Estudo da participação da via de sinalização dependente de ...iba.fmrp.usp.br/sites/default/files/defesas/dissertacoes/dissertac... · universidade de sÃo paulo faculdade de

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA

Estudo da participação da via de sinalização

dependente de ERK5 na polarização de macrófagos

M2 induzida por IL-4

João Paulo Mesquita Luiz

Ribeirão Preto

2015

João Paulo Mesquita Luiz

Estudo da participação da via de sinalização

dependente de ERK5 na polarização de macrófagos


Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada

Orientador: Prof. Dr. José Carlos Farias Alves-Filho

Ribeirão Preto

2015

Dissertação apresentada ao Programa de

pós-graduação em Imunologia Básica e

Aplicada da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto da Universidade de São

para obtenção do título de Mestre em

Ciências.

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA

FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Luiz, João Paulo Mesquita

Estudo da participação da via de sinalização dependente de ERK5 na

polarização de macrófagos M2 induzida por IL-4. Ribeirão Preto, 2015.

90 p.

Dissertação de mestrado, apresentada à Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Programa de Pós-Graduação

em Imunologia Básica e Aplicada.

Orientador: Alves-Filho, José Carlos Farias.

1. Macrófagos; 2. Polarização; 3. IL-4; 4. M2; 5. ERK5

FOLHA DE APROVAÇÃO

JOÃO PAULO MESQUITA LUIZ

ESTUDO DA PARTICIPAÇÃO DA VIA DE SINALIZAÇÃO

DEPENDENTE DE ERK5 NA POLARIZAÇÃO DE MACRÓFAGOS M2

INDUZIDA POR IL-4

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Imunologia Básica e Aplicada da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da

Universidade São Paulo como parte das exigências

para obtenção do título de Mestre em Ciência.

Área de concentração: Imunologia

Banca examinadora

________________________________________

Prof. Dr. José Carlos Farias Alves-Filho

FMRP-USP

________________________________________

Profª. Drª. Vânia Luiza Deperon Bonato

FMRP-USP

________________________________________

Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara

ICB-USP

Trabalho realizado no Laboratório de Inflamação e Dor do Departamento

de Farmacologia e associado ao Programa de pós-graduação em Imunologia

Básica e Aplicada da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade

de São Paulo, com auxílio financeiro da CAPES e do CNPq.

“Eu defendo uma maneira pessoal de viver com sobriedade,

porque para viver é preciso ter liberdade

e para ter liberdade devemos ter tempo ..."

José Mujica, o Pepe - Ex-presidente do Uruguai

DEDICATÓRIA

À minha amada família:

Meus pais, Ilaine e Paulo Edgar

Minha irmã Juliane

Ao meu avô Olindor

Minha eterna gratidão pelo seu amor,

dedicação, paciência, incentivo e apoio incondicional.

Agradeço muito a vocês pela ótima vida que me deram.

Obrigado por tudo!

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. José Carlos pela orientação, confiança e ensinamentos que auxiliaram meu

crescimento profissional e intelectual.

Ao Prof. Fernando Cunha, pela oportunidade de trabalhar em seu laboratório e pela

competência cientifica.

A Drª. Priscilla Tartari, Paula Viacava e a Drª. Daniele Nascimento pela colaboração e

execução do presente trabalho.

Aos colegas de laboratório, por proporcionarem discussões produtivas e um ótimo ambiente

de trabalho.

Aos membros da banca, pela atenção e disponibilidade em participar da minha banca

examinadora.

Aos técnicos do Laboratório de Infalmação e Dor: Giuliana, Diva, Kátia, Ieda e Marquinhos,

por todo apoio e companheirismo.

A todos os docentes e funcionários do Programa de pós-graduação em Imunologia Básica e

Aplicada.

Aos amigos da USP: André (capaz), Annie, Flávio, Paula, Rafael (Ferrerinha), Cássia,

Vanessa, Douglas, Paulo, Caio, Rafael (Panda), Alexandre (Kanashiro), Rangel, Priscilla,

Daniele, pelos bons momentos de discussão cientifica e descontração.

Aos amigos Lucas, André (Brandão), Paula e aos demais amigos pelo convívio, amizade,

parceria e pelos bons momentos vividos durante a realização do meu mestrado.

A minha namorada, Nayara, pelo companheirismo, amor, amizade e pelos ótimos momentos

que temos vivido juntos.

Aos meus pais (Paulo Edgar e Ilaine), minha irmã (Juliane), meu avô (Olindor) e a toda minha

familia, por todo apoio e carinho concedido.

Ao CNPq e à CAPES pelo suporte financeiro.

A todos, que diretamente ou indiretamente, contribuiram para meu crescimento pessoal e

profisional e para a realização deste trabalho.

I

Resumo

II

RESUMO

LUIZ, J. P. M. Estudo da participação da via de sinalização dependente de ERK5 na

polarização de macrófagos M2 induzida por IL-4. Ribeirão Preto, 2015. 90 p. Dissertação

(Mestrado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão

Preto, 2015.

Os macrófagos são células imunológicas que apresentam uma alta capacidade plástica que

permite sua polarização em diferentes súbtipos celulares em respostas a diversos estímulos

ambientais. Dentre esses súbtipos, os macrófagos M2a desempenham um papel central no

reparação tecidual, na resposta imune contra parasitas e na regulação imunológica. A

polarização de macrófagos M2a é induzida por citocinas tipo-2, IL-4 e IL-13, e envolve a

ativação do receptor da IL-4 e, subsequentemente, o fator de transcrição STAT6. Estudos

recentes têm descrito que a ERK5 regula a expressão de genes relacionados ao perfil M2 em

macrófagos durante o processo de eferocitose. No presente estudo, investigamos se a via

MEK5/ERK5 participa da polarização de macrófagos M2 induzida por IL-4. Nossos

resultados mostraram que a IL-4 induz a fosforilação de ERK5 em macrófagos derivados da

medula óssea (BMDMs). A inibição farmacológica da EKR5, com o inibidor XMD 8-92,

reduziu significativamente a expressão de marcadores M2 clássicos, tais como Fizz-1, Arg-1,

YM-1, bem como a produção de quimiocinas e citocinas CCL17, CCL22 e IGF-1 por

macrófagos ativados por IL-4. Além disso, a inibição de ERK5 reduziu os níveis proteicos de

Arg-1 e a produção de ureia. Investigamos também o papel de MEK5, o ativador imediato à

montante de ERK5, na regulação da expressão de marcadores M2. A inibição da MEK5, com

o inibidor BIX 02189, recapitulou os resultados obtidos com inibidor de ERK5 na polarização

M2 induzida por IL-4, confirmando o envolvimento do eixo MEK5/ERK5 em respostas M2.

Adicionalmente, observamos que macrófagos STAT6-KO tiveram menor capacidade em

polarizar para fenótipo M2. Interessantemente, a inibição de ERK5 não afetou os níveis de

fosforilação de STAT6, nem a expressão gênica de Cebpb, sugerindo que a via de sinalização

de EKR5 regula a expressão de marcadores M2 possivelmente em paralelo ou à jusante da via

de STAT6 e C/EBPβ. Em geral, estes achados revelam um papel central da via MEK5/ERK5

na polarização de macrófagos M2 induzida por IL-4.

Palavras-chave: Macrófagos, polarização, M2, IL-4, ERK5.

III

ABSTRACT

LUIZ, J. P. M. Study of participation of the signaling pathway ERK5-dependent on the

IL-4-induced M2 macrophage polarization. Ribeirão Preto, 2015. 90 p. Dissertação

(Mestrado) – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão

Preto, 2015.

Macrophages are immune cells that have a high plastic capacity which allows its polarization

in different cells subtypes in response to various environmental stimuli. Among these

subtypes, the M2a macrophages play a central role in tissue repair, immune response against

parasite and immune regulation. The polarization of M2a macrophages is induced by Th2

cytokine patterns such as IL-4 and IL-13, and involves the activation of the IL-4 receptor and,

subsequently, the transcription factor STAT6. Recent studies have described that ERK5

regulates the gene expression M2-related profile in macrophages during efferocytosis process.

In the present study, we investigated whether MEK5/ERK5 pathway plays a role in the

polarization of IL-4-induced M2 macrophages. Our results show that IL-4 as well as LPS

induced phosphorylation of ERK5 in bone-marrow-derived macrophages (BMDMs). The

pharmacological inhibition of EKR5, with XMD 8-92 inhibitor, markedly reduced the

expression of classical M2 markers, such as Fizz-1, Arg-1, Ym-1, as well as the production of

M2-related chemokines and cytokines, CCL22, CCL17 and IGF-1 in activated macrophages

by IL-4. Moreover, ERK5 inhibition reduced protein Arg-1 expression and urea production.

We also investigated the role of the MEK5, an immediate upstream activator of ERK5, in the

regulation of M2 markers expression. The inhibition of MEK5, with BIX 02189 inhibitor,

recapitulated the results obtained with ERK5 inhibitor in IL-4 induced M2 polarization,

confirming the involvement of MEK5/ERK5 axis in M2 responses. Additionally, we observed

that STAT6-KO macrophage had lower capacity to polarize for M2 phenotype. Interestingly,

ERK5 inhibition did not affect the phosphorylation levels of STAT6, neither gene expression

of Cebpb, suggesting that EKR5 signling pathway regulates M2-associated genes possibly in

parallel or downstream of the STAT6 and C/EBPβ pathway. Overall, this finding reveals a

central role of MEK5/ERK5 pathway in the IL-4-induced M2 macrophage polarization.

Key words: Macrophages, polarization, M2, IL-4, ERK5.

IV

Lista de Abreviaturas

V

LISTA DE ABREVIATURAS

°C – graus Celsius

µg – micrograma

μL – microlitro

BMDM – macrófagos derivados da medula óssea

bp – pares de base

BSA – Albumina derivada de soro bovino

CCR – receptor de quimiocinas CC

CD – “Cluster of differentiation”

cm – centímetros

DNA – ácido desoxirribonucleico

EDTA – ácido etilenodiamino tetracético

ELISA – “Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay”

FITC – Isotiocianato de fluoresceína

g – grama

g – unidade de medida de força centrífuga relativa

h – horas

H2O2 – Água oxigenada

HEPES – 2-4-(2-hidroxietil)-piperazinil-(1) ácido etanosulfônico

IFN-γ – Interferon gama

Ig – Imunoglobulina

IL – Interleucina

kb – kilobase

kg – kilograma

L – litro

M – molar

mg – miligrama

min – minuto

mL – mililitro

mM – milimolar

mRNA – ácido ribonucléico mensageiro

nm – nanometro

VI

PBS – tampão fosfato salina

PE – Ficoeritrina

pg – picograma

RNA – ácido ribonucléico

rpm – rotações por minuto

s – segundos

SBF Soro bovino fetal

SDS – dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE – eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS

TGF-β – Fator de crescimento e transformação β

TNF – Fator de necrose tumoral

Tregs – células T reguladoras

Tris – tris(hidroximetil)aminoglicano

V – volts

WT – animais selvagens (Wild-type) C57BL/6 ou BALB/c

VII

Lista de Figuras

VIII

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Interleucina-4 e lipopolissacarídeo induzem fosforilação de ERK5 durante a polarização de

macrófagos. ........................................................................................................................................... 31

Figura 2: Figura 2A via de sinalização de ERK5 participa do processo de polarização de macrófagos.

............................................................................................................................................................... 32

Figura 3: Expressão de marcadores M2 em macrófagos após estimulação com interleucina-4. .......... 34

Figura 4: Expressão de Arginase-1 e produção de uréia por macrófagos M2 induzidos por IL-4. ....... 35

Figura 5: Expressão de Arginase-1 em macrófagos M2 induzidos por IL-4......................................... 36

Figura 6: A inibição de ERK5 reduz a produção de quimiocinas e fatores marcadores de fenótipo M2

de maneira concentração-dependente. ................................................................................................... 38

Figura 7: A sobrevivência e a viabilidade celular de BMDMs não foram alteradas pela inibição de

ERK5. .................................................................................................................................................... 39

Figura 8: A via de sinalização de ERK5 controla a produção de quimiocinas e fatores de fenótipo M2.

