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LEONICE MANRIQUE FAUSTINO TRESVENZOL

ESTUDO MORFOANATÔMICO, AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE

BIOLÓGICA E COMPOSIÇÃO QUÍMICA E VARIABILIDADE DO

ÓLEO ESSENCIAL DA Memora nodosa (SILVA MANSO) MIERS -

BIGNONIACEAE

Goiânia/GO

2008

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BIGNONIACEAE

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Biologia, área de concentração Biologia Celular e Molecular.

Orientador: Professor Doutor José Realino de Paula

Goiânia/GO

2008

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BIGNONIACEAE

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Biologia, área de concentração Biologia Celular e Molecular.

Aprovada em: 18/12/2008.

BANCA EXAMINADORA

________________________________________________________________________ Prof. Dr. José Realino de Paula (Presidente)

Universidade Federal de Goiás/GO

________________________________________________________________________ Prof. Dr. Tanus Jorge Nagem

Universidade Federal de Ouro Preto/MG

_________________________________________________________________________ Profa. Dra. Conceição Eneida Universidade de Brasília/DF

________________________________________________________________________ Profa. Dra. Clévia Ferreira Duarte Garrote

Universidade Federal de Goiás/GO

_________________________________________________________________________ Profa. Dra. Maria Teresa Freitas Bara Universidade Federal de Goiás/GO

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Ao Emilson e à Thaís o meu carinho e muito obrigada por estarem comigo em mais esta etapa de minha vida.

Aos meus pais, irmãos e cunhados pelo incentivo.

Aos meus queridos amigos Tatiana, Leila e Daniel companheiros de todas as horas.

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AGRADECIMENTOS

Este trabalho foi realizado sob a orientação do Professor Doutor José Realino de Paula

a quem expresso minha gratidão pela paciência, dedicação e suporte científico.

Aos amigos e companheiros de bancada Tatiana de S. Fiuza, Leila Maria L. Parente e

Daniel T. Zatta pela amizade, companheirismo e colaboração na realização de várias etapas

desta pesquisa.

Ao Professor Heleno Dias Ferreira, pelo auxílio na identificação do material botânico,

e à Professora Maria Helena Rezende, pela revisão do trabalho morfoanatômico.

À Professora Fabiana Cristina Pimenta e à sua aluna Ana Beatriz Mori Lima, do

Laboratório de Microbiologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública/UFG, pelo

suporte técnico na realização dos testes microbiológicos.

Ao Professor Ruy de Souza Lino Júnior, do Departamento de Patologia do Instituto de

Patologia Tropical e Saúde Pública/UFG, pela valiosa colaboração nas análises histológicas.

Ao Professor Pedro Henrique Ferri, do Instituto de Química/UFG, pela contribuição

no estudo dos óleos essenciais.

Ao Professor Luiz Carlos da Cunha do Núcleo de Ensino e Pesquisa Tóxico-

farmacológicas (NEPET) da Faculdade de Farmácia/UFG e à colega de pós-graduação Liuba

Laxor Pucci, pelo auxílio nos experimentos toxicológicos.

À Professora Laila Salmen Espindola do Laboratório de Farmacognosia da

Universidade de Brasília, pelos ensaios com Leishmania.

Ao Professor José Daniel G. Vieira do Laboratório de Microbiologia do Instituto de

Patologia Tropical e Saúde Pública/UFG e sua aluna Ariana Alves Rodrigues pelo

experimento com Artemia salina.

À Professora Inês Sabioni Resck, do Departamento de Química da Universidade de

Brasília, pelos espectros de Ressonância Magnética Nuclear de 1H e de 13C.

À Professora Maria Teresa Freitas Bara, pelo incentivo e pela colaboração nas

revisões dos textos.

À Professora Clévia Ferreira Duarte Garrote, pela amizade e apoio em todos os

momentos.

À Professora Joana D`Arc Ximenes Alcanfor, e à amiga-irmã Lílian de Souza (in

memorian) pela colaboração nos momentos necessários.

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Às minhas orientandas Débora Cabral Queiroz, Vanessa Sicorra da Rosa, Emmelline

Flor Ribeiro, Rosineide Ribeiro de Sousa Santos, Clarice Iomara Silva e Simone de Fátima

Cruz pelo auxílio no desenvolvimento de algumas etapas deste trabalho.

Aos amigos e companheiros de pós-graduação Lilia Cristina de Souza Barbosa, Maria

Tereza Faria, Joelma Abadia Marciano de Paula, Alexandre Pereira dos Santos, Giovana

Cristina de Barros, Tiago Branquinho de Oliveira, Leslivan Ubiratan de Morais pela

solidariedade e pelos momentos agradáveis no Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturais

da Faculdade de Farmácia.

Ao Professor Luís Antonio Violin, pela revisão gramatical.

Ao Professor Egídio Turchi, pela tradução do texto em latim.

Aos técnicos Hamilton Sousa Bastos e Otávio Cavalcante Barros, pelos cortes

histológicos.

E a todos aqueles que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste

trabalho, muito obrigada.

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“Do meu telescópio eu via Deus caminhar! A maravilhosa disposição e harmonia do universo só pode ter tido origem segundo o plano de um Ser que tudo sabe e que tudo pode. Isto fica sendo minha última e mais elevada descoberta.” Isaac Newton

“O que sei é uma gota diante do oceano que desconheço.” Isaac Newton

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RESUMO

A Memora nodosa (Silva Manso) Miers é uma planta nativa do Cerrado e utilizada

popularmente na cicatrização de feridas (folhas e caules) e no tratamento de dores abdominais

e sarnas (raízes). Este trabalho objetivou realizar o estudo morfoanatômico, determinar a

composição química e a variabilidade dos constituintes do óleo essencial obtido das folhas e

avaliar a atividade antimicrobiana, leishmanicida e cicatrizante e a toxicidade dos extratos e

frações da M. nodosa. Morfologicamente, observou-se que a M. nodosa é um arbusto com

caules retos ou escandentes reunidos em touceiras. A raiz é pivotante, profunda e apresenta,

na parte superior, uma estrutura em candelabro de onde se originam os caules. As folhas são

opostas cruzadas, recompostas, bipinadas, imparipinadas, com foliólulos lanceolados. A

inflorescência é racemosa com flores de cor amarelo-ouro. O fruto é do tipo cápsula septífraga

com abertura longitudinal e sementes aladas. Anatomicamente, as folhas são hipoestomáticas,

com estômatos predominantemente paracíticos. A epiderme é unisseriada, com cutícula

espessa em todas as estruturas das folhas. Tricomas glandulares e tectores são observados nas

folhas e caules jovens. O óleo essencial das folhas da M. nodosa coletadas em sete localidades

diferentes do Cerrado brasileiro foi analisado por CG (DIC) e CG/EM. Cinco substâncias

foram identificadas, sendo o benzaldeído e o 1-octen-3-ol os principais constituintes. A

análise dos componentes principais e dos agrupamentos possibilitou a distinção de duas

classes diferenciadas em relação ao local da amostragem e aos constituintes. As atividades

antimicrobianas dos extratos etanólicos das folhas, dos caules e das raízes, do óleo essencial

das folhas e das frações obtidas das raízes foram avaliadas usando teste de difusão em poço e

o método de diluição em ágar. O extrato etanólico das raízes apresentou atividade

antimicrobiana fraca, enquanto as frações hexano e diclorometano, obtidas desse extrato,

mostraram atividade de forte a moderada contra várias bactérias Gram-positivas e contra o

fungo Candida albicans. O óleo essencial obtido das folhas apresentou CIM de 0,78 mg/mL a

1,56 mg/mL contra bactérias Gram-positivas e Candida albicans. Constatou-se que a

atividade antimicrobiana do óleo essencial se deve a ação sinérgica entre o benzaldeído, o 1-

octen-3-ol, o 1-octanol, o linalol e a mandelonitrila, constituintes do óleo essencial. A

atividade cicatrizante dos extratos etanólicos das folhas e raízes foi avaliada em feridas

cutâneas de ratos e observou-se uma aceleração na reepitelização apenas no grupo tratado

com solução aquosa a 2% do extrato etanólico das raízes. Essa ação pode estar relacionada

com a alantoína, isolada do extrato etanólico das raízes. Na avaliação da atividade

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leihsmanicida, empregaram-se culturas com formas promastigotas de Leishmania chagasi e

verificou-se que o extrato etanólico das folhas apresentou IC50 de 93,2 µg/mL e as raízes IC50

de 95,87 µg/mL. A fração hexano obtida das raízes apresentou IC50 de 13,51 µg/mL. Da

fração hexano obtida do extrato etanólico das raízes foi isolado e identificado uma mistura de

β-sitosterol e estigmasterol. Essa mistura foi testada contra L. chagasi, obtendo-se IC50 de

69,79 µg/mL. A avaliação da toxicidade aguda dos extratos etanólicos das folhas, das raízes e

da fração hexano obtidas das raízes empregando como modelos experimentais ratos e

camundongos e o teste de citotoxicidade utilizando Artemia salina mostraram que essa planta

não é potencialmente tóxica. Conclui-se que os melhores resultados foram obtido com extrato

etanólico das raízes, que apresentou atividade antimicrobiana, cicatrizante e leishmanicida.As

frações hexano e diclorometano, obtidas das raízes, apresentaram bom potencial

antimicrobiano contra bactérias Gram-positivas e o fungo C. albicans e a fração hexano forte

atividade leishmnicida.

