a

purificar durante os passos de eluição do material não ligado.

A eluição das proteínas ligadas pode ser feita diminuindo o pH, que

destabiliza o complexo metal-proteína, ou através da adição de grupos

competidores no tampão de eluição.

Neste estudo foi utilizada a resina TALON (CLONTECH) para purificar

proteínas com a tag de 6 histidinas (6His) provenientes de extractos proteicos

das estirpes JD184 e JD228. Esta resina possui um ião de cobalto complexado

através de um agente quelante (TC) ligado a um polímero de agarose (figura

18). A eluição das proteínas ligadas ao metal foi efectuada com o auxílio de

imidazole.

Partiu-se de um extracto de células JD184 ou JD228 em tampão de

extracção MA, e utilizou-se a coluna PD-10 para o trocar por tampão Co2+,

obtendo-se assim, como acima descrito o DCE.

Retiraram-se 2 mL do stock de resina em suspensão (equivalente a 1 mL

de resina), centrifugou-se a 700 g e ressuspendeu-se a resina em 20 mL de

tampão Co2+. Este passo de centrifugação e ressuspensão foi repetido duas

vezes, para assim obter a resina equilibrada no tampão de interesse. Adicionou-

se o DCE à resina equilibrada e colocou-se a 4 ºC, durante 1 hora, com

Figura 18 – Diagrama representativo do sistema de metalo-afinidade utilizado, adaptado de CLONTECH, 1999.


agitação. Transferiu-se a suspensão para uma coluna de vidro vazia, de 10 mL,

e deixou-se empacotar pela acção da gravidade. Abriu-se a coluna e colheu-se a

fracção não ligada (FT), tendo o cuidado de não deixar secar o topo da resina.

Efectuou-se uma lavagem com 20 mL de tampão Co2+ e colheu-se o material

eluído (W1). Repetiu-se este passo com o mesmo volume de tampão e colheu-

se de novo o material eluído (W2). Procedeu-se à eluição do material ligado

através de um gradiente de imidazole. Aplicaram-se 2 mL de cada solução de

imidazole (50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM) em tampão Co2+, em

sentido crescente de concentração, tendo o cuidado de colher o material eluído

de cada concentração (E1, E2, E3, E4, E5).

2.2.1.1 – Medição da Actividade Quimotríptica do Proteassoma A medição da actividade quimotríptica do proteassoma foi feita com

recurso a um substrato sintético, Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC (BACHEM). Na

presença deste substrato, o proteassoma quebra a ligação Tyr-AMC, deixando a

coumarina na sua forma livre.

A 7-amido-4-metilcoumarina, após libertação do péptido, é excitável a 380

nm, decaindo por fluorescência, com o pico máximo de emissão a situar-se nos

440 nm. Deste modo é possível detectar a presença de proteassoma funcional

recorrendo à utilização de um fluorímetro.

A 56 µL de uma solução de substrato a 13mM foram adicionados 1144 µL

de água e 300 µL de um tampão de actividade 5 vezes concentrado (50 mM

Tris, 2 mM ATP, 5 mM cloreto de magnésio, 1 mM DTT, pH 7,8) para uma

concentração final de substrato de 0,5 mM. A 20 µL da amostra a analisar foram

adicionados 20 µL desta solução. Após a homogeneização da mistura, esta foi

incubada num banho a 37 ºC durante 1 hora. A reacção foi interrompida pela

adição de 960 mL de etanol absoluto a –20 ºC e as amostras guardadas a –20

ºC até serem analisadas. Os valores de actividade foram obtidos pela medição

da fluorescência a 440 nm após excitação da amostra a 380 nm num fluorímetro

(FP-777 Spectrofluorimeter – JASCO).

Resultados 60

3 – Resultados 3.1 – Efeito do Cádmio e do Choque Térmico no Crescimento de

S. cerevisiae e na Expressão da Subunidade Proteassomal α7/Prs1p

O trabalho realizado por Jungmann et al. (1993) revela que a presença de

cádmio induz um aumento na expressão dos genes codificantes para várias

proteínas envolvidas na via proteolítica dependente de Ubiquitina/Proteassoma,

como sejam: o UBC7, o UBC5 e o UBI4. A resposta a este stress é diferente da

apresentada pelas células expostas a choque térmico em que, apesar de haver

aumento na expressão de UBC5 e UBI4, não há aumento significativo na

expressão de UBC7 (Seufert e Jentsch, 1990; Finley et al., 1987).

Qualquer acréscimo na indução da expressão de subunidades

proteassomais, em princípio, iria aumentar a quantidade de complexos

precursores do proteassoma na célula, facilitando o seu isolamento e

caracterização.

Na tentativa de observar se a presença de cádmio e exposição a um

choque térmico de 37 ºC, seriam condições de stress capazes de aumentar os

níveis de expressão de subunidades proteassomais e, consequentemente, a

quantidade de proteassoma funcional nas células de levedura de padeiro,

realizou-se a experiência que, de seguida, se descreve.

Células da estirpe JD183 foram crescidas em SD-Ura contendo 50 mM de

Cd2+ e, como controlo, cresceu-se a mesma estirpe na ausência de cádmio. O

crescimento foi monitorizado pela medição da OD600 nm ao longo do tempo. Após

30, 60 e 120 minutos de exposição ao cádmio, retiraram-se 10 µL da cultura e

colocaram-se a recuperar em meio sólido (figura 19A).

Resultados 61

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Tempo (min)

OD 60

0

Controlo50 microM Cd++

Controlo

60 minutos

30 m

inut

os

120 minutos

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

0’ 60’ 100’ 130’ 0’ 120’ 240’

Cd2+ Choque térmico

tempo

Cd2+ 37 ºC

130’ 60’ 30’ 30’ 60’ 0’ 120’0’ 240’

50 µM 100 µM

A

B

Ctempo

Figura 19 – Efeito de cádmio e choque térmico a 37 ºC no crescimento de células de S. cerevisiae e na expressão da subunidade proteassomal α7/Prs1p. Curva de crescimento e diferenças no crescimento de células JD183 sob efeito de 50 µM de cádmio (adicionado no tempo zero) (A). Actividade quimotríptica do proteassoma em extractos proteicos de células expostas a diversos tempos a 50 µM de cádmio e choque térmico a 37 ºC (B). Expressão da subunidade proteassomal α7/Prs1p em células expostas durante os tempos indicados a 50 e 100 µM de cádmio e choque térmico a 37 ºC, analisada por immunoblot após separação por SDS-PAGE (C).