............................................................................................................................................................... 40

Figura 9: A expressão de marcadores M2 induzida por IL-4 envolve a ativação da via de sinalização

de ERK5. ............................................................................................................................................... 43

Figura 10: Expressão de Arginase-1 e produção de uréia induzida por IL-4 envolve a ativação da via

de sinalização de ERK5......................................................................................................................... 44

Figura 11: Expressão do receptor de manose (MR) é regulado negativamente pela ativação da via de

sinalização de ERK5. ............................................................................................................................ 45

Figura 12: A via de sinalização de MEK5 controla a produção de quimiocinas e fatores de fenótipo

M2. ........................................................................................................................................................ 47

Figura 13: A via de sinalização de MEK5/ERK5 a controla a expressão de marcadores de fenótipo

M2. ........................................................................................................................................................ 48

IX

Figura 14: Expressão de Arginase-1 e produção de uréia induzida por IL-4 envolve a ativação da via

de sinalização de MEK5/ERK5. ............................................................................................................ 49

Figura 15: A expressão de marcadores de fenótipo M2 induzida por IL-4 está prejudicada na ausência

de STAT6. ............................................................................................................................................. 52

Figura 16: IL-4 estimula a fosforilação de STAT6 em macrófagos independente de ERK5. ............... 53

Figura 17: IL-4 induz a expressão de C/EBPβ em macrófagos independente de ERK5. ..................... 54

X

Sumário

XI

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 2

1.1. Macrófagos .............................................................................................................................. 2

1.2. Polarização de Macrófagos ..................................................................................................... 3

1.2.1. Ativação clássica de macrófagos ..................................................................................... 4

1.2.2. Ativação alternativa de macrófagos ................................................................................ 5

1.3. Macrófagos M2a ..................................................................................................................... 7

1.3.1. Ativação dos receptores de IL-4 ...................................................................................... 7

1.3.2. Caracterização dos macrófagos M2a ............................................................................... 8

1.3.3. Respostas M2 em doenças inflamatórias ....................................................................... 10

1.4. Via de sinalização de MEK5/ERK5 ...................................................................................... 11

1.4.1. Proteínas MAPK ........................................................................................................... 11

1.4.2. Via de ERK5 ................................................................................................................. 11

1.4.3. Sinalização de ERK5 em macrófagos ........................................................................... 12

2. OBJETIVOS ................................................................................................................................. 15

3. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................................... 176

3.1. Animais de experimentação .................................................................................................. 17

3.2. Preparo das soluções e reagentes........................................................................................... 18

3.3. Cultura celular de macrófagos derivados da medula óssea ................................................... 21

3.4. Detecção de citocinas por ensaio imunoenzimático (ELISA) ............................................... 22

3.5. Extração de Proteínas ............................................................................................................ 23

3.6. Eletroforese e Western Blotting ............................................................................................ 23

3.7. Extração do RNA total .......................................................................................................... 24

3.8. Reações de transcrição reversa .............................................................................................. 25

3.9. PCR quantitativo em tempo real ........................................................................................... 25

3.10. Citometria de fluxo ............................................................................................................ 27

3.11. Determinação da concentração de uréia ............................................................................ 27

3.12. Imunofluorescência por Microscopia Confocal ................................................................ 28

3.13. Análise estatística .............................................................................................................. 28

4. RESULTADOS ............................................................................................................................. 29

4.1. Ativação de ERK5 durante a polarização de macrófagos ..................................................... 30

4.2. Caracterização da ativação alternativa de macrófagos induzida por IL-4 ............................. 33

4.3. A produção de quimiocinas e mediadores marcadores M2 necessita da ativação de ERK5 . 37

4.4. A expressão gênica de marcadores M2 depende da ativação de ERK5 ................................ 41

XII

4.5. Envolvimento da via de sinalização de MEK5 na expressão de marcadores M2 ...................... 46

4.6. A via de sinalização de ERK5 na polarização de macrófagos M2 não regula a ativação de

STAT6 nem a expressão de C/EBPβ ................................................................................................. 50

4. DISCUSSÃO ................................................................................................................................. 56

5. CONCLUSÃO ............................................................................................................................ 621

6. REFERÊNCIAS .......................................................................................................................... 643

1

Introdução

2

1. INTRODUÇÃO

1.1. Macrófagos

O sistema fagocitário mononuclear é um sistema orgânico com capacidade fagocitária,

que inclui todas as células derivadas de precursores monocíticos da medula óssea, tais como,

monócitos do sangue periférico, macrófagos teciduais e células dendríticas derivadas de

monócitos. Sobre certas condições, os monócitos do sangue podem migrar para os tecidos,

onde se diferenciam em macrófagos e células dendríticas, e participam de respostas

inflamatórias e infeciosas (Gordon e Taylor, 2005; Geissmann et al., 2010). Os macrófagos

estão presentes com distintos fenótipos em quase todos tecidos, incluindo células de

Langerhans na pele, células de Kuppfer no fígado, células da micróglia no cérebro,

osteoclasto nos ossos e macrófagos alveolares nos pulmões (Gordon e Taylor, 2005). Neste

sentido, os macrófagos são componentes essenciais da imunidade inata, atuando nas primeiras

barreiras de resistência contra patógenos, e também da imunidade adaptativa, onde auxiliam

na montagem de uma resposta mais forte e especifica após exposição secundaria a um mesmo

antígeno. Além disso, essas células apresentam uma notável plasticidade e diversidade que

permite alterar sua fisiologia e responder eficientemente a diferentes estímulos ambientais

(Mosser e Edwards, 2008; Biswas e Mantovani, 2010).

Em 1908, Ilya Metchnikoff e Paul Ehrlich receberam o prêmio Nobel de fisiologia

pela descoberta da função dos macrófagos, sendo as primeiras células descritas envolvidas

com defesa do hospedeiro. Metchnikoff propôs que os macrófagos influenciavam o

desenvolvimento do hospedeiro, assegurando a homeostase e protegendo-o de infecções,

através de um processo chamado de fagocitose (Nathan, 2008). Através de vários receptores

de superfície e intracelulares os macrófagos monitoraram e respondem à mudanças no seu

3

ambiente secretando uma série de mediadores inflamatórios. Receptores do tipo Toll,

receptores lectina do tipo C, tipo NOD e scavengers reconhecem produtos microbianos,

substâncias exógenas e células mortas, levando a fagocitose, ativação celular e a liberação de

citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento (Hajishengallis e Lambris, 2011).

Além de participar de respostas imunológicas, os macrófagos exercem um papel

fundamental na preservação da homeostase do organismo (Kawai e Akira, 2011) (Elinav et

al., 2011). Assim, uma das principais funções dos macrófagos é a limpeza de material extra-

celular no espaço intersticial, como células que entraram em apoptose ou debris celulares

formados durante o remodelamento tecidual. Esse processo ocorre diariamente na ausência de

outras células do sistema imune e resulta em baixa produção de mediadores inflamatórios e

baixa ativação celular (Kono e Rock, 2008). Por outro lado, a fagocitose de debris de células

necróticas, carregadas com sinais de dano endógenos, leva a uma profunda ativação dos

macrófagos e a produção de citocinas e mediadores pró-inflamatórios (Zhang e Mosser,

2008). Desta forma, as funções protetoras e patogênicas dos diferentes fenótipos de

macrófagos revelam uma incrível capacidade de alteração fisiológica em resposta a diferentes

estímulos ambientais.

1.2. Polarização de Macrófagos

Os macrófagos são capazes de responder rapidamente a uma ampla gama de estímulos

endógenos produzidos após uma lesão ou infecção. Esses primeiros estímulos, geralmente

produzidos por células da imunidade inata, exercem um acentuado e transiente efeito na

fisiologia dos macrófagos, enquanto que estímulos secundários, produzidos por células

antígeno-especificas, são mais direcionados e geram mudanças fenotípicas de longa de

duração (Gordon, 2007). Em publicações anteriores, os macrófagos eram classificados em

4

escala linear com a nomenclatura M1 para macrófagos classicamente ativados e a

nomenclatura M2 para macrófagos alternativamente ativados, para representar os dois

extremos das possíveis formas de ativação de macrófagos (Martinez et al., 2008). No entanto,

essa nomenclatura M2 incluía praticamente todos os outros tipos de ativação de macrófagos,

mesmo possuindo grandes diferenças bioquímicas e fisiológicas (Edwards et al., 2006).

Recentemente, Mosser e colaboradores (2008) sugeriram uma nova classificação baseada nas

três funções fundamentais dos macrófagos: defesa do hospedeiro, reparo tecidual e

imunorregulação.

1.2.1. Ativação clássica de macrófagos

Os macrófagos classicamente ativados, também chamados de macrófagos M1, são

uma população celular com alta capacidade microbicida e tumoricida, com eficiente

apresentação de antígeno e secretam grandes quantidades de citocinas e mediadores pró-

inflamatórios. Esses macrófagos M1 promovem respostas imunológicas de perfil Th1,

medeiam a resistência contra uma variedade de bactérias, protozoários, vírus, mas também

contribuem para a destruição tecidual (Liu et al., 2014). Certos produtos bacterianos como

Lipopolissacarídeos (LPS) e citocinas como interferon-γ (IFN-γ) estimulam a polarização de

macrófagos para fenótipo M1. Como resultado, induzem um forte fenótipo pró-inflamatório

com a produção de citocinas como TNF-α, IL-12 e IL-23, além de aumentar a produção de

intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio, a expressão de moléculas do MHC de classe

II e moléculas co-estimulatórias (Dale, Boxer e Liles, 2008); (Wynn, Chawla e Pollard, 2013).

Assim, os macrófagos classicamente ativados são gerados a partir de respostas imunes

celulares, sendo vital para a defesa do hospedeiro. Contudo, uma ativação exacerbada pode

levar ao dano tecidual, como ocorre em várias doenças inflamatórias crônicas e autoimunes,

5

incluindo a doença de Crohn, artrite reumatoide, hepatite autoimune e esclerose múltipla

(Murphy et al., 2003; Smith et al., 2009).

1.2.2. Ativação alternativa de macrófagos

A definição genérica de macrófagos M2 ou macrófagos alternativamente ativados é

baseada no compartilhamento de propriedades funcionais, como a alta expressão de receptor

de manose, IL-10 e fatores angiogênicos, baixa produção de IL-12 e em geral no seu

envolvimento em respostas do tipo II, na regulação imunológica e no remodelamento tecidual

(Mantovani et al., 2002; Mantovani et al., 2004). Baseado em trabalhos anteriores, foram

definidas duas formas de M2: macrófagos M2a, induzidos por IL-4 ou IL-13; e macrófagos

M2b e M2c. Os macrófagos M2b são induzidos por imunocomplexos e agonistas de receptor

tipo-Toll ou IL-1R, enquanto que os macrófagos M2c podem são induzidos por IL-10 e

hormônios glicocorticoides (Mosser e Edwards, 2008; Biswas e Mantovani, 2010).

A polarização de macrófagos M2a ocorre durante respostas imunológicas do tipo Th2,

principalmente na presença de IL-4 e/ou IL-13. Em geral, essas células participam de diversos

processos imunológicos, como na remoção de parasitas, redução da inflamação, promoção de

remodelamento tecidual, progressão tumoral e na regulação imunológica (Lawrence e Natoli,

2011). Macrófagos M2a apresentam maior atividade fagocítica, alta expressão de receptores

scavenger, de manose e galactose, produção de poliaminas e ornitina através da atividade da

arginase, baixa expressão de IL-12 e alta expressão de IL-10 e de quimiocinas CCL17,

CCL22 e CCL24, importantes para a indução de diferenciação de células Th2 e Treg

(Martinez et al., 2006; Gordon e Martinez, 2010). IL-4 promove reparo tecidual, estimulando

a atividade da arginase para a formação de precursores de poliaminas e colágeno, favorecendo

a produção de matriz extracelular (Kreider et al., 2007). Essas células podem também

6

contribuir na defesa do hospedeiro, auxiliando na remoção de helmintos e nematódeos através

do aumento da motilidade intestinal e da secreção do fluído luminal (Zhao et al., 2008).