Palavras-chave: Plantas medicinais. Morfoanatomia. Cicatrização de feridas. Atividade

leishmanicida. Atividade antimicrobiana. Óleos essenciais.

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ABSTRACT

Memora nodosa (Silva Manso) Miers is a native savannah plant popularly used for

wound cicatrization (leaves and stems) and for treating abdominal pains and scabies (roots).

The purpose of this work is to study the morphoanatomy and determine the composition and

variability of the constituents of the essential oil obtained from the M. nodosa leaves, as well

as its antimicrobial, leishmanicidal, cicatrizing activity and toxicity. Morphologically, M.

nodosa is a bush with clumps of straight or curved stems. It has a deep, pivoting root and

presents a chandelier shaped structure in the upper part from where the stems sprout. It

presents compound, bipinnate, imparipinnate, oppositely crossed leaves. The inflorescence is

racemose with golden-yellow flowers. It is characterized by septifrague capsule type fruit

with replum and winged seeds. Anatomically the leaves are hypostomatic with

predominantly paracytic stomates. The epidermis is uniseriate with a thick cuticle and

glandular trichomes throughout the structure of the young leaves. The essential oil from the

M. nodosa leaves collected from seven different locations in the Brazilian savannah was

analyzed by GC(FID) and GC/MS. Five substances were identified, benzaldehyde and 1-

octene-3-ol were the main constituents. Two different classes regarding sampling location

and constituents were identified by means of the principal component and grouping analyses.

The antimicrobial activity of the ethanolic extracts from leaves, stems, roots and of essential

oil from leaves, and the fractions obtained from the roots, were assessed against Gram-

positive and Gram-negative bacteria, as well as the Candida albicans fungus, using well

diffusion test and the agar dilution method. The ethanolic extract from the roots presented

small antimicrobial activity while the hexane and dichloromethane fractions obtained from

this extract presented MIC 0.39 mg/mL and 0.78 mg/mL against a number of Gram-positive

bacteria and the Candida albicans fungus. The essential oil presented MIC 0.78 mg/mL to

1.56 mg/mL. The antimicrobial activity of the essential oil was the result of synergic action

between the benzaldehyde, 1-octene-3-ol, 1-octanol, linalool and the mandelonitrile,

constituents of the essential oil. Promastigote forms of Leishmania chagasi were used for the

leishmanicidal assessment and it was verified that the ethanol extract from the leaves

presented an IC50 of 93.2 µg/mL and from the roots presented an IC50 of 95.87 µg/mL. The

hexane fraction from the roots presented an IC50 of 13.51µg/mL. A mixture of β-sitosterol

and stigmasterol was isolated and identified in the hexane fraction obtained from the ethanol

extract from the roots. This mixture was tested against L. chagasi resulting in an IC50 of

69.79 µg/mL. The cicatrizing activity of the ethanol extract from the leaves and roots was

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assessed on skin wounds in rats, and it be noted reepithelization occurred faster only in the

group treated with a 2% aqueous solution of the ethanol extract from the roots. This action

may be related to the alantoine isolated in the ethanol extract from the roots. The toxicity

assessment of the ethanol extracts from roots, leaves and hexane fraction obtained from M .

nodosa roots, tested on rats, mice and Artemia salina proved that this plant is not potentially

toxic. In conclusion, according to the tests performed, the best results were obtained with

ethanolic extract and it presented antimicrobial, wound cicatrization and leishmanicidal

activities. Hexane and dichloromethane fractions obtained from roots extract presented

antimicrobial activity against Gram-positive bacteria and the Candida albicans fungus and

hexane fraction strong leishmanicidal activity.

Key words: Medical plants. Morphoanatomy. Wound cicatrization. Leishmanicidal activity.

Antimicrobial activity. Essential oils.

12

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO GERAL 12

OBJETIVOS 26

ARTIGO 1: ESTUDO MORFOANATÔMICO DA Memora nodosa (SILVA

MANSO) MIERS (BIGNONIACEAE)

35

ARTIGO 2: COMPOSIÇÃO E VARIABILIDADE QUÍMICA DO ÓLEO

ESSENCIAL DAS FOLHAS DA Memora nodosa (SILVA MANSO) MIERS

(BIGNONIACEAE)

69

ARTIGO 3: COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL E

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DA Memora nodosa

(SILVA MANSO) MIERS

81

ARTIGO 4: AVALIAÇÃO DOS EXTRATOS DA Memora nodosa (SILVA

MANSO) MIERS NA CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS CUTÂNEAS EM

RATOS.

101

ARTIGO 5: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LEISHMANICIDA E DA

TOXICIDADE DA Memora nodosa (SILVA MANSO) MIERS

123

CONCLUSÕES GERAIS 140

13

INTRODUÇÃO GERAL

14

PLANTAS MEDICINAIS E FITOTERÁPICOS AO LONGO DO TEMPO

A utilização de plantas medicinais é um dos traços culturais mais característicos da

espécie humana e é tão antiga quanto o próprio homem. Registros sobre a utilização de

plantas no tratamento de doenças podem ser encontrados em todas as civilizações antigas que

habitaram a Mesopotâmia, o Egito, a China e a Índia (ALONSO, 1998; BOTSARIS, 1999).

No mundo ocidental, os gregos contribuíram significativamente para o conhecimento sobre as

propriedades das plantas medicinais, destacando-se estudiosos como Hipócrates (460-377

a.C.), Aristóteles (384-322 a.C), Teofrasto (372-286 a.C.) e Galeno (129-199 a.C.)

(CORRÊA, et al., 2006).

Na Europa, durante a Idade Média, os monastérios mantiveram viva a bibliografia

sobre o uso de plantas medicinais e apesar da proibição da Igreja Católica, os monges

exerciam a prática médica e usavam as propriedades medicinais das plantas para curar os

enfermos. Nesse mesmo período, o mundo árabe conservou e ampliou o legado da cultura

grega e um grande acervo sobre o uso popular de plantas com fins medicinais foi compilado e

conservado nas bibliotecas desse império. No final da Idade Média, ocorreram a fusão da

medicina oriental com a ocidental e a fundação de várias universidades, o que proporcionou

uma abordagem mais abrangente e científica para o ensino médico (ELDIN; DUNFORD,

2001).

No século XVI foi publicada “De historia stirpium” (A história das plantas) de

Leonhard Fuch, com desenhos de plantas feitos com base na observação da natureza, o que

viria diminuir os erros na identificação das plantas, inclusive de espécies comercializadas.

Nesse período, o interesse pelos remédios à base de plantas intensificou-se em razão das

explorações realizadas no Novo Mundo. O ensino da botânica medicinal passou a ser mais

formalizado e os jardins botânicos passaram a ser implantados em centros-chave de ensino

como Pádua (1545) e Leyden (1587) (ELDIN; DUNFORD, 2001). A preocupação em

catalogar, identificar e classificar as plantas de acordo com a procedência e as características

culminou com a publicação, em 1735, do “Sistema Naturae”, de Lineu (TESKE;

TRENTINI, 2001).

Na Europa, durante o Renascimento, surgiram as primeiras farmacopéias com o

objetivo de padronizar a composição e as formas de preparação das fórmulas prescritas pelos

médicos da época. No princípio do século XVII, foi criada, na Inglaterra, a Farmacopéia

Londinense, que deu origem à atual Farmacopéia Britânica, e, na França, foi publicado o

Codex medicamentarius gallicus. Essas obras, com as Farmacopéias Portuguesa e

15

Espanhola, foram referências no saber médico em muitas regiões, inclusive no novo

continente, e descreviam muitas ervas medicinais, embora sem dados sobre as doses

terapêuticas e tóxicas (ALONSO, 1998).

Com o desenvolvimento das técnicas fitoquímicas de isolamento, várias drogas

vegetais, até então somente empregadas na forma bruta, foram objetos de estudos visando à

obtenção de substâncias puras. Assim, alguns potentes fármacos foram descobertos,

destacando-se a morfina, a codeína e a papaverina (Papaver somniferum L.), a efedrina

(Ephedra sinica Stap.), a hiosciamina (Atropa belladona L.), os ésteres do ácido valérico

(Valeriana officinalis L.), o digital (Digitalis purpurea L.), a quinina (Chinchona calisaya

Wedell), a emetina e a cefaelina [Cephaelis ipecacuanha (Brotero) A. Richard]. Esse fato

provocou uma mudança no enfoque da medicina que passou a se interessar mais pelos

constituintes químicos puros que pelas plantas e seus extratos. Em 1860, Kolbe e Lauteman

sintetizaram o ácido salicílico e seu sal sódico a partir do fenol, propiciando a primeira

produção de salicilatos em 1874. Posteriormente, Hofman sintetizou o ácido acetilsalicílico

(AAS), com custo 10 vezes menor que o da salicina, extraída da Salix alba (YUNES;

CALIXTO, 2001).

No século XX, o panorama da medicina ocidental passou a ser configurado pela

presença de grandes indústrias farmacêuticas, que se fortaleceram em razão de maciço

investimento na pesquisa de novos fármacos e no marketing para a sua comercialização.