OD

600

Resultados 62

As células controlo apresentam um crescimento superior ao observado

para as células expostas a cádmio. Esta diferença no crescimento é mais notória

a partir dos 165 minutos de monitorização em que se nota um claro afastamento

das linhas de crescimento. A partir de 400 minutos de exposição, a densidade

óptica da cultura não exposta a cádmio chega quase a duplicar a densidade

óptica da cultura exposta a este metal tóxico.

Na recuperação em meio sólido após diversos tempos de exposição ao

cádmio observa-se que o tempo de exposição é inversamente proporcional ao

tamanho das colónias isoladas obtidas, ou seja, quanto mais tempo a cultura

esteve exposta ao agente de stress, menor foi o tamanho das colónias isoladas

obtidas.

De modo a verificar se a exposição a 50 µM de cádmio e o choque

térmico a 37 ºC afectavam, de algum modo, a actividade quimotríptica do

proteassoma, foram feitas culturas de células JD183 expostas a estes indutores

de stress (60, 100 e 130 minutos e 120 e 240 minutos, respectivamente).

Prepararam-se extractos proteicos de acordo com o método descrito em 2.2.4.1

e após a normalização da concentração de proteína, a actividade quimotríptica

foi analisada recorrendo a um substrato sintético do proteassoma, cuja

degradação origina um produto fluorogénico (figura 19 B).

A actividade quimotríptica do proteassoma não sofreu alterações

significativas ao longo do tempo de exposição a cádmio relativamente ao

controlo. Este resultado foi verificado também para a indução de stress por

choque térmico, apesar de se notar um ligeiro aumento da actividade

quimotríptica após 120 minutos de exposição a uma temperatura de 37 ºC.

O efeito da exposição de células ao cádmio e a choque térmico sobre a

expressão de subunidades proteassomais, foi estudado em culturas de células

JD183 expostas durante 30, 60 e 130 minutos a 50 µM de cádmio, 30 e 60

minutos a 100 µM de cádmio e 120 e 240 minutos à temperatura de 37 ºC.

Foram preparados extractos como descrito anteriormente e a concentração de

proteína foi normalizada entre eles. As proteínas foram separadas num SDS-

PAGE (ver secção 2.2.7.2.1). Os polipéptidos separados foram

electrotransferidos para uma membrana de PVDF e a presença da subunidade

Resultados 63

proteassomal marcada nesta estirpe, Prs1p-ha foi monitorizada por immunoblot,

como descrito em 2.2.9, com anticorpos anti-ha (figura 19 C).

As bandas obtidas, correspondentes à subunidade Prs1p-ha, em relação

às culturas expostas às duas concentrações de cádmio e a choque térmico, não

apresentam diferenças significativas de intensidade relativamente aos contolos.

3.2 – Marcação da Subunidade α7/Prs1p com o Epítopo ha em JD305

As estirpes de S. cerevisiae utilizadas neste estudo possuem diversas

subunidades marcadas no seu terminal C com epítopos (tabela I) para que

possam ser detectadas imunoquimicamente com anticorpos monoclonais contra

esses epítopos. Nesta secção são apresentados os resultados obtidos nos

vários passos para a marcação da subunidade proteassomal α7/Prs1p na

estirpe JD305 com o epítopo ha.

3.2.1 – Estratégia Usada para a Marcação da Subunidade α7/Prs1p com ha

Plasmídios de DNA contendo genes de interesse com alterações

desejadas podem ser introduzidos em células competentes de levedura. No

caso de existir homologia entre o gene introduzido e o material genético da

levedura, pode ocorrer integração desse gene modificado por recombinação

homóloga (Heinemann e Sprague, 1991) (figura 20 A). Antes da transformação

das células, o plasmídio deverá ser linearizado, com um enzima de restrição,

cujo único local de corte se encontre no gene de interesse. Neste caso foi

utilizado o enzima Cla I, com um sítio de corte único localizado no interior de um

fragmento 5’∆ do gene PRS1 da levedura contendo os codões que codificam

para o epítopo 2xha antes do codão STOP. A integração é efectuada pela DNA

polimerase da levedura durante a replicação do material genético (caminho da

polimerase indicado pelas setas). O resultado final será a introdução do

plasmídio no genoma da levedura, com o gene de interesse modificado de forma

que a sua expressão origine a proteína marcada com o epítopo 2xha.

Resultados 64

5 148 / 4 973 bp 4 268 bp

M + -

pCR8

Cla I

A B

M - + 1 2 4 5 3 6 7 8 C

1375 bp

947 bp

Prs1p-ha

Gel de agarose

Immunoblot

JD305

YPD

SD-Ura

D JD47-13C JD305

JD183 AM1

pCR8

Resultados 65

3.2.2 – Análise da Linearização do Plasmídio pCR8 O plasmídio pCR8 foi incubado com o enzima de restrição Cla I. Num gel

de agarose foram aplicadas as seguintes amostras: Marcador (DNA λ digerido

com EcoR I e Hind III), plasmídio digerido e plasmídio não digerido. Após a

electroforese o resultado foi observado sob luz UV (figura 20 B).

A separação electroforética do plasmídio digerido deu origem a uma só

banda visível (DNA linear). No caso do plasmídio não digerido, são visíveis duas

bandas características do DNA supercoiled (migração rápida) e circular

(migração lenta).

3.2.3 – Análise da Integração por PCR e Immunoblot Uma vez obtido o plasmídio linearizado, procedeu-se à integração do mesmo no

genoma da estirpe JD305. Obtiveram-se cerca de trinta colónias de células

transformadas em meio SD-Ura. Seleccionaram-se oito colónias e a integração

do plasmídio foi analisada por PCR e por Immunoblot, nestas células (figura 20

C).

A análise por PCR foi efectuada com a utilização de primers desenhados

para a amplificação do material integrado desde o início do gene PRS1 até ao

terminador do citocromo c (ver secção 2.2.3.6). Após a amplificação, os produtos

de PCR foram aplicados num gel de agarose juntamente com um marcador. Na

electroforese em gel de agarose, na linha correspondente ao controlo negativo

não foi observada nenhuma banda, contrariamente, nas linhas referentes ao

controlo positivo e às colónias 4, 5 e 6 observou-se uma banda distinta com um

tamanho entre 1375 e 947 bp, que correspondia ao tamanho esperado para o

fragmento a amplificar. Por immunoblot, em todas as amostras analisadas, à

excepção do controlo negativo, foram observadas bandas únicas e distintas.

JD183 Y13∆Prs1p-ha

Resultados 66

3.2.4 – Observação do Fenótipo da Estirpe Mutante (Y13∆) sob Choque Térmico

Para análise do fenótipo da estirpe JD305 marcada com ha (AM1) e não

marcada (JD305), foram incubadas placas a 37 ºC inoculadas com JD305 e AM1

e as estirpes selvagens correspondentes, JD47-13C e JD183. Após a incubação

de 3 dias, a placa foi analisada e o tamanho das colónias isoladas comparado.