Além disso, os macrófagos podem também ser polarizados em um fenótipo tipo-M2,

também chamados de macrófagos M2b ou M2c, os quais compartilham alguns, mas não todos

marcadores característicos de M2 (Shaul et al., 2010). Em geral, essas células estão

envolvidas com atividade anti-inflamatória, regulação imunológica, progressão tumoral e

transformação neoplásica e são induzidas por vários estímulos, como imunocomplexos de

anticorpos junto com LPS ou IL-1, IL-10, glicocorticoides, dando origem a fenótipos

funcionais tipo-M2 que compartilham propriedades com macrófagos ativados por IL-4 e IL-

13 (Mosser, 2003). O desenvolvimento de células T reguladoras, importante para a inibição

de respostas imunológicas e para frear processos inflamatórios, pode ser induzido direta ou

indiretamente por macrófagos M2b e M2c. A produção da citocina reguladora TGF-β por

macrófagos após eferocitose, fagocitose de células apoptóticas, na presença de estímulo pró-

inflamatório também contribui para a propriedade de regulação imunológica dessas células

(Fadok et al., 1998). A citocina imunossupressora IL-10 também é produzida altos níveis por

essa população de macrófagos, diminuindo a produção de IL-12 e outras citocinas pró-

inflamatórias, predispondo o hospedeiro a infecção (Gerber e Mosser, 2001). Certos

patógenos aprenderam a induzir esse subtipo de macrófago mimetizando alguns estímulos.

Como exemplo, o bacilo Anthracis promove aumento AMPc intracelular, ocasionando uma

reduzida atividade microbicida e consequente aumento da sobrevivência e disseminação de

microorganismos (Kim et al., 2008).

7

1.3. Macrófagos M2a

1.3.1. Ativação dos receptores de IL-4

O desenvolvimento de macrófagos alternativamente ativados do tipo M2a ocorre na

presença das citocinas IL-4 e IL-13, através da ativação da cadeia α comum do receptor da IL-

4. São conhecidos dois tipos de receptores de IL-4. O receptor tipo I é composto pela cadeia

IL-4Rα, e pela cadeia IL-2Rγ e é expresso principalmente em células derivadas da medula

óssea, sendo ativado somente pela ligação de IL-4. Por outro lado, o receptor tipo II é

composto pela cadeia IL-4Rα e pela cadeira IL-13Rα1 e é expresso por células não

hematopoiéticas e pode ser ativado tanto por IL-4 quanto por IL-13 (Zurawski et al., 1993)

(Gordon e Martinez, 2010).

A sinalização de IL-4 através do receptor de IL-4 tipo I, induz fosforilação de IRS-2

de forma muito mais potente que IL-13. Em termos de funcionalidade, a sinalização de IL-4

via receptor tipo I resulta em uma maior indução da expressão gênica de marcadores de

ativação alternativa de macrófagos como Arginase 1 (Stein et al., 1992)(Stein et al.,

1992)(Stein et al., 1992), moléculas tipo-quitinase (Ym1/2 e AMCase) e moléculas tipo-

resistina (RELM) α/FIZZ1, em comparação ao receptor de IL-4 tipo II (Heller et al., 2008).

Basicamente, a cadeia IL-4Rα se associa com JAK1 enquanto IL-2Rγ se associa

exclusivamente com JAK3. A quinase JAK3 é ativada por IL-4 através do receptor tipo I por

associação e heterodimerização de receptores que levam a fosforilação nos resíduos de

tirosina no domínio citoplasmático do IL-4Rα (Nelms et al., 1999). A JAK3 está

constitutivamente associada com a cadeia IL-4Rα e é a única JAK envolvida com a ativação

do receptor de IL-4 tipo I (Kelly-Welch et al., 2003). Além disso, JAK3 seletivamente ativa

IRS-2 (Blaeser et al., 2003), e através da fosforilação preferencial de tirosinas que servem

8

como sítios de acoplamento para o recrutamento e interação com Grb-2 e PI3K (Sun et al.,

1995), facilita a integração com a via de sinalização do transdutor de sinal e ativador de

transcrição 6 (STAT6), fator de transcrição crucial para a regulação gênica de marcadores de

ativação alternativa de macrófagos (Heller et al., 2008). As vias de sinalização em comum

compartilhada por IL-4 e IL-13 envolvem a fosforilação e translocação de STAT6 para o

núcleo, onde regula a transcrição de uma série de genes marcadores M2 (Gordon e Martinez,

2010).

1.3.2. Caracterização dos macrófagos M2a

A ativação alternativa de macrófagos induzida IL-4 foi documentada por Stein e

colegas em 1992 (Stein et al., 1992). Além da IL-4, outras citocinas de padrão Th2 como IL-

13, e também IL-33 potencializar a polarização de macrófagos alternativamente ativados

(M2a) que são classificados pela expressão de um painel de genes marcadores M2 (Raes et

al., 2002; Gordon, 2003). Esse tipo de polarização de macrófagos contrasta com a ativação

clássica induzida por IFN-γ em ambientes de resposta imunes Th1. Em geral, citocinas de

padrão Th2 são produzidas por basófilos, eosinófilos, células inatas, mastócitos, macrófagos e

outras células. Além disso, células Th2 e células B ativadas, células tumorais e epiteliais são

importantes fontes da produção dessas citocinas nos tecidos (Moro et al., 2010; Neill et al.,

2010). Uma variedade de processos fisiológicos e patológicos, incluindo homeostase,

inflamação, funções metabólicas, câncer e reparo tecidual têm sido relacionados com

macrófagos M2a. Além de seu papel na imunidade, essas células também participam na

hipersensibilidade, infecções parasitárias, fibrose e alergia (Gordon e Martinez, 2010). Ao se

tratar de receptores caracteristicos de M2, citocinas IL-4 e IL-13 desempenham o papel em

aumentar a expressão do receptor de manose (MR) e moléculas do MHC de classe II,

9

estimulando a fagocitose e a apresentação de antígeno, e induzem a produção de quimiocinas

de padrão M2a – (MDC; também conhecida como CCL22), TARC (CCL17) e o fator de

crescimento semelhante à insulina (IGF-1). As quimiocinas CCL17 e CCL22, ambas ligantes

do receptor CCR4, são fortes quimioatraentes de células Th2 e monócitos, e outras células

que expressam CCR4, como as células T reguladoras (Mantovani et al., 2002; Wirnsberger et

al., 2006). Uma outra citocina produzida por macrófagos M2a é IGF-1, um fator de

crescimento indutor de proliferação e diferenciação que desempenha um papel crucial na

regeneração tecidual em lesões renais, pulmonares e musculares. (Lu et al., 2011).

Uma assinatura de marcadores gênicos de macrófagos murinos tratados com IL-4,

Arg1, Ym1, Fizz1 e Mrc1, têm sido utilizada para estabelecer a ativação alternativa de

macrófagos. Arginase-1 é uma enzima intracelular expressa durante a ativação alternativa,

principalmente por IL-4 e IL-13, mas também por outras vias de sinalização. Através da

atividade da arginase a arginina é convertida em ornitina e uréia, formando poliaminas e

prolina, um importante precursor de colágeno (Munder, Eichmann e Modolell, 1998; Pesce et

al., 2009). FIZZ1 (também conhecido como RELMα ou Retnla) e Ym1 são induzidos

fortemente na ativação alternativa de macrófagos in vivo e in vitro (Sanson, Distel e Fisher,

2013). FIZZ1 é uma proteína secretada tipo-resistina produzida por macrófagos, eosinófilos e

no epitélio alveolar durante inflamação alérgica pulmonar e asma (Nair et al., 2009). Estudos

anteriores identificaram efeitos contraditórios de RELMα na regulação da inflamação,

podendo promover a inflamação pulmonar, mas também regulando negativamente inflamação

mediada por citocinas Th2 no pulmão (Nair et al., 2009). Ym1 é uma lectina secretória tipo-

quitinase que forma cristais nos espaços alveolares e em macrófagos e células gigantes

hiperreativas do pulmão fortemente induzidas por estímulos de células Th2. Essas moléculas

ligam-se a quitina de insetos, nematódeos e ovos de helmintos, forte indutor de respostas Th2

(Reese et al., 2007). O receptor de manose (MR, ou também chamado de CD206) é um

10

importante receptor fagocítico que aumenta a ingestão de microorganismos com resíduos de

manose na superfície. No entanto pode também contribuir para infecção. Embora seja

expresso principalmente em macrófagos M2a, o receptor de manose pode também ser

expresso por outros subtipos de macrófagos (Gordon e Martinez, 2010; Murray e Wynn,

2011).

1.3.3. Respostas M2 em doenças inflamatórias

Para controlar a resposta inflamatória excessiva, os macrófagos podem sofrer apoptose

ou polarizar para o fenótipo M2 para proteger o hospedeiro de lesões exarcebadas e facilitar a

regeneração tecidual. Os macrófagos M2a induzidos por IL-4/IL-13 são importantes

reparadores teciduais, os quais expressam altos níveis de arginase, alguns componentes de

matriz extracelular e TGF-β, um potente ativador da produção de colágeno e aumento da

proliferação de fibroblastos. Após a exposição a algum agente tóxico ou estresse mecânico, os

macrófagos podem ser gerados facilitando a recuperação de tecidos, inibidindo citocinas pró-

inflamatórias e formando matriz extracelular. Uma série de fatores como TGF-β, EGF e

VEGF são produzidos por macrófagos M2a para promover angiogênese, regeneração tecidual

e reparo. Entretanto, a liberação desses mediadores deve ser finamente regulada, pois a

produção excessiva pode levar ao desenvolvimento de patologias como fibrose e tumor

(Murray e Wynn, 2011; Novak e Koh, 2013).

O perfil de citocinas Th2 na asma, uma doença pulmonar crônica, contribui para o

aparecimento de macrófagos M2, que com seus fatores pró-alergicos contribuem para as

respostas inflamatórias e na remodelação das vias aéreas. Macrófagos alveolares de pacientes

asmáticos produzem altos níveis de IL-13 (Prieto et al., 2000) assim como em camundongos

asmáticos induzidos com Aspergillus fumigatus expressam altos níveis de marcadores M2

11

como FIZZ1 e Ym1, que quando ativadas em excesso essas células podem causar aumento do

recrutamento celular, secreção de muco e hiperresponsividade das vias aéreas (Moreira e

Hogaboam, 2011).

1.4. Via de sinalização de MEK5/ERK5

1.4.1. Proteínas MAPK

A cascata de proteínas quinases ativadas por mitogenos (MAPKs) constituem uma

complexa rede de vias de sinalização altamente conservada envolvidas em varias funções

celulares, incluindo proliferação celular, diferenciação e migração. Estímulos extracelulares

como fatores de crescimento e uma série de estresses induzem ativação sequencial de MAPK

quinase quinase (MAPKKK), MAPK quinase (MAPKK) e MAPK (Chang e Karin, 2001).

Pelo menos quatro membros da família das MAPK já foram identificados: quinase regulada

por sinal extracelular 1/2 (ERK1/2), quinase c-Jun N-terminal (JNK), p38 e ERK5, a mais

nova MAPK descrita. Os ativadores de MAPK incluem MEK1 e MEK2 para ERK1/2, MEK5

para ERK5, MKK4 e MKK7 para JNK, e MKK3 e MKK6 para a MAPKs p38 (Robinson e

Cobb, 1997; Chen et al., 2001).

1.4.2. Via de ERK5

A via MEK5/ERK5 é ativada por uma variedade de estímulos incluindo estresse

oxidativo e osmótico, fatores de crescimento, ativação de receptores tirosina quinases, entre

outros. ERK5, também conhecida como grande MAPK (MAPK-1, BMK1 ou MAPK7) é uma

molécula de 98 kDa, quase duas vezes maior que as outras MAPK, que compartilha uma alta

12

homologia com ERK1/2 (Lee, Ulevitch e Han, 1995; Zhou, Bao e Dixon, 1995). A molécula

ERK5 desempenha um papel importante na regulação numa série de funções celulares, como

sobrevivência, proliferação e diferenciação celular. Assim como outros membros da família

das MAPKs, ERK5 contem dois sítios de fosforilação em resídios de treonina (T) e tirosina

(Y) dentro de um motivo T-X-Y que são críticos para a ativação e um domínio conservado

serina/treonina quinase (Widmann et al., 1999). A molécula ERK5 também contem um

domínio de oligomerização, um sinal de localização nuclear e uma região rica em prolina

(Yan et al., 2001). MEKK2 e MEKK3, mas não MEKK1, membros da família das

MAPKKK, são capazes de ativar MEK5, uma MAPKK especifica para ERK5, em resposta ao

uma série de estímulos diferentes (Nakamura e Johnson, 2003). Após a ativação por MEK5,

ERK5 transloca para o núcleo e fosforila um número de proteínas a jusante, incluindo

MEF2C, c-Fos, Sap1, c-Myc e NF-κB (Nishimoto e Nishida, 2006; Wang e Tournier, 2006).