Nesse período, também se iniciaram os avanços na área de síntese. A produção de fármacos

pela via sintética, o ganho econômico com esses produtos pelas indústrias farmacêuticas e a

ausência de comprovação científica sobre a eficácia de vários produtos de origem vegetal,

aliada às dificuldades no controle químico, físico-químico, farmacológico e toxicológico dos

extratos vegetais conhecidos, impulsionaram a substituição desses produtos por fármacos de

origem sintética (RATES, 2001). Com essa nova visão, as plantas medicinais passaram a ser

consideradas sem valor científico, principalmente nos países ocidentais desenvolvidos, e as

grandes empresas farmacêuticas, particularmente as dos EUA, estagnaram suas pesquisas com

plantas medicinais entre 1965 e 1980 (KINGSTON, 1996).

O uso abusivo de medicamentos constituídos principalmente por princípios ativos

sintetizados e purificados tem provocado graves problemas, entre os quais se destacam as

doenças iatrogênicas e o aumento da resistência aos antimicrobianos. Isso levou os órgãos

sanitários responsáveis pela fiscalização de medicamentos a exigir maior rigor nos testes de

eficácia e segurança desses fármacos, obrigando as indústrias a investirem mais recursos em

pesquisas. Esse fato provocou a instalação de empresas multinacionais em vários países, e a

16

conseqüente desnacionalização desse setor, gerando para grande parcela da população,

dificuldades de acesso aos medicamentos industrializados (LEITE, 2008).

Como resposta à dificuldade de acesso aos medicamentos industrializados ressurgiu o

interesse pelas terapias alternativas, bem como por sistemas médicos antigos, como a

medicina tradicional chinesa, a medicina indiana (ayurvédica), e a reabilitação de medicinas

populares ou folk. Esse movimento obteve forte repercussão no campo da saúde e culminou

com a orientação da Organização Mundial de Saúde (OMS) para a utilização da fitoterapia

como prática alternativa, principalmente em países em desenvolvimento, de modo a se

amenizarem os impactos negativos e excludentes resultantes do dispendioso sistema de saúde

que se desenvolveu na maioria dos países (WHO, 1978, 1987).

Paralelamente ao incentivo da OMS à utilização de medicamentos derivados de

vegetais, observou-se também acentuado interesse pelos fitoterápicos na Europa e América do

Norte, originado pela busca de medicamentos mais “naturais”, com eficácia terapêutica para

várias patologias, principalmente doenças crônicas, e com menos efeitos colaterais. Essa

exigência do mercado internacional incentivou os estudos na área, e os produtos derivados de

plantas passaram a apresentar maior número de informações sobre os constituintes ativos e

suas propriedades farmacológicas, novas formas farmacêuticas, melhor controle de qualidade

da matéria-prima e do produto acabado, além de legislação adequada na maioria dos países

desenvolvidos (CUNHA et al., 2005).

A utilização de fitoterápicos é uma estratégia para aumentar a opção terapêutica dos

profissionais de saúde, uma vez que eles podem ter equivalência de efeitos e espectro de ação

mais adequado ou com indicações terapêuticas complementares às medicações existentes no

mercado. Além disso, essa utilização valoriza as tradições populares e fornece substrato

autóctone para o desenvolvimento da indústria farmacêutica local, possibilitando o

desenvolvimento de fitoterápicos de fabricação nacional, com menor custo para os programas

de saúde pública (CASTRO, 2005).

Atualmente, existe uma grande quantidade de pesquisas buscando moléculas

biologicamente ativa a partir de plantas, organismos marinhos, insetos e microrganismos. Isso

pode ser evidenciado tanto na área acadêmica como na industrial, mostrando que existe

ligação ou retroalimentação entre ambas. Na área científica, esse fato pode ser constatado pelo

aumento das publicações científicas, enquanto, na área industrial, pela observação de que, das

42 moléculas novas descobertas em 1992, 18 eram oriundas de produtos naturais ou de seus

derivados (YUNES; CECHINEL FILHO, 2007). Nos últimos anos, os produtos naturais

mostraram-se mais eficientes no desenvolvimento de novos medicamentos com atividades

17

antitumorais (50%), antivirais (15%), antibióticas (5%) e hipocolesterolêmicas (10%)

(YUNES; CECHINEL FILHO, 2007).

A transformação da matéria-prima vegetal em medicamento deve visar à preservação

da integridade química e farmacológica da planta, bem como, garantir a constância de sua

ação biológica e a segurança de sua utilização pelo homem. Portanto, esse estudo envolve

várias etapas e exige uma abordagem multidisciplinar que engloba áreas do conhecimento

como a botânica, a agronomia, a toxicologia, a farmacologia, a química, a farmacotécnica,

entre outras (DI STASI, 1996; MACIEL et al, 2002; MIGUEL; MIGUEL, 2004; SONAGLIO

et al., 2004).

Se considerarmos que existem aproximadamente 350.000 plantas sobre a superfície da

Terra que não foram objeto de nenhum tipo de estudo fitoquímico ou farmacológico, a seleção

de plantas com atividades biológicas interessantes para o desenvolvimento de medicamentos

pode ser uma tarefa muito difícil (HOSTETTMANN; QUEIROZ; VIEIRA, 2003). Assim,

várias abordagens para a seleção de espécies vegetais têm sido apresentadas e, dentre elas,

três tipos são alvos de maiores investigações: a) abordagem randômica, onde a escolha é

realizada considerando a disponibilidade da planta; b) abordagem quimiotaxonômica ou

filogenética, na qual a seleção é feita pelo interesse por uma dada classe de substâncias em um

gênero ou família; c) abordagem etnofarmacológica, na qual a planta é selecionda de acordo

com o uso terapêutico evidenciado por um determinado grupo étnico (ALBUQUERQUE;

HANAZAKI, 2006; MACIEL et al, 2002). Todos os métodos citados são interessantes e a

escolha de um deles depende dos objetivos do pesquisador.Entretanto, a literatura mostra,

com freqüência, que os resultados são mais satisfatórios quando a seleção é realizada com

base em estudos etnofarmacológicos, nos quais vários aspectos relacionados aos usos

populares são considerados (ALBUQUERQUE, 2005; CALIXTO, 2001). A seleção da planta

com base em informações da medicina tradicional ou popular pode conduzir à descoberta de

novas moléculas com potencial terapêutico, especialmente quando se trabalha com plantas de

regiões tropicais e subtropicais, devido à grande diversidade botânica e química. Outra

vantagem é que a etnofarmacologia não se baseia em determinado perfil químico, o que

poderia indicar interação com um determinado alvo biológico. Assim, essa abordagem é

particularmente útil no caso de doenças cuja fisiopatologia não é bem conhecida

(ELIZABETSKY, 1990).

Durante as expedições para a coleta das plantas, as observações do terreno são

importantes. Uma espécie que cresce em ambiente hostil, como as florestas tropicais, onde

insetos, fungos, vírus e bactérias são abundantes, terá de se proteger, sintetizando compostos

18

inseticidas, antifúngicos e/ou antivirais. Isso também é interessante quando se estudam as

raízes, pois o solo é rico em fungos, muitos deles patogênicos para a planta, a qual precisa

desenvolver substâncias para sua proteção. Essas substâncias podem ter efeito similar em

fungos que provocam doenças no homem. Atualmente, pesquisas visando descobrir novas

moléculas antifúngicas têm sido incentivadas devido à forte incidência de micoses sistêmicas

em portadores de HIV e em pacientes que utilizam medicamentos imunossupressores como

no caso de transplantes de órgãos (HOSTETTMANN; QUEIROZ; VIEIRA, 2003). O

potencial microbicida de compostos extraídos de plantas também tem despertado o interesse

na investigação de novas moléculas para o tratamento de doenças infecciosas transmitidas por

protozoários, como a leishmaniose, a malária e a doença de Chagas, que acometem

principalmente a população de países em desenvolvimento e que, por não proporcionarem

retorno financeiro, não recebem a devida atenção das grandes indústrias farmacêuticas

(FUNARI; FERRO, 2005).

Após a seleção da planta, o estudo botânico é fundamental, pois, durante anos, a falta

de rigor técnico-científico levou à publicação de trabalhos sem a correta identificação

taxonômica das espécies utilizadas nas pesquisas. A identificação taxonômica possui caráter

universal no que se refere à real caracterização da espécie que foi objeto do estudo (DI

STASI, 1996). Em geral, a identidade botânica de uma espécie vegetal é definida por meio da

análise de suas características morfológicas, por comparação com material depositado em

herbário e identificado por especialista e pelo estudo de monografias do gênero, da tribo ou da

família. A identificação correta, com a nomenclatura atualmente válida, muitas vezes só pode

ser realizada por um especialista em determinada família ou gênero (MENTZ; BORDIGNON,

2004). Da mesma forma, é importante o estabelecimento de características botânicas

comparativas que permitam detectar a presença de uma ou mais espécies adulterantes. A

identificação macroscópica e microscópica é uma exigência da legislação brasileira na

avaliação da autenticidade de droga de origem vegetal (BRASIL, 2004a).

Outro ponto importante a ser avaliado no estudo de plantas medicinais é a toxicidade.

