MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

E SAÚDE PÚBLICA

MAURÍCIO BARCELOS COSTA

Estudo in situ da heterogeneidade de mastócitos e

células T reguladoras em pacientes com hanseníase,

com e sem episódios reacionais

Goiânia-GO

2014

ii

Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e Dissertações

Eletrônicas (TEDE) na Biblioteca Digital da UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás–UFG a disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações – BDTD/UFG, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [] Dissertação [X] Tese

2. Identificação da Tese ou Dissertação

Autor(a): Maurício Barcelos Costa CPF: 158.666.371-20 E-mail: mbarceloscosta@gmail.com Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [X]Sim [ ] Não Vínculo Empre- gatício do autor

Professor – 40 horas - Regime Jurídico Único – Faculdade de Medicina - UFG

Agência de fomento: Conselho Nacional de Pesquisa Sigla: CNPq País: Brasil UF: Goiás CNPJ: Título: Estudo in situ da heterogeneidade de mastócitos e células T reguladoras em

pacientes com hanseníase, com e sem episódios reacionais Palavras-chave: Treg, mastócitos, triptase, quimase, hanseníase, dermatoses Título em outra língua: In situ study of the heterogeneity of mast cells and regulatory T cells

in patients with leprosy, with and without reactional episodes Palavras-chave em outra língua: treg, mast cell, tryptase, chymase, leprosy, skin diseases Área de concentração: Doenças Infecciosas e Parasitárias Data defesa: (dd/mm/aaaa) 26/02/2014 Programa de Pós-Graduação: EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA Orientador(a): Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani CPF: 260.258.841-53 E-mail: mmastefani@gmail.com Co-orientador(a): CPF: E-mail:

3. Informações de acesso ao documento: Liberação para disponibilização?1 [ X ] total [ ] parcial Em caso de disponibilização parcial, assinale as permissões: [ ] Capítulos. Especifique: __________________________________________________ [ ] Outras restrições: _____________________________________________________

Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação. O Sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat. ________________________________________ Data: 10 /04 /2014 Assinatura do autor

1 Em caso de restrição, esta poderá ser mantida por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Todo resumo e metadados ficarão sempre disponibilizados.

iii

MAURÍCIO BARCELOS COSTA

Estudo in situ da heterogeneidade de mastócitos e

células T reguladoras em pacientes com hanseníase,

com e sem episódios reacionais

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública

da Universidade Federal de Goiás para obtenção do

Título de Doutor em Doenças Infecciosas e

Paraitárias.

Orientadora: Profa. Dra. Mariane Martins de

Araújo Stefani

Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro do Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq – projeto n. 401276/) e da American Leprosy Missions.

Goiânia-GO

26-02-2014

iv

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação na (CIP) GPT/BC/UFG

Costa, Maurício Barcelos. xxxx Estudo in situ da heterogeneidade de mastócitos e células T

reguladoras em pacientes com hanseníase, com e sem episódios reacionais e em outras dermatoses [manuscrito] / Maurício Barcelos Costa. - 2014.

xxx f. Orientadora: Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo

Stefani. Dissertação (Doutorado) – Universidade Federal de Goiás,

Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2014. Bibliografia. Inclui lista de figuras, abreviaturas, siglas, tabelas e

anexos. 1. Hanseníase 2. Matócitos 3. Células T reguladoras.

Título.

CDU: xxx-xxx.xx

v

Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da

Universidade Federal de Goiás

BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO

Aluno: MAURÍCIO BARCELOS COSTA ____________________________________________________________

Orientadora: PROFA. DRA. MARIANE MARTINS DE ARAÚJO STEFANI

__________________________________________________________

Membros:

1. Profa. Dra. Isabela Wastowski – UEG

2. Prof. Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira – UFAM

3. Profa. Dra. Mirian Lane C. de O. Rodrigues – UCG

4. Profa. Dra. Sônia Maria Oliani – IBILCE – UNESP

5. Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani – IPTSP - UFG

Data: 26/02/2014

vi

Dedico minha Tese de Doutorado

Aos Meus Pais, José (Seu Juquita – 80 anos) e Zany;

A Minha Esposa, Eula Maria; e aos Meus Filhos, Fabrício, Mariane e Flávia.

“Feliz é aquele que transfere o que sabe e aprende o que ensina”.

Cora Coralina

vii

AGRADECIMENTOS

Primeiramente à DEUS, por tudo, por permitir a realização dos meus sonhos.

A Eula, minha esposa, cúmplice e companheira de todas ashoras, por entender-me sempre que foi preciso, mantendo a harmonia do lar. A Sogra, que não posso esquecer, Dona Ica, pela amizade e que soube cuidar bem da Eula, para que eu pudesse desfrutar deste convívio.

Aos meus pais, José (Seu Juquita) e Zany, grandes responsáveis por todas asminhas vitórias e de meus irmãos, por tudo que fizeram por mim e por nós, durante toda a minha vida.

Aos meus irmãos, Marcos, Márcio, Maria Márcia, Maristela, Marlúcia, Marcelo e Mônica (“in memoriam”), pela confiança que em mim sempre depositaram epelo apoio em todas as ocasiões.

Aos meus filhos, Fabrício, Mariane e Flávia, motivo de orgulho e de grandes alegrias, apesar das preocupações.

A Dra. Ana Lúcia Osório Maroccolo de Sousa, minha estimada ex-aluna, colega, mãe e esposa dedicada, por toda abnegação e contribuição na parte clínica do projeto. Sem você este trabalho não seria possível.

A enfermeira Maria Divina Silva (Divina Morena), pelo carinho, dedicação e auxílio no recrutamento dos pacientes comhanseníase, peça importante neste quebra-cabeça.

Aos colegas do Laboratório de Imunologia, Mônica Nogueira da Guarda Reis, Yanna Lima, Keila Alcântara, eespecialmente para turma da hansenologia Regiane Morillas de Oliveira, Ludimila Cardoso, Emerith Mayra Hungria, Danielle de Freitas Mizoguti, Aline Freitas e Rodrigo Scalianti Moura, pelas trocas de conhecimentos, experiências, companheirismo, cumplicidade e dedicação. Uma equipe.

Aos professores do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública (IPTSP), por todos os ensinamentos transmitidos. A todos os professores que tive ao longo de minha jornada de doutorando e todos os demais.

A Direção do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública e a Coordenaçãodo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade Federal deGoiás. Aos colegas e funcionários do IPTSP. Na pessoa da Profa. Dra. Marília Dalva Turchi, agradeço a todos!

A Direção Geral do Centro de Referência em Diagnóstico e Terapêutica e a Secretaria Municipal de Saúde de Goiânia, na pessoa da Enfermeira Ana Cecília Coelho, meus agradecimentos e reconhecimento pelo trabalho dedicado à saúde de nosso povo.

Aos pacientes e voluntários que fizeram parte deste estudo, pela permissão quenos deram de estudá-los para a evolução da medicina e ciência.

viii

Ao Dr. Sebastião Alves Pinto, amigo e colaborador de todas as horas, pelo apoio na imuno-histoquímica e outros.

Ao Alexandre Alves Vieira, meu amigo e Histotécnico, que com dedicação e carinho, preparou todas as lâminas para nossos estudos.

A Flávia Aparecida Rodrigues, Secretária de todos os momentos, que pacientemente tolerou-me por todos estes anos e fez a revisão nos bancos de dados. Mais recentemente a nova Secretária, Eliete Macedo da Silva, cúmplice das pequenas inverdades juntos aos Médicos e pacientes, quando meu tempo era escasso e necessário à realização desta tese.

Andréia Luiza Pereira e Magno Belém Cirqueira, biomédicos, técnicos em Imuno-histoquímica da Patologia do HC-UFG, que gentilmente ajudaram-me nas preparações de lâminas da imuno-histoquímica convencional.

Aos Colegas Professores e Médicos Residentes do Departamento de Patologia, Radiologia, Imaginologia e Diagnóstico por Imagem, pelo companheirismo e compreensão pela nossa ausência temporária e parcial.

A Profa. Dra. Sônia Maria Oliani do IBILCE da UNESP de São José do Rio Preto, que viabilizou a realização do estudo de heterogeneidade dos mastócitos em seu laboratório de Imunomorfologia.

A Kallyne Kioko Oliveira Mimura e Rubens de Paula Júnior, colegas do IBILCE da UNESP de São José do Rio Preto, com quem realizamos a contagem dos mastócitos e imuno-histoquímica e densitometria (quimase e tripatse).

Ao Prof. Dr. Fernando Augusto Soares, Professor Titular da USP, Chefe do Departamento de Patologia do Hospital A. C. Camargo – SP, que viabilizou a realização da dupla marcação no laboratório do Centro Internacional de Pesquisa (CIPE).

Ao Juliano Jampietro, colega do Hospital A. C. Camargo – SP, orientando de Mestrado do Prof. Dr. Fernando Augusto Soares, que realizou a dupla marcação imuno-histoqímica, CD25/Foxp3.

A todas as pessoas que direta ou indiretamente me fizeram seguir em frente e que porventura ou desventura esqueci-me de nominar, meus sinceros agradecimentos.

Agradecimento especial

A Professora Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani, minha orientadora, pela

dedicação, pelas oportunidades que tem dado a muitos pós-graduandos, durante vários

anos, pela garra e determinação, paciência e incentivo. Pelo muito que tem produzido

com o pouco que nos é dado e pela manutenção de um grupo de pesquisa dedicado à

Hanseníase. Meus sinceros agradecimentos. Sua orientação foi imprescindível e sem

está minha tese não seria possível!

ix

SUMÁRIO

Agradecimentos ............................................................................................................vii

Sumário ........................................................................................................................ix

Tabelas, figuras e anexos ..............................................................................................xii

Símbolos, siglas e abreviaturas ......................................................................................xiv

Apresentação ................................................................................................................xvii

Resumo .........................................................................................................................xxiii

Abstract ........................................................................................................................xxv

Organização da tese ................................................................................................xxvii

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 1

1.1 Conceito ..................................................................................................................1

1.2 Agente etiológico, infecção e doença ................................................................ 1

1.3 Aspectos históricos................................................................................................3

1.4 Dados epidemiológicos – retrospectiva e atualidade ................................................6

1.5 Manifestações clínicas da Hanseníase – definição de caso ................................ 14

1.5.1 Manifestações cutâneasna Hanseníase ..............................................................15

1.5.2 Manifestações neuraisna Hanseníase ................................................................17

1.5.3 Manifestações otorrinolaringológicas na Hanseníase ................................ 19

1.5.4 Manifestações oftalmológicas na Hanseníase ...................................................20

1.5.5 Manifestações viscerais e/ou sistêmicas na Hanseníase ................................21

1.6 Imunologia da Hanseníase .......................................................................................22

1.6.1 A resposta imune inata contra o M. leprae .......................................................22

1.6.2 A resposta imune adaptativa contra o M. leprae ...............................................26

1.6.3 Hanseníase e Células T reguladoras ................................................................33

1.6.4 Hanseníase e Mastócitos ..................................................................................37

1.7 Hanseníase: classificação de Ridley-Jopling e a classificação operacional–

OMS/MS-Brasil ............................................................................................................

42

1.8 Hanseníase e Genética .............................................................................................46

1.8.1 Predisposição genética e resposta imune inata para a hanseníase ......................46

1.8.2 Predisposição genética e resposta imune adquirida para a hanseníase ..............48

1.9 Diagnóstico .............................................................................................................51

1.9.1 Baciloscopia ................................................................................................52

x

1.9.2 Biópsia e exame histopatológico ................................................................ 52

1.9.3 Biologia Molecular ..........................................................................................53

1.9.4 Estudos sorológicos ........................................................................................54

1.9.4.1 Sorologia anti-PGL-I e outras proteínas ou peptídeos do M. leprae ...............54

1.9.4.2 Avaliação da imunidade celular a peptídeos e proteínas

recombinantes do M. leprae ......................................................................................

58

1.9.4.3 Testes cutâneos para avaliação da imunidade celular ao M. leprae ................61

1.9.4.4 Outros meios auxiliares de diagnóstico .........................................................62

1.10 Diagnósticos Diferenciais ......................................................................................62

1.11 Reações Hansênicas ..............................................................................................64

1.11.1 Reação Tipo 1(RT1 ou Reação Reversa) ........................................................65

1.11.2 Reação Tipo 2 (RT2 ou Eritema Nodoso Hansênico ................................ 67

1.11.3 O impacto das reações no manejo clínico da hanseníase ................................71

1.12 Tratamento: Multidrogaterapia (Poliquimioterapia) ...............................................71

1.12.1 Tratamento: Multidrogaterapia nos adultos .....................................................72

1.12.2 Tratamento: Multidrogaterapia nas crianças e adultos com até 30 Kg ..............74

1.12.3 Tratamento: Multidrogaterapia nas reações .....................................................75

1.12.3 Tratamento: Métodos profiláticos e vacina .......................................................75

2. JUSTIFICATIVA ................................................................................................79

3. OBJETIVOS ...............................................................................................................81

4. APRESENTAÇÃO DOS MANUSCRITOS ..............................................................82

5. RESULTADOS ................................................................................................ 83

5.1. ARTIGO 1: In situ expression of CD25+ Foxp3+ Regulatory T Cells in

human skin diseases: leprosy and leprosy reactions .................................................

83

Abstrat .................................................................................................................83

Introduction .........................................................................................................84

Methods ...............................................................................................................86

Results .................................................................................................................89

Discussion ...........................................................................................................91

References ...........................................................................................................96

Table 1 .................................................................................................................99

Figure 1 ...............................................................................................................99

Figure 2 ...............................................................................................................100

xi

Figure 3 .................................................................................................................101

Figure 4 ...............................................................................................................102

Figure 5 ...............................................................................................................103

Figure 6 ...............................................................................................................104

Figure supplementary 1 ........................................................................................105

5.2. ARTIGO 2: Mast cell heterogenity in human dermatoses: in situ

tryptase and chymase positive cells with emphasis on leprosy and leprosy

reactions ..................................................................................................................

106

Abstrat .................................................................................................................106

Introduction .........................................................................................................107

Methods ...............................................................................................................108

Results .................................................................................................................111

Discussion ...........................................................................................................113

References ...........................................................................................................119

Table 1 .................................................................................................................123

Figure 1 ...............................................................................................................124

Figure 2 ...............................................................................................................125

Figure 3 .................................................................................................................126

Figure 4 ...............................................................................................................127

Figure 5 ...............................................................................................................128

6. CONCLUSÕES ................................................................................................ 129

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 130

8. ANEXOS ..................................................................................................................150

xii

TABELAS, FIGURAS E ANEXOS

Tabela 1. Casos registrados e estimados de hanseníase no mundo em 1966 ..................6

Tabela 2. Casos de Hanseníase no período de 1966 a 1987 ...........................................7

Tabela 3. Casos registrados de hanseníase, casos novos e cobertura pela MDT.............8

Tabela 4. Casos registrados, prevalência e casos novos de hanseníase em 2012 ............9

Tabela 5. Casos de hanseníase no Brasil antes da implementação da MDT ...................10

Tabela 6. Hanseníase – coeficientes de prevalência e detecção por região em

menores e maiores de 15 anos no Brasil 2011 ................................................................

10

Figura 1. Hanseníase no Brasil - coeficiente de prevalência no período de 1990

a 2010 .............................................................................................................................

11

Figura 2. Hanseníase coeficiente de prevalência e detecção no período de 1990

a 2010 .............................................................................................................................

11

Figura 3. Hanseníase – coeficiente de detecção nas diferentes regiões do

Brasil, no período de 1990 a 2010 .................................................................................

12

Tabela 7. Hanseníase – indicadores epidemiológicos e operacionais – Brasil

2001 a 2012 ..................................................................................................................

12

Tabela 8. Hanseníase – tendência de detecção em países com mais de 1000

casos em 2012 .................................................................................................................

13

Figura 4. Hanseníase – coeficiente de detecção geral de casos novos no Brasil

e estados em 2010 .........................................................................................................

13

Figura 5. Hanseníase – coeficientes de prevalência segundo UF - Brasil, em

2011 ..............................................................................................................................

14

Figura 6. Espectro clínico e imunopatológico da hanseníase e reações .........................15

Tabela 9. Hanseníase – formas clínicas, caracterização e classificação

operacional ...................................................................................................................

17

Figura 7. Interação entre a imunidade inata e a imunidade adaptativa na

resposta à infecção pelo M. leprae.................................................................................

33

xiii

Figura 8. Eventos de transdução de sinal na ativação dos mastócitos ............................39

Figura 9. Espectro imunopatológico da hanseníase segundo Ridley-Jopling .................45

Tabela 10. Apresentação das cartelas para o esquema padrão da OMS .........................72

Figura 10. Cartelas com medicamentos dos esquemas padrões da PQT

(Poliquimioterapia/OMS) para adultos e crianças, PB e MB .........................................

72

Tabela 11. Esquema terapêutico utilizado para Paucibacilar: 6 cartelas ........................73

Tabela 12. Cartelas com medicamentos dos esquemas padrões da PQT .......................74

Tabela 13. Dosagens dos medicamentos no esquema terapêutico utilizado para

crianças e adultos com peso inferior a 30 Kg ................................................................

75

Tabela 14. Avaliação para aplicação do BCG ..............................................................76

Anexo 1. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa Médica Humana e animal ...............151

Anexo 2. Parecer da Comissão de Ética em Pesquisa - CONEP ................................152

Anexo 3. Ficha de dados clínicos ..................................................................................153

Anexo 4. Termo de consentimento livre e esclarecido ...................................................154

Anexo 5. Comprovantes de submissão dos artigos/ aceite para publicação para

artigos ainda não publicados/ DOI dos artigos publicados .............................................

155

xiv

SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS

AraLAM Lipoarabinomanana com arabinose

AT Azul de Toluidina

BAAR Bacilo Ácido Álcool Resistente

BB Hanseníase Borderline-Borderline

BCG Bacilo Calmette-Guerin

BL Hanseníase Borderline-Lepromatosa

BT Hanseníase Borderline-Tuberculoide

CEP/CONEP Comitês de Ética em Pesquisa/Conselho Nacional de Ética em Pesquisa

CGRP “Calcitonin gene-related peptide” (peptídeo relacionados com o gene de calcitonina)

CRDT Centro de Referência em Diagnóstico e Terapêutica, Goiânia, Goiás

CXCL Quimiocina com motivo C-X-C

DC “Dendritic Cells” (células dendríticas)

DE Dermatoses

DNA Ácido desoxirribonucléico

ELISA “Enzyme-Linked Immunosorbent Assay” (Ensaio Imunoenzimático)

ENH Eritema Nodoso Hansênico

Foxp3 Fator de transcrição de células T reguladoras

HLA “Human Leucocyte Antigens” (Antígenos leucocitários humanos)

IB Índice baciloscópico

IgG Imunoglobulina G

IGRAs “Interferon-Gamma Release Assays” (ensaios de liberação de interferon-gama)

IL Interleucina

IFN- Interferon Gama

IPTSP Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

LL Hanseníase Lepromatosa

LPS Lipopolissacarídeo

ManLAM Lipoarabinomanana com manose

MB Multibacilar

xv

MCT Mastócitos de mucosa

MCTC Mastócitos de mucosa

MDT Multidrogaterapia

MHB Hanseníase Borderline (Moléstia de Hansen Borderline)

MHI Hanseníase Indeterminada (Moléstia de Hansen Indeterminada)

MHL Hanseníase Lepromatosa (Moléstia de Hansen Lepromatosa)

MHT Hanseníase Tuberculoide (Moléstia de Hansen Tuberculoide)

M. leprae Mycobacterium leprae

MT Mycobacterium tuberculosis

NF-κB Fator Nuclear kappa B

NRAMP1 Proteína 1 dos macrófagos associada à resistência natural

NLRs “NOD-Like-receptors”

NOD “Nucleotide-binding Oligomerization Domain”

OMS Organização Mundial da Saúde

PADL “protein advances diagnostic of Leprosy” (proteína para diagnóstico rápido da hanseníase)

PAMPs “Pathogen-Associated Molecular Patterns” (Padrões Moleculares Associados aos Patógenos)

PB Paucibacilar

PBMC “Peripheral Blood Mononucleated Cell” (Células Mononucleares de sangue periférico)

PCR “Polymerase Chain Reaction” (Reação em Cadeia da Polimerase)

PGL-I Glicolipídeo Fenólico-I ou fenoglicolipídeo I

POC “Point of care” (ponto de atendimento)

PRRs “Pattern Recognition Receptors” (receptores de reconhecimento de padrões)

RIA Resposta imune adaptativa

RII Resposta imune inata

RIC Resposta imune celular

RNI Reativos Intermediários do Nitrogênio

ROI Reativos Intermediários do Oxigênio

RT1 Reação Tipo 1

RT2 Reação Tipo 2

xvi

SNP “Single-nucleotide Polymorphism” (Polimorfismo de Nucleotídeos Simples)

SP Substância P

TCR “T cell receptor” (receptor para antígeno do linfócito T)

TGF-β “Transforming Growth Factor- β” (fator de crescimento transformador-β)

TLR “Toll-Like Receptor”

TT Hanseníase Tuberculoide

TNF- Fator de necrose tumoral

Treg Células T reguladoras

WBA “whole-blood assays” (ensaio de sangue total)

WHO “World Health Organization”

xvii

APRESENTAÇÃO

Nasci em Quintinos, Minas Gerais, segundo filho de uma prole de oito, um dos

oitenta netos de meus avós. Destes, os sete vivos de meus pais, e apenas mais uns quatro

ou cinco primos, tem curso superior. Graças aos meus pais sou médico, e desde os

quatro ou cinco anos falo apenas nesta profissão, como a minha, a que eu sempre

desejei.

Meus estudos superiores foram na UFG, graduação e especialização. Fui um

bom aluno, operava muito bem, ótimo relacionamento médico-paciente, pois gostava e

gosto da Medicina. Passei na seleção para residência de cirurgia, e ginecologia e

obstetrícia, como segunda opção, a primeira sempre foi a Patologia. Nesta, minha

natural predileção inexplicável por pele e pela Hanseníase.

A hanseníase tem sido foco de meu interesse nos trinta e poucos anos de

atividade docente e profissional. Na minha Residência Médica, especialização em

Patologia, quando na área de Dermatopatologia fui orientado pelo Prof. Warteloo João

Alves, que faleceu prematuramente em 1983, tive os primeiros contatos com a doença.

Após sua morte fui convidado por dois colegas Patologistas, Dr. Antônio Martins de

Macedo e Prof. William Machado Sobral, para ocupar o lugar deixando pelo mesmo,

em seu laboratório particular. Assumi então a área de Dermatopatologia, ainda muito

imaturo e pouco preparado para tanta responsabilidade. Na época estudava no livro de

Dermatopatologia da Izamar Malidiu, no “A guide of Dermatopatology” do Pinkus e

“Histopathology of the Skin” do Lever, que ainda conservo-os até hoje. Em 1984 fui

então para São Paulo, fazer um estágio de Dermatopatologia, na Clínica de

Dermatologia da Universidade de São Paulo, na época chefiada pelo Prof. Dr. Sebastião

de Almeida Prado Sampaio, que atendeu a uma solicitação do Chefe de Departamento

de Medicina Tropical e Dermatologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

(IPTSP), o Prof. Paulo Cesar Borges. Permaneci lá por três meses e tive a oportunidade

de conhecer grandes nomes da Dermatologia Brasileira, bem como a

Dermatopatologista do Serviço, Profa. Dra. Mirian Nacagami Sotto, que tornou minha

amiga. Em 1984, aos vinte e oito anos, fui aprovado no concurso de Professor de

Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Goiás, tendo tomado

posse em 02 de janeiro de 1985. Em parte, o responsável pela minha nomeação, foi o

xviii

Prof. Maurício Sérgio Brasil Leite. Ficou sob minha responsabilidade a assistência e

ensino na área de Dermatopatologia.

Ingressei na carreira de magistério, FM-UFG, onde atuo na graduação, sempre

responsável pelas aulas de patologia das doenças infecciosas, entre elas a hanseníase, a

leishmaniose, a tuberculose, a paracoccidioidomicose, entre outras. Hoje tenho por volta

de 3.000 ex-alunos, aos quais incubi a responsabilidade de diagnosticar a hanseníase,

onde quer que fossem atuar como médicos. Desde então, institui também o ensino

sistemático da Dermatopatologia para os Médicos Residentes de Dermatologia e

Patologia da Faculdade de Medicina – Hospital das Clínicas da UFG, onde convivi com

praticamente todos os Dermatologistas Goianos, entre eles destacam o Prof. Paulo Cesar

Borges, o Prof. Anuar Auad, o Prof. Aiçar Chaul, o Prof. Hugo Junqueira, a Profa. Lia

Miranda, entre outros. Neste convívio dermatopatológico, tive a oportunidade de

participar da formação de quase uma centena de Médicos Residentes. Na Patologia são

mais 50 Médicos Residentes que tentei ajudá-los no aprendizado da Dermatopatologia.

Em 1987 foi realizado em Goiânia, no prédio do Fórum recém inaugurado, o

Congresso Brasileiro de Dermatologia, oportunidade na qual conheci o grande nome da

Dermatopatologia Mundial, Dr. Albert Bernard Ackerman (November 22, 1936 –

December 5, 2008). Aprendi com ele, no seu livro ou bíblia da Dermatopatologia,

“Histologic diagnosis of inflammatory skin diseases”, grande parte da arte do

diagnóstico dermatopatológico por silhueta, por padrões.

Em 1989, juntamente com o Prof. Roberto Rhuman Daher – IPTSP, fomos

convidados pela Profa. Dra. Maria Leide Wand-Del-Rey de Oliveira para participar da

edição do manual de Controle da Hanseníase – Uma proposta de integração ensino-

serviço – 1989, publicado pelo Ministério da Saúde – Secretaria Nacional de Programas

Especiais de Saúde – Divisão Nacional de Dermatologia Sanitária. Pude então

aprofundar minhas atividades na área, oportunidade na qual fomos (FM-HC) agraciados

com um microscópio Nikon, para emissão de laudos histopatológicos no Hospital das

Clínicas da Universidade Federal de Goiás, onde tínhamos muitos doentes hansênicos.

Depois, pelos idos de 1991/1992, fiz a análise dos mais de 100 biópsias de pele

dos casos de hanseníase da tese de mestrado da Dra. Mirian Lane Castilho de Oliveira

Rodrigues, sobre proteção da vacina BCG intradérmica contra a hanseníase, artigo

referência sobre o assunto e citado em metanálise do tema.

Em 1992/1993 fui convidado pela Profa. Celina Maria Turchi Martelli a integrar

um grupo de pesquisa na área, sendo que na época a mesma estava interessada em

xix

estudar hepatites e hanseníase, assuntos de sua tese de doutorado, publicada em 1995.

Para acertamos os ponteiros, fizemos um estudo de campo, duplo cego, onde os exames

de pele dos pacientes hansênicos foram vistos por mim e pelo Prof. Dr. Raul Negrão

Fleury, grande conhecedor de hanseníase, na época trabalhando no Instituto Lauro de

Souza Lima de Baurú – SP (faleceu recentemente, 07-02-2014). O Kappa na época foi

em torno de 85%, sendo que considero esta grande concordância pelo fato de ter

aprendido com Raul boa parte da histopatologia da doença. Para a tese da Profa. Celina,

na oportunidade, examinei em torno de 700 biópsias de casos da doença.

Em 1998 a Profa. Dra. Celina Maria Turchi Martelli criou um Grupo

Multicêntrico para o estudo da Hanseníase, incluindo participantes de Rondônia, a Dra.

Kasuê Narahashi Emília Ueda, do Rio de Janeiro/Fiocruz, a Dra. Maria Kátia Gomes,

do Amazonas/IDTVAN, a Dra. Paula Frassinetti Bessa Rebello, de Goiânia, Profa. Dra.

Mariane Martins de Araújo Stefani e eu. Do trabalho deste grupo foi possível

desenvolver teses e alguns artigos publicados em periódicos internacionais. As teses,

sempre sobre hanseníase, foram da Dra. Maria Kátia Gomes, Dra. Paula Rebello e a

minha. Deste grupo fiquei responsável pela análise histopatológica das biópsias de peles

de todos os casos, em torno de 350.

A partir de então, passei a participar como Médico Patologista, emitindo os

laudos histopatológicos das biópsias de peles, deste grupo de estudo de hanseníase, que

se estabeleceu no IPTSP, colaborando indiretamente em várias dissertações e teses:

Em 1999, a dissertação de mestrado da Dra. Maria Kátia Gomes, da Fiocruz -

Rio, orientanda da Profa. Dra. Celina Maria Turchi Martelli: características

epidemiológicas, clínicas e imunológicas de pacientes de hanseníase paucibacilar (PB)

lesão única, tratados com Rifampicina, Ofloxacina e Minociclina em dose única (ROM),

em três regiões do Brasil: estudo multicêntrico. UFRJ - RJ.

Em 2001, a dissertação de mestrado da Dra. Paula Frassinetti Bessa Rebello, do

Instituto de Dermatologia Tropical e Venereologia “Alfredo da Matta” – Fundação

FUAM, orientanda da Profa. Dra. Celina Maria Turchi Martelli: hanseníase paucibacilar

lesão única. IPTSP-UFG, Goiânia – Go.

A dissertação de mestrado da Profa. Dra. Jacqueline Gomes Guerra, orientanda

da Profa. Dra. Lia Cândida Miranda de Castro: “reações hansênicas: aspectos clínicos,

epidemiológicos e imunológicos”. IPTSP-UFG, Goiânia – Go.

Conclusão de minha dissertação de mestrado com o tema: “Caracterização

histopatológica de biópsias de pele de pacientes com hanseníase paucibacilar lesão

xx

única”, orientado pela Profa. Celina Maria Turchi Martelli e co-orientado pelo Prof. Dr.

Florêncio Figueiredo Cavalcanti Neto, oportunidade na qual estudei mais de 350 casos

da doença. Este mestrado propiciou-me uma ida aos Estados Unidos da América, em

Baton Rouge – Louisiana, onde um grupo de pesquisa, em colaboração com o grupo do

IPTSP, estudava a doença. Lá conheci grandes nomes da área, como o Dr. David

Scollard, Dr. Tomas Gillis, Dr. Krahenbuhl, a técnica do setor Nayoko, e

acompanhando a Profa. Mariane, tive minha primeira experiência com a reação da

polimerase em cadeia (PCR- polymerase chain reaction).

Em 2002, a dissertação de mestrado da Dra. Ana Lúcia Osório Maroccolo Sousa,

orientada da Dra. Celina Maria Turchi Martelli: Detecção de DNA de Mycobacterium

leprae por reação em cadeia da polimerase em coorte de pacientes paucibacilares com

lesão única tratados com esquema terapêutico de dose única. IPTSP-UFG, Goiânia –

Go.

Em 2007, a tese de doutorado da Profa. Dra. Jacqueline Gomes Guerra:

“Reações hansênicas: aspectos clínicos, epidemiológicos e imunológicos”. UFRJ, Rio

de Janeiro – Rio de Janeiro.

Em 2008, a dissertação de mestrado de Adriano Badotti Grassi, orientando da

Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani: Hanseníase, comparação entre testes

rápidos com antígeno PGL-I em amostras de sangue total e soro. IPTSP-UFG, Goiânia

– Go.

A dissertação de mestrado de Lucas Henrique Ferreira Sampaio, orientando da

Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani: Diagnóstico da Hanseníase

Paucibacilar: Resposta Imune Celular a Proteínas Recombinantes do Mycobacterium

leprae. IPTSP-UFG, Goiânia – Go.

Em 2009 a tese de doutorado da Profa. Ana Lúcia Osório Maroccolo Sousa,

orientando da Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani: “marcadores moleculares,

imunológicos e genéticos das reações hansênicas”. IPTSP-UFG, Goiânia – Go.

Em 2010 a dissertação de mestrado da Regiane Morillas Oliveira: “pesquisa da

reatividade sorológica a proteínas recombinantes do Mycobacterium leprae”. IPTSP-

UFG, Goiânia – Go.

Em 2011 atese de doutorado de Lucas Henrique Ferreira Sampaio, orientando

Mariane Martins de Araújo Stefani: “avaliação da resposta imune celular a antígenos

recombinantes do Mycobacterium leprae e potencial aplicação para o diagnóstico da

hanseníase paucibacilar”. IPTSP-UFG, Goiânia – Go.

xxi

Em 2013 a dissertação de mestrado da Emerith Mayra Hungria Pinto, orientanda

da Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani: “reatividade sorológica a proteínas

recombinantes do Mycobacterium leprae em diferentes grupos populacionais de

distintas regiões endêmicas do Brasil”. IPTSP-UFG, Goiânia – Go.

Junto com este grupo, produtos das teses e dissertações, como coordenadora e

pesquisadora principal, a Profa. Dra. Mariane Martins de Araújo Stefani, tivemos a

oportunidade de participar como autor ou co-autor da publicação de diversos artigos

sobre o tema Hanseníase, a saber:

Stefani MM, Martelli CM, Morais-Neto OL, Martelli P, Costa MB, de Andrade AL 1998. Assessment of anti-PGL-I as a prognostic marker of leprosy reaction. Int J Lepr Other Mycobact Dis 66: 356-64.

Martelli CM, Stefani MM, Gomes MK, Rebello PF, Peninni S, Narahashi K, Maroccolo AL, Costa MB, Silva SA, Sacchetim SC, Nery JA, Salles AM, Gillis TP, Krahenbuhl JL, Andrade AL 2000. Single lesion paucibacillary leprosy: baseline profile of the Brazilian Multicenter Cohort Study. Int J Lepr Other Mycobact Dis 68: 247-57.

Guerra JG, Castro LCM, Stefani MM, Martelli CM, Penna GO 2002. Erythema Nodosum Leprosum: clinical and therapeutic up-date. An. bras Dermatol 77: 389-407.

Guerra JG, Penna GO, Castro LC, Martelli CM, Stefani MM, Costa MB 2004. Erythema nodosum leprosum case series report: clinical profile, immunological basis and treatment implemented in health services. Rev Soc Bras Med Trop 37: 384-90.

Sousa AL, Stefani MM, Pereira GA, Costa MB, Rebello PF, Gomes MK, Narahashi K,

Gillis TP, Krahenbuhl JL, Martelli CM 2007. Mycobacterium leprae DNA associated with type 1 reactions in single lesion paucibacillary leprosy treated with single dose rifampin, ofloxacin, and minocycline. Am J Trop Med Hyg 77: 829-33.

Stefani MM, Guerra JG, Sousa AL, Costa MB, Oliveira ML, Martelli CT, Scollard DM

2009. Potential plasma markers of Type 1 and Type 2 leprosy reactions: a preliminary report. BMC Infect Dis 9: 75.

Sgambatti S, Andrade JG, Sousa ALS, Stefani MMA, Costa MB, Andrade ALSS. 12010. An unusual presentation of leprosy at diagnosis: erythema multiforme-like type 2 reaction. Revista de Patologia Tropical Vol. 39 (3): 221-227. Jul.-set.

Sampaio LH, Sousa AL, Barcelos MC, Reed SG, Stefani MM, Duthie MS 2011. Evaluation of various cytokines elicited during antigen-specific recall as

xxii

potential risk indicators for the differential development of leprosy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 31: 1443-51.

Sousa AL, Fava VM, Sampaio LH, Martelli CM, Costa MB, Mira MT, Stefani MM 2012. Genetic and immunological evidence implicates interleukin 6 as a susceptibility gene for leprosy type 2 reaction. J Infect Dis 205: 1417-24.

Hungria EM, de Oliveira RM, de Souza AL, Costa MB, de Souza VN, Silva EA, Moreno FR, Nogueira ME, Costa MR, Silva SM, Bührer-Sékula S, Reed SG, Duthie MS, Stefani MM 2012. Seroreactivity to new Mycobacterium leprae protein antigens in different leprosy-endemic regions in Brazil. Memo Inst Oswaldo Cruz 107 Suppl 1: 104-11.

Stefani MM, Grassi AB, Sampaio LH, Sousa ALOM, Costa MB, Scheelbeek P,

Neupane K D, Hagge DA, Macdonald M, Cho S, Oskam L, Bührer-Sékula S 2012. Comparison of two rapid tests for anti-phenolic glycolipid-I serology in Brazil and Nepal. Mem Inst Oswaldo Cruz 107 Suppl 1: 124-131.

Oliveira R, Hungria E, Freitas A, Sousa A, Costa M, Reed S, Duthie M, Stefani MM.

Antigen associations for the diagnosis of paucibacillary leprosy. Abstract Submission for the International Leprosy Congress/ILC Brussels/2013 – Immunology - ILC2013-2122.

Hungria E, Freitas A, Oliveira R, Cardoso L, Mizoguti D, Costa M, Sousa A, Reed S,

Duthie M, Stefani MM. Serologic profile to lid-1 and PGL-I during leprosy reactions. Abstract Submission for the International Leprosy Congress/ILC Brussels/2013 ILC 2013 – Immunology - ILC2013-2137.

Freitas A, Oliveira R, Hungria E, Cardoso L, Costa M, Sousa A, Reed S, Duthie M,

Stefani MM. Differential diagnosis of multibacillary leprosy and other dermatoses: potential application of serology. Abstract Submission for the International Leprosy Congress/ILC Brussels/2013 ILC 2013 – Immunology - ILC2013-2140.

