ESTUDO DE INVESTIGAÇÃO QUÍMICA DA ESPÉCIE · LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS OMS Organização Mundial de Saúde IV Inflavermelho RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE ORGÂNICA E INORGÂNICA

CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

FRANCISCO CARLOS DE OLIVEIRA

ESTUDO DE INVESTIGAÇÃO QUÍMICA DA ESPÉCIE

Lippia rigida Schauer (VERBENACEAE)

FORTALEZA-CEARÁ

2012

FRANCISCO CARLOS DE OLIVEIRA

ESTUDO DE INVESTIGAÇÃO QUÍMICA DA ESPÉCIE

Lippia rigida Schauer (VERBENACEAE)

Dissertação submetida à

Coordenação do Programa de

Pós-Graduação em Química, da

Universidade Federal do Ceará,

como requisito parcial para

obtenção do Título de Mestre em

Química com Área de

Concentração em Química

Orgânica.

Orientador: Prof. Dr. Francisco

Geraldo Barbosa

FORTALEZA-CEARÁ

2012

2

OLIVEIRA, F.C.

3

OLIVEIRA, F.C.

A Deus, por me conceder disposição, força, saúde, amor, paz e fé para superar os obstáculos

da vida.

À minha amada esposa Elieuda, que sempre com muito amor e carinho, me incentivou para a

realização deste trabalho, simplesmente muito obrigado.

Aos meus pais Antonio e Maria, que sempre me apoiaram em meus desafios. Por todo

incentivo, carinho, amor, onde estiveram sempre presente me motivando nos momentos mais

difíceis, a eles serei eternamente grato.

4

OLIVEIRA, F.C.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por estar sempre comigo, me orientando e auxiliando em todos os momentos da

minha vida.

Ao meu orientador Prof. Dr. Francisco Geraldo Barbosa, pela orientação, dedicação, atenção,

sugestões e muitos conhecimentos que foram transmitidos, que foram fundamentais para a

realização deste trabalho.

Aos colegas do LABFITO (Carol Luz, Diana Kelly, Roberta, Marlon, Keyline e Darlan), pela

amizade.

Ao Prof. Jair Marfezoli, pela ajuda nas determinações estruturais.

Aos colegas e amigos de Pós-graduação: Felipe, Duvilardo, João Vitor, Max, Luciana, Irvila,

Diego, Paula, Bruno, Carol, Daniele, Afonso, entre outros.

À Profa. Dra. Mary Ane pela disponibilidade do equipamento de CLAE e a Antonia pela

ajuda na operação do mesmo.

Ao Prof. Dr. Edilberto pela coleta da planta e disponibilidade dos equipamentos de RMN do

CENAUREMN.

Aos operadores dos equipamentos RMN: Elton, Regivaldo e Prof. Dr. Daniel, pela obtenção

dos espectros de RMN.

Ao André pela obtenção dos espectros de massa.

À Profa. Dra. Jane Eire pela realização dos ensaios de atividade de inibição da enzima

acetilcolineterase.

À Profa. Dra. Givandete pela realização dos ensaios de atividade larvicida.

À Profa. Dra. Telma e doutoranda Cleane pela realização dos ensaios de atividade

antioxidante.

À Profa. Dra. Leticia pela realização dos ensaios de atividade anticâncer.

Aos demais professores do programa de Pós-graduação em química da UFC, que

contribuíram com minha formação.

5

OLIVEIRA, F.C.

Aos funcionários da UFC (Raimunda – “Mundinha”, Aurilana – “Lana”, Sr. Paulo, Célia e

Orlando).

À Doutoranda Renata e ao Mestrando Fábio pela realização dos ensaios de atividade

antibacteriana.

À IC Roberta pela realização da atividade nematicida. Às agências de fomento à pesquisa

(CAPES, CNPq e FUNCAP) pelo apoio financeiro através de recursos para custeio dos

materiais. A FUNCAP e CAPES pela bolsa de mestrado, concedida.

6

OLIVEIRA, F.C.

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS......................................

9

LISTA DE FIGURAS............................................................................................... 11

LISTA DE TABELAS.............................................................................................. 16

LISTA DE FLUXOGRAMAS................................................................................. 19I

RESUMO................................................................................................................... 20

ABSTRACT............................................................................................................... 21

1 INTRODUÇÃO...................................................................................................... 22

2. COSIDERAÇÕES BOTANICAS........................................................................ 24

2.1 Considerações botânicas sobre a família Verbenaceae........................................ 24

2.2 Considerações sobre o gênero Lippia.................................................................. 24

2.3 Considerações sobre a espécie Lippia rigida....................................................... 25

3 - LEVANTAMENTO BIBLIOGRAFICO........................................................... 27

3.1 - Levantamentos do potencial biológico do gênero Lippia................................... 27

3.2 Flavonóides: no gênero Lippia dispersão e atividades biológicas....................... 35

3.3 Flavonóides e atividade anticâncer...................................................................... 48

3.4 Flavonóides e inibição da enzima acetilcolinesterase.......................................... 53

3.5 Flavonóides com atividade antioxidantes............................................................. 55

3.6 Flavonóides com atividade antibacteriana............................................................ 61

3.7 Flavonóides com potencial antifúngicos............................................................... 65

3.8 Flavonóides com atividade de citotoxicidade...................................................... 68

3.9 Estruturas química dos flavonóides relatados na literatura com atividade

anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase, antioxidante,

antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade.........................................................

71

4. DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL E CARACTERIZAÇÃO DA

COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE L.

rigida...........................................................................................................................

88

7

OLIVEIRA, F.C.

4.1 Determinação estrutural dos metabólitos secundário isolados das folhas de L.

rigida.....................................................................................................................

88

4.1.1 Determinação estrutural de LEF-1.....................................................................

88

4.1.2 Determinação estrutural de LEF-2..................................................................... 97

4.1.3 Determinação estrutural de LEF-3………………………………………….... 104



4.1.7 Determinação estrutural de LDF-1………………………………………........ 126



4.1.10 Determinação estrutural de LEC-1………………………………………...... 145

4.2 Caracterização da composição química do óleo essencial das folhas de L.

rigida...........................................................................................................................

152

5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL……………………………………...... 159

5.1 Material botânico……………………………………………………………...... 159

5.2 Métodos cromatográficos……………………………………………………..... 159

5.2.1 Cromatografia de adsorção………………………………………………........ 159

5.2.2 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)........................................... 160

5.3 Métodos físicos.................................................................................................... 160

5.3.1 Ponto de fusão.................................................................................................... 160

5.3.2 Rotação óptica [α]D......................................................................................... 160

5.4 Métodos espectrométricos e espectroscópicos...................................................... 161

5.4.1 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)................................ 161

5.4.2 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IV)........................... 161

5.5 Estudo dos constituintes não voláteis de L. rigida................................................ 162

5.5.1 Preparação dos extratos...................................................................................... 162

8

OLIVEIRA, F.C.

5.5.2 Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das folhas de L. rigida

(LEF)...........................................................................................................................

162

5.5.3 Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das folhas de L. rigida

(LEC)...........................................................................................................................

163

5.5.4 Fracionamento cromatográfico da fração LEFD e isolamento de LEF-1 e

LEF-2..........................................................................................................................

163

5.5.5 Fracionamento cromatográfico da fração LEFA e isolamento de LEF-3,

LEF-4 e LEF-5...........................................................................................................

166

5.5.6 Obtenção do óleo essencial e decocto das folhas de Lippia rigida................... 169

5.5.7 Análise química do óleo essencial por CG-EM e CG-DIC............................... 170

5.5.8 Fracionamento por extração líquido-líquido de LDF........................................ 171

5.5.9 Fracionamento cromatográfico da fração LDFA e isolamento de LDF-1,

LDF-2 e LDF-3..........................................................................................................

171

5.5.10 Fracionamento Cromatográfico da fração LECA e isolamento de LEC-1... 174

6 ATIVIDADES BIOLÓGICAS.............................................................................. 178

6.1 Ensaio de atividade de citotoxicidade in vitro frente à linhagem de células

cancerígenas................................................................................................................

178

6.2 Ensaio de atividade larvicida com o óleo essencial das folhas de L. rigida........ 179

6.3 Ensaio de atividade inibitória da enzima acetilcolinesterase................................ 180

6.4 Ensaio de atividade toxicidade frente Artemia salina........................................... 181

6.5 Ensaio de atividade antioxidante........................................................................... 182

6.6 Ensaio de atividade nematicida............................................................................. 183

6.7 Ensaio de atividade antibacteriana........................................................................ 183

7 CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................ 185

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 186

9

OLIVEIRA, F.C.

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS

OMS Organização Mundial de Saúde

IV Inflavermelho

RMN 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN 13

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13

EM-IE Espectrometria de Massa por Impacto Eletrônico

p.f Ponto de fusão

LEF Extrato Etanolico das Folhas

[α]D Rotação óptica

KBr Brometo de Potássio

J Constante de Acoplamento

δ Deslocamento químico

d Dubleto

dd Duplo dubleto

Hz Hertz

s Singleto

COSY Correlated Spectroscopy

DEPT Distortionless Enhancement by Polazation Transfer

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

BB Broad Band decoupling

1D Unidimensional

2D Bidimensional

m Multipleto

LEFD Fração Diclorometano do Extrato Etanolico das Folhas de Lippia rigida

LEFA Fração Acetato de Etila do Extrato Etanolico das Folhas de Lippia rigida

LDFA Fração Acetato de Etila do Decocto das Folhas de Lippia rigida

LECA Fração Acetato de Etila do Extrato Etanolico do Caule de Lippia rigida

IK Indice Kolvats

CG-DIC Cromatografia Gasosa acoplado a Detector por Ionização de Chama

CG-MS Cromatografia Gasosa acoplado a Espectrometria de Massa

ALCA Herbário Alexandre Leal Costa

CCD Cromatografia em Camada Delgada

10

OLIVEIRA, F.C.

Rf Índice de Retenção

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CENAUREMN Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear

Θ Ângulo de nutação

LHF Extrato Hexanico das Folhas de Lippia rigida

LHC Extrato Hexanico do Caule de Lippia rigida

LEF Extrato Etanolico das Folhas de Lippia rigida

LEC Extrato Etanolico do Caule de Lippia rigida

LEFH Fração Hexano do Extrato Etanolico das Folhas de Lippia rigida

LEFM Fração Metano do Extrato Etanolico das Folhas de Lippia rigida

LECH Fração Hexano do Extrato Etanolico do Caule de Lippia rigida

LECD Fração Diclorometano do Extrato Etanolico do Caule de Lippia rigida

LECM Fração Metano do Extrato Etanolico do Caule de Lippia rigida

LDF Decocto das Folhas de Lippia rigida

OEFLR Óleo Essencial das folhas de Lippia rigida

ºC/min Grau Celsius por Minuto

eV ElétronVolt

LDFD Fração Diclorometano do Decocto das Folhas de Lippia rigida

LDFB Fração Butanol do Decocto das Folhas de Lippia rigida

MTT 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-brometo tetrazolina

DMSO Dimetilsulfóxido

AChE Acetilcolinesterase

DTNB Ácido 5,5’-ditiobis-(2-nitrobenzóico)

DPPH 1,1-Difenil-2-picrilhidrazil

ф Diâmetro

11

OLIVEIRA, F.C.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Fotos de L. rigida em seu local de coleta. Planta inteira – A; folhas – B;

inflorescência – C................................................................................................................

26

Figura 2 - Estrutura básica de um flavonóides.................................................................... 35

Figura 3 - Flavonóides isolados de plantas do gênero Lippia............................................. 36

Figura 4 - Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade anticâncer,

registrado na literatura...........................................................................................................

52

Figura 5 - Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade inibição da

enzima acetilcolinesterase, registrado na literatura...............................................................

55

Figura 6 – Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade

antioxidante, registrado na literatura.....................................................................................

61

Figura 7 - Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade

antibacteriana, registrados na literatura................................................................................

65


antifúngica, registrados na literatura.....................................................................................

68


citotoxicidade, registrados na literatura................................................................................

70

Figura 10 - Flavonas com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,

antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade.................................................

71

Figura 11 - Isoflavona com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,

antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade....................................................

79

Figura 12 - Flavanonas com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,

antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade....................................................

80

Figura 13 - Chalconas com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,

antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade........................................................

83

Figura 14 - Biflavonóides com atividade anticâncer, inibição da enzima

acetilcolinesterase, antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade.....................

84

Figura 15 - Bicatequina com atividade antioxidante............................................................... 85

Figura 16 - Catequinas com atividade antioxidante.................................................................. 85

Figura 17 - Diidrochalcona com atividade antioxidante...................................................... 85

Figura 18 – Isoflavanonas com atividade anticâncer, inibição da enzima

acetilcolinesterase, antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade.....................

86

Figura 19 - Flavan-3-ol com atividade antifúngica............................................................... 86

12

OLIVEIRA, F.C.

Figura 20 - Flavanonois com atividade citotoxicidade............................................................. 86

Figura 21 - Outras clases de flavonóides com atividade inbição da enzima

acetilcolinesterase, antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade....................

87

Figura 22 – Espectro na região de infravermelho de LEF-1 (KBr)..................................... 88

Figura 23 - Padrão de acoplamentos observados nos espectros de RMN 1H e COSY de

LEF-1....................................................................................................................................

90

Figura 24 – Espectro de massa (IE, 70 eV) de LEF-1......................................................... 90

Figura 25 – Principais correlações observadas no espectro de HMBC de LEF-1............... 91

Figura 26 - Estrutura química de Sakuranetina.................................................................... 91

Figura 27 - Espectro de RMN 1H de LEF-1 (acetona-d6, 500 MHz).................................. 93

Figura 28 - Expansões do espectro de RMN 1H de LEF-1 (acetona-d6, 500 MHz)............ 93

Figura 29 - Espectro de RMN 13

C de LEF-1 (acetona-d6, 125 MHz)................................. 94


C – DEPT 135º de LEF-1 (acetona-d6, 125 MHz).......... 94

Figura 31 - Espectro de RMN 1H,

1H-COSY de LEF-1 (acetona-d6, 500 MHz)............... 95


13C-HSQC de LEF-1 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)..... 95


13C-HMBC de LEF-1 (acetona-d6, 500 x 125 MHz).... 96

Figura 34 – Expansão do espectro de RMN 1H,

13C-HMBC de LEF-1 (acetona-d6, 500 x

125 MHz)..............................................................................................................................

96

Figura 35 – Espectro na região de infravermelho de LEF-2 (KBr)........................................ 97

Figura 36 – Padrão de acoplamentos observados no espectro de RMN 1H e COSY de

LEF-2....................................................................................................................................

98


Figura 38 - Estrutura química de Pinocembrina.................................................................. 99








1H-COSY de LEF-2 (acetona-d6, 500 MHz)............... 103

Figura 44 - Expansão do espectro de RMN 1H,


125 MHz)..............................................................................................................................

103

Figura 45 - Espectro na região do infravermelho de LEF-3................................................ 104

Figura 46 – Correlações observadas no espectro de COSY de LEF-3............................... 105


13

OLIVEIRA, F.C.

Figura 48 - Estrutura química de Naringenina..................................................................... 106


Figura 50 - Expansão do espectro de RMN 1H de LEF-3 (acetona-d6, 500 MHz)............. 108




1H-COSY de LEF-3 (acetona-d6, 500 MHz)................ 109







125 MHz)..............................................................................................................................

110

Figura 56 - Espectro na região de infravermelho de LEF-4................................................ 111

Figura 57 – Correlações observadas no espectro de COSY de LEF-4................................ 112


Figura 59 - Estrutura química de 7-metoxi-aromadendrina................................................ 113




C de LEF-4 (acetona-d6, 125 MHz)................................ 116




1H-COSY de LEF-4 (acetona-d6, 500 x 500 MHz)...... 117




13C-HMBC de LEF-4 (a cetona-d6, 500

x 125 MHz)...........................................................................................................................

108

Figura 67 – Espectro na região de infravermelho de LEF-5 (KBr).................................... 119

Figura 68 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LEF-5......................................................... 121

Figura 69 - Estrutura química de Genkwanina.................................................................... 121

Figura 70 - Espectro de RMN 1H de LEF-5 (piridina-d5, 500 MHz)................................. 122


C de LEF-5 (piridina-d6, 500 MHz)................................ 123


C – DEPT 135º de LEF-5 (piridina-d5, 125 MHz).......... 123

Figura 73 – Espectro de RMN 1H,

1H-COSY de LEF-5 (piridina-d5, 500 MHz)............... 124


13C-HSQC de LEF-5 (piridina-d5, 500 x 125 MHz).... 124


13C-HMBC de LEF-5 (piridina-d5, 500 x 125 MHz)... 125

Figura 76 – Espectro na região de infravermelho de LED-1 (KBr)................................... 126


LDF-1...................................................................................................................................

128

14

OLIVEIRA, F.C.

Figura 78 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LED-1......................................................... 108

Figura 79 - Estrutura química de Ramnocitrina................................................................... 129

Figura 80 - Espectro de RMN 1H de LED-1 (piridina-d5, 500 MHz)................................. 130


C de LED-1 (piridina-d5, 125 MHz)................................ 130


C – DEPT 135º de LED-1 (piridina-d5, 125 MHz).......... 131


1H-COSY de LED-1 (Piridina-d5, 500 MHz)............. 131


13C-HSQC de LED-1 (piridina-d5, 500 x 125 MHz).... 132


13C-HMBC de LED-1 (piridina-d5, 500 x 125 MHz)... 132

Figura 86 - Espectro na região do infravermelho de LED-2............................................... 133


LDF-2...................................................................................................................................

134

Figura 88 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LED-2......................................................... 135

Figura 89 - Estrutura química do Canferol.......................................................................... 135

Figura 90 - Espectro de RMN 1H de LED-2 (acetona-d6, 500 MHz).................................. 136


C de LED-2 (acetona-d6, 125 MHz)................................. 137


1H-COSY de LED-2 (acetona-d6, 500 MHz)................ 137


13C-HSQC de LED-2 (acetona-d6, 500 x 125 MHz).... 138


13C-HMBC de LED-2 (acetona-d6, 500 x 125 MHz). 138

Figura 95 – Espectro na região do infravermelho de LDF-3 (KBr).................................... 139

Figura 96 - Padrão de acoplamentos observados no espectro de RMN 1H e COSY de

LDF-3...................................................................................................................................

141

Figura 97 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LDF-3......................................................... 141

Figura 98 - Estrutura química de Quercetina....................................................................... 141

Figura 99 - Espectro de RMN 1H de LED-3 (acetona-d6, 500 MHz).................................. 142


C de LED-3 (acetona-d6, 125 MHz)............................... 143


1H-COSY de LED-3 (acetona-d6, 500 MHz).............. 143


13C-HSQC de LED-3 (acetona-d6, 500 x 125 MHz).. 144


13C-HMBC de LED-3 (acetona-d6, 500 x 125 MHz). 144

Figura 104 – Espectro na região do infravermelho de LEC-1 (KBr)..................................... 145

Figura 105 – Correlações observadas no espectro de COSY de LEC-1............................. 146

Figura 106 – Principais correlações observadas no espectro de HMBC de LEC-1............ 147

Figura 107 - Estrutura química de Taxifolina...................................................................... 148

Figura 108 - Espectro de RMN 1H de LEC-1 (acetona-d6, 500 MHz)................................ 149

15

OLIVEIRA, F.C.


C de LEC-1 (acetona-d6, 125 MHz)............................... 149


1H-COSY de LEC-1 (acetona-d6, 500 MHz)............. 150


13C-HSQC de LEC-1 (acetona-d5, 500 x 125 MHz).. 150


13C-HMBC de LEC-1 (acetona-d6, 500 x 125 MHz). 151

Figura 113 - Cromatograma da análise de OEFLR por CG/EM.......................................... 153

Figura 114 - Espectro de massa do α-pineno....................................................................... 153

Figura 115 - Espectro de massa do limoneno...................................................................... 154

Figura 116 - Espectro de massa do trans-β-ocimeno........................................................... 15

Figura 117 - Espectro de massa do linalol........................................................................... 154

Figura 118 - Espectro de massa do nerol............................................................................. 154

Figura 119 - Espectro de massa do ácido Nerolico.............................................................. 154

Figura 120 - Espectro de massa do acetato nerila................................................................ 154

Figura 121 - Espectro de massa do α-cubebeno................................................................... 154

Figura 122 - Espectro de massa do acetato de geranila....................................................... 155

Figura 123 - Espectro de massa do α-copaeno..................................................................... 155

Figura 124 - Espectro de massa do β-cariofileno................................................................. 155

Figura 125 - Espectro de massa do β-cubebeno................................................................... 155

Figura 126 - Espectro de massa do E-β-farneseno............................................................... 155

Figura 127 - Espectro de massa do α-humuleno.................................................................. 155

Figura 128 - Espectro de massa do alloaromadendreno....................................................... 155

Figura 129 - Espectro de massa do α-amorfeno................................................................... 156

Figura 130 - Espectro de massa do germacreno-D.............................................................. 156

Figura 131 - Espectro de massa do biciclogermacreno....................................................... 156

Figura 132 - Espectro de massa do γ-cadineno.................................................................... 156

Figura 133 - Espectro de massa do δ-cadineno.................................................................... 156

Figura 134 - Espectro de massa do trans-nerolidol............................................................. 156

Figura 135 - Espectro de massa do espatulenol................................................................... 156

Figura 136 - Espectro de massa do óxido de cariofileno..................................................... 167

Figura 137 - Espectro de massa do δ-cadinol...................................................................... 167

Figura 138 - Espectros de massa dos compostos não identificados..................................... 167

Figura 139 – Cromatograma de análise da fração LEFA-(36-54)-(12-27) por CLAE, em

condições de fase reversa (MeOH/H2O 80:20, fluxo 4,5 mL/min e λ = 284 nm).................

168

Figura 140 - Estrutura química do radical livre DPPH........................................................ 182

16

OLIVEIRA, F.C.

Figura 141 - Halo de inibição do crescimento bacteriano de Pseudomonas aeruginosa

pelo método de difusão em disco.................................................................................

184

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade anticâncer.... 27

Tabela 2 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade de inibição

da enzima acetilcolinesterase................................................................................................

28

Tabela 3 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade antioxidante. 28

Tabela 4 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade

antibacteriana........................................................................................................................

29

Tabela 5 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade antifúngica... 31

Tabela 6 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade

citotoxicidade........................................................................................................................

34

Tabela 7 - Relação dos flavonóides isolados de plantas do gênero Lippia......................... 36

Tabela 8 - Relação das estruturas dos flavonóides isolados de plantas do gênero Lippia

com suas respectivas espécies..............................................................................................

38

Tabela 9 - Relação das atividades biológicas dos flavonóides isolados de plantas do

gênero Lippia........................................................................................................................

44

Tabela 10 - Flavonóides relatados na literatura com atividade anticâncer.......................... 48

Tabela 11 - Flavonóides relatados na literatura com atividade de inibição da enzima

acetilcolinesterase..................................................................................................................

53

Tabela 12 - Flavonóides relatados na literatura com atividade antioxidante....................... 56

Tabela 13 - Flavonóides relatados na literatura com atividade antibacteriana...................... 62

Tabela 14 - Flavonóides relatados na literatura com atividade antifúngica........................ 65

Tabela 15 - Flavonóides relatados na literatura com atividade de citotoxicidade frente as

larvas Artemia salina............................................................................................................

69

Tabela 16 – Padrão de hidrogenação dos carbonos determinado através da análise

comparativa entre os espectros de RMN 13

C-BB e DEPT 135° de LEF-1..........................

89

Tabela 17 - Dados espectroscópicos de RMN 1H,

13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de

LEF-1, comparados com a literatura (AVENDAÑO, GUERRER, AGUIRRE, 2008 –

17

OLIVEIRA, F.C.

Acetona-d6)........................................................................................................................... 92



LEF-2, comparados com dados da pinocembrina registrados na literatura (YENJAI et

al., 2009 – CDCl3 + CD3OD)...............................................................................................

100



LEF-3, comparados com a literatura (ALMEIDA et al., 2005 – acetona-d6).....................

107



LEF-4, comparados com a literatura (ALMEIDA, et al., 2005 – acetona-d6)....................

114



C-BB e DEPT 135° de LEF-5..........................

120


13C, HSQC e HMBC (piridina-d5) de

LEF-5, comparados com a literatura (AGRAWAL, 1989)..................................................

122



C-BB e DEPT 135° de LDF-1.........................

123



LDF-1, comparados com a literatura (AGRAWAL, 1989).................................................

130




136




142



LEC-1, comparados com a literatura (AGRAWAL, 1989).................................................

148

Tabela 28 - Composição química do óleo essencial das folhas de L. rigida Schauer........ 152

Tabela 29 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das

folhas (LEF).........................................................................................................................

163


folhas (LEC).........................................................................................................................

163

Tabela 31 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFD........................ 164

Tabela 32 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFD-(11-15)........... 164

Tabela 33 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFD-(11-15)-(30-

36) e isolamento de LEF-1..................................................................................................

165

Tabela 34 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFD-(11-15)-(27-

29) e isolamento de LEF-2..................................................................................................

165

18

OLIVEIRA, F.C.

Tabela 35 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFA por exclusão

molecular em Sephadex LH-20............................................................................................

167

Tabela 36 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico da LEFA-(36-54)............ 167

Tabela 37 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico do decocto das folhas

(LDF).................................................................................................................................

171

Tabela 38 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LDFA........................ 172

Tabela 39 - Dados referente ao fracionamento cromatográfico de LDF-(40-49) e

isolamento de LFD-1...........................................................................................................

172

Tabela 40 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LDF-(40-49)-(22-31)

e isolamento de LFD-2 e LFD-3..........................................................................................

173

Tabela 41 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LECA........................ 175

Tabela 42 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LECA-(32-61)........... 175

Tabela 43 - Dados referente ao fracionamento cromatográfico de LECA-(32-61)-(18-

25).........................................................................................................................................

176

Tabela 44 - Dados referente ao fracionamento cromatográfico de LECA-(32-61)-(18-

25)-(31-37)...........................................................................................................................

176

Tabela 45 - Percentual de inibição do crescimento celular de amostras testadas em

concentração única (50 μg/mL) frente à linhagem de células tumorais HCT-8 (cólon)......

179

Tabela 46 – Medida do halo de inibição da enzima acetilcolinesterase.............................. 181

Tabela 47 - Percentual de citotoxicidade frente as larvas de Artemia salina...................... 182

Tabela 48 - Resultado – Atividade antibacteriana pelo teste de difusão em disco Média e

DP dos halos de inibição......................................................................................................

184

LISTA DE FLUXOGRAMAS

Fluxograma 1 - Obtenção do extrato hexânico e etanólico das folhas e do caule de L.

rigida...................................................................................................................................

162

Fluxograma 2 - Fracionamento cromatográfico da fração LEFD, isolamento de LEF-1

e LEF-2...............................................................................................................................

166

Fluxograma 3 – Fracionamento cromatográfico de LEFA e isolamento de LEF-3,

LEF-4 e LEF-5...................................................................................................................

169

Fluxograma 4 - Extração do óleo essencial e obtenção do decocto das folhas de L. 170

19

OLIVEIRA, F.C.

rigida...................................................................................................................................

Fluxograma 5 - Fracionamento cromatográfico da fração LDFA e isolamento de LDF-

1, LDF-2 e LDF-3...............................................................................................................

174

Fluxograma 6 - Fracionamento cromatográfico da fração LECA e isolamento de LEC-

1...........................................................................................................................................

177

20

OLIVEIRA, F.C.

RESUMO

Este trabalho descreve o estudo de investigação química da espécie Lippia rigida Schauer

(Verbenaceae), coletada no município de Muncugê, Bahia. A análise cromatográfica do

extrato etanólico das folhas de L. rigida permitiu o isolamento e caracterização de 3

flavonóides do tipo flavanonas: sakuranetina, pinocembrina e 2 flavanonois: 7-metil-

aromadendrina e taxifolina; 1 flavona: genkwanina; 3 flavonois: ramnocitrina, canferol e

quercetina. Na determinação estrutural dos metabólicos secundários isolados, utilizou-se

técnicas espectroscópicas como Infravermelho (IV) e Ressonância Magnética Nuclear de

hidrogênio (RMN 1H) e de carbono-13 (RMN

13C), incluindo técnicas bidimensionais

(COSY, HMBC e HSQC), além de espectrometria de massa (EM) e comparação com os

dados da literatura. Embora todos os compostos isolados sejam conhecidos na literatura, o

isolamento de flavonóides para a espécie L. rigida corrobora com a dispersão

quimiotaxonômica desta classe para o gênero Lippia. Além disso, os compostos 7-metil-

aromadendrina, ramnocitrina, genkwanina e canferol estão sendo relatados pela primeira vez

para o gênero, além do mais os flavonoides 7-metil-aromadendrina e ramnocitrina estão sendo

relatados pela primeira vez para a família Verbenaceae. O óleo essencial das folhas de Lippia

rigida foi obtido por hidrodestilação e analisado em CG-EM e CG-DIC. Os componentes

majoritários do óleo essencial foram α-humuleno (42,3%) e β-cariofileno (13, 0%). O óleo foi

submetido ensaio de atividade larvicida frente a larvas no estágio III do mosquito Aedes

aegypti com e apresentou CL50 de 138, 97 ± 1,2 μg/mL. Ensaio de atividade de citotoxicidade

frente a linhagens de células MDA-MB435, HCT-8 e SF-295, apresentou IC% 83,79, 86,80 e

79,41, respectivamente. A atividade de inibição da enzima acetilcolinesterase revelou com

halo de inibição de 9 mm similar ao controle fisostigmina.

Palavras-chave: Lippia rigida; flavonóides; Verbenaceae.

21

OLIVEIRA, F.C.

ABSTRACT

This paper describes the study of chemical research of the species Lippia rigida Schauer

(Verbenaceae), collected in the municipality of Muncugê, Bahia. Chromatographic analysis of

the ethanol extract from leaves of L. rigid allowed the isolation and characterization of

flavonoid-type flavanones 3 sakuranetin, pinocembrin and naringenin 2 flavanonois 7-methyl

aromadendrin and taxifolin, 1 flavone genkwanin, 3 flavonois ramnocitrin, kaempferol and

quercetin. In the structural determination of secondary metabolites isolated, we used

spectroscopic techniques such as infrared (IR) and hydrogen nuclear magnetic resonance (1H

NMR) and carbon-13 (13

C NMR), including two-dimensional techniques (COSY, HMBC and

HSQC), and mass spectrometry (MS) and comparison with literature data. Although all the

compounds are known in the literature, the isolation of flavonoids for the species L. rigida

chemotaxonomy corroborates dispersal of this class to the genus Lippia. Moreover, the

compound 7-methyl-aromadendrin, ramnocitrina, genkwanina and kaempferol are being

reported for the first time for the genus, besides the more flavonoids 7-methyl-aromadendrin

ramnocitrina and are being reported for the first time for the family Verbenaceae. The

essential oil of Lippia rigida leaves was obtained by hydrodistillation and analyzed in GC-MS

and GC-FID. The major components of the essential oil were α-humulene (42.3%) and β-

caryophyllene (13,0%). The oil was subjected testing larvicidal activity against larvae in stage

III of the mosquito Aedes aegypti and presented with LC50 of 138.97 ± 1.2 mg/mL. Assay of

cytotoxicity activity against cell lines MDA-MB435, HCT-8 and SF-295, IC% showed 83.79,

86.80 and 79.41, respectively. The activity of inhibiting the enzyme acetylcholinesterase

inhibition zone revealed with 9 mm similar to control physostigmine.

Keywords: Lippia rigida; flavonoids; Verbenaceae.

22

OLIVEIRA, F.C.