Os princípios ativos presentes nas plantas e utilizados como medicinais são estranhos ao

organismo do homem e dos animais e, até que se prove sua inocuidade, devem ser

considerados potencialmente tóxicos. Portanto, o uso popular e mesmo o tradicional, embora

sinalizem bons resultados, não são suficientes para validar as plantas medicinais como

medicamentos eficazes e seguros (BRAGGIO, 2003). A toxicidade pré-clínica deve indicar o

grau de confiança a ser depositada no medicamento a ser administrado à espécie humana. No

Brasil, a Resolução RE no 90 da ANVISA, dá as diretrizes para a realização de estudos de

19

toxicidade pré-clínica de fitoterápicos e recomenda testes que avaliem a toxicidade aguda, a

toxicidade de longa duração e a genotoxicidade (BRASIL, 2004b).

A avaliação da toxicidade é realizada com o objetivo de determinar o potencial de

novas substâncias e produtos em causar danos à saúde do homem. Testes que avaliam a

toxicidade sistêmica aguda são utilizados para classificar e apropriadamente rotular

substâncias de acordo com seu potencial de letalidade ou toxicidade, como estabelecido pela

legislação. Além da letalidade, o potencial tóxico em órgãos específicos, a identificação da

toxicocinética e a relação dose-resposta podem ser investigados com testes de toxicidade

sistêmica aguda. Esses testes também possibilitam os indicativos do mecanismo de ação

tóxica, o estabelecimento de doses para estudos adicionais de toxicidade, a comparação de

toxicidade entre substâncias de mesma classe, bem como a avaliação da reversibilidade da

ação tóxica (VALADARES, 2006). Diversos sistemas testes têm sido empregados e muitos

outros têm sido propostos com o objetivo de propiciar maior confiabilidade na extrapolação

dos dados para o homem. Os métodos tradicionais de ensaio amplamente utilizados estão

detalhados em protocolos publicados principalmente pela Organização para Cooperação

Econômica e Desenvolvimento (OECD) e pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados

Unidos (USEPA). Atualmente, novos protocolos foram estabelecidos visando à redução do

número de animais utilizados nos experimentos, o refinamento dos ensaios e à substituição

dos estudos in vivo por outras metodologias. Os novos protocolos foram publicados pela

OECD e denominados: Método de doses fixas (OECD 420), Toxicidade aguda de classe

(OECD 423) e Procedimento de up-and-down (OECD 425) (CAZARIN; CORRÊA;

ZAMBRONE, 2007).

No estudo de toxicidade aguda os animais são tratados uma única vez com o produto

em testes ou com dose fracionada e administrada no período de 24 horas. O teste deve ser

acompanhado de um screening hipocrático e, embora várias espécies de mamíferos possam

ser utilizadas, os roedores são os animais de escolha (BRITO, 1996). Os estudos de toxicidade

com doses repetidas são divididos, em razão do tempo de duração, em testes subcrônicos

(mínimo de 30 dias) ou crônicos (mínimo de 90 dias) que correspondem ao tempo em que a

amostra em estudo deverá ser administrada ininterruptamente aos animais. Testes que avaliam

embriofetotoxicidade, fertilidade e capacidade reprodutiva, carcinogenicidade e

mutagenicidade são estudos de toxicidade complementares (LAPA, 2004). A metodologia que

utiliza a Artemia salina, um camarão de água salgada, para determinar os efeitos citotóxicos

de extratos vegetais tem sido utilizada nos mais diversos campos de pesquisa como método

alternativo ao uso de animais de laboratório (ARIAS et al. 1995; JIMÉNEZ et al., 2001).

20

Nos últimos tempos a avaliação da atividade biológica assumiu papel primordial nas

pesquisas com plantas medicinais, direcionando os estudos posteriores, principalmente o

estudo fitoquímico. Em geral, essa investigação farmacológica preliminar utiliza modelos

experimentais relevantes relacionados às ações terapêuticas sugeridas pelos dados

etnofarmacológicos. As espécies animais mais utilizadas nesses estudos são ratos,

camundongos, cobaias, coelhos, cães e, em alguns casos, macacos e porcos. Dependendo da

atividade biológica pesquisada, os experimentos podem envolver órgãos ou tecidos isolados,

sistemas enzimáticos, cultura de células, cultura de bactérias, vírus e protozoários.

Posteriormente, estudos farmacológicos com as frações, substâncias isoladas e/ou

formulações farmacêuticas a serem comercializadas, deverão ser realizados para subsidiar os

estudos clínicos (LAPA, 2004).

Quanto aos estudos químicos, eles compreendem as etapas de isolamento, elucidação

da estrutura molecular e identificação dos constituintes mais importantes ou majoritários do

vegetal, responsáveis ou não pela ação biológica. Nos estudos envolvendo extratos vegetais, a

diversidade molecular representa desafio para o químico que pretende isolar e determinar a

estrutura de compostos ativos, uma vez que um extrato pode conter centenas ou milhares de

compostos. Assim, numerosos métodos de extração e estudos de compostos oriundos de

plantas têm sido sugeridos pela literatura. Não se trata de isolar todos os compostos ou um

composto em particular nem caracterizar exaustivamente o perfil químico da espécie vegetal,

e, sim, identificar os compostos responsáveis pela atividade farmacológica ou pelo efeito

terapêutico. A identificação desses constituintes possibilita também o estabelecimento de

marcadores químicos, indispensáveis ao planejamento e monitoramento das ações de

transformação tecnológica e de controle de qualidade químico-biológico, além de

fundamentar futuros estudos farmacológicos com seus derivados semi-sintéticos

(SONAGLIO, 2004).

As plantas representam, portanto um rico material de investigação nos mais variados

campos de pesquisa e mobilizam diferentes interesses econômicos. O foco dos países

desenvolvidos, em particular, das grandes indústrias farmacêuticas é descobrir novas

moléculas com potencial atividade biológica visando à produção de fármacos que atendam às

necessidades do seu mercado. Aos países em desenvolvimento interessa reconhecer todas as

potencialidades de seus recursos naturais, com vista ao desenvolvimento de sistemas de

produção tecnologicamente apropriados, baseados em recursos próprios e direcionados às

suas necessidades. Esse conhecimento contribui para a diminuição da dependência econômica

21

e técnica desses países e para a valorização dos seus recursos naturais e tem como

consequência incentivar a adoção de políticas de conservação e gestão da natureza (GOMES,

2005).

O Brasil possui grande variedade climática e de solos e isso possibilita a existência de

vários tipos de bioma, como a Floresta Amazônica, o Cerrado, a Mata Atlântica, o Pantanal, a

Caatinga. Essa grande biodiversidade estimula o estudo de sua flora na busca de substâncias

com atividades biológicas visando ao desenvolvimento de novos fármacos.

BIOMA CERRADO

O Cerrado é o segundo maior bioma da América do Sul e e excluindo pequenas áreas

do Paraguai e da Bolívia, está totalmente inserido no território nacional. Sua flora é riquíssima

e estimada em 10 mil espécies, entre arbóreas, arbustivas e herbáceas, sendo parte dela ainda

não catalogada (FRANCO; UZUNIAN, 2004).

Embora existam subvariações, é possível caracterizar alguns tipos fisionômicos da

vegetação predominante nessa região: campos limpos, com vegetação rasteira e ausência de

árvores e arbustos; campos sujos com vegetação campestre onde predominam as plantas

rasteiras; cerradão, com grande número de árvores (mata); cerrado “senso restrito”, que

ocupa posição intermediária entre campo sujo e cerradão. As veredas, os palmeirais e os

campos rupestres ocorrem com menos freqüência; as matas de galeria e as matas ciliares

encontram-se ao longo dos cursos de água (PIRES, 1999).

O Cerrado vive sob continua oscilação entre a época das chuvas e a época das secas.

Com a estiagem que pode durar até seis meses, a grama e a vegetação rasteira secam e as

queimadas são freqüentes, mas as plantas desse bioma têm adaptações para suportar as secas e

as queimadas. A maioria das árvores do cerrado tem raízes profundas, as cascas dos caules

são grossas, com espessa camada de súber que protege os troncos da ação do fogo. A presença

de xilopódios, bulbos, rizomas e gemas subterrâneas que resistem dormentes, mesmo quando

toda a parte aérea da planta já desapareceu, possibilitam o rebrotamento com as primeiras

chuvas da primavera (PROENÇA; OLIVEIRA; SILVA, 2000).

O Cerrado brasileiro abriga ampla diversidade de espécies medicinais. A utilização

dessas espécies pela comunidade nativa é prática antiga e baseia-se em conhecimentos

transmitidos oralmente, de geração em geração, sendo as plantas obtidas por extrativismo.

Sobre a exploração comercial, são escassos os dados sobre o volume de espécies medicinais

22

comercializadas no Brasil, em particular as coletadas no Cerrado brasileiro. Entretanto, é

comum encontrar, em farmácias magistrais, em ervanarias e no comércio informal (raizeiros)

plantas extraídas desse bioma, das quais as mais comuns: arnica (Lychnophora ericoides

Less.), assa-peixe (Vernonia ferruginea Less.), barbatimão (Stryphnodendron adstringens

Coville), catuaba da Bahia (Trichilia catigua A. Juss.), jaborandi-do-cerrado (Pilocarpus

trachylophus Holmes) e macela (Achyryocline satureoides DC.) (SILVA, 1998; MORAIS,

2005).