Compreender os mecanismos de regulação e função da via de sinalização de ERK5 fornecem

informações importantes para o estudo de uma variedade de desordens patológicas, incluindo

doenças cardiovasculares e câncer.

1.4.3. Sinalização de ERK5 em macrófagos

Estudos recentes mostram que a ativação da via de sinalização de MEK5/ERK5 pode

ser essencial para direcionar os macrófagos para fenótipo mais anti-inflamatório ou

imunorregulador. A proliferação e sobrevivência de macrófagos induzida por M-CSF são

dependentes da ativação de ERK5, que rapidamente transloca do citosol para o núcleo, onde

aumenta a expressão de c-Jun e reduz p27, afetando o controle do crescimento celular (Rovida

et al., 2008). Além disso, a fagocitose de células apoptóticas (eferocitose) por macrófagos

induz a expressão de ARG II através da ativação da sinalização de ERK5/CREB, competindo

13

com iNOS pela L-arginina, reduzindo a produção de óxido nítrico (Barra et al., 2011).

Adicionalmente, ERK5 participa também do aumento da eferocitose de células apoptóticas

induzida por estatinas, drogas com ação preventiva em doenças cardiovasculares. De fato, a

deleção de ERK5 em macrófagos de camundongos suscetíveis ao desenvolvimento de

aterosclerose resultou no aumento da expressão de genes associados a polarização de

macrófagos M1 e numa acelerada formação de placas ateroscleróticas (Heo et al., 2014).

(Kozicky et al., 2015). Embora já tenha sido descrito a participação de ERK5 na ativação e

diferenciação de macrófagos, nenhum trabalho até o presente momento havia demonstrado o

envolvimento da via de sinalização de ERK5 na polarização de macrófagos M2 induzida por

IL-4.

14

Objetivos

15

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral:

Investigar a participação da via de sinalização de ERK5 na polarização de macrófagos


2.2. Objetivos Específicos:

Avaliar a ativação da via de sinalização de ERK5 em macrófagos estimulados com

IL-4 e LPS

Avaliar se a inibição de ERK5 afeta a expressão de marcadores M2a induzida por IL-

4 em macrófagos

Avaliar se a inibição de MEK5 afeta a expressão de marcadores M2a induzida por IL-

4 em macrófagos

Avaliar o envolvimento da via ERK5 na ativação da via de STAT6 induzida por IL-4

16

Materiais e métodos

17

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Animais de experimentação

No presente estudo foram utilizados camundongos isogênicos da linhagem C57BL/6

(wild type, WT) e BALB/c (wild type, WT), machos, com 6 a 8 semanas de idade. Esses

camundongos foram fornecidos pelo Serviço de Biotério da Prefeitura do Campus da USP-

RP. Foram utilizados camundongos machos, de 6 a 8 semanas de idade, deficientes para

STAT6 (STAT6-/-

) (linhagem Balb/c) adquiridos da Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e

gentilmente cedidos pelo Prof. João Santana da Silva (Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto, USP). Além disso, também utilizamos camundongos transgênicos machos YARG

(Arg1-YFP) (linhagem C57BL/6), de 6 a 8 semanas de idade, nos quais a proteína

fluorescente YFP é expressa sob o controle do promotor para o marcador de M2, Arg1. Esses

animais também foram adquiridos da Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e gentilmente

cedidos pelo Prof. Niels Olsen Câmara (Instituto de Ciências Biomédicas, USP). Os

camundongos deficientes e transgênicos foram criados e fornecidos pelo Centro de Criação de

Camundongos Especiais do Departamento de Genética da FMRP-USP. Todos os animais para

experimentação foram mantidos no biotério do Departamento de Farmacologia da FMRP-

USP, sob condições de temperatura (23-25 ºC) e o ciclo claro/escuro controlados, com livre

acesso à água e ração. Todos os procedimentos experimentais envolvendo animais estão de

acordo com os Princípios Éticos de Experimentação Animal, adotado pelo Colégio Brasileiro

de Experimentação Animal (COBEA), e foram aprovados pela Comissão de Ética em

Experimentação Animal (CETEA) do hospital das Clínicas e da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto – USP.

18

3.2. Preparo das soluções e reagentes

Solução de Ketamina e Xilazina:

Cetamina 10% (Agener União) ................................................................................1,25 mg/mL

Xylazina 2% (Agener União) .....................................................................................0,5 mg/mL

Salina 0.9 % q.s.p ............................................................................................................100 mL

A solução estocada a 4 ºC.

Solução de Tampão Salina-fosfato (PBS) 10X (Solução Mãe):

Cloreto de Sódio (NaCl, Merck) ...........................................................................................80 g

Cloreto de Potássio (KCl, Merck)............................................................................................2 g

Fosfato de Sódio dibásico (Na2HPO4, Merck)....................................................................11,5 g

Fosfato de Potássio monobásico (KH2PO4, Merck)...............................................................20 g

Água deionizada Milli-Q q.s.p. .....................................................................................1000 mL

A solução estocada a 4 ºC.

PBS 1X:

PBS10X ...........................................................................................................................100 mL

Água Milli-Q q.s.p. ..........................................................................................................900 mL

O pH ajustado para 7.2, filtrada e estocada à 4 °C.

PBS/EDTA (1mM):

PBS 1X q.s.p. ...................................................................................................................100 mL

Etilenodiaminotetracético (EDTA, Merck) ....................................................................37,2 mg

O pH ajustado para pH 7.2, filtrada e estocada a 4 °C.

19

Meio RPMI incompleto:

Hepes (C8H18N2O4S, Sigma) ..............................................................................................2,38 g

RPMI 1640 (Sigma) – 1 frasco ..........................................................................................10,4 g

Bicarbonato de sódio (NaHCO3, Vetec) ........................................................................... 2,20 g

Água de Milli-Q q.s.p.....................................................................................................1000 mL


Meio RPMI completo:

Soro Bovino Fetal inativado (SBF-I, Difco) .....................................................................10 mL

Estreptomicina (10mg/mL)/penicilina (10 unidades) (antibiótico, Sigma) .........................1 mL

Fungizona (antifúngico, Sigma) .......................................................................................120 µL

L--Gultamina (200mM, Sigma) ........................................................................................1,3 mL

Gentamicina (Sigma) ........................................................................................................100 µL

RPMI incompleto q.s.p. ...................................................................................................100 mL

A solução foi preparada no dia do uso.

Tampão de citometria de fluxo (Tampão de FACS):

Soro Bovino Fetal inativado (SBF-I, Difco) 2% .................................................................2 mL

PBS 1X q.s.p. ...................................................................................................................100 mL

A solução foi preparada no dia do uso e utilizada gelada.

Tampão de bloqueio (ELISA)

Albumina derivada de soro bovino (BSA, Sigma) 1 % ..........................................................1 g

PBS 1X q.s.p. ...................................................................................................................100 mL


20

Tampão de lavagem (ELISA)

Teewn 20 (Sigma) 0,05 % ...................................................................................................1 mL

PBS 1X q.s.p. .................................................................................................................2000 mL


Tampão de lise:

Cloreto de amônio (NH4Cl, Merck) ...................................................................................4,01 g

EDTA (Labsynth) ..............................................................................................................0,18 g

Bicarbonato de sódio (NaHCO3, Vetec) ............................................................................0,42 g

Água de Milli-Q q.s.p. .....................................................................................................500 mL


21

3.3. Cultura celular de macrófagos derivados da medula óssea

Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) foram obtidos como descrito

previamente por Kurowska (2009). As células foram isoladas da medula óssea do fêmur e

cultivadas em meio RPMI (Sigma) contendo 10% de SFB (v/v) e 20% (v/v) do sobrenadante

de cultura de células L929, rico em fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF). As

culturas de macrófagos foram realizadas em placa de petri especificas para a cultura (BD

OPTILUX) por 6 a 8 dias na estufa a 37ºC e 5% CO2. Após 8 dias de cultura, os macrófagos

foram removidos com auxilio de suporte plástico, contados e ajustados para a densidade

celular requerida para o experimento. Como controle, os macrófagos para controle foram

cultivados em meio RPMI completo para manter estado de M0. Por outro lado, para a

polarização de M2, os macrófagos foram incubados com IL-4 (10 ou 30 ng/mL; R&D), e em

alguns experimentos, utilizamos LPS (100 ng/mL; Sigma) e IFN-γ (200 ng/mL; R&D) para

polarização de M1. Após a incubação com os diferentes estímulos polarizantes, a

diferenciação das células foi confirmada por citometria de fluxo.

Inicialmente, os macrófagos foram plaqueados em placas Costar (Sigma) de 96 poços

(3 x 105 células/poço) ou 12 poços (3 x 10

6 células/poço)em meio RPMI-completo. Após 2

horas de descanso, os macrófagos foram pré-tratados com os inibidores por 1 hora antes da

adição dos estímulos. Todos os inibidores foram preparados em meio RPMI completo onde a

droga XMD 8-92 (10 µM; Tocris) foi utilizada para inibir a ativação da ERK5; a droga BIX

02189 (10 µM; Tocris) para inibir MEK5, e para inibir MEK1/2, foi utilizado a droga

PD98059 (10 µM; Cell Signalling). Como controle as células foram pré-tratadas com DMSO

em concentração máxima de 0,05%, uma vez que o DMSO foi o diluente das drogas. Após o

pré-tratamento as células foram estimuladas com IL-4 ou LPS + IFN-γ por 24 ou 48 horas.

22

3.4. Detecção de citocinas por ensaio imunoenzimático (ELISA)

As quantificações de CCL17, CCL22 e IGF-1 murinos no sobrenadante de cultura de

macrófagos (3 x 105 células/poço) foram realizadas com material coletado 48 horas após a

polarização de macrófagos. A determinação dos níveis destas citocinas foi realizada por

método imunoenzimático (ELISA) utilizandos kits DuoSet ELISA Development Systems

(R&D Systems) de acordo com as informações do fabricante. Resumidamente, as placas de

microtitulação (96 poços) foram recobertas com 50 µL/ poço do anticorpo específico anti-

CCL17, anti-CCL22 e anti-IGF-1 na concentração descrita pelo fabricante. Esses anticorpos

foram diluídos em PBS pH 7.4 e incubados overnight a 4 ºC. As placas foram lavadas por

quatro vezes com PBS/Tween-20 (0,05 % Sigma). As ligações não-especificas foram

bloquedas com 100 µL de PBS contendo BSA 1% durante 1 hora a 37 ºC. A curva padrão

iniciou-se com concentrações conhecidas de CCL17 (8000 pg/mL), CCL22 (1000 pg/mL),

IGF-1 (4000 pg/mL) foram colocadas nas placas (50 µL) e incubados overnight 4 ºC. Após

esse período, as placas foram lavadas com PBS/T e 50 µL dos anticorpos biotinilados

específicos para cada citocina foram adicionados nas concentrações descritas pelo fabricante.

Após uma hora, as placas foram lavadas com PBS/T e o conjugado estreptavidina-peroxidase,

na diluição de 1:200 foi adicionado a cada poço e incubadas por 45 min. Novamente as placas

foram lavadas com PBS/T e foi adicionado o substrato TMB (KPL, USA). A densidade ótica

foi medida a 630 nm no espectrofotômetro SpectraMAX 190 Microplate Reader (Molecular

Devices) e os dados foram analisados usando o software SoftMax Pro 5. A concentração de

citocinas contidas nas amostras foi calculada a partir de uma curva padrão com 10 pontos

obtidos por diluição seriada. O resultados foram expressoss em pg/mL.