1 INTRODUÇÃO

O Brasil é o país com maior biodiversidade do mundo, apresentando cerca de 20%

do número total de espécies do planeta, distribuídas nos diversos biomas (Floresta

Amazônica, Cerrado, Mata Atlântica, Pantanal, Caatinga, Manguezal, etc), sendo que muitas

dessas espécies são endêmicas (KATO, 2001). É estimado que existam cerca de 40 mil

espécies vegetais distribuídas nos diferentes biomas brasileiros (FARNSWORTH, 1991).

Todavia, o levantamento de recursos brasileiros em espécies vegetais ainda é incipiente,

levando-se em conta que outras nações aceleram seus programas de química e farmacologia

de produtos naturais oriundos de plantas, visando à obtenção de patentes para moléculas de

interesse farmacológico derivadas destas.

A organização mundial de saúde (OMS) estima que um em cada cinco habitantes

do planeta, procura assistência médica em terapias não convencionais. A utilização de plantas

como fonte terapêutica para tratamento de diversas doenças é realizada em varias

comunidades do mundo, principalmente na zona rural (RIBEIRO; LEITE; DANTAS-

BARROS, 2005).

No Brasil, observa-se um crescimento na utilização de fitoterápicos

(medicamentos obtidos utilizando-se exclusivamente matéria-prima vegetal) pela população.

Dentre os fatores que poderiam explicar o aumento do uso desta terapêutica, destacam-se os

avanços ocorridos na área científica que permitiram o desenvolvimento de fitoterápicos com

segurança e eficácia reconhecidas, como também uma forte tendência de busca, pela

população, por terapias menos agressivas destinadas ao atendimento primário à saúde

(RIBEIRO; LEITE; DANTAS-BARROS, 2005).

Estudos fitoquímicos têm por finalidade conhecer os constituintes químicos de

espécies de vegetais ou avaliar sua presença. Estes constituintes, que são substâncias

micromoleculares resultantes do metabolismo secundário podem pertencer a diversas classes

de compostos químicos voláteis e não voláteis.

Neste contexto, plantas da família Verbenaceae estão presentes em praticamente

todos os ecossistemas terrestres, sendo uma das cinco mais importantes entre as

23

OLIVEIRA, F.C.

eudicotiledôneas dos campos rupestres (GIULIETTI et al. 1987). Verbenaceae possui 36

gêneros e cerca 1000 espécies com distribuição pan-tropical, principalmente nos neotrópicos.

No Brasil, ocorrem 17 gêneros e aproximadamente 250 espécies, sendo 33 delas

ocorrentes no cerrado. As espécies desta família possuem diversos hábitos, variando de

arbustos, ervas, até, menos frequentemente, árvores e lianas (METCALFE e CHALK, 1950;

SANO e ALMEIDA, 1998; JUDD, 1999; SOUZA e LORENZI, 2005).

A família Verbenaceae também é notabilizada pela diversidade de metabólitos

encontrados, dentre os quais, estão flavonoides, terpenóides, esteróides, iridóides e seus

glicosídeos, quinonas (COSTA, 2001), taninos, saponinas, resinas, alcalóides e naftoquinonas

(PASCUAL et al., 2001).

Dentro da família Verbenaceae destaca-se o gênero Lippia, que possui grande

importância econômica devido aos usos dos óleos essenciais. Além disso, muitas espécies

apresentam diversas atividades farmacológicas (PASCUAL et al., 2001).

Diante da importância do gênero Lippia, este trabalho teve como objetivo

principal realizar o primeiro estudo químico da espécie L. rigida. O trabalho compreendeu o

isolamento, a determinação estrutural dos metabólitos secundários isolados utilizando técnicas

espectrométricas de RMN de 1H e

13C (1D e 2D), IV, EM, além da determinação de p.f. e

[α]D, a caracterização do óleo essencial e a investigação química e atividades biológicas.

Para facilitar a busca de informações, o trabalho está dividido em seis capítulos:

Capítulo 1: Introdução, Capítulo 2: Cosiderações botânicas, Capítulo 3: Levantamento

bibliográfico, Capítulo 4: Determinação estrutural e caracterização da composição

química do óleo essencial das folhas de L. rigida, Capítulo 5: Procedimento experimental,

Capítulo 6: Atividades biológicas, Capítulo 7: Considerações finais e Referências

Bibliográfica.

24

OLIVEIRA, F.C.

2 COSIDERAÇÕES BOTÂNICAS

2.1 Considerações botânicas sobre a família Verbenaceae

Plantas da família Verbenaceae estão presentes em praticamente todos os

ecossistemas terrestres, sendo uma das cinco mais importantes entre as eudicotiledôneas dos

campos rupestres (GIULIETTI et al., 1987). A família Verbenaceae possui 36 gêneros e cerca

1000 espécies com distribuição pan-tropical, principalmente nos neotrópicos. No Brasil,

ocorrem 17 gêneros e cerca de 250 espécies, sendo 33 delas ocorrentes no cerrado. As

espécies desta família possuem diversos hábitos, variando de arbustos, ervas, até, menos

frequentemente, árvores e lianas (METCALFE e CHALK, 1950; SANO e ALMEIDA, 1998;

JUDD, 1999; SOUZA e LORENZI, 2005).

As espécies de Verbenaceae têm seu potencial econômico amplamente explorado,

tanto como ornamentais (LORENZI e SOUZA, 2001), quanto como terapêuticas, neste último

caso devido à presença de óleos essenciais. Muitos estudos atestam atividades analgésicas,

antiespasmódicas, calmantes, sedativas, citostáticas, antimicrobianas, antitumorais,

hepatoprotetoras, antiinflamatórias e laxativas de algumas de suas espécies (STEFANINI et

al. 2002). Além dessas, análises bioquímicas recentes atestam as propriedades de Lantana

camara L. como repelente de mosquitos do gênero Aedes e de Stachytarpheta cayennensis

(Rich) Vahl. como leishmanicida (DUA et al., 2003; MOREIRA et al., 2007).

As principais classes de substâncias encontradas na família são flavonóides,

terpenóides, esteróides, iridóides e seus glicosídeos, quinonas (COSTA, 2001), taninos,

saponinas, resinas, alcalóides e naftoquinonas (PASCUAL et al., 2001).

2.2 Considerações sobre o gênero Lippia

O gênero Lippia reúne aproximadamente 254 táxons, incluindo espécies e

variedades, a maioria localizadas no Brasil, Paraguai e Argentina, havendo poucas espécies

endêmicas na África. No Brasil, os principais centros de diversidade específica desse gênero

estão localizados na Cadeia do Espinhaço em Minas Gerais e na Chapada Diamantina na

Bahia (SALIMENA, 2002).

O gênero Lippia possui grande importância econômica devido aos diferentes usos

dos óleos essenciais, sendo muitas espécies medicinais (SALIMENA, 2002). Muitas espécies

deste gênero são utilizadas em programas fitoterápicos e de complementação alimentar no

25

OLIVEIRA, F.C.

Brasil, sendo L. alba (Mill.) N. E. Brown e L. sidoides Cham. as espécies mais conhecidas e

estudadas sob o ponto de vista químico e agronômico (PASCUAL et al., 2001; LEAL et al.,

2003; DUARTE et al., 2005).

Este gênero pode ser caracterizado por apresentar plantas arbustivas ou

subarbustivas, com folhas decussadas, geralmente com indumento glandular, florescências

parciais capituliformes ou espiciformes, congestas, axilares, brácteas membranáceas ou

cartáceas, verdes ou coloridas, amarelas, róseas ou vináceas, ultrapassando ou não o

comprimento das flores; flores sésseis, cálice comprimido, induplicado, membranáceo,

inconspícuo, persistente no fruto; corola hipocraterimorfa, alva, rósea, magenta, lilás ou

amarelas, tubo reto ou curvo, lábio superior ou adaxial, lábio inferior ou abaxial único, 2

lobos laterais; 4 estames; ovário monocarpelar, bilocular, 2 ovulado, estigma lateral e fruto

dividido na maturidade em dois mericarpos (TRONCOSO, 1974).

Algumas propriedades medicinais atribuídas às espécies do gênero Lippia estão

relacionadas à produção de óleos essenciais pelos tricomas secretores. Em Lippia, a

morfologia, distribuição e frequência dos tricomas secretores e não secretores podem ser

usados como caracteres taxonômicos discriminativos em nível específico (BONZANI et al.,

1997; SALIMENA, 2002).

Algumas espécies do gênero Lippia como a L. alba, apresentam a composição

química de seu óleo essencial com variações quantitativas e qualitativas, levando à

classificação de diferentes quimiotipos.

2.3 Considerações sobre a espécie Lippia rigida

A espécie L. rigida Schauer (Figura 1, p. 26) é um arbusto encontrado no bioma

Caatinga do estado da Bahia. Alcança cerca de 1 m de altura, muito ramificada, de folhas

pequenas (1 a 2 cm) e aromáticas com cheiro forte. As folhas e caule de L. rigida foram

coletados em junho de 2010 em Mucugê, no Estado da Bahia. Uma exsicata representando a

coleta foi depositada no Herbário Alexandre Leal Costa do Departamento de Botânica da

Universidade Federal da Bahia, sob os números 1240-1245, e a indentificação botânica foi

feita pela Professora Ms. Maria Lenise Silva Guedes, do referido Departamento.

26

OLIVEIRA, F.C.

Figura 1 – Fotos de L. rigida em seu local de coleta. Planta inteira – A; folhas – B;

inflorescência – C (Fotografo: Prof. Dr. Edilberto R. Silveira, 2010)

A

B

C

27

OLIVEIRA, F.C.

3 - LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO

3.1 - O potencial biológico do gênero Lippia

O potencial biológico de plantas do gênero Lippia pode ser observado através de

levantamentos bibliográfico registrados na literatura, como no review de plantas do gênero

Lippia, realizado Pascual e colaboradores (2001), onde pode ser encontrado um grande

número de espécies com a sua composição química, aspectos farmacológicos e usos

tradicionais.

Diferentes atividades farmacológicas e biológicas são apontadas para plantas do

gênero Lippia, dentre as quais, se destacam: anticâncer, inibição da enzima

acetilcolinesterase, antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade. Desta forma,

realizou-se um levantamento no período de 2000 – 2011 nas bases de dados Scifinder scholar

e Science direct destas atividades para completar e atualizar informações do gênero Lippia.

Os dados encontram-se apresentados nas tabelas 1 – 6.

Tabela 1 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade anticâncer

Espécie Linhagem de

Células

Parte usada Amostra Referências

L. dulcis Trev.

L. canescens Kunth

B16F10; MK-1;

HeLa

Partes

aéreas

Extrato

ABE et al., 2002

L. sidoides Cham HL60;

CEM

Cerne Extrato COSTA et al., 2001

L. alba;

L. citriodora;

L. dulci;

L. micromera;

L. origanoides

Vero;

THP-1

Partes

aéreas

Óleo

essencial

ESCOBAR et al.,

2010

L. gracilis H.B.K;

L. thymoides Mart et

Schau;

L. microphylla Cham.;

L. sidoides Cham.

Walker 256;

Ehrlich

Folhas

extrato

PESSOA et al., 2006

L. citriodora;

L. dulcis;

L. origanoides;

L. citriodora

Vero

Folhas e

flores

Óleo

essencial

CORREA-ROYER

et al., 2010

28

OLIVEIRA, F.C.

Tabela 2 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade de inibição da

enzima acetilcolinesterase

Espécie Parte usada Amostra Referências

L. alba;

L. sidoides;

Folhas;

Talos;

Caule sem cascas;

Cascas;

Folhas

Extrato

MORAIS et al.,

2007

L. sidoides Folhas Extrato LIBERATO et al.,

2011

Tabela 3 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade antioxidante

Espécie Parte usada Amostra Referências

L. cf microphylla Cham. Folhas e caule Extrato DAVID et al., 2007

L. origanoides;

L. alba (Quimiotipo carvona);

L alba (Quimiotipo limonena);

L. alba (Quimiotipo

biciclosesquifellandreno.

Folhas

Óleo

essencial

OLIVERO-VERBEL

et al., 2009

L. javanica;

L. wilmsii;

L. rehmannii;

L. scaberrima

Folhas

Extrato

SHIKANGA et al.,

2010

L. pseudo-thea;

L. hermannioides;

L. alba;

L. rubella;

L. sidoide

Folhas

Extrato

FABRI et al., 2011

L. graveolens Partes aeréas Extrato MARTÍNEZ-ROCHA

et al., 2008

L. alba ---- Óleo

essencial

PUERTAS-MEJÍA et

al., 2002

L. gracilis Schauer Folhas Óleo

essencial

MENDES et al., 2010

L. multiflora Folhas Óleo

essencial

AGNANIET et al.,

2005

L. nodiflora Partes aeréas Extrato SHUKLA et al., 2009

L. sidoides ----- Extrato LIBERATO et al.,

2011

L. grandis Folhas Óleo

essencial

DAMASCENO et al.,

2011

L. aff. gracillis Folhas e talos Óleo

essencial

LIMA, 2007

29

OLIVEIRA, F.C.

Tabela 4 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade antibacteriana

Espécie Bactérias Parte usada Amostra Referências

L. alba

B. subtilis;

B. megaterium;

S. aureus;

S.lutea;

S. dysentriae;

V. mimicus;

V.parahemolyticus;

S. paratyphy

Folhas e flores

Extrato

COSTA et al., 2009

L. aff. gracillis

S. paratyphi;

S. marcescens;

M. morganii;

P. mirabilis;

K. pneumoniae;

E. coli;

S. aureus

Folhas

Óleo

essencial

PESSOA et al., 2005

L. javanica;

L. wilmsii;

L. rehmannii;

L. scaberrima

S. aureus;

E. faecalis;

E. coli;

P. aeruginosa

Folhas

Extrato

SHIKANGA et al.,

2010

L. alba

L. alba f.

intermedia

S. aureus MRSA;

S. aureus;

L. casei;

S. mutans

Partes aéreas

Óleo

essencial

OLIVEIRA et al.,

2006

L. origanoides

S. aureus MRSA;

S. aureus;

L. casei;

S. mutans

Partes aéreas

Óleo

essencial

OLIVEIRA et al.,

2007

L. chevalieri

E. coli;

S. aureus;

E. hirae

Partes aéreas

Óleo

essencial

MEVY et al., 2007

L. graveolens S. lútea;

V. cholerae

Partes aéreas Extrato HERNÁNDEZ, 2009

L. multiflora

S. aureus NCTC

6571;

B. subtilis NCTC

8236;

E. coli NCTC

10418;

P. aeruginosa

ATCC 10145;

S. aureus;

S. species;

S. epidermidis;

Enteroinvasive

E. coli;

Enterohaemorrhagic

Folhas

Óleo

essencial

OLADIMEJI et al.,

2004

30

OLIVEIRA, F.C.

E. coli;

K. pneumoniae

L. rubella B. cereus Folhas Extrato FABRI et al., 2011

L. chevalieri;

L. multiflora

B. cereus;

E. faecalis;

E. coli;

L. innocua;

P. mirabilis;

S. entérica;

S. dysenteria;

S. aureus;

S. camorum

Folhas

Óleo

essencial

BASSOLE et al.,

2003

L. javanica S. aureus;

E. coli

Planta inteira Óleo

esencial

MANENZHE et al.,

2004

L. javanica

S. aureus;

S. epidermidis;

E. coli;

E. cloacae;

K. pneumoniae;

P. aeruginosa

Folhas

Óleo

esencial

NGASSAPA et al.,

2003

L. multiflora

S. aureus;

E. coli;

P. aeruginosa;

S. typhii;

B. subtilis

Folhas

Extrato

KUNLE et al., 2003

L. nodiflora

S. epidermidis;

S. aureus;

P. vulgaris;

S. paratyphi A;

E. coli;

S. paratyphi B

Panta inteira

Extrato

DURAIRAJ et al.,

2007

L. sidoides

S. mutans;

S. sanguis;

S. salivarius;

S. mitis

Folhas

Óleo

essencial

BOTELHO et al.,

2007

L. turbinata E. coli;

P. aeruginosa;

Shigella sp;

S. aureus;

Partes aéreas

Extrato

HERNÁNDEZ et al.,

2000

L. javanica

K. pneumonia;

C. neoformans;

B. cereus

Partes aéreas

Óleo

essencial

VILJOEN et al., 2005

L. integrifolia

S. aureus MS ATCC

29213;

S. aureus RM

ATCC 43300;

E. coli ATCC

25922;

E. coli LM1.

Partes aéreas

Óleo

esencial

LIMA et al., 2011

31

OLIVEIRA, F.C.

E. coli LM2;

P. aeruginosa

ATCC 27853;

Y. enterocolitica PI;

S. enteritidis MI;

Salmonella sp MI

L. sidoides

K. pneumoniae;

Proteus sp;

E. coli;

S. pyogenes;

Flores

Extrato

MOREIRA et al.,

2011

L. turbinata

S. aureus;

B. cereus;

E. faecalis;

P. mirabilis

Partes aéreas

Óleo

essencial

DEMO et al., 2005

L. aff. gracillis

Salmonella sp;

S. paratyphi;

S. marcescens;

M. morganii;

P. mirabilis;

K. pneumoniae;

E. coli;

S. aureus;

P. aeruginosa

Folhas

Óleo

essencial

LIMA, 2007

Tabela 5 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade antifúngica

Espécie Fungos Parte

usada

Amostra Referências

L. alba

S. cerevaceae;

A. flavus;

A. niger;

C. albicans

Folhas e

flores

Extrato

COSTA et al., 2009

L. alba;

L. alba f.

intermedia

C. albicans;

Serotype B

C. albicans;

C. parapsilosis;

C. guilliermondii

Partes

aéreas

Óleo

essencial

OLIVEIRA et al.,

2006

L. origanoides

C. albicans;

Serotype B

C. albicans;

C. parapsilosis;

C. guilliermondii

C. neoformans;

T. rubrum

Partes

aéreas

Óleo

essencial

OLIVEIRA et al.,

2007

L. chevalieri C. Albicans;

S. cerevisiae

Partes

aéreas

Óleo

essencial

MEVY et al., 2007

L. multiflora

C. pseudotropicalis;

C. albicans;

Folhas

Óleo

OLADIMEJI et al.,

32

OLIVEIRA, F.C.

T. rubrum;

A. flavus

essencial 2004

L. alba

C. albicans

Folhas

Óleo

esencial;

Extrato

DUARTE et al.,

2005

L. alba C. krusei Folhas Extrato HOLETZ et al., 2002

L. pseudo-

thea;

L. sidoide

C. albicans Folhas Extrato FABRI et al., 2011

L. multiflora C. albicans Folhas Extrato KUNLE et al., 2003

L. nodiflora C. albicans;

C. neoformans

Planta

inteira

Extrato DURAIRAJ et al.,

2007

L. rehmannii

L. theobromae;

B.cinerea;

R. solani;

F. oxysporum;

C. gloeosporioides;

A. alternata;

P. digitatum;

A. citri

Planta

inteira

Óleo

essencial

LINDE et al., 2010

L. scaberrima P. digitatum Planta

inteira

Óleo

essencial

PLOOY et al., 2009

L. scaberrima C. gloeosporioides;

L. theobromae

Partes

aéreas

Óleo

essencial

REGNIER et al.,

2010

L. sidoides C. albicans Folhas Óleo

essencial

BOTELHO et al.,

2007

L. alba A. flavus Folhas Óleo

essencial

SINGH et al., 2011

L. graveolens C. albicans;

C. dubliniensis

Planta Óleo

essencial

POZZATTI et al.,

2009

L. alba

A. alternata;

A. flavus;

A. fumigatus;

A. glaucus;

A. niger;

A. shydowi

A. terreus;

C. cladosporioides;

C. lunata;

F. graminearum;

F. nivale;

F. oxysporum;

Fusarium sp.;

P. italicum;

R. solani;

R. stolonifer;

Trichoderma spp.

Folhas

Óleo

essencial

SHUKLA et al.,

2009

L. berlandieri A. niger;

Penicillium spp.

---- Óleo

essencial

SOSA et al., 2010

L. citriodora M. perniciosa Planta Óleo REGNIER e

33

OLIVEIRA, F.C.

inteira essencial COMBRINCK,

2010.

L. citriodora;

L. dulcis;

L. origanoides;

L. citriodora

C. krusei;

A. fumigatus

Folhas e

flores

Óleo

essencial

CORREA-ROYER

et al., 2010

L. geminate;

L. alba

R. solani;

B. oryzae

Folhas Óleo

esencial;

Extrato

BHUYAN et al.,

2010

L. integrifolia

M. gypseum;

T. rubrum;

T. mentagrophytes;

T. rubrum C 110;

T. rubrum C 135;

T. rubrum C 136;

T. rubrum C 137;

T. rubrum C 139;

T. rubrum C 140;

T. mentagrophytes C

108;

T. mentagrophytes C

364;

T. mentagrophytes C

539;

T. mentagrophytes C

738;

T. mentagrophytes C

943;

T. mentagrophytes C

726;

Partes

aéreas

Óleo

esencial

LIMA et al., 2011

L. rehmannii

L. theobromae;

C. gloeosporioides;

L. theobromae;

C. gloeosporioides;

A. alternata;

P. digitatum;

A. citri;

R. solani;

F. oxysporum

Partes

aéreas

Óleo

esencial

LINDE et al., 2010

L. rugosa

A. flavus;

A. Níger;

A. parasiticus;

Aspergillus spp;

F. moniliforme;

Fusarium spp1

Fusarium spp2

P. roqueferti

Penicilium spp

Folhas

Óleo

esencial

AOUDOU et al.,

2010

34

OLIVEIRA, F.C.

Tabela 6 - Plantas do gênero Lippia registradas na literatura com atividade de citotoxicidade

Espécie Parte usada Amostras Referências

L. alba Folhas e flores Extrato ARA et al., 2009

L. cf. microphylla Cham. Partes aéreas Extrato DAVID et al., 2007

L. multiflora Moldenke Partes aéreas Extrato AJAIYEOBA et al.,

2006

Lippia origanoides;

Lippia alba (Quimiotipo

carvona);

Lippia alba (Quimiotipo

limoneno); Lippia alba

(Quimiotipo

biciclosesquifellandreno)

Folhas

Óleo

essencial

OLIVERO-VERBEL

et al., 2009

L. pseudo-thea;

L. hermannioides;

L. alba;

L. rubella;

L. sidoide

Folhas

Extrato

FABRI et al., 2011

L. gracilis Folhas Óleo

essencial

TELES et al., 2010

L. grandis Folhas Óleo

essencial

DAMASCENO et al.,

2011

De acordo com as tabelas de 1-6, 11 espécies apresentaram atividade anticâncer, 2

espécies apresentaram atividade de inibição da enzima acetilcolonesterase, 19 espécies

apresentaram atividade antioxidante, 18 espécies apresentaram atividade antibacteriana, 18

espécies apresentaram atividade antifúgica e 12 espécies apresentaram atividade de

citotoxicidade.

35

OLIVEIRA, F.C.

3.2 Flavonóides no gênero Lippia: dispersão e atividades biológicas

Os flavonóides são substâncias com uma constituição química que compreende os

derivados flavônicos (flavus – amarelos), os derivados antociânicos (anthos – flor e kyanus –

azul), as catequias/catecóis e outros constituintes relacionados (TESTE e TRENTINI, 1997).

São derivados da condensação de uma molécula de ácido cinâmico com três grupos malonil-

CoA2 (MARTINEZ-FLORES, 2002) e representam um dos grupos fenólicos mais

importantes e diversificados entre os produtos de origem natural, sendo amplamente

distribuído no reino vegetal e encontrado em diversas formas estruturais (SIMÕES et al.

2007).

Aos flavonoides e outros polifenóis são atribuídos diversas funções, tais como,

proteção dos vegetais contra a incidência de raios ultravioleta e visível, além de proteção

contra insetos, fungos, vírus e bactérias, atração de animais com finalidade de polinização,

antioxidantes, controle da ação de hormônios vegetais, agentes alelopáticos e inibidores de

enzimas (HARBONE, 1989; HARBONE e WILLIAMS, 2000).

A estrutura básica dos flavonoides (Figura 2) consiste em dois anéis fenil (A e B)

ligados através de um anel pirânico (C) (MARTINEZ-FLORES, 2002). Essa estrutura (C6-

C3-C6) permite que os mesmos sofram diversos tipos de reações como hidroxilação,

metoxilação, glicolisação com mono e oligossacarídeos e acetilação. Estas reações podem

ocorrer em várias posições da estrutura (SHAHIDI, 1996) e estão relacionados com esquemas

de proteção frente a processos oxidativos (BORS et al., 1996; ODABASOGLU et al., 2004).

Figura 2 – Esqueleto básico de um flavonoide

O

O

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '

3 '

4 '

5 '

6 '

B

CA

O interesse econômico pelos flavonoides é decorrente de suas diferentes

propriedades e também de sua importância farmacológica, dentre as quais se destacam a

atividade antitumoral, anti-inflamatória, antioxidante, antiviral, entre outras (TRUEBA e

SANCHES, 2001; SIMÕES et al., 2007).

36

OLIVEIRA, F.C.

Mais de 9.000 flavonoides foram relatados a partir de plantas superiores e micro-

organismos (FERRER et al. 2008), representando uma das maiores classes de produtos

naturais. Em geral, são encontrados nas frações mais polares, como acetato de etila

(agliconas) e butanólica (flavonoides glicosilados). Alguns compostos menos polares, como a

luteolina, são extraídos com clorofórmio ou diclorometano (NIERO, 2000). Segundo o

levantamento bibliográfico realizado para o gênero Lippia, os flavonóides são representados

por 51 estruturas diferentes (Tabelas 7 e 8), sendo 62,74% flavonas; 21,57% flavanonas;

3,63% biflavonóides e 11,89% chalconas, como indicado na Figura 3.

Figura 3 - Flavonóides isolados de plantas do gênero Lippia

Tabela 7 - Relação dos flavonóides isolados de plantas do gênero Lippia

Nº Nome dos flavonóides Referências

01 Desmetoxicentaureidina ABE et al., 2002

02 Eupafolina ABE et al., 2002

03 6-hidroxiluteolina ABE et al., 2002

04

Quercetina

COSTA et al., 2001

LIN et al., 2007

LIMA, 2007

05 Luteolina COSTA et al., 2001

LIN et al., 2007

06 Glucoluteolina COSTA et al., 2001

07 Taxifolina COSTA et al., 2001

LIN et al., 2007

08 Luteolina-7-diglicuronideo HENNEBELLE et

62,74%

21,57%

3,63%

11,89%

0

10

20

30

40

50

60

70

1 Flavononas Flavonas Biflavonóides Chalconas

37

OLIVEIRA, F.C.

al., 2008.

09 5,5”-diidroxi-6,4’,6”,3’”,4’”-pentametoxi-[C7–O–C7”]-

biflavona

BARBOSA et al.,

2005

10 4’,4’”,5,5”-tetrahidroxi-6,6”,3’”-trimetoxi-[C7–O–C7”]-

biflavona

BARBOSA et al.,

2005

11 5,3’-diidroxi-6,7,4’,5’-tetrametoxiflavona ONO et al., 2005

ONO et al., 2006

12 Crisina ONO et al., 2005

13 Salvigenina ONO et al., 2005

KANKO et al.,

2004

14 Eupatorina ONO et al., 2005

15 5-hidroxi-6,7,3’,4’-tetrametoxiflavona ONO et al., 2005

16 Galangina LIN et al., 2007

17 Metilgalangina LIN et al., 2007

18 Apigenina ONO et al., 2008

LIN et al., 2007

19 Apigenina 7-O-glucosideo LIN et al., 2007

20 Escutellareina LIN et al., 2007

21 Escutellareina 7-O-hexosideo LIN et al., 2007

22 6-Metilescutellareina LIN et al., 2007

23 6,7-Dimetilescutellareina LIN et al., 2007

24 Luteolina 7-O-glicosídeo LIN et al., 2007

25 6-Hidroxiluteolina LIN et al., 2007

26 6-Hidroxiluteolina 7-O-hexosideo LIN et al., 2007

27 6-Hidroxiluteolina 7-O-ramnosideo LIN et al., 2007

28 Pinocembrina LIN et al., 2007

29 Naringenina LIN et al., 2007

30 Sakuranetina LIN et al., 2007

31

Eriodictiol

LIN et al., 2007

ALMEIDA et al.,

2010

32 Eriodictiol 7-O-glicosideo LIN et al., 2007

33 Pentahidroxiflavanona-A LIN et al., 2007

34 Pentahidroxiflavanona-A 7-O- hexosideo LIN et al., 2007

35 Pentahidroxiflavanona-B LIN et al., 2007

36 Pentahidroxiflavanona-B 7-O-hexosideo-1 LIN et al., 2007

37 Pentahidroxiflavanona-B 7-O-hexosideo-2 LIN et al., 2007

38 Floretina LIN et al., 2007

39 Floridzina LIN et al., 2007

40 3-Hidroxifloretina LIN et al., 2007

41 3-Hidroxifloretina 6-O-hexosideo LIN et al., 2007

42 2’-O-β-D-glicopiranosil-3,4,4’,6’-tetra-hidroxi-di-hidrochalcona ALMEIDA et al.,

38

OLIVEIRA, F.C.

2010

43 2’-O-β-D-glicopiranosil-4,4’,6’-tri-hidroxi-di-hidrochalcona ALMEIDA et al.,

2010

44 4’,5,7-tri-hidroxi-6-metoxiflavona ALMEIDA et al.,

2010

LIMA 2007

45 Hispidulina ONO et al., 2008

46 Jaceosidina ONO et al., 2008

47 Cirsilineol ONO et al., 2008

48 Eupatorina ONO et al., 2008

49 Hispidulina 7-O-β-D-glucosideo ONO et al., 2008

50 Jaceosidina 7-β-glucosideo ONO et al., 2008

51 3-metil-quercetina LIMA 2007

Tabela 8 - Relação das estruturas dos flavonóides isolados de plantas do gênero Lippia com

suas respectivas espécies

O

O

OH

OMe

OHO H

O H

MeO (01 )

L. dulcis Trev.

L. canescens Kunth.

O

O

OH

OHO H

O H

MeO (02 )

L. dulcis Trev.

L. canescens Kunth.

O

O

OH

OHO H

O H

(03 )

L. dulcis Trev.

L. canescens Kunth.

O

O

OH

OH

O H

O H

O H

(04 )

L. sidoides Cham.

39

OLIVEIRA, F.C.

O

O

OH

O H

O H

OH

(05 )

L. sidoides Cham.

(06 )

O

O H

OH

OH

O H

O

OH

O H

O H

O

O

L. sidoides Cham.

O

OO H

O H

OH

O H

O H

(07 )

L. sidoides Cham.

O

OO H

O H

OH

O H

(08 )

L. alba

(09 )

O

O

MeO

OMe

O

O

OMe

O H

OMe

MeO

O H

O

L. alba

(10 )

O

O

OH

OMe

O

O

OMe

O H

O H

MeO

O H

O

L. alba

O

O

OH

O H

OMe

MeO

MeO(11 )

L. dulcis

O

OO H

O H

MeO

MeO(12 )

L. dulcis

40

OLIVEIRA, F.C.

O

OO H

OMe

MeO

MeO

OMe

O H

(14 )

L. dulcis

O

OO H

OMe

MeO

MeO

OMe

(15 )

L. dulcis

O

OO H

O H

O H

(16 )

L. graveolens

O

O

OMe

OH

(17 )

L. graveolens

O

O

OH

O H

O H

(18 )

L. graveolens

(19)

O

O H

OH

OH

O H

O

O H

O H

O

O

L. graveolens

O

O

OH

O H

O H

OH(20 )

L. graveolens

(21 )

O

O H

OH

OH

OHO

O

O

O H

O H

OH

L. graveolens

41

OLIVEIRA, F.C.

(22 )

O

O

OH

O H

O H

MeO

L. graveolens

(2 3 )

O

O

MeO

O H

MeO

L. graveolens

(24 )

O

O H

OH

OH

O H

O

O H

O H

O

O

O H

L. graveolens

(25 )

O

O

OH

O H

O H

OH

O H

L. graveolens

(26 )

O

O H

OH

OH

OHO

O

O

O H

O H

OH

O H

L. graveolens

(2 7 )

O

O H

CH3

OH

OHO

O

O

O H

O H

OH

O H

L. graveolens

O

OO H

OH

OH

(28)

L. graveolens

O

OO H

OH

OH

O H

(29 )

L. graveolens

42

OLIVEIRA, F.C.