No entanto, a exploração dessas espécies tem levado à redução drástica das populações

naturais, seja pelo processo predatório de exploração, seja pelo desconhecimento dos

mecanismos de sua perpetuação. Outra ameaça a esse bioma é o desmatamento provocado

pela expansão das áreas destinadas à agricultura e pecuária. A devastação do bioma Cerrado,

além de causar a perda da diversidade genética, provoca a perda do conhecimento acumulado

durante milhares de anos, sobre o uso medicinal tradicional das plantas pelas populações a

elas associadas, devido à migração dessas comunidades para os centros urbanos. Isso reforça a

importância de políticas que promovam o desenvolvimento sustentado e a geração de riquezas

baseada nesses componentes, a conservação da biodiversidade remanescente e a restauração

da biodiversidade das áreas degradadas (IORIS, 1999).

Com o aumento da demanda pela utilização de plantas medicinais na cura ou

prevenção de doenças, o cultivo e/ou extrativismo dessas plantas tornaram-se alternativas

importante na agricultura nacional. Contudo, para que ocorra a conservação desses

ecossistemas é necessário criar condições para o retorno econômico por meio de produtos que

possam ser repostos pelo próprio ecossistema num ciclo definido e possibilitem a obtenção de

matéria-prima de espécies em diferentes graus de domesticação e também daquelas não-

domesticadas (REIS, 1996).

Assim, a discussão atual sobre o desenvolvimento de fitoterápicos ultrapassa questões

científicas e assume dimensão política e econômica. O avanço das políticas, dos programas e

projetos do governo na área de plantas medicinais e fitoterápicos demandaram a elaboração de

uma Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, contemplando toda a cadeia

produtiva, objetivando um projeto conjunto entre órgãos governamentais e não-

governamentais para desenvolvimento do setor. O objetivo dessa política é garantir à

população brasileira o acesso seguro e o uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos,

promovendo o uso sustentável da biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da

indústria nacional (BRASIL, 2006, 2008).

23

Espera-se que o uso das plantas medicinais na produção de fitoterápicos, no Brasil,

possa garantir maior universalidade de acesso ao medicamento, como também o

aproveitamento sustentável dos recursos naturais e a geração de trabalho e renda. A utilização

racional de recursos naturais para a obtenção de medicamentos fitoterápicos oriundos da flora

brasileira pode representar para o país uma vantagem competitiva no mercado global, devido

à grande biodiversidade dessa flora e proporcionar benefício para a saúde com o

desenvolvimento de medicamentos seguros e eficazes (LEITE, 2008).

FAMILIA BIGNONIACEAE

A família Bignoniaceae, de acordo com a APG II (Angiosperm Phylogeny Group II)

pertence à ordem Lamiales, subclasse Euasteridae I (CHASE, 2003). Essa família está

dividida em oito tribos, das quais apenas a Bignonieae, Tecomeae e Crescentiae têm

representantes na flora brasileira. A tribo Coleeae inclui, entre outros, o gênero Kigelia, da

África continental, que tem espécies cultivadas no Brasil (GENTRY, 1980). A família

Bignoniaceae compreende 120 gêneros e cerca de 800 espécies, de ampla distribuição nas

regiões tropicais de todo o mundo, principalmente na América do Sul e África, e inclui

árvores, arbustos, trepadeiras e plantas herbáceas (JOLY, 2002; VON POSER et al., 2000).

Os gêneros mais importantes dessa família, com ampla distribuição nas regiões

tropicais são Tabebuia e Jacaranda. No Brasil, os gêneros mais comuns são Tabebuia (ipê

amarelo e ipê roxo), Jacaranda (caroba, carobinha-do-campo, jacarandá-mimoso),

Anemopaegma (catuaba), Pyrostegia (flor-de-são-joão), Bignonia (unha-de-gato) e várias

espécies do gênero Zeyhera (HIRUMA-LIMA; DI STASI, 2002; JOLY, 2002).

Nessa família os caules frequentemente apresentam o lenho com organização anômala.

As formas escandentes apresentam gavinhas de origem foliar, às vezes modificadas em

fixadores semelhantes a unhas ou a ventosas. As flores são geralmente grandes, vistosas,

solitárias ou reunidas em inflorescência de diferentes tipos, hermafroditas, zigomorfas e

pentâmeras. O androceu apresenta quatro estames didínamos e um estaminódio. O ovário,

composto de dois carpelos, é bilocular e multiovular e encontra-se acentado sobre um disco

nectarífero ou imerso nele. O fruto geralmente é seliquiforme, septicido e às vezes em forma

de cápsula loculicida. Na maioria das espécies dessa família as sementes são aladas

(GEMTCHÚNICON, 1976).

24

A família Bignoniaceae tem grande importância econômica na ornamentação devido à

beleza de suas flores, no fornecimento de madeira para a indústria madeireira, na produção de

instrumentos musicais e artesanatos (GENTRY, 1992; LORENZI, 1988). Essa família

também se destaca pela grande indicação na medicina tradicional como afrodisíaco, no

tratamento de artrite, reumatismo, doenças na pele, leucemia, leishmaniose, malária, infecções

crônicas, doenças venéreas, alergias, AIDS, diabetes, hepatite e conjuntivite (GENTRY,

1992; SILVA, 1998; SIQUEIRA, 1988; LORENZI; MATOS, 2008).

No Brasil, várias espécies da família Bignoniaceae são utilizadas popularmente por

suas propriedades medicinais. Macedo e Ferreira (2004) relataram a utilização de espécies dos

gêneros Jacaranda e Tabebuia e a Zeyheria montana Mart. no tratamento de doenças na pele

em comunidades tradicionais da Bacia do Alto Paraguai, Mato Grosso. Siqueira (1988), em

estudo sobre plantas medicinais do Cerrado, descreveu o uso da Cybistax antisyphilitica Mart.

como depurativo e no tratamento de cancros venéreos, em erupções na pele e úlceras; da

Jacaranda brasiliana Pers. em afecções cutâneas, reumatismo e sífilis e da Zeyhera digitalis

(Vell.) Hoehne nas moléstias de pele. Agra, Freitas e Barbosa-Filho (2007), estudando plantas

do Nordeste brasileiro utilizadas como medicinais ou tóxicas, destacaram as Bignoniaceae:

Anemopaegma laeve DC., como afrodisíaca; Crescentia cujete L., como diurética; Jacaranda

brasiliana (Lam.) Pers. no tratamento de doenças genito-urinárias; Jacaranda caroba (Vell.)

A. DC., no tratamento de sífilis e úlceras; Tabebuia avellanedae Lorenz ex Griseb no

tratamento de câncer, inflamações da pele e mucosas. Algumas espécies dessa família vêm

sendo objetos de estudos, que buscam a comprovação das propriedades terapêuticas relatadas

pelo uso popular.

No levantamento bibliográfico foram encontrados estudos enfocando a atividade

antimicrobiana das espécies Kigelia africana (Lam.), Jacaranda decurens Cham., Catalpa

bignonioides Walt. e Tabebuia avellanedae. Os resultados mostraram que, de forma geral,

essas espécies apresentaram maior atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e

fungos (GAFNER et al., 1996; HAQUE et al., 2006; MUÑOZ-MINGARRO, 2003;

RASADAH; HOUGHTON, 1998; OWOLABI; OMOGBAI; OBASUYI, 2007; WAGNER et

al., 1989; ZATTA et al., 2007). Em relação a T. avellanedea (ipê-roxo) foram confirmados os

benefícios do uso local em casos de inflamações da pele e mucosas (gengivas, garganta,

vagina, colo do útero e ânus) (SOUSA et al, 2004) e de atividade antitumoral (PLANCHON

et al., 1995); a Catalpa bignonioides mostrou atividade antiinflamatória e antinoceptiva

(MUÑOZ-MINGARRO, 2003); e a Arrabidade chica atividade antitumoral (PAULETTI;

BOLZANI; YOUNG, 2003). A ação tripanossomicida de Arrabidaea triplinervia (Mart. ex

25

DC.) Baill. ex Bureau foi relatada por Leite et al. (2001) Propriedades inseticidas foram

observadas no óleo essencial da Tanaecium nocturnum (Barb. Rodr.) Bur. & K. Shum.

(FAZOLIN et al., 2007a, 2007b).

Quanto aos estudos fitoquímicos, embora a família Bignoniaceae seja relativamente

grande, um número limitado de espécies foi estudado quimicamente. Nos levantamentos

bibliográficos foram relatados presença de naftoquinonas, principalmente o lapachol e seus

derivados, glicosídeos iridóides e fenólicos, monoterpenos, triterpenos, quinonas, flavonóides,

ácidos cinâmicos e benzóicos, lignanas (BLATT; SANTOS; SALATINO, 1998; FERREIRA

et al., 2000; LISIEUX; JACOME; OLIVEIRA,1999; RAMOS et al.,2003). Iridóides foram

detectados em 18 espécies encontradas no Brasil principalmente entre os representantes das

tribos Bignonieae e Tecomeae (VON POSER et al., 2000).

O gênero Memora pertence a tribo Bignonieae e está constituído de 72 espécies, pouco

estudadas até o momento. A espécie Memora peregrina (Miers) Sandw., conhecida

popularmente como ciganinha, é nativa do Cerrado brasileiro. Essa planta vem infestando

grandes áreas de pastagem na região Centro-Oeste, causando prejuízos econômicos, devido à

dificuldade na sua erradicação (NUNES, 1999). A Memora allamandiflora Bur. ex K. Schum

também tem-se destacado como invasora de pastagens em regiões do Pará (RODRIGUES et

al., 2002). No Peru e na região do rio Xingú, a Memora allamandiflora e a Memora

cladotricha Sandw. são utilizadas na pesca, como veneno ou “vinho”para peixes (GENTRY,

1992).