23

3.5. Extração de Proteínas

Para avaliar a expressão de arginase I, macrófagos foram cultivados em meio RPMI

com 10% de SFB em placa de 6 poços (3x106/mL) e submetidos aos tratamentos com IL-4

(10 ng/mL) ou LPS (1 µg/mL) + IFN-γ (200 ng/mL) por 48 horas. Para avaliar a ativação de

ERK5, macrófagos foram cultivados em meio RPMI com 10% de SFB em tubos eppendorf de

2 mL (2,5 x 106 células/tubo) e submetidos aos tratamentos com IL-4 (30 ng/mL) ou LPS

(300 ng/mL) por 5, 15, 30 e 60 minutos. Após este período, o sobrenadante foi coletado e

separado para posterior dosagem de citocinas, e as células foram coletadas com PBS1x

gelado, centrifugadas e seguidas por lise em tampão RIPA (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NP-40

1%, desoxicolato de sódio 0,25%, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM pH 7,4) contendo os

inibidores de protease (Roche) e fosfatase (Calbiochem) sob leve agitação por 10 min a 4º C.

Uma alíquota do lisado foi separada para dosagem de proteínas pelo método colorimerico

Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL USA).

3.6. Eletroforese e Western Blotting

As amostras proteicas, correspondentes a 30 ou 50 ug de proteínas foram incubadas

com tampão de amostras na proporção de 1:2, a 95°C por 10 minutos, condição desnaturante.

Posteriormente, as amostras foram aplicadas em gel de poliacrilamida de 10-8% dependendo

da proteína a ser investigada na presença de SDS (SDS-PAGE) para separação por

eletroforese (Mini-Protean II Eletrophoresis Cell, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA)

As proteínas separadas foram transferidas para membrana de nitrocelulose 0.2µm (Amersham

Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK), utilizando o sistema de transferência Trans Blot

Turbo (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, USA). Após transferência as membranas foram

24

lavadas em água deionizada e o bloqueio dos sítios antigênicos inespecíficos foi realizado

pela incubação das membranas com TBST (Tris-HCl 100 mM pH 7,5, NaCl 150 mM,

Tween20 0,05%) com 5% de leite em pó desnatado ou BSA 5% por 2 h. Após o bloqueio, as

membranas foram lavadas três vezes com TBST, por 5 minutos. Em seguida foram incubadas

com anticorpos primários por 18-24 h sob leve agitação a 4º C. Para a caracterização dos

macrófagos foram utilizados anticorpos primários contra ARG1 (AF5868; R&D), iNOS

(N7782; Sigma), β-actin (A1978; Sigma), p-Erk5 (#3371; CellSignaling). Anticorpos

secundários apropriados conjugados a HRP foram adicionados e incubados de 1-2 h

atemperatura ambiente. Após esta incubação as membranas foram novamente lavadas com

TBST por 5 minutos. Para revelar as membranas, foi utilizado substrato Luminata (Millipore)

para a detecção por quimioluminescência utilizando o equipamento ChemiDoc™ XRS com o

software ImageLab 3.0 (Bio-Rad). Como controle de carregamento proteico foi utilizado a β-

actina.

3.7. Extração do RNA total

Para analisar a expressão gênica, o RNA total dos macrófagos (5 x 105 células/poço)

derivados da medula óssea de murinos foi extraído usando utilizando o RNeasy Mini Kit 250

(Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, 200 μl de clorofórmio

(Gibco BRL) foram adicionados à suspensão, a qual foi centrifugada a 13000 g, por 15

minutos, a 4 °C. A fase aquosa formada foi transferida para um novo tubo, no qual foram

adicionados isopropanol na proporção de 3:1 e, após agitação em Vortex, a mistura foi

incubada overnight a -20 °C para precipitação do RNA contido na fase aquosa. Após

incubação e centrifugação a 12000 g durante 15 minutos a 4 °C, o sobrenadante foi

descartado. O precipitado foi ressuspenso em etanol 75%, e centrifugado a 7500 g por 5

25

minutos a 4 °C. O sobrenadante foi novamente descartado e o precipitado ressuspenso em

água livre de RNAse. A concentração de RNA foi determinada pela densidade ótica no

comprimento de onda de 260 nm, por meio do aparelho Nanovue (GE). As amostras foram

armazenadas no -70 °C. O RNA total foi utilizado para as reações de transcrição reversa. Para

garantir a ausência de DNA genômico, as amostras foram tratadas com DNAsel (Invitrogen)

seguindo as indicações do fabricante.

3.8. Reações de transcrição reversa

As reações de transcrição reversa foram realizadas com 1 μg de RNA total, 1 μl de

oligo (dT) e 1 μl de DNTP mix 10 nM, em um volume de 12 μl, através da utilização do kit

High-Capacityc DNA Reverse Transcription (Applied Biosystems) de acordo com as

instruções fornecidas pelo fabricante e protocolo estabelecido no nosso laboratório. As

amostras permaneceram a 65 °C durante 5 minutos e, depois, foram colocadas imediatamente

no gelo. Posteriormente, adicionou 4 μl de Buffer 5x firststrand, 2 μl de dTT e 1 μl de

RNAsin, seguida da incubação por 2 minutos a 42 °C. Após esta incubação, foi adicionado 1

μl de enzima Superscript II RNase H Reverse Transcriptase (Invitrogen Corporation,

Carlsbad, CA, USA) em volume final de 20 μl. Esta reação permaneceu a 42 °C por 50

minutos, e depois a 70 °C por 15 minutos.

3.9. PCR quantitativo em tempo real

O PCR quantitativo em tempo real foi realizado usando kit TaqMan

(AppliedBiosystems) ou kit SYBR Green (Life Technologies) e o sistema Viia7 Real-Time

26

PCR (Life Technologies). O protocolo de ciclagem térmica foi: 1 x 95 ºC durante 1 minuto

(Holdingstage); 40x: desnaturação a 95 ºC, 15 segundos e anelamento 60 ºC, 1 minuto

(Cyclingstage); obtenção da curva de melting (Melting curve stage). A curva foi obtida após

três passos, sendo o primeiro a 95 ºC, 15 segundos; o segundo a 60 ºC, 1 minuto e o terceiro a

95 ºC, 15 segundos; para verificar se apenas um produto foi amplificado. Amostras que

obtiveram mais de um pico foram excluídas. Os resultados foram analisados através do

método comparative cyclethreshold (CT). Para realizar os qPCRs foram usados

primersTaqman (AppliedBiosystems) para Arg1 (Mm00475988_m1),Mrc1

(Mm00485148_m1), Cebpb (Mm00843434_s1), Gapdh (Mm99999915_g1), Retlna

(Mm00445109_m1) e pares de primersSYBR Green (Life Technologies) mostrados na tabela.

Tabela – Primers utilizados nas reações de qPCR e seus respectivas sequências sense e anti-

sense:

Todos dados foram normalizados em relação aos valores de Gapdh, e a quantificação das

diferenças entre os grupos foi calculada de acordo com as instruções do fabricante. A

expressão gênica foi apresentada baseada na quantidade de vezes que aumentou em relação

aos macrófagos não-estimulados. A expressão de GAPDH foi utilizada como controle interno

para cada reação de PCR.

Primers Sense Anti-sense

Ym1 5´-CATGAGCAAGACTTGCGTGAC-3´ 5´-GGTCCAAACTTCCATCCTCCA-3´

Gapdh 5´-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3´ 5´-CCTTCCACAATGCCAAAGTT-3´

27

3.10. Citometria de fluxo

Macrófagos de animais WT e YARG (3 × 106 células/poço) da linhagem C57BL/6

foram plaqueados em placas de 6 poços e estimulados com RPMI-C ou IL-4 (10 ng/mL) por

48 horas. Para avaliar a fosforilação de STAT6 induzida por IL-4, macrófagos de animais WT

(1,2 x 106 células/tubo) foram colocados em tubos FACS e estimulados com RPMI-C ou IL-4

(30 ng/mL) por 15 e 60 minutos. Após esse estímulo, os macrófagos foram lavados uma vez

com PBS pH 7,4 gelado e coletados para marcação celular. As suspensões celulares foram

marcadas com a combinação dos seguintes anticorpos: anti-F4/80 conjugado à APC

(eBioscience; San Diego, CA), anti-F4/80 conjugado à FITC (eBioscience; San Diego, CA),

anti-CD206 (MMR) conjugado à APC (Biolegend;San Diego, CA), anti-p-STAT6(pY641)

conjugado à AlexaFluor647 (BD Biosciences, San Jose, CA), anti-CD11b conjugado à FITC

(BD Biosciences, San Jose, CA). As células foram fixadas em formalina 2% e analisadas

usando o citometro BD FACSVerse™ (BD Bioscience) e o software FCS Express V3 (De

Novo Sotware; Glendale, CA). Os resultados foram expressos como intensidade média de

fluorescência (quantitativo) ou porcentagem (qualitativo) de expressão de marcadores de

macrófagos.

3.11. Determinação da concentração de uréia

A formação de uréia foi dosada dos sobrenadantes das culturas de macrófagos após 24

ou 48 horas na presença ou não de IL-4. A quantificação foi conduzida utilizando o ensaio

colorimétrico enzimático Uréia CE LABTEST Diagnóstica conforme recomendação do

fabricante. As absorbâncias foram determinadas em leitor de ELISA (Espectra Max-250,

Molecular Devices), no comprimento de onda de 600 nm e os valores expressos em mg/dL.

28

3.12. Imunofluorescência por Microscopia Confocal

A fim de verificar a polarização de macrófagos para o perfil M2 com a Incubação com

IL-4, tais células, ou seja, macrófagos de camundongos YARG (5 × 105 células/poço) foram

plaqueadas em poços contendo lamínulas (13mm) e incubados com IL-4 (30 ng/mL). Meio

RPMI-C foi utilizado como controle. Após 48h de estimulação, os sobrenadantes da cultura

foram removidos e a expressão de arginase I foi avaliada por imunofluorescência como

descrita a seguir. Depois do tempo de estímulo, as células foram lavadas duas vezes com PBS,

fixadas por 15 minutos com PBS contendo 2% de paraformaldeído, A marcação do núcleo

celular foi realizada usando 4’,6-diamidino-2- phenylindole, 2 HCl (DAPI; Calbiochem)

durante 15 minutos. Após a marcação, as lâminas foram montadas usando Acqua Poly/Mount

(Polysciences) e examinadas por microscopia confocal a laser Leica DMI6000B (Wetzlar,

Alemanha). Imagens individuais foram obtidas objetivas de 20X e 40X.

3.13. Análise estatística

Os dados foram apresentados como média ± DP de três experimentos independentes.

A significância estatística foi estimada por teste t de Student não-pareado para comparação

entre dois grupos. Para comparação entre três ou mais grupos foi usado ANOVA de uma via,

seguido pelo pós-teste de Bonferroni. O teste ANOVA de duas vias seguido pelo pós-teste de

Bonferroni foi utilizado para avaliar análises agrupadas. Diferenças com p<0,05 foram

consideradas significativas. Todas analises estatísticas foram conduzidas usando

GraphPadPrism 5.0 (GraphPad Software).

29

Resultados

30

4. RESULTADOS

4.1. Ativação de ERK5 durante a polarização de macrófagos

O envolvimento da participação da via de sinalização de ERK5 já foi descrito em

vários processos biológicos em macrófagos, como sobrevivência, proliferação e ativação

celular (Zhu et al., 2000; Rovida et al., 2008). Para avaliar o papel de ERK5 na ativação de

clássica e alternativa de macrófagos, estimulamos macrófagos derivados da medula óssea

(BMDMs) com lipopolissacarídeo (LPS) ou interleucina-4 (IL-4), respectivamente. O padrão

de fosforilação de ERK5 em macrófagos com estímulo de LPS e IL-4 foi determinado por

western blot. Como mostrado na Fig. 1, ambos os estímulos, LPS ou IL-4, foram capazes de

induzir a fosforilação de ERK5 em BMDMs. O estímulo de LPS promoveu ativação de ERK5

a partir de 5 minutos com pico de ativação mais tardio (60 min), enquanto que IL-4 promoveu

ativação de ERK5 nos primeiros minutos com um pico de fosforilação em 15 minutos (figura

1).