Observou-se que as colónias isoladas nas estirpes selvagens são maiores do

que colónias isoladas nas estirpes mutadas, independentemente da marcação

(figura 20 D).

3.3 – Presença de Várias Subunidades Proteassomais ao Longo das Fracções Obtidas por Filtração em Gel

A presença de várias subunidades proteassomais e do factor Ump1 foi

monitorizada por immunoblot ao longo das fracções obtidas pela separação de

extractos proteicos em Superose 6, após uma electroforese desnaturante. A

actividade catalítica destas fracções foi também observada para as estirpe

selvagem JD183 e estirpe mutante AM1.

3.3.1 – Análise da Actividade Quimotríptica em JD183 e AM1 Após separação dos extractos proteicos provenientes das estirpes JD183

e AM1 por exclusão molecular em Superose 6, procedeu-se à análise da

actividade quimotríptica.

Como apresentado na figura 21 A, para a estirpe selvagem, a actividade

catalítica inicía-se na fracção 13, sofre um aumento intenso até atingir o seu

máximo na fracção 16 e decresce até à fracção 20, a partir da qual deixa de

existir actividade catalítica significativa.

Resultados 67

Figura 21 – Análise da actividade quimotríptica e da presença das subunidades proteassomais Pre1p-ha e Prs1p-ha e do factor Ump1p-ha nos complexos separados por filtração em gel. Os extractos de células JD47-13C (sem marcação), AM1 (Prs1p-ha), JD125 (Pre1p-ha), JD129 (Ump1p-ha) e JD183 (Prs1p-ha) foram separados por filtração em gel numa coluna de Superose 6. A presença dos polipéptidos marcados foi analisada ao longo das fracções colhidas, por immunoblot (B) e a actividade catalítica entre a estirpe selvagem e a estirpe mutada foi comparada (A). As subunidades proteassomais marcadas foram salientadas na estrutura cristalina do proteassoma (C).

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30fr acco e s

JD47-13CA M1

CE

Pre1p-ha

Ump1p-ha

Prs1p-ha

Prs1p-ha

158

kDa

232

kDa

669

kDa

A

B

C

*

(JD125)

(JD129)

(AM1)

(JD183)

Resultados 68

A estirpe mutante, à semelhança da selvagem, apresenta o início da

actividade catalítica na fracção 13, com uma subida acentuada da actividade até

à fracção 15 onde atinge valores semelhantes à estirpe selvagem decrescendo a

partir desta até à fracção 19, onde deixa de se observar actividade significativa.

Os valores de actividade monitorizados entre as fracções 16 e 19 da estirpe

mutante são muito inferiores aos observados nas mesmas fracções para a

estirpe selvagem. Um padrão semelhante ao apresentado foi obtido sempre que

se repetiu a experiência.

3.3.2 – Presença de Várias Subunidades Marcadas ao Longo do Padrão de Separação por Filtração em Gel

Extractos de células JD125, JD129, JD183 e AM1 foram passados numa

coluna de Superose 6 e colhidas as fracções daí resultantes. Amostras destas

fracções foram separadas por electroforese em gel desnaturante e a presença

das várias subunidades proteassomais marcadas com ha analisada por

immunoblot com anticorpos contra este epítopo (figura 21 B).

Seguindo uma ordem decrescente de massa molecular, a subunidade

Pre1p (marcada a verde na figura 21 C) está presente nas fracções com

complexos de maior massa molecular até à fracção 23, após a qual se segue

um desaparecimento desta subunidade, voltando a aparecer a partir da fracção

27 e estando presente daí até à fracção 30.

O factor Ump1 (não representado na figura 21 C) encontra-se apenas

presente em complexos colhidos entre as fracções 21 e 24 (figura 21 B)

Curiosamente, a subunidade α7/Prs1p (sinalizada a azul na figura 21 C),

nas duas estirpes analisadas contendo esta subunidade marcada com o epítopo

ha, está presente desde as fracções contendo complexos, de massa molecular

elevada até às fracções contendo os complexos mais leves.

Resultados 69

3.4. – Análise de Complexos Contendo a Subunidade β4/Pre1p e o factor de maturação Ump1p

Foi analisada uma estirpe contendo a subunidade β4/Pre1p e o factor

Ump1p ambos marcados com o epítopo ha (células JD127).

O extracto foi separado por filtração em gel e as fracções analisadas por

immunoblot após electroforese desnaturante (figura 22 A). Foi observado a

presença de uma banda com início na fracção 14, correpondente a complexos

de maior massa molecular, até à fracção 23. Este sinal é interrompido, não

sendo observável sinal nas fracções 24 e 25, voltando a ser visível na fracção 26

e até à ultima fracção analisada.

É também visível o sinal de um polipéptido de menor massa molecular

nas fracções 21 a 23, não observável em nenhuma das outras fracções

analisadas, referente ao factor de maturação Ump1p.

As proteínas foram transferidas para membrana PVDF e as subunidades

marcadas com ha analisadas por immunoblot com dois conjuntos de anticorpos

anti-ha: (16B12/AM e 3F10/AR). Para verificar se algumas das bandas

observadas correspondiam a ligação não específica por parte dos anticorpos

utilizados, o mesmo procedimento foi efectuado com células JD47-13C (estirpe

não marcada). Os filmes foram expostos à luz emitida pelo decaimento do

luminol durante 15 e 70 minutos.

As fracções resultantes da separação de um extracto de células JD127

foram submetidas a electroforese em géis nativos com o objectivo de observar

complexos com diferentes razões carga/massa que contenham os polipéptidos

marcados. Na figura 22 B podem observar-se os resultados obtidos para as

duas estirpes. Quando fracções correspondentes ao fraccionamento do extracto

proteico de células JD127 foram analisados com o conjunto de anticorpos

16B12/AR, foi visível um sinal repetitivo desde a fracção 16 até à 22. Para além

deste sinal observou-se um complexo distinto que se estende da fracção 21 à

25, e um outro conjunto de sinais cujos polipéptidos mostram uma migração no

gel menor que a do conjunto referido anteriormente, nas fracções 25 a 27.