Segundo Vidal (1978) no gênero Memora são encontrados arbustos eretos ou

escandentes, com ramos cilíndricos ou subcilíndricos, estriados ou lisos, glabros ou

pubescentes; gemas persistentes, cujos catáfilos externos, muitas vezes foliáceos são pseudo-

estipulares. Folhas opostas, glabras ou pubescentes, imparipinada e às vezes com a pina

terminal modificada em gavinha. A variação foliar é muito acentuada, mas raramente

observam-se na mesma espécie folhas paripinadas e imparipinadas, mas ocorrem tipos de

pinados a bipinado com ramificação tripinada na base. O número de pinas varia de dois, nas

bipinado-pinadas a binado-bipinadas e de três, nas ternado-pinadas e de cinco a nove, nas

bipinadas. Raques com 2 cm a 23 cm de comprimento, subcilíndricas, nodosas no ponto de

inserção das pinas, na porção abaxial e canaliculadas na adaxial, retas ou com leve inclinação

na altura dos nós, estriadas ou lisas, glabras ou pubescentes. Pecíolo com 1 cm a 6,5 cm de

comprimento, raramente com 10 cm. Raque de segunda ordem com 0,5 cm a 22 cm de

comprimento com nodosidade no ponto de inserção dos foliólulos, na face abaxial e

canaliculadas na face adaxial, glabas ou pubescentes. Folíolos ou folólulos opostos, de sésseis

26

a quase sésseis, com 1 cm a 13 cm de comprimento e 0,3 cm a 6,5 cm de largura, de

simétricos a levemente assimétricos, de elípticos a oblongos, lanceolados, lineares ou ovados,

papiráceos ou subcoriáceos, de glabros a pubescentes; base de aguda a cuneada e atenuada no

pecíolo, ou de obtusa a arredondada, às vezes, levemente oblíqua; bordos em geral inteiros;

ápice variável, de agudo a mucronado ou acuminado e de obtuso e emarginado, podendo se

dar a variação dentro de mesma espécie. Padrão de venação broquidódromo.

Em relação à atividade biológica desse gênero, Gentry (1992), em estudo

etnobotânico, relatou a utização da Memora flavida (DC.) Bareau & Schumann no tratamento

da dor por três diferentes grupos étnicos do Suriname. Siqueira (1988), catalogando plantas

medicinais do Cerrado, citou o uso popular das folhas e dos caules da Memora nodosa (Silva

Manso) Miers como cicatrizante de úlceras e feridas externas, enquanto Silva (1998) relatou a

utilização das raízes da M. nodosa, internamente, para dores abdominais e externamente, para

sarnas. Relatos populares informais reportam a utilização das raízes da M. nodosa para o

alívio da dor de dente.

Segundo Marston, Msonthi e Hostettmann (1984) dados etnobotânicos descrevendo

plantas utilizadas no tratamento de feridas são interessantes objetos de pesquisa, pois podem

indicar a presença de substâncias com atividade antimicrobiana, adstringente e hemostática. A

cicatrização é essencial para a manutenção da integridade do organismo e envolve uma série

de eventos celulares e moleculares que interagem para que ocorra a repavimentação e

reconstituição do tecido (MALDELBAUM; DI SANTIS; MALDELBAUM, 2003).

Alterações provocadas por infecções ou distúrbios metabólicos como o diabetes, podem

dificultar a cicatrização, levando à feridas crônicas. Essas feridas diminuem a qualidade de

vida do doente e geram alto custo para a sociedade (KRISHNAN, 2006). Assim, plantas

medicinais apresentando relatos de atividade cicatrizante têm sido investigadas na busca de

terapias mais eficazes no tratamento de feridas, bem como, na avaliação de seu potencial

contra bactérias, fungos e outros parasitas.

27

OBJETIVOS

OBJETIVO GERAL

Realizar o estudo morfoanatômico, atividades biológicas e toxicidade de extratos e frações e a

composição química e variabilidade do óleo essencial da Memora nodosa (Silva Manso)

Miers.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

♦ Estudar a morfoanatomia das partes aéreas e subterrâneas da M. nodosa.

♦ Verificar a composição química e a variabilidade populacional dos constituintes do óleo

essencial das folhas da M. nodosa.

♦ Investigar a atividade antimicrobiana do óleo essencial, dos extratos etanólicos das folhas,

dos caules e das raízes, bem como das frações obtidas do extrato etanólico das raízes.

♦ Avaliar a capacidade de cicatrização dos extratos etanólicos brutos das folhas e raízes sobre

feridas cutâneas de ratos.

♦ Avaliar a atividade leishmanicida e toxicidade aguda e citotoxicidade de M. nodosa.

28

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36

ARTIGO 1

MORFOANATOMIA DA Memora nodosa (SILVA MANSO) MIERS

(BIGNONIACEAE)

37

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi realizar o estudo morfoanatômico das partes aéreas e

subterrâneas da Memora nodosa (Silva Manso) Miers, uma planta encontrada no Cerrado

brasileiro e utilizada popularmente como medicinal. A análise morfológica mostrou que a M.

nodosa é um arbusto com caules retos ou escandentes reunidos em touceiras. A raiz é

pivotante, profunda e apresenta, na parte superior, uma estrutura em candelabro de onde

originam-se os caules. As folhas são opostas cruzadas, recompostas, bipenadas,

imparipenadas, com foliólulos lanceolados. A inflorescência é do tipo racemosa com flores

infundibuliformes, apresentando cálice tubuloso-turbinado, cinco dentado, com glândulas

nectaríferas pequenas e proeminentes, no terço superior das nervuras; corola amarelo-ouro

com grande quantidade de tricomas glandulares, internamente, na região de inserção dos

estames, no tubo e nos lobos; androceu com quatro estames férteis, epipétalos, didínamos e

um estaminódio reduzido; gineceu com ovário súpero, bicarpelar, assentado sobre um disco

nectarífero. O fruto é do tipo cápsula septífraga achatada, muito comprimida, com abertura

longitudinal; sementes aladas. Anatomicamente verificou-se que os foliólulos, as raques, os

pecíolos e peciólulos das folhas apresentam epiderme unisseriada, com cutícula mais espessa

na face adaxial. Os estômatos são predominantemente paracíticos e observados apenas na face

abaxial dos foliólulos. O mesofilo é dorsiventral com parênquima paliçadico ocupando mais

da metade do mesofilo. Tricomas glandulares e tectores podem ser observados nas folhas e

caules jovens. O sistema vascular de todas as estruturas está circundado por calotas ou

bainhas esclerificadas. No caule observa-se grande quantidade de cristais no parênquima

cortical e medular. A raiz, em crescimento primário, é poliarca; na raiz em crescimento

secundário, observam-se estrias de Caspary, cristais estilóides e amido.

Palavras-chave: Plantas medicinais. Cerrado. Bignonieae. Morfonatomia.

38

INTRODUÇÃO

A família Bignoniaceae compreende 120 gêneros e cerca de 800 espécies distribuídas

nas regiões tropicais de todo o mundo, principalmente na América e na África, e apresenta

plantas lenhosas, arbustivas, arbóreas e trepadeiras (JOLY, 2002; VON POSER et al., 2000).

No Brasil, várias espécies dessa família são utilizadas na medicina tradicional como

depurativo do sangue, antiinflamatório e afrodisíaco e no tratamento de erupções e úlceras na

pele, vitiligo, cancros venéreos, reumatismo, sífilis e câncer (AGRA; FREITAS; BARBOSA-

FILHO, 2007; MACEDO; FERREIRA, 2004; SIQUEIRA, 1988).

O gênero Memora, família Bignoniaceae, tribo Bignonieae, apresenta 72 espécies, até

o momento, pouco estudadas. A morfologia e algumas características anatômicas das folhas

do gênero Memora foram relatadas por Vidal (1978). Rodrigues et al. (2002) realizaram o

estudo morfoanatômico da Memora allamandiflora Bur. ex K. Schum. e Grassi et al. (2005)

fizeram o estudo fitoquímico da Memora peregrina (Miers) Sandw. Essas duas espécies são

descritas como invasoras de pastagens, de difícil controle.

Dentro desse gênero, encontra-se a espécie Memora nodosa (Silva Manso) Miers,

planta típica do Cerrado, que ocorre nos estados de Goiás, Minas Gerais e Mato Grosso. M.

nodosa é um arbusto, com folhas apresentando folíolos pequenos, flores amarelas e frutos

semelhantes a vagens com várias sementes aladas (PROENÇA; OLIVEIRA; SILVA, 2000).

A M. nodosa, conhecida popularmente como bambuzinho, carobinha-do-campo e

caroba-amarela, é utilizada como planta medicinal. O infuso das folhas e caules da M. nodosa

é empregado, na forma de banho, para cicatrização de feridas e úlceras externas (SIQUEIRA,

1988) e o infuso das raízes, por via oral, para dores abdominais e, na forma de banho no

tratamento de sarnas (SILVA, 1998).

A única descrição morfológica dos órgãos aéreos de M. nodosa encontrada na

literatura foi realizada há mais de cem anos (BUREAU; SCHUMANN, 1897). Na literatura

pesquisada, não há relatos de estudos anatômicos das partes aéreas e subterrâneas, nem dados

sobre a morfologia do órgão subterrâneo dessa planta. Considerando esses fatos, este trabalho

teve como objetivo contribuir com o estudo morfológico dos órgãos vegetativos e

reprodutivos da M. nodosa e caracterizar anatomicamente esses órgãos vegetativos.