Para investigar o papel da via de sinalização de ERK5 na polarização de macrófagos

M1 e M2, foi determinado os níveis proteicos de iNOS e Arg-1 por western blot. Para isso os

macrófagos foram pré-tratados com um inibidor de ERK5 (XMD 8-92) por 1 hora e então

estimulados com LPS/IFN-γ ou IL-4 por 48 horas. O pré-tratamento com XMD reduziu a

expressão de Arg-1 induzida por IL-4 e aumentou a expressão de iNOS induzida por LPS e

IFN-γ (figura 2). Esses resultados sugerem que a via de sinalização de ERK5 pode estar

envolvida controle diferencial da polarização de macrófagos M1 e M2. No presente estudo,

concentramos nossos esforços no entendimento do papel da ERK5 na polarização de

macrófagos M2 induzida por IL-4.

31

Figura 1: Interleucina-4 e lipopolissacarídeo induzem fosforilação de ERK5 durante a

polarização de macrófagos.

Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos C57Bl/6 foram estimulados com LPS (300

ng/mL) e IL-4 (30 ng/mL) nos tempos indicados. Os níveis de fosforilação foram determinados por

Western Blot. As imagens foram cortadas para apresentação. A intensidade das bandas de Western

blot foi analisada por densitometria, normalizada pelos níveis de β-actina. Os valores relativos de

densidade ótica de cada banda em relação ao controle não tratado foram mostrados sob cada banda.

Um de dois experimentos independentes com resultado idêntico foi mostrado.

32

Figura 2: A via de sinalização de ERK5 participa do processo de polarização de macrófagos.

Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos C57Bl/6 foram pré-tratados com inibidor de

ERK5 (XMD8-92, 5 µM) por 1 hora, seguido pelos estímulos de LPS+IFN-γ (1 µg/mL e 200 ng/mL)

e IL-4 (10 ng/mL) por 48 horas. Os níveis de expressão de iNOS (marcador de M1) e ARG1

(marcador de M2) foram determinados por Western Blot. As imagens foram cortadas para

apresentação. A intensidade das bandas de Western blot foi analisada por densitometria, normalizada

pelos níveis de β-actina. Os valores relativos de densidade ótica de cada banda em relação ao controle

não tratado foram mostrados sob cada banda. DMSO foi utilizado como veículo (<0,05%). Um de dois

experimentos independentes com resultado idêntico foi mostrado.

33

4.2. Caracterização da ativação alternativa de macrófagos induzida por IL-4

Para avaliar a ativação alternativa de macrófagos induzida por IL-4, realizamos uma

caracterização e examinamos os níveis de diversos marcadores de fenótipo M2. Por ensaio de

ELISA, observamos que a produção da quimiocina CCL22 e do fator IGF-1 foi nitidamente

aumentada após estimulação de macrófagos usando diferentes concentrações de IL-4 (figura

3A). Após esses resultados determinamos a concentração de 10 ng/mL de IL-4 como padrão

para os experimentos seguintes. O aumento na produção desses mediadores pela indução com

IL-4 foi tempo-dependente com uma ótima indução entre 24 e 48 horas (figura 3B). Em

adição ao ELISA, a regulação da expressão e da atividade de Arg-1 foi também analisada por

citometria de fluxo e pela produção de uréia.

Os níveis de expressão de Arg-1 foram detectáveis após 12 horas de tratamento com

máxima indução em 48 horas (figura 4A). Além disso, de acordo com níveis aumentados de

Arg-1, observamos aumento na atividade da arginase através da formação de uréia por

macrófagos estimulados com IL-4 (figura 4B). Esses dados foram confirmados também por

imunofluorescência utilizando BMDMs de camundongos repórter para Arg1-YFP, nos quais

o gene repórter YFP é expresso sob o controle do promotor de Arg-1 (Reese et al., 2007).

Nesse experimento observamos maior quantidade de macrófagos Arg1-YFP+ no grupo

estimulado com IL-4 do que no grupo controle (figura 5). De acordo com outros estudos

confirmamos que durante a polarização de macrófagos M2, IL-4 induz a expressão de uma

série de marcadores M2, como Arginase I, CCL22, IGF-1, entre outros.

34

Figura 3: Expressão de marcadores M2 em macrófagos após estimulação com interleucina-4.

Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos C57Bl/6 foram estimulados com IL-4 pelos

tempos indicados. A) Os níveis de produção de CCL22 e IGF-1 foram determinados por ELISA após

48 horas de estimulo com IL-4 (10, 30 e 100 ng/mL). B) Os níveis de produção de CCL22 e IGF-1

foram determinados por ELISA nos tempos indicados após estímulo com IL-4 (10 ng/mL). Dados

foram mostrados como média ± EPM (n=3). ###

p < 0,001 comparado com controle RPMI. Diferenças

foram analisadas por (A) one-way ANOVA e (B) two-way ANOVA, seguido por pós-teste

Bonferroni. Um de três experimentos independentes foi mostrado.

35

Figura 4: Expressão de Arginase-1 e produção de uréia por macrófagos M2 induzidos por IL-4.

Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos YARG e WT (linhagem C57Bl/6) foram

estimulados com IL-4 pelos tempos indicados. A) Porcentagem de expressão de ARG-1 em BMDMs

YARG foi avaliada por citometria de fluxo nos tempos indicados com IL-4 (10 ng/mL). O Dot plot

acima é uma imagem representativa de BMDMS controle e estimulados com IL-4 após 48 horas. B) A

atividade de ARG-1 em BMDMs WT foi avaliada pela produção de uréia após 48 horas de estímulo

com IL-4 (10 ng/mL). Dados foram mostrados como média ± EPM (n=3). #p < 0,05 e

###p < 0,001

comparado com controle RPMI. Diferenças foram analisadas por (A) two-way ANOVA, seguido por

pós-teste Bonferroni e (B) teste t de student.

36

Figura 5: Expressão de Arginase-1 em macrófagos M2 induzidos por IL-4.

Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos YARG (linhagem C57Bl/6) foram

estimulados com IL-4. A expressão de Arg1 em BMDMs YARG foi avaliada por imunofluorescencia

após 48 horas de estímulo com IL-4 (30 ng/mL). A presença de macrófagos M2 (Arg1-YFP+) esta

mostrada em amarelo e o núcleo em azul. A barra de escala representa 50 µM (20x) e 25 µM (40x).

37

4.3. A produção de quimiocinas e mediadores marcadores M2 necessita da ativação

de ERK5

A ativação da MAPK ERK5 por células apoptóticas, imunogobulinas e outros

estímulos induz polarização para um fenótipo anti-inflamatório/regulador e promove a

expressão de marcadores M2, como Arg-1 e IL-10 (Barra et al., 2011; Heo et al., 2014;

Kozicky et al., 2015). Para investigar o papel da via de sinalização de ERK5 na regulação da

produção de quimiocinas e mediadores marcadores de fenótipo M2, pré-tratamos os

macrófagos com inibidor de ERK5, XMD 8-92. A produção de marcadores M2, como as

quimiocinas CCL17 e CCL22 e do mediador IGF-1 por macrófagos estimulados com IL-4 foi

reduzida em resposta ao tratamento com inibidor de ERK5 de maneira concentração-

dependente (figura 6). As diferentes concentrações do inibidor de ERK5 não tiveram efeito na

sobrevivência celular de BMDMs não-estimulados e estimulados com IL-4 (figura 7A e B). A

redução da produção das quimiocinas e mediadores M2, CCL17, CCL22 e IGF-1 induzida

por IL-4 foi tempo-dependente com ótima inibição entre 12 e 24 horas, e como mostrado

anteriormente também em 48 horas (figura 8). Nossos achados sugerem o envolvimento via

de sinalização de ERK5 na regulação da produção de quimiocinas e mediadores

característicos de macrófagos M2 estimulados com IL-4.

38

Figura 6: A inibição de ERK5 reduz a produção de quimiocinas e fatores marcadores de

fenótipo M2 de maneira concentração-dependente.

Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos WT (linhagem C57Bl/6) foram pré-tratados

com inibidor de ERK5 (XMD8-92) por 1 hora, e em seguida foram estimulados com IL-4 (10 ng/mL).

Os níveis de produção de CCL17, CCL22 e IGF-1 foram determinados por ELISA após 48 horas de

estimulo com IL-4. Dados foram mostrados como média ± EPM (n=3). ###

p <0,001 comparado com

controle RPMI. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 comparado ao grupo estimulado com IL-4.

Diferenças foram analisadas por one-way ANOVA, seguido por pós-teste Bonferroni. Um de três

experimentos independentes foi mostrado.

39

Figura 7: A sobrevivência e a viabilidade celular de BMDMs não foram alteradas pela inibição

de ERK5.


com inibidor de ERK5 (XMD8-92) por 1 hora, seguido pelo estímulo IL-4 (10 ng/mL). Viabilidade

celular, expressa em porcentagem, após tratamento com inibidor de ERK5 foi avaliada em BMDMs

(A) controle e (B) estimulados com IL-4 por 48 horas. Dados foram mostrados como média ± EPM

(n=3). Diferenças foram analisadas por one-way ANOVA, seguido por pós-teste Bonferroni. Um de

três experimentos independentes foi mostrado.

40

Figura 8: A via de sinalização de ERK5 controla a produção de quimiocinas e fatores de fenótipo

M2.


com inibidor de ERK5 (XMD8-92, 10 µM) por 1 hora, e em seguida foram estimulados com IL-4 (10

ng/mL). Os níveis de produção de CCL17, CCL22 e IGF-1 foram determinados por ELISA após a

estimulação com IL-4 nos tempos indicados. Dados foram mostrados como média ± EPM (n=3). ##

p

<0,01, ###

p <0,001 comparado com controle RPMI. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 comparado ao

grupo estimulado com IL-4. Diferenças foram analisadas por two-way ANOVA, seguido por pós-teste


41

4.4. A expressão gênica de marcadores M2 depende da ativação de ERK5

Durante a ativação alternativa, macrófagos estimulados com IL-4 expressam arginase I

(Arg-1), Fizz1 e YM1, marcadores característicos de macrófagos M2 (Mosser e Edwards,

2008). Adicionalmente, (Heo et al., 2014) descreveram recentemente o envolvimento da via

de sinalização de ERK5 na regulação de marcadores M2 e na polarização alternativa de

macrófagos induzida por fagocitose de células apoptóticas. Para investigar o papel da via de

sinalização de ERK5 na regulação da expressão de marcadores de M2, usamos um inibidor de

ERK5. Macrófagos derivados da medula óssea foram tratados com inibidor de ERK5 antes do

estimulo com IL-4. O tratamento com inibidor de ERK5 reduziu os níveis de expressão gênica

de marcadores M2, Retnla (Fizz1), Ym1 induzido por IL-4 (figura 9). Além disso, o mRNA e

os níveis proteicos de Arg-1 também foram reduzidos na presença do inibidor de ERK5

(figura 10A e C). Assim como a redução nos níveis de arginase I, também observamos

diminuição na atividade da enzima, verificado pela menor produção de ureia por macrófagos

tratados inibidor de ERK5 (figura 10B). Esses resultados sugerem o envolvimento da via de

sinalização de ERK5 na regulação da expressão gênicos de marcadores M2.

O receptor de manose (MR) é outro importante marcador de macrófagos M2, induzido

por IL-4 e também por uma série de outros estímulos (Mantovani et al., 2002). Ao contrário

do observado na expressão gênica dos outros marcadores M2, o tratamento com inibidor de

ERK5 aumentou os níveis de mRNA do receptor de manose em relação ao grupo não tratado

(figura 11A). Confirmando nossos resultados, observamos que a inibição de ERK5 aumentou

a frequência de macrófagos que expressam receptor de manose (figura 11B). Esse achado

sugere que a expressão do receptor de manose é regulada por um mecanismo dependente de

ERK5 diferente do que o dos outros marcadores de M2 e por isso novos experimentos devem

ser realizados para comprovar esta relação. Portanto, nossos resultados confirmam o papel da

42

via de sinalização de ERK5 controle da expressão de marcadores, exceto MR, durante a

polarização de macrófagos M2.