Freitas A, Oliveira R, Hungria E, Cardoso L, Costa M, Sousa A, Reed S, Duthie M,

Stefani MM. The impact of multidrug therapy on cell mediated and humoral immune responses to mycobacterium leprae protein antigens. Abstract Submission for the International Leprosy Congress/ILC Brussels/2013 ILC 2013 – Immunology - ILC2013-2142.

Com este retrospecto de minha vida acadêmica, pesquisando sobre Hanseníase,

nada mais justo que minha tese de doutorado fosse sobre o tema.

xxiii

RESUMO

Titulo: Estudo in situ da heterogeneidade de mastócitos e células T reguladoras em pacientes com hanseníase, com e sem episódios reacionais. Resumo

A hanseníase é uma complexa doença dermato-neurológica, crônica, de causa infecciosa

que afeta a pele e os nervos periféricos, especialmente durante os episódios imuno-

inflamatórios agudos conhecidos com reações tipo 1/RT1 e tipo 2/RT2. Não existe

modelo experimental para hanseníase e as lesões de pele têm sido extensivamente

usadas para desvendar os multifacetados mecanismos imunopatológicos associados com

a doença. Este estudo investigou a expressão in situ de duas distintas populações

celulares que apresentam importante papel imunorregulatório: células Treg (Treg) e

mastócitos (MC) em pele normal e diversas doenças cutâneas com ênfase nas reações

hansênicas RT1 e RT2. Para o estudo de Tregs foram utilizadas 154 biópsias cutâneas de

114 participantes de três grupos: 1. Hanseníase (n=74), 56 RT1 (28-biópsias pareadas

do mesmo paciente sem reação/durante reação, 28 biópsias únicas de RT1), 18 RT2 (12

biópsias pareadas sem reação/durante reação, 6 biópsias únicas de RT2); 2. Dermatoses:

(n=29) doenças cutâneas não infecciosas e infecciosas. Controles Normais: fragmentos

de peles obtidos de mamoplastias eletivas em mulheres saudáveis. Imunomarcação

dupla CD25+Foxp3+de células Treg foi realizada em plataforma automatizada.

Quantificação das células Treg duplo positivas foram feitas sem conhecimento da

condição clínica do paciente (valores expressos em mm2). Para o estudo dos MC 80

biópsias de 3 grupos foram investigadas: 40 pacientes com hanseníase recém

diagnosticados não tratados (18 sem reação, 11 RT1, 11 RT2), 29 pacientes com outras

dermatoses e 11 biópsias de pele normal. Quantificação de MC intactos e desgranulados

corados por azul de toluidina/mm2; imunomarcação streptavidina-biotina-peroxidase foi

empregada para detectar MC triptase/try+ e chimase/chy+ e a densidade ótica (mediana

da densidade ótica) foi avaliada. Resultados: Estudo das Tregs: Nenhuma célula Treg

CD25+Foxp3+ foi identificada em nenhuma das 11 amostras de pele normal, enquanto

um número variável de Tregs foi identificado nas diversas doenças cutâneas (p<0.0001);

o número de células Treg duplo positivas foi maior nas doenças infecciosas comparado

com as não-infecciosas (p=0.008). Medianas de Treg entre hanseníase e outras doenças

infecciosas foram semelhantes (p=0.157). Quantificação de Tregs em lesões reacionais

foram maiores do que as sem reação (p<0.02). Nas biópsias pareadas de lesões de

xxiv

RT1/sem reação ou RT2/sem reação, números maiores de Treg foram vistos durante a

RT1 quando comparados com a não reacional do mesmo paciente (p< 0.001). Mediana

de Treg em RT1 desenvolvidas durante MDT foi ligeiramente superior comparada a RT1

desenvolvida em pacientes sem de tratamento (p=0.047). Observou-se uma tendência de

aumento no número das Tregs do polo tuberculoide em direção ao lepromatoso, mais

especificamente até a forma borderline-lepromatosa que apresentou a maior mediana da

quantificação de Treg, entretanto esta diferença não foi estatisticamente significativa

(p>0.8). Estudo dos Mastócitos: lesões cutâneas de origem infecciosa e não infecciosa

mostraram números aumentados de mastócitos desgranulados do que intactos tanto na

hanseníase como nas outras dermatoses quando comparados com pele normal. Os

números de mastócitos (MC) desgranulados foram maiores do que intactos,

independente da forma de hanseníase (do polo tuberculoide/TT ao lepromatoso/LL),

independente da ocorrência de reações hansênicas (lesão reacional/sem reação) e

independente do tipo de reação (RT1/RT2). Número e densidade de mastócito triptase

positivo (MC try+) estão aumentados em relação aos quimase positivo (MC chy+) na

hanseníase, em pacientes com e sem reação, particularmente na RT2, mas não nas

outras dermatoses. Conclusões: aumento nas Treg detectados durante RT1 sugerem

papel supressor dessas células em eventos associados à resposta imune celular

exacerbada, responsáveis pela RT1. Expressão diferencial das subpopulações de MC

try+ e chy+ foi observada na hanseníase em relação a outras doenças cutâneas e pele

normal. Entretanto, nem a forma da hanseníase, nem a ocorrência de reação hansênica,

estava associada a mudanças nas subpopulações de MC nas lesões sugerindo que o

processo infeccioso pelo Mycobacterium leprae per se direciona a expressão de MC nas

lesões cutâneas da hanseníase.

Palavras chaves: células Treg, mastócitos, triptase, quimase, hanseníase, dermatose.

xxv

ABSTRACT

Title: In situ study of the heterogeneity of mast cells and regulatory T cells in patients with leprosy, with and without reactional episodes. Abstract

Leprosy is a complex, chronic, infectious dermato-neurological disease that affects the

skin and peripheral nerves especially during acute immune-inflammatory episodes

known as type 1/T1R and type 2/T2R reactions. There is no experimental model for

leprosy and leprosy skin lesions have been extensively used to unravel its multifaceted

immunopathological mechanisms.This study investigated in situ expression of two

distinct cell populations with important immunoregulatory roles: T regulatory (Treg)

cells and mast cells (MC) in diverse skin diseases with emphasis on leprosy T1R and

T2R. For the Treg cell study, 154 skin biopsies from 114 participants belonging to 3

groups were investigated: 1. Leprosy (n=74), 56 T1R (28-paired biopsies reaction-

free/reactional from the same patient, 28 single reactional biopsy), 18 T2R (12 paired-

reaction-free/reactional lesions, 6 single reactional biopsy); 2. Dermatoses: (n=29) non-

infectious and cutaneous infectious diseases; 3. Normal controls: skin fragment of

mammoplasty from healthy females that had cosmetic surgery. Double

immunohistochemical detection of Treg cells was performed with automated platform

for CD25 and Foxp3 staining. Quantifications of double immunostained Treg cells was

performed (values expressed by mm2) blinded to the participants’ clinical status. For

the mast cell study 80 skin biopsies from 3 groups were investigated: 40 newly

diagnosed untreated leprosy patients (18 reaction-free, 11 T1R, 11 T2R), 29 patients

with other dermatoses (the same as for Treg study) and 11 normal skins. Toluidine blue

stained intact and degranulated MC counts/mm2; streptavidin-biotin-peroxidase

immunostaining was used to detect tryptase/try+ and chymase/chy+ MCs and their

density (median optical density) was evaluated. Results: Treg study: Not one

CD25+Foxp3+Treg cell was seen in any of the 11 normal skin sections while variable

numbers were detected in skin diseases (p<0.0001); the number of double stained cells

was higher in infectious compared to non-infectious diseases (p=0.008). Treg cell

numbers were comparable between leprosy and other infectious dermatoses (p=0.157)

Treg cell counts in reactional lesions were higher than in reaction-free leprosy lesions

(p<0.002). Paired biopsies of T1R or T2R reactional/reaction-free lesions showed

xxvi

increased numbers of Treg during T1R compared to reaction-free lesions from the same

patient (p< 0.001). Treg cell median in T1R developed during MDT was slightly higher

compared to T1R developed at diagnosis in naïve patients (p=0.047). There was a trend

in increasing Treg cell numbers from the tuberculoid to borderline-lepromatous form,

which showed the highest median value of Tregs, however this difference was not

significant (p>0.8). Mast cell study: Infectious and non-infectious skin lesions showed

higher numbers of degranulated than intact MC both for leprosy and other dermatoses,

compared to normal skin. The numbers of degranulated MC were higher than intact MC

regardless of the leprosy form (from tuberculoid/TT to lepromatous/LL), regardless of

the occurrence of leprosy reactions (reactional and reaction-free) and regardless of the

type of reaction (T1R/T2R). Try+ MC numbers and density were higher than chy+ MC

in leprosy, in reaction-free and reactional lesions, particularly in T2R, but not in other

dermatoses.

Conclusions: Higher Treg numbers seen in T1R suggest Treg role in suppressing the

exacerbated cell-mediated phenomenon that causes T1R. Differential expression/ of

try+ and chy+ MC subsets was seen in leprosy compared to other skin diseases and to

normal skin. However, neither leprosy form nor leprosy reaction was associated with

MC changes in lesions suggesting that the Mycobacterium leprae infectious process per

se dictates MC expression in leprosy skin lesions.

Key words: treg, mast cell, tryptase, chymase, leprosy, skin diseases.

xxvii

ORGANIZAÇÃO DA TESE

Esta tese de doutorado está apresentada de conformidade com a NORMA –

CPGMTSP No. 04/2009, sendo composta por uma introdução, contendo uma

abordagem geral acerca da hanseníase, desde a epidemiologia, aspectos clínicos, meios

de diagnóstico, moleculares, imunológicos, genéticos, diagnósticos diferenciais, reações

e tratamento. Conforme a norma supracitada, a colocação dos métodos é opcional, e não

foram colocados por ser redundante, e já estarem no contexto dos artigos.

Além da introdução, esta tese inclui dois artigos científicos, ambos em fase de

submissão para publicação.

O artigo 1 se refere às células T regulatórias (Treg): “In situ expression of

CD25+ Foxp3+ Regulatory T Cells in human skin diseases: leprosy and leprosy

reactions”, realizado em colaboração com o Hospital A. C. Carmargo, Departamento de

Patologia, chefiado pelo Prof. Dr. Fernando Augusto Soares.

O artigo 2 se refere aos Mastócitos: “Mast cell heterogenity in human

dermatoses: in situ tryptase and chymase positive cells with emphasis on leprosy and

leprosy reactions”, realizado em colaboração com o IBILCE, Departamento de

Biologia, Laboratório de Imunomorfologia, coordenado pela Profa. Sônia Maria Oliani,

UNESP – São José do Rio Preto – São Paulo.

1

1. INTRODUÇÃO

1.1- Conceito

A hanseníase é uma doença infecciosa, granulomatosa, de evolução crônica,

causada pelo Mycobacterium leprae (M. leprae), descrito por Gerhard Amauer Hansen

em 1873, dermato-neurológica, complexa, comprometendo principalmente pele e

nervos periféricos, podendo levar a incapacidades físicas. Entretanto pode acometer

qualquer órgão do corpo humano, como: testículos, fígado, ossos, etc. Apesar da

evolução crônica pode apresentar surtos de agudizações, denominados episódios

reacionais ou reações tipo 1 (RT1) e tipo 2 (RT2) (Modlin 1987, Talhari et al. 1997,

revisado por Jacobson & Krahenbuhl 1999, Britton & Lockwood 2004, revisado por

Scollard et al. 2006, Walker& Lockwood 2006). É uma das primeiras constatações de

uma doença microbiana do homem (WHO 1988a). A Organização Mundial da Saúde

(OMS/WHO) inclui a hanseníase entre as 17 doenças tropicais negligenciadas (WHO

2012a).

1.2- Agente etiológico, infecção e doença.

O M. leprae é uma bactéria intracelular obrigatória, não cultivável em meios de

culturas axênicos, que tem tropismo para macrófagos da pele e células de Schwann dos

nervos periféricos (Ridley 1955, Jopling 1978, WHO 1988a, Scollard et al. 2006). A

taxa de replicação do M. leprae é extremamente lenta, quando comparada a de outras

bactérias, apresentando ciclo replicativo de, em média, 12,5 dias (Ridley 1955, Jopling

1978, Jacobson & Krahenbuhl 1999). O M. leprae é um bastonete reto, corado em

vermelho pela fucsina e que não é descorado na passagem em álcool e ácidos orgânicos,

ou seja, é um bacilo ácido álcool resistente (BAAR). Nos esfregaços de raspado

intradérmico (linfa) e nos cortes histopatológicos os bacilos podem ser vistos

isoladamente ou em agrupamentos de tamanhos variados (Ridley 1955, Jopling 1983),

referidos como globias.

Em 2008, foi descrita uma nova bactéria imputada na etiologia da hanseníase, o

Mycobacterium lepromatosis sp nov. Os autores descreveram esta nova espécie

baseados em diferenças genéticas significativas com oM leprae, incluindo uma

divergência de 2,1% do gene 16S RNA ribossomal (rRNA), um marcador altamente

conservado da evolução. Análise filogenética dos genes 16S rRNA, rpoB e hsp65

indicou que os organismos são relacionados e evoluíram de um ancestral comum que

2

tinha ramificado de outras micobactérias. Estes resultados e as características únicas

clinicopatológicas da Hanseníase Lepromatosa Difusa (Hanseníase bonita, Lepra de

Lúcio e Latapi) levaram-os a propor esta nova espécie, que pode contabilizar algumas

das variabilidades clínicas e geográficas da hanseníase. Esta descoberta pode ter

implicações para a pesquisa e o diagnóstico da hanseníase (Han et al. 2008).

O M. leprae e o Mycobacterium tuberculosis (MT) surgiram de um ancestral

comum há 36 milhões de anos atrás (Cole et al. 2001, Djelouadji et al. 2011). O

Mycobacterium tuberculosis foi descrito em 1883 por Robert Koch e foi a primeira

micobactéria a ter seu genoma seqüenciado (Cole et al. 1998), enquanto o M. leprae foi

sequenciado a seguir (Cole et al. 2001). Comparando o M. leprae com o MT, o

sequenciamento completo do genoma do M. leprae revelou uma extensa redução

evolutiva em comparação ao genoma do M. tuberculosis, o que significa redução do

número de genes, grande número de pseudogenes e redução do número de proteínas

produzidas pelo primeiro. Esse processo evolutivo redutivo pode ter tornado o M.

leprae um microrganismo extremamente fastidioso, com longo período de duplicação e

impossibilitando seu cultivo in vitro (Cole et al. 2001, revisado por Vissa & Brennan

2001).

Apesar do M. leprae ter sido o primeiro patógeno humano a ser descrito no final

do século XIX, os mecanismos de transmissão ainda não estão totalmente estabelecidos.

Acredita-se que o trato respiratório seja a principal porta de entrada e fonte de

transmissão do M. leprae, já que um grande número de bacilos é eliminado pelas vias

aerodigestivas de pacientes com formas bacilíferas não tratadas (Ridley 1955, Jopling

1978; Jacobson & Krahenbuhl 1999, revisado por Walker & Lockwood 2007). Outras

possíveis fontes de transmissão do bacilo são hansenomas ulcerados, urina, fezes, suor,

leite materno, secreções vaginais e esperma (Jopling 1978, Job et al. 1989, Fine et al.

1997), e, mais recentemente, a possibilidade de ser uma doença zoonótica, tendo o tatú

como uma possível fonte de infecção para o homem (Truman et al. 2011).

Acredita-se que o período de incubação da doença pode variar de 2 até 10 anos e

que a maioria das pessoas expostas não é susceptível à infecção, ou seja, há uma

resistência natural na ordem de 95% dos indivíduos (Jopling 1978). Populações de

diferentes etnias, morando na mesma área endêmica, exibem taxas de prevalência

diferentes (WHO 1988a, Fine et al. 1997). Entretanto, a hiperpopulação doméstica e

fatores genéticos do hospedeiro parecem predispor a infecção e ao desenvolvimento da

3

doença (Jopling 1978, WHO 1988a, Schurr et al. 1991, Jacobson & Krahenbuhl 1999,

Fine et al. 1997, Mira et al. 2004, Goulart et al. 2008, Pereira et al. 2009, Bazin-Furini

et al. 2011). A maioria das pessoas que vivem em áreas endêmicas para a hanseníase já

esteve exposta ao M. leprae, mas, apenas cerca de 0,1-1,0% desenvolve a doença

(Ridley 1955, Fine et al. 1997, Moraes et al. 2006, revisado por Pereira et al 2009).

Contatos domiciliares de pacientes com formas bacilíferas de hanseníase apresentam

risco aumentado para o adoecimento. Estima-se que contatos intradomiciliares de

pacientes com baciloscopia positiva apresentem 4 a 10 vezes mais risco de adoecer que

outros indivíduos de uma população endêmica (Ridley 1955, WHO 1988a, Fine et al.

1997, Jacobson & Krahenbuhl 1999, Goulart et al. 2008). Evidências apontam para a

ocorrência de transmissão da doença entre domiciliares, inclusive na fase pré-

sintomática (Fine et al. 1997).

Após um período de incubação variável, os indivíduos susceptíveis que foram

infectados podem desenvolver a doença. Esta é bastante pleomórfica, com diferentes

formas clínicas, que serão categorizadas a seguir, sendo as lesões predominantemente

de pele e de nervos periféricos, mas a doença pode acometer também órgãos internos,

tais como: fígado, testículos, olhos, etc (Jopling 1978, Neves & Talhari 1997, Scollard

et al. 2006). A evolução é habitualmente crônica, mas pode manifestar-se com episódios

agudos denominados de reações ou formas reacionais.

1.3- Aspectos históricos

A Hanseníase é tida como uma das doenças mais antigas da humanidade, com

muitas citações, mas sem registros precisos e commuitos pontos obscuros, sendo difícil

uma abordagem precisa do tema. Segundo relatos, era também confundida com várias

outras doenças de pele, muitas das quais descritas sob a mesma denominação de “lepra

ou morféia” (revisado por Andrade 1996, revisado por Eidt 2004). A relação do

cristianismo com os hansenianos está ligada à vida de Jesus. No Novo Testamento

(Mateus 8,1-14; Marcos 1,40-45; Lucas 5,12-16; Lucas 17,11-19) encontram-se relatos

sobre a dedicação de Jesus aos hansenianos por meio dos milagres da cura destes

doentes. Com as palavras: “Os cegos veem e os coxos andam, os leprosos ficam limpos

e os surdos ouvem, os mortos ressuscitam e os pobres são evangelizados” (Mateus 11,5-

6), Cristo quer expressar, além do objetivo da sua missão, a sua piedade e compaixão

principalmente para com os doentes e marginalizados, e ambas são características dos

hansenianos (Cunha 1997).

4

Na Europa, a Hanseníase alcançou seu ponto máximo de disseminação e

contaminação entre os séculos XI e XV, com o pico no século XIII e XIV. Nas

Américas e Brasil a doença foi trazida pelos europeus e africanos, já que a doença não

existia entre os indígenas. Em 1897, foi realizada a “Conferência sobre a Lepra”, que

aconteceu em Berlim. Nesta foram apresentadas as novas descobertas dos cientistas e

médicos, como Danielsen, que, em 1847, identificou as formas tuberculosa e anestésica

da Hanseníase; Virchow, em 1860 identificou a forma “L” da doença e sua

contagiosidade e, ainda Hansen, que em 1873 isolou o bacilo e descobriu a forma de

transmissão da doença (revisado por Cunha 1997, revisado por Eidt 2004, Lyon & Lyon

2013).

Estudo sobre a diversidade genética e a filogeografia do M. leprae sugere que

este bacilo começou a infectar os seres humanos há cerca de 5.000 anos na atual Etiópia

(Monot et al. 2009). Apenas quatro padrões de polimorfismo de nucleotídeos simples

(“Single-nucleotide Polymorphism”, SNP) foram encontrados em todo o globo. O tipo 1

está presente na maior parte da Ásia Central e leste da África. O tipo 2 foi encontrado na

Etiópia, Malawi, Nepal e norte da Índia. O tipo 3 foi encontrado na Europa, norte da

África e Américas e o tipo 4 apenas no oeste da África. O trabalho de Monot lançou a

hipótese de que os soldados de Alexandre, o Grande (século IV a.C.) foram os

prováveis responsáveis pela disseminação do M. leprae pela Ásia e Europa, e que a

colonização e tráfico de escravos foram os responsáveis pela vinda do M. leprae para as

Américas. O fato da bactéria ser extremamente lenta em sua duplicação, talvez explique

a baixíssima quantidade de cepas diferentes em todo o mundo (Monot et al. 2005).

Ácido desoxirribonucléico (DNA) do M. leprae foi detectado e amplificado pela reação

em cadeia da polymerase (PCR - polymerase chain reaction) utilizando-se primers

específicos, em restos de ossos do crânio de um esqueleto encontrado em um cemitério

da Escócia, em caso de hanseníase virchowiana, do século 13–14, Orkney - Escócia

(Taylor et al. 2000).

A Hanseníase era endêmica na Europa até a idade média e sequências de DNA

do M. leprae foram amplificadas de esqueletos de cinco casos de hanseníase medieval

do Reino Unido, Suécia e Dinamarca. Em um caso, o DNA foi tão bem preservado que

a montagem do genoma bacteriano antigo poderia ser alcançada por meio de

sequenciamento. Estas sequências antigas do M. leprae, comparadas com as de 11

variedades modernas, representam diversos genótipos e origens geográficas. As

comparações revelaram notável conservação genômica durante os últimos 1.000 anos,

5

uma origem européia para hanseníase nas Américas, e a presença do genótipo M.

leprae, na Europa medieval, agora comumente associado com o Médio Oriente. A

preservação excepcional de biomarcadores de M. leprae, ácidos micólicos tanto de

DNA, em esqueletos antigos tem implicações importantes para a palaeomicrobiologia e

evolução do patógeno humano (Schuenemann et al. 2013).

Alguns dados da história da doença no Brasil merecem ser lembrados. Nos três

primeiros séculos da nossa história, poucos médicos aqui se estabeleceram, muitos

vinham de Portugal ficavam temporadas depois retornavam. Em 1740, ano em que

aconteceu no Rio de Janeiro a 1ª Conferência Médica sobre a Hanseníase no Brasil, cujo

objetivo era indicar e uniformizar otratamento a ser dispensado aos hansenianos, o

número de doentes nesta capital era estimado em 400 e a doença existia oficialmente

desde o ano de 1600. Em 1741, é fundado o primeiro lazareto, hospital especializado em

tratar os hansenianos, que proliferaram com o crescente número de casosexistentes. Em

Goiás foi construído o primeiro “preventório”, local destinado a abrigar os filhos de

hansenianos (revisado por Cunha 1997, Lyon & Lyon 2013).

O Brasil teve e tem pesquisadores atuando nesta área há muitos anos, muitos

destes com destaque no cenário mundial. A classificação internacional vigente de

“formas” ou “grupos” da hanseníase é a redação final da antiga “classificação

sulamericana”, nascida no Brasil (Michalany & Michalany 1988). A doença passou a

ser de notificação obrigatória em 1904, quando foi também instituída a criação dos

leprosários. Em 1920, foi instituído o isolamento compulsório para os doentes, sendo

este abolido em 1962 (Eidt 2004, revisado em Lyon & Lyon 2013). O nome Hanseníase

em substituição a “lepra” foi sugerido, em 1967, por Abrahão Rotberg, dermatologista

brasileiro (Michalany & Michalany 1988). Em 1976, um decreto substitui o termo

“lepra” por hanseníase, sendo que em 1995, outro decreto de lei federal proibiu a

utilização do termo “lepra”. Em 1941, começa a terapia da doença com a sulfona, sendo

que a multidrogaterapia (MDT ou poliquimioterapia/PQT, conforme portaria do

Brasil/Ministério Saúde 2010a) foi iniciada na década de 1980, por recomendação da

OMS (Eidt 2004, revisado em Lyon &Lyon 2013).

No cenário mundial a OMS, a partir de 1982, patrocinou os principais eventos,

fases ou períodos, assim distribuídos:

1- de 1982 a 1985 – introdução de MDT em uma base global.

2- de 1986 a 1990 – expansão de MDT em áreas "menos difícil".

6

3- de 1991 a 1999 – estratégia de eliminação da hanseníase como problema de

saúde pública, definida como uma prevalência de menos de um caso para cada 10.000

habitantes, meta que deveria ser atingida no ano 2000 (WHO 1991).

4- a partir de 2000 – um quarto período, planejado para os últimos 6 anos,

designados para a "estratégia de eliminação intensiva" ou o "empurrão final" (WHO

2004).

Hoje, na era pós-MDT e genômica a doença ainda permanece intrigante e com

muitas perguntas ainda para serem respondidas, e apesar de todas as mediadas

terapêuticas, educacionais e preventivas a incidência, não tem diminuído (Rodrigues &

Lockwod 2011).

1.4- Dados epidemiológicos – retrospectiva e atualidade

É difícil fazer uma estimativa do número totalde casos de hanseníase no mundo,

pois os diagnósticos e suas definições de casos nem sempre são claros ou consistentes.

Em 1966 o relatório da OMS aponta para os números da tabela 1 mostrada abaixo

(Bechelli & Martinez Dominguez 1966).

Tabela 1. Casos registrados e estimados de hanseníase no mundo em 1966. Fonte:

Bechelli & Martinez Dominguez 1966. Bull World Health Organ (WHO).

A WHO estimou para 1966, 1976 e 1985, 10,8, 10,6 e 12,0 milhões de casos de

hanseníase, respectivamente. Nas décadas de 60, 70 e 80, o número de casos registrados

sofreu aumento constante, conforme mostra a tabela 2. A introdução da

7

multidrogaterapia reduziu em mais de 80% a prevalência global de hanseníase. (WHO

1988a, WHO 1988b).

Ano Casos registrados Aumento no período Prevalência/10.000

habitantes

1966 2.831.775

89,6%

8,40

1976 3.599.949

49,1%

8,80

1985 5.368.202 12,0

1987 5.609.283

Tabela 2. Casos de Hanseníase no período de 1966 a 1987. Fonte: WHO 1988a. “A

guide to leprosy control”.

Em 1985, o número estimado de casos de hanseníase no mundo era de 12

milhões de pessoas, correspondendo a uma prevalência estimada de 19 casos para

10.000 habitantes. A implementação da MDT começou gradualmente, de forma piloto,

durante o período 1982–1985, com cobertura estimada inferior a 1%. Posteriormente foi

implementada em muitos países endêmicos e a cobertura geográfica começou a

aumentar significativamente, atingindo quase 50% no final de 1992 e 100% dos casos

registrados em 1997, tabela 3 (WHO 2004).

8

Tabela 3. Casos registrados de hanseníase, casos novos e cobertura pela MDT. Fonte:

WHO 2004. Multidrug therapy against leprosy. Development and implementation over

the past 25 years.

O boletim de Registro Epidemiológico Semanal da WHO (OMS) informou, que

a prevalência global de hanseníase registrada no ano de 2012, em 115 países, foi de

189.018 casos, com 232.857 novos casos detectados. Esses dados mostram que a meta

de prevalência global de menos de 1 caso de hanseníase para cada 10.000 habitantes foi

atingida, ou seja, a prevalência global foi de 0,33 casos por 10.000 habitantes.Apesar da

drástica redução no número de casos registrados nas últimas duas décadas, a incidência

da doença tem caído lentamente. O número de casos novos detectados mostra uma

incidência de 4,00 casos por 100.000 habitantes, ou seja, permanece alta (WHO 2013),

tabela 4. O declínio apresentado na prevalência de hanseníase, com a implementação da

MDT, não foi acompanhado de um declínio da incidência, detecção ou casos novos,

indicando que a prevalência é um parâmetro inadequado para se avaliar o controle da

infecção (Brasil/Ministério da Saúde/SVS 2009, SINAN/SVS/MS 2012).

9

Tabela 4. Casos registrados, prevalência e casos novos de hanseníase em 2012. Fonte:

WHO 2013. Global leprosy: update on the 2012 situation. Wkly Epidemiol Rec 35.

No Brasil, a doença esteve presente desde a época colonial, trazida pelos

europeus e africanos, e foi aumentando paulatinamente até tornar-se endêmica. Além

disso, o levantamento de casos feito no Hospital dos Lázaros do Rio de Janeiro, no

período de 12 de setembro de 1798 a 27 de janeiro de 1872, demonstrou que um grande

número de pacientes hansenianos era de origemafricana: num total de 2.170 assentados,

sendo que 751 eram escravos negros africanos procedentes de Moçambique, Congo,

Cabinda, Manguella, Angola e outros. Entre 1923 e 1936, foi realizado o primeiro senso

de doentes de hanseníase no Brasil, por Sousa-Araújo, totalizando 48.840 doentes

distribuídos por todos os estados da federação (revisado por Cunha 1997). Em 1966, o

relatório da OMS aponta para o Brasil 104.398 casos registrados (Bechelli & Martinez

Dominguez 1966).

No período de 1980-1983, na era pré-MDT, o Brasil mostrava uma tendência de

crescimento da endemia, com 70% dos casos registrados nos 12 países da América

Central e do Sul de maior prevalência da hanseníase, bem como, tinha 80% dos casos

novos registrados nestes países (Lombardi 1989). Tabela 5.

10

Tabela 5. Casos de hanseníase no Brasil antes da implementação da MDT. Fonte:

Lombardi 1989. Evaluation of leprosy epidemiology in 12 countries of the Americas.

Bull Pan Am Health Organ.

Após a assinatura do Compromisso para a Eliminação da Hanseníase em 1991,

no Brasil houve uma redução de 60% na prevalência, em decorrência das altas por cura,

no entanto, houve um aumento na detecção de casos novos (Brasil/Ministério da

Saúde/SVS 2009). O Brasil é o segundo país em todo o mundo em número absoluto de

casos, ficando atrás apenas da Índia, e há estados com baixa, média, alta, muita alta

endemicidade e hiperendêmico. É considerado hiperendêmico quando a detecção é ≥ 40

casos/100.000 habitantes, de muito alta endemicidade entre 20 e 39,99 casos/100.000

habitantes, alta endemicidade entre 10 e 19,99 casos/100.000 habitantes, média de 2 a

9,99 casos/100.000 habitantes e baixa quando há menos de 2 casos/100.000 habitantes

(SINAN/SVS/MS 2012). Tabela 6.

Tabela 6. Hanseníase – coeficientes de prevalência e detecção por região em menores e

maiores de 15 anos no Brasil 2011. Fonte: SINAN/SVS/MS 2012.

11

O Brasil está entre os 16 países, que entre 2001 e 2009 tiveram um número de

casos novos maior do que 1.000, ocupando hoje o segundo lugar no mundo em número

de casos novos, sendo sobrepujado apenas pela Índia (WHO 2012b). Em 2012, o Brasil

registrou um total de 33.303 casos novos, apresentando uma taxa de detecção de 17,17

casos/100.000 habitantes, portanto, um país com alta endemicidade, e a prevalência de

1,51 casos/10.000 habitantes (SINAN/SVS/MS 2012, WHO 2013). As figuras 1 a 3 e

tabelas 7 e 8 mostram uma série histórica, culminando com a atual (Tabela 8).

Figura 1. Hanseníase no Brasil - coeficiente de prevalência no período de 1990 a 2010.

Fonte: SINAN/SVS/MS 2012.

Figura 2. Hanseníase coeficiente de prevalência e detecção no período de 1990 a 2010.

Fonte: SINAN/SVS/MS 2012.

12

Figura 3. Hanseníase – coeficiente de detecção nas diferentes regiões do Brasil, no

período de 1990 a 2010. Fonte: SINAN/SVS/MS 2012.

Tabela 7. Hanseníase – indicadores epidemiológicos e operacionais – Brasil 2001 a

2012. Fonte: SINAN/SVS/MS 2012.

13

Tabela 8. Hanseníase – tendência de detecção em países com mais de 1000 casos em

2012. Fonte: WHO 2013.

No Estado de Goiás em 2012 foram registrados 2.205 casos novos, com

coeficiente de detecção muito alto, de 35,82 casos/100.000 habitantes, enquanto

aprevalência foi de 3,00 casos/10.000 habitantes, considerada média. O estado foia

sétima unidade federativa com maior incidência e prevalência em 2010/2011

(SINAN/SVS/MS 2012). Figuras 4 e 5.

Figura 4. Hanseníase – coeficiente de detecção geral de casos novosno Brasil e estados

em 2010. Fonte: SINAN/SVS/MS 2012.

14

Figura 5. Hanseníase – coeficientes de prevalência segundo UF - Brasil, em 2011.

Fonte: SINAN/SVS/MS 2012.

Em Goiânia, no ano de 2013, foram registrados 659 casos de hanseníase (SINAN/SVS/MS 2013).

1.5- Manifestações clínicas da hanseníase – definição de caso

Hanseníase deve ser suspeitada em pessoas com qualquer um dos seguintes

sintomas ou sinais: manchas hipocrômicas ou avermelhadas na pele; perda ou

diminuição da sensibilidade nas manchas da pele; dormência ou formigamento das

mãos ou pés; fraqueza das mãos, pés ou pálpebras; nervos dolorosos ou sensíveis;

inchaço ou nódulos na face ou orelhas; feridas indolores ou queimaduras nas mãos ou

pés (WHO 2012c). Definição de caso de hanseníase: é uma pessoa com sinais cardinais

(clínicos) da doença e que ainda não tenha sido submetida ao tratamento específico ou

que requer tratamento quimioterápico. Os sinais cardinais são: diminuição da

sensibilidade em área ou lesão cutânea; espessamento neural periférico e/ou presença de

BAAR em pele, baciloscopia positiva (WHO 1988a, Brasil/Ministério da Saúde 2002,

Britton & Lockwood 2004, Brasil/Ministério da Saúde 2010). Nesta tese foi

considerado caso de hanseníase o paciente com sinais clínicos da doença, baciloscopia

positiva e/ou encontro no exame histopatológico de características da doença, conforme

os critérios de Ridley e Jopling (1966).

A hanseníase é uma doença espectral, cujas formas clínicas são determinadas

pela interação entre o agente e a resposta imunológica do paciente (Ridley & Jopling

15

1966, Modlin & Rea 1987, Jacobson & Krahenbuhl 1999, revisado por Walker &

Lockwood 2007). Figura 6.

Figura 6: espectro clínico e imunopatológico da hanseníase e reações. Fonte:

Leprosy. Walker SL, Lockwood DN 2007.

1.5.1- Manifestações cutâneas na hanseníase

A avaliação diagnóstica da hanseníase se baseia no exame dermato-neurológico,

mediante identificação de lesões de pele com alteração da sensibilidade térmica,

dolorosa e/ou tátil, geralmente ocorrendo nesta ordem. A sensibilidade nas lesões pode

estar diminuída (hipoestesia), ausente (anestesia) ou, em menor frequência, aumentada

(hiperestesia) (Ridley 1955, Neves &Talhari 1997, Britton & Lockwood 2004, revisado

por Scollard 2006, Sampaio & Rivitti 2011, Rodrigues Júnior & Gresta 2013).

As lesões cutâneas da hanseníase podem se manifestar como manchas, placas,

infiltração difusa, nódulos, tubérculos, alopecia, madarose, triquíase e lesões de mucosa

(Ridley & Jopling 1966, Brasil/Ministério da Saúde 2002, Lyon 2013). Os distúrbios

sensitivos nas lesões são devido às neurites, que podem ser causadas tanto pela ação do

bacilo nos nervos como pela reação do sistema imune ao bacilo (Ridley 1955, Neves

&Talhari 1997, Walker & Lockwood 2006, Sarubi & Shibuya 2013).

A manifestação inicial da hanseníase é geralmente a forma indeterminada, com

resposta imune do hospedeiro e manifestações clínicas indiferenciadas, não permitindo

16

a classificação clínica nem o prognóstico da doença. A hanseníase indeterminada (MHI)

geralmente se manifesta como uma lesão hipocrômica, com alteração de sensibilidade

(hipoestesia ou hiperestesia), podendo evoluir para cura espontânea ou para outras

formas clínicas da doença (Ridley & Jopling 1966, Guinto et al. 1986, Neves &Talhari

1997, revisado por Jacobson & Krahenbuhl 1999, Brasil/Ministério da Saúde 2002,

Sampaio & Rivitti 2011, Lyon 2013), não sendo incluída no espectro de Ridley e

Jopling por seu caráter incipiente e imunologicamente indeterminado (Ridley & Jopling

1966).

A Hanseníase Tuberculoide (MHT ou TT) apresenta lesões cutâneas eritemato-

hipocrômicas, eritematosas, eritemato-escamosas, com bordos discretamente elevados

ou com microtubérculos, com alteração de sensibilidade, hipoestesia ou mesmo

anestesia. O centro da lesão pode estar aparentemente poupado, indene. As lesões

podem apresentar alopecia e/ou anidrose. As placas variam de forma, tamanho e

número, sendo que a forma clássica habitualmente não tem tendência à disseminação e

pode curar espontaneamente (Ridley & Jopling 1966, Guinto et al. 1986, Neves &

Talhari 1997, revisado por Jacobson & Krahenbuhl 1999, Brasil/Ministério da Saúde

2002, Sampaio & Rivitti 2011, Lyon 2013).

A Hanseníase Borderline (MHB ou BB, BT ou BL) exibe lesões eritematosas,

eritemato-violáceas, ferruginosas, infiltradas, edematosas, brilhantes, escamosas,

contornos internos bem definidos e externos mal definidos (lesões pré-foveolares ou

foveolares), centro deprimido, aparentemente poupado, hipocrômico ou com cor de pele

normal. Seu caráter instável faz-se assemelhar com as lesões bem delimitadas da TT ou

com as lesões disseminadas da Hanseníase Lepromatosa (LL) (Ridley & Jopling 1966,

Guinto et al. 1986, Neves & Talhari 1997, revisado por Jacobson & Krahenbuhl 1999,

Brasil/Ministério da Saúde 2002, Sampaio & Rivitti 2011, Lyon 2013).