O

OO H

MeO

OH

O H

(30 )

L. graveolens

O

OO H

OH

O H

O H

(31 )

L. graveolens

(32 )

O

O H

OH

OH

O H

O

O H

O H

O

O

OH

O H

L. graveolens

O

OO H

OH

OH

O H

O H

(33 )

L. graveolens

(34 )

O

O H

CH3

OH

OHO

O

O

O H

O H

OH

O H

L. graveolens

O

OO H

OH

OH O H

(35)

L. graveolens

(36 )

O

O H

CH3

OH

OHO

O

O

O H

O H

OH

L. graveolens

(37 )

O

O H

CH3

OH

OHO

O

O

O H

O H

OH

L. graveolens

O H

O

OH

O H

(38 )

L. graveolens

(3 9 )

O

O H

OH

OH

O H

O H

O

OH

O H

O

L. graveolens

43

OLIVEIRA, F.C.

(40 )

O H

O

OH

O H

O H

O H

L. graveolens

(41 )

O

O H

CH3

OH

OH

O H

O

OH

O H

O

O H

L. graveolens

(42 )

O

O H

OH

OH

O H

O H

O

OH

O

O H

L. sidoides

(4 3 )

O

O H

OH

OH

O H

O H

O

OH

O

O H

L. sidoides

(44 )

O

O

OH

O H

MeO

O H

L. sidoides

(4 5 )

O

O

OH

O H

O H

L. triphylla

(46 )

O

O

OH

O H

O H

OMe

MeO

L. triphylla

(47 )

O

O

MeO

O H

O H

MeO

L. triphylla

44

OLIVEIRA, F.C.

(48 )

O

O

MeO

O H

O H

MeO

OMe

L. triphylla

(49)

O

O H

OH

OH

O H

O

O H

O H

O

O

MeO

L. triphylla

(50)

O

O H

OH

OH

O H

O

O H

O H

O

O

MeO

L. triphylla

(51 )

O

O H

OH

OH

O H

O

O H

O H

O

O

OH

OMe

L. aff. gracillis

Para os flavonoides isolados do gênero Lippia realizou-se um levantamento

bibliográfico das atividades biológicas apresentadas por estes. Dentre os flavonoides

relatados, 15 apresentaram diversas atividades biológicas, confirmando o potencial biológico

dos flavonoides isolados deste gênero, conforme mostra a Tabela 9.

Tabela 9 - Relação das atividades biológicas dos flavonoides isolados de plantas do gênero

Lippia

Nº Nome dos flavonoides Atividade biológica Referências

02 Eupafolina Anticâncer ABE et al., 2002

HERRERIAS, 2009

Anticâncer

WILLIAMS, 2004

CALTAGIRONE et al., 2000

TAKAHASHI et al., 1998

MANTHEY et al., 2002

SAEWAN et al., 2011

PICK et al., 2011

HE e Liu, 2006

PLOCHMANN et al., 2007

GRYNBERG, 2009

45

OLIVEIRA, F.C.

04

Quercetina

Inibição da enzima

acetilcolinesterase

JUNG e PARK, 2007

KHAN et al., 2009

Antioxidante

BRIGHENTE et al., 2007

FURUSAWA et al., 2005

FROEHLICHER et al., 2009

SÖHRETOLU et al., 2009

SILVA et al., 2008

VINSON et al., 1995

BURDA e OLESZEK, 2001

GALOTTA et al., 2008

Antibacteriana IWAGAWA et al., 1990

TALEB-CONTINI et al., 2003

Antifúngica TALEB-CONTINI et al., 2003

5

Luteolina

Anticâncer

TAKAHASHI, et al., 1998



HERRERIAS, 2009


Antioxidante

MIEAN e MOHAMED, 2001


SI et al., 2011

SILVA et al., 2008


Antibacteriana XU e LEE, 2001

Antifúngica

XUE-GU et al., 2010

SATHIAMOORTHY et al., 2007

07

Taxifolina

Antioxidante


VINSON et al., 1995


46

OLIVEIRA, F.C.

12

Crisina

Anticâncer

PICK et al., 2011

BASABE et al., 2010

USIA et al., 2002


Antioxidante


VINSON et al., 1995

BURDA e OLESZEK 2001

Antibacteriana ALI et al., 1998

Antifúngica YANG et al., 2011

16

Galangina

Anticâncer USIA et al., 2002

Antioxidante BURDA e OLESZEK, 2001

Antibacteriana MARCUCCI, 1996


18

Apigenina

Anticâncer

CALTAGIRONE et al., 2000


USIA et al., 2002


PICK et al., 2011


HERRERIAS, 2009

Inibição da enzima

acetilcolinesterase

FALÉ et al., 2011

Antioxidante

MIEAN e MOHAMED, 2001


BABAEI et al., 2008

SI et al., 2011

SHARIFIFAR et al., 2009

VINSON et al., 1995



Antibacteriana BASILE et al., 1999

Antifúngica LOPES et al., 2004

20 Escutellareina Anticâncer PLOCHMANN et al., 2007

47

OLIVEIRA, F.C.

24

7-O-β-D-glicosideo

Luteolina

Antioxidante TASKOVA et al., 2003

Toxicidade TASKOVA et al., 2003

28

Pinocembrina

Anticâncer

SIMIRGIOTIS et al., 2008

USIA et al., 2002

Antioxidante SIMIRGIOTIS et al., 2008

Antibacteriana BREMMER e MEYER, 1998


29

Naringenina

Anticâncer

SCHULTZ 2003



Antioxidante


BABAEI et al., 2008

DELAZAR et al., 2008

VINSON et al., 1995


Antibacteriana MALTERUND et al., 1985

31

Eriodictiol

Anticâncer PLOCHMANN et al., 2007

Antifúngica XUE-GU et al., 2010

38

Floretina

Anticâncer



45

Hispidulina

Anticâncer PLOCHMANN et al., 2007

Toxicidade MOREIRA et al., 2003

51 3-metoxi quercetina Inibição da enzima

acetilcolinesterase

JUNG e PARK, 2007

Considerando-se a importância dos flavonóides como metabólitos bioativos,

realizou-se um levantamento bibliográfico das atividades anticâncer, inibição da enzima

acetilcolinesterase, antioxidantes, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade, destes

compostos no período de 1985-2011, nas bases de dados Scifinder scholar e Science direct.

Segundo o levantamento realizadado foram identificados 428 flavonóides diferentes, os quais

foram agrupados nas Tabelas 10 a 15 e nas Figuras 4 a 9.

48

OLIVEIRA, F.C.

3.3 Flavonóides e atividade anticâncer

Vários flavonoides têm demonstrado suprir a carcinogênese em modelos animais

(Tabela 10). Há na literatura relatos de que os flavonoides exercem um efeito benéfico em

vários mecanismos que envolvem a patogenia do câncer. Estudos investigativos têm

demonstrado que os possíveis mecanismos de inibição da carcinogênese por polifenois

estejam relacionados com o aumento da expressão de superóxido dismutase (MANSON,

2003), inibição da cicloxigenase e lipoxigenase (HONG, 2001; SAKATA, 2003), indução de

apoptose e repressão do ciclo celular, como demonstrado em células carcinogênicas humanas

in vitro (MANSON, 2003).

Os flavonoides vêm sendo extensivamente pesquisados como protetores das

células contra danos de raios-X, bloqueando a progressão do ciclo celular e a síntese de

prostaglandinas e inibindo mutações em experimentos animais (REDDY, 2003). Quercetina,

luteolina e genistiteína têm mostrado capacidade de inibir o dano oxidativo de DNA induzido

por irradiação ultravioleta (WEISS, 2003). Além disso, a quercetina expressa efeitos

antiproliferativos e induz a morte celular de células tumorais predominante por mecanismos

apoptóticos em diversas linhagens de células cancerosas (WILLIAMS, 2004). A naringenina é

que é uma flavanona que causa citotoxicidade e apoptose via inibição do crescimento tumoral

em linhagens de células humanas leucêmicas (SCHULTZ, 2003).

Dos flavonoides pesquisados com atividade anticâncer, 58,76% pertencem à

classe das flavonas; 1,03% pertencem à classe das isoflavonas; 27,83% pertencem à classe das

flavanonas; 10,31% pertencem à classe das chalconas e 2,06% pertencem à classe dos

biflavonoides, conforme a Figura 4, p. 52.

Tabela 10 - Flavonoides relatados na literatura com atividade anticâncer.

Nome dos flavonoides Linhagem de

Células

Referências

Quercetina (4) -- WILLIAMS, 2004

Naringenina (29) -- SCHULTZ, 2003

Nobiletina (52) HT-1080 SATO et al., 2002

Quercetina (4)

Apigenina (18)

B16-BL6 CALTAGIRONE

et al., 2000

Genisteina (53)

Apigenina (18)

Luteolina (5)

Quercetina (4)

Floretina (38)

HL-60

TAKAHASHI et

al., 1998

49

OLIVEIRA, F.C.

Agehoustina (54)

Lucidina-dimetil éter (55)

Artemetina (56)

Gnafaliina (57)

LLC-MK2;

C6

SÁNCHEZ et al.,

2001

3,5,6,7,8,3’,4’-heptametoxiflavona (58)

Tangeretina (59)

Nobiletina (52)

Sinensetina (60)

Escutellareina-tetra-O-metil (61)

Nobiletina-5-desmetil (62)

Escutellareina-tetra-metiliso (63)

Sinensetina-5-desmetil (64)

Quercetina 3,5,7,3’,4’- pentametil éter (65)

Quercetina 3,7,3’,4’- tetrametil éter (66)

Limocitrina 3,5,7,4’-tetrametil éter (67)

Quercetina 5,7,3’,4’-tetrametil éter (68)

Limocitrina 3,7,4’-trimetil éter (69)

Quercetina 5,7,3’,4’-tetrametil éter-3-acetato (70)

Limocitrina 3,7,4’-trimetil éter-5-acetato (71)

Quercetina3,7,3’,4’-tetrametil éter-5-acetato (72)

5,8-diidroxi-3,7,3’,4’-tetrametoxiflavona (73)

Ramnetina (74)

Canferol (75)

Crisoeriol (76)

Apigenina (18)

Luteolina (5)

Quercetina (4)

Hesperetina (77)

Naringenina (29)

DMS-114;

HT-29;

ER+; ER-;

MCF-7;

MDA-MB-435;

DU-145;

SK-MEL5

MANTHEY et al.,

2002

Bonaniona A (78)

Bonanniol A (79)

Bonanniol B (80)

Bonanniol C (81)

Bonanniol E (82)

KB;

KB-VIN;

A549;

DU145

ROSSELLI et al.,

2011

Diidroquercetina-7,4’-dimetil éter (83)

Blumeatina (84)

Quercetina (4)

Luteolina-7-metil éter (85)

KB; NCI-H187

SAEWAN et al.,

2011

6-Metoxiflavanona (86)

Pinostrombina (87)

Dimetil pinocembrina (88)

Estrobopinina (89)

Estrobopinina-7-metil éter (90)

Dimetilcriptostrobina (91)

6-Metoxiflavona (92)

Apigenina (18)

Crisina (9)

Crisina-dimetil éter (93)

Canferol (75)

MDCK BCRP

MCF-7 MX

PICK et al., 2011

50

OLIVEIRA, F.C.

Quercetina (4)

Morina (94)

Penduletina (95)

Ayanina (96)

Retusina (97)

Tangeretina (59)

Sinensetina (60)

Nobiletina (52)

3,5,6,7,8,3’,4’-Heptametoxi-flavona (98)

5-Hidroxi-6-metil-7-metoxi-flavona (99)

Estrobocrisina-dimetil éter (100)

Genisteina (53)

Neocalicopterona (101)

Neocalicopterona 4-metil éter (102)

Califlorenon B (103)

4-Hidroxiderrincina (104)

Isobachalcona (105)

Xantoangelol (106)

Xantoangelol F (107)

Xantoangelol H (108)

2”-deoxixantoangelol H (109)

Lespeol (110)

6’-diidro-7”-hidroxilespeol (111)

Isobavachina (112)

Prostratol F (113)

7-O-metil prostratol F (114)

4’-O-geranil naringenina (115)

HL60;

CRL1579;

A549; AZ521

AKIHISA et al.,

2011

Rutina (116) GL-15 SANTOS et al.,

2011

7,7” dimetil lanaraflavona (117)

Agatisflavona (118)

7”-metil agatisflavona (118)

HT-29;

NCl-H460;

RXF-393;

MCF-7;

OVCAR-3

PRADHAN et al.,

2009

Crisina (12)

6,8-Di-C-7-O-trigeranilcrisina (120)

6-C-7-O-Digeranilcrisina (121)

6-C-Geranilcrisina (122)

8-C-Geranilcrisina (123)

3-O-8-C-Digeranilcanferol (124)

Isomacarangina (125)

4’-hidroxi-3,7-dimetoxiflavona (126)

3,7,4’-trimetoxiflavona (127)

HeLa;

A549;

HT-29;

HL-60

BASABE et al.,

2010

2’,4’-diidroxi-3’,5’-dimetil-6’-metoxichalcona (128)

Estercurensina (129)

Cardamonina (130)

(S)-Pinocembrina (28)

SW-480

SIMIRGIOTIS et

al., 2008

2’,4’-diidroxi-6’-metoxi-3’,5’-dimetilchalcona (131)

SMMC-7721;

8898;

SPC-A-1;

YE et al., 2004

51

OLIVEIRA, F.C.

HeLa;

95-D;

GBC-SD

Canferol 3-O-(4”-O-acetilil-α-L ramnopiranosideo

(132) Canferol 3-O-(2”,3”,4”-tri-O-acetil-α-L-

ramnopiranosideo (133)

MCF-7 SMITH et al., 2006

Flavona (134) HT-29 WENZEL et al.,

2000

3-O-[(S)-2-metilbutiroil]pinobanksina (135)

Crisina (12)

Galangina (16)

Apigenina (18)

Pinocembrina (28)

B16-BL6;

HT-1080;

A549;

HeLa

Colon 26-L5

USIA et al., 2002

Canferol 5-O-β-D-glicopiranosideo (136)

(+)-Catequina (137)

(+)-Gallocatequina (138)

HepG2;

Caco-2;

MCF-7

DONG et al., 2007

Quercetina (4) MCF-7 HE e LIU, 2006

Quercetina (4)

Isorhamnetina (139)

Miricetina (140)

Eriodictiol (31)

Apigenina (18)

Floretina (38)

Morina (94)

Canferol (75)

Naringenina (29)

Hesperetina (74)

Escutellareina (20)

Baicaleina (141)

Baicaleina-7-glucuronideo (142)

Crisina (12)

Catequina (137)

Hispidulina (45)

7-metoxi-baicaleina (143)

Luteolina (5)

Cirsimaritina (144)

7-metoxi-apigenina (145)

Xantohumol (146)

Naringenina chalcona (147)

Leucemia

PLOCHMANN et

al., 2007

Desmetoxicentaureidina (148)

Eupafolina (2)

6-hidroxiluteolina (149)

B16F10; MK-1;

HeLa

ABE et al., 2002

Reinoutrina (150)

Hiperina (151)

Miricitrina (152)

Quercitrina (153)

Guaijaverina (154)

SW-480

SIMIRGIOTIS et

al., 2008

5-Hidroxi-7-metoxiflavona (155) MCF-7; KHAMIS et al.,

52

OLIVEIRA, F.C.

5-Hidroxi-6,7-dimetoxiflavona(156)

2,5-Diidroxi-7-metoxiflavanona (157)

2,5-Diidroxi-6,7-dimetoxiflavanona (158)

MCF-7 ADR;

MDAMB435;

MT-1

2004

Flavona (134)

Eupafolina (2)

Apigenina (18)

Luteolina (5)

B16-F10

HERRERIAS,

2009

Amentoflavona (159)

7''-Ometilagatisflavona (160)

Quercetina (4)

Ehrlich;

S180

GRYNBERG,

2009

3-O-metoximinimiflorina (161)

A549;

K562;

WiDR

RUIZ, 1998

Minimiflorina (162)

3-metoximinimiflorina (163)

Mundulinol (164)

Buceracidina A (165)

Buceracidina B (166)

KB;

KB-VIN;

A549;

1A9;

HCT-8;

MCF-7;

PC-3;

U87-MG;

SK-MEL-2;

HAYASHI et al.,

2003

Figura 4 – Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade anticâncer,

registrado na literatura

53

OLIVEIRA, F.C.

3.4 Flavonóides e inibição da enzima acetilcolinesterase

Estudos com animais mostraram que os déficits de memória, cognição e

aprendizado durante o processo de envelhecimento está relacionado ao acúmulo de radicais

livres. Esses sinais assemelham-se àqueles observados na DA (Doença de Alzheimer).

Pesquisas demonstram ainda que o tratamento à base de antioxidantes corrigem problemas

relativos à memória, ao aprendizado e à cognição, provocados por envelhecimento ou

moléstias e seu uso pode ser útil no tratamento da DA (SOCCI et al., 1995; PEERING et al.,

1997; MONTINE et al., 2002).

Flavonoides com mono-O-7-C-glicosídeo apresentam inibição da enzima

acetilcolinesterase (RAUTER et al., 2005). A presença de um açúcar (7-O-glicosídeo), um

substituinte 4-OMe, o comprimento da cadeia de glicosídeo e as ligações interglicosídicas da

cadeia de açúcar também são importantes e/ou necessários para a atividade (FAN et al.,

2008).

A presença de um grupo hidroxila livre em C-7 no anel A é importante para a

atividade. A hidratação do grupo prenila em C-3 diminui significativamente a potência de

inibição (KIM et al., 2011). Nas flavonas, um grupo hidroxila em C-5 em vez de um

grupo metóxi em C-5 e a presença de um grupo metóxi em C-3 reduziu a potência inibitória.

Entretanto, um grupo metoxi adicional em C-4’ melhora a atividade inibitória (SAWASDEE,

et al., 2009).

Dos 54 flavonóides que apresentavam inibição da enzima acetilcolinesterase

(Tabela 11), 46,67% pertencem à classe das flavonas; 20,00% pertecem a classe das

isoflavonas; 13,33% pertencem à classe das flavanonas e 10,31% perencem a classe das

chalconas, conforme a Figura 5, p.55.

Tabela 11 - Flavonóides relatados na literatura com atividade de inibição da enzima

acetilcolinesterase.

Nome dos flavonóides Referências

8-metoxiquercetina 3,7-O-a-L-ramonopiranoseo (167)

8-metoxikanferol 3,7-di-O-raminosídeo (168)

MORAIS et al.,

2007

Genisteína (53) EXNER et al.,

2001

Genisteina-8-C-glicosídeo (169)

Genisteina-7-O-glicosídeo (170)

Genisteina-5-O-metil (171)

54

OLIVEIRA, F.C.

Genisteina-7-O-glicosídeo-5-O-metil (172)

Apigenina-7-O-glicosídeo (173)

Luteolina-7-O-glucosideo (174)

Apigenina-7-O-(2-O-glucosilglicosídeo (175)

Hesperidina (176)

Luteolina 7,3-di-O-glicosídeo (177)

RAUTER et al.,

2009

Luteolina-7-O-glicuronídeo (178)

Apigenina 7-O-glicuronideo (179)

Acacetina-7-O-glicuronideo (180)

Luteolina glucuronideo (181)

Apigenina (18)

FALÉ et al., 2011

5’-geranil-4’-metoxi-5,7,2’-triidroxiflavona (183)

5’-geranil-5,7,2’,4’-tetrahidroxiflavona (184)

Kkuwanon U (185)

Kuwanon E (186)

Kuwanon C (187)

Morusina (188)

Morusinol (189)

Ciclomorusina (190)

NeocIclomorusina (191)

KIM et al., 2011

Tilirosideo (192)

Quercetina-3-Metoxi (51)

Quercitrina (153)

Quercetina (4)

JUNG e PARK,

2007

Quercetina (4)

Macluraxantona (193)

KHAN et al.,

2009

2-(3-(1-Benzilpiperidina-4-iloxi)fenil)-6,7-dimetoxicroman-4-ona (194)

2-(3-((1-Benzilpiperidina-4-il)metoxi)fenil)-6,7-dimetoxicroman-4-ona (195)

3-(4-(1-Benzilpiperidina-4-iloxi)fenil)-6,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona (196)

3-(4-((1-Benzilpiperidina-4-il)metoxi)fenil)-6,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona

(197)



(199)



(201)

2-(3-(1-Benzilpiperidina-4-iloxi)fenil)-6,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona(202)


(203)

(E)-3-(4-(1-Benzilpiperidina-4-iloxi)fenil)-1-(2-hidroxi-4,5-

dimetoxifenil)prop-2-en-1-ona (204)

(E)-3-(4-((1-Benzilpiperidina-4-il)metoxi)fenil)-1-(2-hidroxi-4,5-

SHEN et al., 2009

55

OLIVEIRA, F.C.

dimetoxifenil) prop-2-en-1-ona (205)

5,7,4’-trimethoxiflavona (206)

5,7-dimetoxiflavona (207)

3,5,7,4’-tetrametoxiflavona (208)

3,5,7,3’,4’-pentametoxiflavona (209)

5-hidroxi-7,4’-dimetoxiflavona (210)

5,3’-diidroxi-3,7,4’-trimetoxiflavone (211)

SAWASDEE et

al., 2009

Canferol-8-lavandulil (212)

Kushenol C (213)

Kuraridina (214)

Kurarinona-2’-metoxi (215)

Isoxanthohumol (216)

Maackiaina (217)

JUNG et al., 2010

Figura 5 - Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade inibição da

enzima acetilcolinesterase, registrado na literatura

3.5 Flavonóides com atividade antioxidante

Vários estudos classificam a ação dos flavonóides como agentes antioxidantes,

cujo, o mecanismo de ação têm por base a modulação de sinal das vias intracelulares

importantes para a função celular. A baixa toxicidade e a elevada acessibilidade favorecem os

flavonóides como compostos biologicamente ativos para prevenir e tratar danos causados pelo

stress (GOMES et al., 2008).

As propriedades antioxidantes dos flavonóides são devido a vários mecanismos

diferentes, tais como, eliminação de radicais livres, quelação de íons metálicos como ferro e

56

OLIVEIRA, F.C.

cobre, e inibição de enzimas responsáveis pela geração de radicais livres. Dependendo da

estrutura, os flavonóides são capazes de limpar praticamente todos os ROS (radicais livres)

conhecidos, incluindo o superóxido, peróxido de hidrogênio, radicais hidroxila, oxigênio

singlete, alcóxi, aroxi e peroxil radicais, assim como alquila, arila e nitrogênio-

radicais. Assim, os flavonóides podem proteger os biossistemas contra o ataque dos radicais

livres que podem estar envolvidos em vários tipos de câncer e doenças coronárias

(VAN ACKER et al., 1996; BENAVENTE-GARCIA et al., 1997).

Quanto maior o número de grupos hidroxila no anel B, maior o potencial anti-

radical dos flavonóides. No entanto, a ligação dupla entre C2-C3 aparentemente não contribui

para a capacidade de doação de hidrogênio dos flavonóides na ausência de uma estrutura

polihidroxilada no anel B. Estes grupos hidroxila ajudam a estabilizar o radical ariloxil após a

doação de hidrogênio no processo de eliminação dos radicais livres (CAO et al., 1997).

As substituições orto-hidroxila, seja no anel B ou no anel A, são as

características mais importantes para a atividade anti-radical de flavonóides,

(YOKOZAWA et al., 1998).

Dos 199 flavonóides que apresentam atividade antioxidante (Tabela 12), 62,79%

pertencem à classe das flavonas; 4,65% pertecem à classe das isoflavonas; 33,95% pertencem

à classe das flavanonas; 18,60% perencem à classe das chalconas; 2,56% pertencem à classe

das bicatequinas; 15,38% pertencem à classe das catequinas; 5,13% pertencem à classe das

diidrochalconas; 2,25% pertencem à classe dos biflavonóides; 3,37% pertencem à classe das

isoflavanonas e 6,74% pertencem à outras classes de flavonóides, conforme a Figura 6, p. 61.

Tabela 12 - Flavonóides relatados na literatura com atividade antioxidante

Nome dos flavonóides Referências

Rutina (116)

Chalconaringenina (147)

Canferol-3-O-rutinosídeo (218)

LE GALL et al., 2003

Quercetina glicosilada (219)

Luteolina (5)

Apigenina (18)

CROZIER et al., 1997

MIEAN e

MOHAMED, 2001

Aromadendrina (219)

Naringenina (29)

Taxifolina (7)

Luteolina (5)

Apigenina (18)

Quercetina (4)

BRIGHENTE et al.,

2007

57

OLIVEIRA, F.C.

Canferol-3-O-a-L-ramnopiranosil-(1,2)-b-D-glucopiranosil cafeico

(220)

Canferol (75)

Crisina (12)

Luteolina (5)

3,7-diidroxiflavona (221)

Baicaleina (141)

3,4’-diidroxiflavona (222)

2’,3-diidroxiflavona (223)

Canferol (75)

Canferol 4’-O-metileter (224)

Quercetina (4)

Miricetina (140)

Morina (94)

Fisetina (225)

3,3’,4’-triidrixiflavona (226)

3-metoxi-3’,4’-diidroxiflavona (227)

Quercetina-3-O-glucosideo (228)

Quercetina-4’-O-glucosideo (229)

3,2’,6’-triidroxiflavona (230)

FURUSAWA et al.,

2005

Miricetina 3-O-(3”-O-acetil)-a-L-ramnosideo (231)

Miricetina 3-O-a-L-ramnosideo (232)

Miricetina 3-O-b-D-glucosideo (234)

Quercetina 3-O-(3”-O-acetil)-a-L-ramnosideo (235)

Quercetina 3-O-a-L-ramnosideo (236)

Quercetina 3-O-b-D-glucosideo (237)

Helicrisina B (238)

Isosalipurposideo (239)

AGNIHOTRI et al.,

2008

Quercetina 3-O-ramnosideo (240)

Luteolina 7-O-ramnosideo (241)

Isoramnetina 3-O-rutinosideo (242)

Canferol 3-O-ramnosideo (243)

Apigenina (18)

Naringenina (29)

BABAEI et al., 2008

Luteolina (5)

Apigenina (18)

SI et al., 2011

Neobavaisoflavona (244)

8-prenildaidzeina (245)

Isobavachalcona (246)

Bavachinina (247)

Corilifol A (248)

XIAO et al., 2010

isoramnetina 3-Orungiosideo Bavachinina (249)

3’-O-metilorobol Bavachinina (250)

AHMAD et al., 2010

Isoorientina (251) DU et al., 2010

58

OLIVEIRA, F.C.

Isovitexina 6″-O-E-p-coumarate (252)

Quercetina (4)

Quercetina 3-O-β –glucopiranosideo (253)

Quercetina 3-O-β –galactopiranosideo (254)

Quercetina 3-O-(2”-O-galloil)-β-glucopiranosideo (255)

Quercetina 3-O-(2”-O-galloil)-β –galactopiranosideo (256)

Quercetina 3-O-(6”-O-galloil)-β-glucopiranosideo (257)

Quercetina 3-O-(6”-O-galloil)-β-galactopiranosideo (258)

Quercetina-3-O−α-arabinofuranosideo (259)

Quercetina-3-O-α-ramnopiranosil-(1→6)-β-glucopiranosideo (260)

SÖHRETOLU et al.,

2009

Procianidina (267)

Quercetina (4)

Rutina (116)

Epicatequina (268)

Hiperosideo (269)

FROEHLICHER et al.,

2009

Rutina (116)

Crisoeriol 7-O-rutinosideo (270)

Canferol 3-Oglucosideo (271)

Crisoeriol 7-O-glucosideo (272)

Naringenina (29)

DELAZAR et al., 2008

Rutina (116)

Apigenina (18)

Apigenina 3’,6-dimetoxi (273)

Apigenina 4’,7 dimetoxi (274)

SHARIFIFAR et al.,

2009

Canferol 5-O-â-D-glucopiranosideo (275)

(+)-Catequina (276)

(+)-Gallocatequina (277)

(-)-Epicatequina (268)

3,5,7,3’,4’,5’-hexahidroxiflavanona-3-O-β-D-glucopiranosideo

(278)

3,5,7,3’,4’-pentahidroxiflavona-3-O-β-D-glucopiranosideo (279)

DONG et al., 2007

Quercetina (4)

Hiperosideo (269)

Rutina (116)

Isoquercitrina (280)

Quercitrina (153)

Canferol (75)

Luteolina (5)

SILVA et al., 2008

Apigenina 6-neohesperidose (281)

Canferol 3-robinobiosideo (282)

Canferol 3-O-a-L-ramnopranosil-(1 6)-β-D-galactopiranosideo

(283)

Rutina (116)

ABRAHAM et al.,

2008

2’,4’-diidroxi-3’,5’-dimetil-6’-metoxichalcona (284)

59

OLIVEIRA, F.C.

Estercurensina (285)

Cardamonina (286)

(S)-pinocembrina (28)

SIMIRGIOTIS et al.,

2008

Abacopterina E (287)

Abacopterina F (288)

Abacopterina G (289)

Abacopterina H (290)

Abacopterina I (291)

Trifillina B (292)

Eruberina A (293)

Astragalina (294)

Contigoside B (295)

ZHAO et al., 2007

Genisteina (54)

Apigenina (18)

Baicaleina (141)

Crisina (12)

Flavona (134)

Hesperitina (77)

Hesperetina rutinosideo (296)

Neohesperidina (297)

Naringenina (29)

Quercetina (4)

Taxifolina (7)

Miricetina (140)

Rutina (116)

Morina (94)

Canferol (75)

Epigallocatechina 3-gallato (298)

Epicatechina 3-gallato (299)

Epigallocatechina (300)

Catechina (137)

VINSON et al., 1995

Canferol (75)

Galangina (16)

Quercetina (4)

Morina (94)

Robinetina (301)

Fisetina (225)

Canferide (302)

3-hidroxiflavona (303)

Laricitrina (304)

Laricitrina 3’-O-glucosideo (305)

Miricetina (140)

Hesperetina (77)

3,5,7,3’,4’,5’-hexametoxiflavona (306)

60

OLIVEIRA, F.C.

3,5,7,3’,4’-pentametoxiflavona (307)

Laricitrina 3,3’-O-diglucosideo (308)

Flavona (134)

5-hidroxiflavona (312)

Quercetina 3-O-glucosideo-7-O-rhamnosideo (309)

Laricitrina 3,7,3’-O-triglucosideo (310)

Rutina (116)

Taxifolina (7)

Naringenina (29)

GB-1a (biflavanona) (319)

Canferol 3,7-O-diramnosideo (311)

Formononetina (321)

Biochanina A (322)

Crisina (12)

Flavanona (316)

Fustina (318)

Genisteina (53)

Luteolina 7-O-glucosideo (24)

8-metoxiflavona (313)

Apigenina 8-C-glucosideo (314)

GB-1 (biflavanona) (320)

Daidzeina (323)

Naringina (317)

Apigenina 7-O-glucosideo (315)

Apigenina (18)

BURDA e OLESZEK,

2001

Aromadendrina (219)

Naringenina (29)

Taxifolina (7)

Luteolina (5)

Apigenina (18)

Quercetina (4)

Canferol (75)

Canferol-3-O-α-L-ram(1 2)-β-D-glc (324)

BRIGHENTE et al.,

2007

Luteolina-7-diglucuronideo (325) HENNEBELLE et al.,

2008

Luteolina 7-O-β-d-glucosideo (24)

Quercimeritrina (326)

Quercitrina (153)

TASKOVA et al., 2003

(+)-Catequina (137)

(-)-Epicatequina (268)

(+)-Astilbina (327)

Rutina (116)

Quercetina (4)

GALOTTA et al., 2008

Naringenina (29) ALMEIDA et al., 2010

61

OLIVEIRA, F.C.