Resultados 70

JD127

A

B

15 min

70 min

CE 13 12 15 14 16 18 17 20 19 21 23 22 24 25 26 28 27 29 30

Pre1p-ha Ump1p-ha

*

JD127

JD47-13C

15 min

70 min

16 18 17 20 19 21 23 22 24 25 26 28 27 29 30

15 min

16 18 17 20 19 21 23 22 24 25 26 28 27 29 30

15 min

16 18 17 20 19 21 23 22 24 25 26 28 27 29 30

70 min

16 18 17 20 19 21 23 22 24 25 26 28 27 29 30

70 min

16 18 17 20 19 21 23 22 24 25 26 28 27 29 30

26S 20S

15S *

*

16 18 17 20

19 21 23 22 24 25 26 28 27 29 30

*

*

16 18

17 20

19

21 23 22 24

25 26

28 27

29

30

26S 20S

15S *

*

16 18 17 20 19 21 23 22 24 25 26 28 27 29 30

*

*

16B12 / AM

3F10 / AR

26S 20S

15S

26S 20S

15S

Figura 22 – Presença das subunidades proteassomais Pre1p-ha e Prs1p-ha e do factor Ump1p-ha nos complexos separados por filtração em gel e electroforese nativa. Os extractos de células AM1 (Prs1p-ha), JD125 (Pre1p-ha), JD129 (Ump1p-ha) e JD183 (Prs1p-ha) foram separados por filtração em gel em Superose 6. A presença dos polipéptidos marcados foi analisada ao longo das fracções colhidas pela separação após electroforese nativa por immunoblot com anticorpos anti-ha. A ligação não específica dos anticorpos foi marcada com *.

Resultados 71

Nas fracções 24, 25 e 26 é também visível um sinal na zona inferior do gel.

Estes dois últimos conjuntos foram salientados e são mais facilmente

observados com 70 minutos de exposição. É também visível um arrastamento

nas três últimas fracções que termina quase no final do gel.

Quanto aos resultados obtidos com este conjunto de anticorpos na estirpe

JD47-13C, observam-se dois conjuntos de sinais. O primeiro estende-se da

fracção 25 à 27, enquanto o segundo aparece com uma maior migração no gel,

nas fracções 24, 25 e 26.

Pela análise com o conjunto de anticorpos 3F10/AR, observa-se existirem

muitas semelhanças com os resultados obtidos com os anticorpos 16B12/AM.

Nomeadamente, são semelhantes os sinais visíveis nas fracções 16 a 21,

apesar de, com estes anticorpos, o sinal na zona superior seja mais intenso,

também, são vísiveis as bandas nas fracções 20 a 25 correspondentes a

complexos com maior migração no gel e ainda o arrastamento nas três últimas

fracções até à frente de migração do gel. Realça-se o desaparecimento de dois

conjuntos de sinais, mencionados na análise dos resultados obtidos com os

anticorpos 16B12/AR. Na estirpe JD47-13C, com a utilização do segundo

conjunto de anticorpos, não existe qualquer sinal visível.

3.5 – Análise de complexos proteassomais contendo β4/Pre1p, α7/Prs1p e Ump1p

Os resultados apresentados na figura 21 B, obtidos por análise das

fracções recolhidas na separação dos extractos das respectivas estirpes por

filtração em gel, após electroforese desnaturante foram comparados com a

análise das referidas fracções separadas por electroforese em condições nativas

(figura 23).

Resultados 72

Na estirpe JD125 é visível a presença da β4/Pre1p num complexo

presente desde as fracções a que corresponde uma massa molecular mais

elevada até à fracção 23 e de novo nas três últimas fracções analisadas, no final

da migração. É ainda observável um conjunto de bandas nas fracções 24 a 26

correspondente a ligação não específica dos anticorpos, como se constatou

pelas análises realizadas e apresentadas na figura anterior.

O complexo contendo Ump1p, analisado na estirpe JD129, é visível nas

fracções 21 a 24.

Quanto à subunidade α7/Prs1p analisada na estirpe JD183, é visível em

complexos de elevada massa molecular nas fracções 16 a 23. Está também

presente nas fracções 20 a 25 em complexos com uma maior migração.

Curiosamente, nestas mesmas fracções observa-se um outro complexo com

uma menor intensidade de sinal e uma migração mais lenta. É, também

claramente, visível a presença desta subunidade em complexos com uma

16 18 17 20 19 21 23 22 24 25 26 28 27 29 30 16 18 17 20 19 21 23 22 24 25 26 28 27 29 30

16 18 17 20 19 21 23 22 24 25 26 28 27 29 30

*

16 18 17 20 19 21 23 22 24 25 26 28 27 29 30

*

JD125 JD129

JD183 AM1 Pre1p-ha Ump1p-ha

Prs1p-ha Prs1p-ha

26S 20S

15S

26S 20S

26S 20S

15S

Figura 23 – Presença das subunidades proteassomais Pre1p-ha e Prs1p-ha e do factor Ump1p-ha ao longo dos complexos separados por filtração em gel e electroforese nativa. Os extractos de células AM1 (Prs1p-ha), JD125 (Pre1p-ha), JD129 (Ump1p-ha) e JD183 (Prs1p-ha) foram separados por filtração em gel em Superose 6. A presença dos polipéptidos marcados foi analisada nas fracções colhidas pela separação após electroforese nativa por immunoblot com anticorpos anti-ha 16B12/AM para as estirpes JD125 e JD129 e 3F10/AR para as estirpes JD183 e AM1. A ligação não específica dos anticorpos foi marcada com *.

Resultados 73

elevada mobilidade, que se estende da fracção 21 à 30. Menos distintamente,

são ainda visíveis dois conjuntos de bandas nas fracções 27, 28 e 29, com uma

mobilidade intermédia entre o complexo 15S e a forma livre, que se parecem

repetir, um ligeiramente acima do outro.

A análise da subunidade α7/Prs1p na estirpe com a delecção da

subunidade α3/Y13, mostrou-nos que esta está presente em complexos de

elevada massa molecular (fracções 16 a 21) e apareceu distribuída ao longo das

fracções 19 a 30, numa forma com elevada mobilidade no gel nativo. Na posição

onde habitualmente se encontra o complexo 15S, nesta estirpe são apenas

visíveis bandas com uma fraca intensidade de sinal, quase indistintas do

background. Também com um sinal muito fraco, aparecem bandas nas fracções

27 a 29, semelhantes às observadas na análise desta subunidade na estirpe

selvagem JD183.

3.6 – Purificação de Complexos contendo α7/Prs1pFLAG-6His Para uma melhor caracterização dos complexos precursores envolvidos

na montagem do proteassoma 20S, testou-se um processo de purificação por

cromatografia de metalo-afinidade, usando a estirpe JD228 com a subunidade

α7/Prs1p marcada com o epítopo FLAG e com 6His. A cromatografia foi

efectuada como descrito em 2.2.10 e o material recolhido foi separado por

electroforese desnaturante e analisado por coloração com prata e por

immunoblot com anticorpos anti-FLAG (figura 24).