A Hanseníase Lepromatosa (MHL ou LL) mostra pele com infiltração difusa,

numerosas lesões eritematosas, infiltradas, brilhantes, coalescentes, mal definidas e de

distribuição simétrica. Há infiltração difusa da face, regiões malares, supraciliares e

pavilhões auriculares, com formação de tubérculos e nódulos, perda de supercílios

(madarose), o que confere ao paciente aspecto peculiar, denominado facies leonina. Por

vezes mostra nódulos e tubérculos, poucos ou múltiplos, são semelhantes ao quelóide,

caracterizando a forma históide (Neves & Talhari 1997, revisado por Jacobson &

Krahenbuhl 1999, Brasil/Ministério da Saúde 2002, Brasil/Ministério da Saúde/SVS

17

2009, Sampaio & Rivitti 2011, Lyon 2013). São descritas duas variantes da forma LL, a

saber: a forma histoide, já referida acima, e a forma de Lúcio e Alvarado (hanseníase

difusa ou “lepra bonita”), que pode cursar com o fenômeno de Lúcio, uma forma

reacional, com vasculite trombótica, necrose tecidual e ulcerações (Ridley & Jopling

1966, Ridley & Jopling 1966, Guinto et al. 1986, Neves & Talhari 1997, Sampaio &

Rivitti 2011, Lyon-Moura & Pedrosa 2013).

A tabela 9 mostra um resumo das características das lesões cutâneas das formas

clínicas da hanseníase e a classificação operacional adotada na rede pública de saúde

(Brasil/Ministério da Saúde/SVS 2009, Brasil/Ministério da Saúde 2010a), sendo o

paciente diagnosticado e classificado pelo número de lesões, em paucibacilar (PB) e

multibacilar (MB), com até cinco lesões ou mais de cinco lesões, respectivamente.

Tabela 9. Hanseníase – formas clínicas, caracterização e classificação operacional.

Fonte: Brasil/Ministério da Saúde/SVS 2009.

1.5.2- Manifestações neurais na hanseníase

Os nervos são frequentemente acometidos na hanseníase, com neurites

(neuropatias periféricas), levando a perdas de sensibilidades (térmica, dolorosa e tátil) e

distúrbios motores, como paralisias, atrofias musculares, reabsorções ósseas e outras,

provocando sequelas e incapacidades físicas de graus variados (Facer et al. 2000, van

Brakel et al. 2008, Jadhav et al. 2011). Estas ocorrem em todas as formas da hanseníase

18

do espectro de Ridley e Jopling e ao diagnóstico da doença já acometem 25% dos

hansênicos. Algumas vezes o hansênico apresenta clinicamente apenas sinais de

comprometimento neural, sendo estas formas denominadas de neuríticas puras, variando

na literatura entre 1 a 16% dos pacientes, e que por vezes são assintomáticas, as neurites

silenciosas, sendo o diagnóstico estabelecido pela biópsia neural (Scollard 2008, Sarubi

& Shibuya 2013). Os nervos mais frequentemente acometidos são: o cubital (ulnar), o

mediano, o radial, o ciático poplíteo, o tibial posterior, o ramo zigomático do facial, o

trigêmeo e o auricular. Entre as incapacidades físicas mais frequentes estão a garra

cubital (por lesão do nervo cubital), a paralisia cúbito-mediana (por lesão do cubital e

mediano, com amiotrofia de músculos interósseos), a mão caída (por lesão do nervo

radial), úlceras em mãos e pés (mal perfurante plantar), a mão e o pé reacional,

diminuição da sensibilidade corneana (por lesão do ramo do trigêmeo) etc (Neves &

Talhari 1997, Sarubi & Shibuya 2013).

A neurite pode levar a perda de força muscular, com posterior paralisia, o que

pode originar incapacidades e deformidades, como articulações anquilosadas (sem

movimento) e em garras, ectrópio e lagoftalmo (eversão e desabamento da pálpebra

inferior) (Ridley & Jopling 1966, Neves & Talhari 1997, Sarubi & Shibuya 2013).

Outras deformidades também podem se originar de infecção secundária grave devido a

traumas em regiões sem sensibilidade, podendo causar necrose, que muitas vezes pode

levar a amputação da região ou a osteomielite com um processo de reabsorção das

extremidades ósseas, particularmente os dedos dos pés e mãos (Moonot et al. 2005,

Warren 1971).

O comprometimento dos nervos está ligado à resposta imune do hospedeiro, que

ao tentar defender o organismo do M. leprae agride também os componentes neurais. O

envolvimento neural é maior nas formas de maior resposta imune celular (RIC), ou seja,

no polo tuberculoide, onde os filetes nervosos podem ser completamente destruídos. No

polo lepromatoso este comprometimento é menor, geralmente com o infiltrado

inflamatório circundando a fibra neural, sem destruí-la (Talhari & Neves 1997, Sarubi

& Shibuya 2013).

As bases moleculares da neuropatia hansênica ainda não estão bem definidas.

Um estudo sobre esta, avaliando anticorpos anti-PGL-I, imunoglobulinas G e M anti-

LAM (IgG e IgM), anti-ceramida, anti- S100 e anti-fator de necrose tumoral alfa (TNF-

α), os autores mostraram que a lesão neural é uma dinâmica entre estes e os antígenos

do M. leprae, do nervo e de citocinas (Jadhav et al. 2011). Outro estudo demonstrou que

19

a base molecular do tropismo neural do M. leprae é imputada ao domínio G da cadeia

de laminina-α2 das células de Schwann (Rambukkana et al. 1997). Em outro estudo

Rambukkana demonstra as bases moleculares do dano neural, com o M. leprae

invadindo a célula de Schwann e levando a perda motora e sensorial e consequente

deformidades e incapacidades. A base molecular deste evento é que a célula de

Schwann possui lâmina basal, com moléculas de laminina-α2 com os domínios G e

complexos de distroglicans, onde o M. leprae se liga através do PGL-1 (Rambukkana

2001).

Em outro estudo, mais recente, focando na lecitina tipo C, CD209, expressa em

macrófagos e nas células de Schwann, foi observado que as células positivas se ligam

mais ao M. leprae que expressam CD209. Observou-se também que a IL-4 aumentou a

expressão de CD209 nas células de Schwann, com posterior ligação ao M. leprae. As

citocinas Th1 não induz a expressão de CD209 nas células de Schwann (Teles et al.

2010).

Mediadores dos mastócitos também podem estar envolvidos nestas neurites, por

exemplo, a triptase mastocitária, uma protease, liga a receptores de proteinase, agindo

diretamente sobre os neurônios sensitivos. Além disso, ATP liberado dos mastócitos

pode ativar os nervos sensoriais vizinhos e neuropeptídeos lançados de neurites, tais

como, o peptídeo relacionado com o gene de calcitonina (CGRP) e a substância P (SP),

ligam aos seus receptores nos mastócitos e podem estimular a degranulação (revisado

por Silver & Curley 2013).

Todos os estudos com base molecular poderão servir de base para futuras

terapias moleculares, minimizando assim o dano neural. As sequelas ou incapacidades

físicas relacionadas ao comprometimento neural podem ser evitadas ou minoradas com

o diagnóstico precoce e tratamento da hanseníase e da neurite, esta comum nas formas

reacionais (Neves & Talhari 1997, Walker & Lockwood 2007, Teles et al 2010).

1.5.3- Manifestações otorrinolaringológicas na hanseníase

As manifestações otorrinolaringológicas são mais frequentes nas formas MHB e

LL com ressecamento da mucosa e obstrução nasal, aumento das secreções, coriza

persistente, que inicialmente é mucosa, evoluindo para sanguinolenta ou epistaxe,

levando a infecção secundária, formação de crostas, com odor fétido, que tardiamente

leva a ulceração, destruição e perfuração do septo nasal. Como sequela ocorre o

20

desabamento do nariz, com aponta caindo e colapso do dorso nasal, conferindo ao

hansênico o nariz com aspecto de “tromba de elefante” ou “nariz de anta” e “nariz em

sela”, respectivamente. Ao final do processo instala-se a rinite atrófica, lenta e

irreversível. As secreções e tecidos nasais são ricos em BAAR e uma das principais vias

de contaminação de comunicantes ou contatos. Pode haver também comprometimento

da orofaringe, geralmente secundário ao comprometimento da mucosa nasal, palato

mole, úvula, laringe, sendo que antigamente o comprometimento desta, por vezes era

grave, provocando obstrução e morte do hansênico por asfixia. O comprometimento do

pavilhão auricular, com espessamento da borda livre ocorre em 80% dos casos BL e LL

(Neves & Talhari 1997, Walker & Lockwood 2007, Sampaio & Rivitti 2011, Lyon &

Oliveira 2013).

A boca também é comprometida em muitos casos de hanseníase e, na forma LL,

o comprometimento ocorre em 60% dos casos. Lesões aparecem em maior frequência

no palato mole, úvula e pilares de fauces, que vão desde eritema até ulcerações, levando

a cicatrizes com atrofias e deformidades. Nas formas reacionais, RT2, pode ocorrer

necrose de palato. A língua, dentes e tecidos periodontais também podem ser

acometidos. As alterações são pouco comuns nas formas paucibacilares, TT e BT

(Walker & Lockwood 2007, Sampaio & Rivitti 2011, revisado por Lyon 2013).

1.5.4- Manifestações oftalmológicas na hanseníase

As manifestações oftalmológicas na hanseníase são frequentes, variando de 47 a

90% o envolvimento ocular dos pacientes. Nos olhos, as partes mais comprometidas são

o aparelho lacrimal, pálpebra, córnea e úvea. Pacientes hansênicos BL e LL apresentam

diminuição da produção de lágrima, principalmente os que usam clofazimina. Esta

diminuição poderá levar a ressecamento da córnea com sensação de queimor. Paciente

com comprometimento da mucosa nasal poderá ter bloqueio do canal nasolacrimal,

provocando lacrimejamento e retenção da lácrima no saco lacrimal, o que poderá

ocasionar infecção bacteriana secundária, a dacriocistite. As pálpebras podem

apresentar problemas nos músculos que as movimentam, devido a uma fraqueza dos

mesmos, secundária à lesão neural, o que poderá levar ao fechamento inadequado das

pálpebras (lagoftalmo), eversão da pálpebra inferior (ectrópio) com consequente

ressecamento da córnea, o que poderá levar até a cegueira. A hanseníase é uma das

principais causas de cegueira no mundo, variando de 0,7 a 30% dos pacientes. As

21

alterações palpebrais podem estar associadas com alterações da sensibilidade da córnea,

com abolição do reflexo córneopalpebral, expondo o paciente a risco de trauma nos

olhos, devidoa abolição de reflexo de defesa, que nos protege de corpos estranhos. O

uso de corticoides, tão comum no tratamento das reações, poderá levar à catarata e

aumento da pressão intraocular (glaucoma) (Woods 1997, Wlaker & Lockwood 2007,

Sampaio & Rivitti 2011, Lyon & Lyon-Freire 2013).

Na córnea, o comprometimento dos ramos oftálmicos dos nervos trigêmeos leva

a uma hipoestesia, que com traumas leva a uma ceratite, inflamação da córnea,

denominada ceratite neurolítica, com proliferação de vasos e formação do “panos”,

tecido que provoca redução da visão e diminuição da sensibilidade da córnea (Woods

1997, Lyon & Lyon-Freire 2013).

A úvea, camada média e vascular do olho, é composta por 3 estruturas: íris,

corpo ciliar e coroide. Na hanseníase o comprometimento mais importante é o da íris,

que é a camada visível e que da cor ao olho, levando a inflamação da mesma, a irite

aguda ou crônica, isolada ou em conjunto com a inflamação do corpo ciliar, ou seja, a

iridociclite. Estas mostram sintomas variados, como lacrimejamento, ardor e

vermelhidão nos olhos, diminuição da visão, fotofobia (dificuldade para ver em

ambientes claros, aversão à luz), entre outros. A forma crônica pode ser silenciosa ou

assintomática, provocando atrofia progressiva da íris, o que leva a um fechamento da

pupila, com redução da entrada da luz, prejudicando a visão do paciente. (Woods 1997,

Lyon & Lyon-Freire 2013).

1.5.5- Manifestações Viscerais e/ou Sistêmicas da hanseníase

A hanseníase é doença sistêmica, envolvendo mais frequentemente pele e nervos

periféricos, mas pode comprometer qualquer órgão interno, como: aparelho respiratório,

digestivo, fígado, linfonodos (gânglios linfáticos), medula óssea, testículos, entre outros.

Este comprometimento é principalmente nas formas multibacilares (MB) do polo

lepromatoso (formas BL e LL) e mais intenso, com reação inflamatória sistêmica,

durante as reações tipo II. As alterações viscerais são mais lentas, por aparente

dificuldade de proliferação do BAAR e, consequentemente, pouco sintomáticas,

regredindo com o tratamento específico, exceto o comprometimento testicular e da

laringe. São mais evidentes o comprometimento da laringe com sintomas de rouquidão,

mas pode ser grave, com fibrose laríngea e levar a dificuldade de fonação e respiração.

Já o comprometimento testicular pode ser intenso, levando a atrofia total dos mesmos,

22

com consequente infertilidade, alterações hormonais secundárias com perda dolibido e

impotência sexual, e das características sexuais, como redução e distribuição dos pelos e

ginecomastia (Fleury 1997, Magnago 2013).

Outra manifestação sistêmica importante é a amiloidose secundária, com

produção de amiloide pelos macrófagos ativados durante a inflamação, depositando nos

rins e podendo levar a lesões, tipo glomerulonefrites, atrofia dos mesmos e morte por

insuficiência renal crônica. O comprometimento renal é mais comum nos surtos de RT2

(Woods 1997, Magnago 2013).

Comprometimentos menos importantes, muitas vezes assintomáticos, podem

ocorrer no fígado, baço, medula óssea, linfonodos e outros, com a presença de

granulomas, mas sem repercussões clínicas. A suprarrenal pode ser acometida em até

um terço dos pacientes, com depósitos de amiloide, podendo levar a disfunções no eixo

hipotálamo-hipófise-adrenal e consequente distúrbios endócrinos (Magnago 2013).

1.6- Imunologia da hanseníase

A hanseníase tem sido explorada como um modelo de doença humana que exibe

padrões dinâmicos de resposta imunológica frente à infecção por um patógeno

intracelular. Como não existe um modelo experimental ideal, as lesões humanas da

hanseníase têm sido extensamente utilizadas para desvendar os mecanismos

imunológicos protetores e a sua complexa patogênese (Modlin 2010, Montoya &

Modlin 2010). É um exemplo de doença espectral na qual, diferentes tipos de resposta

imune ao M. leprae definem as manifestações clínicas, ilustrado por duas respostas

polares, a da hanseníase tuberculóide e lepromatosa (Modlin 1987, Yamamura et al

1991, Modlin 1994, revisado por Scollard et al. 2006, revisado por Duthie et al. 2008).

O organismo humano frente a um patógeno agressor responde de imediato com a

resposta imune inata (RII) e, mais tardiamente, com a resposta imune adaptativa

(RIA).É intrigante que na hanseníase, tanto as diferentes manifestações clínicas da

doença crônica como as manifestações agudas das reações hansênicas estejam

diretamente associadas ao tipo de resposta imune do hospedeiro aos antígenos do M.

leprae (Britton & Lockwood 2004, Montoya & Modlin 2010).

1.6.1- A resposta imune inata contra o M. leprae

23

A resposta imune inata é inicial e rápida à penetração de agentes agressores,

feita mediante mecanismos imunológicos inatos, que sãoinespecíficos e gerais contra

patógenos, independente de sua natureza. Esta é constituída por barreiras, ou seja, pele e

mucosas íntegras, fatores plasmáticos solúveis, como a lisozima, o complemento,

proteínas, citocinas, pela fagocitose (células dendríticas, macrófagos, neutrófilos e

outros), células “natural killer”, etc. (Akira 2003, Costa et al. 2013). A RII desempenha

papel crucial na definição do tipo de estratégia a ser usada pela resposta imune

adaptativa (Modlin 2010, Montoya & Modlin 2010).

As células do sistema imune inato expressam em suas membranas receptores de

reconhecimento de padrões (pattern recognition receptors/PRRs), que interagem e

reconhecem moléculas das membranas dos patógenos, os padrões moleculares

associados aos patógenos (“pathogen-associated molecular patterns/PAMPs”) (Akira

2003, Scollard et al. 2006, Modlin 2010, Montoya & Modlin 2010).Os PRRs são

proteínas, que forma a família dos Toll-like receptores (TLRs, TLR1 a 13), que são

expressos nas membranas dos monócitos, macrófagos e células dendríticas(“dendritic

cells” – DC), as células apresentadoras de antígeno (APCs) clássicas. Por outro lado, os

PAMPs são moléculas das paredes dos patógenos, como por exemplo, o

lipopolissacarídeo (LPS) das paredes das bactérias gram negativas, as lipoproteínas di e

tri-aciladas das micobactérias, a lipoarabinomanana com manose ou arabinose

(ManLAM e AraLAM), etc (Akira 2003, Modlin 2010, Hart & Tapping 2012).

A ligação entre um TLR e seu agonista gera uma cascata sinalizadora que

culmina com a ativação de genes regulados pelo fator nuclear kappa B (NF-κB), que

codificam citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e moléculas co-estimulatórias, que

irão ativar as células T etc (Akira 2003). Na hanseníase, o TLR2, dimerizado com

outros TLRs (TLR2/6 e TLR2/1), reconhece os PAMPs do M. leprae, representados por

lipoproteínas di e tri-aciladas, pelo fenoglicolipídeo ou glicolipídeo fenólico I (PGL-I),

pela ManLAM, AraLAM, etc. A ligação entre um TLR e seu agonista ativa a resposta

inflamatória via produção de citocinas, a produção de TNF- e da interleucina 12 (IL-

12), direcionando a RIA para o tipo Th1(Krutzik et al. 2005, Scollard 2006, Bochud et

al 2008, Misch et al. 2008, Modlin 2010, Montoya & Modlin 2010).

O genoma do M. leprae prevê 31 genes para diferentes lipoproteínas, sugerindo

que muitas delas tri-aciladas poderiam sinalizar via TLR2/1, desencadeando atividade

imunoestimuladora ou imunossupressora.

24

A defesa e/ou resistência à hanseníase estão relacionadas também à produção de

reativos intermediários do oxigênio (ROI) e nitrogênio (RNI), elementos fundamentais

para a destruição bacilar dentro do macrófago. A produção de ROI, RNI e IL-12, pelo

macrófago, ocorre após o reconhecimento de antígenos do M. leprae via TLR2/1

(Scollard et al. 2006, Modlin 2010, Montoya & Modlin 2010).

Polimorfismos de uma única base de nucleotídeo nas regiões codificadoras das

moléculas de TLR2 ou TLR1 parecem estar associados a uma maior suscetibilidade a

hanseníase (revisado por Scollard et al. 2006, Bochud et al. 2008, Modlin 2010,

Montoya & Modlin 2010). Misch e colaboradores concluíram que a deficiência de

TLR1 influencia a resposta imune adaptativa durante a infeção pelo M. leprae,

provocando manifestações clínicas, tais como, o dano neural e incapacidades (Misch et

al. 2008). Outros receptores TLR parecem correlacionar-se com a resistência ou

susceptibilidade à doença. O TLR9 reconhece o DNA CpG do M. leprae, por isso SNPs

associados ao gene codificador do TLR9 predispõe as formas lepromatosas de

hanseníase (Krutzik et al. 2005). Por outro lado, polimorfismos no TLR4, que se liga a

HSP-20 (proteína do choque térmico) do M. leprae, estão relacionados às formas

tuberculoides (citado por Scollard et al. 2006, Teles et al. 2010).

Além dos TLR, existem outros PRRs localizados no citoplasma, os NLRs

(receptores semelhantes ao NOD [Nucleotide-binding oligomerization domain]-like-

receptors). No M. leprae, NOD1 e NOD 2 reconhecem componentes das paredes das

células (ácido d-glutamil-meso-diaminopimélico e o muramil dipeptídeo/MDP,

respectivamente). Estimulação dos NLRs ativa um complexo protéico denominado

“inflamosoma”, que atua na caspase, levando a clivagem proteolítica e ativação da

produção da IL-1β e outras citocinas (Modlin 2010). Em adição aos TLRs e NLRs,

existem outros PRRs, os receptores semelhantes ao RIG-I (“RIG-I-Like receptors),

receptores de manose e receptores de proteínas do complemento. Os receptores

citoplasmáticos do tipo NOD2 parecem ser altamente relevantes na resposta contra

hanseníase, já que polimorfismos de uma única base de nucleotídeo (SNPs) de NOD2

estão relacionados com manifestação de formas lepromatosas de hanseníase (Zhang et

al. 2009, Kang et al. 2010, Modlin 2010, Montoya & Modlin 2010).

Receptores de lectina tipo C (CD209), expressos em macrófagos, reconhecem

especificamente estruturas de carboidratos encontradas na parede celular do M. leprae,

como a galactana, iniciando a produção de TNF-α e óxido nítrico (revisado por Scollard

et al. 2006). Outro receptor de lectinas, o DC-SIGN [DC-Specific Intercelular adhesion

25

molecule (ICAM)-3-Grabbing Nointegrein ou CD209] de células dendríticas e

macrófagos, promove imunossupressão, ou seja, é receptor considerado inibitório,

expresso mais em células de pacientes multibacilares (Krutzik et al. 2005, citado por

Scollard et al. 2006, Montoya et al. 2009, Teles et al. 2010).

Os receptores do complemento CR3 podem facilitar a fagocitose do M. leprae

por meio de opsoninas do complemento ou fagocitose mediada por lectinas. Pacientes

LL/BL expressam menos receptores CR3 (Modlin 2010). Outra proteína receptora que

parece ter relação com as diferentes formas de manifestação da hanseníase é o receptor

de vitamina D (VDR). Essa proteína, que está relacionada à ativação de macrófagos e

produção de catalecidinas e defensinas, parece estar aumentada em pacientes TT/BT em

comparação a pacientes LL/BL (Prevedello & Mira 2007, Montoya et al. 2009, Modlin

2010). O polimorfismo de VDR não está associado a fenótipos da hanseníase (Sapkota

et al. 2010).

A fagocitose é um dos principais mecanismos efetores da imunidade inata e

desencadeia uma série de mecanismos microbicidas e digestivos que possibilitam o

processamento e apresentação dos antígenos e o início da resposta imune adaptativa. A

fagocitose é realizada principalmente pelos macrófagos, que também têm a função de

varredores (“scavenger”) para remover material extracelular, em especial lipoproteínas

oxidadas de baixa densidade, que contribuem para a formação de células vacuolizadas

(células de Virchow). Na hanseníase, os macrófagos desenvolvem diferentes programas

funcionais para fagocitose e resposta antimicrobiana que são desencadeados por

citocinas da resposta imune inata. Assim, a IL-15 presente nas lesões tuberculóides

induz a via antimicrobiana dependente de vitamina D. Já a IL-10, presente nas lesões

lepromatosas, induz a via fagocítica com expressão de receptores scavenger e fagocitose

de micobactéria e lípides oxidados (Montoya et al. 2009).

Para evadir-se da resposta imune do hospedeiro o patógeno usa de vários meios.

Na hanseníase, nas lesões lepromatosas, a diferenciação das células dendríticas, APCs,

em células maduras, a partir de precursores mieloides, é interrompida resultando em

menor diferenciação e função das DCs e da sua capacidade de apresentar antígenos.

Agonistas do TLR2/1 (ManLAM e AraLAM) são fatores que contribuem tanto para

ativação de macrófagos e destruição bacilar como para imunomodulação das respostas

do hospedeiro “desativando” os macrófagos, com o bloqueio da fusão fagosoma-

lisosoma, e estimulando da resposta Th2. Estas moléculas funcionam em grande parte

como consumidoras de espécies reativas de oxigênio produzidas durante a explosão

26

oxidativa do fagosoma, o que proporciona condições para que o bacilo fique protegido

no citoplasma da célula, multiplicando-se, formando globias e disseminando-se (Modlin

2010, Teles et al. 2010).

Nas formas lepromatosas, são encontrados bacilos vivos residentes em vacúolos

lipídicos no citoplasma e nas membranas dos macrófagos. O bacilo ainda possui

mecanismos para inibir a atividade de reativos do oxigênio no interior dos macrófagos,

como a inibição da síntese de superóxido pelo PGL-I e a expressão de superóxido-

dismutases SodA e SodC que inibem o óxido nítrico (revisado por Scollard et al. 2006).

Trabalho recente demonstrou que a apoptose está diminuída em macrófagos infectados

com BAAR, mesmo que a carga bacilar seja alta, em comparação com macrófagos

infectados com BAAR irradiados ou mortos (Lahiri et al. 2010).

O M. leprae possui, ainda, mecanismos para impedir a fusão do fagossoma com

o lisossomo. A TACO (tryptophan aspartate-containing coat protein ou CORO1A) é

uma proteína, presente na membrana lisossomal de macrófagos infectados pelo M.

leprae, que inibe fusão dos fagossoma ao lisossomo do macrófago e é expresso em altas

concentrações em lesões de pacientes MB (Suzuki et al. 2006, Tanigawa et al. 2009).

1.6.2- A resposta imune adaptativa contra o M. leprae

Após a resposta imune inata inicial, fagocitose e processamento dos patógenos,

com as APCs apresentando os antígenos aos linfócitos, dá-se o início da resposta imune

adaptativa, representada pela ativação dos linfócitos T e B, que é complementar e agora

simultânea com a inata e representa uma segunda linha na defesa do organismo, já que a

RII por si só, pode não ser suficiente para eliminar o patógeno (Modlin 1994, Akira

2003, revisado por Scollard et al. 2006, revisado por Moraes et al. 2006, Abbas et al.

2012c).

As células T auxiliares CD4+ (T helper/Th) são fundamentais para o

funcionamento do sistema imune e atuam coordenando a expansão e regulação das

células T CD8+, facilitando a resposta de células B, recrutando e modulando múltiplos

componentes da RIA. O encontro inicial de células T “naïve” (virgens) com o antígeno

varia, dependendo do sitio anatômico, do tipo de patógeno e da presença de citocinas e

moléculas co-estimulatórias que influenciam a diferenciação de células Th em células

efetoras específicas para o antígeno com características funcionais distintas. As células

apresentadoras de antígenos, células dendríticas, podem processar e apresentar

27

antígenos protéicos via MHC de classe I e MHC de classe II além de antígenos

glicolipídicos via CD1 para linfócitos (Hunger et al. 2004, Abbas et al. 2012a). As

células T virgens requerem dois sinais diferentes das APCs para se tornarem ativadas.

O sinal 1 se refere à interação entre o receptor para antígeno do linfócito T (T cell

receptor/TCR) e o Ag processado/peptídeo associado à molécula de MHC apresentado

na superfície da APC. O sinal 2 se refere à expressão na superfície das APCs de

moléculas co-estimulatórias e a produção de citocinas (Abbaset al. 2012a). A existência

do sinal 1 na ausência do sinal 2 induz anergia de células T, e na ausência de ativação

completa de APC, pode ser iniciada uma resposta do tipo Th2.

As DCs de pacientes tuberculoides, assim como os macrófagos ativados desses

pacientes, podem produzir citocinas pró-inflamatórias, como a IL-12 e TNF-α, que

estimularão uma resposta Th1 (revisado por Scollard et al, 2006). Porém as DCs de

pacientes lepromatosos, infectadas com M. leprae, passam a expressar PGL-I em sua

membrana celular e produzem IL-4 e IL-10. A utilização de anticorpos anti-PGL-I

opsoniza essas DCs, que passam a produzir IL-12, que estimularão uma resposta Th2.

(Modlin 1994, Krutzik et al. 2005).

A resistência à infecção pelo M. leprae está fortemente condicionada às células

T do tipo Th1 (fator de transcrição T-bet), que desempenham papel essencial na síntese

local das citocinas IL-12, TNF-α, Interferon Gama (IFN-γ), IL-2 e a produção de

mediadores de oxidação, como reativos intermediários do oxigênio e do nitrogênio

parecem ser essenciais no combate ao bacilo (Yamamura et al. 1991, Modlin 1994,

Misra et al. 1995, Stefani et al. 2003, Sampaio & Rivitti 2011).

Os pacientes TT desenvolvem resposta imune celular específica do tipo Th1 com

produção de citocinas IL-2, IFNγ e TNF-α (Ochs et al. 2009). Nestes os bacilos são

escassos ou ausentes, caracterizando a doença paucibacilar, com teste cutâneo

(Lepromina ou Reação de Mitsuda), os testes de linfoproliferação e ensaio de sangue

total (“whole blood assay/WBA”) positivos. As lesões TT expressam também citocinas

da imunidade inata do tipo 1 como linfotoxina α/β, IL12p70, IL-18 e GM-CSF

(Yamamura et al. 1991, Modlin 1994, revisado por Scollard et al. 2006, Montoya &

Modlin 2010). A IL-2 é produzida pelas células T CD4+ e CD8+ em pacientes TT, mas

não por pacientes LL. Esta ativa receptores dos linfócitos Th1, responsáveis pela

manutenção da produção de citocinas, e estimula a formação de clones celulares

específicos (Modlin 1994, Kim et al. 2001).

28

No outro lado do espectro, os pacientes LL desenvolvem resposta imune do tipo

Th2 (fator de transcrição GATA3), com expressão das citocinas IL-4, IL-10 e IL-5,

produção de anticorpos, que não protegem contra o bacilo intracelular, clinicamente,

mas frequentemente com múltiplas lesões disseminadas, os testes cutâneos, de

linfoproliferaçãoe ensaio de sangue total negativos. A anergia apresentada pelos

pacientes LL é restrita aos antígenos do M. leprae (Yamamura et al. 1991, Ochs et al.

2009, Scollard et al. 2006, Montoya & Modlin 2010). Em um estudo, os autores

encontraram que a IL-9 é capaz de reverter o efeito inibitório da IL-10 e IL-13 na

atividade citotóxica induzida pelo M. leprae (Finiasz et al. 2007).

A IL-12 é secretada por células dendrítcas e macrófagos em resposta

principalmente a antígenos protéicos do M. leprae em pacientes TT, mas não em

pacientes LL. Estimula a produção de IFN-γ pelos linfócitos Th1 e linfócitos TCD8+ na

lesão. A IL-12 parece, ainda, inibir a secreção de IL-4 por outros macrófagos, células

dendríticas e linfócitos (Libraty et al. 1997). Um estudo que avaliou pacientes com

hanseníase e IL-12 mostrou que as células T de pacientes tuberculoide, a forma

resistente da hanseníase, são sensíveis a IL-12; no entanto, as células T de pacientes

virchowiana, forma suscetível de lepra, não respondem a IL-12. Neste a IL-12Rβ2 foi

mais altamente expressa nas lesões tuberculoides em comparação com lesões

virchowianas. Em contraste, a expressão de IL-12Rβ1 foi semelhante em ambos

tuberculoide e lesões virchowianas(Kim et al. 2001).

O TNF-α, citocina pró-inflamatória, é secretado por macrófagos e linfócitos T

CD4+, em resposta aos antígenos lipídicos e glicídicos, como o PGL-I. O TNF-α é

crucial na manutenção da ativação macrófagos e células Th1, sendo a principal citocina

responsável pela manutenção da granuloma em pacientes tuberculoides, mas não é

encontrado nas lesões de pacientes lepromatosos (Foss 1997, Moraes et al. 2001,

Modlin 1994, Sapkota et al. 2010). É encontrado em grandes quantidades em pacientes

de hanseníase com osteomielite e reabsorção óssea e, podendo provocar dano neural

(Barnes et al. 1992, Sarno et al. 2000). Outro estudo mostra que existe uma relação

entre polimorfismo de região promotora de TNF-α e IL-10 com o desenvolvimento de

hanseníase PB (Santos et al. 2002).

O IFN-γ é produzido por células T CD4+ e CD8+ nas lesões de pacientes

TT/BT, sendo importante na manutenção do granuloma e inibe a formação de IL-4 e IL-

5 por macrófagos e a produção de anticorpos por linfócitos B (Yamamura et al 1991,

Modlin 1994). Este estimula a fagocitose pelos macrófagos e os mecanismos de

29

ativação celular, expressão de MHC de classe II, processamento, destruição, digestão e

apresentação de antígenos do M. leprae e potencialização da produção de óxido nítrico e

intermediários reativos de oxigênio. O IFN-γ promove a inibição da diferenciação de

células T “naive” em células Th2 (Modlin 1994). A expressão de IFN-γ apresentou

maiores níveis em lesões TT quando comparadas às lesões LL (Yamamura et al. 1991,

Modlin 1994, Misra et al. 1995, Libraty et al 1997, Moubasher et al. 1998, Stefani et al.

2003). Esta citocina participa também nos episódios reacionais, quando está elevada

(Moraes et al. 2001). Recentemente outro trabalho mostrou a inibição do intereferon

tipo II (IFN-γ) pelo tipo I (IFN-α e β), sendo que este, juntamente com a IL-10,

expressaram-se mais em pacientes MB (Teles et al. 2013).

Quando ocorre a polarização do tipo Th2, há exacerbação da resposta humoral,

com vigorosa produção de anticorpos, que é ineficaz para a eliminação dos bacilos

intracelulares e causa maior suscetibilidade à hanseníase (Yamamura 1991, Modlin

1994). A subpopulação Th2 produz as citocinas IL-4, IL-5 e IL-10 que são supressoras

da atividade macrofágica, produzindo bloqueio da estimulação de células Th1, com

consequente desvio da resposta imunológica (Modlin 1994, Foss 1997). Os antígenos

PGL-I e lipoarabinomanana (LAM) apresentam função supressora na ativação dos

macrófagos, favorecendo a polarização para resposta do tipo Th2 com a produção de

citocinas supressoras como fator de crescimento transformador- β (TGF-β), IL-10 e IL-

4 (Foss 1997).

A IL-4 é uma citocina encontrada principalmente nas lesões de pacientes LL/BL

e é produzida tanto por macrófagos quanto por linfócitos T CD8+ e CD4+ (Modlin

1994). Esta estimula a ativação de linfócitos B, que aumenta a secreção de

imunoglobulinas, e a ativação de mastócitos locais, que passam a produzir mais IL-4,

potencializando a resposta supressora macrofágica (Yamamura et al. 1991, Misra et al.

1995, Teles et al. 2010).

A IL-5 é produzida pela subpopulação de células Th2 e mastócitos nas lesões de

pacientes células LL/BL e inibe fortemente a produção de TNF-α e IL-12 pelos

macrófagos (Ochoa et al. 2010). Apesar da IL-5 estimular o crescimento e a

diferenciação dos eosinófilos em outros tipos de infecções, dificilmente são encontrados

eosinófilos nas lesões da hanseníase (Modlin 1994). Uma análise de lesões de

hanseníase por imuno-histoquímica mostrou que houve cerca de 8% mais células IgM

positivas nas lesões LL do que em lesões TT. Além disso, a IL-5 sinergizada in-vitro

pelo M. Leprae, aumenta a secreção de IgM total das células mononucleares do sangue

30

periférico. Este estudo in vitro demonstrou o papel da IL-5 na promoção do aumentado

do IgM no local da lesão de hanseníase (Ochoa et al. 2010).

A IL-10 é uma citocina produzida por macrófagos e células dendríticas em

lesões de pacientes LL/BL. Inibe fortemente a produção de substâncias microbicidas

como reativos de oxigênio, óxido nítrico e catalecidinas em macrófagos infectados pelo

M. leprae (Yamamura et al. 1991, Modlin 1994, Misra et al. 1995, Pereira et al. 2009).

A IL-10 inibe ainda a expressão de MHC de classe II, assim como a produção de IL-12

por células dendríticas e macrófagos (Misra et al. 1995). Já referido anteriormente foi

demonstrado que polimorfimos da IL-10 favorece o desenvolvimento de hanseníase PB

(Santos et al. 2002) e que a IL-10 favorece o desenvolvimento das formas MB (Teles et

al. 2013).

Em lesões de pacientes com hanseníase há clara diferença na proporção de

linfócitos TCD8+ e TCD4+. Nas lesões de pacientes TT, os linfócitos T encontram-se

bem unidos a macrófagos ativados, dentro e nas proximidades de granulomas e são

geralmente observados em uma proporção de 1,9:1,0 células TCD4+/CD8+. As células

TCD4+ encontram-se distribuídas por todo granuloma, enquanto as TCD8+ são

geralmente encontradas na periferia deste (Modlin et al 1983, Modlin & Rea 1987). Nas

lesões TT, tanto as células TCD8+ quanto TCD4+ produzem grandes quantidades de

IFN-γ (Modlin et al. 1983, Modlin & Rea 1987, revisado por Foss 1997, revisado por

Scollard et al. 2006). Em pacientes tuberculoides, as células TCD8+ produzem grandes

quantidades de perforina, granzima e granulisina (Modlin et al. 1988). Em contraste, nas

lesões de pacientes LL as células T são encontradas na proporção de 0,6:1,0

TCD4+/TCD8+, e ambos os fenótipos de linfócitos T estão distribuídos de forma

desorganizada dentro do processo inflamatório (Modlin et al. 1983, Modlin et al. 1988).