Figura 6 – Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade antioxidante,

registrado na literatura.

3.6 Flavonóides com atividade antibacteriana

Os flavonóides são conhecidos por serem sintetizados por plantas em reposta a

infecções microbianas, justificando assim sua ação antimicrobiana frente a vários

microorganismos. Esta atividade se dá provavelmente devido a habilidade de complexação

com a parede bacteriana (COWAN, 1999).

Uma série de flavonas, flavonóis, flavanonas, e isoflavonas, bem como algumas

de seus derivados metoxilados, isoprenilados e acilados mostraram atividade antibacteriana.

De acordo com a Tabela 13, p. 62, os flavonóides são eficazes no combate as bactérias, sendo

que foram encontrados 63 flavonóides ativos.

Isoflavononas contendo grupos prenila tem melhor atividade contra bactérias

Gram-positivas como Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis. Esta atividade é observada

quando os grupos prenila estão localizados em posições C-6 ou C-8 no anel A e C-3' ou C-

5' no anel B (BOJASE et al., 2002).

A maior atividade antimicrobiana contra Proteus vulgaris e Staphylococcus

aureus, para alguns flavonóides esta relacionada à presença de grupos hidroxilas nos

carbonos 3', 4', 5' no anel B e no C-3. Epigalocatequina e diidrorobinetina exibiram fraca

atividade antimicrobiana, indicando que a ligação dupla entre C-2 e C-3, não é importante

para atividade antibacteriana (MORI et al.,1987).

62

OLIVEIRA, F.C.

Flavonas metiladas exibem atividade antibacteriana principalmente

contra bactérias Gram-positivas. Os flavonóides que apresentam grupos hidroxila nos

carbonos C-5 e C-7 e com três substituições no anel B são ativos. Por exemplo, a atividade

de 5,7,4'-triidroxi-3',5'-dimetoxiflavona contra bactérias Gram-positivas S. aureus era muito

maior do que a de 7,4'-diidroxi-3', 5'-dimetoxiflavona (ZHENG et al., 1996).

Flavonóides que apresentam grupos hidroxilas no anel B aumentam sua atividade

antimicrobiana, quando comparados com as flavonas que não possuem grupos hidroxila no

anel B. Este fato pode levantar a hipótese de que o mecanismo de ação seja em alvos na

membrana plasmática. Compostos lipofílicos podem interromper a estrutura da membrana

microbiana e a maior hidroxilação do composto pode levar a maior atividade antimicrobiana

por aumento de toxicidade aos microrganismos (COWAN, 1999).

Dos flavonóides levantados com atividade anticâncer 61,90% pertencem à classe

das flavonas; 23,81% pertencem à classe das flavanonas; 2,38% perencem à classe das

chalconas, 2,38% pertencem à classe dos biflavonóides e 9,52% pertencem à outras classes de

flvonóides, conforme a figura 7, p. 65.

Tabela 13 - Flavonóides relatados na literatura com atividade antibacteriana.

Nome dos flavonóides Bactérias Referências

Crisina (12) Ps. Aeruginosa ALI et al., 1998

Apigenina (18)

Vitexina (328)

Saponarina (329)

Lucenina 2-O-glicosídeo (330)

P. vulgaris

P.mirabilis

Ps. aeruginosa

E.coli

K. pneumoniae

E. cloacae

BASILE et al., 1999

OKSUS et al., 1984

5,7-diidroxi-4’,6,8-trimetoxiflavona (331)

5,6-diidroxi-4’,7,8-trimetoxiflavona (332)

B. subtilis

(MTCC121)

S. aureus

(MTCC96)

E. coli (MTCC68)

S.typhimurium

(MTCC98)

BRAHMACHARI et

al., 2011

5-Hidroxi-4’,3,7-trimetoxiflavona (333)

3,5,7-trihydroxy-4’-metoxiflavona (334)

E.coli

(ATCC25922)

S. blanc

LEFAHAL et al., 2010

Quercetina-3-O-rhamnoside (336)

Quercetina-O-glicosídeos

(3-O-glicosídeo (328),

Sl. maltophilia

63

OLIVEIRA, F.C.

3-O-galactosideo (335),

3'-O-galactosideo (336),

3-O-rutinosideo (337),

3-O-galactoglucosideo (338),

7-O-glicosídeo (339)

E. cloacae WAAGE e HEDIN,

1985

Canferol-3-O-(3"-Z-p-coumaroil)- (6"-O-E-

feruloil)-β-glicopiranosídeo (340)

B cereus

S. aureus

S. epidermidis

LIU et al., 1999

Quercetina (4)

Quercetina 3-arabino-piranoside-2"-galato

(342)

E. coli

IWAGAWA et al.,

1990

Tiliroside (343)

S. aureus

S. epidermidis

E. coli

Ps. aeruginosa

K. pneumoniae

MITROKOSTA et al.,

1993

Naringenina (29)

E coli

S.Staphylococcus

E faecalis

MALTERUND et al.,

1985

Pinocembrina (28)

Pinocembrina chalcona (147)

S. aureus

S. mutans

BREMMER e MEYER,

1998

PARK et al., 1998

5,7,4'-tri-6-metil-8-isoprenilflavonona (344)

5,7,4'-triidroxi 8-metil-6-isoprenilflavonone

(345)

S. aureus WACHTER et al., 1999

5,3'-dihidroxi-4'-metoxi-6'', 6'' -

dimetilcromeno (7,8,2 ",3") –flavanona (346)

5,7,4 '-tri-6,8-di-(3-metilbutil 2-enilo)-

flavanona (347)

Gram-positivas

Gram-negativas

RAHMAN e GRAY,

2002

Miricetina (140)

Emorina (94)

Quercetagetina (348)

Datiscetina (349)

Robinetina (301)

P. vulgaris

S. aureus

MORI et al., 1987

5,7,4'-tri-3',5'- dimetoxiflavona (350)

7,4'-dihidroxi 3', 5'-dimetoxiflavona (351)

S. aureus

E. coli

ZHENG et al., 1996

Galangina (16) Stenotrophomonas

maltophilia

MARCUCCI, 1996

Luteolina (5)

Mirecettina (140)

S. aureus

resistentes a

meticilina

(MRSA)

XU e LEE, 2001

5,7-dimetoxiflavanona-4’-O-β-D- E. coli;

64

OLIVEIRA, F.C.

glicopiranosídeo (352)

5,7-dimetoxiflavanona-4’-O-[2”-O-(5’”-O-

trans-cinnamoil)-β-D-apiofuranosil]-b-D-


5,7,30-triidroxi-flavanona- 4’-O-β-D-


Naringenina-7-O-β-D-glicopiranosídeo (355)

Rutina (116)

Nicotiflorina (356)

P. aeruginosa;

P.mirabilis;

K. pneumoniae;

A. baumannii;

S. aureus;

E. faecalis;

B. subtilis.

ORHAN et al., 2010

tricina-4’-O-β-L-arabinosídeo (357) S. aureus;

E. coli

PARVEEN et al., 2010

Canferol-3-O-α-L-(2a′,3a′-E-di-p coumaroil)-

ramnosídeo 7-O-(6′′′′-O-acetil-β-D-

glucopiranosil-(1→3)-[α-L-ramnopiranosil-

(1→2)]-β-D-glicopiranosídeo (358)

S. aureus;

B. subtilis;

E.coli;

P. aeruginose

RAO et al., 2007

Kuwanon C (359)

Mulberrofurano G (360)

Albanol B (361)

Soforaflavanona G (362)

Sanggenon D (363)

Papyriflavonol A (364)

5-metilsoforaflavanona B (365)

E. coli;

S. typhimurim;

S. epidermis;

S. aureus

SOHN et al., 2004

Quercetina (4)

5,6,4’-triidroxi-7-metoxiflavona (366)

5,6,3’,4’-tetrahidroxi-7-metoxiflavona (367)

5,7,3’,4'-tetrahidroxi-3-metoxiflavonol (368)

5,7,3’,4'-tetrahidroxiflavona (369)

S. aureus (ATCC

6538);

S. aureus (ATCC

29213);

S. epidermidis

(6ep);

S. sobrinus (87.3);

E. faecalis (ATCC

10541)

TALEB-CONTINI et

al., 2003

4’”-O-metilagatisflavona (370) S. aureus NDONGO et al., 2010

Isoliquiritigenina (371) B. subtilis MACHADO, 2000

Lanceolatina B (372)

Derriobtusona A (373)

S. aureus

SORIANO, 1999

65

OLIVEIRA, F.C.

Figura 7 - Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade antibacteriana,

registrados na literatura.

3.7 Flavonóides com potencial antifúngicos

Devido à capacidade generalizada de flavonóides para inibir germinação de

esporos de patógenos de plantas, eles têm sido propostos para uso contra patógenos

fúngicos do homem (HARBORNE e WILLIAMS, 2000). Segundo o levantamento

bibliográfico realizado, 57 flavonóides paresentaram atividade antifúngica (Tabela 14).

A presença de substituintes doadores de elétrons no anel B, tende a enfraquecer a

atividade antifúngica, enquanto que a presença de substituintes retiradores de elétrons

aumentam esta atividade (LÓPEZ et al., 2001).

Dos 57 flavonóides pesquisados com atividade antifúngica, 35,89% pertencem à

classe das flavonas; 1,03% pertecem a classe das isoflavonas; 33,33% pertencem à classe das

flavanonas; 5,13% perencem a classe dos flavanonois; 2,56% pertencem à classe dos

biflavonóides; 2,56% pertecem à classe das isoflavanonas; 15,38% pertecem à classe das

isoflavonas e 5,13% pertebcem à outras classes de flavonóides, conforme a Figura 8, p. 68.

Tabela 14 - Flavonóides relatados na literatura com atividade antifúngica.

Nome dos flavonóides Fungos Referências

3,5,7,3’,4’-pentahidroxi flavona-3-O-β-D-xilopiranosil-7-

O-α-arabinopiranosil-(1→3)-O-α-L-ramnopiranosideo

(374)

4’-hidroxi-5,7dimetoxi flavona-4’-O-β-xilopiranosil-(1-

F. oxisporum;

A. Níger;

P. digitatum

SATNAMI e

YADAVA,

66

OLIVEIRA, F.C.

3)-O-β-D-glucopiranosil-(1→4)-O-α-L-ramnopiranosideo

(375)

5,2’-diidroxi-6,7dimetoxi isoflavona (376)

3,5,7,3’,4’,5’-hexahidroxi flavona (377)

2011

Pinobanksina (378)

Pinocembrina (28)

Crisina (12)

Galangina (16)

P. italicum

YANG et al.,

2011

Eriodictiol (31)

Homoeriodictiol (379)

Diidroquercetina (380)

Luteolina (5)

F.

graminearum;

S. zeicola

XUE-GU et

al., 2010

(-)-epicatequina3-O-β-glicopiranosídeo (381)

5-hidroxi-3-(4-hidroxilfenil)pirano[3,2-g]cromeno-4(8H)-

ona (382)

6-( p-hidroxibenzil)-taxifolina-7-O-β-D-glicosídeo (383)

Quercetina-3-O-α-glicopiranos-l-(1→2)-β-D-


(–)-epicatequina-(2-(3,4-diidroxifenil)-3,4-diidro-2H-

cromeno-3,5,7-triol (385)

A. alternata;

A. fumigates;

A. niger;

M.

phaseolina;

P. citrii

KANWAL et

al., 2010

3,5-diidroxi-6,7,8-trimetoxiflavona (386) C. albicans SÜZGEÇ-

SELÇUK e

BIRTEKSÖZ,

2011

5,7-dimetoxiflavanona-4’-O-β-D-glicopiranosídeo (387)

5,7,3’-triidroxi-flavanona- 4’-O-β-D-glicopiranosídeo

(388)

Naringenina-7-O-β-D-glicopiranosídeo (389)

5,7-dimetoxiflavanona-4’-O-[2”-O-(5’”-O-trans-

cinnamoil)-β-D-apiofuranosil]-b-D-glucopiranosideo

(390)

Rutina (116)

Nicotiflorina (356)

C. albicans

C. krusei

ORHAN et

al., 2010

Tricina-4’-O-β-L-arabinosideo (357) S.

typhimurium;

C. albicans

PARVEEN et

al., 2010

5, 7-diidroxi-3, 6,4’-trimetoxiflavona-7-O-α-L-

xilopiranosil-(1--3)-O-α-L-arabinopiranosil-(1→4)-O-β-

D-galactopiranosideo (391)

F.oxysporum;

P. digitatum;

A. niger;

T. viride

YADAVA e

TIWARI,

2007

3′-(3R-acetoxi-5,5-dimetilciclopent-1-eno)-4′-O-

metilescutellareina 7-O-(6′′′′-O-acetil-β-D-

glucopiranosil-(1→3)-[α-L-ramnopiranosil-(1→2)]-β-

67

OLIVEIRA, F.C.

D-glucopiranosideo (392)

Canferol-3-O-β-D-glucopiransoil-(1→4)-α-L-

ramnopiranosil-(1→6)-β-D-galactopiranosideo 7-O-(6′′′′-

O-acetil-β-D-glucopiranosil-(1→3)-[α-L-

ramnopiranosil-(1→2)]-β-D-glucopiranosideo (393)

Canferol-3-O-β-D-glicopiranosil(1→2)-β-D-(6a′-O-

caffeoil)-glicopiranosídeo 7-O-(6′′′′-O-acetil-β-D-

glicopiranosil-(1→3)-[α-L-ramnopiranosil-(1→2)]-β-

D-glicopiranosídeo (394)

Canferol-3-O-α-L-(2a′,3a′-E-di-p-coumaroil)-ramnosídeo

7-O-(6′′′′-O-acetil-β-D-glicopiranosil-(1→3)-[α-L-

ramnopiranosil-(1→2)]-β-D-glicopiranosídeo (358)

A. Níger;

A. Ochraceus;

A. versicolor;

As flavus;

P.ochrochloro

n;

P.

funiculosum;

T. viride;

C.cladosporioi

des A.

alternate

RAO et al.,

2007

5’-hidroxi-3’,4’,3,6,7-pentametoxiflavona (395)

4’,5,7-triidroxi-3’-O-β-D-glucuronico ácido-6”-metil

(396)

Luteolina (5)

iso-orientina (397)

ester,

T. mentagroph

ytes;

C. neoformans

SATHIAMOO

RTHY et al.,

2007

Canferol (75)

(±)-Catequina (137)

C. rugosa RUIZ et al.,

2006

Orientina (398)

M. canis;

M.gypseum;

T.

mentagrophyte

s; T. rubrum;

E. flocosum;

C. neoformans

CAMPOS et

al., 2005

Amentoflavona (399) C. albicans JUNG et al.,

2007

Hildegardiol (400)

2-Hidroximaackiaina (401)

Farrerol (402)

C. albicans;

C. glabrata;

C. krusei

MERAGELM

AN et al.,

2005

Papiriflavonol A (364)

Kuraridina (403)

Soforaflavanona D (404)

Sophoraisoflavanona A (405)

C. albicans,

S. cerevisiae

SOHN et al.,

2004

4’-metoxicanferol-7-(acetiloxi)-3,5-O-α-L-ramnosideo

(406) Apigenina (18)

C. cladosporioi

LOPES et al.,

68

OLIVEIRA, F.C.

Figura 8 - Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade antifúngica,

registrados na literatura

3.8 Flavonóides com atividade de citotoxicidade

O ensaio de atividade de citotoxicidade sobre Artemia salina tem sido inserido

dentro da rotina de trabalho de muitos laboratórios de química de produtos naturais, no intuito

de selecionar e monitorar o estudo fitoquímico de extratos de plantas na procura de

substâncias bioativas (HAMBURGER, HOSTETTMANN, 1991).

Quercetrina (153)

7-O-metoxiquercetrina (407)

des 2004

Biochanina A 7-O-β-D-xilopiranosil-(1--6)-β-D-


Biochanina A 7-O-β-D-apiofuranosil-(1--6)-β-D-

glicopiranosíde (409)

Biochanina A 7-O-β-D- glicopiranosídeo (410)

Biochanina A 7-O-β-D-apiofuranosil-(1--5)-β-D-

apiofuranosil-(1--6)-β-D-glicopiranosídeo (411)

C. krusei

C. glabrata

C. albicans

C. parapsilosis

C. neoformans

GARCEZ et

al., 2010

Quercetina (4)

C. albicans

(ATCC 1023);

C. albicans;

C. tropicalis

TALEB-

CONTINI et

al., 2003

Cudraflavanona B (412)

Wighteona (413)

C. neoformans;

A. Fumigates;

A. nidulans;

C. glabrata

FUKAI et al.,

2003

69

OLIVEIRA, F.C.

Diversos trabalhos tentam correlacionar a toxicidade sobre Artemia salina com

atividades como antifúngica, viruscida e antimicrobiana (MACRAE, HUDSON, TOWERS,

1988) parasiticida (SAHPAZ et al., 1994), tripanossomicida (ZANI et al., 1995), alelopática,

entre outras.

Dos 21 flavonóides pesquisados com atividade de citotoxicidade (Tabela 15),

46,67% pertencem à classe das flavonas; 13,33% pertecem a classe das flavanonois; 20,00%

pertencem à classe das flavanonas e 6,67% pertencem à classe dos biflavonóides e 13,33%

pertecem à ouras classes de flavonóides, conforme a Figura 9, p. 70.

Tabela 15 - Flavonóides relatados na literatura com atividade de citotoxicidade frente as

larvas de Artemia salina.

Nome dos flavonoides Referências

Biochanina A (322) GARCEZ et al., 2010

Luteolina 7-O-glucosideo (24) TASKOVA et al., 2003

Miricetina 3-O-(2”-O-galloil)-α-ramnopiranosideo 7- metil

éter (414)

Miricetina 3-O-(3”-O-galloil)-α-ramnopiranosideo 7-metil

éter (415)

Miricetina 3-O-(3”-O-galloil)-α-ramnopiranosideo (416)

Miricitrina (153)

LEE et al., 2000

2,5-Diidroxi-7-metoxiflavanona (417)

2,5-Diidroxi-6,7-dimetoxiflavanona (418)

5-Hidroxi-7-metoxiflavona (419)

5-Hidroxi-6,7-dimetoxiflavona (420)

KHAMIS et al., 2004

CIclochampedol (421) ACHMAD et al., 1996

Afzelina A (422)

Afzelina B (423)

Afzelina C (424)

AWANTU et al., 2011

4’”-O-Metilagatisflavona (425) NDONGO et al., 2010

Hispidulina (45) MOREIRA et al., 2003

3-O-metílico de minimiflorina (161)

3-hidroxi-minimiflorina (162)

RUIZ, 1998

(E)-7-O-Metil pongamol (426)

Lanceolatina B (427)

Derriobtusona A (428)

SORIANO, 1999

70

OLIVEIRA, F.C.

Figura 9 - Gráfico representando a distribuição de flavonóides com atividade de

citotoxicidade, registrados na literatura.

71

OLIVEIRA, F.C.

3.9 Estruturas químicas dos flavonóides relatados na literatura com atividade

anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase, antioxidante, antibacteriana,

antifúngica e citotoxicidade.

Figura 10 - Flavonas com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,

antioxidante, antibacteriana, antifúngica e citotoxicidade.

O

O

R 7

R 8

R 5

R 6

R 9

R 4

R 1

R 2

R 3

Nº R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9

52 OMe OMe OMe OMe H H OMe OMe H

54 OMe OMe OMe OMe H OM

e

OMe OMe OMe

55 OMe OMe OMe OMe H H H H H

57 OMe OH H OH OMe H H H H

58 OMe OMe OMe OMe OMe H OMe OMe H

59 OMe OMe OMe OMe H H H OMe H

60 H OMe OMe OMe H H OMe OMe H

61 H OMe OMe OMe H H H OMe H

62 OMe OMe OMe H H H OMe OMe H

63 OMe OMe H OMe H H H OMe H

64 H OMe OMe OH H H OMe OMe H

65 H OMe H OMe OMe H OMe OMe H

66 H OMe H OH OMe H OMe OMe H

67 OMe OMe H OMe OMe H OMe OMe H

68 H OMe H OMe OH H OMe OMe H

69 OMe OMe H OH OMe H OMe OMe H

70 H OMe H OMe Acetila H OMe OMe H

71 OMe OMe H Acetila OMe H OMe OMe H

72 H OMe H Acetila OMe H OMe OMe H

73 OH OMe H OH OMe H OMe OMe H

74 H OMe H OH OH H OH OH H

75 H OH H OH OH H OH H H

76 H OH H OH H H H H H

72

OLIVEIRA, F.C.

92 H H OMe H H H H H H

93 H OMe H OMe H H H H H

94 H OH H OH OH OH H OH H

95 H OH OMe OMe OMe H H OH H

96 H OMe H OH OMe H OH OMe H

97 OMe OH H OMe H H OMe OMe H

98 OMe OMe OMe OMe OMe H OMe OMe H

99 H OMe Me OH H H H H H

100 H OMe Me OMe H H H H H

116 H OH H OH A H OH OH H

120 Ger Ger Ger OH H H H OH H

121 H Ger Ger OH H H H OH H

122 H H Ger OH H H H H H

123 Ger H H OH H H H H H

124 Ger H H OH OGer H H OH H

125 H H H OH Ger H H OH H

134 H H H H H H H H H

136 H OH H OGlc OH H H OH H

139 H OH H OH OH H OH OH H

140 H OH H OH OH H OH OH OH

141 H OH OH OH H H H H H

142 H OGlc OH H H H H H H

143 H OMe OH OH H H H H H

144 H OMe OMe OH H H H OH H

145 H OMe H OH H H H OH H

148 H OH H OH OH H OMe OMe H

149 H OH OH OH H H OH OH H

150 H OH H OH Xil H OH OH H

151 H OH H OH OGlc H OH OH H

152 H OH H OH ORha H OH OH H


154 H OH H OH OArab H OH OH H

155 H OMe H OH H H H H H

156 H OMe OMe OH H H H H H

167 OMe ORha H OH OH H OH OH H

168 OMe ORha H OH OH H H OH H

173 H OGlc H OH H H H OH H

174 H OGlc H OH H H OH OH H

175 H OGlc-2-

OGlc

H OH H H H OH H

73

OLIVEIRA, F.C.

176 H OGlc H OH H H OGlc OH H

178 H OGlcr H OH H H OH OH H

179 H OGlcr H OH H H H OH H

180 H OGlcr H OH H H H OMe H

181 H ORha(1-

6)Glc

H OH H H H OMe H

182 H OGlc H OH H H H OMe H

183 H OH H OH H OH H OMe

184 H OH H OH H OH H OH

191

OH H OH

OH H OH H

192 H OH H OH O

H

H

OH

O H

O H

O

O

OH

H H OH H

206 H OMe H OMe H H OMe H H

207 H OMe H OMe H H H H H

208 H OMe H OMe OMe H H OMe H

209 H OMe H OMe H H H OMe H

210 H OMe H OH H H H OMe H

211 H OMe H OH OMe H OH OMe H

212

OH H OH OH H H OH H

213 OH H OH OH OH H OH H

220 H OH H OH Rha-Glc H H H H

221 H H H H OH H H H H

222 H H H H OH H H OH H

223 H H H H OH OH H H H

224 H OH H OH OH H H OMe H

225 H OH H H OH H OH OH H

226 H H H H OH H OH OH H

227 H H H H OMe H OH OH H


229 H OH H OH OH H OH OGlc H

230 H H OH H OH OH H H H

231 H OH H OH ORha-(3”-OAc) H OH OH OH

74

OLIVEIRA, F.C.

232 H OH H OH ORha H OH OH OH

234 H OH H OH OGlc H OH OH OH

235 H OH H OH ORha-(3”-OAc) H OH OH H

236 H OH H OH Rha H OH OH H



241 H ORha H OH H H OH OH H

242 H OH H OH ORut H OMe OH H

243 H OH H OH ORha H H OH H

247 H OH

H H H H OH H

249 H OH H OH OGlc-3-Rha H OMe OH H

251 H OH Glc OH H H OH OH H

252 H OH Glc-

O

O

OH OH H H OH OH H

253 H OH H OH OGlcp H OH OH H

254 H OH H OH OGalp H OH OH H

255 H OH H OH (2”Ga)OGlcp H OH OH H

256 H OH H OH (2”Ga)OGalp H OH OH H

257 H OH H OH (6”Ga)OGlcp H OH OH H

258 H OH H OH (6”Ga)OGalp H OH OH H

259 H OH H OH OArab H OH OH H

260 H OH H OH ORha(1-6)Glcp H OH OH H

269 H OH H OH OGalcts H OH OH H

280 H OH H OH OGlcp H OH OH H

281 H OH H OH ORha(1-6)Galact. H H OH OH

282 H OH H OH ORha(1-2)Galact. H H OH OH

75

OLIVEIRA, F.C.

283 H OH H OH ORha-6-Galact. H H OH OH

301 H OH H H OH H OH OH OH


303 H H H H OH H H H H

304 H OH H OH OH H OH OH OMe

305 H OH H OH OH H OGlc OH OMe


307 H OMe H OMe OMe H OMe OMe OMe

308 H OH H OH OGlc H OGlc OH OMe

309 H ORha H OH OGlc H OH OH H

310 H OGlc H OH OGlc H OGlc OH OMe

311 H ORha H OH ORha H H OH H

312 H H H OH H H H H H

313 H OMe H H H H H H H

314 OGlc OH H OH H H H OH H

315 H OGlc H OH H H H OH H

324 H OH H OH ORha(1-2)Glc H H OH H

325 H OdiGlc H OH H H OH OH H

326 H OGlc H OH OH H OH OH H

328 Glc OH H OH H H H OH H

329 H OGlc Glc OH H H H OH H

330 Glc OH Glc OH H H OH OH H

331 OMe OH OMe OH H H H OMe H

332 OMe OMe OH OH H H H OMe H

333 H OMe H OH OMe H H OMe H

76

OLIVEIRA, F.C.


335 H OH H OH OGalt H H OH H

336 H OH H OH OH H H OGalt H

337 H OH H OH ORha H H OH H

338 H OH H OH OGaltGlc H H OH H

339 H OGlc H OH OH H H OH H

340 H OH H OH OGlcp(3”,6”-

OH

C H 3

O

H

H )

H H OH H

341 H OH H OH OGlcp(3”-A,6”-

OH

CH 3

O

H

H

)

H H OH H

342 H OH H OH OArabps H OH OH H

343 H OH H OH O

O H

O H

O H

O

O

OH

H H OH H

356 H OH H OH ORut H H OH H

357 H OH H OH H H OMe OH OMe

359 H OH H OH

OH H OH H

364 H OH O

O H

O H

O H

O

O

OH

OH OH H OH OH O

O H

O H

O H

O

O

OH

366 H OMe OH OH H H H OH H

367 H OMe OH OH H H OH OH H

368 H OMe H OH OMe H OH OH H

369 H OMe H OH H H OH OH H

375 H OMe H OMe H H H OXilp(1-

3)Glc(1-4)Rha

H

377 H OH H OH OH H OH OH OH

77

OLIVEIRA, F.C.

A =

OOH

OH

O H

O

O H

O O H

OH

O G er=O O H

O H

O H

OH

O

Xil=

O -G li=

O

O H

OH O H

O H

O

O -R am =

O

O H

OH O H

OO

O H

OH O H

O

O -A rab=

187 R =

188 R =

O

O

O H

O H

O

O H

R

O H

1 9 6 : n=1

1 9 7 : n=0

1 9 8 : n=1

1 9 9 : n=0

( )n

( )n

N

O

O

MeO

MeO

O

O

O

MeO

MeO

O

N

384 H OH H OH OGlcp(1-4)Glcps H OH OH H

386 OMe OMe Me OH OH H H H H

291 H OXil(1-3)

Ara(1-

4)Galt

OMe OH H H H OH H

395 H OMe OMe OH OMe H OMe OMe H

396 H OH H OH H H OGlcpr

Ac.-6”-

Metil

OH H

397 H OH Glc OH H H OH OH H

398 Glc OH H OH H H OH OH H

406 H CH3CO2 H ORha ORha H H OMe H

407 H OMe H OH ORha H OH OH H

375 H OMe H OMe H H H OXilp(1-

3)Glc(1-

4)Rha

H

419 H OMe H OH H H H H H

420 H OMe OMe OH H H H H H

78

OLIVEIRA, F.C.

OO H

OH

O H

OH

OO H

O H

O

OO H

O H

O

O H

OOH

OH

O H

O

O H

OHOH

O

O

O

O

OH

O H

O

O H

O

O

O H

OO

358

O

O

O

372

R 1 R 2 R 3

414 M e G G

415 M e H G

416 H G GG =

O

O

O

OH

O H O

O H

O H

421

O

OR 2 OR 3

O H

C H 3

OR 1

O H O

O

O H

O H

O H

OOH

OH

O H

O

O H

OHOH

O

O

O

OH

O H

O

O

OO

OH

O H O

OMe

O

O

292

OOH

OH

O H

O O H

OH

O H

OH

O

O HO H

O

CH3

O O H

O H

O H

O

O

O H

OHOH

O

O

O

OH

O H

O

O

OO

OH

O H O

O H

O

393

O O H

OH

O H

OH

OOH

OH

O HO O

O H

O

O H

OHOH

O

O

O

OH

O H

O

O

OO

OH

O H O

O H

O

OHOO

OH

O H

394

79

OLIVEIRA, F.C.

Figura 11 - Isoflavona com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,


O

O

R 2

R 1

R 3

R 5

R 4R 6

Nº R1 R2 R3 R4 R5 R6

53 H OH H OH H OH

169 OH OH H OH H OH

170 H OGlc H OH H OH

171 H OGlc H OMe H OH

244 H OH H H

OH

245

OH H H H OH

248 H OH H H

OH

250 H OH H OH OMe OH

408 H OXil(1-6)Glc H H H OMe

409 H OApi(1-6)Glc H H H OMe

410 H OGlc H H H OMe

411 H OApi(1-5)Api(1-6)Glc H H H OMe

415 H OH H H H OH

O

O

MeO

MeO

O N

( ) n

2 0 0 : n=1

2 0 1 : n=0

N

O

O

MeO

MeO

O

( )n

2 0 2 : n =1

2 0 3 : n =0O O

O H O

O H

3 8 2

80

OLIVEIRA, F.C.

Figura 12 - Flavanonas com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,


O

O

R 7

R 8

R 4

R 3

R 2

R 5

R 9

R 1 R 6

Nº R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 R9 R10 R11

77 H OH H OH H H H OH OMe H H

78 H OH Ger OH H H H H OH H H

79 H OH Ger OH OH H H H OH H H

80 H OH Ger OMe OH H H H OH H H

83 H OMe H OH OH H H OH OMe H H

84 H OH H OH H H H OH H OH H

86 H H OMe H H H H H H H H

87 H OH H OMe H H H H H H H

88 H OMe H OMe H H H H H H H

89 H OH Me OH H H H H H H H

90 H OMe Me OH H H H H H H H

91 Me OMe H OMe H H H H H H H

112

OH OH OH H H H H H H H

113 OH H H H H H H OH H H

114 OMe H H H H H H OH H H

115 H OH H H H H H H

H H

157 H OMe H OH H Me H H H H H

158 H OMe OMe OH H Me H H H H H

177 H OGlc(1-

2)Rha

H OH H H H OH OMe H H

177 H OGlc(1-

2)Rha

H OH H H H OH OMe H H

185 H OH H OH H H OH H OMe

H

186 H OH H OH H H OH H OH

H

81

OLIVEIRA, F.C.