No gel submetido a análise pelo método da prata observam-se muitos

polipéptidos contaminantes nas fracções eluídas com imidazole.

No immunoblot observa-se uma banda intensa, correspondente à

subunidade marcada, nas amostras ce, dce, ft e w1, juntamente com outras

bandas não específicas. Nas amostras w10 e w11 não é visível nenhum sinal.

Nas amostras e1 – e5, observa-se a presença da subunidade marcada com uma

intensidade decrescente de sinal.

Resultados 74

ce dce ft w1 w10 w11 e1 e2 e3 e4 e5 ce dce ft w1 w10 w11 e1 e2 e3 e4 e5

JD228

Coloração por prata Immunoblot

Prs1pFLAG6His

Figura 24 – Análise das fracções obtidas por cromatografia de metalo-afinidade através de coloração dos péptidos por nitrato de prata e immunoblot com anticorpos anti-FLAG, após separação por electroforese desnaturante. ce – extracto cru, dce – extracto cru dessalinizado, ft – eluição do material não ligado à resina, w1 - primeiro mililitro da lavagem com tampão de eluição, w10 – décimo mililitro da lavagem com tampão de eluição, w11 – décimo primeiro mililitro da lavagem com tampão de eluição, e1, e2, e3, e4, e5 – eluições com concentrações crescentes de imidazole (50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 400 mM)

Discussão 75

4 – Discussão 4.1 - Efeito do Cádmio e do Choque Térmico no Crescimento de

S. cerevisiae e na Expressão da Subunidade Proteassomal α7/Prs1p

O efeito de vários tipos de stress como o cádmio e choque térmico leva a

mudanças na regulação celular e pode alterar a expressão de várias proteínas

cuja competência é a de a proteger a célula. Algumas das proteínas cuja

expressão é alterada pela presença de cádmio fazem parte da via proteolítica

dependente de ubiquitina/proteassoma (Jungmann et al.,1993).

Sendo o proteassoma um dos complexos proteicos presentes neste

mecanismo de degradação proteica, havia a hipótese de stress induzido por

cádmio e/ou choque térmico provocar efeitos na expressão das subunidades

que formam este complexo. Em caso de aumento de expressão, a quantidade

intracelular disponível para análise seria maior, podendo facilitar o isolamento e

caracterização de complexos precursores na montagem do proteassoma 20S.

4.1.1 – O Cádmio Influencia o Crescimento Celular em Levedura Como o observável na figura 19 A, relativamente ao controlo, a cultura

sujeita ao tratamento com cádmio teve um crescimento menos acentuado, o que

é visível pelo afastamento das curvas de crescimento. Esta diferença é mais

salientada para elevados tempos de exposição. O efeito nocivo do cádmio foi,

também, verificado nas células em recuperação em meio sólido, uma vez que

células mais tempo expostas ao indutor de stress tiveram uma taxa de

recuperação menor, observável pelos diferentes tamanhos das colónias

isoladas.

A diminuição no crescimento das células expostas a cádmio poderá

dever-se ao efeito deste metal nas proteínas, que origina anormalidades na

formação das mesmas (Vallee e Ulmer, 1972). As proteínas malformadas podem

tornar-se tóxicas e formar agregados que podem levar à morte celular.

Discussão 76

4.1.2 – O Cádmio e Choque Térmico não Afectam os Níveis de Expressão nem a Actividade Quimotríptica do Proteassoma

Pela observação da figura 19 B, verifica-se que não houve diferenças

significativas na actividade quimotríptica do proteassoma de células expostas a

cádmio e choque térmico, por comparação com os controlos, apesar dos vários

tempos de exposição testados. Este facto poderá ser explicado em conjunto com

os resultados apresentados na figura 19 C, que mostra não haver aumento na

expressão da subunidade proteassomal α7/Prs1p. É provável que este tipo de

stress, apesar de aumentar a expressão de determinadas proteínas

relacionadas com o sistema de conjugação com Ub, não o faça com os

polipéptidos que constituem o proteassoma. Assim, a actividade quimotríptica

não é afectada uma vez que a concentração de proteassoma presente a nível

intracelular pode não ter sofrido alterações por exposição aos agentes de stress

testados.

4.2 – Marcação da Subunidade α7/Prs1p com o Epítopo ha

A detecção específica de subunidades proteassomais pode realizar-se

com o auxílio de anticorpos. Utilizou-se um epítopo sintético, ha, para a

marcação das subunidades no seu terminal carboxílico, de modo a não interferir

com o tamanho e estrutura do propeptídio apresentado por algumas delas que,

como já mencionado é importante para a montagem correcta do proteassoma

(Chen et al., 1996).

4.2.1 – Verificação da Linearização do pCR8 por Cla I Como observável no gel de agarose (figura 20 B), no poço onde foi

aplicado o plasmídio incubado com o enzima de restrição Cla I é visível uma

única banda, correspondente à forma linearizada do plasmídio de 4612 bp, por

Discussão 77

comparação com as posições relativas das bandas do marcador. No poço

correspondente ao plasmídio não digerido são visíveis duas bandas distintas

cuja migração não é comparável com o marcador, visto tratar-se das formas

características de um plasmídio não linearizado: a forma circular e a forma

supercoiled.

4.2.2 – Verificação da Integração por PCR e Immunoblot A correcta integração do pCR8 no genoma da levedura foi verificada

recorrendo à técnica de PCR e Immunoblotting. Para a primeira foram

desenhados primers para a amplificação de modo a obter um produto com início

na origem do gene PRS1 da levedura até ao terminador do citocromo c

introduzido.

Como é visível na figura 20 C, o controlo negativo não originou produto,

como esperado, uma vez que a estirpe utilizada contém no seu genoma o início

do gene PRS1, mas não o terminador do citocromo c. As colónias 4, 5 e 6 deram

origem a um produto com um padrão de migração semelhante ao obtido no

controlo positivo, com aproximadamente o tamanho esperado (1288 bp). As

restantes colónias não deram origem a produtos de PCR. No entanto, existe a

possibilidade de ter havido problemas na reacção de amplificação, uma vez que

estas colónias, à semelhança do controlo positivo e colónias 4, 5 e 6, deram

origem a uma banda pela reacção com anticorpos anti-ha, com um padrão de

migração semelhante ao destas, como observável no immunoblot (figura 20 C),

banda esta que está ausente no controlo negativo.