Outra diferença notável nas lesões LL é a grande quantidade de citocinas IL-4

produzidas pelo linfócito TCD4+ e principalmente por TCD8+ (Yamamuraet al. 1991,

revisado por Foss 1997).

O paradigma Th1 e Th2 foi substituído por um painel de novas subpopulações

de células T, que foram adicionadas ao “portfolio” de células Th (Joosten et al. 2007,

Ochs et al. 2009, Shevach 2009). Estas novas subpopulações incluem as células Th17,

Th22, Th9, Th3, células T auxiliares foliculares (Thf), células T invariantes associadas à

mucosa (MAIT), células T restritas por MHC Ib e subpopulações de células T

reguladoras (Treg). Existem evidências de que algumas destas subpopulações de

31

células T participam da resposta imune contra o M. leprae (Massone et al. 2010,

Palermo et al. 2012).

As células Th17 são pró-inflamatórias, associadas a doenças autoimunes e

participam da imunidade antimicrobiana contra bactérias extracelulares e fungos,

principalmente nas superfícies mucosas (Nouri-Aria 2009, Ochs et al. 2009). Estas são

induzidas a partir de células T “naive”, na presença de IL-6 e TGF-β (“transforming

growth factor β”), requerem IL-23 para sua expansão e estabilização, expressando o

fator de transcrição RORγT (orphan nuclear receptor). As células Th17 produzem IL-

17, IL-24, IL-21, IL-22 e CCL-20 (Nouri-Aria 2009). Na hanseníase, as células Th17

parecem participar da patogênese da reação tipo 2 (Martiniuk et al.2012). Na vacinação

experimental com Bacilo Calmette-Guerin (BCG) ocorreu ativação de Th17, no entanto,

exposições repetidas a M. tuberculosis e a BCG levaram a doença pulmonar e não a

proteção.

As células Th22, funcionalmente, sobrepõem-se às células Th17, mas não

existem evidências que participem da proteção contra a tuberculose em murinos. Estudo

recente dos subconjuntos de células T, demonstra Th17e Th22, agem localmente para

induzir plasticidade de células T nas lesões LL, manifestando com hiperplasia pseudo-

epiteliomatosa da epiderme (HPE) e que miR-21 e STAT3 encontram-se aumentadas

em lesões LL com HPE, dada sua associação com a hiperproliferação epitelial (Fischer

et al. 2012).

As células T helper foliculares (Tfh) e Th9 associadas à defesa do hospedeiro

contra patógenos extracelulares, ainda não foram estudadas na hanseníase nem na

tuberculose.

Os estudos não esclarecem exatamente o que constitui uma resposta imune

protetora e não dispomos, até o momento, de um marcador ideal de proteção para

hanseníase. Além disso, diante da complexidade da resposta imune contra

micobactérias, não parece razoável supor que uma única população celular seja

responsável pela proteção do hospedeiro.

Uma característica intrigante da resposta imune adaptativa é a sua plasticidade,

segundo a qual as populações de células T e macrófagos não estão em estágios de

diferenciação terminais, mas podem se converter e reverter em fenótipos opostos (Sun

et al. 2007, Shevach & Davidson 2010, Wohlfert & Belkaid 2010). Por exemplo, as

células Th17 podem se converter em células Th1 ou mesmo as células Th1 podem ser

redirecionadas em células Treg. Existem também evidencias de que as células pró-

32

inflamatórias Th17 juntamente com as células Treg devem atuar de forma a manter o

equilíbrio do sistema imune do hospedeiro. Tanto células imunomoduladoras Treg

como células pró-inflamatórias Th17 são ativadas por M. leprae, sendo que a ação das

células Treg se contrapõe à ativação das células Th17, inibindo o recrutamento precoce

de células efetoras para o sítio da infecção. Mais recentemente, foi demonstrado que as

células Th17 estão em balanço positivo/negativo com células Treg, e existem células T

híbridas, que possuem tanto o fator de transcrição de células Th17, RORγ T, como o

fator de transcrição de Treg (Foxp3), podendo atuar com função pró-inflamatória ou

supressora. Assim, neste novo conceito de plasticidade, populações celulares únicas

podem adquirir diferentes funções numa infecção crônica como a hanseníase,

dependendo do contexto e da situação em que atuam. A figura 7, esquematicamente,

ilustra a intrincada resposta imunológica, inata e adaptativa, frente a uma infecção pelo

M. leprae.

33

Figura 7. Interação entre a imunidade inata e a imunidade adaptativa na resposta à

infecção pelo M. leprae. Fonte: esta figura é parte do capítulo de Imunologia de

autoria de Stefani et al., livro de Hanseníase, Talhari et al. Comunicação pessoal.

1.6.3- Hanseníase e Células T Reguladoras

O balanço entre imunidade e tolerância é importante para manter a homeostase

imune. Muitos mecanismos são utilizados para manter a resposta imune sob controle,

como a anergia de linfócitos T, a apoptose e a ignorância imunológica. Um quarto

mecanismo de tolerância periférica é a supressão ativa por células reguladoras.

As Treg foram descritas primeiramente no início dos anos 70 (Gershon& Kondo

1970), mas como fatores supressores solúveis hipotéticos, que não puderam ser

NOD2

Reconhecimento - Vias Aéreas Superiores

Apresentação do an geno Órgãos Linfóides Secundários

M. leprae

Polo Tuberculóide

IL-4; IL-5IL-13

Polo Lepromatoso

I FN Ac I B

A vação de Formação de granuloma

espumososAusência de granuloma

Receptor de Manose

TLR2/6

TLR2/1

Receptor Scanvenger

PAMPs - LIPOPROTEÍNAS - GLICOLIPÌDEOS -

I FN Ac I B

IL-10

TH17

IL-17

DC

Fase Efetora Tecidos periféricos

LB

LB

LB

TNF-; INF-IL-1

34

identificados em nível molecular e marcadores celulares apropriados não eram

conhecidos, o conceito de célula T supressora permaneceu esquecido por um longo

tempo. A descoberta de Sakaguchi e seus colaboradores de que a transferência adotiva

de uma população de células T depletadas da molécula CD25+ induzia uma série de

doenças autoimunes órgão-específicas em recipientes imunodeficientes, colocou o

modelo de células T supressoras de novo no foco de imunologistas (Sakaguchi et al.

1995). As células T CD4+CD25+ reguladoras foram inicialmente descritas como

derivadas do timo, entretanto, descobertas recentes indicam que essas células também

podem ser geradas na periferia (revisado por Shevach & Davidson 2010).

As células Treg são uma subpopulação minoritária das células T, têm papel

essencial na regulação da tolerância imunológica, atuam prevenindo o dano tecidual por

inflamação e autoimunidade, pois são capazes de suprimir os efeitos deletérios das

respostas imunes contra auto ou não auto-antígenos (Hori & Sakaguchi 2004, Beissert et

al. 2006, Shevach & Davidson 2010, Kitagawa et al. 2013). Entretanto, para o

hospedeiro, a função supressora das células Treg pode ser tanto benéfica, quando atua

suprimindo a imunopatologia, ou pode ser maléfica quando suprime a resposta imune

protetora (Joosten & Ottenhoff 2008).

Muitos tipos de células T têm função imune reguladora, mas os dois

subconjuntos de células Treg mais importantes expressam o fator de transcrição Foxp3

e desenvolvem no timo ou podem ser induzidos em locais periféricos, incluindo o tecido

linfoide associado à mucosa (MALT). Embora a expressão de Foxp3 seja considerada

um marcador útil para essas subpopulações de células em camundongos, a expressão de

Foxp3 também pode ser induzida em células T humanas que não possuem a função de

células Treg (Shevach e Davidson, 2010).

As células Treg humanas naturais são CD4+ e expressam constitutivamente a

cadeia α do receptor para IL-2 (IL-2Ra-chain/CD25) e o fator de transcrição Foxp3

(forkhead box P3), apresentando o fenótipo CD4+CD25+Foxp3+. Há vários fenótipos de

células Treg, mas nem todos expressam atividade supressora. As Treg expressam

constitutivamente as moléculas CTLA-4, GITR e Foxp3, as células Th3 produtoras de

TGF-β, células Tr1 produtoras de citocinas anti-inflamatórias como IL-10 e TGF-βde

IL-10 e células T CD8+CD28-. O CTLA-4, uma molécula co-estimulatória capaz de

suprimir várias funções de células TCD4+ (Fontenot et al. 2003, Fontenot et al.

2005,Sakaguchi 2005, Sakaguchi et al. 2008, Sakaguchi et al. 2010, Shevach &

Davidson 2010, Pandiyan & Zheng 2011).

35

Células Treg Foxp3+ humanas funcionais ativadas, expressam um padrão único

de marcadores de superfície celular que podem facilitar o seu isolamento. Um tipo

importante de célula Treg segrega citocina imunossupressora, a interleucina-10 (IL-10),

e pode-se desenvolver a partir de células T CD4+ convencionais ativadas na presença de

IL-10 ou a partir de T helper 1 (Th1) ou subconjuntos de células Th2. Outras

subpopulações de células T, incluindo células T “natural killer” (NK), as células Tγδ e

células T CD8+ também podem exercer funções de potentes supressores em

determinadas configurações (Shevach e Davidson 2010).

O Foxp3 foi identificado como um marcador molecular específico para células

Treg e sua expressão é essencial para o desenvolvimento e a função dessa célula.

Camundongos deficientes de Foxp3 morrem com 3-4 semanas de vida, devido a uma

síndrome linfoproliferativa auto-imune fatal (“Scurfy”) e rápida. Além disso, esses

mesmos camundongos são incapazes de gerar Treg (Fontenot et al. 2003). Mutações no

gene Foxp3 interferem com o desenvolvimento de células Treg e causam desregulação

imune, a rara síndrome ligada ao X de poliendocrinopatia e enteropatia (IPEX). Outros

defeitos de gene simples resultando em função de células Treg reduzida incluem CD25,

transdutor de sinal e ativador da transcrição 5b, regulador auto-imune e síndrome da

proteína de Wiskott-Aldrich (O’Garra & Vieira 2003, Ochs et al. 2009).

As células Treg mantêm a tolerância periférica suprimindo a função das células

T autorreativas e têm sido alvo de investigações em diferentes doenças cutâneas como

lúpus eritematoso, doenças reumáticas, dermatite atópica, dermatite de contato,

psoríase, doença de enxerto versus hospedeiro, sarcoidose, leishmaniose, tuberculose e

câncer cutâneo (Chen et al. 2007, de Boer et al. 2007, Cruvinel et al. 2008, Chiacchio et

al 2009).

Em um estudo imuno-histoquímico, em peles normais e dermatoses (Psoríase

vulgar, micose fungoide e dermatites eczematosas), foram observados os seguintes

resultados: 1) na pele normal, as células epidérmicas e dérmicas Foxp3+ eram raras; 2)

na Psoríase vulgar, micose fungoide e nas dermatites eczematosas continham números

substanciais de CD3+ e Treg Foxp3+ na epidérmica e dérmica; 3) a epiderme continha

um percentual maior de células CD3+ e Treg Foxp3+ do que na derme; 4) a

percentagem de células Foxp3+ entre as CD3+ ou CD4+ foi significativamente menor

nas dermatites eczematosas do que na Psoríase vulgar e na Micose fungoide; 5) e o

número de células Foxp3+ dérmicas foi significativamente menor na Psoríase vulgar do

que nas dermatites eczematosas e na Micose fungoide (Fujimora et al. 2008).

36

Na hanseníase, estudos sobre a expressão de Treg são muito poucos e usando

desenhos e metodologias distintas (estudos “in situ” com imuno-histoquímica versus

estudos de citometria de fluxo em sangue periférico) mostraram resultados conflitantes.

A frequência de células Treg circulantes expressando Foxp3 foi avaliada por

citometria de fluxo em pacientes com hanseníase TT, BT, BB, BL e LL, em pacientes

com reação tipo 2 e em controles saudáveis. Níveis elevados de Treg foram encontrados

nos pacientes TT comparados com controles normais sugerindo papel benéfico no

controle bacilar na hanseníase. Não houve diferença de Treg entre as diferentes formas

de hanseníase e estas estavam aumentadas em pacientes com RT2 comparados com

controles normais (Attia et al. 2010).

Estudo recente com imuno-histoquímica mostrou a presença de células Foxp3+

no infiltrado granulomatoso sem diferença entre as formas TT, BT, BL e LL, com

aumento estatisticamente significativo na RT1, quandocomparada com a RT2 e em

pacientes sem reação (Massone et al. 2010).

Outro estudo recente avaliou a expressão de células T regulatórias na circulação

por citometria de fluxo e em lesões de pacientes com hanseníase, com imuno-

histoquímica e dupla marcação (CD25 e Foxp3+), bem como contatos domiciliares e

controles saudáveis. Uma maior proporção de Treg e IL-10 foi encontrada na circulação

de pacientes lepromatosos. Já a produção de IFN-γ e resposta linfoproliferativa foram

maiores entre os pacientes com hanseníase tuberculóide. Resultados similares foram

obtidos nas lesões de pele, com duas vezes mais células T regulatórias, IL-10 e CTLA-4

nas lesões de pacientes lepromatosos (Palermo et al. 2012).

Ainda recente, outro estudo de pacientes hansênicos menores de 15 anos e em

contatos foram avaliadas as frequências de células CD4+/CD8+ CD25high Foxp3+ e

CD4+/CD8+ CD25high Foxp3high. Células Mononucleares de sangue periférico

(“peripheral blood mononucleated cell”/PBMC) dos pacientes e contatos foram

cultivadas com anti-CD3 e anti-CD28 (ativadores) ou com ativadores associados com

sonicado total de fração do M. leprae. Após a cultura, a frequência de CD4+/CD8+ Treg

foi identificada por citometria de fluxo. Células dos pacientes multibacilares

estimuladas pelos ativadores e antígenos mostraram frequências de Treg quase duas

vezes mais que dos contatos e a intensidade de fluorescência média de Foxp3 nas Treg

foi maior em pacientes multibacilares, do que nos contatos (Fernandes et al, 2013).

Desta forma, os estudos realizados até o momento trazem resultados conflitantes

e não esclareceram em definitivo qual o papel das células Treg na hanseníase. As

37

células Treg podem ter papel benéfico controlando a resposta imune inflamatória que

destrói os nervos periféricos ou maléfico, suprimindo a resposta imune celular protetora

contra o M. leprae. Nos episódios reacionais, RT1 e RT2, a participação das Treg ainda

não foi motivo de estudo com o número significativo de pacientes, nem comparando as

Treg no momento do episódio e fora dele, em um mesmo paciente, motivo principal do

nosso estudo.

1.6.4- Hanseníase e Mastócitos.

Os mastócitos foram relatados primeiramente por Friedrich von Recklinghausen

(1833–1910) quando ele descreveu em 1863, a presença de células granuladas em

tecidos conjuntivos de várias espécies. Muitos anos depois, os mastócitos foram assim

denominados por Paul Ehrlich (1854–1915), em sua tese sobre a teoria e a práxis de

coloração histológica, publicada em 1878, onde descreveu as células com granulações

em tecidos conectivos que coravam com tinturas de anilina básicas (revisado por Blank

et al. 2013).

Os mastócitos são componentes fisiológicos da pele e mucosas, e estão presentes

no tecido conjuntivo em torno dos vasos sanguíneos, subepiteliais, estruturas linfáticas,

anexos da pele e nervos. São caracterizadas pela presença de inúmeros grânulos

citoplasmáticos contendo potentes mediadores farmacológicos. Estes originam-sw a

partir de células pluripotentes da medula óssea, que expressam CD34+/CD117+e um

receptor tirosina quinase (c-kit) específico para o ligante c-kit, e se diferenciam

emcélulas maduras pela influência do fator de células fonte (SCF) e outras citocinas

localmente produzidas comointerleucina-3 (IL-3), IL-4, IL-9 e IL-10,expressam o

fenótipo final, ou seja, mastócitos detecido conjuntivo (MCTC) ou de mucosa (MCT)

(Metcalfe et al. 1997, Metcalfe 2008, Blank et al. 2013, revisado por Silver & Curley

2013).Ao ocorrer essa interação, promove-se o crescimento e a diferenciação dos

mastócitos, que migram e maturam na pele e nas mucosas; estes são células

heterogêneas quanto à morfologia, bioquímica e função (revisado por Malufet al. 2009,

Abbas et al. 2012b, revisado por Silver & Curley 2013).

Em humanos, a heterogeneidade dos mastócitos é baseada em dois subtipos,

classificados pelas serina proteinases estocadas em seus grânulos citoplasmáticos:

mastócitos que contêm triptase/quimase (MCTC), que estão presentes

predominantemente na derme, vasos sanguíneos e submucosa intestinal, ou aqueles que

contêm somente triptase (MCT) e encontram-se predominantemente em paredes

38

alveolares e na mucosa do intestino delgado (MCCT) (Payne & Kam 2006, Metcalfe et

al. 1997, Metcalfe 2008, Abbas et al. 2012b, revisado por Silver & Curley 2013).

Osmastócitos contêm potentes mediadores bioativos pré-estocados em seus

grânuloscitoplasmáticos, tais como histamina, heparina, triptase e quimase, capazes de

potencializara migração e a proliferação celular, induzir a expressão de moléculas de

adesão nas célulasendoteliais e, consequentemente, ativar o processo de angiogênese e

proliferação celular (Amon et al. 1994, Abbas et al. 2012b, Metcalfe et al. 1997).

Os grânulos dos mastócitos coram metacromaticamente em róseo-avermelhado

com o Azul de Toluidina (AT), corante básico ou catiônico, devido aos seus

componentes pré-formados proteoglicans, heparina e sulfato de condroitina B, que são

ácidos e se ligam ao Azul de Toluidina (revisado por Sridharan & Shankar 2012,

revisado por Chatura & Sangeetha 2012). A metacromasia depende da polimerização do

AT, proporcionado pela presença da heparina, que o atrai por meio das forças de van

der Waals. O Azul de Toluidina na sua forma monomérica é ortocromático, azul,

enquanto na sua forma polimérica é metacromático, ou seja, vermelho/púrpura (Kumar

& Kiernan 2010, Silva et al. 2011, revisado por Sridharan & Shankar 2012). As

proteases, triptase e quimase, componentes dos grânulos, são específicas dos

mastócitos, são demonstradas por métodos imuno-histoquímicos, por meio de

anticorpos específicos (revisado por Magalhães et al. 2008).

Os mastócitos participam das complexas respostas imunes cutâneas, inatas e

adaptativas, principalmente nas reações de hipersensibilidade imediata, resposta Th2,

juntamente com a imunoglobulina E (IgE) e contribuem também nas reações de

hipersensibilidade tardia, resposta Th1 (Abbas et al. 2012b, Metcalfe 2008). A ativação

dos mastócitos através dos receptores de alta afinidade da IgE, FcεRI, leva a

desgranulação parcial, com liberação de produtos pré-formados, como a histamina,

proteoglicans (heparina e sulfato de condroitina B), serotoninas e proteases (triptase e

quimase), entre outras, e produção de mediadores lipídicos (prostaglandina D2 e

leucotrienos), tromboxanas, citocinas e quimiocinas, e outros, com atividade pró-

inflamatórias, que potencializam os efeitos dos já liberados, prolongando sua ação no

tecido (Figura 8) (Metcalfe 2008, Abbas et al. 2012b). Os mastócitos são também

produtores de substâncias mediadoras anti-inflamatórias, como a anexina, e outras

destrutivas e nocivas aos nossos tecidos, com as enzimas proteases, quimase e triptase

(Oliani et al. 2000, Oliani & Gil 2006).

39

Figura 8. Eventos de transdução de sinal na ativação dos mastócitos,iniciados pelo Kit

e FcεRI levando a respostas específicas do mastócito e a integração destas vias ao

reforço sinérgica de liberação dos mediadores do mastócito. Fonte: Metcalfe 2008.

Mast cells and mastocytosis. Blood 112.

Estudos prévios sobre o papel dos mastócitos na hanseníase e nas reações

hansênicas apresentam resultados diversos e contraditórios. A variação em diferentes

estudos pode ser devido a diferentes critérios usados para seleção dos casos e diferentes

números de casos de cada forma clínica. Vários fatores também influenciam o

diagnóstico histopatológico, tais como, as diferenças em tamanho dos espécimes,

escolha do sítio da biópsia, idade da lesão, status imunológico e tratamento do paciente

no tempo da biópsia (revisado por Chatura & Sangeetha 2012). Estas discrepâncias

devem ser explicadas em partepelos métodos de colorações adotados, anticorpo anti-

triptase ou anti-quimase usados, e pela de quantificação dos mastócitos (manual,

automatizada, análise assistida por computador, etc). Magalhães afirma: “em nossa

experiência, a imunomarcação histoquímica de mastócitos é a ferramenta mais eficaz

para a identificação do que qualquer outro método clássico” (Magalhães et al. 2008).

Em estudo de hanseníase tuberculóide reacional, os autores encontraram um

número significativamente menor de mastócitos do que nos casos não reacionais, com

40

0,9 mastócitos por campo, ou seja, pelo menos 40% menos que nos não reacionais

(média 1,4 mastócitos por campo), sendo a grande maioria eram desgranulados

(Chowdhury e Gjosh 1968).

Uma estreita associação de BAAR com os mastócitos, os quais acumulam ao

redor do BAAR ou onde estão as estruturas da pele, afetadas na hanseníase, isto é,

nervos, vasos sanguíneos, músculos, folículos pilosos e elementos glandulares indicam

similar distribuição de ambos (Kumar & Vaidya 1982).

Outro estudo, os autores não encontram nenhuma diferença na quantidade de

mastócitos em pele da borda e na pele não afetada do centro da lesão, sendo que os

mastócitos estão mais presentes dentro dos granulomas do que na derme interveniente,

sendo comparáveis aos encontrados em torno de anexos. Mastócitos de qualquer área do

corpo mostravam o mesmo número de mastócitos, mostrando ser independente do sítio

da lesão, ou seja, é sistemicamente determinado (Cree et al. 1990).

O predomínio de mastócito no polo LL pode estar ligado ao aumento da

vascularização e alterações observadas nas células endoteliais, as quais são mais

evidentes na LL. Mas no polo TT, mastócitos não parecem permanecer tanto tempo

como na LL (Aroni et al. 1993).

Outro estudo, quantidade de mastócitos em número mais elevado foi observado

na MHI (p<0,01) e significativamente em menor quantidade no polo TT do que no LL

(p<0,01). A LL também mostrou aumento de mastócitos desgranulados e morfologia

alterada. Relata ainda que, os mastócitos estão presentes em pequeno número nas

biópsias de pele de controles saudáveis (Mysorekar et al. 2001).

Estudo avaliando subtipos de mastócitos e neuropeptídeos, nas reações

hansênicas, mostrou que o número total de mastócitos e o número relativo de mastócitos

triptase-positivos foi signifivativamente maior no interior do infiltrado inflamatório do

que na derme normal, não ocupada pelo infiltrado, pois segundo os autores este

aumento pode estar relacionado com a deflagração do processo reacional (Antunes et al.

2003)

Quantificação de mastócitos usando AT foi normal na MHI e TT e mostrou um

aumento da densidade ao longo do espectro imunológico a BT para LL, com valores em

LL 32,86/mm2, e em pele normal a densidade média foi de 11,43/mm2 (Bagwan et al.

2004).

41

Em 70 casos de TT corados pelo AT, a densidade média foi de 26,6 mm2 fora do

granuloma e 15,1 mm2 dentro do granuloma. A diferença foi estatisticamente

significante, com p<0,0001 (Pilli et al. 2005).

Outro estudo de mastócitos e colagenização epineural os autores demonstraram

que mastócitos, por meio da triptase, induz a fibrogênese, por ser um fator mitogênico

para fibroblastos, levando a fibrose epineural e sequelas (Montagna et al. 2005)

Em 51 biópsias de peles, de casos de pacientes com hanseníase, na imuno-

histoquímica, com imunomarcação por Ac anti-triptase, os casos de LL mostraram

menores densidades de mastócitos nas dermes. As densidades maiores foram nos casos

BT e BB, sendo considerada uma evidência indireta do papel dos mastócitos na ativação

da resposta imune para o M. leprae (Magalhães et al. 2008).

Estudo onde os autores observaram mastócitos na coloração de Fite-Faraco, no

espectro hansênico, encontraram uma densidade baixa de mastócitos no polo TT

comparado com o LL, sendo as quantificações mais altas nas formas borderlines.

Afirmam que provavelmente uma redução dos mastócitos ocorre quando as lesões

evoluem para o polo TT, com mudanças no perfil das citocinas. Extensiva

desgranulação por causa do aumento da atividade funcional pode ser a causa de baixos

valores em LL. Provavelmente por causa destas duas razões a quantificação de

mastócitos diminui, quando move-se de BB para ambos os polos. Os autores referem

ainda números de mastócitos em todos os subtipos de hanseníasemenores dos que os

citados na literatura, provavelmente em função do método de coloração. A tendência

dos mastócitos diminuírem da forma LL para a TT foi observada neste estudo. As

formas reacionais RT1, em BT e BL não tinham mastócitos, mas nos casos de BL com

RT2 tinha contagem de mastócitos de 6,58/mm2 (Chatura & Sangeetha 2012).

Outro estudo de 60 casos de lesões não neoplásicas de biópsias de peles,

incluindo casos de hanseníase, coradas pelo AT, foi observado aumento do número de

mastócitos quando os casos Indeterminados evoluem para um dos polos, T ou L (Naik

etal. 2003).

Mastócitos foram encontradas e eram mais numerosos na pele aparentemente

normal de pacientes que tinham também lesões da hanseníase, bem como entre o grupo

indeterminado. A ausência de mastócitos foi conspícua em LL (16,7%), em BB

(41,7%), BT (40,9%) e TT (68,0%), nos casos estudados. Isto sugere que os mastócitos

devem ter um papel nos estágios iniciais da doença e proliferação do tecido conjuntivo

pós-reacional (Rav et al. 1990).

42

A resposta imune contra infecções deve representar um equilíbrio complexo

entre as respostas pró-inflamatórias contra o patógeno e as respostas anti-inflamatórias

necessárias para limitar o dano tissular do hospedeiro. A hanseníase é caracterizada por

um amplo espectro de lesões distintas, que refletem a resposta imune do paciente contra

o M. leprae, e estas lesões podem sofrer alterações durante os episódios reacionais.

Vários aspectos da imunopatogênese das reações hansênicas permanecem

desconhecidos. Na hanseníase as lesões de pele contem muitos, senão todos os tipos

celulares que ocorrem na pele não acometida pela doença, além dos componentes

celulares do sangue periférico que migram para lesão granulomatosa. Neste contexto, é

necessário investigar mais na hanseníase e nos episódios reacionais duas populações

celulares, mastócitos, com características pró-inflamatórias importantes, e as células T

regulatórias (Treg), conhecidas pela sua ação imunossupressora. Alguns trabalhos têm

mostrado que mastócitos e células Treg podem se juntar para efetuarem uma boa

resposta imunológica (Lu et al. 2006). Análise de células Treg in vitro mostrou que

estas células produzem grandes quantidades de IL-9, fator de crescimento de mastócitos

(Leavy 2006).

1.7- Classificaçãode Ridley-Jopling e a classificação operacional (OMS/MS-Brasil)

A classificação clínica, imunológica e histopatológica proposta por Ridley &

Jopling (1966) é considerada o método mais completo e criterioso de categorização das

diferentes formas de hanseníase. Segundo Ridley e Jopling, a hanseníase pode ser

classificada de acordo com suas características clínicas, imunológicas e histopatológicas

em um espectro, variando de um polo imunologicamenre mais resistente, a hanseníase

tuberculoide (TT), ao polo mais susceptível, a hanseníase lepromatosa (LL), com

formas intermediárias: BT (borderline-tuberculoide), BB (borderline-borderline) e BL

(borderline-lepromatosa) (Ridley & Jopling 1966, revisado por Scollard et al. 2006).

Apesar disto, é utilizada uma classificação operacional simplificada para fins de

tratamento dos pacientes nos serviços de rotina, recomendada pela OMS e pelo

Ministério da Saúde do Brasil, ficando a classificação de Ridley e Jopling mais aplicada

nas pesquisas (WHO 1988b, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). Esta classificação

operacional, visando definir o esquema detratamento com a MDT, é baseada no número

de lesões cutâneas, de acordo com osseguintes critérios: paucibacilar são casos com até

cinco lesões de pele e multibacilar casos com mais de cinco lesões de pele. A

43

baciloscopia de pele (raspado intradérmico), sempre que disponível, deve ser

utilizadacomo exame complementar para a classificação dos casos como PB ou MB. A

baciloscopia positiva classifica o caso como MB, independentemente do número

delesões (WHO 1998b, Walker & Lockwood 2006, Brasil/Ministério da Saúde/SVS

2009, Brasil/Ministério da Saúde 2010a).

Na classificação de Ridley e Jopling (1966), a caracterização das formas é feita

conforme descrito abaixo:

Hanseníase Tuberculoide: é a forma mais localizada que se manifesta em

pessoas com resposta imune celular exacerbada ao bacilo. Os pacientes com hanseníase

TT apresentam uma única lesão ou poucas lesões, habitualmente menores que 10

centímetros, geralmente eritematosas, de limite bem definido. Podem ocorrer alterações

nos nervos próximos à lesão causando dor, fraqueza e atrofia muscular. Também

podem ser observados distúrbios de sensibilidade. As lesões TT apresentam bordas

elevadas, ásperas, sem pelos e demonstram centro com sinais de regressão ou cura. A

superfície da lesão é seca devido à deficiência da sudorese. A perda de sensibilidade e

bordas bem definidas das lesões são sinais característicos da forma tuberculoide da

hanseníase. A baciloscopia é negativa, forma provavelmente não contagiosa. Sob o

ponto de vista histopatológico ocorre a formação de granuloma tuberculoide,

constituído por um agregado de múltiplas células fagocitárias mononucleares com

diferenciação epitelioide bem evidente e participação de células gigantes multinucleadas

tipo Langhans no centro da lesão e presença de linfócitos contornando este granuloma.

Os granulomas são bem desenvolvidos e compactos e estendem-se desde a derme

profunda até a camada papilar, podendo inclusive atingir a camada basal da epiderme

(Ridley & Jopling 1966, Ridley 1974, Ridley 1977, Guinto et al. 1986, Job & Chandi

2001, revisado por Fleury 2006, revisado por Scollard et al. 2006, Lyon-Moura &

Pedrosa 2013).

Hanseníase borderline-tuberculoide: manifesta-se por poucas lesões cutâneas,

geralmente até cinco, eritematosas bem definidas e delimitadas. Esta forma geralmente

apresenta um número maior de troncos nervosos acometidos e de lesões que a forma

TT. A baciloscopia do esfregaço de raspado intradérmico/linga é negativa.

Histopatologicamente, a forma BT apresenta lesões com granulomas mais frouxos que

podem mostrar raros bacilos e granulomas formados por linfócitos e células

epitelioides, geralmente localizadas na derme com presença de células gigantes tipo

Langhans (Ridley & Jopling 1966, Ridley 1974, Ridley 1977, Guinto et al. 1986, Job &

44

Chandi 2001, revisado por Fleury 2006, revisado por Scollard et al. 2006, Lyon-Moura

& Pedrosa 2013).

Hanseníase borderline-borderline: manifestação intermediária entre as formas

tuberculoide e lepromatosa. Clinicamente a hanseníase BB pode se manifestar por

poucas lesões amplas, sem limites precisos, elevadas e porosas. Em casos mais raros, a

forma BB pode se manifestar por múltiplas lesões (mais de 5) bem delimitadas de borda

eritematosa elevada e centro hipocrômico. A baciloscopia é positiva. Ao exame

histopatológico são observados bacilos, com células epitelioides difusamente

espalhadas, assim como granulomas tuberculoides, porém as células gigantes e

linfócitos em geral são escassos e pode se observar edema intra e intercelular. Pode ser

observada a faixa de Unna, que é uma faixa de fibras colágenas correspondente à derme

papilar retificada, livre de células inflamatórias. (Ridley & Jopling 1966, Ridley 1974,

Ridley 1977, Guinto et al. 1986, Job & Chandi 2001, revisado por Fleury 2006, revisado

por Scollard et al. 2006, Lyon-Moura & Pedrosa 2013).

Hanseníase borderline-lepromatosa: o paciente apresenta entre 5 a 10 lesões de

pele mal delimitadas. As lesões podem se manifestar como pápulas, tubérculos,

nódulos, placas, ulcerações e infiltração. Pacientes com a forma BL apresentam

baciloscopia do esfregaço de raspado intradérmico/linfa positiva. Ao exame

histopatológico a forma BL apresenta agrupamentos de macrófagos não ativados, que

contêm grande número de bacilos em seu interior. Há raros linfócitos nas proximidades

dos agrupamentos de macrófagos. Sempre ocorre a observação da faixa de Unna

(Ridley & Jopling 1966, Ridley 1974, Ridley 1977, Guinto et al. 1986, Job & Chandi

2001, revisado por Fleury 2006, revisado por Scollard et al. 2006, Lyon-Moura &

Pedrosa 2013).

Hanseníase lepromatosa (LL): é considerada o polo anérgico da doença, na qual

a RIC específica ao M. leprae encontra-se ausente e o bacilo se multiplica levando a um

quadro disseminado. Pode haver um polimorfismo de lesões com pápulas, tubérculos,

nódulos, placas, ulcerações e infiltração difusa da pele e as lesões têm limites

imprecisos. Esta forma pode estar associada à atrofia muscular, inchaço das pernas e

lesões na pele. Órgãos internos também podem ser acometidos pela doença. Nesta

forma os pacientes apresentam mais de 10 (dez) lesões de pele. Máculas com bordas

pouco definidas aparecem numa fase inicial da forma lepromatosa e são geralmente

pequenas e numerosas. Lesões infiltradas surgem numa fase mais tardia e o infiltrado

45

inflamatório pode originar nódulos. Os nódulos aparecem geralmente nas orelhas, face,

extremidades, articulações e, raramente, nas genitálias. Alguns pacientes não passam

pela fase de máculas e os primeiros sinais notórios de hanseníase podem ser os nódulos,

mais comuns nas orelhas. Na histopatologia mostra um infiltrado inflamatório celular

composto de histiócitos multivacuolados, com o citoplasma carregado de bacilos e

grandes quantidades de lipídios, conferindo o aspecto de células espumosas. Há raros ou

nenhum linfócito nas proximidades dos grupamentos de macrófagos infectados. O

infiltrado inflamatório não atinge a camada basal da epiderme, ficando separado dela

pela faixa de Unna (Ridley & Jopling 1966, Ridley 1974, Ridley 1977, Guinto et al.

1986, Job & Chandi 2001, revisado por Fleury 2006, revisado por Scollard et al. 2006,

Lyon-Moura & Pedrosa 2013). Um artigo recente descreve achado inusitado com

aumento significativo de basófilos nas lesões da forma LL (Otsuka et al. 2012)

A figura 9 (Scollard et al. 2006) ilustra as formas as 5 (cinco) formas clínicas,

conforme a classificação esepctral de Ridley e Jopling.

Figura 9. Espectro imunopatológico da hanseníase segundo Ridley-Jopling.

46

Histopatologia das diferentes formas histopatológicas da hanseníase na classificação

de Ridley-Jopling, em secções coradas pela HE (painel superior) e Fite-Faraco (painel

inferior). As infiltrações granulomatosas epitelioides bemformadas vistas em lesões

polarestuberculoide (TT) tornam-se cada vez mais desorganizadas em direção ao polo

lepromatoso (LL), onde são agregados de histiócitos espumosos completamente

desorganizados, com apenas ocasionais linfócitos. Fonte: Scollard et al. 2006. The

continuing challenges of leprosy. Clin Microbiol Rev.

1.8- Hanseníase e Genética

Antes da descoberta do bacilo por Hansen em 1874, a hanseníase foi

amplamente considerada como uma doença hereditária (revisado por Scollard et al.

2006).Ao longo das últimas décadas, a hanseníase vem sendo estudada por perspectiva

talvez inesperada para uma doença infecciosa: modernos métodos de análise

experimental têm sido empregados para evidenciar a importância do componente

genético no controle da susceptibilidade do hospedeiro à hanseníase e seus fenótipos. A

variabilidade genômica do M. leprae é mínima, e para as diferentes manifestações

clínicas e a transmissibilidade tão baixa da doença, só fatores genéticos podem explicar

tal diversidade.

Esses estudos indicam que constituição genética favorável do hospedeiro,

somada a fatores propícios, ambientais e relativos ao agente patogênico, tem alto

impacto na definição da susceptibilidade tanto à infecção propriamente dita quanto na

evolução clínica da doença. Hoje, diversos genes e regiões genômicas já foram

relacionados ao controle da susceptibilidade à hanseníase. Outros estudos estão em

andamento, visando ao avanço no entendimento das bases moleculares de controle da

susceptibilidade do hospedeiro à doença. O conjunto de resultados desses estudos pode

levar a formas mais eficazes de diagnóstico, tratamento e prevenção da hanseníase e

outras doenças infecciosas. Todas as doenças comuns, pelo menos em parte, são

genéticas. Rotberg, dermatologista brasileiro e estudioso da hanseníase, em 1937

sugeriu a possibilidade de ter um fator genético na susceptibilidade à doença,

denominado Fator N, desconhecido (Prevedello & Mira 2007).