219 H OH H OH OH H H H OH H H

238 H OH H OGlc H H H H OH H H

279 H OH H OH OGalct H H OH OH OH H

296 H ORut H OH H H H OH OMe H H

316 H H H H H H H H H H H

317 H Oneo H OH H H H H H H H

318 H OH H H OH H H OH OH H H

344 Isoprop. OH Me OH H H H H OH H H

345 Me OH Isoprop. OH H H H H OH H H

347

OH

OH H H H H OH H H

352 H OMe H OH H H H H OGlcp H H

353 H OMe H OH H H H H Apf.Glcp H H

354 H OMe H OH H H H OH OGlcp H H

355 H OH H OH H H H H OH H H

362

OH H OH H H OH H OH H H

374 H OArab(1

-6)Rha H OH OXilop H OH OH H H H

378 H OH H OH OH H H H H H H

379 H OH H OH H H OH OMe H H H

380 H OH H OH OH H OH OH H H H

383 H OGlc O H

OH OH H OH OH H H H

387 H OMe H OMe H H H OGlc H H H

388 H OH H OH H H OH OGlc H H H

389 H OGlc H OH H H H OH H H H

402 Me OH Me OH H H H OH H H H

82

OLIVEIRA, F.C.

403 O

OH H OH H OH H OH H H H

404 H OH

OH H OH H OH H H OH

413 H OH

OH H OH H OH H H H

417 H OMe H OH H OH H H H H H

418 H OMe OMe OH H OH H H H H H

O

O H

O H

OO H

O

O H

8 2

OO

O

O H

O H

OH

OH

8 1

OO

OO H

R 2

R 1

R 3

Nº R1 R2 R3

161 H OMe

162 OH OH

163 H OH

164 OH H

165 H OH H

147 OMe OH H

83

OLIVEIRA, F.C.

193 n= 1

194 n= 0

( )n

O

O

MeO

MeO

O

N

195

N

O

O

MeO

MeO

O

O

O H

O

OMe

O

O H

346

O

OHO H

O

O

O H

O O H

O H

O

OOMe

MeO

O

O

390

( )n

Figura 13 - Chalconas com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,


R 5

R 6

OR 4

R 2

R 1

R 3

Nº R1 R2 R3 R4 R5 R6

104 Me OH

H H OH

105 H OH

H H OH

106 Me OH H H OH

107 H OH

H H OH

146 H OH

OMe H OH

147 H OH H OGlc H OH

239 Me OH Me OH OH OH

246

OH H H OH OH

284 H OH Me OH OMe H

285 H OH H OH OMe H

286 H OH H OGlc OMe H

371 H OH H H OH OH

84

OLIVEIRA, F.C.

O

MeO

O H

O

R

108 R = O H

109 R = H

OO H

O H

O

110

OO H

O H

O

111

204 n= 1

205 n= 0

O H

O

MeO

MeO

O

N

( )n

Figura 14 - Biflavonóides com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,


O

OO H

OH

O H

O

OR

OH

O

O H

159 R = H

160 R = M e

O

O

O H

O H

OH

O

O

R 3

O H

OH

R 2

R 1

R 1 R 2 R 3

319 H H O H

320 O H H O H

OOH

O H O

O H

O

O

OH O H

OMe

370

O

O

O H O

OH

O H

OH O H

O

O H

399

O

O H

OO H

OH

OH

O H

O

OMe

425

85

OLIVEIRA, F.C.

Figura 15 - Bicatequina com atividade antioxidante.

OOH

O H

O H

O H

O HOOH

O H

O H

O H

O H267

Figura 16 - Catequinas com atividade antioxidante.

OOH

O H

O H

R 1

O H

R 2

Figura 17 - Diidrochalcona com atividade antioxidante.

O H

O H

OMe

OO H

RutinO

297

Nº R1 R2

268 OH H

276 OH H

277

O H

O H

O H

O

O

H

298

O H

O H

O H

O

O

OH

300 OH H

86

OLIVEIRA, F.C.

Figura 18 – Isoflavanonas com atividade anticâncer, inibição da enzima acetilcolinesterase,


OR 1

R 2 O

R 3

R1 R

2 R

3

321 O H H O M e

322 O H O H O M e

323 O H H O H

OOH

O H O

O H

O H

405

Figura 19 - Flavan-3-ol com atividade antifúngica.

O

O H

O H

R

O H

OH

R

381 O G lcp

385 O H

Figura 20 - Flavanonois com atividade citotoxicidade.

OO

O H O

O H

O H

4 2 2

OO

O H O

O

O H

4 2 3

OO

O H O

O

O

4 2 4

87

OLIVEIRA, F.C.

Figura 21 - Outras clases de flavonóides com atividade inbição da enzima acetilcolinesterase,


O

O

O H

O H

O

O

O H

O

O

O H

O H

O

O

189

OO

OMe

O

373

190

OO H

O H

OH

O

OR 3

OO

R 2

R 1 O

R1 R

2 R

3

287 H H H

288 H H H

289 H O M e H

290 H O M e M e

291 G lc H M e

292 H H M e

OO H

O H

OH

O

OR 2

O HO

R 1

GlcO

R1 R

2

293 C H2O H H

294 M e M e

295 C H2O H M e

O OO

O H

O H

O H

OH

O H

H H

H

360

O OO

O H

O H

O H

OH

O H

361

O

O H

O

O H

O

OH

O H

O

O H

O H

O H

OH

363O

O

O

MeO

OH

H

OH

400

OO

O H

OMe427

O OMe

O

OMe

428

O

O

OO

OH

OH

H

H

401

88

OLIVEIRA, F.C.

4. DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL E CARACTERIZAÇÃO DA COMPOSIÇÃO

QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE L. rigida.

4.1 Determinação estrutural dos metabólitos secundário isolados das folhas de L. rigida

4.1.1 Determinação estrutural de LEF-1

O tratamento cromatográfico da fração LEFD (Item 5.5.4, p. 163) obtida pelo

fracinamento cromatográfico do extrato etanólico das folhas de L. rigida, forneceu um sólido

amorfo amarelo com ponto de fusão entre 122–124 ºC e rotação óptica [α]D = - 0,31 (c = 1,0

MeOH), que foi denominado de LEF-1.

O espectro na região do infravermelho de LEF-1 (Figura 22) mostrou duas bandas

em 3523 e 3148 cm-1

, correspondentes à deformações axiais de ligação O-H, caracterizando a

presença de hidroxila; observou-se também absorções em 2915 e 2849 cm-1

características de

deformação axial de ligação Csp3-H; uma banda em 1644 cm-1

que foi relacionada à

deformação axial C=O de carbonila conjugada; as bandas em 1605 e 1558 cm-1

foram

atribuidas às vibrações de deformação axial de ligação C=C de anel aromático e uma banda

em 1214 cm-1

foi associada às vibrações de deformações axiais de ligações C-O.

Figura 22 – Espectro na região do infravermelho de LEF-1 (KBr)

3523

3523

2915

2849

3523

1605 1644

1558 1214

1380 3148

89

OLIVEIRA, F.C.

O espectro de RMN 1H [500 MHz, (CD3)2CO] (Figura 27 e 28, p. 93) apresentou

quatro sinais na faixa δ 6,35 – 4,99, os quais foram associados a hidrogênios ligados a anel

aromático. Destes, foram assinalados os dubletos centrados em δ 7,39 (2H, d, J = 8,4 Hz) e

6,90 (2H, d, J = 8,4 Hz), relativos a hidrogênios em posição orto. Os outros dois sinais,

referentes a hidrogênios ligados a anel aromático, assinalados em δ 6,04 (1H, d, J = 2,0 Hz) e

6,03 (1H, d, J = 2,0 Hz) foram compatíveis com hidrogênios meta posicionados. Além disso,

foi observado um sinal em δ 3,84 (3H, s) compatível com os hidrogênios de grupo metoxila,

um sinal em δ 5,46 (1H, dd, J = 12,8 e 3,0 Hz) referente a hidrogênios metínico oxigenado e

dois sinais em δ 3,20 (1H, dd, J = 12,8 e 17,1 Hz) e 2,75 (1H, dd, J = 3,0 e 17,1 Hz) referentes

a dois hidrogênios diasterotópicos. Mais dois sinais foram observados em δ 11,10 (1H, s) e

7,74 (1H, s) referentes a duas hidroxilas, sendo a primeira quelada, (Tabela 17, p. 92).

No espectro de RMN 13

C [125 MHz, (CD3)2CO], (Figura 29, p. 94) foram

observadas quatoze linhas espectrais, das quais duas (δ 128,1 e 115,3) foram relacionadas a

dois carbonos cada, após análise do espectro de 1H,

13C-HSQC (Figura 32, p. 95). Comparação

do espectro de RMN 13

C totalmente desacoplado, com RMN 13

C-DEPT 135º, (Figura 30, p.

94), permitiu identificar a presença de um carbono metílico (δ 57,2), um metilênico (δ 44,4) e

sete carbonos monoidrogenados (δ 128,1-79,2), dos quais, um deles (δ 79,2) foi associado a

carbono metínico oxigenado. Os setes sinais restantes foram identificados como carbonos não

hidrogenados, sendo um, característico de carbono carbonílico (δ 198,6), (Tabela 16).



C-BB e DEPT 135° de LEF-1

C CH CH2 CH3 Fórmula molecular

196,8 (C=O) 128,1 (2X) 43,6 55,4 (C-O)c

168,0 (C-O)a 79,2 (C-O)

c

164,1 (C-O)b 115,3 (2X)

163,3 (C-O)c 94,6

157,9 (C-O)a 93,7

129,7

102,9

7 C 7 CH 1 CH2 1 CH3 C16H14O5

a – carbono sp

2 ligado a hidroxila;

b – carbono sp

2 ligado a grupo metoxila;

c – carbono ligado

oxigênio de éter.

90

OLIVEIRA, F.C.

Após análise do espectro de correlação heteronuclear 1H,

13C-HSQC, foi

possível identificar que os sinais em δ 115,3 e 128,1 são referentes a dois átomos de carbonos

cada, totalizando 16 carbonos na estrutura de LEF-1. Estes dados juntamente como o espectro

de massa obtido por impacto eletrônico a 70 eV (Figura 23) forneceu o pico correspondente

ao íon molecular m/z 286,0 daltons, que possibilitou sugerir a fórmula molecalar do composto

(C16H14O5). Apos análise de todos os dados até aqui descritos possibilitou sugerir um

esqueleto flavonônico para LEF-1.

Figura 23 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LEF-1

A análise do espectro de RMN 1H,

1H-COSY (Figura 31, p. 95), confirmou os

acoplamentos dos hidrogênios orto posicionados em H-2’ e H-6’ (δ 7,39) com os hidrogênios

H-3’ e H-5’ (δ 6,90). Além disso, observou-se acoplamento do hidrogênio H-2 (δ 5,46) com o

hidrogênio diasterotópicos H-3a (δ 3,20), assim como, o acoplamento entre os dois

hidrogênios diasterotópicos H-3a (δ 3,20) e H-3b (δ 2,75), como representado na Figura 24.

Figura 24 – Padrão de acoplamentos observados nos espectros de RMN 1H e COSY de LEF-

1

O

O

H

HHa

Hb

H

H

H

H

H

2

34

5

6

78

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '

91

OLIVEIRA, F.C.

Análise do diagrama de contorno do espectro de HMBC (Figura 33 e 34, p. 96)

permitiu identificar os acoplamentos dos hidrogênios em δ 6,04 (H-8), δ 6,03 (H-6) e δ 3,84

(metoxila) com o carbono em δ 169,8 (C-7) determinando a posição da metoxila no carbono 7

do esqueleto flavonoídico. Mostrou também os acoplamentos dos hidrogênios em δ 6,90 (H-

3’ e H-5’) e δ 7,39 (H-2’ e H-6’) com o carbono em δ 157,9 (C-4’) permitido-se determinar a

posição da hidroxila no anel B. Verificou-se também acoplamentos do hidrogênio em δ 6,04

(H-8) com o carbono δ 163,3 (C-9), do hidrogênio δ 6,03 (H-6) com o carbono δ 164,1 (C-5),

determinando a posição da hidroxila no anel A. Os acoplamentos do hidrogênio δ 5,46 (H-2)

com o carbono δ 43,6 (C-3) e acoplamento dos hidrogênios δ 3,20 e 2,75 com o carbono

196,8 (C-4), também foram observados. Figura 25.

Figura 25 – Principais correlações observadas no espectro de HMBC de LEF-1

O

O

O H

OH

H 3 CO

H

HH

H

H

H

H

H

H

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '

A partir dos dados analisados e em comparação com os dados descritos na

literatura (JERZ, WAIBEL, ACHENBACH, 2005) pôde-se confimar para LEF-1 a estrutura

de um flavonóide do tipo flavanona, registrado na literatura como sakuranetina (Figura 26).

Figura 26 - Estrutura química de sakuranetina (LEF-1)

O

O H

OH

MeO

O

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '

3 '

4 '

5 '

6 '2

3

4

Embora a substância sakuranetina (LEF-1) já se encontre descrita na literatura

para o gênero Lippia (ONO, 2006), este é o primeiro relato para a espécie L. rigida.

92

OLIVEIRA, F.C.


13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de LEF-

1, comparados com a literatura (JERZ, WAIBEL, ACHENBACH, 2005 – CDCl3)

HSQC HMBC Sakuranetina

C δC δH 2JCH

3JCH δ

13C

2 79,2 5,46 (1H, dd, J = 12,8 e 3,0

Hz)

Ha-3; Hb-3 H-2’;H-

6’

78,9

3 43,6 3,20 (1Ha, dd, J = 12,8 e 17,1

Hz)

2,75 (1Hb, dd, J = 3,0 e 17,1

Hz)

H-2 43,2

4 196,8 Ha-3; Hb-3 196,0

5 164,1 12,13 (1H, s) H-6 162,9

6 94,6 6,03 (1H, d, J = 2,0 Hz) H-8 94,2

7 168,0 168,0

8 93,7 6,04 (1H, d, J = 2,0 Hz) H-6 95,1

9 163,3 164,1

10 102,9 H-6 103,1

1’ 129,7 H-2; Ha-3;

Hb-3; H-2’;

H-6’

H-3’; H-

5’

130,7

2’ 128,1 7,39 (2H,d, J = 8,4 Hz) 128,0

3’ 115,3 6,90 (2H,d, J = 8,4 Hz) H-2’ H-5’ 115,7

4’ 157,9 H-2’; H-6’ H-3’; H-

5’

156,1

5’ 115,3 6,90 (2H,d, J = 8,4 Hz) H-6’ H-3’ 115,7

6’ 128,1 7,39 (2H,d, J = 8,4 Hz) 128,0

OCH3 55,4 3,84 (3H, s) 55,7

93

OLIVEIRA, F.C.

OH-5

OCH3

3a

3b

Figura 27 - Espectro de RMN 1H de LEF-1 (acetona-d6, 500 MHz)

Figura 28 - Expansões do espectro de RMN 1H de LEF-1 (acetona-d6, 500 MHz)

2’;6’ 3’;5’ 6;8

2

94

OLIVEIRA, F.C.


C de LEF-1 (acetona-d6, 125 MHz)


C – DEPT 135º de LEF-1 (acetona-d6, 125 MHz)

3’ ; 5’

6

10

8 2 3

2’ ; 6’

1’

9

5

7

4 4’

OCH3

6 8 2

3

OCH3 3’;5’

2’;6’

95

OLIVEIRA, F.C.

3Ha 3Hb 3C 3C


1H-COSY de LEF-1 (acetona-d6, 500 MHz)


13C-HSQC de LEF-1 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)

2H 2C

6H 6C

8H 8C

3’H 3’C

5’H 5’C

2’H 2’C

6’H 6’C

2’;6

’

3’;5

’ 6;8

2

2

3a 3b

3a

3b

6;8

3’;5

’

2’;6

’

96

OLIVEIRA, F.C.

3;4

25;26

O

OO H

O

H

HHa

Hb

H

H

H

H

H O H

CH 32

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

5 '

6 '

O

OOH

O

H

HHa

Hb

H

H

H

H

H O H

CH 3

6

1

2

3

4

5

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

O

OO H

O

H

HHa

Hb

H

H

H

H

H O H

CH 3

19

17

2218

20

21

23

24

26

25


13C-HMBC de LEF-1 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)


13C-HMBC de LEF-1 (acetona-d6, 500 x 125

MHz)

1

2

8

5

6

7 9;10

11;12

13;14

15;16

18;19

17

20;21

22

23;24 13;14 3; 4

97

OLIVEIRA, F.C.


O tratamento cromatográfico da fração LEFD (Item 5.5.4, p. 163) obtida pelo

fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das folhas de L. rigida, forneceu um sólido

amorfo amarelo com ponto de fusão entre 192-194 oC e rotação óptica [α]D = - 0, 64 (c = 0,5 ,


Assim como em LEF-1, no espectro na região do infravermelho de LEF-2

(Figura 35), observou-se duas bandas em 3421 e 3097 cm-1

, correspondentes à deformações

axiais de ligação O-H, caracterizando a presença de hidroxila; absorção em 2925 cm-1

característico de deformação axial de ligação Csp3-H; uma banda em 1627 cm-1

foi relacionada

a deformação axial C=O de carbonila conjugada; as bandas em 1602 e 1589 cm-1

foram às

vibrações de deformação axial de ligação C=C de anel aromático e as bandas em 1297 a 1093

cm-1

foram associadas às vibrações de deformações axiais de ligações C-O.


4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

30

40

50

60

70

T%

cm-1

1214 3421

3097

2925

1627 1602

1589

1297

1093

98

OLIVEIRA, F.C.

O espectro de RMN 1H [500 MHz, (CD3)2CO] de LEF-2 (Figura 39 e 40, p. 101)

mostrou dois sinais referentes à hidrogenios pertencentes a anel aromático, um dos quais em δ

5,92 (2H, dd, 2,0 Hz), caracteristico de hidrogenios meta posicionados e o outro em δ 7,35

(5H, m) sugerindo a presença de um anel aromático monosubstituido. Além disso, observou-

se um sinal em δ 5,35 (1H, dd, J = 3 e 13,0 Hz) referente a um hidrogênio metínico

oxigenado; dois sinais em δ 3,00 (1H, dd, J = 3 e 17,0 Hz) e 2,73 (1H, dd, J = 3,0 e 17,0 Hz)

referentes a dois hidrogênios diasterotópicos. Figura 36.


C [125 MHz, (CD3)2CO] (Figura 41, p. 102) de LEF-2

observou-se doze sinais, sendo um destes em δ 198,2 (C-4) referente a carbono carbonilíco,

10 sinais referentes a carbonos de anel aromáticos e um sinal em δ 80,9 (C-2) referente a

carbono com hibridização sp3

oxigenado, na Tabela 18, p. 100.

Após análise do espectro de 1H,

13C HSQC (Figura 42, p. 102), foi possível

identificar que o sinal em δ 126,1 refere-se a dois carbonos e o sinal em δ 128,8 refere-se a

três carbonos, totalizando 15 carbonos na estrutura de LEF-2. O espectro de HSQC permitiu

associar inequivocamente os sinais de todos os hidrogênios a seus respectivos carbonos,

conforme descrito na Tabela 18, p. 100. Após análise de todos os dados até aqui descritos foi

possibilitou sugerir também para LEF-2 um esqueleto flavonônico.



acoplamentos dos hidrogênios H-2 (δ 5,35) com o hidrogênio diasterotópicos H-3a (δ 3,00),

assim como, o acoplamento entre os dois hidrogênios diasterotópicos H-3a (δ 3,00) e H-3b (δ

2,73), como representado na Figura 36.

Figura 36 – Padrão de acoplamentos observados no espectro de RMN 1H e COSY de LEF-2

O

O

H

HHa

Hb

H

H

H

H

H H

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '

O espectro de HMBC (Figura 44, p. 103), mostrou os acoplamentos dos

hidrogênios δ 5,92 (H-6 e H-8) com o carbono em δ 166,8 (C-7) permitido-se confirmar a

posição da hidroxila no carbono 7 do esqueleto flavonoídico. Observou-se também

99

OLIVEIRA, F.C.

acoplamento do hidrogênio δ 5,92 (H-6) com o carbono δ 163,8 (C-5) permitido-se confirmar

a posição da hidroxila quelada no anel A. Além disso, observou-se acoplamentos dos

hidrogênios em δ 5,92 (H-6 e H-8) com os carbonos em δ 96,5 (C-8) e 96,6 (C-6),

respectivamente. Observou-se também acoplamentos do hidrogênio δ 5,92 (H-8) com o

carbono δ 163,0 (C-9), do hidrogênio em δ 5,92 (H-6) com o carbono δ 163,8 (C-5), do

hidrogênio δ 5,35 (H-2) com o carbono δ 40,2 (C-3) e acoplamento dos hidrogênios δ 3,00

(H-3a) e 2,70 (H-3b) com o carbono 195,6 (C-4), como representado na Figura 37 e Tabela

18, p. 100.


O

OO H

H

HH

H

H

H

H

H

H H

OH

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '


literatura (YENJAI et al., 2009) pôde-se confirmar para LEF-2 a estrutura de um flavonóide

do tipo flavanona, registrada na literatura como pinocembrina (Figura 38).

Figura 38 - Estrutura química da pinocembrina (LEF-2)

O

OH

OH

O

Embora a substância pinocembrina (LEF-2) já se encontre relatada na literatura

para o gênero Lippia (LIN et al., 2007), assim com como LEF-1 é a primeira vez que o seu

isolamento a partir da espécie L. rigida é registrado.

100

OLIVEIRA, F.C.



2, comparados com dados da pinocembrina registrados na literatura (YENJAI et al., 2009 –

CDCl3 + CD3OD)

HSQC HMBC Pinocembrina

C δC δH 2JCH

3JCH δ

13C

2 79,1 5,35 (1H, dd, J = 3,0 e

13,0 Hz)

Ha-3; Hb-3 M 79,1

3 40,2 2,73 (1H, dd, J = 3,0 e

17,0 Hz)

3,00 (1H, dd, J = 13,0 e

17,0 Hz)

H-2 43,2

4 195,6 Ha-3; Hb-3 H-2 195,6

5 163,8 H-6 166,2

6 96,5 5,92 (1H, d, J = 2,0 Hz) H-8 96,6

7 166,8 H-8; H-6 166,2

8 96,6 5,92 (1H, d, J = 2,0 Hz) H-6 95,6

9 163,0 H-8 163,1

10 102,4 Ha-3; Hb-3;

H-6

102,6

1’ 138,4 H-2; 138,4

2’ 126,1 H-2; 126,1

3’ 128,8 128,8

4’ 128,8 7,35 (5H, m, H-2', H-3',

H-4', H-5' e H-6')

128,8

5’ 128,8 128,8

6’ 126,1 H-2 126,1

101

OLIVEIRA, F.C.



6 e 8 2

3a 3b

6 e 8

2

3a 3b

102

OLIVEIRA, F.C.

Ha-3 Hb-3 C-3 C-3





3’ ;4’; 5’

6 10

8

2 3

2’ e 6’

1’ 9

5

7 4

H-2 C-2

H-6 C-6

H-8 C-8

103

OLIVEIRA, F.C.

O

OOH

OH

H

HHa

Hb

H

H

H

H

H H

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

5 '

6 '

12

9

1011

13

15

14

O

OOH

OH

H

HHa

Hb

H

H

H

H

H H

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

5 '

6 '

6

1

2

3

4

5

7

8

10 2

7

8

9

15

3

1





MHz)

2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 f2 (ppm)

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

f 1 ( p p m )

3a

O

OOH

OH

H

HHa

Hb

H

H

H

H

H H

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '

3a

3b

2

2

3b

3;4

5;6

11;12

13;14

104

OLIVEIRA, F.C.


O tratamento cromatográfico da fração LEFA (Item 5.5.5, p. 166) obtida pelo


amorfo amarelo com ponto de fusão entre 229-231 ºC e rotação óptica [α]D = - 0,37 (c = 0,45,


O espectro na região do infravermelho de LEF-3 (Figura 45), de forma

semelhante a LEF-1 e LEF-2, mostrou uma banda larga em 3264 cm-1

, correspondente à

deformação axial de ligação O-H, caracterizando a presença de grupo hidroxila; absorções em

2920 e 2848 cm-1

características de deformação axial de ligação Csp3-H; uma banda em 1638

cm-1

compatível com a deformação axial C=O de carbonila conjugada; as bandas em 1598 e

1519 cm-1

características de deformação axial de ligação C=C de anel aromático e as bandas

em 1260 a 1062 cm-1

compatíveis com deformações axiais de ligações C-O.

Figura 45 - Espectro na região do infravermelho de LEF-3

3264

2920

2848

3119

3800

1638

1466

1306

1466

1519

1598

1135

1260

1062

837 461

105

OLIVEIRA, F.C.

O espectro de RMN 1H [500 MHz, (CD3)2CO] de LEF-3 (Figura 49 e 50, p. 107

108) também apresentou semelhança com LEF-1 e LEF-2, revelando três sinais na faixa δ

7,38 – 5,95, os quais foram associados a hidrogênios ligados a carbonos de anel aromático.

Destes, foram assinalados os dubletos centrados em δ 7,38 (2H, d, J = 8,4 Hz) e 6,89 (2H, d, J

= 8,4), como relativos a hidrogênios orto posicionados. O outro sinal, referente a hidrogênio

ligado a carbono aromático, assinalados em δ 5,95 (2H, dd, J = 2,1; 2,1 Hz) foi compatíveis

com hidrogênios meta posicionados. Além disso, foi observado um sinal em δ 5,43 (1H, dd, J

= 2,9 e 12,9 Hz) referente a hidrogênios metínicos de carbono oxigenado e dois sinais em δ

3,17 (1Ha, dd, J = 12,9 e 17,1 Hz) e 2,72 (1Hb, dd, J = 2,9 e 17,1 Hz) referente a dois

hidrogênios diasterotópicos. Observou-se também um sinal em δ 12,18 (1H, s) referente à

hidroxila fenólica quelada, (Tabela 19, p. 107). O padrão de acoplamentos apresentado por

LEF-3, pela semelhança com LEF-1 e LEF-2, se mostrou compatível com um esqueleto

flavonônico 5,7,4’-trissubstituido, Figura 46.


C [125 MHz, (CD3)2CO] (Figura 51, p. 108) de LEF-3

observou-se treze linhas espectrais, sendo um destes em δ 198,2 (C-4) referente a carbono

carbonílico, dez sinais referentes a carbonos aromáticos e dois sinais em δ 80,9 (C-2) e 44,4

(C-3) referentes a carbonos com hibridização sp3, sendo o primeiro oxigenado. Duas linhas

espectrais (δ 129,9 e 117,1) foram relacionados a dois carbonos cada, após análise do espectro

de 1H,

13C-HSQC (Figura 53, p. 109). O espectro de correlação heteronuclear a uma ligação

1H,

13C-HSQC permitiu associar de maneira inequívoca os sinais de todos os hidrogênios a

seus respectivos carbonos, conforme descrito na Tabela 19, p. 107.



acoplamentos dos hidrogênios orto posicionados em H-2’ e H-6’ (δ 7,38), com os hidrogênios

H-3’ e H-5’ (δ 6,89), respectivamente. Além disso, observou-se acoplamento entre os dois

hidrogênios diasterotópicos H-3a (δ 3,17) e H-3b (δ 2,72), assim como destes com o H-2 (δ

5,43), como representado na Figura 46.

Figura 46 – Correlações observadas no espectro de COSY de LEF-3

O

O

H

H

Ha

Hb

H

H

H

H

H

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '

106

OLIVEIRA, F.C.

Análise do espectro de HMBC (Figura 54 e 55, p. 110), permitiu confirmar a

posição das hidroxilas através dos acoplamentos dos hidrogênios em δ 5,95 (H-8 e H-6) com

o carbono em δ 168,4 (C-7), dos hidrogênios em δ 6,89 (H-3’ e H-5’) com o carbono δ 159,6

(C-4’), dos hidrogênios em δ 7,38 (H-2’ e H-6’) com o carbono δ 159,6 (C-4’), Figura 47,

Tabela 19, p. 108. Verificou-se, ainda, os acoplamentos do hidrogênio em δ 5,95 (H-8) com o

carbono δ 165,3 (C-9), do hidrogênio em δ 5,95 (H-6) com o carbono em δ 166,2 (C-5), do

hidrogênio em δ 5,43 (H-2) com o carbono em δ 44,4 (C-3) e acoplamento dos hidrogênios

em δ 3,17 (H-3a) e 2,72 (H-3b) com o carbono em δ 198,2 (C-4).

A partir dos dados analisados, foi possível verificar que LEF-3 apresentava uam

estrutura semelhante a LEF-1, sendo a única diferença a presença da hidroxila no carbono C-

7 ao invés de uma metoxila.


O

O

O H

OH

OH

H

HH

H

H

H

H

H

H

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '


literatura (ALMEIDA et al., 2005) pôde-se confirmar para LEF-3 a estrutura de um

flavonóide do tipo flavanona, registrada na literatura como naringenina (Figura 48).

Figura 48 - Estrutura química da naringenina (LEF-3)

OOH

O H

O H

O

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '

3 '

4 '

5 '

6 '

A flavanona naringenina (LEF-3) também já se encontre relatada na literatura

para o gênero Lippia (COSTA, 2001), porém, é a primeira vez que o seu isolamento a partir

da espécie L. rigida é registrado.

107

OLIVEIRA, F.C.

OH-5

3a 3b



3, comparados com a literatura (ALMEIDA et al., 2005 – acetona-d6).

HSQC HMBC Naringenina

C δC δH 2JCH

3JCH δ

13C

2 80,9 5,43 (1H, dd, J = 13,0 e 2,8

Hz)

Ha-3; Hb-3 H-2’;H-6’ 80,0

3 44,4 3,17 (1Ha, dd, J = 13,0 e 17,1

Hz)

2,72 (1Hb, dd, J = 2,9 e 17,1

Hz)

H-2 43,5

4 198,2 Ha-3; Hb-3 H-2 197,3

5 166,2 H-6 165,3

6 97,8 5,95 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-8 96,9

7 168,4 H-8; H-6 167,4

8 96,8 5,95 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-6 95,9

9 165,3 H-8 164,4

10 104,1 H-3; H-6 103,3

1’ 131,6 H-2; H-2’;

H-6’

Ha-3; Hb-

3; H-3’; H-

5’

130,8

2’ 129,9 7,38 (2H,d, J = 8,5 Hz) H-3’ H-2 129,0

3’ 117,1 6,89 (2H,d, J = 8,5 Hz) H-2’ H-5’ 116,2

4’ 159,6 H-2’; H-6’ H-3’; H-5’ 158,7

5’ 117,1 6,89 (2H,d, J = 8,5 Hz) H-6’ H-3’ 116,2

6’ 129,9 7,38 (2H,d, J = 8,5 Hz) H-5’ H-2 129,0

Figura 49 - Espectro de RMN 1H de LEF-3 (acetona-d6, 500 MHz).

2’;6’

3’;5’

6;8

2

108

OLIVEIRA, F.C.

4’

Figura 50 - Expansão do espectro de RMN 1H de LEF-3 (acetona-d6, 500 MHz).


C de LEF-3 (acetona-d6, 125 MHz).

4 7

5 9

1’

2’;6’

3’;5’

10

6

8

2

3

4’

109

OLIVEIRA, F.C.

Ha-3 Hb-3 C-3 C-3

H-2 C-2

H-6’ C-6’

H-5’ C-5’

H-2’ C-2’

H-3’ C-3’

H-6 C-6

H-8 C-8

3’;5’ 2’;6’


1H-COSY de LEF-3 (acetona-d6, 500 MHz).


13C-HSQC de LEF-3 (acetona-d6, 500 x 125 MHz).

O

O

O H

OH

OH

H

H

Ha

Hb

H

H

H

H

H

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '

3a

3b

2

2

3a

3b

3’;5’

2’;6’

O

O

O H

OH

OH

H

H

Ha

Hb

H

H

H

H

H

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '

110

OLIVEIRA, F.C.

O

OOH

OH

H

HHa

Hb

H

H

H

H

H O H

6

1

2

3

4

5

7

8

9

10

11

12

13

14

15

161 2

3;4 5 11;12

13;14

15;16

O

OOH

OH

H

HHa

Hb

H

H

H

H

H O H19

17

23

18

20

22

21

24

25

27

26

20;21

22

23


13C-HMBC de LEF-3 (acetona-d6, 500 x 125 MHz).