43

Figura 9: A expressão de marcadores M2 induzida por IL-4 envolve a ativação da via de

sinalização de ERK5.



ng/mL). Os níveis de expressão de Retlna e Ym1 foram determinados por PCR quantitativo após a

estimulação com IL-4 nos tempos indicados. Dados foram mostrados como média ± EPM (n=3). #p

<0,05, ##

p <0,01, ###

p <0,001 comparado com controle no tempo 0 h. *p <0,05, **p <0,01, ***p

<0,001 comparado ao grupo pré-tratado com veículo. Diferenças foram analisadas por two-way

ANOVA, seguido por pós-teste Bonferroni. Um de três experimentos independentes foi mostrado.

44

Figura 10: Expressão de Arginase-1 e produção de uréia induzida por IL-4 envolve a ativação da

via de sinalização de ERK5.



ng/mL). O nível de expressão de Arg1 foi determinado por (A) PCR quantitativo após a estimulação

com IL-4 nos tempos indicados e (C) Western blot após 48 horas. B) A atividade de ARG-1 foi

avaliada pela produção de uréia após 48 horas de estímulo com IL-4 (10 ng/mL). Dados foram

mostrados como média ± EPM (n=3). #p <0,05,

##p <0,01,

###p <0,001 comparado com controle no

tempo 0 h ou RPMI. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 comparado ao grupo pré-tratado com veículo.

Diferenças foram analisadas por two-way ANOVA, seguido por pós-teste Bonferroni. Um de três

experimentos independentes foi mostrado.

45

Figura 11: Expressão do receptor de manose (MR) é regulado negativamente pela ativação da

via de sinalização de ERK5.

Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos WT (linhagem C57Bl/6 e BALB/c) foram

pré-tratados com inibidor de ERK5 (XMD8-92, 10 µM) por 1 hora, e em seguida foram estimulados

com IL-4 (10 ng/mL). A) Os níveis de expressão de Mrc em BMDM WT (linhagem C57Bl/6) foi

determinado por PCR quantitativo após a estimulação com IL-4 nos tempos indicados. B) A

porcentagem de expressão de MR em BMDM WT (linhagem BALB/c) foi avaliada por citometria de

fluxo após 48 horas de estímulo com IL-4. Dados foram mostrados como média ± EPM (n=3). ###

p

<0,001 comparado com controle no tempo 0 h. **p <0,01, ***p <0,001 comparado ao grupo pré-

tratado com veículo. Diferenças foram analisadas por two-way ANOVA, seguido por pós-teste


46

4.5. Envolvimento da via de sinalização de MEK5 na expressão de marcadores M2

Em resposta ao uma série de diferentes estímulos MEK5, uma MAPKK, promove a

ativação de ERK5 através de fosforilação, que transloca para o núcleo e fosforila uma série de

proteínas alvos (Wang e Tournier, 2006). Para investigar o possível papel da via de

sinalização de MEK5 na produção de quimiocina e mediadores de marcadores de ativação

alternativa, macrófagos derivados da medula óssea foram pré-tratados com inibidor de MEK5

(BIX 02189) antes do estimulo com IL-4. A produção de quimiocinas e mediadores de perfil

M2 foram detectados usando ensaio de ELISA. O tratamento com o inibidor de MEK5

reduziu a produção de CCL17, CCL22 e IGF-1 induzida por IL-4 (figura 12).

Como mostramos acima, a sinalização de ERK5 é importante para a expressão de

marcadores M2 em macrófagos estimulados com IL-4. Para avaliar a participação do eixo

MEK5/ERK5 na regulação da expressão de arginase I em macrófagos induzida por IL-4. Os

níveis de expressão de arginase I foram determinados por citometria de fluxo usando BMDMs

de camungongos YARG. Ambos os inibidores, de ERK5 e de MEK5, reduziram fortemente

os níveis de expressão de arginase I em macrófagos estimulados com IL-4, tanto em

frequência relativa quanto em níveis de expressão (figura 13A e B). Para confirmar nossos

resultados, foram também determinados os níveis proteicos de arginase I por western blot. Da

mesma maneira, ambos os inibidores, de ERK5 e MEK5, reduziram profundamente os níveis

proteicos de arginase I induzida por IL-4 (figura 14A). Além disso, assim como o inibidor de

ERK5, o inibidor de MEK5 diminui produção de uréia por macrófagos estimulados com IL-4

(figura 14B). Dessa forma, nossos resultados mostram que a inibição da sinalização de ERK5

e MEK5 resulta em baixa ativação alternativa de macrófagos e confirmam a participação do

eixo MEK5/ERK5 na polarização de macrófagos M2 induzida por IL-4.

47

Figura 12: A via de sinalização de MEK5 controla a produção de quimiocinas e fatores de

fenótipo M2.


com inibidor de MEK5 (BIX02189) por 1 hora, e em seguida foram estimulados com IL-4 (10

ng/mL). Os níveis de produção de CCL17, CCL22 e IGF-1 foram determinados por ELISA após 48

horas de estimulo com IL-4. Dados foram mostrados como média ± EPM (n=3). ###

p <0,001

comparado com controle RPMI. ***p <0,001 comparado ao grupo estimulado com IL-4. Diferenças

foram analisadas por one-way ANOVA, seguido por pós-teste Bonferroni. Um de três experimentos

independentes foi mostrado.

48

Figura 13: A via de sinalização de MEK5/ERK5 controla a expressão de marcadores de fenótipo

M2.

Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos YARG (linhagem C57Bl/6) foram pré-

tratados com inibidor de ERK5 (XMD8-92, 10 µM) e MEK5 (BIX02189, 10 µM) por 1 hora, e em

seguida foram estimulados com IL-4 (30 ng/mL). A) A frequência de BMDMs Arg1-YFP+ foi

avaliada por citometria de fluxo após 48 horas de estimulo com IL-4. O Dot plot acima é uma imagem

representativa da frequência de BMDMS Arg1-YFP+. B) Os níveis de expressão de ARG1 por

intensidade média de fluorescência em YARG BMDMs foram expressos em histograma. Dados foram

mostrados como média ± EPM (n=3). ###

p <0,001 comparado com controle RPMI. ***p <0,001

comparado ao grupo estimulado com IL-4. Diferenças foram analisadas por one-way ANOVA,

seguido por pós-teste Bonferroni. Um de três experimentos independentes foi mostrado.

49

Figura 14: Expressão de Arginase-1 e produção de uréia induzida por IL-4 envolve a ativação da

via de sinalização de MEK5/ERK5.


com inibidor de ERK5 (XMD8-92, 10 µM) e MEK5 (BIX02189, 10 µM) por 1 hora, e em seguida

foram estimulados com IL-4 (10 ng/mL). A) O nível de expressão de Arg1 foi determinado por

Western blot após 48 hs de estimulo com IL-4. B) A atividade de ARG-1 foi avaliada pela produção

de uréia após 48 horas de estímulo com IL-4 (10 ng/mL). Dados foram mostrados como média ± EPM

(n=3). ###

p <0,001 comparado com controle RPMI. *p <0,05, ***p <0,001 comparado ao grupo

estimulado com IL-4. Diferenças foram analisadas por one-way ANOVA, seguido por pós-teste


50

4.6. A via de sinalização de ERK5 na polarização de macrófagos M2 não regula a

ativação de STAT6 nem a expressão de C/EBPβ

O fator de transcrição STAT6 desempenha um papel central na expressão de genes

marcadores de M2 induzida por IL-4, como Arg1, Ym1 e Fizz1 (Mantovani et al., 2002).

Assim, investigamos o papel de STAT6 na produção de quimiocionas e mediadores

marcadores de M2 induzida por IL-4 em BMDMs de camundongo deficientes para STAT6.

Após estimulação com IL-4, BMDMs deficientes para STAT6 apresentaram uma dramática

redução na produção das quimiocinas e mediadores M2, como CCL17, CCL22 e IGF-1

comparado com os BMDMs WT (figura 15A). Adicionalmente, foi demonstrado que em

macrófagos a expressão de arginase I induzida por IL-4 depende da ativação de STAT6 (Gray

et al., 2005). De acordo com essa informação, observamos também menor produção uréia

pelos macrófagos deficientes para STAT6 (figura 15B). Nossos resultados juntos de outros

publicados anteriormente confirmam o papel essencial de STAT6 na regulação da expressão

de marcadores M2.

A ligação da IL-4 no seu receptor ativa proteínas tirosina quinases da família JAK,

levando a uma rápida fosforilação e ativação de STAT6, o qual transloca para o núcleo e se

liga em regiões especificas de promotores de genes marcadores de M2 (Heller et al., 2008).

Baseado nessa informação, investigamos se a polarização de macrófagos M2 mediada pela

sinalização de ERK5 está envolvida com a ativação de STAT6 induzida por IL-4. Os níveis

de fosforilação de STAT6 foram determinados usando citometria de fluxo. A estimulação de

macrófagos com IL-4 induz rapidamente (15 min) a fosforilação de STAT6 com pico de

ativação após 1 hora. Os macrófagos tratados com inibidor de ERK5 apresentaram os mesmos

níveis de fosforilação de STAT6 comparado com o grupo controle (figura 16). Esses

resultados demonstram que a IL-4 induz fosforilação de STAT6 de forma independente da

51

ativação de ERK5, sugerindo que a via de sinalização de ERK5 age em paralelo ou à jusante

da via de STAT6 para regular a polarização de macrófagos M2.

C/EBPβ exerce também um papel importante na polarização de macrófagos M2

induzida por IL-4 (Gray et al., 2005). A indução da expressão de Cebpb mediada por CREB é

necessária para regulação expressão gênica marcadores M2, como IL10, Arg-1, IL13ra e

Msr1 (Ruffell et al., 2009). Por esta razão, avaliamos se a ativação de ERK5 regula a

expressão de Cebpb durante a polarização de macrófagos M2 induzida por IL-4. A expressão

gênica de Cebpb foi determinada por PCR quantitativo. O tratamento com inibidor de ERK5

não alterou os níveis de mRNA de Cebpb em macrófagos estimulados com IL-4 (figura 17).

Assim, esses dados mostram que a expressão de C/EBPβ em macrófagos induzida pela

estimulação com IL-4 não necessita da ativação de ERK5.

52

Figura 15: A expressão de marcadores de fenótipo M2 induzida por IL-4 está prejudicada na

ausência de STAT6.

Macrófagos derivados da medula óssea de camundongos WT e STAT6-/-

(linhagem BALB/c) foram

pré-tratados com inibidor de ERK5 (XMD8-92, 10 µM) por 1 hora, e em seguida estimulados com IL-

4 (10 ng/mL). A) Os níveis de produção de CCL17, CCL22 e IGF-1 foram determinados por ELISA e

(B) a atividade de ARG-1 pela produção de uréia após 48 horas de estímulo com IL-4 (10 ng/mL).

Dados foram mostrados como média ± EPM (n=3). ###

p <0,001 comparado com controle RPMI. ***p

<0,001 comparado ao grupo estimulado com IL-4. Diferenças foram analisadas por two-way ANOVA,

seguido por pós-teste Bonferroni. Um de dois experimentos independentes foi mostrado.

53

Figura 16: IL-4 estimula a fosforilação de STAT6 em macrófagos independente de ERK5.


com inibidor de ERK5 (XMD8-92, 10 µM) por 1 hora, e em seguida estimulados com IL-4 (30

ng/mL) nos tempos indicados. Os níveis de fosforilação de STAT6 foram determinados por citometria

de fluxo após estimulo com IL-4. Os níveis de fosforilação por intensidade média de fluorescência em

BMDMs CD11b+ foram expressos em histograma, representado pelo tempo 60 minutos. Dados foram

mostrados como média ± EPM (n=3). #p <0,05,

###p <0,001 comparado com controle RPMI. *p <0,05,

***p <0,001 comparado ao grupo estimulado com IL-4. Diferenças foram analisadas por two-way

ANOVA, seguido por pós-teste Bonferroni. Um de dois experimentos independentes foi mostrado.