1.8.1- Predisposição genética e resposta imune inata para a hanseníase

A maioria das pessoas que viveem áreas endêmicas da hanseníase já esteve

exposta ao M. leprae, mas, apenas algumas delas desenvolvem a doença (0,1 a

47

1%)(revisado por Moraes et al. 2006). Por isso, a influência de fatores genéticos na

resistência ou susceptibilidade à doença vem sendo investigada. Alguns autores

sugeriram que pelo menos 2 diferentes genes deveriam controlar a resposta imune à

hanseníase, atuando na susceptibilidade e na forma clínica da doença (de Vries et al.

1976, revisado por Scollard et al. 2006).

A susceptibilidade à hanseníase é também influenciada por características

ambientais, como o estado nutricional do hospedeiro, pelas taxas de exposição ao M.

leprae e de vacinação com BCG. As taxas de proteção com a BCG são altamente

variáveis entre as diferentes populações (Rodrigues 1992, Lockwood 2001, revisado por

Moraes et al. 2006, Setia et al. 2006). Estudos em gemelares na Índia demonstraram que

a doença é mais freqüente entre os monozigóticos do que nos dizigóticos tanto para a

doença propriamente dita como para suas formas clínicas (revisado Prevedello & Mira

2007).

A escolha dos genes candidatos para estudo genético não é tarefa fácil, uma vez

que o genoma humano possui cerca de 30 a 40 mil genes. A seleção pode ser ao acaso,

partindo de hipóteses (teste de hipótese) por estudos de associação ou caso-controle.

Esta escolha geralmente é baseada em três critérios: possível papel do gene/produto na

patogênese da doença; localização do gene em região genômica previamente

identificada estar envolvida no controle da doença, ou a combinação das duas (revisado

por Moraes et al. 2006, revisado por Prevedello & Mira, 2007).

Um dos mais extraordinários avanços no entendimento da hanseníase foi a

identificação por Mira e colegas de um locus dentro do gene PARK2 / PACRG que está

associado a susceptibilidade geral das populações humanas aoM. Leprae (Scollard et al.

2006). A análise de desequilíbrio de ligação da região candidata mostrou que 15 dos 17

SNPs associados estavam localizados em um único bloco, cobrindo a região reguladora

compartilhada por dois genes: o gene do parkinsonismo juvenil autossômico recessivo

(AR-JP), denominado Parquina (PARK2) e o gene PACRG (gene co-regulado com

parquina). Uma análise de regressão logística multivariada detectou dois SNPs que

capturavam completamente a informação de associação observada na região. Haplótipos

definidos por estes dois tag SNPs estavam associados com aumento de até 5,28 vezes do

risco de contrair hanseníase (Mira et al. 2003; Mira et al. 2004).

A proteína SLC11A1 (solute Carrier family 11, member 1), também conhecida

como NRAMP1 (natural resistance-associated macrophage protein-1), está localizada

na região 2q35 e tem papel no transporte de íons. O NRAMP foi descrito como o gene

48

envolvido na resistência/susceptibilidade a patógenos intracelulares em camundongos.

Estudo realizado em famílias relatou ligação entre NRAMP1 e múltiplos casos de

hanseníase (revisado por Mira 2006, revisado por Moraes et al. 2006, revisado por

Scollard et al. 2006, revisado por Prevedello & Mira, 2007, revisado por Fava et al.

2012).

1.8.2- Predisposição genética e resposta imuneadquirida para a hanseníase

Os principais genes relacionados à resposta imune investigados quanto à

susceptibilidade à hanseníase foram os genes do sistema de antígenos leucocitários

humanos (“Human Leucocyte Antigens”/HLA) e também genes que codificam

importantes citocinas e que estão localizados fora do complexo HLA como TNFα, LTα,

IL-10, IL-12/23. O complexo HLA é um conjunto de genes localizado no braço curto do

cromossomo 6 região 6p21. Em geral, várias dessesestudos de sorotipagem sugeriram

uma associação de HLA-DR2 e HLA-DR3 com hanseníase tuberculóide

(paucibacilares) ou como sendo fatores de risco importantes na susceptibilidade a

formas da hanseníase. Embora alguns estudos indicaram que uma associação de HLA-

DR2 com hanseníase tuberculoide e virchowiana, nenhuma evidência convincente

demonstrou uma associação da resposta virchowiana com qualquer outros loci HLA-

D(revisado por Mira 2006, revisado por Moraes et al. 2006, revisado por Scollard et al.

2006, revisado por Prevedello & Mira, 2007, Visentainer et al. 1997).

Em estudo genômico entre indianos com predomínio da forma paucibacilar da

hanseníase, encontrou-se associação da região cromossômica 10p13 com

susceptibilidade à forma paucibacilar da doença (Siddiqui et al. 2001). Esse achado foi

replicado através de estudo genômico realizado com população vietnamita. Este

mostrou associação da região 6q25-q27 com susceptibilidade à hanseníase (Mira et al.

2003).

O transportador associado de processamento do antígeno (TAP) é uma proteína

composta de dois polipeptídeos, TAP1 e TAP2. Seus respectivos genes, localizados no

cromossomo 6p21, dentro da região MHC classe II, entre HLA-DP e HLA-DQ.

Funcionalmente, as proteínas TAP transportam peptídeos para o retículo

endoplasmático em células apresentadoras de antígeno, onde eles são unidos ao MHC

classe I para apresentação de antígenos. O gene TAP2 tem sido associado com a

hanseníase tuberculoide, mas este gene situa-se tão perto de outros genes HLA, que

interpretação dos resultados tem sido difícil e a importância deste achado é incerta e

49

espera por estudos mais detalhados (revisado por Mira et al. 2006, revisado por Moraes

et al. 2006, revisado por Scollard et al. 2006).

Os genes do TNF estão localizados na região cromossômica da classe III do

complexo MHC, região 6p21.3. O TNF-α é o gene que codifica o fator de necrose

tumoral alfa, uma citocina pró-inflamatória que participa de vários processos biológicos,

como a modulação da resposta imune, tanto inata quanto adaptativa. O TNF-α está

envolvido na formação do granuloma, com controle da infecção por micobactéria e atua

impedindo sua disseminação. Polimorfismo no gene TNF-α está associado tanto com

susceptibilidade, quanto à resistência à hanseníase em populações de etnias distintas

(revisado por Mira 2006, revisado por Moraes et al. 2006, revisado por Scollard et al.

2006).

O gene LTA codifica a linfotoxina alfa, que é uma citocina importante na

modulação da resposta inflamatória, está localizado na região III do complexo MHC.

Estudos encontraram forte evidência de associação entre alelos do gene LTA e

susceptibilidade à hanseníase per se em populações do Vietnã do Sul (revisado por Mira

2006, revisado por Moraes et al. 2006, revisado por Prevedello & Mira 2007).

Estudos recentes mostram a influência de fatores genéticos no desencadeamento

de reações hansênicas, quanto a presença de marcadores tipo SNPs no gene TLR1 em

pacientes no Nepal, revelou que a presença do alelo 1805G estava associada à proteção

contra a reação tipo 1 (revisado por Scollard et al. 2006, revisado por Fava et al. 2012).

Um estudo de polimorfismo tipo microssatélite no gene TLR2 com utilização de

metodologia de caso-controle em pacientes na Etiópia, encontrou associação entre a

presença de homozigose para a extensão alélica de 280pb e um risco aumentado de

reação tipo 1 e o alelo -597T como protetor. Estes dados sugerem um papel significativo

para TLR2 na ocorrência da reação de reversão (Bochud et al. 2008).

O gene VDR (receptor de vitamina D) está localizado no 12q12-q14 e é

responsável pelos efeitos biológicos da vitamina D. A forma ativa da vitamina D induz

a diferenciação de monócitos, enquanto a ativação macrofágica através do VDR, em

combinação com TNFα e IFNγ, é responsável pela destruição do M. tuberculosis

(Montoya et al. 2009). Em estudo feito na população indiana encontrou-se associação

entre o gene VDR e a hanseníase e detectou-se a susceptibilidade à forma LL e TT na

presença dos genótipos TT e tt respectivamente (revisado por Moraes et al. 2006,

revisado por Prevedello & Mira, 2007, revisado por Fava et al. 2012). Um estudo caso-

controle de gene candidato a susceptibilidade da lepra, com trinta e oito sítios

50

polimórficos de 13 genes foram investigados pelo seu papel na susceptibilidade a

hanseníase comparando 270 casos com 452 controles no distrito de Karonga, norte do

Malawi. Homozigotos para a variável T→C silenciosa no códon 352 do gene do

receptor da vitamina D pareciam ser de alto risco, enquanto os homozigotos para o

grupo de sangue b McCoy definindo a variante K1590E no gene exon 29 do receptor do

complemento 1 (anteriormente CD35) parecia ser protetor (Fitness et al. 2004). O

polimorfismo de VDR não está associado a fenótipos da hanseníase (Sapkota et al.

2010).

Estudo por genotipagem de associação de dois estágios de doenças, testou três

conjuntos de replicação independente para uma associação entre a presença da

hanseníase e 93 polimorfismos de nucleotídeos simples, que foram mais fortemente

associados com a doença no estudo de associação e testes de heterogeneidade das

associações (ou falta dela), estratificadas de acordo com o subtipo clínico (multibacilar

vs paucibacilares). Observou-se uma associação significativa entre SNPs nos genes

CCDC122, C13orf31, NOD2, TNFSF15, HLA-DR e RIPK2 e uma tendência para uma

associação com um SNP no LRRK2. As associações entre os SNPs em C13orf31,

LRRK2, NOD2 e RIPK2 e hanseníase multibacilar foram mais fortes do que as

associações entre esses SNPs e hanseníase paucibacilar. Variantes de genes da via de

sinalização mediada por NOD2 (que regula a resposta imune inata) estão associadas

com susceptibilidade à infecção por M. leprae (Zhang et al. 2009, revisado por Fava et

al. 2012)

Devido à importância da resposta imune na hanseníase e, sobretudo, no

desencadeamento das reações hansênicas, os genes candidatos mais estudados têm sido

os genes das citocinas e de outras moléculas marcadoras importantes no contexto

imunológico (Moraes et al, 2006). Presença de polimorfismos tipo SNPs em diferentes

genes que codificam para citocinas têm sido descritos e associados com doenças. Os

episódios reacionais são a principal causa de incapacidade física permanente associada

com hanseníase e representam um grande desafio no manejo clínico dos pacientes.

Dado o impacto que a etnia tem sobre o risco de desenvolver episódios reacionais,

fatores genéticos do hospedeiro que podem contribuir para os episódios reacionaistêm

sido descritos. Polimorfismos em sete genes [receptores do tipo Toll (TLR)1, TLR2,

domínio de oligomerização de ligação de nucleotídeos contendo 2 (nucleotide-binding

oligomerisation domain containing 2), receptor de vitamina D, proteína 1de macrófagos

51

associada à resistência natural, C4B e interleucina-6] foram associados com episódios

reacionais (revisado por Fava et al. 2012).

Estudos de uma coorte de 409 pacientes com hanseníase do Brasil central,

monitorados para RT1 e RT2, mostraramevidências de associação entre RT2 e IL-6

rs2069832 de polimorfismos de nucleotídeo único tag, rs2069840, e rs2069845, com

informações sobre o locus inteiro de IL-6, bem como funcional rs1800795 variante do

IL-6. Além disso, os níveis plasmáticos de IL-6, em pacientes com RT2,

correlacionaram com genótipos de IL-6. Nenhuma associação foi encontrada entre as

variantes de IL-6 e T1R (Sousa et al. 2012, revisado por Fava et al. 2012).

1.9- O diagnóstico da hanseníase

O diagnóstico da hanseníase ainda é baseado na identificação de sinais clínicos

dermato-neurológicos da doença, mas testes laboratoriais como o exame histopatológico

da lesão e a baciloscopia podem auxiliar no diagnóstico da hanseníase (Ridley &

Jopling 1966, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). A definição de caso de hanseníase é

uma pessoa com sinais cardinais (clínicos) da doença e que não foi submetida ao

tratamento específico ou que requer tratamento quimioterápico. Os sinais cardinais são:

diminuição da sensibilidade em área ou lesão cutânea; espessamento neural periférico

e/ou presença de BAAR em pele, baciloscopia positiva (WHO 1988a, Brasil/Ministério

da Saúde 2002, Brasil/Ministério da Saúde 2010a).

A classificação espectral de Ridley e Jopling é importante para o melhor

entendimento da doença e para seu tratamento adequado, mas não é utilizada em centros

de saúde, que adotam os critérios simplificados da OMS e MS/Brasil, classificando os

pacientes em paucibacilares e multibacilares, simplesmente pelo número de lesões. Tal

simplificação é inaceitável para os Centros de Referência em assistência, ensino e

pesquisa em hanseníase, de modo que é recomendada a padronização pela classificação

de Ridley-Jopling. Devido ao potencial dano neural, com risco de incapacidades, e o

estigma da hanseníase, a correta classificação histopatológica é mandatória para

permitir ao médico uma compreensão do espectro da doença e seu prognóstico,

favorecendo assim uma conduta terapêutica adequada e o acompanhamento do paciente

(Ridley & Jopling 1966, Costa et al, 2001, Scollard 2004, Pardillo et al. 2007, Teixeira

et al. 2008, Brasil/Ministério da Saúde 2010a).

Onde estiver disponível é recomendável a complementação diagnóstica com

outros métodos, como: a baciloscopia, a biópsia da lesão cutânea com estudo

52

histopatológico, sorologia, entre outros (Teixeira et al. 2008, Brasil/Ministério da Saúde

2010a).

1.9.1- Baciloscopia

A baciloscopia é o exame complementar mais importante e específico na

hanseníase para identificar o agente causal, porém, é negativo nas formas paucibacilares

e em alguns pacientes multibacilares, necessitando, ainda, para sua execução de

infraestrutura laboratorial e de profissionais capacitados, inexistentes na maioria dos

serviços de atenção básica (Lyon et al. 2008).

É o exame microscópico onde se pesquisa BAAR nos esfregaços de raspados

intradérmicos das lesões suspeitas de hanseníase, lóbulos auriculares e/ou cotovelos,

corados pela técnica de Ziehl-Neelsen (Ridley 1955, Ridley & Jopling 1966, Leiker &

McDougall 1987, Jacobson & Krahenbuhl 1999, Brasil/Ministério da Saúde 2002,

Brasil/Ministério da Saúde 2010a, Brasil/Ministério da Saúde 2010b). A pesquisa de

BAAR em muco nasal foi proscrita pela OMS, pois pode gerar falsos positivos e

negativos. A carga bacilar é expressa como um índice baciloscópico (IB) que relata o

número de bacilos por campo microscópico em escala logarítmica (revisado por Leiker

& McDougall 1987, Ponnighaus et al. 1987, Brasil/Ministério da Saúde, 2010b). A

baciloscopia é geralmente negativa nas formas tuberculoides, positiva nas formas

borderline e fortemente positiva nas formas lepromatosas, por isso a baciloscopia

negativa não afasta o diagnóstico da hanseníase (Ridley & Jopling, 1966, Lyon et al.

2008). Geralmente o material de quatro sítios (lóbulos auriculares, cotovelos e/ou lesão)

é analisado e a carga bacilar é expressa pelo IB médio dos quatro sítios analisados

(Leiker & McDougall 1987, Brasil/Ministério da Saúde, 2002, Brasil/Ministério da

Saúde, 2010b). Independente do número de lesões do paciente, quando a baciloscopia

for positiva, o mesmo é classificado com multibacilar (Brasil/Ministério da Saúde,

2010b).

1.9.2- Biópsia e exame Histopatológico

O exame histopatológico baseia-se na análise microscópica de preparados

histopatológicos das biópsias de lesões cutâneas e nervos, com o estudo dos espécimes

para verificar infiltrado inflamatório, presença de granulomas, agressão neural, presença

de bacilos álcool-ácido resistentes, vasculite na derme e/ou hipoderme, paniculite,

estratificação e espessamento de tecidos. A descrição dos achados histopatlógicos

53

característicos de cada forma clínica do espectro, foi descrita anteriormente, nesta

introdução. Entre as formas clínicas do espectro há infinitos pontos entre um polo e

outro, o que dificulta a classificação dos pacientes. (Ridley & Jopling 1966, Ridley

1974, Fleury 2006, Job & Chandi 2001).

Tanto a baciloscopia, quanto o exame histopatológico não são exames

preconizados pela OMS para o diagnóstico da hanseníase, por isso não são realizados de

forma rotineira pelos serviços de saúde pública (WHO 2005, Costa et al, 2001, Fleury

2006), ou seja, na rotina operacional os pacientes são classificados baseados apenas no

número de lesões. Estudo realizado na Índia e outros mostram altos índices de

diagnósticos falsos positivos (Single-lesion Multicentric Trial Group 1997, Pardillo et

al. 2007).

Estudo que avaliou a concordância entre o diagnóstico clínico e o da hanseníase,

utilizando os resultados de biópsias, a concordância diagnóstica clínico-histopatológica

foi de 67,6%. A maior concordância foi obtida para a forma V, e a menor para a forma

I. A maior discrepância diagnóstica ocorreu para a forma BB (Teixeira et al. 2008).

1.9.3- Biologia Molecular

A identificação do DNA do M. leprae pela reação em cadeia de polimerase

(PCR) específica (ML-PCR) pode ser realizada com vários tecidos e fluidos biológicos

como: sangue, secreção nasal e linfa, porém, fragmentos de biópsia de pele e de nervos

parecem ser os materiais biológicos de maior sensibilidade para a amplificação do DNA

do M. leprae (Gillis & Williams 1991, Santos et al. 1993).

A técnica de PCR tem mostrado especificidade de 100% e sensibilidade

variando de 34-80% em pacientes com forma paucibacilar e taxa de sensibilidade acima

de 90% em pacientes com forma multibacilar (revisado por Scollard et al. 2006). Os

testes com ML-PCR geralmente apresentam uma positividade em torno de 95% em

pacientes multibacilares, mas dificilmente alcança 50% em pacientes paucibacilares

(Gillis and Williams 1991, Santos et al. 1993, Stefani et al 2003, Truman et al. 2008).

Diferentes genes específicos do M. leprae são utilizados como alvo da

amplificação por PCR (Santos et al. 1993), gene LSR/A15 que codifica o antígeno de

15 kDa (Misra et al. 1995), o fragmento de 360 pb do gene que codifica a proteína de

18 kDa (Williams et al. 1990; Scollard et al. 1998; Stefani et al. 2003, revisado por

Scollard et al. 2006), entre outros.

54

A ML-PCR não é recomendada como teste diagnóstico da hanseníase (WHO,

2005) e requer para sua realização, equipamentos e infraestrutura de alto custo, por isso

continua sendo mais um instrumento de pesquisa (Sousa et al. 2007).

1.9.4- Estudos Sorológicos

O desenvolvimento de métodos laboratoriais para auxiliar o diagnóstico ou

classificação das diversas formas clínicas da hanseníase é uma das prioridades em

pesquisa na área. No campo do sorodiagnóstico, a detecção de anticorpos IgM anti-

PGL-I, permanece como o melhor padronizado e mais avaliado teste em hanseníase.

(revisado por Stefani 2008). O ideal no diagnóstico nos serviços de saúde seriam testes

que possam ser realizados com recursos laboratoriais mínimos e sem necessitar de mão

de obra especializada, de leitura simples, objetiva e rápida, para serem utilizados no

ponto do atendimento (“point of care”, POC), facilitando o diagnóstico e a classificação

da hanseníase em PB e MB.

1.9.4.1- Sorologia anti-PGL-I e outras proteínas ou peptídeos do M. leprae

A sorologia anti-PGL-Ié um teste altamente específico para hanseníase, e a

presença de anticorpos no soro correlaciona-se com o índice bacteriano. Esta baseia-se

na detecção de anticorpos IgM anti-PGL-I, e não apresenta reação cruzada com M.

tuberculosis (Cho et al. 1983). O PGL-I é um componente de parede celular, exclusivo

do M. leprae, que constitui cerca de 2% da massa total bacteriana, cuja estrutura é

composta de um mono, di ou trissacarídeo, fenol, fitiocerol e de ácido micoceosídico

(Hunter and Brennan 1981, Stefani et al. 1998, revisado por Scollard et al. 2006,

Bührer-Sékula et al. 2008).

Outros estudos propuseram a produção de análogos sintéticos do PGL-I, da

porção mono, di ou trissacarídea associados a carreadores hidrossolúveis (BSA/HSA),

ecomo monossacarídeo–octyl–BSA (M-O-BSA), dissacarídeo natural-octyl–BSA (ND–

O–BSA), dissacarídeo natural-octyl–HSA (ND-O-HSA), trissacarídeo natural-phenil–

BSA (NT-P-BSA) e o trissacarídeo natural-phenil– HSA (NT-P-HSA). Estes antígenos

são utilizados atualmente por diversos grupos de pesquisa em hanseníase (Bührer-

Sékula et al. 2000).

A sorologia anti-PGL-I possui baixa sensibilidade para pacientes paucibacilares,

pois forma-se um baixo título desses anticorpos, além de que em áreas endêmicas uma

proporção de indivíduos saudáveis pode ser anti-PGL-I positiva (Stefani et al. 1998,

55

revisado por Stefani 2008). A sensibilidade do teste anti-PGL-I é de até 98% em

pacientes MB e de cerca de 30% em pacientes PB (Bührer-Sékula et al.2003, Bührer-

Sékula et al.2008). Com a morte do M. leprae pelo uso da MDT, a síntese de PGL-I é

cessada e o antígeno é eliminado do organismo, consequentemente os níveis de

anticorpos declinam (Silva et al. 2008). Por isto, os títulos de IgM correlacionam-se

com a forma clínica, carga bacilar e a atividade da doença, e apresentam significante

declínio em decorrência do uso da MDT, sendo útil no seguimento do paciente, para

controle de cura ou monitorar recidiva, onde há aumentos dos títulos (Bührer-Sékula et

al. 2008).

Alguns estudiosos defendem ouso do anti-PGL-I em associação com parâmetros

clínicos para classificação e monitoramento dos pacientes multibacilares e não como

ferramenta diagnóstica única das formas multibacilares de hanseníase. Os resultados da

sorologia anti PGL-I podem ser úteis para a classificação/diferenciação de pacientes

MB/PB e podem contribuir para decisões terapêuticas adequadas (Bührer-Sékula et al.

2007).A detecção rápida de anticorpos anti-PGL-I pode ser feita por método do fluxo

lateral (“MLflow”), que possue especificidade e sensibilidade semelhante ao método de

ensaio imunoenzimático(“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay” ELISA) anti-PGL-I

e apresenta maior facilidade de execução (Bührer-Sékula et al, 2003, Bührer-Sékula et

al, 2008, Stefani et al. 2012).O teste dipstick, POC, para detecção de anticorpos anti-

PGL-I que fornece resultados em 3 horas e apresenta 97.2% de concondância com os

resultados do ELISA, e não requer equipamentos sofisticados nem reagentes

refrigerados. Já no fluxo lateral o resultado é imediato e feito com sangue total, em

qualquer local onde estiver o paciente (Bührer-Sékula et al. 1998).

A presença de anticorpos anti PGL-I em contatos domiciliares de pacientes MB

é considerada fator de risco para desenvolvimento de hanseníase. Contatos que

apresentam anticorpos anti PGL-I tem oito vezes mais risco de desenvolver hanseníase

do que contatos soronegativos. Entre os contatos soropositivos para o PGL-I o risco de

desenvolver hanseníase do tipo MB é de 34 vezes (revisado por Scollard et al. 2006). O

seguimento dos contatos de pacientes MB pode permitir o diagnóstico precoce e a

quimioprofilaxia deste grupo de risco poderia prevenir a transmissão da hanseníase.

(Oskam & Bührer-Sékula 2003). Num seguimento de 5 (cinco) anos, observou-se que

2% dos contatos de MB desevolveram a hanseníase e apresentaram um risco de 3,8 de

desenvolver a doença (Goulart et al. 2008).

56

O genoma do M. leprae (Leproma), cujo sequenciamento foi finalizado em

2001, possui 1605 genes codificadores de proteínas em um total de 3.268.203 pb.

Aproximadamente 165 destes genes codificadores de proteínas nãopossuem ortólogo

em Mycobacterium tuberculosise mais da metade dos genes do M. tuberculosis está

ausente no genoma do M. leprae (Cole et al. 2001). O sequenciamento genômico

completo do M. leprae representou um avanço na elucidação da biologia deste bacilo e

abriunovas possibilidades de identificação de antígenos que possam ser utilizados como

reagentes para diagnóstico ou vacina para a hanseníase (Aseffa et al. 2005). Desde o

sequenciamento do genoma do M. leprae, vários laboratórios de pesquisa examinaram

cerca de 200 proteínas recombinantes (Geluk et al. 2011), quanto a reatividade

humoral e celular e quanto ao potencial uso no desenvolvimento de testes “point of

care”. Estes testes poderiam contribuir para a classificação de pacientes com hanseníase

(PB/MB), triagem de indivíduos saudáveis e de contactantes de MB com alto risco de

adoecimento e permitir o diagnóstico precoce e monitorização do tratamento.

Recentemente vários estudos, baseados em sequências genômicas, têm

identificado novas proteínas ou peptídeos específicos do M. leprae, que são apropriados

para o sorodiagnóstico da hanseníase. Diferentes estudos têm avaliado a

imunorreatividade de várias proteínas recombinantes do M. leprae em pacientes com

hanseníase e controles. Estas podem ser associadas ao teste com o PGL-1, na tentativa

de melhorar a sensibilidade do mesmo para os pacientes PB (revisado por Stefani 2008).

Mais recentemente, testes sorológicos (ELISA) para detecção de anticorpos da

classe IgG contra proteínas recombinantes do M. leprae tem revelado novos antígenos

candidatos ao uso no diagnóstico sorológico da hanseníase, especialmente para

pacientes com hanseníase MB (Duthie et al. 2007, Geluk et al. 2009, Corstjens et al.

2011,Duthie et al. 2010). Dentre as proteínas avaliadas, ML0405, ML2331 e ML2055

demonstraram altas taxas de reconhecimento por pacientes LL/BL. Pacientes com

tuberculose e controles saudáveis não endêmicos mostraram baixa reatividade

sorológica. No polo paucibacilar da doença baixas taxas de reconhecimento foram

encontradas, assim como nos contatos de pacientes MB (Geluk et al. 2010, Geluk et al.

2011, Geluk 2013).

O diagnóstico precoce da hansneíase reduz a transmissão e sequelas dos

pacientes, Apesar da redução da prevalência da hanseníase em todo o mundo, como

resultado do uso generalizado de poliquimioterapia, a incidência permanece

relativamente estável, mostrando que há transmissão e o diagnóstico é feito tardiamente

57

(Duthie et al. 2010, Geluk et al. 2010, Geluk 2013,Richardus et al. 2013). Com a

finalidade de desenvolver uma alternativa diagnóstica eficaz, simples, rápida e barata,

foi analisada a resposta sorológica de anticorpos para identificar proteínas de M. leprae,

que são reconhecidas pelos pacientes de hanseníase. Uma nova proteína de fusão,

baseado em estudos anteriores, foi construída unindo as proteínas ML0405 e ML2331,

denominada LID-1 (Leprosy IDRI Diagnostic). Esta foi testada em diferentes

populações (Brasil, Filipinas e Japão) para ver a influência da localização geográfica no

reconhecimento dos antígenos. A LID-1 manteve a atividade diagnóstica e era capaz de

diagnosticar casos de hanseníase com 6 a 8 meses antes do início dos sintomas

clínicos.A taxa de reconhecimento de LID-1 foi de 87% entre os MB e 20% entre os

PB, indicando grande potencial para o uso de LID-1 para o diagnóstico da hanseníase

MB. Entre os controles endêmicos apenas 4% foram sororeativos para esta proteína de

fusão. O aumento dos anticorpos anti LID-1 foi maior do que os anticorpos anti PGL-I,

indicando que LID-1 poderia fornecer um diagnóstico mais precoce da hanseníase

(Duthie et al. 2007).

Outro estudo, mais de 100 antígenos recombinantes foram analisados em um

formato de matriz de proteína para selecionar aqueles com propriedades

discriminatórias para diagnóstico de hanseníase. O estudo foi com a metodologia

ELISA e os dados deste indicam que os pacientes multibacilares podem ser distinguidos

de pacientes paucibacilares, e ambos estes grupos podem ser separados de grupos de

controle endêmico. Foi demonstrado o desempenho destes antígenos em formatos de

teste rápido com o objetivo de desenvolver um teste de diagnóstico“point-of-care”

(Duthie et al. 2008).

Estudo posterior, foi projetada e produzida uma proteína de fusão quimérica com

multiepítopos, a proteína para o diagnóstico rápido da hanseníase (“protein advances

diagnostic of Leprosy” [PADL]), a partir da fusão dos epítopos reativos de proteínas

recombinantes do M. leprae (ML0405, ML2311, ML2055, ML0049, ML0050 ML0091

e ML0411). A proteína foi avaliada em soro de pacientes com hanseníase MB e PB de

São Paulo/Brasil e de Cebu/Filipinaspacientes com hanseníase MB e PB e controles

endêmicos. Foi demostrado que todas as porções da proteína mantinham sua

capacidade de ligação a anticorpos e a proteína oferecia grande acurácia no diagnóstico

de pacientes MB. Entre os controles saudáveis endêmicos não foi observada resposta

para PADL. Entretanto, outros estudos devem ser realizados para avaliar se PADL pode

fornecer o diagnóstico precoce da hanseníase (Duthie et al. 2010).

58

1.9.4.2- Avaliação da imunidade celular a peptídeos e proteínas recombinantes do

M. leprae

Os testes que avaliam a imunidade humoral têm pouca relevância para o

diagnóstico dahanseníase PB, já que esta apresenta resposta de anticorpos fraca ou

ausente. Estudos que utilizam a detecção de IFN-γ, como marcador de imunidade

celular, após estímulo de células sanguíneas com proteínas recombinantes ou peptídeos

sintéticos do M. leprae, têm o objetivo de desenvolver um método diagnóstico para

hanseníase PB. A secreção de IFN-γ em resposta a proteínas e peptídeos do M. leprae é

observada tipicamente em pacientes TT/BT, contatos domiciliares e controles

endêmicos (Duthie et al. 2008a; Geluk et al. 2005; Geluk et al. 2009; Geluk et al. 2010;

Sampaio et al. 2011; Geluk et al. 2012; Sampaio et al. 2012, Geluk 2013).

Ensaios baseados na liberação de IFN-γ (“Interferon-Gamma Release Assays”

IGRAs) foram desenvolvidospara o diagnóstico de TB latente. Estes se baseiam na

detecção de IFN-γ após estimulação com os antígenos ESAT-6, CFP-10 e TB7.7, que

são expressos especificamente no M. tuberculosis. Existem dois IGRAs no mercado

para diagnóstico de tuberculose latente: “QuantiFERON-TB Gold In-Tube assay” e “T-

SPOT.TB assay”(Cattamanchi et al. 2011).De modo semelhante tem se buscado o

desenvolvimento deIGRAs para o diagnóstico da hanseníase PB. Neste sentido os

homólogos de ESAT-6 e CFP-10 na tuberculose, a ML0049 e a ML0050 na hanseníase,

respectivamente, presentes no M. leprae foram testados e houve reconhecimento destes

antígenos por células T de pacientes com tuberculose, limitando o potencial uso destes

antígenos em áreas endêmicas para TB (Geluk et al. 2009, Geluk 2013).

Pesquisadores avaliaram a imunorreatividade celular a 4 proteínas

recombinantes do M. leprae e a 58 peptídeos sintéticos em pacientes com hanseníase e

grupos controles do Brasil, a partir da detecção de IFN-γ em sobrenadantes de cultura

de células sanguíneas polimorfonucleares de sangue periférico (PBMC). Dos 58

peptídeos testados, 35 induziram respostas com produção de IFN-γ somente nos grupos

paucibacilares e contactantes (Spencer et al. 2005).

Estudo que avaliou estratégias para aumentar a sensibilidade do ensaio de

sangue total com dois peptídeos (p1-15 e 11-25) da proteína ML2531 pela adição de

citocinas, adição de anticorpos anti CD49, CD28, CD40, IL-10 ou CD40L e pela

manosilação de peptídeos, demonstrou que somente a citocina IL-12 aumentou a

59

produção de IFN-γ em cultura de sangue total em amostras de pacientes com hanseníase

BT da Holanda. Diferente do esperado, nenhum dos anticorpos teve impacto no

aumento da secreção de IFN- γ pelas células T. A manosilação não aumentou a

sensibilidade do ensaio, entretanto permitiu utilizar uma quantidade 100 vezes menor

dos peptídeos, diminuindo o custo do teste (Geluk et al. 2010).

Estudo do nosso grupo avaliou um painel de proteínas recombinantes de M.

leprae para avaliar as respostas de células T, medida pela produção de IFN-γ, entre os

pacientes de hanseníase. O estudo foi com ensaios simples de sangue total, que são mais

aplicáveis no campo ou situações clínicas. As respostas de células Tno WBA de

indivíduos de Goiânia-Brasil demonstraram que vários antígenos de M. leprae

(ML0276, ML0840, ML1623, ML2044 e 46f) suscitaram produção de IFN-γ maior que

0,5 UI/ml e estas proteínas foram classificados como imunogênicas e hanseníase

específica. Vários destes antígenos individuais foram reconhecidos por células emmais

de 60% dos pacientes PB e ML0276, ML0840, ML1623 e 46f complementavam uma a

outra, tal que 82% dos pacientes PB tinham respostas fortes (IFN-γ > 1,25 UI/ml) para

pelo menos uma destas proteínas. Mas, estas proteínas também foram reconhecidas por

parte significativa dos contatos familiares dos pacientes MB, em contraste, com poucas

respostas observadas em pacientes com tuberculose ativa ou grupos de controle

saudável de áreas de endemicidade. Os resultados indicam vários antígenos são

potenciais candidatos que podem ser úteis para o diagnóstico de hanseníase ou

vacinação e demonstra a utilidade da hanseníase WBA que pode ser aplicado

amplamente em contextos clínicos ou de campo (Duthie et al. 2008).

Outro estudo do nosso grupo de pesquisa comparou paralelamente a resposta de

anticorpos e de células T, produção de IFN-α, de pacientes com hanseníase MB e PB,

contatos domiciliares de pacientes MB, controles saudáveis de área endêmicas e

pacientes com TB pulmonar provenientes de Goiânia/Goiás. Um painel de 33 proteínas

recombinantes foi avaliado quanto à imunogenicidade e especificidade da resposta por

meio de ELISA e ensaio de sangue total. Destas 33 proteínas avaliadas, 16 delas foram

imunogênicas e estimularam a produção de IFN-α em pacientes PB e contatos

domiciliares ou foram reconhecidas por anticorpos IgG de pacientes com hanseníase

MB. As proteínas ML0405, ML2331 e ML2055 foram reconhecidas por anticorpos e

por resposta imune celular específica para o M. leprae. As proteínas ML1632, ML1685,

ML1556, ML2044, ML0276 e ML0840 foram imunogênicas, entretando somente a

resposta de IFN-α foi específica. As proteínas ML2358, ML2346, ML2541, ML2603,

60

ML0022, ML2380 e ML2203 foram imunogênicas, mas houve reconhecimento por

anticorpos e produção de IFN-α em todos os grupos testados, ou seja, eram proteínas

imunogênicas, mas seu reconhecimento foi inespecífico. As outras 17 proteínas

avaliadas foram não imunogênicas, não reagiram no ensaio de sangue total nem no

ELISA para detecção de IgG. O número de proteínas capazes de estimular a resposta de

IFN-α foi superior ao número de proteínas que foram reconhecidas por anticorpos IgG.

A análise paralela da resposta imune celular e humoral a estas proteínas permitiu

concluir que somente proteínas que foram capazes de induzir imunidade celular/IFN-α

foram também reconhecidas por anticorpos. Além disso, os resultados deste estudo

mostraram que as análises in silico não devem ser o único critério para exclusão de

antígenos, visto que proteínas com alta homologia com proteínas de outras

micobactérias não apresentaram reatividade cruzada. Por exemplo, a proteína ML2331

apresentou mais de 80% de homologia com várias proteínas de outras micobactérias,

entretanto quando avaliada não apresentou reatividade cruzada na resposta imune

humoral e celular. Por outro lado a proteína ML2346 que não apresentou homólogo em

M. tuberculosis nem em outras micobactérias ambientais apresentou reatividade

cruzada, estimulando resposta de IFN-α em todos os grupos avaliados (Sampaio et al.

2011).

Como a resposta de IFN-α para as proteínas e peptídeos do M. leprae é

praticamente idêntica entre os casos TT/BT e contatos domiciliares, outros

biomarcadores que sejam capazes de distinguir estes dois grupos tem sido investigados.

Em recente estudo nosso grupo de pesquisa analisou 14 biomarcadores (eotaxina, IFN-

γ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-15, IL-17A, IL-23, IL-31, CXCL10

(IP10)e TNF-α) em pacientes com hanseníase PB e MB e em contatos de pacientes MB.

Neste estudo, nenhum destes biomarcadores foi capaz de distinguir a resposta de

pacientes com hanseníase TT/BT da resposta de contatos domiciliares de pacientes MB,

confirmando resposta com perfil Th1 em ambos os grupos. Houve produção de IL-4 em

ensaio de sangue total de pacientes BL/LL. Entretanto, um contactante de paciente MB

apresentou resposta imune do tipo Th2 e ausência de IFN-γ, o que poderia indicar

doença MB inicial ou subclínica. A confirmação deste achado é essencial para

determinar o valor prognóstico deste imunomarcador (Sampaio et al. 2012).