4.2.3 – A Estirpe Mutante JD305 (Y13∆) é Sensível a Stress Provocado por Choque Térmico

Como é visível na figura 20 D, quando colocadas a 37 ºC, o crescimento

da estirpe com a delecção da subunidade α3/Y13 é severamente afectado

apresentando um menor nível de multiplicação, por comparação do tamanho das

Discussão 78

colónias isoladas relativamente às estirpes selvagens, o que mostra um menor

nível de resistência a este stress por parte desta estirpe. Este efeito é

observável na a estirpe marcada com Prs1p-ha e na estirpe não marcada,

demonstrando assim que a marcação não influencia o fenótipo desta estirpe em

relação ao stress induzido por choque térmico.

Provavelmente, a delecção da subunidade levará a que haja um menor

nível de proteassomas funcionais dentro da célula, ou um abaixamento na

funcionalidade dos mesmos, que permite a acumulação de agregados proteicos

e proteínas anormais a nível intracelular formados por indução do choque

térmico e que, normalmente, são eliminados por acção da via proteolítica

dependente de Ub/proteassoma.

4.3 – Existem Diferenças na Distribuição das Várias Subunidades ao Longo de Complexos Separados por Exclusão Molecular

A passagem dos extractos por uma coluna de exclusão molecular permite

separar complexos distintos, com diferentes massas moleculares, envolvidos na

formação do proteassoma 20S e proteassoma 26S.

A análise das actividades quimotrípticas dos complexos presentes nas

fracções colhidas dá uma ideia precisa das fracções onde é eluído o

proteassoma completamente montado e activo (figura 21 A), uma vez que, só

depois da montagem e da degradação do factor Ump1, o proteassoma fica

funcional para a degradação de outros substratos (Ramos et al., 1998).

A análise das fracções por immunoblot, após separação por electroforese

desnaturante, permite associar a presença da subunidade numa determinada

fracção a complexos com uma massa molecular correspondente ao volume de

eluição da fracção em causa.

Discussão 79

4.3.1 – A Estirpe Mutante AM1 Apresenta uma Actividade Catalítica Semelhante à Estirpe Selvagem no Proteassoma 26S, mas mais Reduzida no Proteassoma 20S

A estirpe mutante tem um padrão de actividade quimotríptica semelhante

à estirpe selvagem até à fracção 15 (correspondente a uma massa molecular

extrapolada de cerca de 1050 kDa), a partir da qual sofre um decréscimo. Os

valores de actividade da fracção 16 à 19, a partir da qual deixa de ter actividade

catalítica significativa, são inferiores aos da estirpe selvagem (figura 21 A).

Parece claro que a mutação (delecção da subunidade α3/Y13) afecta a

actividade catalítica do proteassoma 20S. É no entanto desconhecida a razão

deste efeito. Curiosamente, as fracções correspondentes a massa molecular

mais elevada que o proteassoma 20S não mostram grandes diferenças em

relação à estirpe selvagem.

Estes resultados sugerem que a ligação dos complexos regulatórios ao

proteassoma 20S venha, de algum modo, minimizar o efeito inibitório que possa

estar a ser induzido por uma alteração estrutural devido à falta da subunidade

α3/Y13.

4.3.2 – A Subunidade α7/Prs1p Está Presente ao Longo de Todas as Fracções Obtidas por Filtração em Gel

A análise da presença das subunidades proteassomais β4/Pre1p e

α7/Prs1p e do factor Ump1p nas fracções obtidas por filtração em gel dos

extractos das estirpes correspondentes (figura 21 B) mostrou-nos que a

α7/Prs1p está presente ao longo de todas as fracções obtidas, e deste modo,

presente em toda a gama de complexos proteassomais separados, na estirpe

selvagem JD183 e mutante AM1. Em contraste está o resultado obtido pela

análise da subunidade β4/Pre1p que apenas se encontra presente nas fracções

correspondentes a massas moleculares baixas e nas fracções correspondentes

a massas moleculares acima dos 200 kDa.

Discussão 80

O factor Ump1, em concordância com os resultados apresentados por

Ramos et al. (1998), é apenas detectado nas fracções 21 a 24, o que poderá

significar que este factor é integrado no complexo 15S e degradado após o

acoplamento de dois destes complexos, para dar origem ao proteassoma 20S,

segundo modelo apresentado por Ramos et al. (1998).

Estes resultados levam a crer que a subunidade α7/Prs1p está presente

desde os estágios iniciais da montagem do proteassoma, sendo integrada muito

cedo ou mesmo sendo ela a iniciadora da montagem do proteassoma 20S. O

“desaparecimento” da subunidade β4/Pre1p nas fracções 24 a 26 pode significar

que esta subunidade é separada na sua forma livre (fracções 27 a 30) e que

posteriormente só é de novo encontrada integrada num complexo pré-existente.

Estas observações foram confirmadas através da análise por immunoblot das

fracções obtidas por filtração em gel de extractos de JD127 (β4/Pre1p-

ha/Ump1p-ha). Como observável na figura 22 A, os padrões são semelhantes

aos obtidos anteriormente com estes polipéptidos marcados em estirpes

separadas, sendo mais uma vez notório o intervalo no padrão da β4/Pre1p-ha

nas fracções 24 e 25 que, como descrito acima, poderá indicar que esta

subunidade é incorporada num nível avançado da montagem do proteassoma, e

está ausente dos passos iniciais.

Os resultados obtidos com o factor Ump1p marcado anteriormente (figura

21 B) foram também observados com esta estirpe (figura 22 A).

As fracções colhidas foram também analisadas por electroforese em

condições nativas, tendo como controlo de especificidade de anticorpo as

fracções obtidas a partir da estirpe não marcada JD47-13C. A primeira grande

observação provém do resultado obtido com esta estirpe em que se verifica a

existência de dois conjuntos de sinais correspondentes a ligação não específica

por parte do conjunto de anticorpos 16B12/AM (assinalados com * na figura 22

B) uma vez que esta estirpe não possui qualquer marcação para ser detectada

por estes anticorpos. Comprova-se que estas bandas são ligação não específica

pela observação do resultado obtido, com esta estirpe, recorrendo à utilização

Discussão 81

do conjunto de anticorpos 3F10/AR, em que não houve qualquer reacção

observável, nem mesmo após 70 minutos de exposição (figura 22 B).

Nos resultados obtidos por immunoblot, a partir da separação

electroforética em condições nativas das amostras colhidas por fraccionamento

em coluna de Superose 6 de extractos proteicos de células JD127, observou-se

o conjunto proteassoma 26S/20S, determinado pela baixa mobilidade dos

complexos e pela massa molecular correspondente às fracções em que são

identificados (figura 22 B). É também visível o complexo 15S (sinal visível da

fracção 20 à 26), cujo sinal é proveniente não só do factor Ump1p marcado mas

também da subunidade β4/Pre1p, também marcada nesta estirpe e que, como

descrito por Ramos et al. (1998), está presente neste complexo. A partir da

fracção 28 é visível um arrastamento que deverá corresponder à migração da

subunidade β4/Pre1p na forma livre.