MHz)

6

7

8

9;10

18

19

24;25

26;27

23

111

OLIVEIRA, F.C.


O tratamento cromatográfico da fração LEFA (Item 5.5.5, p. 166), obtida pelo


amorfo amarelo com ponto de fusão entre 182,8-183,9 ºC e rotação óptica [α]D = - 0,14 (c =

0,42, MeOH) , que foi denominado de LEF-4.

De forma semelhante a LEF-1, LEF-2 e LEF-3, o espectro na região do

infravermelho de LEF-4 (Figura 56), mostrou duas bandas em 3463 e 3364 cm-1

,

correspondentes à deformações axiais de ligação O-H, caracterizando a presença de grupo

hidroxila; absorções em 2927 cm-1

características de deformação axial de ligação Csp3-H; uma

banda em 1625 cm-1

característica de deformação axial C=O de carbonila conjugada; uma

banda em 1512 cm-1

típicas de deformação axial de ligação C=C de anel aromático e as

bandas em 1294 a 1089 cm-1


Figura 56 - Espectro na região do infravermelho de LEF-4

O espectro de RMN 1H [500 MHz, (CD3)2CO] de LEF-4 (Figura 60 e 61, p. 115)

apresentou semelhança com LEF-1, mostrando quatro sinais na faixa δ 7,43 – 6,06, os quais

foram associados a hidrogênios ligados a anel aromático. Destes, foram assinalados os

3463

3364

2927

1453

1512

1367

1625

1294 1155

1089

997 831

112

OLIVEIRA, F.C.

dubletos centrados em δ 7,43 (2H, d, J = 8,4 Hz) e 6,91 (2H, d, J = 8,4), como relativos a

hidrogênios em posição orto. Os outros dois sinais, assinalados em δ 6,09 (1H, d, J = 2,2 Hz)

e 6,06 (1H, d, J = 2,2 Hz) foram compatíveis com hidrogênios meta posicionados, assim

como foi visto para LEF-1. Também form observado sinais em δ 5,12 (1H, d, J = 11,6 Hz) e

em δ 4,69 (1H, d, J = 11,6 Hz) referentes a hidrogênios oxigenados. Um sinal em δ 11,71

(1H, s) referente a hidroxila fenólica quelada e um sinal em δ 3,87 (3H, s) referente à

metoxila, (Tabela 20, p. 114).


C [125, MHz, (CD3)2CO] (Figura 62, p. 116) foram

obsevados quatorze linhas espectrais. Sendo uma destas em δ 199,6 referente a carbono

carbonilíco, dez sinais na faixa δ 170,2-95,6, referentes a carbonos de anel aromático e dois

sinais em δ 85,4 e δ 74,1 referentes a carbonos sp3 oxigenados. Duas destas linhas espectrais

(δ 131,2 e 116,9) foram relacionadas a dois carbonos cada, após análise do espectro 1H,

13C-

HSQC (Figura 63, p. 116)

Após análise do espectro de correlação heteronuclear a uma ligação 1H,

13C-

HSQC, duas das linhas foram relacionadas a dois carbonos cada, permitiu associar com

segurança os sinais de todos os hidrogênios a seus respectivos carbonos, conforme descrito na

Tabela 20, p.114.

A semelhança dos dados analisados com os dados de LEF-1, permitiu sugerir

para LEF-4 uma estrutura semelhante, diferindo apenas pela presença de uma hidroxila no

carbono C-3. A confirmação da estrutura foi possível apartir da análise dos espectros

bidimensionais de RMN.




H-3’ e H-5’ (δ 6,91) e acoplamento do H-2 (δ 5,12) com H-3 (δ4,69), Figura 57.

Figura 57 – Correlações observadas no espectro de COSY de LEF-4

O

O

H

H

H

H

H

H

H

H

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '

113

OLIVEIRA, F.C.

No espectro de HMBC (Figura 65 e 66, p. 118), foi possível identificar os

acoplamentos dos hidrogênios em δ 6,06 (H-8), 6,09 (H-6) e 3,87 (metoxila) com o carbono

em δ 170,2 (C-7) confirmando-se a posição da metoxila no carbono 7 do esqueleto

flavonoídico. Observou-se também, os acoplamentos dos hidrogênios δ 6,91 (H-3’ e H-5’)

com o carbono δ 159,8 (C-4’), acoplamentos dos hidrogênios δ 7,43 (H-2’ e H-6’) com o

carbono δ 159,8 (C-4’), confimando-se a posição da hidroxila no anel B, Figura 58, Tabela

20, p. 114.

Outros acoplamentos importantes foram observados dentre eles, do hidrogênio δ

6,06 (H-8) com o carbono δ 164,9 (C-9), do hidrogênio δ 6,09 (H-6) com o carbono δ 165,6

(C-5), do hidrogênio δ 5,12 (H-2) com o carbono δ 74,1 (C-3) e do hidrogênio δ 4,69 (H-3)

com o carbono 199,6 (C-4), confirmando a posição na hidroxila no anel C, Figura 58.


O

O H

OH

H 3CO

H

H

H

H

H

H

H

O H

H

O

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '

Mediante comparação dos dados analisados com os dados descritos na literatura

(ALMEIDA et al., 2005) pôde-se confirmar para LEF-4 a estrutura de um flavonóide do

flavanonol, registrado na literatura como 7-metoxi-aromadendrina (Figura 59).

Figura 59 - Estrutura química de 7-metoxi-aromadendrina (LEF-4)

O

O

O H

MeO

O H

O H

2

34

5

6

7

8

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '9

114

OLIVEIRA, F.C.

Embora o flavononol 7-metoxi-aromadendrina (LEF-4) já tenha sido relatada

(FREITAS et al., 2008) este é o seu primeiro relato o gênero Lippia e conseguentemente para

a família Verbenaceaea.



4, comparados com a literatura (ALMEIDA et al., 2005 – acetona-d6).

HSQC HMBC 7-metoxi-

aromadendrina

C δC δH 2JCH

3JCH δ

13C

2 85,4 5,1 (1H, d, J = 11,6 Hz) H-3 H-2’; H-6’ 85,3

3 74,1 4,7 (1H, d, J = 11,6 Hz) H-2 74,0

4 199,6 H-3 H-2 198,8

5 165,6 11,7 (1H, s) H-6 165,6

6 96,7 6,1 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-8 97,7

7 170,2 H-8; H-6;

OCH3

169,1

8 95,6 6,0 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-6 96,7

9 164,9 H-8 164,9

10 103,1 H-3; H-6 102,2

1’ 129,9 H-2; H-2’;

H-6’

H-3;H-3’;

H-5’

129,6

2’ 131,2 7,4 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-3’ H-2; H-6’ 130,7

3’ 116,9 6,9 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-2’ H-5’ 116,5

4’ 159,8 H-2’; H-6’ H-3’; H-5’ 159,5

5’ 116,9 6,9 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-6’ H-3’ 116,5

6’ 131,2 7,4 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-5’ H-2; H-2’ 130,7

57,3 3,9 (3H, s)

115

OLIVEIRA, F.C.

OH-5

2’;6’ 3’;5’



6 8

2 3

O

O

O H

OH

O

H

HO H

H

H

H

H

H

H

CH 3 2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '

116

OLIVEIRA, F.C.

H-3 C-3

H-2 C-2

H-2’ C-2’

H-6’ C-6’





H-6 C-6

H-8 C-8

H-3’ C-3’

H-5’ C-5’

4 7

5 9

4’

2’;6’

1’

3’;5’

10

6

8 2

3

OCH3

O

O

O H

OH

O

O H

CH 3 2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '

117

OLIVEIRA, F.C.


1H-COSY de LEF-4 (acetona-d6, 500 x 500 MHz)

2 3

2

3

2’;6’ 3’;5’

2’;6’

3’;5’

118

OLIVEIRA, F.C.

O

OO H

O

H

HO H

H

H

H

H

H

H O H

CH 3 2

34

5

6

78

9

10

1 '

2 '3 '

5 '

6 '

5

1

2

3

4

6

7

8

11

12

13

14

9

10

O

OO H

O

H

HO H

H

H

H

H

H

H O H

CH 3 2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

5 '

6 '

16

2015

17

19

18

21

22

24

23

19


13C-HMBC de LEF-4 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)


13C-HMBC de LEF-4 (a cetona-d6, 500 x 125

MHz)

1

20

2 3

4

5

6

7;8

9;10

11;12

13;14

15 16

17 18

21;22

23;24

OCH3

119

OLIVEIRA, F.C.


O tratamento cromatográfico da fração LEFA (Item 5.5.5, p. 166), obtida pelo

tratamento cromatográfico do extrato etanólico das folhas de L. rigida, forneceu um sólido

amorfo amarelo com ponto de fusão entre 288-290 ºC, que foi denominado de LEF-5.

O espectro na região do infravermelho de LEF-5 (Figura 67), mostrou uma banda

larga em 3255 cm-1

, correspondente à deformação axial de ligação O-H, caracterizando a

presença de grupo hidroxila; absorções em 2935 e 2844 cm-1

características de deformação

axial de ligação Csp3-H; uma banda em 1612 cm-1

característica de deformação axial C=O de

carbonila conjugada; uma banda em 1507 cm-1

típica de deformação axial de ligação C=C de

anel aromático e a banda em 1155 cm-1

compatível com deformações axiais de ligações C-O.


4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

20

30

40

50

60

70

1 1 5 5 ,0

1 3 7 6 ,8

1 4 3 5 ,9

1 5 0 7 ,51 6 1 1 ,8

1 6 8 3 ,4

2 8 4 4 ,4

2 9 3 5 ,5

3 2 5 5 ,3

T%

cm-1

L E F -6

O espectro de RMN 1H [300 MHz, piridina-d5] de LDF-1 (Figura 70, p. 122),

mostrou quatro sinais na faixa δ 7,96 – 6,60, os quais foram associados a hidrogênios ligados

a anel aromático. Destes, foram assinalados os dubletos centrados em δ 7,96 (2H, d, J = 8,8

Hz) e 7,29 (2H, d, J = 8,8), relativos a hidrogênios orto posicionados, um singleto em δ 6,92

3255

2935

2844

1436

1683

1612 1507

1377

1155

120

OLIVEIRA, F.C.

(1H, s) e outros dois sinais, referentes a hidrogênios ligados a anel aromático, em δ 6,71 (1H,

d, J = 2,2 Hz) e 6,60 (1H, d, J = 2,2 Hz) os quais foram compatíveis com hidrogênios meta

posicionados. Foram observados ainda um sinal em δ 13,61 (1H, s) característico de uma

hidroxila fenólica quelada e um sinal em δ 3,79 (3H), tipico de grupo metoxila.

O espectro de RMN 13

C [75 MHz, piridina-d5], (Figura 71, p. 123) foram

obsevadas quatoze linhas espectrais, duas das quais (δ 129,4 e 117,3) foram relacionadas a


13C-HSQC (Figura 74, p. 124).

Comparação do espectro de RMN 13

C totalmente desacoplado, com o espectro de RMN 13

C-

DEPT 135º [75 MHz, piridina-d5], (Figura 72, p. 123), permitiu identificar a presença de um

carbono metílico (δ 56,3), sete carbonos monoidrogenados (δ 129,4-93,3). Os oito sinais

restantes foram identificados como carbonos não hidrogenados, sendo um, característico de

corbono de carbonila cetônica conjugada (δ 183,2), (Tabela 21).



C-BB e DEPT 135° de LEF-5

C CH CH3 Fórmula molecular

183,2 (C=O) 129,4 (2X) 56,3 (C-O)c

166,2 (C-O)b 117,3 (2X)

165,2 (C-O)a 104,4

163,3 (C-O)a 98,9

163,1 (C-O)c 93,3

158,5 (C-O)c

122,5

106,2

8 C 7 CH 1 CH3 C16H12O6

a – carbono sp


b – carbono sp



oxigênio de éter.


13C-HSQC

foi possível associar de forma inequívoca os sinais de todos os hidrogênios a seus respectivos

carbonos. A análise de todos os dados descrito possibilitou sugerir um esqueleto flavonônico

para LEF-5.

121

OLIVEIRA, F.C.

O espectro de massa obtido por impacto eletrônico a 70 eV (Figura 68) forneceu o

pico correspondente ao íon molecular m/z 284,0 daltons, condizente com a fórmula molecular

C16H12O5.

Figura 68 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LEF-5

No espectro de HMBC (Figura 75, p. 125), foi possível identificar os


em δ 166,2 (C-7) determinando a posição da metoxila no carbono 7 do esqueleto

flavonoídico. Identificou-se também os acoplamentos dos hidrogênios em δ 7,29 (H-3’ e H-

5’) com o carbono δ 163,3 (C-4’), dos hidrogênios em δ 7,95 (H-2’ e H-6’) com o carbono δ

163,3 (C-4’) permitido-se determinar a posição da hidroxila no anel B. Observou-se ainda o

acoplamento do hidrogênio δ 6,71 (H-8) com o carbono δ 158,5 (C-9) e do hidrogênio δ 6,60

(H-6) com o carbono δ 163,1 (C-5).

Com base nos dos dados analisados e em comparação com os dados descritos na

literatura (AGRAWAL, 1989) pôde-se propor para LEF-5 a estrutura de um flavonol e

registrado na literatura como genkwanina (Figura 69).

Figura 69 - Estrutura química de genkwanina (LEF-5)

O

O H

OO H

MeO

Embora a flavona genkwanina (LEF-5) já tenha sido relatada (gênero Aloysia

(Verbenaceae) (VANDRESEN et al., 2010) este é o seu primeiro relato para o gênero Lippia

(Verbenaceaea).

122

OLIVEIRA, F.C.


13C, HSQC e HMBC (piridina-d5) de LEF-

5, comparados com a literatura (AGRAWAL, 1989)

HSQC HMBC Genkwanina

C δC δH 2JCH

3JCH δ

13C

2 1165,2 H-2’;H-6’ 166,0

3 104,4 104,2

4 183,2 181,4

5 163,1 13,62 (1H, s) H-6 161,4

6 98,9 6,60 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-8 99,2

7 166,2 H-8; H-6;

OCH3

167,1

8 93,3 6,71 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-6 93,7

9 158,5 H-8 157,4

10 106,2 H-8 106,5

1’ 122,5 H-3;H-3’; H-5’ 122,9

2’ 129,4 7,95 (1H, d, J = 8,8 Hz) H-6’ 129,6

3’ 117,3 7,29 (1H, d, J = 8,8 Hz) H-5’ 117,2

4’ 163,3 162,8

5’ 117,3 7,29 (1H, d, J = 8,8 Hz) H-6’ 117,2

6’ 129,4 7,95 (1H, d, J = 8,8 Hz) H-2’ 129,6

OMe 56,3 3,79 (3H, s) 56,7

Figura 70 - Espectro de RMN 1H de LEF-5 (piridina-d5, 500 MHz)

2’;6’

3’;5’

8

6 OH-5

3

OCH3

123

OLIVEIRA, F.C.


C de LEF-5 (piridina-d5, 500 MHz)


C – DEPT 135º de LEF-5 (piridina-d5, 125 MHz)

3’ ; 5’

6

10

8

2

3

2’ ; 6’

1’ 9

5

7

4

4’

OCH3

124

OLIVEIRA, F.C.

Figura 73 – Espectro de RMN 1H,



13C-HSQC de LEF-5 (piridina-d5, 500 x 125 MHz)

3’;5’ 3 6

6

3

3’;5

’

8

8

6H 6C

8H 8C

3’H 3’C

5’H 5’C

2’H 2’C

6’H 6’C

3H 3C

125

OLIVEIRA, F.C.


13C-HMBC de LEF-5 (piridina-d5, 500 x 125 MHz)

1

2

5

6

7

8

11

4

3

9

13

12

14 10

15

O

OH

H 3CO

H

H

H

H

H

H O H

H

O

4

2

3

1

67

5

9

8

10

5

7

6

11

11

12

13

14

15

126

OLIVEIRA, F.C.

4.1.6 Determinação estrutural de LDF-1

O tratamento cromatográfico da fração LDFA (Item 5.5.9, p. 171), obtida pelo

fracionamento cromatográfico do decocto das folhas de L. rigida, forneceu um sólido amorfo

amarelo com ponto de fusão entre 196,0-197,9 ºC, que foi denominado de LDF-1.

O espectro na região do infravermelho de LDF-1 (Figura 76), mostrou uma banda

larga em 3261 cm-1

, correspondente à deformação axial de ligação O-H, caracterizando a

presença de grupo hidroxila; absorções em 2923 e 2851 cm-1




uma carbonila conjugada; as bandas em 1586 e 1508 cm-1

típicas de deformação axial de

ligação C=C de anel aromático e as bandas em 1234 a 1162 cm-1

compatíveis com

deformações axiais de ligações C-O.

Figura 76 – Espectro na região do infravermelho de LDF-1 (KBr)

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 3 ,6

1 1 6 2 ,0

3 4 9 0 ,3

1 5 0 7 ,5

1 6 6 3 ,9

1 5 8 6 ,1

2 8 5 0 ,6

2 9 2 3 ,0

3 2 6 1 ,5

T %

cm-1

L D F P A -12

3261 2923

2851

1664

1586 1508 1162

1234

127

OLIVEIRA, F.C.

O espectro de RMN 1H [300 MHz, piridina-d5] de LDF-1 (Figura 80, p. 130),

apresentou quatro sinais na faixa δ 8,59 – 6,62, os quais foram associados a hidrogênios

ligados a anel aromático. Destes, foram assinalados os dubletos centrados em δ 8,59 (2H, d, J

= 8,4 Hz) e 7,39 (2H, d, J = 8,4), relativos a hidrogênios orto posicionados. Os outros dois

sinais, assinalados em δ 6,75 (1H, d, J = 2,2 Hz) e 6,63 (1H, d, J = 2,2 Hz) foram compatíveis

com hidrogênios meta posicionados. Além disso, foi observado um sinal em δ 3,80 (3H, s)

compatível com os hidrogênios de grupo metoxila.


C [75 MHz, piridina-d5], (Figura 81, p. 130) foram

obsevadas quatoze linhas espectrais, das quais duas (δ 130,2 e 116,2) foram relacionadas a


13C-HSQC (Figura 84, p. 132).

Comparação do espectro de RMN 13

C totalmente desacoplado, com o espectro de RMN 13

C-

DEPT 135º [75 MHz, piridina-d5], (Figura 82, p. 131), permitiu identificar a presença de um

carbono metílico (δ 55,7), seis carbonos monoidrogenados (δ 130,2-91,9). Os noves sinais

restantes foram identificados como carbonos não hidrogenados, sendo um, característico de

carbono de carbonila de cetona conjugada (δ 176,9), (Tabela 23).



C-BB e DEPT 135° de LDF-1

C CH CH3 Fórmula molecular

176,9 (C=O) 130,2 (2X) 55,7 (C-O)c

165,2 (C-O)b 116,2 (2X)

161,7 (C-O)a 97,8

160,6 (C-O)a 91,9

156,8 (C-O)c

148,0 (C-O)c

137,3 (C-O)a

122,8

105,0

9 C 6 CH 1 CH3 C16H12O6

a – carbono sp


b – carbono sp



oxigênio de éter.

128

OLIVEIRA, F.C.


13C-HSQC

permitiu associar de forma inequívoca os sinais de todos os hidrogênios a seus respectivos

carbonos. A análise de todos os dados até aqui descritos possibilitou sugerir um esqueleto

flavonônico para LDF-1.

A semelhança dos dados analisados com os dados de LEF-5, permitiu sugerir

para LDF-1 uma estrutura semelhante, diferindo apenas pela presença de uma hidroxila no

carbono C-3 (δ 135,5).




H-3’ e H-5’ (δ 7,39), como representado na Figura 77.

Figura 77 – Padrão de acoplamentos observados nos espectros de RMN 1H e COSY de LDF-

1

O

O

H

H

H

H

H

H

2

3

4

5

6

78

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '


pico correspondente ao íon molecular m/z 300,0 daltons, condizente com a fórmula molecular

C16H12O6.

Figura 78 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LDE-1

No espectro de HMBC (Figura 85, p. 132), foi possível identificar os


em δ 165,2 (C-7) possibilitou-se determinar a posição da metoxila no carbono C-7 do

esqueleto flavonoídico. Mostrou também os acoplamentos dos hidrogênios em δ 4,39 (H-3’ e

129

OLIVEIRA, F.C.

H-5’) com o carbono em δ 160,6 (C-4’), dos hidrogênios em δ 8,58 (H-2’ e H-6’) com o

carbono δ 160,6 (C-4’) permitido-se confirmar a posição da hidroxila no anel B.

Após análise de todos os dados e comparação com os dados descritos na literatura

(AGRAWAL, 1989) pôde-se confirmar para LDF-1 a estrutura de um flavonóide do tipo

flavonol, registrado na literatura como ramnocitrina (Figura 79).

Figura 79 - Estrutura química de ramnocitrina (LDF-1)

O

O H

O H

OO H

MeO

Embora o flavonol ramnocitrina (LED-1), já tenha sido relatada (BACHHETI et

al., 2011), este é o seu primeiro relato para o gênero Lippia e consequentemente para a família

Verbenaceaea.


13C, HSQC e HMBC (piridina-d5) de LDF-


HSQC HMBC Ramnocitrina

C δC δH 2JCH

3JCH δ

13C

2 148,0 H-2’;H-6’ 147,2

3 137,5 135,9

4 176,9 176,0

5 161,7 H-6 160,3

6 97,8 6,63 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-8 97,4

7 165,2 H-8; H-6;

OCH3

164,9

8 91,9 6,75 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-6 92,1

9 156,8 H-8 156,1

10 105,1 H-8 104,0

1’ 122,8 H-2’; H-6’ H-3;H-3’;

H-5’

121,6

2’ 130,2 8,58 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-6’ 129,4

3’ 116,2 7,39 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-5’ 115,4

4’ 160,6 159,3

5’ 116,2 7,39 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-6’ 115,4

6’ 130,2 8,58 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-2’ 129,4

OMe 55,7 3,80 (3H, s)

130

OLIVEIRA, F.C.

Figura 80 - Espectro de RMN 1H de LED-1 (piridina-d5, 500 MHz)


C de LED-1 (piridina-d5, 125 MHz)

3’ ; 5’

6

10

8

2

3

2’ ; 6’

1’ 9

5

7 4

4’

OCH3

2’;6’ 3’;5’

8 6

OCH3

131

OLIVEIRA, F.C.


C – DEPT 135º de LED-1 (piridina-d5, 125 MHz)


1H-COSY de LED-1 (Piridina-d5, 500 MHz)

6 8

OCH3

3’;5’ 2’;6’

2’;6’

6

6

3’;5

’

8

8

3’;5’

2’;6’

O

O

H

H

H

H

H

H

2

3

4

5

6

78

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '

132

OLIVEIRA, F.C.


13C-HSQC de LED-1 (piridina-d5, 500 x 125 MHz)


13C-HMBC de LED-1 (piridina-d5, 500 x 125 MHz)

1

2 8

5

6

7

9

11

13

O

OH

MeO

H

H

H

H

H

H O H

O H

O

4

2

3

1

67

5

10

9

8

1112

5

7

6

13

13

14

14

4

3

10

12

14

6H 6C

8H 8C

3’H 3’C

5’H 5’C

2’H 2’C

6’H 6’C

133

OLIVEIRA, F.C.


O tratamento cromatográfico do decocto LDFA (Item 5.5.9, p. 171), obtida pelo


amarelo com ponto de fusão entre 255-257 ºC, que foi denominado de LDF-2.

De forma semelhante a LDF-1 o espectro na região do infravermelho de LDF-2

(Figura 86), mostrou uma banda larga em 3451 cm-1

, correspondente à deformação axial de

ligação O-H, caracterizando a presença de grupo hidroxila; absorção em 2923 cm-1

características de deformação axial de ligação Csp3-H; uma banda em 1618 cm-1

característica

de deformação axial C=O de uma carbonila conjugada; ama banda em 1501 cm-1

típica de

deformação axial de ligação C=C de anel aromático e as bandas em 1234 a 1175 cm-1


Figura 86 - Espectro na região do infravermelho de LED-2 (KBr)

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

25

30

35

40

45

1 1 7 5

1 2 3 41 3 9 7

1 5 0 1

1 6 1 8

1 6 6 4

2 9 2 3

3 4 5 1

T%

cm-1

134

OLIVEIRA, F.C.

O espectro de RMN 1H [300 MHz, (CD3)2CO] de LDF-2 (Figura 90, p. 136),

mostrou quatro sinais na faixa δ 8,15 – 6,27, os quais foram associados a hidrogênios ligados

a anel aromático. Destes, os dubletos centrados em δ 8,15 (2H, d, J = 8,8 Hz) e 7,01 (2H, d, J

= 8,8), foram associados a hidrogênios em posição orto. Os outros dois sinais, assinalados em

δ 6,53 (1H, d, J = 2,0 Hz) e 6,27 (1H, d, J = 2,0 Hz) foram compatíveis com hidrogênios meta

posicionados.



observadas treze linhas espectrais, das quais duas (δ 131,4 e 117,3) foram relacionadas a dois

carbonos cada, após análise do espectro de 1H,

13C-HSQC (Figura 93, p. 138). Sendo um

destes em δ 177,6 (C-4) referente a carbono carbonilico conjugado e os dez sinais na faixa δ

165,9-95,5, relacionados a carbonos de anel aromático. Os sinais em δ 148,0 (C-2) e δ 137,6

(C-3) relacionados a carbonos sp2 oxigenados.


13C-

HSQC, foi possível associar de forma inequívoca os sinais de todos os hidrogênios a seus

respectivos carbonos, conforme descrito na Tabela 25, p. 136.




H-3’ e H-5’ (δ 7,01). Além disso, observou-se acoplamento dos hidrogênios meta

posicionados em H-8 (δ 6,53) com o hidrogênio H-6 (δ 6,27), como representado na Figura

87.

Figura 87 – Padrão de acoplamentos observados nos espectros de RMN 1H e COSY de LDF-

2

O

O

H

H

H

H

H

H

2

3

4

5

6

78

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '

O espectro de massa obtido por impacto eletrônico a 70 eV (Figura 88, p. 135)

forneceu o pico correspondente ao íon molecular m/z 286,0 daltons, condizente com a fórmula

molecular C15H10O6.

135

OLIVEIRA, F.C.

Figura 88 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LDF-2

No espectro de espectro de HMBC (Figura 94, p. 138), foi possível identificar os

acoplamentos dos hidrogênios em δ 6,53 (H-8) e 6,27 (H-6) com o carbono em δ 165,9 (C-7)

determinando a posição da hidroxila no carbono 7 do esqueleto flavonoídico. Mostrou

também, os acoplamentos dos hidrogênios em δ 7,01 (H-3’ e H-5’) com o carbono em δ 161,2

(C-4’) e dos hidrogênios em δ 8,15 (H-2’ e H-6’) com o carbono em δ 161,2 (C-4’) permitido-

se determinr a posição da hidroxila no anel B. Verficou-se ainda acoplamento dos hidrogênio

em δ 6,53 (H-8) com o carbono em δ 158,8 (C-9) e do hidrogênio δ 6,27 (H-6) com o carbono

δ 163,3 (C-5).

A partir dos dados analisados, comparação com os dados de LDF-1 e comparação

com os dados descritos na literatura (AGRAWAL, 1989) pôde-se confirmar para LDF-2 a

estrutura de um flavonóide do tipo flavonol, registrado na literatura como canferol (Figura

89).

Figura 89 - Estrutura química do canferol (LDF-2)

O

O H

O H

OO H

OH

Embora o flavonol canferol (LDF-2), já tenha sido descrita para o gênero Vitex

(Verbenaceae) (CHEN et al., 2011) este é o seu primeirorelato para o gênero Lippia

(Verbenaceaea).

136

OLIVEIRA, F.C.


13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de LDF-


HSQC HMBC Canferol

C δC δH 2JCH

3JCH δ

13C

2 148,0 H-2’; H-6’ 146,8

3 137,5 135,6

4 177,6 175,9

5 163,3 H-6 160,7

6 100,1 6,27 (1H, d, J = 2,0 Hz) H-8 98,2

7 166,0 H-8; H-6 163,9

8 95,5 6,53 (1H, d, J = 2,0 Hz) H-6 93,5

9 158,8 H-8 156,2

10 105,1 H-8 H-6 103,1

1’ 124,3 H-2’; H-6’ H-3;H-3’; H-5’ 121,7

2’ 131,4 8,15 (2H, d, J = 8,5 Hz) H-6’ 129,5

3’ 117,3 7,01 (2H, d, J = 9,0 Hz) H-5’ 115,4

4’ 161,2 159,2

5’ 117,3 7,01 (2H, d, J = 9,0 Hz) H-6’ 115,4

6’ 131,4 8,15 (2H, d, J = 8,5 Hz) H-2’ 129,5

Figura 90 - Espectro de RMN 1H de LED-2 (acetona-d6, 500 MHz)

2’;6’ 3’;5’

8 6

OH-5

137

OLIVEIRA, F.C.


C de LED-2 (acetona-d6, 125 MHz)


1H-COSY de LED-2 (acetona-d6, 500 MHz)

3’ ; 5’

6

10

8

2 3

2’ ; 6’

1’

9 5

7 4

4’

2’;6

’

3’;5

’ 6

6

3’;5

’

2’;6

’

6

8

138

OLIVEIRA, F.C.


13C-HSQC de LED-2 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)


13C-HMBC de LED-2 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)

6H 6C

8H 8C

3’H 3’C

5’H 5’C

2’H 2’C

6’H 6’C

1

2 8

5

6

7

9

11

13

O

OH

MeO

H

H

H

H

H

H O H

O H

O

4

2

3

1

67

5

10

9

8

1112

5

7

6

13

13

14

14

4

3

10

12

14

139

OLIVEIRA, F.C.


O tratamento cromatográfico da fração LDFA (Item 5.5.9, p. 171), obtida pelo


amarelo com ponto de fusão entre 289-291 ºC, que foi denominado de LDF-3.

De forma semelhante a LDF-1 e LDF-2 o espectro na região do infravermelho de

LDF-3 (Figura 95), mostrou uma banda larga em 3419 cm-1

, correspondente à deformação

axial da ligação O-H, caracterizando a presença de grupo hidroxila; uma banda em 1618 cm-1

característica de deformação axial C=O de uma carbonila conjugada; uma banda em 1514

cm-1

típica de deformação axial de ligação C=C de anel aromático e as bandas em 1247 a

1162 cm-1


Figura 95 – Espectro na região do infravermelho de LDF-3 (KBr)

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

30

35

40

45

50

55

60

65

1 1 6 2

1 2 4 71 3 7 1

1 5 1 4

1 6 1 8

1 6 6 43 4 1 9

T%

cm-1

140

OLIVEIRA, F.C.

O espectro de RMN 1H [300 MHz, (CD3)2CO] de LDF-3 (Figura 99, p. 142),

apresentou cinco sinais na faixa δ 7,81 – 6,26, os quais foram associados a hidrogênios

ligados anel aromático. Destes, foram assinalado a um singleto largo em δ 7,81 (1H, sl), um

duplo dubleto em δ 7,69 (1H, dd, J = 8,2 e J = 1,4 Hz), relativos a hidrogênios em posições

orto e meta, repectivamente e o dubleto em δ 6,99 (1H, d, J = 8,4), foram assinalados como

hidrogênios orto posicionados. Os outros dois sinais, referentes a hidrogênios ligados a

carbonos aromáticos, assinalados em δ 6,39 (1H, d, J = 2,0 Hz) e 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz)

foram compatíveis com hidrogênios meta. Foi observado também, um sinal em δ12,17 (s)

característico de hidroxila fenólica quelada.



observadas quinze linhas espectrais. Sendo um destes em δ 177,5 (C-4) referente a carbono

carbonílico conjugados. Os doze sinais na faixa δ 165,9-95,4, forma relacionados a carbonos

de anel aromático e dois sinais em δ 147,9 (C-2) e 137,7 (C-3) foram compatíveis com

carbonos sp2 oxigenados, Tabela 26, p. 142.