Outro estudo recente de biomarcadores, avaliou a resposta a 17 proteínas

recombinantes e 19 biomarcadores (IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-

12p70, IL-13, IL-17A, IFN-γ, CXCL10, FSC-G, FSC-GM, MCP-1, CXCL9, MIP-1β e

61

TNF-α), com o objetivo de encontrar biomarcadores que distinguissem controles

endêmicos de pacientes TT/BT. Foram avaliadospacientes com hanseníase PB, contatos

domiciliares, pacientes com TB pulmonar e controles endêmicos provenientes do Brasil

(Fortaleza), Bangladesh, Coréia do Sul e Etiópia. Apenas, a proteína ML2478 foi capaz

de estimular resposta de células T específica em grupos geneticamente diversos

(Africano, Asiático e da América do Sul). A citocina IL-1β e as quimiocinas MIP-1β e

MCP-1 foram capazes de diferenciar pacientes TT/BT e controles endêmicos.

Entretanto, foi observada resposta entre contatos domiciliares e em pacientes com

tuberculose (Geluk et al. 2012).

Os resultados de vários estudos que pesquisaram a resposta imune celular de

pacientes com hanseníase e grupos controles a peptídeos sintéticos e proteínas

recombinantes do M. leprae são de extrema importância, pois abrem caminho para a

realização de novas pesquisas que buscam testes sensíveis e específicos para serem

utilizados no diagnóstico de rotina da hanseníase, além de antígenos candidatos ao

desenvolvimento de uma vacina contra a hanseníase(Geluk et al. 2009, Duthie et al.

2008, Duthie et al. 2010, Sampaio et al. 2011, Geluk et al. 2012, Sampaio et al. 2012).

1.9.4.3- Testes cutâneos para avaliação da imunidade celular ao M. leprae

O teste cutâneo para avaliação da imunidade celular ao M. lepraemais utilizado

em hanseníase foi o da lepromina ou Reação de Mitsuda, que é uma reação de

hipersensibilidae tardia aos antígenos M. leprae, e é associado com a capacidade de

desenvolver uma resposta imune granulomatosa, envolvendo células apresentadoras de

antígeno e participação de linfócitos CD4. A lepromina de Mitsuda consiste de bacilos

autoclavados e cada ml da solução de contém 4,0x107(40 milhões) de BAAR (WHO

1989a). O teste é feito com injeção intradérmica de 0,1 ml da solução aplicado na face

ventral do antebraço, e a leitura da reação é feita 24 a 28 dias após a aplicação. O teste

positivo é aquele que mostra induração igual ou maior que 4,0 mm, e o ideal é que

também fosse avaliada a resposta por biópsia e exame histopatológico do local do teste

(WHO 1989a, revisado por Talhari & Neves 1997, revisado por Scollard et al. 2006).

O teste de Mitsuda não serve para ser utilizado no diagnóstico da doença, pois

não é específico para a hanseníase devido a forte reatividade cruzada com micobactérias

ambientais não patogênicas e a vacinação BCG e pode apresentar respostas positivas em

indivíduos que nunca foram expostos ao M. leprae (WHO 1989a, revisado por Talhari

& Neves 1997, Geluk et al 2012). Na hanseníase PB, o teste cutâneo é, na maioria das

62

vezes positivo, enquanto que pacientes LL tipicamente não apresentam resposta, ou

seja, são negativos ao teste. Embora a resposta à lepromina de Mitsuda não seja

específica para a hanseníase, uma resposta negativa é associada a forma MB, sem

capacidade para responder ao M. leprae e de eliminar os bacilos (revisado por Scollard

et al. 2006, Goulart et al. 2008, revisado por Geluk et al. 2012).

Atualmente, o teste de Mitsuda (intradermorreação de Mitsuda) não está mais

previsto nas rotinas dos serviços públicos de diagnóstico e tratamento da hanseníase. O

Guia de Controle da Hanseníase, de 1993, ainda ensinava a sua execução

(Brasil/Ministério da Saúde 1993).

1.9.4.4- Outros meios auxiliares de diagnóstico

O comprometimento de nervos periféricos é uma constante nos casos de

hanseníase, devendo ser investigado para corroborar os achados clínicos e afastar ou

confirmar a doença como causa da mesma. A eletroneuromiografia é um exame

complementar e não estabelece o diagnóstico etiológico, mas neuropatia múltipla em

área endêmica, até que se prove o contrário pode ser hanseníase. Esta pode ser

importante na orientação dos atos cirúrgicos de descompressão neural, localizado o

processo e também no estabelecimento de ramos nervosos a serem biopsiados para

diagnóstico das formas neurais puras (Coelho 2013).

1.10 – Diagnósticos Diferenciais

Os diagnósticos diferenciais em hanseníase são numerosos, tanto no aspecto

clínico quanto histopatológico, sendo assunto para livros específicos. Daí também a

necessidade de uma classificação acurada, não apenas baseada em critérios clínicos, que

levam a inúmeros erros de diagnóstico e terapias intempestivas e incorretas (Ridley &

Jopling 1966, Single-lesion Multicentric Trial Group 1997, Scollard 2004, Pardillo et al.

2007, Teixeira et al. 2008, Job & Chandi 2001, Manifold & Marshman 2009). A

banalização do diagnóstico é feita com a classificação da OMS e MS/Brasil, baseada no

número de lesões.

A hanseníase pode ser confundida clinicamente com outras doenças de pele e

com outras doençasneurológicas que apresentam sinais e sintomas semelhantes aos

seus. Portanto, deve serfeito diagnóstico diferencial em relação a essas doenças.

Existem doenças que provocam lesões de pele semelhantes às lesões característicasda

hanseníase, e que podem ser confundidas com as mesmas. Afirmação leviana encontra-

63

se no Guia 2002/MS/Brasil: “A principal diferença entre a hanseníase e outras doenças

dermatológicas é que as lesõesde pele da hanseníase sempre apresentam alteração de

sensibilidade. As demais doençasnão apresentam essa alteração”(Brasil/Ministério da

Saúde 2002). Há um alforisma em medicina que diz: “em Medicina e no amor, nem

sempre nem nunca”. Alteração de sensibilidade nem sempre está presente na

hanseníase, como nas lesões da face, ou mesmo são muitos subjetivas e por vezes de

difícil caracterização clínica.

As principais doenças de pele que fazem diagnóstico diferencial com hanseníase

são: pitiríase versicolor (pano branco), eczemátide, tinha do corpo, vitiligo, esclerose

tuberosa, nevo acrômico, eczemas, psoríase, lúpus vulgar, pitiríase rósea, lintomas

cutâneos, xantomatose, esclerodermia, granuloma anular, sarcoidose, sífilis,

leishmaniose cutânea, neurofibromatose, etc (Guinto et al. 1986, Opromolla& Ura 2002,

Brasil/Ministério da Saúde 2002, Walker & Lockwood 2007, Samapio & Rivitti 2011).

O diagnóstico diferencial também deve ser feito em relação a outras doenças

neurológicas, como: a síndrome do túnel do carpo, neuralgia parestésica, neuropatia

alcoólica, neuropatia diabética e lesões por esforços repetitivos (Brasil/Ministério da

Saúde 2002).

Do ponto de vista histopatológico, a hanseníase pode ser confundida com várias

outras doenças granulomatosas ou não. Job e Chandi tem um livro específico para este

fim, onde faz uma interessante abordagem clínico-patológica. Segundo eles doenças que

relembram a hanseníase indeterminada: pitiríase versicolor, sífilis secundária,

oncocercose, dermatite seborréica, vasculite linfocítica, pitiríase alba, cicatriz pós-

inflamatória, hipopigmentação nutricional, esclerodermia (morféia), vitiligo e o nevo

hipocrômico. As doenças que relembram da hanseníase tuberculóide e borderleine são:

lúpus vulgar, tuberculose cutânea verrucosa, tubercúlide, sífilis terciária, pinta,

cromomicose, esporotricose, blastomicose, granuloma anular, necrobiose lipoídica,

granuloma multiforme, urticária, eritema anular centrífugo, psoríase vulgar, líquen

nítico, líquen plano, pitiríase rósea, lúpus eritematoso discoide, erupção polimorfa à luz,

e o frinoderma. Já as doenças que relembram a hanseníase lepromatosa são:

neurofibromatose, lipomatose múltipla, dermatofibroma, leucemia “cutis”, micose

fungoide, sarcoma de Kaposi, queloide, verruga vulgar, molusco contagioso,

leishmaniose dérmica pós-calazar, eritema nodoso, síndrome de Weber-Christian, acne

vulgar, rosácea, eritema multiforme, actinomicose, hipotireoidismo e a “normal shiny

waxy skin” (Job & Chandi 2001).

64

Como fazer o diagnóstico diferencial morfológico entre a plêiade de doenças não

será tema abordado nesta tese.

1.11- Reações Hansênicas

A evolução clínica crônica da hanseníase pode ser interrompida por fenômenos

inflamatórios agudos denominados episódios reacionais, que podem ocorrer nos

pacientes virgens de tratamento, antes da MDT, durante ou após a terapia específica.

São classificados como reação tipo 1 e tipo 2, sendo condições distintas que ocorrem

separadamente mas podem surgir em momentos diferentes no mesmo paciente e ambas

podem resultar em perda definitiva da função neural (Ridley & Jopling 1966, Scollard

1994, revisado por Scollard et al. 2006). Alguns autores consideram a neurite como uma

forma especial de reação, classificando os episódios reacionais em três tipos (Nery et al.

2006). A neuropatia pode ser silenciosa, termo proposto para descrever a ocorrência do

dano neural na ausência de sintomas (Jopling 1965, Britton e Lockwood 2004, Walker e

Lockwood 2007, van Brakel &Lockwood 2008).

Os episódios reacionais podem incidir em qualquer das formas clínicas, sendo

rara sua detecção na hanseníase indeterminada (Scollard 1994, revisado por Foss et al.

2003, Ney et al. 2006).

Os episódios reacionais decorrem do processo inflamatório e resposta

imunológica mediada por antígenos do M. leprae, e estabelecem relação com a carga

bacilar e a resposta imune do hospedeiro. Cerca de 30 a 50% dos pacientes apresentam

os episódios reacionais, que se não diagnosticadas e tratadas precocemente, podem

deixar sequelas e incapacidades (Lockwood et al. 1993, Scollard et al. 1994, revisado

por Foss et al. 2003, Walker & Lockwood 2008, revisado por Nery et al 2006, revisado

por Scollard et al. 2006, revisado por Grossi 2013).

Em um estudo epidemiológico prospectivo sobre reações, 45% da coorte

desenvolveu reação; 32% dos pacientes considerados em risco desenvolveram reações

do tipo 1 e 37% dos pacientes considerados em risco desenvolveram reações de tipo 2.

Apesar da predominância de homens entre os pacientes de hanseníase, reações do tipo 1

ocorreram com frequência significativamente maior em mulheres e não parece ser

influenciada pela idade de início da lepra. Indivíduos experimentando uma reação do

tipo 1 não eram propensos a experimentar uma recorrência, sugerindo que os

mecanismos imunológicos desta reação podem ser limitados ou regulados por fatores

genéticos ou imunológicas. Reações do tipo 2, por outro lado, ocorreram com igual

65

frequência em homens e mulheres, mas foram altamente associadas com o aparecimento

da hanseníase na segunda década de vida. Indivíduos que experimentaram reações tipo

2 muitas vezes tinham uma ou mais recorrência da reação (Scollar et al. 1994).

Em uma população de pacientes brasileiros do Rio de Janeiro com baciloscopia

positiva, 25% apresentaram reação tipo 1 durante o período de 2 anos de tratamento

com MDT (Nery et al. 1998). Em um estudo retrospectivo feito em um centro de

referência no Nepal em pacientes com forma borderline 30% desenvolveram reação tipo

1 (van Brakel et al. 1994). Neste estudo, a metade dos indivíduos que teve reação tipo 1

apresentou dano neural. Em uma coorte de pacientes multibacilares recrutados em dois

centros de referência na Índia observou-se taxa de 19,8% de reação tipo 1 na primeira

avaliação e de 2,0% de reação tipo 2 (van Brakel et al. 2005). Estudo prospectivo do

Vietnã detectou taxa de 29,1% de reação tipo 1 (Ranque et al. 2007).

1.11.1- Reação Tipo 1 (RT1 ou Reação Reversa) A RT1 acomete principalmente pacientes tuberculoides e borderlines (BT, BB e

BL) e estima-se que cerca de um terçodestes pacientes podem apresentar a reação,

principalmente nos primeiros 6 meses de PQT. A RT1 raramente ocorre vários anos

após o término do tratamento com PQT e nesta situação pode ser difícil a distinção entre

RT1 tardia e recidiva da doença (Scollard et al. 1994, Manandhar et al. 2002, Brito et al

2005, Misch et al 2008).A incidência da RT1 na forma LL é significamente menor do

que na forma BL e sua ocorrência pode ser observada na forma TT (revisado por Foss et

al. 2003, revisado por Nery et al. 2006). Pacientes com formas polares também podem

apresentar reação tipo 1, associada a uma exacerbação da resposta imune celular tipo

Th1, com predominância de expressão de citocinas IL-2, IFN-γ e IL-12 (Stefani et al.

2003).

A RT1 resulta do aumento na imunidade celular, resposta Th1, aos antígenos do

M. leprae, mas a causa desta alteração imunológica e o seu mecanismo são

desconhecidos (Scollard 2008). Há aumento das citocinas IFN-γ e IL-12 (Sreenivasan et

al. 1998), TNF-α e IL-1 (Sarno et al.1991), IL-2, IL-6 e IL-8 (Moraes et al.1999).

Os antígenos do bacilo são encontrados no interior dos macrófagos na pele e

dentro das células de Schwann nos nervos periféricos dos pacientes com RT1. Estudos

mostraram que o número e a porcentagem de linfócitos T CD4+, que secretam IFN-γ,

IL-12 e TNF-α, estão aumentados nas lesões de RT1. Foi demonstrado, em estudo

recente, que a expressão do RNA mensageiro (RNA-m) das quimiocinas IL-8, proteína-

66

1 quimiotática de monócitos (MCP-1) e fator regulado por ativação, expresso e

secretado por células T normais (RANTES) é maior nas lesões cutâneas durante a RT1.

NaRT1 tem sido documentado aumento na expressão dos genes de várias citocinas pró-

inflamatórias (IL-1, IL-2, IL-12, IFN-γ, TNF-α) localmente, nas lesões de pele, e

sistemicamente, no soro e nas células mononucleares periféricas (Moraes et al 1999).

Estudos de imuno-histoquímica mostraram coloração mais intensa para TNF-α na pele e

nervos durante a RT1 quando comparado com controles de hanseníase não reacionais.

Produção de citocinas pelos linfócitos do sangue periféricoe concentrações de citocinas

séricas TNF-α e IL-1β também estão elevadas durante a RT1. Entretanto, os níveis de

citocinas circulantes podem não refletir as alterações observadas na pele durante o

episódio de RT1. Todas estas evidências apontam para aumento da resposta imune do

tipo Th1 durante a reação tipo 1 (Walker & Lockwood 2006).

A RT1 manifesta-se clinicamente pelo aparecimento de novas lesões por

exacerbação de lesões pré-existentes com eritema, infiltração,calor local, dore edema,

edema de pés, mãos e facepode ser característico da RT1. Na maioria das vezes a RT1

apresenta evolução gradual, sendo que seu curso natural pode durar várias semanas.

Estes episódios geralmente não cursam com comprometimento sistêmico e nos casos

graves podem ocorrer ulceração e necrose acentuada das lesões (Naafs 1992). Apesar de

apresentar um quadro clínico, geralmente, bem localizado, a RT1 é extremamente

preocupante, pois está frequentemente associada ao envolvimento de um ou mais nervos

periféricos, neurites, e consequentemente paralisias e incapacidades (Scollard 1994, van

Brakel et al. 1994, Talhari & Neves 1997, Sampaio & Rivitti 1998).

Na RT1 não se observam alterações de exames laboratoriais, hematológicas,

função hepática e renal, durante o episódio reacional. As características histopatológicas

da RT1 são: edema, aumento do número de linfócitos na derme e perda da organização

do granuloma. Com o tempo há um aumento do número de células gigantes tipo

Langhans (Job 1994). Foss refere aumento do número de células epitelioides, de células

gigantes e linfócitos e redução do número de bacilos (Foss et al. 2003). Antígenos de M.

leprae foram demonstrados em nervos e pele de pacientes com reação tipo 1 localizados

nas células de Schwann e macrófagos (Lockwood et al. 2002). As células de Schwann

expressam receptores Toll-like-2 (Oliveira et al. 2003). Segundo Scollard RT1 não é um

diagnóstico histopatológico.

Dentre os principais fatores de risco citados para a ocorrência da RT1, são: sexo

feminino, forma clínica multibacilar (doença difusa, mais de 2 áreas corporais

67

acometidas), maior número de lesões, formas borderlines imunologicamente instáveis

da hanseníase (Lienhardt & Fine, 1994); idade mais avançada; índice baciloscópico

mais alto, consideradofator de risco para episódios múltiplos (Ranque et al. 2007), grau

de incapacidade física 1 ou 2 ao diagnóstico; ocorrência de reação após início da PQT,

ou durante o primeiro ano de tratamento (van Brakel et al. 1994), ou durante o puerpério

(Lockwood & Sinha 1999); sorologia positiva para os anticorpos anti-PGL-I(Stefani et

al. 1998); e uso de infliximab para tratamento de outras doenças (ex: Doença de Crohn,

artrite reumatoide e psoríase) (Scollard et al. 2006).

Um estudo identificou que indivíduos comidade de 15 anos ou mais ao

diagnóstico de hanseníase é fator de risco independente para a ocorrência de

RT1(Ranque et al. 2007). Scollard e cols. publicaram relato dos dois primeiros casos de

hanseníase que se manifestaram pós-início de terapia biológica para artrite reumatoide

com Infliximab, droga que se liga ao TNF-α bloqueando sua ação, sendo que ambos

pacientes desenvolveram RT1 após descontinuação desta terapêutica (Scollard et al.

2006).

O infliximab é um inibidor de TNF-α, capaz de ativar infecção latente pelo M.

leprae ou M. tuberculosis em pacientes que desenvolveram tuberculose pulmonar ou

hanseníase. O TNF-α tem papel crítico na granulogenese e no controle da infecção por

micobactéria prevenindo a sua disseminação. Pacientes apresentando co-infecção HIV-

hanseníase, após a introdução de HAART (Highly Active Anti Retroviral Therapy)

podem apresentar reação reversa devido à Síndrome de Reconstituição Imune que

consiste em uma reorganização da imunidade. Esta síndrome é ocorre da 4ª. à 24ª.

semana após a introdução da terapia anti-retroviral devido ao aumento das células

CD4+ (Pereira et al. 2004; Ustianowski et al. 2006). Em estudo de pacientes com lesão

única de hanseníase tratados com esquema de dose única ROM e acompanhados por 3

anos, o aumento da idade e a positividade ao DNA de M. leprae detectado por PCR em

biópsias de pele, estiveram associados à maior chance de ocorrência de reação

hansênica tipo 1 (Sousa et al. 2007).

1.11.2- Reação Tipo 2 (RT2 ou Eritema Nodoso Hansênico)

A manifestação clínica mais frequente da RT2 é oEritema Nodoso Hansênico

(ENH), que são nódulos inflamatórios, eritematosos, de surgimento súbito, dolorosos,

disseminados, mais palpáveis do que visíveis, subcutâneos, que na histopatologia

mostra uma paniculite. Estes aparecem principalmente nos membros, de etiologia

68

variada, mas se presente nos membros superiores e inferiores a causa mais provável é a

hanseníase (Sampaio & Rivitti 2011). Podem aparecer em áreas do corpo, que não

haviam sido acometidas previamente, pápulas superficiais ou profundas ou ainda por

formas ulceradas, necróticas, pustulares e bolhosase com comprometimento sistêmico,

febre, mal-estar, sudorese, caquexia, ataxia, náuseas, vômitos e mialgia (revisado por

Guerra et al. 2002, Foss et al. 2003).

Na reação tipo 2, pode haver edema periférico, enfartamento ganglionar

generalizado, artralgias, mialgias, iridociclite, fotofobia, lacrimejamento, orquite,

artrites, epididimite, neurite, edema de mãos, pés e face (Guerra et al. 2002, Talhari &

Neves 1997,Sampaio & Rivitti 2011). Nas formas graves, as lesões cutâneas podem

ulcerar caracterizando o ENH necrotizante. O curso natural do ENH é de uma a duas

semanas, entretanto muitos pacientes apresentam recorrências durante vários meses.

Estes episódios acontecem principalmente durante o segundo e o terceiro ano após o

início da MDT, e devido à sua gravidade, são importantes causas de internações

hospitalares, além de gerarem insegurança quanto à cura da doença e muitas vezes

induzir ao re-tratamento, mas podem ocorrer antes, durante e após a MDT (Guerra et al.

2002, Talhari & Neves 1997, Sampaio & Rivitti 2011).

O ENH ocorre principalmente em pacientes multibacilares (BL e LL) e é

considerado importante causa de morbidade. Caso não seja pronta e

adequadamentetratada, a RT2 pode ocasionar em dano neural, paralisias e

deformidades. Antes da introdução da MDT mais de 50% das formas LL e 25% dos BL

tratados com monoterapia com sulfona desenvolviam RT2 durante a evolução da

doença (revisado por Scollard et al 2006, Wlaker e Lockwood 2007). Após a início do

uso da MDT, provavelmente devido ao efeito anti-inflamatório da clofazimina, incluída

ao esquema terapêutico, observou-se declínio da frequência e gravidade de reação tipo

2. A maioria dos pacientes com eritema nodoso hansênico desenvolve múltiplos

episódios durante anos (revisado por Guerra et al. 2002, Scollard et al. 2006). Estudo de

coorte desenvolvido durante 11 anos na Índia mostrou que menos de 10% dos pacientes

tiveram apenas um único episódio de ENH e 62,5% tiveram eritema nodoso crônico

(Pocaterra et al. 2006).

O eritema nodoso hansênico pode ser classificado como leve moderado e grave.

No ENH leve os pacientes apresentam menos de 10 nódulos por segmento corporal

comprometido, localizados mais frequentemente nos membros inferiores, pouco

dolorosos à palpação, sinais e sintomas sistêmicos ausentes ou de leve intensidade. No

69

ENH moderado, os pacientes apresentam de 10 a 20 nódulos por segmento corporal

comprometido, necessariamente mais de um, dolorosos à palpação, associados à febre

de moderada intensidade (<38,4ºC), com discreta sintomatologia sistêmica, podendo

haver comprometimento de cadeia de linfonodos local e/ou regional. Na forma grave de

ENH estão presentes mais de 20 nódulos por segmento corporal comprometido,

dolorosos espontaneamente, podendo haver lesões ulceradas, acometendo geralmente

grande área do tegumento, acompanhado de sintomatologia sistêmica exuberante como

febre alta (>38,5ºC), artralgias, calafrios, cefaleia, anorexia, fadiga e comprometimento

generalizado da cadeia linfonodal (revisado por Guerra et al. 2002).

As alterações nos exames laboratoriais mais frequentemente observadas durante

o ENH são leucocitose com neutrofilia, aumento de proteínas da fase inflamatória

aguda, como a proteína C reativa, aumento de gamaglobulinas (IgM e IgG), aumento

das frações C2 e C3 do complemento e proteinúria. No exame histopatológico, biópsias

cutâneas na RT2 mostram infiltrado inflamatório na derme e no subcutâneo (paniculite).

Em lesões agudas, de até 72 horas de aparecimento, há predomínio de neutrófilos,

podendo também estar presentes eosinófilos e mastócitos (Foss et al 2003). A

histopatologia de lesão cutânea geralmente mostra infiltrado inflamatório neutrofílico

perivascular, compatível com vasculite e numerosos bacilos fragmentados e granulosos

(Job & Chandi 2001, Foss et al. 2003). Biópsias mais tardias apresentam poucos

neutrófilos e aumento do número de linfócitos, plasmócitos e histiócitos, representando

um infiltrado inflamatório crônico. Outras características encontradas no eritema nodoso

incluem o edema da derme e subcutâneo, vasculite e paniculite. O infiltrado na forma

LL pode conter histiócitos com alteração gordurosa e arranjo difuso de células

espumosas. Na forma BL o granuloma pode conter histiócitos e linfócitos (Ridley &

Jopling, 1966). Nas formas LL e BL pode ser encontrada uma grande quantidade de

bacilos, geralmente de aparência granular, “poeira bacilar” (Michalany e Michalany

1988).

Apesar de serem alvo de numerosas investigações clínicas e laboratoriais, a

etiologia e imunopatologia do ENH não são completamente conhecidas. Nas lesões

agudas do ENH há infiltração neutrofílica sobrepondo padrão inflamatório crônico da

hanseníase. Durante muitos anos, acreditou-se que o ENH ocorria em conseqüência de

uma reação mediada por deposição de imunecomplexos circulantes. Entretanto, apesar

das evidências favoráveis a esta teoria, como a deposição de imunoglobulinas e

complemento nas lesões, diminuição do complemento sérico e identificação de alguns

70

constituintes micobacterianos nestes complexos, a presença de imunecomplexos fixos

ou circulantes não foi confirmada por outros estudos (revisado por Guerra et al. 2002,).

A reação tipo 2 parece se originar de uma forte ativação transitória e repentina

da resposta imune Th1, com aumento de IFN-γ, TNF-αe IL-12 circulantes e aumento do

RNA-m destas citocinas nas lesões, com inflamação sistêmica e alterações da

imunidade humoral (Modlin et al. 1985, Scollard et al. 1994, Scollard 2008). Elevados

níveis de TNF-α circulantes têm sido demonstrados em pacientes durante o ENH e

células mononucleares do sangue periférico de indivíduos com ENH secretam elevadas

quantidades de TNF-α após estimulação. Entretanto, estudo recente de Haslett e cols.

demonstrou baixos níveis de TNF-α circulantes em pacientes com forma leve de ENH.

Os autores postulam que quadros de ENH com significativo envolvimento sistêmico

podem produzir níveis circulantes de TNF-α elevados e que isto pode não acontecer nas

formas mais leves desta afecção.Embora ocorra em pacientes com resposta imune do

tipo Th2, vários estudos têm demonstrado altas concentrações das citocinas IFN-γ e

TNF-α (Sarno et al. 1991), IL-2, IL-6 (Moraes et al. 1999; Stefani et al. 2008), IP-10

(Stefani et al. 2008) e baixos níveis das citocinas IL-10 e IL-4 (Moraes et al. 1999,

Teles et al. 2002). A principal subpopulação de células T nas lesões do eritema nodoso

é a célula T CD4+ em contraste com a hanseníase lepromatosa que tem predomínio de

células T CD8+ (Modlin et al. 1986). Contrariamente, foram observadas elevações na

expressão do RNA-m das IL-6, IL-8 e IL-10e expressão mantida do RNA-m das IL-4 e

IL-5 nas lesões de ENH, todas associadas com quimiotaxia de neutrófilos, produção de

anticorpos e redução da imunidade mediada por células (revisado por Guerra et al.

2002,).

Os principais fatores de risco para a ocorrência do ENH são: hanseníase LL,

índice baciloscópico acima de 4 (quatro), idade inferior a 40 (quarenta) anos e sexo

feminino (Manandhar et al. 1999, Foss et al. 2003). Outros fatores como a infiltração

cutânea difusa, gravidez e lactação, ciclo menstrual e primeiro sintoma da doença

durante a adolescência, devido às influências hormonais, também são aventados como

fatores de risco. A relação entre fatores hormonais e genéticos e a incidência de eritema

nodoso não foi ainda elucidada (revisado por Guerra et al. 2002).

Os seguintes fatores desencadeantes para o ENH foram descritos: doenças virais,

outras infecções, febre, vacinação e estresse psicológico, mas não há evidências

científicas convincentes. As reações tipo 2 aparecem mais frequentemente durante o

primeiro ano da PQT e por introdução de drogas como iodetos, brometos, dapsona,

71

rifampicina, claritromicina e ofloxacina (Foss et al 2003, Pocaterra et al. 2006). A

gravidez, lactação, ciclo menstrual, infecções intercorrentes, febre, vacinação e estresse

psicológico podem precipitar o aparecimento de eritema nodoso (Scollard et al. 1994).

1.11.3- O impacto das reações no manejo clínico da hanseníase

As reações hansênicas causam impacto significativo no curso clínico da

hanseníase por vários fatores, dentre os quais se destaca: a evolução flutuante e

espontânea destas reações que leva à deterioração do quadro clínico dos pacientes e,

como ocorre principalmente após o início da MDT, confundem os mesmos, causando

dificuldade na adesão ao tratamento. Além disso, a ocorrência frequente das reações

hansênicas no período pós-alta do tratamento específico confunde os pacientes,

comprometendo a aceitação de cura da doença. Estes episódios reacionais tardios

podem ser consequências da persistência bacilar nos tecidos e devem ser diferenciados

de quadros de recidiva da hanseníase. Adicionalmente, os episódios reacionais

exacerbam a inflamação nos nervos causada pela hanseníase, agravando o dano neural e

potencializando o surgimento de sequelas deformantes e incapacitantes, principais

responsáveis pela manutenção do estigma associado à doença. Como as reações

hansênicas, sobretudo o ENH, apresentam-se frequentemente como emergências

médicas, sendo importantes causas de atendimento médico ambulatorial e internações

hospitalares, esses eventos levam ao afastamento do trabalho e prejuízo na vida social

dos pacientes (Guerra et al. 2002).

1.12- Tratamento: Multidrogaterapia (ou PQT)

A terapia da hanseníase evoluiu do óleo de chalmoogra usado desde a

antiguidade atéa década de 1940, quando surgiu a sulfonoterapia. O tratamento era por

longos tempos, 10, 20 anos, ou até mesmo pela vida inteira e os pacientes eram

confinados em colônias. Em 1977 a OMS recomendou o tratamento com 3 drogas para

evitar resistência, a MDT. Na década de 1990, para fins operacionais, foi instituído pela

OMS, o uso de um sistema declassificação clínica simplificada, baseada na contagem do

número de lesões de pele, em serviços de saúde pública para fim terapêutico (WHO

1994a, WHO 1997, WHO 1998, Scollard 2004, Brasil/Ministério da Saúde 2005, Naafs

2006, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). Essa classificação subdivide os pacientes em

duas categorias: PB até 5 (cinco) lesões e MB mais de 5 lesões ou qualquer caso com

bacioloscopia positiva, sendo que o primeiro recebe medicação por 6 (seis) meses ou

72

seis doses e o segundo por 12 (doze) meses ou doze doses. O tratamento é feito com a

distribuição de cartelas padronizadas contendo a medicação (Brasil/Ministério da Saúde

2010a, revisado por Castorina-Silva 2013). Tabela 10 e figura 10.

Tabela 10. Apresentação das cartelas para o esquema padrão da OMS

(Poliquimioterapia/OMS). Brasil/Ministério da Saúde 2009.

Cartela PB Cartela MB

Cartela PB para criança

Cartela MB para criança

Figura 10. Cartelas com medicamentos dos esquemas padrões da PQT

(Poliquimioterapia/OMS) para adultos e crianças, PB e MB. Brasil/Ministério da Saúde

2009.

1.12.1- Tratamento: Multidrogaterapia nos adultos

O tratamento com a MDT para pacientes PB adultos consiste em uma

combinação da rifampicina (uma dose mensal de 600 mg com administração

73

supervisionada) e dapsona, (uma dose mensal de 100mg supervisionada) e uma dose de

100mg auto-administrada, diariamente. A duração do tratamento para pacientes PB é de

seis meses ou tomada de seis doses em 9 (nove) meses (WHO 1994; Brasil/Ministério

da Saúde 2009, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). Tabela 11.

O tratamento com a MDT para pacientes MB baseia-se emuma combinação de

rifampicina (uma dose mensal de 600 mg, com administração supervisionada), dapsona

(uma dose mensal de 300 mg com administração supervisionada e uma dose diária de

50mg auto-administrada) e de clofazimina (uma dose mensal de 100mg supervisionada

e uma dose diária de 100mg auto-administrada).A duração do tratamento para pacientes

MB é de um ano ou tomada de doze doses em até 18 (dezoito) meses (WHO 1994;

Brasil/Ministério da Saúde 2009, Brasil/Ministério da Saúde 2010a). Tabela 12.

Tabela 11. Esquema terapêutico utilizado para Paucibacilar: 6 cartelas

74

Tabela 12 – esquema terapêutico utilizado para Multibacilar: 12 cartelas

A alta por cura é dada após a administração do número de doses preconizadas

pelo esquema terapêutico, após exame dermato-neurológico para avaliar incapacidades

da doença (WHO 1994; Brasil/Ministério da Saúde 2009, Brasil/Ministério da Saúde

2010a).

Por ser um esquema terapêutico com associação de drogas poderá algum

paciente apresentar efeitos colaterais, intolerância a um medicamento ou mesmo

contraindicação. Neste caso, a portaria no. 3.125 de 7 de outubro de 2010, que

regulamenta a terapia da hanseníase no Brasil, prevê esquemas terapêuticos

substitutivos (Brasil/Ministério da Saúde 2010a).

1.12.2- Tratamento: Multidrogaterapia nas crianças e adultos com até 30 Kg

As doses devem ser reajustadas de acordo com o peso para crianças e adultos

com peso até 30 Kg. Tabela 13.

75

Tabela 13 – Dosagens dos medicamentos noesquema terapêutico utilizado para

crianças e adultos com peso inferior a 30 Kg.

1.12.3- Tratamento: Multidrogaterapia nas reações

O manejo adequado das reações interfe na incapacidade física que o paciente

poderá vir a ter em função destas. Desde o início, no momento do diagnóstico, o

paciente deverá receber orientações adequadas quanto a estas, para evitar a suspensão

da terapêutica ou geração de dúvidas quanto aos efeitos da mesma. Orientação quanto às

neurites, com imobilização, cuidado com olhos e traumas de extremidades devem ser

bem enfatizados, são os autocuidados para evitar sequelas. Pacientes com neurites

devem ser bem avaliados e monitorados para avaliação da necessidade de intervenção

cirúrgica, em casos de compressão e abscessos neurais (Brasil/Ministério da Saúde

2010a).

O tratamento de escolha para RT1 é a corticoterapia, com a prednisona na dose

de 1 a 1,5 mg/kg/dia e para RT2 consiste na administração de talidomida na dose de

100 a 400 mg/dia para pacientes do sexo masculino ou para mulheres que não estejam

em idade fértil (Brasil/Ministério da Saúde 2010a). Caso contrário, faz-se o uso de

corticosteroides (Talhari & Neves 1997, Guerra et al. 2002, Foss et al. 2003, Sampaio &

Rivitti 2011). Nas formas moderadas e graves do eritema nodoso hansênico, associa-se

a talidomida à corticoterapia sistêmica.

Outras drogas para esquema terapêutico alternativo, com efeito no tratamento da

reação tipo 2, são a clofazimina, pentoxifilina, azatioprina, metotrexate, zinco oral e

anticorpo monoclonal quimérico anti TNF – “Infliximab” (Talhari et al. 1995, Foss et

al. 2003, Scollard et al 2006, Brasil/Ministério da Saúde 2010a).

1.12.4- Tratamento: Métodos profiláticos e vacina

Em vários países do mundo tem sido realizada uma vacinação de rotina com

Mycobacterium bovis (BCG) para prevenir a infecção por M. leprae. A vacina BCG

76

confere proteção cruzada contra a hanseníase (Rodrigues 1992, Setia et al. 2006, WHO

2006, revisado por Richardus et al. 2013). Desde 1973 vem sendo utilizada no Brasil a

vacina BCG intradérmica, principalmente nos contatos intradomiciliares. A aplicação

segue normas da OMS e MS/Brasil, sendo feita em contatos intradomiciliares de PB e

MB, sem sinais ou sintomas da hanseníase (WHO, 1988, Brasil/Ministério da Saúde

2010a). Tabela 14

Tabela 14. Avaliação para aplicação do BCG

Estudos realizados em várias partes do mundo demonstraram que o BCG tem

maior variação na eficácia protetora para a tuberculose (0 a 80%), do que para a

hanseníase (20 a 80%).A vacinação BCG tem sido parcialmente eficaz em evitar a

hanseníase, porém estudos tem mostrado que o grau de proteção varia significativamente

entre os estudos (0-80%) e a proteção conferida pela vacina BCG declina ao longo do

tempo (Fine 1996, revisado por Lockwood 2001, revisado por Setia et al 2006). A

principal explicação para estas variações são fatores genéticos das populações estudadas.

Acredita-se também, que provavelmente esta variação seja atribuída em parte a efeitos

imunológicos de exposição a diferentes tipos de micobactérias ambientais.

No Brasil, em um estudo realizado em Goiás observou-se que a presença de

cicatriz de BCG, estava negativamente associada à hanseníase indicando um risco de 5,3

para aqueles não vacinados e o efeito protetor foi de 81%. A proporção de pacientes

paucibacilares que apresentavam cicatriz de BCG foi significativamente superior aos

pacientes multibacilares, sugerindo também variação da proteção de acordo com

diferentes formas clínicas da hanseníase (Rodrigues et al. 1992).

Em outro estudo brasileiro, os autores estimaram um efeito protetor do BCG para

a hanseníase em 90% para pacientes memores de 18 anos. Na região metropolitana do

Rio de Janeiro, Alvim et al. 1993, em estudo realizado em contatos, cujos casos índices

77

apresentavam as formas clínicas multi e paucibacilares da hanseníase, observou uma

proteção global de 59% (Lombardi et al. 1995).