Estes resultados estão de acordo com os obtidos após separação das

fracções em gel desnaturante (figura 22 A), apesar de nos géis nativos, o

intervalo de sinal não ser tão evidente como no desnaturante.

A análise da subunidade β4/Pre1p na estirpe JD125 e do Ump1p na

estirpe JD129, recorrendo ao uso de géis nativos (figura 23), está também de

acordo com o observado com os géis desnaturantes (figura 21 B). Apesar do

blot obtido para JD125 apresentar uma intensidade de sinal fraca, possivelmente

devido a qualquer anormalidade no decorrer do procedimento, é visível a

presença da subunidade β4/Pre1p em complexos correspondentes ao

proteassoma 26S/20S e na sua forma livre nas fracções 28 a 30. Ao contrário do

esperado, não é detectada a presença desta subunidade no complexo 15S. No

entanto, isto poderá dever-se à degradação do complexo ou à possível

irregularidade na detecção, uma vez que esta subunidade foi detectada neste

complexo com o uso de um gel de acrilamida nativo a 6% (resultado não

apresentado). O Ump1p é detectado nas fracções 21 a 24 (figura 23) como

esperado por comparação com o gel desnaturante (figura 21 B).

Discussão 82

4.3.3 – A Delecção da Subunidade α3/Y13 Provoca Alterações na

Distribuição da Subunidade α7/Prs1p

Apesar de a subunidade α7/Prs1p ser detectada na estirpe selvagem

(JD183) e na estirpe mutante com delecção da subunidade α3/Y13 (AM1),

existem grandes diferenças no padrão de distribuição desta subunidade na

montagem do proteassoma 20S.

Na estirpe JD183 (figura 23), observaram-se claramente os complexos de

massa molecular elevada correspondentes ao proteassoma 26S/20S

demonstrando que esta subunidade está presente no proteassoma montado,

como descrito por Groll et al. (1997). A presença desta subunidade no complexo

15S, nesta estirpe, é também evidente. No entanto, o aparecimento de um

conjunto de sinais extremamente semelhantes aos revelados pelo complexo

15S, numa posição imediatamente acima deste, apesar de com uma intensidade

de sinal mais baixa, poderá significar a existência de alterações estruturais ou a

existência de uma modificação num dos constituintes do complexo que altere a

sua razão carga/massa e consequentemente a mobilidade deste complexo.

Como esperado, observou-se a presença da subunidade na forma livre nas

últimas frações analisadas. No entanto, inesperadamente, este sinal é também

visível em fracções correspondentes à separação de massa molecular mais

elevada, e é observado desde a fracção 19 à 30. Como o extracto foi separado

numa coluna de exclusão molecular e, o que se observa, é o sinal

correspondente à forma livre, admite-se que tenha havido dissociação desta

subunidade a partir de complexos precursores na formação do proteassoma,

uma vez que pensamos que esta é uma das subunidades iniciais na formação

de complexos, como acima descrito. A dissociação pode ter sido causada pelo

tratamento sofrido com a electroforese, após a colheita das fracções, uma vez

que, provavelmente, estes complexos terão um tempo de semi-vida bastante

curto e serão extremamente instáveis. As bandas visíveis, se bem que com fraca

intensidade, nas fracções 27, 28 e 29 poderão ter origem na detecção desses

complexos precursores (figura 23).

Discussão 83

Na estirpe AM1 é também evidente a presença da subunidade α7/Prs1p

no proteassoma 26S/20S. A presença desta subunidade no complexo 15S,

perfeitamente visível na estirpe selvagem, é quase imperceptível na estirpe

mutante (figura 23). Numa das hipóteses colocadas para explicar este facto

pensou-se que, devido à falta da subunidade α3/Y13, os complexos mais leves

que o complexo 15S poderiam sofrer alterações estruturais que impedissem a

formação deste. No entanto, a acontecer, certamente levaria a uma acumulação

de complexos malformados detectável por um aumento da intensidade das

bandas correspondentes às fracções anteriores ao complexo 15S no gel

desnaturante (figura 21 B), o que não se verificou. Nesta estirpe, à semelhança

do que se observa para a JD183, a forma livre está presente da fracção 19 à 30

(figura 23). Assim como para a estirpe mutante, isto poderá ser consequência da

dissociação desta subunidade de complexos precursores da biogénese do

proteassoma 20S. Na estirpe JD183 são igualmente visíveis bandas nas

fracções 27, 28 e 29 que poderão indicar a presença destes complexos (figura

23).

4.4 – Purificação de Complexo contendo α7Prs1pFLAG-6His

Posteriormente à purificação de complexos precursores da montagem do

proteassoma 20S, poder-se-iam utilizar técnicas avançadas, como por exemplo

a electroforese bi-dimensional para os caracterizar.

Os polipéptidos contidos nas amostras resultantes da cromatografia de

metalo-afinidade foram comparados após separação por electroforese

desnaturante, coloração com prata e immunoblot.

Como se pode observar na figura 24 (immunoblot), a cromatografia de

metalo-afinidade permite purificar especificamente material contendo a

subunidade de interesse, no entanto, as condições utilizadas têm de ser

melhoradas, uma vez que, na coloração por prata, são visíveis contaminantes

nas fracções eluídas com imidazole. A quantidade de resina utilizada foi

insuficiente já que, pela observação da amostra FT (material não ligado),

Discussão 84

verifica-se que é perdido material de interesse, o que pode indicar a saturação

da resina.

A presença de material de interesse ao longo do gradiente de imidazole

pode ser explicado pela razão tamanho/posições de ligação. Isto é, neste tipo de

cromatografia existe uma baixa de eficácia com o aumento do tamanho da

molécula a purificar. No entanto, para complexos proteassomais com tamanhos

elevados, como seja o proteassoma 20S, passam a existir dois locais de ligação

da molécula à resina (uma subunidade marcada com 6His por cada meio

proteassoma) o que torna a ligação mais estável.

As fracções de eluição e1, e2 e e3, foram separadas numa coluna de

filtração em gel (resultados não apresentados) dando origem a resultados não

conclusivos, que podem ser indicadores da necessidade de afinamento de

condições da cromatografia, nomeadamente ao nível do aumento da quantidade

de material utilizado.