Após análise do espectro de correlação heteronuclear a uma ligação 1H-

13C-HSQC

(Figura 102, p. 144), foi possível associar de forma inequívoca os sinais de todos os

hidrogênios a seus respectivos carbonos, conforme descrito na Tabela 26, p. 142. Após análise

de todos os dados até aqui descritos possibilitou sugerir também para LDF-3 um esqueleto

flavonônico.



acoplamentos dos hidrogênios H-8 (δ 6,51) com o hidrogênio H-6 (δ 6,26), e do hidrogênio

H-6’ (δ 7,69) com o hidrogênio H-5’ (δ 6,99), como representado na Figura 96.

Figura 96 – Padrão de acoplamentos observados no espectro de RMN 1H e COSY de LDF-3

O

H

H

H

H

H

O

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '

141

OLIVEIRA, F.C.


pico correspondente ao íon molecular m/z 302 daltons, condizente com a fórmula molecular

C15H10O7.

Figura 97 - Espectro de massa (IE, 70 eV) de LDF-3


hidrogênios em δ 6,51 (H-8) e 6,26 (H-6) com o carbono em δ 166,0 (C-7) permitido-se

confirmar a posição da hidroxila no carbono 7 do esqueleto flavonoídico. Observou-se

também os acoplamentos dos hidrogênios em δ 6,99 (H-5’) e 7,69 (H-6’) com o carbono δ

148,3 (C-4’), permitido-se confirmar a posição das hidroxilas no anel B. Além disso,

observou-se os acoplamento do hidrogênio em δ 6,51 (H-8) com o carbono δ 158,7 (C-9) e do

hidrogênio δ 6,26 (H-6) com o carbono δ 163,3 (C-5) .

A partir dos dados analisados, comparação com os dados descritos na literatura

(AGRAWAL, 1989) pôde-se confirmar para LDF-3 a estrutura de um flavonóide do tipo

flavonol, registrado na literatura como quercetina (Figura 98).

Figura 98 - Estrtura química de quercetina (LDF-3)

O

O H

O H

OO H

OH

O H

Embora a substância quercetina (LDF-3) já tenha sido relatado para o

gênero Lippia (COSTA et al., 2001), é a primeira vez que o seu isolamento a partir da espécie

L. rigida é registrado.

142

OLIVEIRA, F.C.


13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de LDF-


HSQC HMBC Quercetina

C δC δH 2JCH

3JCH δ

13C

2 147,9 H-2’; H-6’ 147,5

3 137,7 136,5

4 177,5 176,5

5 163,3 12,17 (OH,s) H-6 161,0

6 100,1 6,26 (1H, sl) H-8 99,5

7 166,0 H-8; H-6 166,0

8 95,4 6,51 (1H, sl) H-6 94,5

9 158,7 H-8 156,7

10 105,1 H-6; H-8 104,0

1’ 124,3 H-2’ H-5’ 123,0

2’ 116,7 7,81 (1H, sl) H-6’ 116,0

3’ 146,8 H-2’ H-5’ 145,7

4’ 149,3 H-5’ H-6’ 148,1

5’ 117,2 6,99 (1H, d, J = 8,5 Hz) H-6’ 116,5

6’ 122,4 7,69 (1H, dd, J = 8,5 e 1,5

Hz)

H-5’ H-2’ 121,0

Figura 99 - Espectro de RMN 1H de LED-3 (acetona-d6, 500 MHz)

2’

5’

8 6

OH-5

6’

143

OLIVEIRA, F.C.


C de LED-3 (acetona-d6, 125 MHz)


1H-COSY de LED-3 (acetona-d6, 500 MHz)

5’

6

10

8

2 3

6’

1’ 9 5

7

4

4’ 3’

2’

6’ 5’

6

6

5’

8

8

2’

6’

2’

144

OLIVEIRA, F.C.


13C-HSQC de LED-3 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)


13C-HMBC de LED-3 (acetona-d6, 500 x 125 MHz

6H 6C

8H 8C

5’H 5’C

2’H 2’C

6’H 6’C

1

2

5

6

7

8

10

12 4

3

9 11

13

14

O

OH

OH

H

H

O H

H

H

H O H

O H

O

4

2

3

1

5

9

8

1011

5

7

6

12

13

14

145

OLIVEIRA, F.C.

4.1.9 Determinação estrutural de LEC-1

O tratamento cromatográfico da fração LECA (Item 5.5.10, p. 174), obtida pelo

fracinamento cromatográfico do extrato etanólico do caule de L. rigida, forneceu um sólido

amorfo amarelo com ponto de fusão entre 137-139 ºC e rotação óptica [α]D = - 0,05 (c = 0,42,

MeOH) , que foi denominado de LEC-1.

O espectro na região do infravermelho de LEC-1 (Figura 104), mostrou uma

banda larga em 3262 cm-1

, correspondente à deformação axial da ligação O-H, caracterizando

a presença de grupo hidroxila; absorções em 2923 e 2851 cm-1




uma carbonila conjugada; as bandas em 1586 e 1508 cm-1

típicas de deformação axial de

ligação C=C de anel aromático e as bandas em 1234 a 1162 cm-1

compatíveis com

deformações axiais de ligações C-O.

Figura 104 – Espectro na região do infravermelho de LEC-1 (KBr)

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

10

20

30

40

50

60

1 2 3 3 ,6

1 1 6 2 ,0

3 4 9 0 ,3

1 5 0 7 ,5

1 6 6 3 ,9

1 5 8 6 ,1

2 8 5 0 ,6

2 9 2 3 ,0

3 2 6 1 ,5

T %

cm-1

L D F P A -12

3262 2923

2851

1664

1586 1508

1162

1234

146

OLIVEIRA, F.C.

O espectro de RMN 1H [500 MHz, (CD3)2CO] de LEC-1 (Figura 108, p. 149),

apresentou cinco sinais na faixa δ 7,07 – 5,94, os quais foram associados a hidrogênios

ligados a anel aromático. Destes, foi assinalado um dubleto em δ 7,07 (1H, d, J = 1,9 Hz),

relativos a hidrogenio com acoplamento meta, um duplo dubleo com acoplamento orto e

meta, respectivamente, em δ 6,91 (1H, dd, J = 8,1 e 1,9), um dubleto em δ 6,86 (1H, d, J = 8,1

Hz), relativos a hidrogênios em posição orto. Os outros dois sinais, referentes a hidrogênios

ligados a anel aromático, assinalados em δ 5,99 (1H, d, J = 2,0 Hz) e 65,95 (1H, d, J = 2,0

Hz) foram compatíveis com hidrogênios meta posicionados. Além disso, foram observados

dois sinais em δ 5,01 (1H, d, J = 11,6 Hz) e em δ 4,61 (1H, d, J = 11,6 Hz) referentes a

hidrogênios ligados a carbonos sp3 oxigenados. E mais um sinal em δ 11,71 (1H, s) referente

a hidroxila fenólica quelada, (Tabela 27, p. 148). O padrão de acoplamentos apresentado por

LEC-1 se mostrou compatível com um núcleo flavonoídico 3,5,7,3’,4’-pentassubstituido.


C [125, MHz, (CD3)2CO] (Figura 109, p. 149) observou-se

quinze linhas espectrais. Sendo uma destas em δ 199,1 (C-4) referente a carbono carbonilíco,

doze sinais na faixa δ 168,9-97,0, referentes a carbonos de anel aromáticos e dois sinais em δ

85,5 e 74,1 referentes a carbonos sp3 oxigenados, Tabela 27, p. 148.

O espectro de correlação heteronuclear a uma ligação 1H-

13C-HSQC (Figura 111,

p. 150) permitiu associar os sinais de todos os hidrogênios a seus respectivos carbonos,

conforme descrito na Tabela 27, p. 148.



acoplamento do hidrogênio H-6’ (δ 6,91) com o hidrogênio H-5’ (δ 6,86) e acoplamento do

hidrogênio H-2 (δ 5,01) com o hidrogênio H-3 (δ 4,61), como representado na Figura 105.

Figura 105 – Correlações observadas no espectro de COSY de LEC-1

O

H

H

H

H

H

H

O

H

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '

147

OLIVEIRA, F.C.


hidrogênios em δ 5,95 (H-8) e 5,99 (H-6) com o carbono em δ 168,9 (C-7) permitido-se

confirmar a posição da hidroxila no carbono 7 do esqueleto flavonoídico. Observou-se

também os acoplamentos dos hidrogênios em δ 6,86 (H-5’) com o carbono em δ 147,6 (C-4’),

dos hidrogênios em δ 7,07 (H-2’) com o carbono em δ 147,6 (C-4’) permitido-se confirmar a

posição da hidroxila no anel B. Além disso, observou-se os acoplamentos dos hidrogênio em

δ 5,95 (H-8) com o carbono em δ 165,1 (C-9), do hidrogênio em δ 5,99 (H-6) com o carbono

em δ 165,9 (C-5), do hidrogênio em δ 5,01 (H-2) com o carbono δ 74,1 (C-3) e do hidrogênio

em δ 4,61 (H-3) com o carbono 199,1 (C-4), confirmando a posição na hidroxila no anel C,

como representado na Figura 106 e Tabela 27, p. 148.

Figura 106 – Principais correlações observadas no espectro de HMBC de LEC-1.

O

O H

OH

OH

H

H

O H

H

H

H

O H

H

O

H

2

34

5

6

7

8

9

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '

A partir da análise de todos os dados obtidos foi possível verifica uma grande

similaridade estrutural entre LEC-1 e LDF-3. Sendo que, enquanto LDF-3 apresentava uma

ligação dupla entre C-2 e C-3; LEC-1 apresentava estas posições reduzidas e com a presença

de uma hidroxila em C-3.


literatura (AGRAWAL, 1989) pôde-se confirmar para LEC-1 a estrutura de um flavonóide do

tipo flavanonol, registrado na literatura como taxifolina (Figura 107, p.148).

148

OLIVEIRA, F.C.

Figura 107 - Estrutura química de taxifolina (LEC-1)

O

O H

OH

OH

O H

O

O H

2

34

5

6

7

8

10

1 '

2 '3 '

4 '

5 '

6 '9

Embora a substância taxifolina (LEC-1) já tenha sido relatada na literatura

(HEEMANN et al., 2006), ainda não foi relatada na literatura para o gênero Lippia

(Verbenaceaea), sendo este o primeiro relato de isolamento para o gênero Lippia.


13C, HSQC e HMBC (acetona-d6) de LEC-


HSQC HMBC Taxifolina

C δC δH 2JCH

3JCH δ

13C

2 85,5 5,01 (1H, d, J = 11,6 Hz) H-3 H-2’; H-6’ 85,3

3 74,1 4,61 (1H, d, J = 11,6 Hz) H-2 74,0

4 199,1 H-3 H-2 198,8

5 165,9 11,71 (1H, s) H-6 165,6

6 98,1 5,99 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-8 97,7

7 168,9 H-8; H-6; 169,1

8 97,0 5,95 (1H, d, J = 2,2 Hz) H-6 96,7

9 165,1 H-8 164,9

10 102,5 H-3; H-6 102,2

1’ 130,7 H-2; H-2’;

H-6’

H-3;H-3’;

H-5’

129,6

2’ 116,9 7,07 (1H, d, J = 2,0Hz) H-3’ H-2; H-6’ 130,7

3’ 146,7 H-2’ H-5’ 116,5

4’ 147,6 H-2’; H-6’ H-3’; H-5’ 159,5

5’ 116,8 6,86 (1H, d, J = 8,4 Hz) H-6’ H-3’ 116,5

6’ 121,8 6,91 (1H, dd, J = 8,4 e 2,0

Hz)

H-5’ H-2; H-2’ 130,7

149

OLIVEIRA, F.C.

Figura 108 - Espectro de RMN 1H de LEC-1 (acetona-d6, 500 MHz)


C de LEC-1 (acetona-d6, 125 MHz)

5’

6

10

8

2

3

6’

1’

9 5

7

4

4’ 3’

2’

2’ 3

8 6

OH-5

6’

5’

2

150

OLIVEIRA, F.C.


1H-COSY de LEC-1 (acetona-d6, 500 MHz)


13C-HSQC de LEC-1 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)

6’

5’ 6

6

5’

2

8

2’

6’ 2’

8

3

6H 6C

8H 8C

3H 3C

5’H 5’C

2’H 2’C

6’H 6’C

2H 2C

151

OLIVEIRA, F.C.


13C-HMBC de LEC-1 (acetona-d6, 500 x 125 MHz)

1

2

5

6

7

8 10

12 4

3

9 11

13

14

16

15

O

OH

OH

H

H

O H

H

H

H O H

O HO

H

H

4

2

3

1

5

9

8

1011

5

7

6

12

14

13

15 16

152

OLIVEIRA, F.C.

4.2 Caracterização da composição química do óleo essencial das folhas de L. rigida

O óleo essencial das folhas de L. rigida, obtido por hidrodestilação, apresentou

um rendimento de 0,18% (v/m). A Tabela 28, mostra a identificação e a quantificação relativa

dos constituintes químicos do óleo.

Tabela 28 - Composição química do óleo essencial das folhas de L. rigida Schauer

IK* Indice de Kolvats calculado IK#

Indice de Kolvats da literatura

Composto IK* IK# % Relativo

CG-DIC

α-Pineno 956 944 2,1

Limoneno 1035 1031 0,8

Trans-β-ocimeno 1048 1043 1,5

Linalol 1095 1096 3,3

Nerol 1230 1229 0,5

Ácido Nerólico 1314 1316 2,7

Acetato nerila 1364 1362 0,3

α-Cubebeno 1373 1380 0,3

Acetato geranila 1382 1383 0,8

α-Copaeno 1400 1394 2,8

β-Cariofileno 1441 1443 13,0

β-Cubebeno 1449 1449 0,7

E-β-Farneseno 1465 1460 0,9

α-Humuleno 1471 1460 42,3

Alloaromadendreno 1479 1481 1,8

α-Amorfeno 1489 1485 1,7

Germacreno-D 1495 1499 8,6

Biciclogermacreno 1509 1500 3,9

γ-Cadineno 1522 1523 0,6

δ-Cadineno 1529 1530 2,9

trans-nerolidol 1556 1561 0,4

Espatulenol 1573 1572 0,6

Óxido de cariofileno 1579 1580 1,1

δ-Cadinol 1625 1636 0,5

Total 94,1

153

OLIVEIRA, F.C.

Segundo a Tabela 28, p. 152, foram identificados um total de 24 constituintes

(94,1%), sendo 11,2% de monoterpenos e 82,9% de sesquiterpenos. Os sesquiterpenos α-

humuleno (42,3%) e β-cariofileno (13,0%) foram identificados como componentes

majoritários. De acordo com a literatura os constituintes mais comuns encontrados em óleos

essenciais de plantas do gênero Lippia são limoneno, β-cariofileno, p-cimeno, cânfora, linalol,

α-pineno e timol (PASCUAL et al., 2001)

A presença do sequiterpeno α-humuleno como componente majoritário em óleos

essenciais de espécies do gênero Lippia, só foi relatada apena para a espécie Lippia aff.

microphylla (SILVA et al., 2010). Geralmente o α-humuleno é enconrado em pequenas

concentrações em espécies do gênero Lippia. Para a espécie L. gracilis o teor de α-humuleno

está abaixo de 1% (MENDES et al., 2010), enquanto que para óleos essenciais de diversas

espécies de Lippia da Colômbia, o teor de α-humuleno varia entre 1,0 e 6% (ESCOBAR et

al., 2010).

O cromatograma e os espectros de massa dos constituintes químicos identificados

do óleo essencial das folhas de L.rigida estão ilustrados nas figuras 113-138 (p. 153-157).

Figura 113 - Cromatograma da análise de OEFLR por CG/EM

Figura 114 - Espectro de massa do α-pineno

154

OLIVEIRA, F.C.

Figura 115 - Espectro de massa do limoneno

Figura 116 - Espectro de massa do trans-β-ocimeno

Figura 117 - Espectro de massa do linalol

O H

Figura 118 - Espectro de massa do nerol

O H

Figura 119 - Espectro de massa do ácido nerolico

O HO

Figura 120 - Espectro de massa do acetato nerila

O

O

Figura 121 - Espectro de massa do α-cubebeno

155

OLIVEIRA, F.C.

Figura 122 - Espectro de massa do acetato de geranila

O

O

Figura 123 - Espectro de massa do α-copaeno

Figura 124 - Espectro de massa do β-cariofileno

Figura 125 - Espectro de massa do β-cubebeno

Figura 126 - Espectro de massa do E-β-farneseno

Figura 127 - Espectro de massa do α-humuleno

Figura 128 - Espectro de massa do alloaromadendreno

156

OLIVEIRA, F.C.

Figura 129 - Espectro de massa do α-amorfeno

Figura 130 - Espectro de massa do germacreno-D

Figura 131 - Espectro de massa do biciclogermacreno

Figura 132 - Espectro de massa do γ-cadineno

H

H

Figura 133 - Espectro de massa do Δ-cadineno

Figura 134 - Espectro de massa do trans-nerolidol

O H

Figura 135 - Espectro de massa do espatulenol

O H

157

OLIVEIRA, F.C.

Figura 136 - Espectro de massa do óxido de cariofileno

OH

H

Figura 137 - Espectro de massa do δ-cadinol

O H

Figura 138 – Espectros de massa dos compostos não identificados

158

OLIVEIRA, F.C.

159

OLIVEIRA, F.C.

5 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

5.1 Material botânico

As folhas e o caule de L. rigida foram coletados em junho de 2010 no município

de Mucugê-BA, pelo professor Dr. Edilberto R. Silveira. A identificação botânica foi

realizada pela professora Ms. Maria Lenise Silva Guedes do Departamento de Botânica da

Universidade Federal da Bahia. A exsicata n° 1240, representando a coleta encontra-se

depositada no Herbário Alexandre Leal Costa (ALCB).

5.2 Métodos cromatográficos

5.2.1 Cromatografia de adsorção

Para o fracionamento dos extratos brutos e frações, bem como a separação e

purificação de substâncias, foram utilizadas cromatografias de adsorção em coluna aberta

(CCA) utilizando-se como suportes gel de sílica 60 (70-230 mesh), silica para cromatográfia

“flash” (230-400 mesh) e gel de dextrana Sephadex® LH-20. Os eluentes utilizados nas

separações foram: hexano, diclorometano (CH2Cl2), acetato de etila (AcOEt), clorofórmio

(CHCl3), metanol (MeOH) e água (H2O), puros ou em misturas, sendo todos da marca Synth.

O monitoramento das frações obtidas após os processos cromatográficos foi

realizado por cromatografia em camada delgada, CCD, (gel de sílica 60 F254 = 0,2 mm) em

folhas de alumínio da marca Merck®. Como revelador não destrutivo foi utilizada a radiação

ultravioleta no comprimento de onda de 365 nm, e como destrutiv o solução ácida de vanilina.

As placas foram cortadas nas dimensões apropriadas para cada situação de

análise. A amostra foi aplicada por meio de um tubo capilar a uma altura de ≈ 0,9 cm com

uma distância de ≈ 0,3 cm de uma para a outra.

Para cromatografia de adsorção em coluna sob baixa pressão (flash) utilizou-se

sílica gel 60 (0,040 – 0,063 mm; 230 – 400 mesh) da Merck®. O diâmetro e o comprimento

das colunas variaram de acordo com as quantidades das amostras e com valores de Rf. Para a

eluição sob baixa pressão, utilizou-se um sistema adaptado com bomba compressora do

fabricante NS Indústria de Aparelhos Médicos Ltda. referência R-60.

160

OLIVEIRA, F.C.

5.2.2 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)

A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi realizada em equipamento

da marca Shimadzu®, constituído por três bombas de alta pressão, modelo Shimadzu

® LC-

20AT e um detector Shimadzu® SPD-M20A. Nas separações foram usadas uma coluna

Phenomenex® RP-18 (250 x 10 mm, 5 μm), mantida num forno a temperatura ambiente.

Foram empregados solventes de grau CLAE [MeOH, CH3CN (Tedia®

) e H2O (Milli-Q®

)]

que foram filtrados através de membranas de nylon com poros de 0,45 μm (Phenomex®

). As

amostras foram dissolvidas nas fases móveis empregadas em cada análise e filtradas em

membranas de teflon com poros de 0,45 μm (Waters®).

5.3 Métodos físicos

Os dados espectrais deste trabalho foram obtidos nos equipamento da Central

Analítica do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do

Ceará.

5.3.1 Ponto de fusão

Os pontos de fusão das substâncias isoladas foram determinados em equipamentos

de microdeterminação digital da Mettler Toledo® com placa aquecedora FP82HT e uma

central de processamento FP90. As determinações foram realizadas a uma velocidade de

aquecimento de 2 ºC/min e não foram corrigidos.

5.3.2 Rotação óptica [α]D

As rotações ópticas foram obtidas em polarímetro 341 da Perkin-Elmer®

,

operando a 589 nm, a temperatura de 25 ºC e utilizando uma cubeta de 5 mL.

161

OLIVEIRA, F.C.

5.4 Métodos espectrométricos e espectroscópicos

5.4.1 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN)

Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H) e

Ressonância Magnética Nuclear de Carbono 13 (RMN 13

C), uni e bidimensionais, foram

obtidos em espectrômetro Bruker®, modelo Avance DRX-500, operando na freqüência de 500

MHz para o hidrogênio e na frequência de 125 MHz para o carbono, localizado no Centro

Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear da Universidade Federal

do Ceará (CENAUREMN-UFC).

Os solventes deuterados utilizados na dissolução das amostras e obtenção dos

espectros foram: acetona [(CD3)2CO], piridina (C5D5N) e metanol (CD3COD). Seus

deslocamentos químicos (δ) foram expressos em parte por milhão (ppm) e referenciados nos

espectros de RMN 1H pelos picos dos hidrogênios pertencentes as moléculas residuais não-

deuteradas (δH, 2,06), (δH, 8,71; 7,55 e 7,19) e (δH 3,31), respectivamente. Nos espectros de

carbono 13, os deslocamentos químicos foram referenciados pelos picos dos carbonos-13 (δC

206 e 30,2), (δC 150,3; 135,9 e 123,9) e (δC 49,2), respectivamente.

As multiplicidades das absorções foram indicadas segundo a convenção: s

(singleto), d (dubleto), dd (duplo dubleto), t (tripleto), ddd (duplo dubleto dubleto) e m

(multipleto).

O padrão de hidrogenação dos carbonos no espectro de RMN 13

C foi determinado

através do emprego da técnica DEPT (Distortionless Enhacement by Polarization Transfer),

com ângulo de nutação (θ) de 135º com CH e CH3 com amplitude em oposição aos CH2, e foi

descrito conforme a convenção: C (carbono não hidrogenado), CH (carbono metínico), CH2

(carbono metilênico) e CH3 (carbono metílico). Os carbonos não hidrogenados foram

caracterizados pela subtração dos espectros de DEPT 135º e do espectro BB (Broad Band),

além das correlações dos espectros de HMBC e HSQC.

5.4.2 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IV)

Os espectros na região do infravermelho foram obtidos em Espectrômetro Perkin

Elmer®, modelo FT-IR Espectrum 1000, utilizando-se pastilhas de KBr para análise das

amostras.

162

OLIVEIRA, F.C.

5.5 Estudo dos constituintes não voláteis de L. rigida

5.5.1 Preparação dos extratos

As folhas (1,6 kg) e caule (3,1 kg) de L. rigida, secos à temperatura ambiente e

triturados, foram submetidos à extração com hexano seguido de etanol em intervalos de 24 h

(Fluxograma 1). As soluções resultantes das extrações foram filtradas e concentradas sob

pressão reduzida em evaporador rotativo, fluxograma 1.

Fluxograma 1 - Obtenção dos extratos hexânico e etanólico das folhas e do caule de L.

rigida.

5.5.2 Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico das folhas de L. rigida (LEF)

Parte do extrato LEF (23,0 g) foi adsorvido em 40 g de gel de sílica, pulverizada

em gral de porcelana e acondicionada sobre 203 g de gel de sílica em coluna cromatográfica

de 6,3 cm de diâmetro. Os solventes usados na eluição durante o fracionamento foram hexano

(2500 mL), diclorometano (3000 mL), acetato de etila (2800 mL) e metanol (1800 mL) puros

e em ordem crescente de polaridade. Após evaporação dos solventes, sob pressão reduzida em

evaporador rotativo, às massas foram sumarizadas na Tabela 29, p.163.

Material Botânico

Folhas (1,6 kg); caule (3,1 kg)

1.Pulverização 2. Extração com hexano (3x) 3. Evaporação do solvente

Extrato Hexânico (LHF) 13,0 g; (LCH) 25,1 g

(25,13 g)

Torta

1. Extração com etanol (3x)

2. Evaporação do solvente

Extrato Etanólico

(LEF) 45,0 g; (LEC) 51,0 g

Resíduo

163

OLIVEIRA, F.C.


folhas (LEF)

Eluente Fração Massa (mg) Rendimento (%)

Hexano LEFH 465,0 2,0

Diclorometano LEFD 3916,0 17,0

Acetato de etila LEFA 12108,0 52,6

Metanol LEFM 1978,0 8,6

Total 18467,0 80,3

5.5.3 Fracionamento cromatográfico do extrato etanólico do caule de L. rigida (LEC)

Parte do extrato LEC (32,3 g) foi adsorvido em 35,0 g de gel de sílica,

pulverizada em gral de porcelana e acondicionada sobre 202 g de gel de sílica em coluna

cromatográfica de 6,3 cm de diâmetro. Os solventes usados na eluição durante o

fracionamento foram hexano (2300 mL), diclorometano (3000 mL), acetato de etila (2800

mL) e metanol (1900 mL) puros e em ordem crescente de polaridade. Após evaporação dos

solventes, sob pressão reduzida em evaporador rotativo, as massas foram sumarizadas na

Tabela 30.


folhas (LEC)


Hexano LECH 146,0 0,4

Diclorometano LECD 1768,0 5,5

Acetato de etila LECA 5738,0 17,8

Metanol LECM 21186,0 65,8

Total 28838,0 89,5

5.5.4 Fracionamento cromatográfico da fração LEFD e isolamento de LEF-1 e LEF-2

Parte da fração LEFD (3,0 g) foi adsorvida em 5,4 g de gel de sílica, pulverizada

em gral de porcelana e acondicionada sobre 55 g de gel de sílica em coluna cromatográfica de

2,4 cm de diâmetro (Fluoxograma 2, p. 166). Os solventes usados na eluição foram

diclorometano e metanol em misturas binárias, em ordem crescente de polaridade, além de

164

OLIVEIRA, F.C.

metanol puro. Foram obtidas 58 frações de 10 mL cada, que foram concentradas a

temperatura ambiente e reunidas após análise em CCD, como descrito na Tabela 31.

Tabela 31 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFD

Eluente Frações Frações reunidas Massa (mg)

CH2Cl2/MeOH 10% 1-16 1-5 0,6

CH2Cl2/MeOH 20% 17-29 6-10 266,5

CH2Cl2/MeOH 30% 30-41 11-15 1608,0

CH2Cl2/MeOH 40% 42-50 16-20 915,2

MeOH 100% 51-58 21-26 50,9

27-28 10,2

29-30 7,5

31-33 12,5

34-58 12,0

Total 2883,4

A fração LEFD-11-15 (1,608 g) foi recromatografada por cromatografia de

exclusão em gel de dextrana Sephadex® LH-20 em coluna (2,8 cm de diâmetro e 39 cm de

altura). A eluição foi feita com metanol e foram coletadas 47 frações de 10 mL, que após

análise por CCD foram reunidas como descrito na Tabela 32.

Tabela 32 - Dados referente ao fracionamento cromatográfico por exclusão de LEFD-(11-15)


Metanol 48 1-11 31,3

12-14 128,0

15-19 97,0

20-26 241,7

27-29 388,0

30-36 177,0

37-40 2,2

41-48 3,4

Total 1068,6

165

OLIVEIRA, F.C.

A fração LEFD-(11-15)-(30-36) (177 mg) foi adsorvida em 4,7 g de sílica “flash”,

pulverizada em gral de porcelana e acondicionada sobre 26,6 g de sílica para cromatografia

“flash” em coluna cromatográfica de 1,6 cm de diâmetro e cromatografada sob baixa pressão.

O solvente usado na eluição isocrática foi hexano/acetato de etila 30% (500 mL). Foram

obtidas 51 frações de aproximadamente 10 mL cada, que foram reunidas após análise em

CCD, como descrito na Tabela 33. A fração (8-9) apresentou 59 mg de um sólido amorfo

amarelo, solúvel em metanol, que foi denominado de LEF-1.

Tabela 33 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFD-(11-15)-(30-36) e

isolamento de LEF-1


Hexano/AcOEt 30% 1-51 1-7 8,7

8-9 59,0

10-17 57,8

18-49 41,9

Total 167,4

A fração LEFD-(11-15)-(27-29) 388,0 mg foi adsorvida em 6,3 g de sílica para

cromatografia “flash”, pulverizada em gral de porcelana e acondicionada sobre 106 g de gel

de sílica em coluna cromatográfica de 1,6 cm de diâmetro e cromatografada sob baixa pressão

Os solventes usados na eluição durante o fracionamento foram hexano, acetato de etila e

metanol, puros ou em misturas binárias. Foram obtidas 67 frações de 10 mL cada, que foram

reunidas após análise em CCD, como descrito na Tabela 34. A fração (10-13) apresentou 6

mg de um sólido amorfo amarelo, solúvel em metanol, que foi denominado de LEF-2.

Tabela 34 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFD-(11-15)-(27-29) e

isolamento de LEF-2


Hexano/AcOEt 20% 1-13 1-5 2,5

Hexano/AcOEt 30% 14-22 6-7 4,7

Hexano/AcOEt 40% 23-32 8-9 3,4

Hexano/AcOEt 50% 33-41 10-13 6,0

Hexano/AcOEt 60% 42-50 14-18 79,6

AcOEt 100% 51-59 19-25 223,0

MeOH 60-67 26-67 54,3

Total 373,5

166

OLIVEIRA, F.C.

Fluxograma 2 - Fracionamento cromatográfico da fração LEFD, isolamento de LEF-1 e

LEF-2

5.5.5 Fracionamento cromatográfico da fração LEFA e isolamento de LEF-3, LEF-4 e

LEF-5

Parte da fração LEFA (4,2 g) foi submetida à fracionamento por exclusão

molecular em gel de dextrana de Sephadex® LH-20 em coluna cromatográfica (ф = 2,8 cm e

39 cm de altura) (Fluxograma 3, p. 169). A eluição foi feita com metanol e foram coletadas 96

frações de 10 mL, que após análise por CCD foram reunidas, como descritas na Tabela 35 (p.

167).

LEFD

(3,02 g)

LEFD-(11-15)

(1608,0 mg)

Demais frações (1008,0 g)

Demais frações (267,0 mg)

Coluna cromatográfica

Coluna Sephadex LH-20



LEFD-(27-29)

(484,0 mg)

LEFD-(30-36)

(177,0 mg)

Coluna “flash”

LEF-1

(59,0 mg)



Coluna “flash”

LEF-2

(6,0 mg)



167

OLIVEIRA, F.C.

Tabela 35 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFA por exclusão

molecular em gel de dextrna Sephadex® LH-20


Metanol 1- 96 1-11 6,4

12-20 26,2

21-25 131,0

26-29 72,9

30-33 174,0

34-35 255,0

36-54 3083,0

55-58 3,2

59-70 21,0

71-76 47,0

77-80 5,0

81-84 7,7

85-89 5,2

90-96 8,5

Total 3846,5

Uma alíquota da fração LEFA-(36-54) 3,1 g foi adsorvida em 8,7 g de sílica para

cromatografia “flash”, pulverizada em gral de porcelana e acondicionada sobre 51,3 g de

sílica “flash” em coluna cromatográfica de 1,6 cm de diâmetro e cromatografada sob baixa

pressão. Os solventes usados na eluição durante o fracionamento foram diclorometano,

acetato de etila e metanol em misturas ternárias. Foram obtidas 161 frações de 10 mL cada,

que foram reunidas após análise em CCD, como descrito na Tabela 36.