Devido ao fato da vacinação BCG ter demonstrado eficácia apenas parcial em

evitar a hanseníase, alguns estudos têm pesquisado diferentes regimes de

quimioprofilaxia na tentativa de diminuir a transmissão da hanseníase. Um estudo

contatos domiciliares de uma ilha tomaram uma dose única de ROM enquanto que os

pacientes de outra ilha tomaram comprimidos placebos. Porém, o estudo mostrou, que

após cinco anos, que não havia diferença significativa na prevalência de hanseníase

entre contatos domiciliares que fizeram quimioprofilaxia com ROM e contatos que não

fizeram quimioprofilaxia (Bakker et al. 2006).

Alguns outros estudos relatam o uso da quimioprofilaxia com uma ou duas doses

de Rifampicina como possível proteção de populações com maior risco de adoecer de

hanseníase (Moet et al. 2004). Até o momento, os estudos têm mostrado uma eficácia

parcial em evitar o contágio da hanseníase (Bakker et al. 2006). Na nova estratégia

global de controle da doença proposta pela OMS para o período 2011-2015 é

recomendado que as áreas endêmicas avaliem o uso da quimioprofilaxia, de modo a

possibilitar acúmulo de experiência em diferentes contextos (WHO 2006). Em alguns

países do Mundo, estão sendo realizados estudos quimioprofiláticos para avaliar a

eficácia desta estratégia (Goulart & Goulart 2008, Penna et al. 2011, Richardus et al.

2013).

No Brasil oficialmente a quimioprofilaxia não está prevista, segundo a última

portaria que regulamenta a terapêutica da hanseníase (Brasil/Ministério da Saúde 2010a).

78

Em conclusão

Assim, no momento em que se discute a eliminação da hanseníase, as atenções

se voltam principalmente para as reações hansênicas, devido ao significativo impacto

social, econômico, no manejo clínico dos doentes e na demanda dos serviços de saúde

causado por esses episódios inflamatórios. Apesar dos significativos avanços no

conhecimento do genoma do bacilo, na imunopatologia e na quimioterapia da doença,

houve pouco impacto na conduta clínica das reações hansênicas. Nos últimos anos tem-

se buscado entender melhor o mecanismo imunopatológico das reações hansênicas.

Uma estratégia nova para a identificação de potencias células e seus produtos

envolvidos na imunopatologia dos eventos reacionais, com estudo “in situ”, de painéis

citocinas produzidos por estas células. Esses conhecimentos podem levar a novos testes

laboratoriais ou a novas opções terapêuticas. Assim, a definição de marcadores

imunológicos, moleculares ou endócrinos para o desenvolvimento de reações

hansênicas ou fatores prognósticos poderão contribuir para o manejo clínico desta

doença. A prevenção e o manejo das reações e neuropatias são considerados áreas de

pesquisa prioritárias pela Organização Mundial de Saúde na era da eliminação da

hanseníase.

A hanseníase é uma doença endêmica em nosso país e as reações hansênicas

representam sobrecarga nos serviços de saúde, uma vez que constituem em emergências

médicas que devem ser prontamente atendidas e tratadas, principalmente pelo risco de

acometimento neural e conseqüente desenvolvimento de sequelas incapacitantes

irreversíveis.

Nesse contexto, a presente tese de doutorado discute aspectos clínico-

epidemiológicos, histopatológicos e imunológicos das reações, mediante estudos em

pacientes com hanseníase da região metropolitana de Goiânia.

79

2. JUSTIFICATIVA

O objetivo do nosso trabalho foi investigar a expressão ‘in situ” de duas

populações celulares com importantes funções imunorregulatórias: mastócitos e Tregs,

com ênfase na hanseníase e reações hansênicas do tipo 1 e 2, comparando-as com outras

dermatoses e controles saudáveis. Uma vez que não existe nenhum modelo

experimental para hanseníase e, como o M. leprae nunca foi cultivado “in vitro” em

culturas axênicas, as lesões de pele continuam sendo extensivamente investigadas para

desvendar os complexos mecanismos e células envolvidos na imunopatogênese da

doença.

A justificativa da escolha da hanseníase, como modelo, se deve ao fato de ser

uma doença dermato-neurológica espectral complexa, na qual o sistema imunológico

desempenha papel fundamental determinando a forma clínica. As manifestações clínicas

polares tuberculoide e lepromatosa se apresentam com nítida dicotomia da resposta

imune Th1/Th2, respectivamente, sendo que formas intermediárias (borderline)

imunologicamente instáveis mesclam características imunológicas de ambos os polos.

Além da complexidade das manifestações clínicas, o curso crônico da doença pode ser

interrompido por manifestações imunoinflamatórias agudas que costumam deixar

sequelas neurológicas e motoras irreversíveis, se não forem prontamente diagnosticadas

e tratadas.

A escolha destas duas populações celulares como tema de estudo, se deve a

diversos fatores. Os mastócitos são células amplamente distribuídas no organismo,

sobretudo, na pele, e produzem uma ampla gama de substâncias biologicamente ativas.

Embora os mastócitos tenham sido descritos e conhecidos por sua participação nas

reações alérgicas imediatas, hoje se reconhece que seu papel é bem mais amplo que

inicialmente imaginado. Sabe-se que os mastócitos participam de diversos processos

cutâneos patológicos inflamatórios e não inflamatórios, como infeções, reparo de lesões

traumáticas e neoangiogênese de doenças malignas da pele. Os mastócitos afetam a

resposta imune promovendo inflamação ou suprimindo-a. As lesões de pele da

hanseníase contem todas as células presentes em pele normal incluindo os mastócitos e

diversos estudos mostram resultados conflitantes sobre o possível papel dos mastócitos

na hanseníase e nas reações hansênicas.

As células Treg representam uma população celular com funções supressoras e

quando ativadas, podem ter papel benéfico em doenças autoimunes, rejeição de

80

transplantes e reações alérgicas. Por outro lado, o efeito supressor das células Treg pode

ser deletério se este comprometer a imunidade antitumoral ou imunidade contra

microorganismos. Alguns estudos descrevem resultados controversos sobre o papel de

celulas Treg na hanseníase e nas reações hansênicas.

Desta forma, uma melhor compreensão sobre o papel destas duas populações

celulares imunorregulatórias em dermatoses humanas, incluindo a hanseníase e,

sobretudo, as reações hansênicas, poderão contribuir não só para o melhor entendimento

da imunopatogênese como indicar potenciais alvos ou abordagens terapêuticas para

estes episódios.

81

3. OBJETIVOS

3.1- Objetivo Geral

Investigar a expressão “in situ” dos mastócitos e das células Treg duplo postivas,

CD25 e Foxp3, na hanseníase e nas reações hansênicas, comparando-as com diversas

outras dermatoses e com peles normais.

3.2- Objetivos específicos

3.2.1- Investigar a presença dos mastócitos na hanseníase e suas formas

reacionias, comparando-as com diversas dermatoses com e pele normal;

3.2.2- Quantificar as populações dos mastócitos triptase e quimase positivas em

hanseníase, em diversas dermatoses e em pele normal;

3.2.3- Avaliar as proporções dos mastócitos íntegros e desgranulados nas diversas

manifestações clínicas da hanseníase;

3.2.4- Comparar as populações de mastócitos triptase e quimase positivos nas

diversas manifestações clínicas da hanseníase;

3.2.5- Avaliar os mastócitos nas reações hansênicas tipo 1 e 2;

3.2.6- Estudar populações de mastócitos triptase e quimase positivos nas reações

hansênicas tipo 1 e 2;

3.2.7- Investigar a expressão “in situ” de células Treg duplo positivas para CD25

e Foxp3 em lesões da hanseníase e suas formas reacionias, comparando-as

com diversas dermatoses com e pele normal;

3.2.8- Estimar a frequência de células Treg nas diversas manifestações clínicas da

hanseníase;

3.2.9- Avaliar o impacto das reações hansênicas na expressão das células Treg em

amostras pareadas coletadas na vigência e ausência de reações hansênicas

tipo 1 e 2.

82

4. APRESENTAÇÃO DOS MANUSCRITOS

Este trabalho de conclusão de doutorado esta apresentado em formato de artigos.

O primeiro manuscrito se refere às células T regulatórias (Treg): “In situ

expression of CD25+ Foxp3+ Regulatory T Cells in human skin diseases: leprosy and

leprosy reactions”, realizado em colaboração com o Hospital A. C. Carmargo,

Departamento de Patologia, chefiado pelo Prof. Dr. Fernando Augusto Soares.

O artigo 2 refere-se aos Mastócitos: “Mast cell heterogenity in human

dermatoses: in situ tryptase and chymase positive cells with emphasis on leprosy and

leprosy reactions”, realizado em colaboração com o Laboratório de Imunomorfologia do

Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas - IBILCE/UNESP de São José Rio

Preto – SP – Brasil, chefiado pela Profa. Dra. Sônia Maria Oliani.

Ambos os artigos já estão preliminarmente formatos para serem submetidos para

publicação. Estamos confiantes de que os resultados são atrativos para aceitação

epublicação em periódico indexado com alto fator de impacto.

83

5. RESULTADOS

5.1 Manuscript 1

IN SITU EXPRESSION OF CD25+ Foxp3+ REGULATORY T CELLS IN

HUMAN SKIN DISEASES: LEPROSY AND LEPROSY REACTIONS

Maurício B. Costa1, Aline A. Freitas1, Emerith M. Hungria1, Ana Lúcia O. M. Sousa1, Juliano Jampietro2, Fernando A. Soares2, Mariane M. A. Stefani1 1Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University of Goiás, Goiânia, Brazil. 2Hospital A. C. Camargo, CIPE - Centro Internacional de Pesquisa– São Paulo, São Paulo, Brazil. Abstract

T regulatory cells (Treg) expressing CD25 and Foxp3 have suppressive activity and have

been implicated in the regulation of a wide variety of pathological conditions including

antimicrobial immunity.Leprosy is a complex chronic, infectious dermato-neurological

disease that affects the skin and peripheral nerves especially during

immunoinflammatory episodes known as type 1/T1R and type 2/T2R reactions. Leprosy

skin lesions have been used to unravel its immunopathological mechanims. This study

investigated in situ expression of double stained CD25+ Foxp3+ Treg cells in 154 skin

biopsies from 114 participants with non-infectious and infectious skin diseases, with

special emphasis on leprosy type 1/T1R and type 2/T2R reactions. Three study groups

were investigated: 1. Leprosy (n=74): 56 T1R (28-paired biopsies reaction-

free/reactional, 28 single reactional biopsy), 18 T2R (12 paired-reaction-free/reactional,

6 single reactional biopsy); 2. Dermatoses: (n=29) infectious and non-infectious skin

diseases; 3. Normal controls: (n=11) skin fragment of healthy females that had cosmetic

mammoplasty.Double immunohistochemical detection of Treg cells was performed with

automated platform employing the ultra View Universal DAB detection kit for CD25

staining and the ultraView Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit for Foxp3

staining. Not one CD25+Foxp3+ Treg cell was seen in any normal skins while variable

numbers were detected in skin diseases; the number of cutaneousTreg cells was higher in

infectious diseases compared to non-infectious diseases. Treg cell counts in reactional

84

lesions were higher than counts in lesions of reaction-free leprosy patients. Paired

biopsies of reactional T1R or T2R and reaction-free lesions showed that difference in

Treg numbers was statistically significant for T1R that expresses higher numbers during

reactional episode. There was a trend in increasing Treg cell numbers from the

tuberculoid to borderline-lepromatous form which showed the highest median value of

Treg, however this difference was not significant. In conclusion higher Treg numbers seen

in T1R suggest Treg role in suppressing the exacerbated cell-mediated phenomenon that

causes T1R

Keywords: human skin diseases, T regulatory cells, CD25+ Foxp3+, leprosy, leprosy

reactions.

Introduction

T regulatory cells, formerly described as T suppressor cells in the late 70’s- early

80’s, returned in the mid to late 90’s as T regulatory cells (Tregs) following the

description of CD4+CD25+ T cells with suppressive activity that specifically expressed

the transcription factor Foxp3 (Gershon 1975; Sakaguchi 2004).Treg cells have been

implicated in the regulation of autoimmunity, transplant rejection, allergic diseases,

antimicrobial and anti-tumor immunity(Sakaguchi and Powrie 2007).Upregulation of

Treg cell function or increase in the numbers of Treg cells might be beneficial for treating

autoimmune diseases and allergies and for preventing allograft rejection. Conversely,

inhibiting Treg cell function or decreasing Treg cell numbers might boost immunity

against tumors and microorganisms. Tregs play a crucial role in the regulation of the

immune response to microbial antigens and may favor the persistence of pathogens

causing chronic granulomatous disease such as leishmaniasis and tuberculosis

(Campanelli et al. 2006; Guyot-Revol et al. 2006; Silva et al. 2009).

Treg cells are characterized by the expression of the transcription factor Foxp3

and the absence of Foxp3 in patients with immune dysregulation, polyendocrinopathy,

enteropathy X-linked (IPEX) syndromeor scurfy mice results in lack of functional Treg

cells (Clark et al. 1999; Torgerson and Ochs 2007). The majority of Treg cells express

high levels of CD25 (interleukin-2 IL-2 receptor α chain),suggesting a major influence

of IL-2 for the long-term maintenance and competitiveness of these cells and STAT5,

which is activated by IL-2, has been shown to be required for the maintenance of Foxp3

expression (Sakaguchi et al. 2006). Treg cells also express TGF, IL-10, cytotoxic T

85

lymphocyte–associated antigen (CTLA4), and glucocorticoid-induced TNF receptor

(GITR), which may play a role in their function (Burchill et al. 2007; Yao Z et al.

2007). Homing of Treg cells to inflammation sites is required for their suppressive

function (Schneider et al. 2007). The importance of cutaneous Treg cells for the

maintenance of immune homeostasis in the skin has been demonstrated in transfer

experiments using Foxp3-deficient scurfy mice in which reduced Treg cell accumulation

in the skin caused severe inflammation without other scurfy-associated symptoms

(Dudda et al. 2008).

Leprosy is a complex chronic, infectious dermato-neurological disease that

affects the skin and peripheral nerves and that can result in significant impairment of

nerve function and permanent deformities, which are the hallmark of the disease

(Scollard et al. 2006a). Although multidrug therapy (MDT) available since the 80’s has

reduced prevalence, incidence remains stable indicating an active transmission chain of

its etiologic agent, Mycobacterium leprae. Leprosy still represents an important public

health problem in many endemic countries, some of them with growing economies such

as India and Brazil (WHO 2013). The disease is characterized by a spectrum of clinical,

immunologic, microbiologic and histopathologic manisfestations in which

paucibacillary patients present low bacillary load and few lesions, and develop Th1 type

cell-mediated immunity (CMI) to M. leprae characterized by INF- production and low

antibody production. Multibacillary patients show multiple skin lesions, high bacillary

load, low or no specific CMI and vigorous antibody production(Scollard et al. 2006).

Some patients can also be immunologically unstable and change to any side of the

spectrum (Kumar et al. 2004).

One of the major complications in the clinical management of leprosy patients is

the development of acute inflammatory episodes during the chronic course of the

disease, either before, during or after the specific treatment. Type 1 reaction (T1R) and

type 2 reaction (T2R) represent the major cause of permanent physical disabilities and

deformities due to irreversible nerve damage they can cause (Scollard et al. 2006a). T1R

is associated with alterations in Th1 type CMI while T2R is associated with Th2 type

immunity with immune complex deposition and transient CMI activation (Walker and

Lockwood 2008).

M. leprae has never been cultivated in vitro in axenic cultures and there is no

experimental model for leprosy, therefore the best approach to investigate immunologic

mechanisms associated with protection and pathology is to use biopsies of human skin

86

lesions. This study aimed to investigate in situ expression of Treg cells in different

human skin diseases including non-infectious and infectious conditions with special

emphasis on leprosy and type 1 and type 2 reactions.

Methods

Study groups: Dermatoses, leprosy and normal controls

1. Dermatoses: This group included 29 patients with diverse skin diseases that were

recruited at a public health reference center (Centro de Referência em Diagnóstico e

Terapêutica, CRDT, Goiânia, Goiás State, central West Brazil) and the final diagnosis

was based on the clinical and histopathological findings. The dermatoses group

comprised: eczema (n=5), pityriasis rosea (n=1), pityriasis alba (n=2), granuloma

annulare (n=2), drug induced skin disorder (n=2), lupus erythematosus (n=2),

necrobiosis lipoidica (n=1), foreign-body granuloma (n=1) and urticaria (n=1), and

individuals with chronic infectious diseases as tinea (n=2), chromomycosis (n=1),

cutaneous leishmaniasis (n=5), paracoccidioidomycosis (n=3) and syphilis (n=1).

2. Leprosy: This group comprised 74 leprosy patients that developed a T1R or T2R

episode. These patients were selected from a cohort of 239 recently diagnosed,

untreated leprosy patients that were followed up during MDT to monitor the occurrence

of leprosy reactions. In this cohort, 74 out of 239 leprosy patients (74/239; 30.96%)

developed a reactional episode and were selected for this study: 56 cases of T1R and 18

cases of T2R. Most patients (n=61) were diagnosed during a reactional episode and 13

developed reaction during or after conclusion of MDT (2-19 months after diagnosis).

Leprosy patients were recruited at a public health reference center (Centro de

Referência em Diagnóstico e Terapêutica, CRDT, Goiânia, Goiás State, central West

Brazil). All patients were submitted to a complete dermato-neurologic examination by

one dermatologist with expertise in leprosy diagnosis (ALOMS) and patients had at

least one biopsy taken from a typical leprosy skin lesion. Leprosy patients were

classified according to Ridley & Jopling criteria taking into account histopathology,

bacilloscopic and clinical data. All leprosy patients classified as tuberculoid (TT) had

negative bacilloscopy and patients classified as borderline-tuberculoid included

individuals with either negative or low bacilloscopic index (BI), while patients

classified as borderline lepromatous (BL) and lepromatous individulas (LL) were BI

87

positive.

Forty reactional leprosy patients had two paired skin biopsies taken: one was collected

during the reactional episode and the other biopsy was collected when the patient was

not undergoing a leprosy reaction (T1R n=28, T2R n=12). Additionally, for another 34

reactional leprosy patients (T1R n=28, T2R n=6) only one biopsy, taken during the

reactional episode was available.

3. Normal controls: For ethical reasons no biopsies could be taken of normal skin from

healthy individuals. Therefore, exceeding fragments of normal skin from 11 healthy

females obtained during elective mammoplasty were used for standardizing the double

immunostaining reaction and as well as normal controls.

The detailed design of Treg study groups is shown in Figure 1. A total of 154

skin biopsies, taken from 114 participants were examined in this study and the main

features of participants are shown in Table 1, including the 40 reactional leprosy

patients (28T1R and 12 T2R) that had paired skin biopsies collected. Among leprosy

patients, male individuals predominated (74/49), while all normal controls were females

that underwent elective mammoplasty. The median age of patients with other skin

diseases and leprosy patients (unreactional and reactional) was similar (p=0.06).

Skin biopsies

Biopsies were taken with a standard dermatologic biopsy punch (4mm) of the

edges of well-characterized and infiltrated skin lesions and fixation was performed with

10% neutral buffered formalin in 4% formaldehyde for 24 hours. For leprosy patients,

3-4 µm sections of skin biopsies were stained by hematoxilin-eosin (HE) and by Fite-

Faraco for bacilli detection.

Double Immunohistochemical detection of CD25+Foxp3+ Treg cells

For the immunohistochemical study, skin biopsies were deparafinized (EZPrep,

Roche), treated with Cell Conditioner (Roche) and submitted to heat induced antigen

retrieval.Double immunostaining reaction to detect CD25/Foxp3 coexpression was

performed using an automated platform (Ventana BenchMark XT, Roche, Manhein,

Germany). The ultra View Universal DAB detection kit (Roche, Manhein, Germany)

was used for CD25 staining. The primary antibody–HRP labelled antibody complex

88

(anti-human monoclonal antibody, clone 4C9, Ventana, Roche, Tucson, AZ, USA)

visualized using DAB resulting in a brown/black target signal. Kit reagents comprise:

ultraView Universal HRP Multimer, ultraView Universal DAB Chromogen, ultraView

Universal DAB H202 and ultraView Universal DAB Copper. Foxp3 staining

employed anti-Foxp3+ antibodies (mice anti-human monoclonal antibodies, clone

236A/E7, Abcam, Cambridge, UK) and the ultraView Universal Alkaline Phosphatase

Red Detection Kit (Roche, Manhein, Germany) comprising the following reagents:

ultraView Red Alkaline Phosphatase, ultraView Red Enhancer, ultraView Red

Naphthol, ultraView Red Fast Red A and ultraView Red Fast Red B. The primary

antibody–alkaline phosphatase labelled antibody complex was visualised using Fast

Red/Naphthol resulting in a bright red target signal. Both DAB and alkaline

phosphatase detection kits are biotin-free multimer-based detection systems that

eliminate non-specific staining from endogenous biotin providing a clean background

for the sensitive and specific visualization of the targeted antigen being useful for the

detection of antigens present in low concentrations. Detection systems were optimized

for use on the VENTANA BenchMark XT, the staining procedures were followed

according to vendors’ instructions and all reagents were provided in pre-diluted and

ready-to-use form. Slides were then washed and Hematoxylin II (Roche, Manhein,

Germany) added, incubated, washed and the Bluing Reagent (Roche) was added and

washed. Slides were then processed by the automated Tissue-Tek® Prisma®/Film®

(Sakura, AJ Alphen aan den Rijn, The Netherlands).

Quantification of double immunostained CD25+Foxp3+ Treg cells was performed

using Nikon Eclipse E400 microscope (8 fields in 400X corresponding to 2mm2; values

were then divided by 2 to give counts in 1mm2). Quantifications of Treg positive cells

were done exclusively by one observer with vast expertise in dermatopathology (MBC.)

blinded to the participants’ clinical status (different forms of leprosy, reactional or

unreactional leprosy, other dermatoses, normal skin). Immunostained cells were

quantified both in areas with and without inflammatory infiltrates and double stained

Treg cells were visualized as brown/golden cytoplasm stained by anti CD25 revealed

with DAB and violet/magent nuclei stained Foxp3 revealed by alkaline phosphatase.

Statistical analyses

89

Exploratory data analysis, including dot plot, box plot, medians were used to

analyze the quantifications of Treg cells/mm2 among different study groups. Statistical

significance was assessed by Kruskall-Wallis one way analysis of variance for

comparison of multiple groups and Mann-Whitney for comparison between two groups.

Results were considered statistically significant when p-values <0.05 were obtained.

Ethical issues

This study was approved by the regional and national review boards (“Comitê

de Ética em Pesquisa Humana e Animal do Hospital das Clínicas da Universidade

Federal de Goiás”, protocol # 119/2005 and “Comissão Nacional de Ética e

Pesquisa/CONEP/Brasil”, protocols # 4862, 12962). All patients signed an informed

consent form.

Results

1. Skin CD25+Foxp3+ Treg cells in skin diseases and normal skin

Treg cell numbers were variable in different skin diseases and Tregcell counts in

lesions of different skin disorders (infectious and non infectious) versus leprosy were

similar (p=0.239) (Figure 2A). Therefore data on Treg cell counts in lesions of leprosy

and other dermatoses were grouped and compared to counts in normal skin. The

difference in Treg cell counts between skin diseases and normal skin was highly

significant (p<0.0001) (Figure 2B) as no CD25+Foxp3+ double stained Treg cell was

seen in any section of the 11 normal breast skins obtained from healthy females that

underwent elective mammoplasty (Figure 2C). Figure 2D depicts Treg cells in pityriasis

rosea lesion (67 Treg cells/mm2) and Figure 2D shows Treg cell in

paraccocidioidomycosis lesion (212 Treg cells/mm2). Double stained Treg cells in

different skin disorders are illustrated in supplementary figure 1.

2. CD25+Foxp3+ Treg cells in infectious and non-infectious skin diseases

Higher median values of Treg cells were seen in infectious skin diseases (n=86)

compared to non-infectious dermatoses (n=17) (Figure 3A) and this difference was

statistically significant (p= 0.008). However, when the infectious dermatoses were

analysed as two groups: leprosy versus other infectious dermatoses, no difference in

median values of Tregs was observed (p=0.157) (Figure 3B). Total Treg cells

90

countsamong infectious diseases were: 40 leprosy patients (mean = 45 Treg cell/mm2) , 2

tinea (mean = 1 Treg cell/mm2), 1 chromomycosis (total = 0Treg cell/mm2), 5 cutaneous

leishmaniasis (mean = 102 Treg cell/mm2), 3 paracoccidioidomycosis (mean = 212 Treg

cell/mm2), 1 syphilis (total = 71 Treg cell/mm2),Treg cell counts in non-infectious

diseases were: 2 granuloma annulare (mean = 3 Treg cell/mm2), 5 eczema (mean =

13Treg cell/mm2), 2 drug induced skin disorders (mean = 14 Treg cell/mm2), 2 lupus

erythematosus (mean = 147 Treg cell/mm2), 1 necrobiosis lipoidica (total = 108 Treg

cell/mm2), 2 pityriasis alba (mean= 0Treg cell/mm2), 1 urticaria (total = 0 Treg cell/mm2),

1 pityriasis rosea (total = 67Treg cell/mm2) and 1 foreign-body granuloma (total = 30

Treg cell/mm2). Double stained Treg cells in different skin disorders are shown in Figures

3 C-E: 3C) eczema, 3D) cutaneous leishmaniasis and 3E) syphilis skin lesion.

3. CD25+Foxp3+ Treg cells in different infectious-skin diseases and in leprosy

patients with T1R, T2R

Considering Treg cell numbers among leprosy patients, higher median value was

seen in reactional versus reaction-freelesions (p=0.002)(Figure 4A). When Treg cell

counts were stratified according to the type of leprosy reaction (T1R/T2R) and

compared to paired unreactional lesion, higher numbers were seen during T1R

(p=0.001) versus reaction-free lesions (Figure 4B-C). No impact on Treg cell numbers

was seen in paired T2R lesions compared to reaction-free samples (p>0.05) (Figure 4D-

E). Treg cells in paired biopsies samples from T1R/reaction-free are show in Figure 4F-

G Figures 4H-I show Treg cells in T2R/reaction-free lesions.

4. Treg numbers developed in naïve patients with reaction at diagnosis or during

MDT

In many cases, the diagnosis of leprosy occurs at the same time as the diagnosis

of a leprosy reaction and leprosy reaction can also occur during MDT or even years

after specific treatment. Previous studies have shown that M. leprae specific humoral

immune response declines after MDT and the same can occur with T cell responses. To

evaluate if MDT influenced Treg cell numbers in patients that developed reaction during

treatment, we have analysed Treg numbers in naïve patients for whom the diagnosis of

leprosy and of reaction coincided (no impact of MDT on immunity) (Figures 5 A and D

for T1R and T2R, respectively) and among patients that developed a leprosy reaction

91

during MDT (Figures 5B and E for T1R and T2R, respectively). These analyses have

shown that for T1R, Treg numbers were slightly higher during reaction developed during

MDT compared to reaction developed in naïve patients (Figure 5 C, p=0.047). For T2R,

Treg numbers were comparable despite treatment status (Figure 5F).

5. Treg cell numbers in different leprosy forms

Leprosy is a complex disease with several clinical manifestations associated with

bacilloscopic, histopathological and clinical features that were classically classified by

Ridley & Jopling. We then investigated if Treg cell expression differs among TT, BT,

BB, BL and LL leprosy lesions. In this regard, there was a trend in increasing Treg cell

numbers from the paucibacillary to the multibacillary pole, more specifically from the

tuberculoid to the borderline-borderline and borderline-lepromatous lesions which

showed the highest median values of Treg cells (Figure 6A, D-H). However, the

difference of Treg cellsamong leprosy forms was not statistically significant (p=0.80).

Since T1R was shown to impact Treg cells increasing cell counts, lesions of different

leprosy forms were analysed taking into account both leprosy form and the occurrence

of leprosy reaction. The same trend of higher number of Tregs from tuberculoid to

borderline-lepromatous form was observed for both reactional and reaction-free lesions,

however without reaching statistical significance (Figure 6B). Additionally when Treg

cell numbers were analysed among paucibacillary (n=16) and multibacillary leprosy

(n=63), similar median values were seen (Figure 6C) (p>0.05).

Discussion

The current study discloses data on CD25+ Foxp3+ double stained Treg cell

expression in 154 skin biopsies from different human dermatoses and normal skin. Our

results showed total absence of Tregs cells in normal skin contrasting with variable

values, sometimes very high, seen in skin diseases. A previous study on normal skin and

inflammatory dermatoses described similar frequencies of CD25+ Foxp3+ cells in

normal human skin as in diseased skin but the absolute numbers were significantly

lower in normal skin (de Boer et al. 2007). Rare CD25+ Foxp3+ cells were identified in

normal skin when compared to other skin diseases as psoriasis and eczematous

dermatitis (Fujimura et al. 2008). Tregs exert their suppressive role by suppressive

cytokine release requiring cell-cell contact, therefore in cutaneous infection or

inflammation Tregs need to be at the site of infection/inflammation to perform their role

92

rather than in the circulation. The preferential location of Tregs at the site of infection in

various diseases suggest an active role for Tregs, probably by limiting local effector

immunity and local inflammation. Moreover the rise of Tregs in infection sites such as

the skin suggest that Tregs can directly inhibit effector mechanisms used for pathogen

killing leading to persistent infection.

Another interesting finding from our study was the higher numbers of Treg cells

in infectious versus non-infectious lesions suggesting that homing of Treg cells to skin

lesions during infection is more pronounced than in non-infectious inflammatory

diseases that take place in the absence of a pathogen. Treg cells have been isolated from

lesions of different infectious skin diseases such as in leishmaniasis, fungal infections

and leprosy (Modlin RL et al. 1986; Campanelli et al. 2006; Cavassani et al. 2006).

These data indicate that Treg cells are attracted to sites of inflammation or infection

probably to exert their immunosuppressive or immunomodulatory roles. Treg cells are

known to protect against tissue injury in infectious diseases. After clearance of

pathogens they negatively regulate the immune response protecting against chronic

immunopathology related to chronic infections (Sakaguchi 2004; Sakaguchi et al. 2006;

Fujio et al. 2010). The mechanisms by which antigen-specific Treg cells achieve

suppression of effector cells are unknown.

In the 80’s CD4+ and CD8+ Tregs from human lepromatous patients both from

peripheral blood and skin lesions were isolated and cloned (Ottenhoff TH et al. 1896;

Modlin RL et al. 1986). After the revival of Treg cells, recent studies have investigated

Treg cells in leprosy with contradictory results and interpretations. Treg cells have been

identified in the circulation and in leprosy skin lesions. One study has used flow

cytometry to identify the frequency of CD25+ Foxp3+ Treg circulating in 38 leprosy

patients and 38 healthy individuals.Elevated circulating Tregs were seen in TT patients.

Patients with LL leprosy and T2R expressed lower frequency of Tregs suggesting a

detrimental role for Tregs in leprosy (Attia et al. 2011). In the current study we have

investigated 74 leprosy skin biopsies including 28 paired samples from T1R and 12

paired samples from T2R. Although a rising trend of Treg cell medians was seen from

paucibacillary tuberculoid lesions towards borderline lepromatous lesions, this

difference did not reach statistical significance. One possible explanation for the rising

trend in Treg numbers from TT to BL lesions and then a decline seen in multibacillary

LL is the requirement of IL-2 for Treg survival. Multibacillary LL forms are

characterized by weak or absent cell mediated immunity, therefore limited IL-2

93

production in LL is compatible with our findings. Another immunohistochemistry

study in a small group of leprosy cases (1TT, 3BT, 5BL, 5 LL, 1 T1R, 3 T2R) did not

find any difference of Foxp3+ cells among leprosy forms(Massone et al. 2010). Astudy

including lepromatous and tuberculoid leprosy and healthy M. leprae exposed contacts

showed CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood mononuclear cells stimulated in

vitro with M. leprae and CD25+Foxp3+double stained Treg cells were identified by

immunohistochemistry in leprosy skin lesions. Tregs were more frequent in situ in

lepromatous patients suggesting an association between their increased numbers and a

pathogenic role in multibacillary leprosy (Palermo et al. 2012). Recently, circulating

CD4+CD8+C25+Foxp3+ cells were investigated in 12 patients under 15 years with

multibacillary leprosy and 17 household contacts. Young mutibacillary leprosy patients

had greater CD4+ CD8+ Treg frequencies correlating with disseminated clinical disease

and suggesting their involvement in multibacillary leprosy (Fernandes et al. 2013). In

tuberculosis, Treg populations are mainly associated with active disease, particularly at

the site of infection probably contributing to the persistence of the pathogen (Chen et al.

2007; Guyot-Revol et al. 2006). It is possible that the conflicting results of Treg cells

seen in leprosy may be at least partially associated with the use of different

methodologies and cell markers to detect Treg cells in different compartments

(circulation versus skin lesions).

Our study provides important information about Treg cell participation in leprosy

reactions. The evidence of increased Tregs during T1R is compatible with the

immunopathogenic mechanism of T1R which is considered an exacerbation of cell

mediated immunity. The same trend of higher Treg in T1R was also seen in one patient

with T1R (Massone et al. 2010). However higher Foxp3 expression and lower

frequency of Tregs in the circulation was seen in T2R (Attia et al. 2011). The lack of

association between Tregs and T2R found in our study is also concordant with T2R

immunopathologic mechanism which is based on humoral immunity and lack or only

transient cell mediated immunity. Altogether our results suggest that the higher number

of Tregs during T1R seems to be beneficial rather than detrimental to the host and may

be associated with its immunomodulatory role to limit pathology. This finding raises

the possibility to modulate Tregs for T1R therapy.

Phenotypic identification of human Tregs is difficult because of the lack of

specific markers. Expression of Foxp3 is considered a prerequisite for Treg function, as

94

mutations in Foxp3 gene result in autoimmune diseases due to dysfunctional Tregs.

However in humans Foxp3 is expressed on natural Tregs and not all Foxp3+ cells are Tregs

(Morgan et al. 2005). Also, non Tregs can have transient expression of Foxp3 (Wang et

al. 2007). In our study, although we have not included CD4 cell marker, we believe that

the double stained CD25+ Foxp 3+ cells identified are indeed CD4+ Tregs. Although

CD8+ suppressor cells have been identified in lepromatous leprosy in the 80’s, up to

now no report has described CD8+ Tregs in leprosy (Ottenhoff TH et al. 1896; Modlin

RL et al. 1986). Tregs can be either natural CD4+ Tregs or inducible CD4+ or CD8+ Tregs

(induced by specific pathogen or derived antigens), however descriptions of human

CD8+ Tregs are scarce (Joosten and Ottenhoff 2008). We have used the CD25 marker for

Tregs which is the interleukin-2 receptor chain that is expressed at high levels on

activated T cells and Tregs, and previous study has shown that some CD8+ Treg

completely lack CD25 expression (Elrefaei et al. 2007). Moreover, phenotype and

effector molecules of CD8+ Tregs are unknown. In this study, we have used an automated

platform for the detection of double immunostained CD25+ Foxp3+ Treg cells which

provided consistent procedures and results. Another strength of our methodology was

the analysis and Treg counts performed by a single professional with vast expertise in

dermatopathology, therefore eliminating inter-individual differences. We acknowledge

that although we have used Treg counts cell count as an indirect indicator of functional

activity, only functional evaluation can assess Treg activity. Another challenge to

understand Treg cell function is the recent indication that Treg cells show some degree of

plasticity and can lose their suppressive function, especially under autoimmune and

inflammatory conditions (Noack and Miossec 2014). Developmental pro-inflammatory

Th17 and suppressive Treg cell pathways are reciprocally regulated and can influence the

outcome of immune responses in autoimmune and inflammatory conditions (Prakken B

et al. 2013).

Corroborating the assumption of a differential expression of Tregs upon infection,

we have observed that the level of Treg cell expression for infectious skin diseases was

similar, regardless of the etiologic pathogen. When leprosy, which is a dermato-

neurological disease, caused by M. leprae was compared to other infectious-dermatoses,

no difference in median Treg cell values was observed. Chronic infection with

Leishmania major has been shown to depend on antigen specific Tregs present on the site

of infection (Suffia et al. 2006). In the mouse model Leishmania major infection

promoted Treg cell accumulation in the dermis, where they probably regulated the

95

immune response preventing complete eradication of the parasite from the host in part

through IL-10 mediated mechanisms (Belkaid et al. 2002). In our study, leishmaniasis

skin lesions investigated showed variable number of Treg cells ranging from 70 to 223

cells/mm2. Treg cells have the capacity to shape the infection as shown for human

cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania guyanensis. Treg cells with suppressive

function accumulated in the early phase of acute lesions, decreased thereafter and

increased again in the chronic phase (Bourreau et al. 2009). The different frequency of

Tregs seen in leishmanisasis lesions from our study may represent lesions collected at

different stages of infection. In Kalazar, human visceral leismanisasis was not

associated with expansion or accumulation of CD4+ Foxp3+ cells in the spleen or blood

(Maurya et al. 2010) while Foxp3+ correlated with parasite burden in post kalazar

dermal leishmaniasis (Katara et al. 2011). The equilibrium established between effector

and regulatory T cells in sites of chronic infection probably reflect both parasite and

host survival strategies.