54

Figura 17: IL-4 induz a expressão de C/EBPβ em macrófagos independente de ERK5.



ng/mL). A) O nível de expressão de C/EBPβ foi determinado por PCR quantitativo após 48 hs de

estimulo com IL-4. Dados foram mostrados como média ± EPM (n=3). #p <0,05,

##p <0,01,

###p

<0,001 comparado com controle do tempo 0 h. Diferenças foram analisadas por two-way ANOVA,

seguido por pós-teste Bonferroni. Um de três experimentos independentes foi mostrado.

55

Discussão

56

4. DISCUSSÃO

Os macrófagos desempenham um papel crucial na homeostase tecidual e na iniciação

e resolução de respostas inflamatórias. Estas células são dinâmicas, pois polarizam para

fenótipos pró-inflamatórios e anti-inflamatórios, dependendo do microambiente de citocinas,

enxercendo diferentes funções fisiológicas (Biswas e Mantovani, 2010). Em um estudo

publicado anteriormente, os macrófagos foram classificados basicamente em três subtipos de

acordo com suas funções: defesa do hospedeiro, reparo tecidual e imunoregulação (Mosser e

Edwards, 2008). Macrófagos alternativamente ativados (macrófagos M2) estão envolvidos

com regulação imunológica, remodelamento tecidual, destruição de parasitas e promoção

tumoral. Os macrófagos M2 podem ser divididos em dois tipos: macrófagos M2a e

macrófagos M2b e M2c. Os macrófagos M2a, induzidos por IL-4 e IL-13, regulam o reparo

tecidual e tem função anti-inflamatória. Por outro lado, os macrófagos M2b e M2c exercem

funções imunoreguladoras, contribuem para a progressão tumoral e podem secretar grandes

quantidades de IL-10 em resposta a imuno-complexos, células apoptóticas, entre outros

(Gerber e Mosser, 2001). Macrófagos M2a e M2b/M2c são claramente distintos, tanto

funcional quanto bioquimicamente. Macrófagos M2a contribuem para a produção de matriz

extracelular, enquanto que macrófagos M2b e M2c expressam altos níveis de moléculas co-

estimulatórias (CD80 e CD86) e por isso podem apresentar antígenos a células T. Embora

existam diferenças entre os subtipos de macrófagos M2, a principal característica em comum

é a atividade de regulação imunológica (Edwards et al., 2006).

A via de sinalização da ERK5 participa de uma série de processos celulares, como

ativação, proliferação e polarização em diferentes tipos celulares, incluindo macrófagos.

Anteriormente, um estudo demonstrou que em resposta ao estímulo com LPS, macrófagos

murinos da linhagem RAW264.7 ativam diferentes vias de MAPK, incluindo a via de ERK5

57

(Zhu et al., 2000). No entanto, outro trabalho observou que potentes ativadores de

macrófagos como LPS e IFN-γ, bem como outros citocinas pró-inflamatórias como IL-1 e IL-

6 falham em ativar ERK5 em linhagem de macrófagos murinos BAC1.2F5 (Rovida et al.,

2008). No presente estudo, investigamos a ativação de ERK5 induzida por LPS e IL-4 em

macrófagos derivados da medula óssea. Nossos resultados demonstram que embora tenham

cinéticas diferentes, tanto IL-4 quanto LPS induzem a ativação da via de sinalização de ERK5

em macrófagos derivados da medula óssea, sugerindo o envolvimento da via de ERK5 na

polarização de macrófagos M1 e M2.

Recentemente, foi demonstrado que a estimulação de macrófagos com

imunoglobulinas polarizam para um estado anti-inflamatório, através da sinalização de ERK5,

(Kozicky et al., 2015). Embora alguns trabalhos já tenham demonstrado o papel de ERK5 na

regulação da expressão de marcadores M2 (Heo et al., 2014), ainda não havia sido descrito o

envolvimento da via de sinalização de ERK5 na polarização de macrófagos M2a induzida por

IL-4. Uma vez observada a ativação de ERK5 em macrófagos estimulados com IL-4, a

próxima etapa foi investigar os efeitos da inibição farmacológica de ERK-5. Para tanto,

utilizamos XMD, um inibidor de ERK5, e observamos que esses macrófagos produziram

menores quantidades de mediadores inflamatórios M2, CCL17, CCL22, IGF-1 por um

período prolongado quando comparado aos macrófagos não tratados, indicando que

macrófagos com a via de ERK5 inibida são altamente resistentes a polarização M2, sugerindo

que ERK5 é um ativador intrínseco de respostas inflamatórias M2. Além disso, também

demonstramos que macrófagos tratados com inibidor de ERK5 apresentam menor polarização

para M2, representada pela baixa expressão de marcadores M2 como Arg-1, Fizz1 e Ym2

após estimulação com IL-4. A baixa resposta inflamatória de macrófagos tratados com

inibidor de ERK5 é consistente com um trabalho recente que observou diminuição de

marcadores M2 em macrófagos isolados de camundongos com deleção especifica de ERK5

58

em células mieloides (ERK5-MKO) (Heo et al., 2014). De fato, camundongos ERK5-MKO

são mais suscetíveis ao desenvolvimento de aterosclerose induzida por dieta hipercalórica e

apresentam uma baixa capacidade eferocitica e pobre polarização M2 (Heo et al., 2014).

A MAPK quinase MEK5 é o ativador imediato a montante de ERK5, promovendo sua

fosforilação e translocação para o núcleo onde regula uma série de fatores de transcrição

(Nishimoto e Nishida, 2006; Wang e Tournier, 2006). Assim como o tratamento com inibidor

de ERK5, macrófagos derivados da medula óssea tratados com um inibidor de MEK5 também

foram mais resistentes em polarizar para fenótipo M2. A inibição da via de MEK5 resultou

em baixa expressão de Arg-1 e diminuição da produção de mediadores inflamatórios M2,

CCL17, CCL22, IGF-1 após ativação com IL-4. Dessa forma, MEK5 é também essencial para

a polarização de macrófagos M2 e reforça a importância da via de sinalização de

MEK5/ERK5 no controle da polarização de macrófagos M2. Contudo, experimentos futuros

serão necessários para investigar através de qual transdutor de sinal à ativação do receptor de

IL-4 promove a ativação de MEK5/ERK5.

STAT6 e C/EBPβ desempenham um papel central, bem estabelecido, na polarização

de macrófagos M2 (Gray et al., 2005). A ativação de STAT6 induzida por IL-4 é crucial para

a expressão de marcadores característicos de M2, como Arg-1, Ym1, Fizz1, IRF-4 (Biswas e

Mantovani, 2010). Em concordância com esses estudos, observamos que a estimulação com

IL-4 promove uma rápida ativação de STAT6 em macrófagos WT. Macrófagos deficientes

para STAT6 foram menos responsivos a estimulação com IL-4. De fato, os macrófagos

STAT6-KO produziram menores quantidades de quimiocinas e mediadores M2, CCL17,

CCL22, IGF-1 após ativação in vitro com IL-4, indicando que a depleção genética de STAT6

em macrófagos torna-os altamente resistentes a polarização M2, confirmando o papel central

de STAT6 na regulação de respostas inflamatórias M2. Além disso, foi detectada menor

produção de uréia pelos macrófagos STAT6-KO, possivelmente devido a uma menor

59

expressão de Arg-1, marcador M2 fortemente regulado por STAT6. Curiosamente, não

observamos diferença nos níveis de fosforilação de STAT6 induzidos por IL-4 em

macrófagos WT tratados e não-tratados com inibidor de ERK5, sugerindo que ERK5 possa

regular a polarização de macrófagos M2 em paralelo ou à jusante da sinalização de STAT6.

Embora a maior parte das atividades de IL-4 seja regulada pela ativação da via de

JAK/STAT6, estudos indicam que outras moléculas de sinalização, tais como as MAPK

também podem estar envolvidas (Kelly-Welch et al., 2003). Recentemente, demonstraram

que a MAPK p38, mas não ERK1/2 e JNK, regula a polarização de macrófagos induzida por

IL-4 através de mecanismo dependente tanto da via de STAT6, quanto da via de PI3K/Akt,

ambas independentes uma da outra (Jiménez-Garcia et al., 2015). E assim como a via

PI3K/Akt ativada por p38, observamos que a MAPK ERK5 pode controlar a polarização de

macrófagos M2 induzida por IL-4 por uma via de sinalização paralela ou à jusante de STAT6.

A expressão C/EBPβ induzida por CREB é necessária para regeneração de músculo

lesionado e para regulação de genes associados ao fenótipo M2, como Arg-1, IL-10 e MR

(Ruffell et al., 2009). De fato, após a eferocitose de células apopticas, ERK5 é capaz de

promover a ativação de CREB e a subsequente expressão de Arginase II, polarizando os

macrófagos para um fenótipo regulador (Barra et al., 2011). Entretanto, em macrófagos

estimulados com IL-4, a tratamento com inibidor de ERK5 não alterou os níveis de expressão

gênica de cebpb, sugerindo que a baixa polarização M2 promovida pela inibição de ERK5 não

é regulada pela expressão de C/EBPβ, apesar de já ter sido demonstrado que a depleção de

sítios para ligação de CREB no promotor de Cebpb (Ruffell et al., 2009), e consequentemente

sua expressão, reduz a aquisição de fenotipo M2. Portanto, os dados indicam que a deficiente

polarização M2 em macrófagos tratados com inibidor de ERK5 não é mediada pela via

CREB-C/EBPβ.

60

Embora neste estudo não tenha sido possível identificar por qual mecanismo ERK5

regula a polarização de macrófagos M2 induzida por IL-4, algum entre os diversos fatores de

transcrição com papel bem estabelecido na ativação alternativa pode esta participando no

controle desta via de sinalização. Dentre os fatores conhecidas envolvidos com a polarização

de macrófagos M2, além de STAT6 e CREB-C/EBP-β, destacam-se: PPARγ, IRF4, o c-

MYC, KLF4. A atividade de PPARγ pode ser regulada positivamente por ERK5 e a ativação

de ERK5 pode inibir respostas pró-inflamatórias através da ativação de PPARγ (Woo et al.,

2006). De fato, a depleção de PPAR-γ em macrófagos prejudica a polarização para fenótipo

M2 (Odegaard et al., 2007). Além disso, IRF-4 também é um dos fatores que exercem um

papel crucial na polarização de macrófagos M2, o qual regula uma série de genes com

funções imunológicas (El Chartouni et al., 2010), e pode ser induzido por IL-4, M-CSF,

quitina e durante a defesa do hospedeiro contra infecções helmínticas (Satoh et al., 2010).

Adicionalmente, outro fator está envolvido com a indução de genes associados com ativação

alternativa por IL-4 (Pello et al., 2012), c-MYC, o qual a expressão pode ser regulada pela

ativação de ERK5 (Takaoka et al., 2012). Em conjunto, esses estudos podem nos auxiliar na

identificação do mecanismo molecular pelo qual ERK5 controla a polarização de macrófagos

M2 induzida por IL-4.

Entender os mecanismos que participam na polarização dos macrófagos M2a é um

passo importante para o desenvolvimento de diagnóticos em doenças e estratégias terapêuticas

contra respostas infecciosas, câncer e fibrose. No presente estudo, demonstramos que

macrófagos derivados da medula óssea tratados com um inibidor de ERK5 ou MEK5 foram

mais resistentes em polarizar para fenótipo M2. Sendo assim, nosso trabalho demonstrou que

a via de sinalização de MEK/ERK5 é um regulador crítico que controla a polarização de

macrófagos M2 induzida por IL-4 e pode ser uma importante molécula alvo para o controle da

polarização de macrófagos M2 em diferentes desordens patológicas.

61

Conclusão

62

5. CONCLUSÃO

Concluímos que a ativação da via de sinalização de MEK5/ERK5 é crítica para a

expressão de marcadores M2 durante a polarização de macrófagos M2 induzida por IL-4.

Desta forma, nossos achados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos

envolvidos nas respostas de macrófagos M2a, e assim auxiliam no desenvolvimento de novas

abordagens terapêuticas para o tratamento de uma série de doenças inflamatórias.

63

Referências

64

6. REFERÊNCIAS

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