39

MATERIAL E MÉTODOS

Material botânico

Para o estudo morfoanatômico foram utilizados exemplares da M. nodosa (Silva

Manso) Miers coletados em regiões de Cerrado dos municípios de Senador Canedo-GO,

Brasil (16o45’01’’S, 49o07’50,6’’W, altitude de 717 m) e de Nerópolis-GO, Brasil

(16o25’15,6’’S, 49o10’07,8’’, altitude de 818 m), e espécimes cultivados de sementes dos

exemplares nativos desses municípios, no Horto de Plantas Medicinais da Faculdade de

Farmácia da Universidade Federal de Goiás (UFG), com dois, seis e doze meses. O material

botânico foi identificado pelo Professor MSc. Heleno Dias Ferreira e as exsicatas, depositadas

no Herbário da UFG sob os registros 29981 (Senador Canedo) e 29982 (Nerópolis).

Caracterização morfológica

A caracterização macroscópica das folhas, dos caules e das raízes da Memora nodosa

foi realizada à vista desarmada e a das flores à vista desarmada e com o auxílio de

microscópio estereoscópico, seguindo os parâmetros de Gonçalves e Lorenzi (2007), Judd et

al. (1999) e Vidal e Vidal (2000). As imagens dos órgãos estudados foram registradas por

máquina digital Sony (MPEG).

Caracterização anatômica

Para o estudo anatômico da M. nodosa empregando microscopia óptica, foram

utilizados amostras de folhas, caules e raízes e, para a microscopia eletrônica de varredura

(MEV), amostras da lâmina dos foliólulos.

Microscopia Óptica

Folhas completamente expandidas, provenientes do quinto nó de plantas nativas e

folhas jovens, do primeiro e segundo nó, a partir do ápice, foram coletadas de plantas nativas

e de plantas cultivadas. Dessas folhas, foram retirados fragmentos da região mediana e do

bordo da lâmina dos foliólulos e das regiões medianas da raque principal, da raque

secundária, do peciólulo e do pecíolo.

40

As gavinhas foram retiradas da região superior dos ramos e os fragmentos obtidos do

seu terço médio.

Os caules e as raízes foram coletados de plantas cultivadas, em diferentes fases de

desenvolvimento, e de plantas nativas. Do caule das plantas cultivadas foram retiradas

amostras da região entre o segundo e terceiro e entre quinto e sexto entrenós e da região basal

(rente ao solo). Do caule de plantas nativas foram retirados fragmentos da região entre o

quinto e sexto entrenós. Da raiz principal das plantas cultivadas foram retirados fragmentos

das regiões superior, média e inferior e da raiz lateral, fragmentos do terço superior e inferior

(próximo ao ápice). Da raiz das plantas nativas foram retirados fragmentos do terço superior.

As secções à mão livre foram realizadas em material fresco. As lâminas histológicas

foram confeccionadas utilizando secções paradérmicas e transversais da lâmina dos foliólulos;

secções transversais do pecíolo, do peciólulo, da raque primária e secundária, da gavinha, dos

caules e das raízes. As secções foram submetidas à dupla coloração com azul de

Alcian/safranina (BUKATSHC1, 1972, apud KRAUS; ARDUIN, 1997) ou azul de

astra/fucsina básica (LUQUE; SOUSA; KRAUS, 1996) e montadas em glicerina 50%.

Para as secções em micrótomo o material botânico (caule e raízes) foi fixado em FPA

70% (formaldeído, ácido propiônico e etanol) (BERLYN; MIKSCHE2, 1976 apud KRAUS;

ARDUIN, 1997), desidratado em série butílica terciária (JOHANSEN, 1940) e incluído em

parafina. As secções, com cerca de 3µm de espessura, foram tratadas com uma série xilol:

etanol, coradas com azul de astra/fucsina básica, de acordo com o método de Bukatsch (1972)

apud Kraus e Arduin (1997), e montadas em verniz vitral (Acrilex) (PAIVA et al., 2006).

A dissociação da epiderme foi realizada segundo Ghouse e Yunus (1972) e as

amostras submetidos à coloração com azul de Alcian e safranina, azul de metileno 1% ou

safranina a 1%. Para os testes microquímicos, as secções foram coradas com cloreto férrico a

1% e reagente de Sudan IV (COSTA, 2001).

As fotomicrografias foram realizadas em fotomicroscópio ZEISS Axioskop,

utilizando-se filme Kodacolor ASA 100.

1 BUKATSCH, F. Bemerkungen zur doppelfarburg astrablau-safranin. Microkosmos, v. 61, n. 8, p. 255, 1972. 2 BERLIN, G. P.; MIKSCHE, J. P. Botanical microtechnique and cytochemistry. Ames: The lowa State Press, 1976.

41

Microscopia Eletrônica de Varredura

Amostras da porção mediana da lâmina dos foliólulos da M. nodosa foram fixadas em

solução de Karnovsky modificada, por 24 horas. Posteriormente, essas amostras foram

transferidas para um tampão cacodilato de sódio e tetróxido de ósmio (1:1) por 1 hora,

lavados em água destilada, desidratados em série etanólica crescente (30%, 50%, 70% e 90%)

durante 15 minutos e em etanol absoluto durante 10 minutos (BOZZOLA; RUSSEL, 1992).

Em seguida, os fragmentos foram levados à secagem ao ponto crítico de CO2, em aparelho de

secagem ao Ponto Crítico da Balzers CPD30, fixados com fita adesiva de dupla face em

pequenos ‘stubs’ e metalizados em ouro, com camada de cobertura de aproximadamente 40

nm por 2 minutos, em Aparelho Metalizador Zeiss DSM-962. As etapas de secagem,

metalização e análise da superfície foram realizadas no laboratório de Microscopia Eletrônica

da Universidade de Brasília (UnB).

A análise foi realizada em Microscópio de Varredura JEOL-JSM 840A e as

eletromicrografias obtidas em filme FUJI NEOPAN Asa 100.

RESULTADOS

No presente estudo, observou-se que a M. nodosa é encontrada de forma esparsa na

região do Cerrado de Goiás. Em áreas abertas e ensolaradas, a planta propaga-se rapidamente

e é facilmente visualizada às margens de rodovias, em terrenos baldios e em áreas desmatadas

para práticas agropecuárias. Um rebrotamento rápido e vigoroso, muitas vezes seguido de

floração, é observado quando a planta é submetida a poda (parcial ou total) e à ação do fogo.

A planta, em seu habitat natural, geralmente floresce de março a agosto, mas

exemplares floridos podem ser encontrados à margem de rodovias e em terrenos baldios

praticamente durante todo o ano.

Caracterização morfológica

A M. nodosa é um arbusto perene, em geral, com 1,5 m a 2,0 m de altura, e pode

atingir 3,0 m cujos caules se agrupam formando touceiras (Figura1A).

O caule é cilindrico e sua cor varia do verde ao marron-esverdeado, é flexível,

escandente, glabro e ceroso, piloso quando jovem. O caule de plantas adultas apresenta

lenticelas organizadas em fileiras longitudinais no terço inferior (Figura 1B). Quando jovens,

42

os caules são eretos e não-ramificados (Figura 1C); quando adultos, apresentam-se fletidos,

com várias ramificações no terço superior (Figura 1D). As gavinhas, presentes nos ramos

jovens, podem fixar-se as plantas vizinhas.

A B

C D

Figura 1 - Aspecto geral do arbusto e detalhes do caule da Memora nodosa (Silva Manso) Miers. Figura 1A - Aspecto geral do arbusto, com caules reunidos em touceira. Figura 1B – Detalhe do caule onde se observam lenticelas (seta). Figura 1C - Aspecto geral dos caules jovem, retos e não-ramificados. Figura 1D – Detalhe das ramificações do caule.

A raiz é pivotante, profunda (Figura 2A), e pode atingir mais de 1,5 m de

comprimento e cerca de 15 cm de diâmetro. Na parte superior da raiz encontra-se uma

estrutura dilatada, arredondada ou alongada, semelhante a um candelabro (Figura 2B), de

43

onde se originam os caules. A raiz da planta nativa é rugosa, pardo-amarelada e com

lenticelas (Figura 2C). Raramente observam-se raízes com ramificações. A raiz principal da

planta cultivada tem cor branca ou amarelo-clara, e alguns espécimes apresentam raiz lateral

(Figura 2D).

A B

C D Figura 2 - Raiz da Memora nodosa (Silva Manso)Miers. Figura 2A - Aspecto geral da raiz, in loco. Figura 2B - Detalhe da estrutura dilatada na porção superior da raiz (seta). Figura 2C - Detalhe da raiz de planta adulta evidenciando lenticela (seta). Figura 2D - Aspecto geral de uma planta cultivada com 12 meses. C: caule; R: raiz principal; Rl: raiz lateral.