In conclusion, our study shows differential expression of Tregs in different

human skin diseases, contrasting to their absence in normal skin. The role of Treg cells in

infectious skin diseases was further substantiated by their higher numbers in infectious

compared to non-infectious disease, while among infectious dermatoses, no difference

was observed. The increased numbers of Treg cells seen during T1R is compatible with

its immunopathological mechanism and favors the hypothesis of a beneficial role

controlling exacerbated inflammation and lesion. In human infectious diseases Treg cells

may function like as a “double-edged sword” in which both the host and the pathogen

may benefit from their function: the pathogen because Tregs reduces effector immunity

and leads to disease chronicity and the host because Treg activity limits tissue damage

caused by inflammation and infection. Specific upregulation of Tregs during infection

may increase effector immunity and lead to pathogen clearance. Vaccine studies for

infectious diseases should incorporate knowledge on Treg induction and activity by both

the vaccine and the pathogen (Joosten and Ottenhoff 2008). The immunomodulatory

role of Tregs on skin infectious diseases is complex and multifaceted and certainly

depend on the type of the infection, the pathogen, and the immune response induced.

96

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99

Table 1. Main features of study groups.

Study groups Gender (M/F) Age Median (years) (range) Dermatoses (n=29) 15/14 51 (6-70) Normal control (n=11) 0/11 34 (16-55) Leprosy (n=74) 49/25 48 (20-75) PB (n=13) 06/07 41 (20-73) MB (n=61) 43/18 48 (20-75) T1R (n=56) 35/21 49 (20-75) T2R (n=18) 14/4 42 (20-71)

Figure 1. Design for Treg cell study.

100

Figure 2. A) Treg cell counts in skin biopsies of patients with leprosy and other

dermatoses. B) Treg cell counts in skin disorders (leprosy + dermatoses) and normal

skin. C) Absence of double stained CD25+ Foxp3+ Treg cells in normal skin from a

healthy individual submitted to elective mamoplasty. D) Double CD25+ Foxp3+ Treg

cells inpityriasis rosea skin lesion; E) Double CD25+ Foxp3+ Treg cells in a

paracoccidioidomycosis. Marks= 50 µm.

101

Figure 3. A) Treg cell counts in skin biopsies of patients with infectious dermatoses and

in patients with non-infectious dermatoses. B) Treg cell counts in skin lesions of

infectious dermatoses and leprosy. C) Double stained CD25+ Foxp3+ Treg cells in

eczema lesion; D) Double CD25+ Foxp3+ Treg cells in a cutaneous leishmaniasis; E)

Double CD25+ Foxp3+ Treg cells in syphilis skin lesion. Marks= 50 µm.

102

Figure 4. A) Treg cell counts in skin biopsies of paired biopsies reaction free/reactional.

B and C) Treg cell counts in biopsies of paired biopsies of patients with T1R and

reaction-free. D and E) Treg cell counts in biopsies of paired biopsies with T2R and

reaction-free. F) Double stained CD25+ Foxp3+ Treg cells in a reaction-freeborderline-

tuberculoid lesion; G) T1R lesion of the same patient depicted in Figure F during a

T1R; H) Double CD25+ Foxp3+ Treg cells in a reaction-free borderline-lepromatous

patient. I) T2R lesion of the same patient depicted in Figure I paired samples from

patients. Marks: 50m.

103

Figure 5. A) Treg cell counts in skin biopsies of paired samples from patients with T1R

at diagnosis and post-reactional. B) Treg cell counts in skin biopsies of paired samples

from patients with T1R during MDT and reactional-free at diagnosis. C). Treg cell

counts among T1R at diagnosis and T1R during MDT. D) Treg cell counts in skin

biopsies of paired samples collected during T2R diagnosis and post-reactional lesion.

E) Treg cell counts in skin biopsies of paired samples collected during T2R that occurred

during MDT and reaction-free at diagnosis. F) Treg cell count among T2R at diagnosis

and T2R during MDT.

104

Figure 6. A) Treg cell counts among different leprosy forms: TT, BT, BB, LL. B) Treg

cell counts among different leprosy forms: TT, BT, BB, LL during leprosy reactions

and in reaction-free lesions. C) Treg cell counts among paucibacillary and multibacillary

leprosy. D) CD25+ Foxp3+ Treg cells in tuberculoid leprosy. E) CD25+ Foxp3+ Treg

cells in borderline-tuberculoid leprosy. F) CD25+ Foxp3+ Treg cells in borderline-

lepromatous leprosy. G) CD25+ Foxp3+ Treg cells in lepromatous leprosy. Marks:

50m.

105

Figure supplementary 1. Double stained CD25+ Foxp3+ Treg cells in different human

skin diseases investigated: A) Lupus erythematosus. B) Paracoccidioidomycosis. C)

American cutaneous leishmaniasis D) Syphilis. Marks: 50 µm.

106

5.2 Manuscript 2

Mast cell heterogenity in human dermatoses: in situ tryptase and chymase positive

cells with emphasis on leprosy and leprosy reactions

Maurício B. Costa1, Aline A. Freitas1, Emerith M. Hungria1, Ana Lúcia O. M. Sousa1, Kallyne K. O. Mimura2, Sônia M. Oliani2, Mariane M. A. Stefani1 1Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University of Goiás, Goiânia, Brazil. 2Department of Biology, Institute of Biosciences, Letters and Exact Sciences, São Paulo State University (UNESP), São José do Rio Preto, São Paulo, Brazil.

Abstract

Background: Mast cells (MCs) have regained interest due to their immunoregulatory

role in several pathophysiological processes including skin inflammation by the

production and secretion of a plethora of biologically active molecules. Tryptase (try)

and chymase (chy) granule serine proteases are phenotypic markers of MCs and

try+chy+ MCs predominate in human skin.This study investigated MCs heterogeneity in

human dermatoses with especial emphasis on leprosy and type 1/T1R and type 2

leprosy reactions/T2R. Methods: Eighty skin biopsies from 3 groups were investigated:

40 newly diagnosed untreated leprosy patients (18 reaction-free, 11 T1R, 11 T2R), 29

patients with other dermatoses and 11 normal skin. Toluidine blue stained intact and

degranulated MC counts/mm2, streptavidin-biotin-peroxidase immunostaining was used

to detect try+and chy+ MCs and their density (median optical density) was evaluated

(Axiovision software, Zeiss Axioskop 2, Carl Zeiss, 63X). Statistical significance of

medians was assessed by Kruskall-Wallis and Mann-Whitney (p<0.05). Results:

Infectious and non-infectious skin lesions showed higher numbers of degranulated than

intact MCs in leprosy and other dermatoses, compared to normal skin. The numbers of

degranulated MCs were higher than intact MCs regardless of the leprosy form (from

tuberculoid/TT to lepromatous/LL), regardless of the occurrence of leprosy reactions

(reactional and reaction-free) and regardless of the type of reaction (T1R/T2R). Try+

MCs numbers and density were higher than chy+ MC in normal skin, in leprosy, in

reaction-free and reactional leprosy particularly in T2R, but not in other dermatoses.

Conclusions: Overall results indicate differential expression/ activation of try+ and

107

chy+MCs subsets in leprosy compared to other skin diseases and to normal skin.

However, neither leprosy form nor leprosy reaction was associated with MCs changes

in lesions suggesting that the Mycobacterium lepraeinfectious process itself dictates

MCs expression in leprosy skin lesions.

Key words: mast cell, tryptase, chymase, leprosy, skin diseases

Introduction

Mast cells (MCs) represent one of the most versatile cells in the body and in the

skin due to their ubiquitous distribution and the plethora of biologically active

molecules they produce[1]. Although MCs have been classically associated with

allergic responses, they have been shown to have a much broader role participating in

diverse pathological processes of cutaneous inflammatory and non-inflammatory

diseasesandthey can affect the immune system, promoting inflammation or even

suppressing it. MCs are typically associated with connective tissues surrounding blood

vessels, lymphatic structures, skin appendages and nerves and they are located at the

upper dermal skin, respiratory tract and bowel mucosa which are sites where the host is

exposed to external antigens, allergens, toxins and microbes[2, 3].

Human tissue MCs can express several neutral granule proteases, which

represent the best phenotypic markers of MCs heterogeneity. Based on the protease

content of their granules at least two subpopulations of cells can be differentiated:

connective tissue mast cells that contain tryptase and chymase (try+chy+ MC), and

mucosal mast cells that contain only tryptase (try+ MC) andalso mast cells positive to

chymase only have been described (chy+ MC) [4, 5]. Almost all MCs in the human skin

belong to the try+chy+ MCpopulation, whereas try+ MC predominate in the lung and

bowel mucosa [6]. Pre-formed mediators stored in MCs secretory granules include

different proteases, histamine, heparin proteoglycan, chondroitin sulphate E, acidic

hydrolases, various cytokines and growth factors. Moreover, after activation, MCs can

secrete newly-synthesized mediators, includingprostaglandin D2, leukotriene C4, and

several cytokines, chemokines and growth factors. In addition, MCs can express cell

membrane receptors and ligands. These molecules can modulate the immune system in

the skin, e.g in psoriasis, atopic dermatitis and epithelialcancers and can regulate

cutaneous wound healing after traumaand neoangiogenesis of malignancies[7–9]. MCs

are known to undergo slow and partial degranulation after activation and other

mechanisms such as exosome secretion and selective degranulation-independent

108

mediator secretion have been described [10–13].

Leprosy is a granulomatous, dermato-neurological disease caused by

Mycobacterium leprae that represents an important public health problem in many

endemic countries, some of them with growing emerging economies as India and Brazil

[14].Leprosy shows a wide spectrum of clinical manifestations which depend on the

immune response to the pathogen ranging from few localized skin lesions in

paucibacillary (PB) diseasewith Th1 type cell mediated immunity (CMI), to

disseminated multibacillary (MB) disease characterized by Th2 humoral immunity[15].

During the chronic course of leprosy, before, during or after treatment, some patients

can develop acute immune inflammatory episodes known as leprosy type 1 and type 2

reactions (T1R, T2R). Leprosy reactions represent a major challenge for patients

management because if not promptly treated, they can lead to irreversible nerve damage

and consequent paresthesia, hypoesthesia or paresia[15].Leprosy reactions are

characterized by an increase in the immune response with augmented levels of

cytokines such as TNF-α, IL-1β, IFN-γ and IL-12 [16–18].

Leprosy skin lesions contain all the cells that are present in normal skin and also

cells that migrate from the peripheral blood as a consequence of the granulomatous

response, including MCs. The data about MCs in leprosy skin lesions are controversial

however the majority of studies indicate increased number in lepromatous lesions [19–

23]. In order to understand the heterogeneity of MCs in human dermatoses, this study

investigated tryptase and chymasesubsets of MCs in normal skin and several dermatoses

with especial emphasis on leprosy skin lesions and type 1 and type 2 leprosy reactions.

Methods

1. Study groups

This study investigated the expression of MCs in 80 skin biopsies from three

different study groups: leprosy, other skin diseases and normal skin. Forty newly

diagnosed, untreated leprosy patients were recruited at the main regional public health

center for leprosy diagnosis and treatment (Centro de Referência em Diagnóstico e

Terapêutica/CRDT in Goiânia, Goiás, Central Western Brazil) in a highly endemic area

for leprosy. Patients were submitted to complete dermato-neurological examination by

one single physician with expertise in leprosy diagnosis (ALOMS). After signing

109

informed consent, skin biopsies were obtained from the active edges of leprosy skin

lesions.

Leprosy patients were classified according to Ridley & Jopling criteria as

tuberculoid/TT, borderline-tuberculoid/BT, borderline-borderline/BB, borderline

lepromatous/BL, lepromatous/LL, taking into account clinical, bacilloscopic index (BI)

and histopathologic findings [24]. Leprosy group comprised 14 paucibacillary patients

(TT and BT- BI negative) and 26 multibacillary patients (BT, BL and LL- BI positive).

Among 40 leprosy patients 18 were reaction-free patients and 22 had leprosy reactions,

11 had type 1 reaction and 11 had type 2 reactions.

An additional group of 29 patients with other skin diseases was recruited at the

same reference center and were diagnosed according to histopathology findings: eczema

(n=5), pityriasis rosea (n=1), pityriasis alba (n=2), granuloma annulare (n=2), drug

induced skin disorder (n=2), lupus erythematosus (n=2), necrobiosislipoidica (n=1),

foreign-body granuloma (n=1) and urticaria (n=1); individuals with chronic infectious

diseases as tinea (n=2) chromomycosis (n=1), cutaneous leishmaniasis (n=5),

paracoccidioidomycosis (n=3) and syphilis (n=1).

For ethical reasons no biopsies could be taken from normal skin or from healthy

individuals. Normal skin by macroscopic and microscopic criteria was includedas

control (n=11); these skin biopsies were taken from contralateral skin for

histopathologic comparisons of certain skin diseases as scleroderma and vitiligo.

Exclusion criteria used in this study were: patients under 18 years old, pregnant

patients, co-morbidities as AIDS, tuberculosis and diabetes mellitus.

This study was approved by the regional and national review boards (Comitê de

Ética em Pesquisa Humana e Animal do Hospital das Clínicas da Universidade Federal

de Goiás – protocol# 119/2005 and Comissão Nacional de Ética e

Pesquisa/CONEP/Brasil – protocols # 4862 e 12962). All patients signed an informed

consent form.

Main features of study participants (Table 1) indicate that males predominated

among leprosy patients and controls but patients with other dermatoses were mainly

females. Age of participants (leprosy patients, other dermatoses and controls) was

similar (p=0.730).

110

2. Histopathological analysis

Skin biopsies were taken with a standard dermatologic biopsy punch (4mm) of

the edges of well-characterized and infiltrated skin lesions and fixation was preformed

with 4% neutral buffered paraformaldehyde for 24 hours. For leprosy patients, 3-4 µm

sections of skin biopsies were stained by hematoxilin-eosin (HE) and by Fite-Faraco for

bacilli detection and used for the Ridley& Jopling classification. Histopathologic

features of different human skin diseases investigated in this study (lupus

erythematosus, american cutaneous leishmaniasis, paracoccidioidomycosis, syphilis and

leprosy) are shown in Figure 1 (A-F).

Toluidine blue stained sections (0.5% in alcohol) were used for quantitative analysis

of intact and degranulated mast cells. Intact mast cells were identified by metachromatic

granules in the cytoplasm and degranulated mast cells were identified by the reduction

of density in cytoplasmatic granules [25]. MCs were identified using ZEISS-

AXIOSKOP 2 (ZEISS, Jena, Germany). Photographic digital images of 1.0 mm2 (27

fields/section) were obtained by the Software AXIOVISION using a high power

objective (40X, ZEISS,Jena, Germany) and analysed by two independent observers

(KKM and MBC) with expertise in MCs morphology/analysis,blinded to the

participants clinical status (different forms of leprosy, reactional or reaction-free

leprosy, other dermatoses, normal skin) and comparable cell counts were obtained

(p=0.63). For each stain, two separate counts were performed. For the intralesional

count, the entire area of the skin lesion was scanned, and the immunopositive cells as

well as the number of fields were recorded. For the perilesional count, only the fields of

view along the interface between the lesion and its neighbourhood were chosen, and

then the number of positive cells and fields were recorded.

3. Immunohistochemical analysis

All skin biopsies from leprosy patients, other dermatoses and normal controls

were submitted to streptavidin-biotin-peroxidaseimmunostaing method to detect

tryptase and chymase positive MCs. Briefly, deparafinized, rehydrated skin biopsies

were submitted to heat induced antigen retrieval (citrate buffer, pH 6, 96ºC, 20 minutes)

endogenous peroxidase was blocked (3% hidrogen peroxidase, 30 minutes). After

washes the diluted primary antibodies, mouse monoclonal anti-human tryptase

(AA1;1:1000; Dako, Glostrup, Denmark) or mouse monoclonal anti-human chymase

111

(1:100; Abcam, Cambridge, UK) was incubated (16 hours, 4ºC), washed when the

biotinilated secondary antibody and the peroxidase-streptavidin complex were added,

incubated and revealed by 3,3-diaminobenzidine (DAB). All sections were

counterstained with Harris Hematoxiline. For the negative control, the primary antibody

was not added, while positive controls consisted of sections of normal small intestine

mucosa which are rich in MCs and were used to validate immunostaining techniques.

4. Densitometry analysis

The density of expression of tryptase and chymase in theMCs was calculated

assessing 20 tryptase/chymase positive cells in each sample/section using Axiovision

software (Zeiss Axioskop 2, Carl Zeiss, Jena, Germany, and 63 X)in three different

areas/cell and was expressed as value of the mean optical density (MOD) in

immunoreactive areas.

5. Data analysis

Exploratory data analysis, includingmean, medians and standard deviation (SD)

(GrafhPad Prism 6and MS Excel, 2010) was used to analyze the quantifications of

degranulated and intact MC and try+ and chy+ positive MC/mm2 among different study

groups. Statistical significance was assessed by Kruskall-Wallis one way analysis of

variance for comparison of multiple groups and Mann-Whitney for comparison between

two groups.

Results

1. Mast cells activation

Toluidine blue staining counts of total, intact and degranulated MCs in leprosy,

skin dermatoses and normal skin sections (Figure 2 A-D) showed statistically

significant differences (p=0.001).Higher numbers of total MCs were seen in normal skin

compared to skin disorders (dermatoses and leprosy). Quantification of total MCs was

diferent between all groups: leprosy vs dermatoses (p=0.007), leprosy vs normal

controls (p<0.0001) and dermatoses vs controls (p=0.015). Differences in numbers of

intact MCs among groups were statistically significant (p<0.0001) and the highest

numbers were observed in normal skin, followed by dermatoses. Leprosy lesions

112

presented the lowest numbers of intact MCs (leprosy vs controls p<0.0001, leprosy vs

dermatoses p=0.007 and dermatoses vs controls p=0.017). Higher numbers of

degranulated MCs compared to intact cells were seen in dermatoses and in leprosy. The

highest numbers of degranulated MCs were observed in leprosy lesions (p<0.0001),

followed by dermatoses (p=0.001). In normal skin, no statistically significant difference

was found between intact and degranulated MCs.

2. Tryptase and Chymase positive mast cells in leprosy, dermatoses and normal

skin

Heterogeneity of immunostained try+ and chy+MCs was compared in leprosy,

other dermatoses and normal skin (Figure 3 A-H). The numbers of try+ MCs were

similar in all groupswhereas counts of chy+ MCsdiffered (p=0.015) (Figure 3A).In

leprosy lesions, the numbers of try+ MCs were higher than chy+ MC (p<0.0001) and the

same trend was seen in normal skin (p=0.003). In other dermatoses the numbers of try+

and chy+ positive cells were similar. Densitometric analysis of chymase and tryptase

positive cells confirmed differences identified by cell counts among groups (p=0.0001)

(Figura 3B).

Tryptase positive MC differed inleprosy vs dermatoses (p=0.011) and leprosy vs

controls (p=0.009). Densitometric analysis of chymase expression was also different

among groups (p=0.018) and the only statisticallysignificant difference was detected in

leprosy vsnormal controls (p=0.008). Within each group densitometric analyses of

tryptase and chymase were different in leprosy lesions (p=0.010) and controls (p=0.007)

while no difference was observed in the dermatoses group (Figure 3B).

3. Mast cells in leprosy lesions

3.1 TT, BT, BL, LL leprosy forms

Toluidine blue staining in leprosy lesions showed higher numbers of

degranulated than intact MCs in TT, BT, BL and LL (Figure 4A); difference of

degranulated and intact cells was significant in TT, BT and LL forms. Higher numbers

of try+ than chy+ MCs were seen in TT, BT, BL, LL leprosy forms and statistically

significant within TT and LL lesions (Figure 4B). Densitometric analysis of tryptase

and chymase expression was similar in all leprosy forms, in MB (BT, BL,LL) vs PB

(TT,BT) leprosy (data not shown).

113

Within leprosy skin lesions intact mast cells stained by toluidine blue and

tryptase and chymase MCs were seen in the interstice, close to blood vessels; more

often inside the inflammatory infiltrates and perianexial region. In leprosy granulomas

MCs were identified more frequently in the lympho-histiocytic mantle than in the

center.

3.2 LeprosyType 1 and Type 2 reactions

Within reactional and reaction-free lesions (Figure 5A) the numbers of

degranulated MCs were higher than intact cells and in both groups this difference was

significant but the numbers of intact MC were higher in reactional than reaction-free

patients. This trend of higher numbers of degranulated MCs than intact cells was

maintained both in T1R and T2R lesions (p<0.050); intact and degranulated cell counts

were similar between T1R and TR2. Try+ MCs numbers were higher than chy+ MCs

both in reactional and reaction-free lesions (p<0.05). The same pattern was seen in T1R

and T2R with higher numbers of try+ than chy+ MCs (p=0.040 and 0.006 respectively)

however the difference was more pronounced in T2R (Figure 5B).Densitometric

analysis showed that the expression of tryptase positive and chymase positive MCs in

T2R was borderline (p=0.048) (Figure 5C).

Discussion

This study perfomed among 80 participants from three different study groups

(leprosy, dermatoses and normal skin) shows the differential expression of MCs in

diverse human skin diseases including leprosy and reactional episodes. MCs have

recently regained interest as important immunomodulators in a wide variety of

processes, including allergy, infectious and auto-immune diseases, cancers, venom

reactions by insect sting and snake bite and in cutaneous wound healing after

trauma[26–29]. In this study, emphasis was given to leprosy and MCs due to precedent

evidence of cutaneous involvement of MCs in skin protection or pathogenesis in

leprosy and other parasitic and bacterial infections [30–32] . Moreover MCs can recruit

cells of the immune system,like T cells, neutrophils and eosinophils to the inflammatory

site in the skin and they can stimulate maturation of Langerhans cells and dendritic cells

and their migration to lymphnodes [1]. Leprosy is a dermato-neurological disease in

which the clinical manifestations are closely associtated to the type of immune response

114

developed by the host. Moreover, the chronic course of leprosy can be interrupted by

immune-inflammatory episodes known as leprosy reactions, which can lead to

irreversible nerve damage[15]. Given the inflammatory properties of MCs and the

immune-regulated manifestations of leprosy and of reactional episodes, it is expected

that MCs may play an important role in leprosy skin lesions. In fact, results presented in

this study indicate an active role for MCs as indicated by the presence of degranulated

cells and mast cell proteases identified.

MCs exert their physiological and pathological activities by releasing granules

containing histamine, cytokines, chemokines, and proteases, including mast cell-

specific chymase and tryptase. Degranulation of MCs contents implies not only

activation but also functional activity [1]. In the current study, as expected, infectious

and non-infectious inflammation in the skin led to higher numbers of degranulated MCs

in leprosy and other dermatoses compared to normal skin. Moreover, taking leprosy as

our study model, the numbers and the density of degranulated MCs were higher than

intact MCs regardless of the leprosy form (from TT to LL), regardless of the occurrence

of leprosy reactions (reactional and reaction-free) and regardless of the type of reaction

T1R/T2R. Therefore leprosy and markers of MCs activation were seen in all forms of

leprosy, paucibacillary (TT,BT) and multibacillary (BT, BL,LL) and no association of

bacillary load and mast cell degranulation was found (data not shown). Moreover,

although leprosy reactions are characterized by exacerbated inflammation in skin

lesions (and nerves), degranulated MCs outnumbered intact cells both in reactional and

reaction-free patients. Altogether these data indicate that MCs degranulation and

functional activity are increased in skin disorders, particularly leprosy, independently of

reactional episodes.

Other studies using different methodologies identified higher numbers of MCs in

lepromatous compared to tuberculoid lesions [20–22]. Reduced MCs stained by HE

were observed in reactional versus reaction-free patients [33]. Several factors may

account for differences in results obtained. MCs are difficult to visualize on routine

stains, and they can be often confounded with other inflammatory cells. The toluidine

blue is considered a classical stain and can differentiate degranulated and intact MCs.

Since MCs maturation is based on heparin content, granule and size of the MCs, mature

MCs are more easily identified in tissues than immature MCs due to their scarcity of

secretory granules [34, 35]. Moreover, different methods of MCs identification and

protocols for quantifications of MCs probably concur to controversial results described

115

in leprosy. Additionally some of the studies have investigated a very small number of

patients.

Serine proteases are the major protein constituents within MC secretory granules

and these proteases are subdivided into chymases and tryptases depending on their

primary cleavage specificity [5]. Proteases released by skin MCshave a specific function

by degrading different proteins and peptides. Therefore, many MCs derived products

such as tryptase and chymase can, through their enzymatic action, have detrimental

effects on tissue structure/ modeling while MC derived mediators such as cytokines and

chemokines can perpetuate inflammation. The role of MCs in skin diseases can be

directly related to their granule content and our results revealed changes in the

expression of some mast cell-specific proteases as chymase and tryptase in leprosy and

reactions indicating that these proteases probably exert their enzymatic function in

leprosy lesions. Tryptase is a neutral tetrameric serine protease of 134 kD composed of

four monomers of 32 to 34 kD, each with one catalytic site [36]. Tryptase is the most

abundant protein component of human MCs, which store it with full enzymatic activity

in the secretory granules of all types of human MCs. MCs degranulate upon activation

and release both histamine and tryptase together because tryptase is present in secretory

granules in a complex with heparin proteoglycan [4]. The half life of tryptase in the

circulation is longer than histamine, therefore tryptase has been used as a precise

clinical marker of mast cell activation in systemic diseases as anaphylaxis and asthma

[37]. Tryptase can have multiple functions stimulating smooth muscle, fibroblasts, and

tissue turnover indicating that its enzymatic activity can be a therapeutic target via a

putative inhibitor as indicated in a sheep model of human asthma [38]. Recent data

indicate that MCs tryptase can have both stimulatory and inhibitory functions in skin

inflammation and inhibitory function has been associated with its capacity to cleave

eotaxin and RANTES, capacity to cleave neuropeptides and cathelicidin LL-37

(reviewed in 1).

In leprosy, the relationship between tryptase MC and nerve fibrosis was

investigated and an association between collagen increase and MC density in the

epineurium, and not in the endoneurium, was observed [39]. These results suggest that

MC contribute to collagenization in leprosy through tryptase secretion. In our study the

numbers and the density of try+ MC were higher than chy+ MC in all leprosy forms

(from TT to LL) and both in reaction-free and reactional lesions, especially in T2R.

These results differed from other dermatoses. A previous double staining study of

116

try+/chy+ MC detected two populations of MC try+/chy+ and try+ chy- in leprosy

biopsies [40]. Although in our study double tryptase, chymase immunostaining was not

performed in skin biopsies, where try+ MC and chy+ MC predominate, our data show

that the higher tryptase count than chymase and density indicates its selective

expression in leprosy lesions.

Try+ MC were significantly elevated in T2R which can be associated with

vasculitis and evidence from cancer biology have revealed that MCs regulate

angiogenesis through the production of vascular endothelial growth factor (VEGF) and

release of proangiogenic proteases. A previous study from our groupsearching for

plasma markers of T1R and T2R used multiplex approach to measure 27 plasma factors

including VEGF. For T2R the difference between reactional cases and reaction-free

controls was marginally significant for VEGF (p=0.06) [41]. An increase of try+ MC in

reactional biopsies compared to pre-reactional lesions has been previously reported

[40]. Our results of higher try+ MC counts and density compared to chy+ MC in all

leprosy forms, differ from the lower numbers of MC detected in LL leprosy [30].

In our study the numbers of chy+ MC were higher in dermatoses than in leprosy

and normal skin and numbers of chy+ MC were similar in leprosy and normal skin.

These results indicate that chy+ MC may have a more relevant participation in other skin

diseases compared to leprosy. In fact chy+MC may be involed in skin lesions by

different mechanisms. Chymase is protease mainly located in MCs granules and it has

previously been demonstrated to be activated in tissue fibrosis, which may be more

pronounced in the other dermatoses compared to leprosy [42–44]. Chymase has also

been shown to be involved in tissue matrix remodeling due to its ability to activate

procollagenase and degrade the extracellular matrix [45, 46]. Leprosy lesions mainly TT

and LL show important differences in dermal collagen content, which may be attributed

to different MCs subpopulations and products released [47]. Moreover, chymase

contributes to the release of anti-inflammatory TGF-β1 from its precursor and it is also

able to convert inactive interleukin-1β, a proinflammatory cytokine, to its active form.

Human chymases can activate matrix metalloproteinases, produce angiotensin II, and

induce endothelial cell and smooth muscle cell apoptosis [48–50]. Besides its

proinflammatory capacity, chymase can regulate inflammation by degrading IL-6 and

IL-13 and also TNF-α (reviewed in 1). A previous experimental study showed that

MCchymase played a role in the normal wound healing process measured by the size of

the burn wounds, the density of the capillaries, collagen accumulation and mast cell

117

number and chymase activity [51]. It is possible that MCchymase may also be

participating in wound healing processes in both leprosy and other dermatoses.

Immunohistochemistry for MC proteases as tryptase and chymase is considered

a specific and sensitive approach for assessing mast cells in tissues. However, chymase

detected in a subset of MCs only and try+ chy+MCs predominates in human skin. The

MC quantifications data in our study has been validated by two independent experts in

dermatopathology that have used precise anti-tryptase and anti-chymase

immunostaining methods for identification of MC subsets. We acknowledge that we

have used only indirect evidence of mast cell activation such as degranulation and

protease content and that evaluation of functional activity, which was not performed in

this study, may be more important than their overall numbers in skin lesions.

Conclusions

The present study shows differential mast cell expression and try+ and chy+

subsets in leprosy and dermatoses compared to normal skin. The potential role of MC in

these pathologic processes is justified by the multitude of biologically relevant

molecules they produce and secrete. Furthermore, we observed that for leprosy,

evidence of mast cell activation assessed by degranulation and tryptase expression

seems to be triggered by the infectious process and is not influenced by the leprosy form

(form TT to LL), nor the occurrence of leprosy type 1 and type 2 reactions.

List of abbreviations

BB: Borderline-borderline; BL: Borderline-lepromatous; BT: Borderline-tuberculoid;

Chy: chymase; DE: other dermatoses; F: Female; HE: hematoxilin-eosin; IB:

bacilloscopic index; IFN:interferon gamma; IL: Interleukin; LL: lepromatous; M:

Male; MB: multibacillary; MCs: mast cells; mm2: square millimeter; MOD: mean

optical density;NC: normal controls; PB: paucibacillary; SD: standard deviation; T1R:

type 1 reaction; T2R type 2 reaction; TGF: transforming growth factor; Th1: T helper 1;

Th2: T helper 2; TNF:tumor necrosis factor; Try: Tryptase; TT: tuberculoid; VEGF:

vascular endothelial growth factor.

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.

118

Author’s contributions

MBC participated in the design of the study, carried out the histopathological analysis,

immunohistochemical analysis, densitometry analysis and drafted the manuscript. AAF

and EMH participated in the field work, performed the statistical analysis and drafted

the manuscript. ALOMS participated in the field work in the diagnosis of leprosy

patients. KKOM carried out the histopathological analysis, immunohistochemical

analysis, densitometry analysis and performed the statistical analysis, SMO participated

in the design the study, coordinated the field work and analyzed the data. MMAS

conceived, designed the study, coordinated the field work, analyzed the data and

contributed to write the manuscript. All the authors read and approved the final

manuscript.

Author’s information 1 Tropical Pathology and Public Health Institute, Federal University of Goiás, 235th

Street, Setor Universitário, Goiânia-Goiás, Brazil. 2Department of Biology, Institute of Biosciences, Letters and Exact Sciences, São Paulo

State University (UNESP), São José do Rio Preto- São Paulo, Brazil.

Acknowledements

This study was supported by American Leprosy Missions.

Dr. Mariane M. A. Stefani is a recipient of a fellowship from CNPq (grant #

304869/2008-2), EMH is supported by a fellowship from CNPq (grant# 141554/2013-4)

and AAF is supported by a fellowship from CAPES (grant# 1054292).

119

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123

Table 1. Main features of study groups

Group Gender

(M/F)

Age

(median, range years)

Leprosy (n=40) 29/11 50,0 (20-95)

PBa (n=14) 9/5 52,0 (30-95)

MBb (n=26) 20/6 49,0 (20-66)

T1R (n=11) 7/4 50,0 (33-66)

T2R (n=11) 8/3 48,0 (20-95)

NC (n=11) 3/8 42,0 (20-79)

DE (n=29) 15/14 51,0 (6-70)

PB: paucibacillary leprosy; MB: multibacillary leprosy; T1R: type 1 reaction; T2R:

type 2 reaction; NC: normal controls with normal skin, DE: other dermatoses; F:

Female; M: Male. PBa patients group: 10 TT and 4 BT; MBb patients group: 6 BT, 15

LL and 5 BL.

124

Figure 1. Histopathologic findings in different human skin diseases investigated: A)

Lupus erythematosus (HE) and inset PAS stain demonstrating a thickened and tortuous

basement membrane zone; B) American cutaneous leishmaniasis (HE); C)

Paracoccidioidomycosis (inset shows fungi stained by Grocott silver); D) Syphilis (HE);

E) Borderline-lepromatous leprosy (HE) and inset acid fast bacilli (Fite-Faraco

staining); F) Acid fast bacilli in lepromatous leprosy (Fite-Faraco staining). Marks: 100

µm (A-E) and 50 µm (F).

125

Figure 2. Histopatological features of mast cells in: A) Intact and degranulated mast

cells by toluidine blue staining in leprosy lesions, other dermatoses and normal skin.

Intact MCs are identified by arrowheads and degranulated MC are identified by arrow;

B) Borderline lepromatous leprosy; C) other dermatoses (Eczema) and D) normal skin.

Marks: 20 µm (B-D).

126

Figure 3. A) Tryptase and chymase positive MCs numbers in leprosy lesions, others

dermatoses and normal skin (controls); B) Densitometric analyses of tryptase and

chymase in leprosy lesions, others dermatoses and normal skin (controls); C, E, G:

Tryptase positive mast cells in borderline lepromatous leprosy (C), others dermatoses

(Eczema) (E) and normal skin (G); D,F,H: Chymase positive mast cells in borderline

lepromatous leprosy (D), others dermatoses (Eczema) (F) and normal skin (H). Bars:

20 µm (C-H).

127

Figure 4. A) Toulidine blue stained intact and degranulated MCs among leprosy forms

according Ridley & Jopling (TT, BT, BL and LL). B) Immunohistochemistry analyses

of tryptase and chymase positive MCs among leprosy forms according Ridley &

Jopling (TT, BT, BL and LL).

128

Figure 5: A) Toulidine blue stained intact and degranulated MC among reactional and

reaction-free leprosy patients and among T1R and T2R; B) Tryptase and chymase

positive MC among reactional and reaction-free leprosy patients and among T1R and

T2R. C) Densitometric analyses of trypase and chymase positive MCs among

reactional and reaction-free leprosy patients and among T1R and T2R.

129

6. CONCLUSÕES

Células Tregs em doenças cutâneas

As células Treg estão ausentes em pele normal enquanto números variáveis são

detectadas em doenças cutâneas, infecciosas e não infecciosas, sendo maior nas

infecciosas. Entre asdoenças cutâneas infecciosas de diferentes etiologias, observamos

distribuição semelhante das Tregs. As células Tregs estão aumentadas na RT1 mesmo

quando o paciente desenvolve reação durante MDT, enquanto nenhuma variação de Treg

foi vista na RT2. Na hanseníase não houve associação entre formas de hanseníase e as

células Tregs. Concluímos que as células Treg fazem parte do infiltrado inflamatório da

hanseníase, não sofrem efeito das variações clínicas, microbiológicas, imunológicas da

hanseníase. O aumento das células Tregs, visto na RT1, é compatível com sua

imunopatologia e sugere papel benéfico para o hospedeiro, protegendo contra a

imunopatologia.

Mastócitos em doenças cutâneas

Os mastócitos são células identificadas na pele normal. Lesões cutâneas de origem

infecciosa e não-infecciosa apresentam números aumentados de mastócitos

desgranulados em relação aos intactos, tanto na hanseníase como nas outras dermatoses

quando comparados com pele normal. Os números de MC desgranulados superam os

intactos independente da forma de hanseníase (do polo tuberculoide/TTao

lepromatoso/LL), independe da ocorrência das reações hansênicas (lesão reacional/sem

reação) e independente do tipo de reação (RT1/RT2). Números e densidade de MC

try+foram maiores que MC chy+ na hanseníase, em pacientes com e sem reação,

particularmente na RT2, mas não nas dermatoses estudadas. Estes dados sugerem que o

processo infeccioso pelo Mycobacterium leprae, per se direciona a expressão de MC

nas lesões cutâneas da hanseníase.

130

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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150

8.ANEXOS

Anexo 1– Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa Médica Humana e animal

Anexo 2 – Parecer da Comissão de Ética em Pesquisa - CONEP Anexo 3 - Ficha de dados clínicos

Anexo 4 – Termo de consentimento livre e esclarecido

Anexo 5 – Comprovantes de submissão dos artigos/ aceite para publicação para

artigos ainda não publicados/ DOI dos artigos publicados

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ANEXO 1 - Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa Médica Humana e animal

152

ANEXO 2 - Parecer da Comissão de Ética em Pesquisa - CONEP

153

ANEXO 3 - Ficha de dados clínicos

154

ANEXO 4 - Termo de consentimento livre e esclarecido

155

156

ANEXO 5 - Comprovantes de submissão dos artigos/aceite para publicação para

artigos ainda não publicados/ DOI dos artigos publicados

Artigos em processos de submissão.