Tabela 36 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LEFA-(36-54)


CH2Cl2/AcOEt/MeOH 89/10/1 % 1- 34 1-4 1,9

CH2Cl2/AcOEt/MeOH 88/10/2 % 35-56 5-9 32,5

CH2Cl2/AcOEt/MeOH 84/13/3 % 57-68 10 29,6

CH2Cl2/AcOEt/MeOH 80/15/5 % 69-76 11 26,7

CH2Cl2/AcOEt/MeOH 70/20/10 % 77-86 12-27 1183

CH2Cl2/AcOEt/MeOH 60/25/15 % 87-98 28-47 666,7

CH2Cl2/AcOEt/MeOH 50/30/20 % 99-108 29-35 5,6

CH2Cl2/AcOEt/MeOH 40/35/25 % 109-119 36-42 5,7

CH2Cl2/AcOEt/MeOH 30/40/30 % 120-130 43-59 22,4

AcOEt/MeOH 50/50 % 131-139 60-79 42,5

MeOH 100% 140-161 80-99 30,3

100-128 11,7

129-147 9,8

148-161 6,5

Total 2074,9

168

OLIVEIRA, F.C.

Uma alíquota de 360,0 mg da fração LEFA-(77-86) foi analisada por CLAE, em

coluna semi-preparativa (C-18) em condições de fase reversa utilizando-se MeOH/H2O

(80:20) como fase móvel em modo isocrático, empregando-se um fluxo de 4,5 mL/min. O

cromatograma (Figura 139) exibiu seis picos a 284 nm. A fração referente ao pico 2 (250,0

mg; tR = 3,7 min) foi denominada LEF-3, ao pico 3 (42,1 mg; tr = 4,2 min) foi denominada

LEF-4 e ao pico 5 (7 mg; tr = 6,9 min) foi denominado de LEF-5.

Figura 139 – Cromatograma de análise da fração LEFA-(36-54)-(12-27) por CLAE, em

condições de fase reversa (MeOH/H2O 80:20, fluxo 4,5 mL/min e λ = 284 nm).

LEF-3

LEF-4

LEF-5

169

OLIVEIRA, F.C.

Fluxograma 3 – Fracionamento cromatográfico de LEFA e isolamento de LEF-3, LEF-4 e

LEF-5

5.5.6 Obtenção do óleo essencial e decocto das folhas de L. rigida

As folhas secas de L. rigida (424 g) foram trituradas mecanicamente e submetida

à extração por hidrodestilação (Fluxograma 4, p. 170) por 2 h em aparelho tipo Cleavenger

modificado. O óleo coletado foi seco com sulfato de sódio anidro (Na2SO4), acondicionado

em frasco de vidro âmbar hermeticamente fechado e armazenado sob refrigeração em freezer

para análise posterior. A solução aquosa resultante foi filtrada e concentrada sob pressão

reduzida em evaporador roatativo, rendendo 63,0 g de decocto que foi denominado LDF.

Demais frações

666,0 mg

LEFA-(36-54)

3080,0 mg

Demais frações

98,0 mg

LEFA

4,2 g

Coluna Sephadex LH-20

Demais frações

64,0 mg

LEFA-(36-54)-12-27)

360,0 mg

Demais frações

801,0 mg

Coluna “flash”

LEF-5

15,9 mg

Demais frações

8,0 mg

CLAE

LEF-3

250,0 mg

LEF-4

42,1 mg

Demais frações

39,0 mg

170

OLIVEIRA, F.C.

Fluxograma 4 - Extração do óleo essencial e obtenção do decocto das folhas de L. rigida

5.5.7 Análise química do óleo essencial por CG-EM e CG-DIC

A análise do óleo essencial foi realizada por cromatografia gasosa acoplada a

espectrômetro de massas (CG-EM) Shimadzu®

modelo QP-2010, equipado com coluna

capilar DB-5 (J W Scientific®, 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm) e detector série 5973 nas

seguintes condições operacionais: gás carreador hélio, fluxo de gás de 0,87 mL/min, razão de

split 1:100, temperatura programada inicial de 60 ºC por 3 min, taxa de aquecimento de 15

ºC/min até 290 ºC, temperatura do injetor de 280 ºC e temperatura da interface de 280 ºC. A

energia de ionização foi de 70 eV, o volume da amostra de 0,5 µL (CH2Cl2), modo varredura

com velocidade de 1,0 scan/s e intervalo de aquisição de 40 a 400 m/z.

A quantificação relativa dos constituintes foi realizada por CG-DIC em aparelho

Shimadzu®, modelo QP-2010, utilizando coluna capilar DB-5 (J W Scientific, 20 m x 0,18

mm x 0,25 µm), gás de arraste hélio, fluxo de gás de 1,0 mL/min, volume de injeção da

amostra de 1,0 µL (solução de 1,0 mg/mL de óleo em CH2Cl2) e razão de split 1:30. As

temperaturas do injetor e do detector foram fixadas em 220 e 280 °C, respectivamente e a

Material Botanico

(Folhas)-424,0 g

Óleo + hidrolato Folhas + solução aquosa

Hidrodestilação

Fase aquosa Fase orgânica

Óleo essencial

(OEFLR)-767,9 mg

Separação

1. Na2SO4

2. Filtração

Identificação

Análise por CG-EM e CG-DIC

Decocto (LDF)

(63,0 g)

Concentração sob

pressão reduzida

171

OLIVEIRA, F.C.

temperatura do forno foi programada a partir de 60-280 °C a 3 °C/min, mantendo-se 10 min a

280 °C no final da análise. A quantificação percentual relativa dos constituintes foi

determinada com base na área de cada pico em relação à área total dos picos no

cromatograma.

Cada componente do óleo essencial foi identificado com base no tempo de

retenção, índice de Kovats corrigido por regressão linear, bem como, por comparação do

padrão de fragmentação de cada componente com espectros de massa registrados na literatura.

5.5.8 Fracionamento por extração líquido-líquido de LDF

Parte do decocto LDF (41,6 g) foi solubilizada em 200 mL de MeOH/H2O na

proporção 4/6 e aquecida a uma temperatura de 40 °C. Em seguida foram feitas extrações

sucessivas com diclorometano (5 x 80mL), acetato de etila (5 x 80 mL) e n-butanol (5 x 80

mL). Após evaporação dos solventes, sob pressão reduzida em evaporador rotativo, as massas

foram sumarizadas na Tabela 37.

Tabela 37 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico do decoto das folhas de L.

rigida (LDF)


Diclorometano LDFD 2014,0 4,8

Acetato de etila LDFA 11544,0 27,8

n-Butanol LDFB 8210,0 19,7

Total 21768,0 52,4

5.5.9 Fracionamento cromatográfico da fração LDFA e isolamento de LDF-1, LDF-2 e

LDF-3

Parte da fração LDFA (3,3 g) foi adsorvida em 5,4 g de gel de sílica, pulverizada em

gral de porcelana e cromatografada sobre 55 g de gel de sílica em coluna cromatográfica de

2,4 cm de diâmetro (Fluoxograma 5, p. 174). Os solventes usados na eluição foram

diclorometano e metanol em misturas binárias, em ordem crescente de polaridade, além de

metanol puro. Foram obtidas 89 frações de 10 mL cada, que foram concentradas a

temperatura ambiente e reunidas após análise em CCD, como descrito na Tabela 38, p. 172.

172

OLIVEIRA, F.C.

Tabela 38 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LDFA


CH2Cl2/MeOH 10% 1-15 1-12 11,1

CH2Cl2/MeOH 20% 16-30 13-14 53,0

CH2Cl2/MeOH 30% 31-42 15-18 86,2

CH2Cl2/MeOH 40% 43-52 19-23 162,0

CH2Cl2/MeOH 60% 53-59 24-39 1900,0

CH2Cl2/MeOH 80% 60-72 40-49 640,6

MeOH 100% 73-89 50-53 49,0

54-89 94,1

Total 2996,0

A fração LDFA-(40-49) (640,6 mg) foi recromatografada sobre 56,6 g de gel de

sílica, por cromatografia “flash” em coluna (2,3 cm de diâmetro e 35 cm de altura). Os

solventes usados na eluição foram diclorometano e metanol em mistura binária, além de

metanol puro, em ordem crescente de polaridade. Foram obtidas 129 frações de 10 mL cada,

que foram concentradas a temperatura ambiente e reunidas após análise em CCD, como

descrito na Tabela 39. A fração (12-16) apresentou 30,0 mg de um sólido amorfo amarelo,

solúvel em metanol, que foi denominado de LDF-1.

Tabela 39 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LDFA-(40-49) e

isolamento de LFD-1


CH2Cl2/MeOH 5% 1-6 1-11 3,0

CH2Cl2/MeOH 10% 7-15 LDF-1 30,0

CH2Cl2/MeOH 15% 16-24 17-21 89,2

CH2Cl2/MeOH 20% 25-42 22-31 80,2

CH2Cl2/MeOH 30% 43-56 32-38 9,3

CH2Cl2/MeOH 40% 57-68 39-50 29,4

CH2Cl2/MeOH 50% 69-79 51-58 28,8

CH2Cl2/MeOH 60% 80-92 59-91 59,2

CH2Cl2/MeOH 80% 93-116 92-129

MeOH 100% 117-129

Total 309,1

173

OLIVEIRA, F.C.

A fração LDFA-(40-49)-(22-31) 80,2 mg foi adsorvida em 3,7 g de sílica para

cromatografia “flash”, pulverizada em gral de porcelana e acondicionada sobre 38 g de sílica

para cromatografia “flash” em coluna cromatográfica de 1,6 cm de diâmetro e cromatografada

sobre baixa pressão. Como solventes de eluição foram usados diclorometano e metanol em

misturas binárias, em ordem crescente de polaridade, além de metanol puro. Foram obtidas

87 frações de 10 mL cada, que foram concentradas a temperatura ambiente e reunidas após

análise em CCD, como descrito na Tabela 40. A fração (11-17) apresentou 38,9 mg de um

sólido amorfo amarelo, solúvel em metanol, que foi denominado de LDF-2 e a fração (38-48)

apresentou 9,0 mg de um sólido amorfo amarelo, solúvel em metanol, que foi denominado de

LDF-3.

Tabela 40 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LDF-(40-49)-(22-31) e

isolamento de LFD-2 e LFD-3.


CH2Cl2/MeOH 5% 1-11 1-10 2,0

CH2Cl2/MeOH 10% 12-22 11-17 31,9

CH2Cl2/MeOH 15% 23-36 18-19 9,0

CH2Cl2/MeOH 20% 37-47 20-37 14,6

CH2Cl2/MeOH 30% 48-58 38-48 9,0

CH2Cl2/MeOH 50% 59-68 49-60 3,7

CH2Cl2/MeOH 80% 69-78 61-89 2,9

MeOH 100% 79-87

Total 73,1

174

OLIVEIRA, F.C.

Fluxograma 5 - Fracionamento cromatográfico da fração LDFA e isolamento de LDF-1,

LDF-2 e LDF-3

5.5.10 Fracionamento cromatográfico da fração LECA e isolamento de LEC-1

Parte da fração LECA (5,3 g) foi submetida a fracionamento cromatográfico em

coluna (ф = 2,8 cm e 23 cm de altura) (Fluxograma 6, p. 177). A eluição foi feita com

diclorometano, acetato de etila e metanol, em misturas binárias e ternárias. Foram coletadas

61 frações de 10 mL, que após análise por CCD foram reunidas em 8 frações, como descrito

na Tabela 41, p. 175.

LDFA

(3,3 g)

LDFA-(40-49)

(640,6 mg)

Demais frações (143,1mg)


Coluna cromatografica

Coluna flash



LDF-1

(30,0 mg)

LDF-(22-31)

(80,2 mg)

LDF-(17-20) (89,2 mg)

Coluna flash

LDF-2

(31,9 mg)


LDF-(18-37)

(23,6 mg)


LDF-3

(9,0 mg)

175

OLIVEIRA, F.C.

Tabela 41 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LECA

Eluente Frações Frações

reunidas

Massa (mg)

CH2Cl2/Acetato de etila/MeOH 90/9/1 1-13 1-11 125,2





Acetato de etila/MeOH 60/40 47-53 27-28 130,0

MeOH 100% 54-61 29-31 172,9

32-61 3587,0

Total 4659,0

Uma alíquota da fração LECA-(32-61), 3587,0 mg, foi adsorvida em 4,7 g de

sílica para cromatografia “flash”, pulverizada em gral de porcelana e acondicionada sob 52,3

g de sílica para cromatografia “flash” em coluna cromatográfica de 2,3 cm de diâmetro e

cromatografada sobre baixa pressão. Os solventes usados na eluição foram hexano, acetato de

etila e metanol puro, em misturas binárias e ternárias. Foram obtidas 97 frações de 10 mL

cada, que foram reunidas após análise em CCD, como descrito na Tabela 42.

Tabela 42 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LECA-(32-61)

Eluente Frações Frações

reunidas

Massa (mg)

Hexano/Acetato de etila/MeOH 28/70/2 1-27 1-12 36,7





Acetato de etila/MeOH 50/50 70-80

Acetato de etila/MeOH 30/70 81-91

MeOH 100% 92-97

Total 1904,4

A fração LECA-(32-61)-(18-25), 254,5 mg, foi recromatografada, por

cromatografia de exclusão molecular em gel de dextrana de Sephadex® LH-20 em coluna (2,8

176

OLIVEIRA, F.C.

cm de diâmetro e 39 cm de altura). A eluição foi feita com metanol e foram coletadas 54

frações de 10 mL, que após análise por CCD foram reunidas, como descrito na Tabela 43.

Tabela 43 - Dados referentes ao fracionamento cromatográfico de LECA-(32-61)-(18-25)


Metanol 54 1-12 15,4

13-16 36,7

17-20 38,4

21-29 38,1

30 2,6

31-37 87,7

38-54 15,6

Total 234,5

A fração LECA-(32-61)-(18-25)-(31-37) 87,7 mg foi adsorvida em 3,3 g de sílica

para cromatografia “flash”, pulverizada em gral de porcelana e acondicionada sobre 33,3 g de

gel de sílica em coluna cromatográfica de 1,6 cm de diâmetro e cromatografada sob baixa

pressão. Os solventes usados na eluição foram diclorometano e metanol em misturas binárias,

em ordem crescente de polaridade, além de metanol puro. Foram obtidas 103 frações de 10

mL cada, que foram concentradas a temperatura ambiente e reunidas após análise em CCD,

como descrito na Tabela 44. A fração (20-27) apresentou 60,0 mg de um sólido amorfo

amarelo, solúvel em metanol, que foi denominado de LEC-1.

Tabela 44 - Dados referente ao fracionamento cromatográfico de LECA-(32-61)-(18-25)-(31-

37)


CH2Cl2/MeOH 5% 1-12 1-16 2,0

CH2Cl2/MeOH 10% 13-24 17-18 3,0

CH2Cl2/MeOH 20% 25-33 19 2,0

CH2Cl2/MeOH 30% 34-43 20-27 60,0

CH2Cl2/MeOH 40% 44-54 28,54 2,3

CH2Cl2/MeOH 60% 55-65 55-103 3,1

CH2Cl2/MeOH 80% 66-76

MeOH 100% 77-103

Total 72,4

177

OLIVEIRA, F.C.

Fluxograma 6 - Fracionamento cromatográfico da fração LECA e isolamento de LEC-1

Coluna Sephadex® LH-20

LECA

(5,3 g)

LECA-(32-61) (3587,0 mg)


Coluna cromatografica

Coluna “flash”



LECA-(18-25)

(254,5 mg)



LECA-(31-37)

(87,7 mg)



LEC-1

(60,0 mg)

178

OLIVEIRA, F.C.

6. ATIVIDADES BIOLOGICAS

6.1 Ensaio de atividade de citotoxicidade in vitro frente à linhagem de células

cancerígenas.

A investigação de citotoxicidade do óleo essencial das folhas de L. rigida foi

realizada com 3 linhagens tumorais (MDA-MB435, HCT-8 e SF-295) pelo método de

redução do 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-brometo tetrazolina (MTT), seguida de

análise colorimétrica. As amostras foram testadas em triplicatas e em dose única de 50 µg/mL

para determinação do percentual de inibição do crescimento celular.

O óleo essencial apresentou boa atividade de citotoxicidade contra as linhagens de

células cancerígenas MDAMB-435, HCT-8 e SF-295, com IC% de 83,79; 86,80 e 79,41%,

respectivamente. De acordo com a literatura, os componentes majoritários do óleo (α-

humuleno e β-cariofileno) apresentam atividade citotóxica. Bem como os sequiterpenos

germacreno-D (8,6%) e α-copaeno (2,8%) também apresentam atividade citotóxica (WRIGHT

et al., 2007) e um efeito de sinergia dos constituintes poderia estar contribuindo para a

atividade citotóxica do óleo essencial de L. rigida.

Os ensaios de citotoxicidade dos extratos e dos flavonóides isolados foram

realizados somente com a linhagem de célula HCT-8 (cólon) em concentração única de 50

μg/mL. De acordo com a Tabela 45, p.179, somente os flavonoides LEF-1 (sakuranetina);

LDF-3 (quercetina) e LEF-4 (7-metoxi aromadendrina) apresenteram atividade citotóxica

significativa. O flavonoide LEF-4, com 94,74% de IC pode ser considerada uma substância

com elevada citotoxicidade e com potencial de atividade anticâncer.

O ensaio de atividade citotoxicidade frente a linhagem de células cancerígenas foi

realidado no Laboratório de Oncologia Experimental, sob a supervisão da profesora Dra.

Letícia V. Costa-Lotufo do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC.

179

OLIVEIRA, F.C.

Tabela 45 - Percentual de inibição do crescimento celular de amostras testadas em

concentração única (50 μg/mL) frente à linhagem de células tumorais HCT-8 (cólon)

6.2 Ensaio de atividade larvicida com o óleo essencial das folhas de L. rigida

No ensaio de atividade larvicida, os ovos de A. aegypti foram eclodidos em água

isenta de cloro à temperatura ambiente. Em condições normais, os ovos maduros eclodem

quando submersos em meio líquido e apresentam quatro estágios larvários, sendo

selecionadas larvas de estágio 3 para serem utilizadas nos ensaios.

Em um béquer de 50 mL, à temperatura ambiente, as amostras testadas, em

diferentes concentrações (12,5 µg/mL a 500 µg/mL) foram dissolvidas em 0,3mL de DMSO e

a cada solução foram adicionadas 50 larvas de estágio 3, completando-se o volume para 20

mL com água. Após 24 horas, à temperatura ambiente, as larvas mortas foram contadas e

calculada a percentagem letal e posteriormente a CL50. Os testes foram feitos em triplicatas.

Utilizando-se como controle negativo a solução DMSO 1,5%. O ensaio foi realizado no

Laboratório de Entomologia do Núcleo de Endemias da Secretária de Saúde do Estado do

Ceará, sob coordenação da prof.ª Dra. Gilvandete Maria Pinheiro Santiago.

A investigação da atividade larvicida do óleo essencial de L. rigida contra as

larvas do mosquito A. aegypti revelou uma CL50 de 138,9 ± 1,2 μg/mL, que pode ser

considerada uma atividade moderada.

Amostra 50 μg/mL Amostra 50 μg/mL

% Inibição % Inibição

LCH -12,35% LEF-4 94,74%

LCA 2,60% LEF-6 49,40%

LCE 1,74% LEC-1 65,75%

LEF-1 73,76% LDF-1 49,78%

LEF-2 4,27% LDF-2 65,37%

LEF-3 30,87% LDF-3 76,07%

180

OLIVEIRA, F.C.

6.3 Ensaio de atividade inibitória da enzima acetilcolinesterase

A inibição da enzima acetilcolinesterase (AChE), foi realizada segundo a

metodologia descrita por ELLMAN (ELLMAN, 1961), modificada por RHEE (RHEE et al.,

2001). Neste ensaio, as amostras, forma testadas nas concentrações de 4 mg/mL para extratos

e de 2 mg/mL para óleo essencial, substâncias isoladas e do controle positivo (fisoestigmina).

As amostras foram aplicadas em CCD (Silicagel 60 F254, 0,2 mm Merck) por meio de um

capilar de vidro e deixadas em repouso até a evaporação do solvente. Em seguida, pulverizou-

se a placa com uma solução contendo o substrato (ATCI, 1mM e tampão 1) e o reagente de

Ellman (ácido 5,5’-ditiobis-[2-nitrobenzóico], DTNB, 1mM em tampão 1) e aguardou-se a

secagem da placa durante 3 a 5 minutos. Após esse tempo borrifou-se a enzima AChE na

concentração de 3 U/mL em tampão 1. Decorridos 7 minutos, a cromatoplaca desenvolveu

uma coloração amarela, com o aparecimento de halo branco em torno dos “sports” das

amostras onde houve inibição da enzima, cujos diâmetros foram imediatamente medidos. Em

virtude de sua eficácia o método de Ellman tem sido rotineiramente empregado, como ensaio

preliminar, na avaliação da atividade de metabólitos secundários sobre a enzima AChE.

O ensaio de atividade de inibição da enzima acetilcolinesterase foi realizado no

Laboratório de Pesquisa em Química (LPQ), sob a supervisão da Profa. Dra. Jane Eire Silva

Alencar de Menezes, do Curso de Química - Faculdade de Educação de Itapipoca (FACEDI),

Universidade Estadual do Ceará – UECE.

Conforme a Tabela 46, p.181, os extratos (LEC e LDF) e as substâncias LEF-1

(sakuranetina), LDF-2 (canferol) e LEC-1 (taxifolina), apresentaram bons resultados, quando

comparados com o padrão fisostigmina.

O óleo apresentou um halo de inibição de 9 mm, o mesmo apresentado pela

fisoestigmina (controle positivo). A elevada atividade apresentada pelo óleo de L. rigida pode

estar relacionada com a presença dos constituintes α-humuleno, limoneno, α-pineno e linalol,

os quais apresentam ação inibitória da AChE descrita na literatura (HOWES e HOUGHTON,

2003; PERRY et al., 2003).

181

OLIVEIRA, F.C.

Tabela 46 – Medida do halo de inibição da enzima acetilcolinesterase

Amostra Halo de inibição (mm) Amostra Halo de inibição (mm)

LEC 7 LEF-5 Negativo

LDF 8 LDF-2 8

LEF Negativo LDF-3 Negativo

LEF-1 8 LEC-1 8

LEF-2 Negativo OEFLR 9

LEF-3 Negativo Fisostigmina

(padrão)

9

LEF-4 7

6.4 Ensaio de atividade de citotoxicidade frente Artemia salina

O ensaio de toxicidade foi realizado, utilizando-se a metodologia de Meyer. Os

cistos de Artemia salina foram mantidos por 24 h em um aquário com água do mar artificial

(38 g/L) filtrada, sob aeração suave e iluminação intensa, até a eclosão dos naupilus. Dez

naupilus de Artemia salina foram transferidos para cada um dos frascos contendo água do mar

artificial/DMSO 1% (v/v) e as amostras a serem testadas em quatro concentrações diferentes

(1000; 100; 10 e 1 ppm). Os frascos foram mantidos sob iluminação e a contagem dos

naupilus mortos e vivos foi realizada após 24 h. como controle positivo utilizou-se a cafeína e

como controle negativo utilizou-se a solução de água do mar artificial com DMSO 1%. As

análises foram feitas em triplicatas e utilizou-se o método de Probitos de análise para

obtenção dos valores DL50 (HOWES e HOUGHTON, 2003).

De acordo com a Tabela 47, p.182, os extratos etanólicos do caule e das folhas

LEC e LEF apresentaram valores de DL50 892,92 e 67,67, respectivamente. Já o extrato

obtido do decocto das folhas (LDF) apresentou uma DL50 de 78,91 μg/mL. O óleo essencial

das folhas (OEFLR) se mostrou bastante ativo com uma DL50 de 18,9 μg/mL. Desta forma, a

elevada citotoxicidade apresentada pelo óleo essencial corrobora a atividade de citotoxicidade

apresentada frente à linhagens de células cancerígenas.

182

OLIVEIRA, F.C.

Tabela 47 - Percentual de citotoxicidade frente as larvas de Artemia salina.

Amostra DL50 (µg/mL)

LEC 892,92

LDF 78,91

LEF 67,67

OEFLR 18,9

Cafeína

(padrão)

280,9

6.5 Ensaio de atividade antioxidante

O método utilizado para avaliar a atividade antioxidante foi DPPH (1,1-difenil-2-

picrilhidrazil) (Figura 154)(YEPEZ et al., 2002). Sendo que em um tubo de ensaio, colocou-

se 3,9 mL de uma solução metanólica de radical livre DPPH 6,5 x 10-5

M de coloração roxa.

Em seguida adicionou-se ao tubo 0,1 mL da solução metanólica do óleo essencial (0,1 g/mL)

a ser testado. Mediu-se a absorbância em um espectrofotômetro ajustando-se a um

comprimento de onda de 515 nm no intervalo, de 0 até 60 minutos. Não se observou o

desaparecimento da coloração do DPPH na presença de substâncias antioxidantes.

A atividade antioxidante de óleos essenciais é determinada através da sua

capacidade de sequestar o radical DPPH onde se calcula o potencial de inibição do DPPH da

amostra em percentagem (PI%) usando-se a formula:

P I

A D P P H A a m ostra

A D P P H

x 100

Sendo ADPPH a absorbância inicial da solução de DPPH e AAMOSTRA a absorbância final,

decorridos 60 minutos. A leitura é feita na proporção molar eugenol/DPPH de 0,5.

Figura 140 - Estrutura química do radical livre DPPH

N N

O 2 N

O 2 N

NO 2

183

OLIVEIRA, F.C.

O ensaio de atividade antioxidante foi realidado no Laboratório Produtos Naturais

e Biotecnologia, sob a supervisão da profesora Dra. Telma Leda Gomes de Melo, do

Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, da UFC.

O óleo essecnial foi submetido ao ensaio de atividade antioxidade, porém se

mostrou inativo. Os metabolitos secundários não foram testados porque já havia relato na

literatura, para todos os compotos isolados.

6.6 Ensaio de atividade nematicida

As massas de ovos de nematóides (Meloidogyne incogna) foram extraídas de das

raízes de Vernonia sp e colocados em uma placa de Petri de 5 cm de diâmetro, durante 24 h

em água destilada para a eclosão dos juvenis. Após a eclosão, porções de 50 μL de água

destilada contendo cerca de 100 juvenis (J2) foram colocadas em placa de Elisa, e

acrescentados soluções das amostras a serem testadas dissolvidas em uma solução DMSO 2%

em 4 concentrações (1000; 500; 250 e 100 µg/mL). Em seguida foi adicionada uma solução

de H2O:DMSO 2% até completar o volume de 1 mL. Os ensaios foram realizados em

triplicata, utilizando-se como controle negativo de DMSO 2%. As placas de Elisa foram

mantidas a temperatura ambiente para posterior contagem dos nematóides mortos.

O óleo essecnial e os extratos não apresentaram atividade nematicida.

6.7 Ensaio de atividade antibacteriana

A determinação da atividade antibacteriana das amostras foi realizadas pelo o

método de difução de Agar, em disco de papel. Os extratos e quatro dos flavonóides isolados

foram testados frente à cepas de diferentes espécies de Vibrio, além de outras espécies

causadoras de problemas na carcinicultura.

Os ensaios foram realizados no LABOMAR sob a supervisão da professora Dra

Regine Helena Silva dos Fernandes Vieira. Segundo mostra a Tabela 48 e Figura 141, p. 184,

somente o flavonóide LEF-3 se mostrou ativo contra Pseudomanas aerugina com halo de

inibição de 12,21 mm.

184

OLIVEIRA, F.C.

Tabela 48 - Resultado – Atividade antibacteriana pelo teste de difusão em disco Média e DP

dos halos de inibição.

Código Cepas

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

LDF - - - - - - - - - - - - - - -

LFA - - - - - - - - - - - - - - -

LFE - - - - - - - - - - - - - - -

LFH - - - - - - - - - - - - - - -

LEC - - - - - - - - - - - - - - -

LEF - - - - - - - - - - - - - - -

LEF-1 - - - - - - - - - - - - - - -

LEF-3 - - - - - - - - - - - - 12,21±0,39 - -

LEF-4 - - - - - - - - - - - - - - -

LEC-1 - - - - - - - - - - - - - - -

Código Espécie Origem Código Espécie Origem

1 V. xuii Hemolinfa

L. vannamei 9 V. ponticus Ostra C.

rhizophorae

2 V. parahaemolyticus Hemolinfa

L. vannamei 10 V. rumoiensis Ostra C.

rhizophorae

3 V. brasiliensis Hemolinfa

L. vannamei 11 V.

parahaemolyticus

ATCC

17802

4 V. vulnificus Hemolinfa

L. vannamei 12 Escherichia coli ATCC

25922

5 V. cholerae Hemolinfa

L. vannamei 13 Pseudomonas

aeruginosa

ATCC

27853

6 V. parahaemolyticus Ostra C.

rhizophorae 14 Staphylococcus

aureus

ATCC

25923

7 V. parahaemolyticus Ostra C.

rhizophorae 15 Samonella IOC

8 V. proteolyticus Ostra C.

rhizophorae

Figura 141 - Halo de inibição do crescimento bacteriano de Pseudomonas aeruginosa pelo

método de difusão em disco.

185

OLIVEIRA, F.C.

7. CONSIDERAÇÕES FINAIS

O primeiro estudo químico do extrato etanólico das folhas de L. rigida Schauer

(Verbenaceae) permitiu o isolamento de 9 flavonóides do tipo flavanonas: sakuranetina,

pinocembrina, naringenina, quercetina, 7-metoxi aromadendrina, taxifolina, genkwanina e

ramnocitrina e canferol, sendo que os quatro primeiros flavonóides já foram relatados para o

gênero Lippia, e os demais estão sendo descritos pela primeira vez para o gênero Lippia.

Os compostos sakuranetina, a 7-metoxi aromadendrina e quercetina, apresentaram

considerável atividade citotoxicidade contra a linhagem de célula HCT-8. Os extratos (LEC e

LDF) e as substâncias sakuranetina, canferol e taxifolina, apresentaram signifivativa atividade

de inibição da enzima acetilcolinesterase, quando comparados com o padrão fisostigmina.

Com relação a atividade antibacteriana o flavonoide naringenina apresentou uma considerável

atividade. Já com relação a atividade namaticida os extratos mostraram-se inativos.

O estudo de caracterização da composição química do óleo essencial das folhas de

L. rigida posibilitou a identicação de 24 constituintes (94,1%), sendo 11,2% de monoterpenos

e 82,9% de sesquiterpenos. A presença do sesquiterpeno α-humuleno (42,3%) como

constituinte majoritário revelou um perfil químico diferenciado para o óleo essencial de L.

rigida em relação às demais espécies do gênero. O óleo demonstrou moderada atividade

larvicida com CL50 de 138,9 ± 1,2 μg/mL e elevado potencial citotóxico, relacionados,

possivelmente, ao efeito sinérgico dos sesquiterpenos presentes. A elevada atividade de

inibição da enzima acetilcolinesterase in vitro, sugere a continuidade de estudos para um

melhor conhecimento deste potencial. Os resultados obtidos neste estudo demonstram a

importância química e biológica de plantas do gênero Lippia na busca de agentes naturais

ativos.

Além disso, o isolamento de flavonóides da espécie L. rigida corrobora com a

dispersão quimiotaxonômica desta classe para o gênero Lippia contribuido para um melhor

conhecimento químico do gênero.

186

OLIVEIRA, F.C.

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