Conclusões 85

5 – Conclusões No decorrer deste trabalho, foi conseguido um conjunto de resultados que

permitiu o desenvolvimento das conclusões abaixo descritas.

A nível do efeito dos indutores de stress aplicados em levedura, como o

cádmio e choque térmico, conclui-se que o primeiro influencia o

desenvolvimento normal de levedura de uma forma negativa. No entanto, apesar

do proteassoma ser um dos principais componentes da via de degradação

proteolítica dependente de ubiquitina/proteassoma, e desta via ser a principal

responsável pela eliminação de proteínas malformadas e não funcionais

originadas por indutores de stress como os testados, pelos resultados obtidos

conclui-se que a exposição a cádmio ou a choque térmico não influencia o nível

de expressão do proteassoma nem a actividade quimotríptica do mesmo. Na

estirpe mutante AM1, o crescimento em condições de choque térmico é inibido

em relação à estirpe selvagem.

A subunidade α3/Y13 é essencial para a existência de uma correcta

actividade quimotríptica pelas diferenças observadas entre esta actividade na

estirpe mutante e na estirpe selvagem.

A observação da distribuição das várias subunidades estudadas em

complexos separados por exclusão molecular permite concluir que a ordem de

inserção das subunidades durante da montagem do proteassoma é diferente

para cada uma delas. A subunidade β4/Pre1p é incorporada em complexos com

cerca de 400 kDa contendo a α7/Prs1p, enquanto que esta é incorporada em

complexos com inferior massa molecular.

A delecção da subunidade α3/Y13 provoca alterações ao nível da

distribuição normal da subunidade α7/Prs1p.

Perspectiva Futura 86

6 – Perspectiva Futura No decorrer deste trabalho, e pela observação dos resultados

experimentais, foram encontradas respostas a algumas questões. No entanto,

muitas outras ficaram por responder ou foram levantadas. De futuro, é nossa

intenção tentar responder a algumas dessas questões, nomeadamente no

campo dos passos iniciais da montagem do proteassoma 20S.

Um dos nossos objectivos futuros é conseguir caracterizar complexos que

estejam envolvidos nos passos iniciais de montagem do proteassoma. Uma das

aproximações será a purificação desses complexos recorrendo à utilização de

cromatografias de metalo-afinidade, já iniciadas no presente trabalho,

cromatografias de imuno-afinidade e imuno-precipitação, e posterior

caracterização por electroforese bi-dimensional.

Seria também interessante aprofundar um pouco mais o conhecimento

sobre o efeito da delecção da subunidade α3/Y13 na estrutura e actividade do

proteassoma 20S.

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Anexos 96

8 – Anexos Em anexo encontra-se uma cópia do trabalho apresentado em forma de

poster no “27th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies”, 30

de Junho a 5 de Julho, 2001; Lisboa, Portugal.

António MARQUES†, Jürgen DOHMEN‡, Paula RAMOS†

†ADQuímica, FCT, Universidade do Algarve, PORTUGAL‡Institut für Genetik, Universität zu Köln, DEUTSCHLAND

DISTRIBUTION OF THE α7/Prs1p SUBUNIT (HsC8 HOMOLOG) IN YEAST

PROTEASOMAL COMPLEXES

INTRODUCTIONMany short-lived proteins including various regulatory

proteins in the cell suffer selective ubiquitylation and destruction. Ubiquitin-mediated proteolysis (UMP) therefore serves an important role in a variety of basic cellular functions. In a very simplified view, the UMP system functions in two steps: first, the substrate proteins are modified by the covalent attachment of ubiquitin molecules, second, these polyubiquitylated proteins are recognized by the 26S proteasome and degraded inside its catalytic core, the 20S proteasome 1.

In its mature and active state, the eucaryotic 20S proteasome is characterized by the presence of 14 different subunits, seven of the α-type and seven of the β-type, organized in four heptameric stacked rings with the arrangement α7β7β7α7, as showing in its crystal structure 2 (Fig.1).

Fig. 1 – Crystal structure of the 20S proteasome. Side view (left) and top view (right).

In the past few years much information has been accumulated on many steps of protein degradation, nevertheless our knowledge on the 20S proteasome assembly process is still diffuse with fragments of information stemming from studies donein various species and under different conditions 3.

METHODS

Extracts from a Saccharomyces cerevisiaestrain expressing the α subunit α7/Prs1p tagged with the haepitope, and other with the βsubunit β4/Pre1 and Ump1 tagged with the same epitope, were separated by gel filtration on a Superose 6 column. The fractions were scanned for proteasomal activity (chymotryptic) and analysed by PAGE and SDS-PAGE. The polypeptides were transfered to a PVDF membrane and incubated with anti-ha antbody (Fig. 2)

Fig. 2 – Schematic resuming the methods used;

RESULTS and DISCUSSIONOur results showed that α7/Prs1p is present in all

fractions from the free subunit to the catalytic active 26S proteasome fractions. This observations suggested the presence of distinct complexes containing this subunit. By comparison, the analysis for the presence of β4/Pre1 subunit in proteasomal complexes showed a gap between the Ump1 complex (half proteasome) 4 and what appears, according to its molecular weight, to be the free subunit (Fig. 3).

These results suggest that α7/Prs1p could be one of the initiators or participate in very early events of the proteasomeassembly process, before the two Ump1 complexes assemble together, as shown in a model previously reported 4.

Analysis of the fractions from the α7/Prs1p-ha tagged strain on a native gel (Fig. 4) revealed the presence of this subunit in complexes lighter than the Ump1 complex but heavier than the free subunits, in agreement with the SDS-PAGE analysis.

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26S/20S proteasome

Ump1 complex

**

Fig. 3 – Chymotryptic activity in the fractions obtained after gel filtration on a Superose 6 column and the corresponding SDS-PAGE and immunoblot patterns of Prs1p-ha and Pre1p-ha (blue and green subunits respectively on the proteasome structure) and Ump1p-ha.

Fig. 4 – PAGE analysis followed by anti-ha immunoblot of the fractions collected using the α7/Prs1-ha tagged strain; ** - α7/Prs1p containing complexes.

CHYMOTRYPTIC ACTIVITY

PAGE SDS-PAGE

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3. Hilt W, Wolf G (ed.); 2001; “Proteasomes: The world of regulatory proteolysis”; Landes & Co.; USA

4. Ramos P, Höckendorff J, Johnson E, Varshavsky A, Dohmen J; 1998; Cell 92:489-499

This work was supported by a grant from Fundação para a Ciência e Tecnologia

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Estudo da Incorporação de Subunidades Durante a Montagem ... · "There must be no barriers for freedom of inquiry. There is no place for dogma in science. The scientist is free,