44

As folhas da M. nodosa são opostas cruzadas, raramente verticiladas, recompostas,

bipinadas com dois a três pares de folíolos (Fig. 3A), mais raramente quatro ou cinco pares,

que se subdividem geralmente em cinco a sete foliólulos, mas podem chegar a se

subdividirem em nove a onze. As folhas coletadas do quinto nó possuem 32 cm a 57 cm de

comprimento e 33 cm a 75 cm de largura. Os folíolos são opostos e imparipinados. Os

foliólulos são cartáceos, glabros, verde-escuros na face adaxial e verde-claros na face abaxial,

muito brilhantes nas folhas jovens, ovalados-lanceolados ou lanceolados, de base assimétrica,

subarredondada ou cuneada, ápice agudo, margens inteiras (Figura 3A e 3B), nervuras

peninérveas mais proeminentes na face abaxial, com padrão de venação camptódromo-

broquidódromo (Figura 3B). Os foliólulos apresentam 2,0 cm a 8,5 cm de comprimento por

0,2 cm a 1,2 cm de largura. A variação foliar é muito freqüente em M. nodosa e verifica-se

que, em geral, as folhas coletados no topo da planta apresentam foliólulos menores e mais

delicados que os coletados na base. A presença de foliólulos bipinados ou tripinados também

é bastante comum (Figura 3C). Foliólulos terminais modificados em gavinhas podem ser

observados nas folhas que apresentam um ou dois pares de folíolos, no terço superior dos

caules e ramos jovens (Figura 3D) e nas folhas cujas axilas apresentam inflorescência.

A raque principal é subcilíndrica, sulcada superiormente, glabra, com 8 cm a 30 cm

de comprimento. A raque secundária também é subcilíndrica, sulcada superiormente, glabra,

com 3 cm a 17 cm de comprimento. As raques principal e secundária apresentam nodosidades

na face abaxial, no ponto de inserção dos folíolos e dos foliólulos, respectivamente. O pecíolo

é subcilíndrico, reto ou sulcado na face superior, alargado na base, glabro, medindo de 2,0 cm

a 12,5 cm.

A inflorescência é racemosa (Figura 4A), terminal ou axilar, contendo, em geral, de 10

a 16 flores hermafroditas, às vezes moderadamente ramificadas formando panículas e com

brácteas caducas. As flores possuem pedicelos curtos de cor verde-claro, glabros, com

brácteas caducas. O cálice da M. nodosa é tubuloso-turbinado, de cor verde-claro, com 0,9 cm

a 1,3 cm de comprimento, cinco dentado (dentes com 0,1 cm), glabro ou com pêlos

minúsculos nos bordos; glândulas nectaríferas pequenas e proeminentes são observadas sobre

as nervuras, no terço superior do cálice (Figura 4B). A corola é infundibuliforme, com 6,3 cm

a 7,3 cm de comprimento, cor amarelo-ouro, com tonalidade mais escura nos lobos (Figura

4C), externamente glabra e internamente com tricomas glandulares, em grande quantidade, na

base dos estames e na metade superior do tubo e nos lobos. O gineceu apresenta estilete com

3,0 cm a 4,0 cm de comprimento, estigmas bilamelados, ovário súpero, com 0,3 cm a 0,4 cm,

bicarpelar, bilocular com 12 óvulos, sendo seis por lóculo. Presença de disco nectarífero na

45

base do ovário. O androceu com quatro estames férteis, epipétalos, didínamos e um pequeno

estaminódio (0,4 cm a 0,5 cm), anteras amarelas com tecas de 0,3 cm de comprimento. Essa

espécie é constantemente visitada por insetos, principalmente pelas formigas (Figuras 4B,

4C).

A B

C D Figura 3 - Folha da Memora nodosa (Silva Manso) Miers. Figura 3A, - Aspecto geral de uma folha evidenciando suas estruturas. Figura 3B - Detalhes da venação. Figura 3C - Detalhe de um folíolo com variação nos foliólulos (setas). Figura 3D - Detalhe das gavinhas (setas). Fo: folíolo; Fu: foliólulo; Rp: raque principal; Rs: raque secundária; Pe: pecíolo; Pu: peciólulo. Coloração: Figura 3B - Folha diafanizada e corada com safranina 1%.

46

A B

C

Figura 4. Flores da Memora nodosa (Silva Manso) Miers. Figura 4A - Aspecto geral da inflorescência. Figura 4B - Aspecto geral do cálice e destaque das glândulas no terço superior do cálice (seta) . Figura 4C - Aspecto geral da flor.

O fruto da M. nodosa é do tipo cápsula septífraga com 8 cm a 33 cm de comprimento

e 1,1 cm a 3,0 cm de largura, linear ou ligeiramente ondulado, achatado, fortemente e

uniformemente comprimido, agudo nas duas extremidades, margens sub-onduladas e

espessadas e glabro (Figura 5A). O fruto seco é escuro externamente e quando se abre, mostra

duas valvas e uma coluna seminífera presa pela base e circundada por dois filamentos

47

(réplum) (Figura 5B). As sementes (Figura 5B), em número de 2 a 12 por fruto, são aladas e

estão aderidas à coluna seminífera pelo hilo e alas.

A B Figura 5 - Frutos da Memora nodosa (Silva Manso) Miers. Figura 5A - Aspecto geral dos frutos verdes. Figura 5B - Detalhe do fruto seco evidenciando coluna seminífera (cabeça de seta), réplum (setas) e as sementes aladas.

Caracterização anatômica

Lâmina do foliólulo

Em vista frontal, as células epidérmicas, em ambas as faces, são poligonais com

paredes anticlinais retas ou curvas (Figuras 6A e 6B). As células da epiderme da face adaxial

são maiores e apresentam cutícula mais espessa que as da face abaxial. A lâmina do foliólulo

de M. nodosa, em secção transversal, evidencia epiderme inisseriada com cutícula delgada

(Figura 6C). A folha é hipoestomática , com estômatos predominantemente paracíticos, mais

raramente anisocíticos e ciclocíticos (Figura 6B e 6D). Tricomas glandulares e tectores são

observados com mais freqüência nas folhas jovens. Células da epiderme organizadas

radialmente, em formato de roseta, podem ser observadas em cicatrizes de tricomas (Figura

6D).

A eletromicrografia da lâmina do foliólulo, face adaxial, mostra células epidérmicas

com paredes espessadas (Figura 7A). A face abaxial tem relativo denso de estômatos (Figura

7B) e evidencia células estomáticas com paredes internas espessadas (Figura 7C). Cicatriz de

48

tricoma com célula central refrigente e células epidérmicas dispostas radialmente, bem como

tricoma glandulares podem ser observados na face abaxial (Figura 7D).

A lâmina foliar, em corte transversal, é dorsiventral. O parênquima paliçadico com até

seis camadas de células retangulares e justapostas, ocupa mais da metade do mesofilo; o

parênquima lacunoso é plurisetratificado com células de formatos variados (Figura 8A). Os

feixes vasculares de pequeno e médio porte estão envoltos por bainha esclerenquimática; os

de médio porte apresentam extensão de bainha na face adaxial (Figura 8B).

O bordo dos foliólulos da folha adulta, em secção transversal, é agudo, a epiderme está

revestida por cutícula espessa e observa-se colênquima com duas a quatro camadas de células

(Figura 8C). Na folha jovem o bordo é arredondado.

A região da nervura central, em secção transversal, é convexa nas duas faces. As

células epidérmicas, em ambas as faces, são semelhantes no formato, mas as células da face

adaxial são relativamente maiores e revestidas por cutícula mais espessa com flange cuticular;

sob a epiderme, vê-se o colênquima angular com três a quatro camadas de células. O feixe

vascular é do tipo colateral e o sistema vascular está disposto em forma de arco aberto, com

pequenos feixes de floema na face adaxial. Espessa bainha esclerenquimática envolve o

sistema vascular (Figura 8D).

Nas secções transversais da lâmina do foliólulo e da nervura central, coradas com

cloreto férrico a 1% e Sudan III evidenciam-se, respectivamente, compostos fenólicos nos

parênquimas paliçádico, lacunoso e cortical e cutícula espessa.

49

A B

C D Figura 6 - Epiderme do foliólulo da planta adulta da Memora nodosa (Silva Manso) Miers em secção transversal e paradérmica, planta adulta. Figura 6A - Epiderme da face adaxial, em vista frontal. Figura 6B - Epiderme da face abaxial, em vista frontal, evidenciando estômatos. 6C – Destaque para a epiderme da face abaxial em corte transversal. Figura 6D - Detalhe de uma cicatriz de tricoma. Ct: cicatriz de tricoma; Ep:epiderme; Est:estômato; Pl: parênquima lacunoso. Coloração: Figuras 6A, 6B e 6C azul Alcian/safranina; Figura 6D: azul metileno 1%.

50

A B

C D Figura 7 - Eletromicrografias da lâmina do foliólulo da folha Memora nodosa (Silva Manso) Miers, planta adulta. Figura 7A - Aspecto geral da epiderme, face adaxial. Figura 7B - Aspecto geral da epiderme, face abaxial. Figura 7C - Detalhe dos estômatos, mostrando paredes internas espessas. Figura 7D - Detalhe de um tricoma glandular e de uma cicatriz de tricoma mostrando células epidérmicas em disposição radial.

51

A B

Figura 8 - Detalhes do mesofilo, bordo e nervura central do foliólulo da planta adulta da Memora nodosa (Silva Manso) Miers, em secção transversal. Figura 8A - Detalhe do parênquima paliçádico e lacunoso com feixes vasculares de pequeno calibre. Figura 8B - Detalhe de um feixe vascular envolto por bainha esclerenquimática e com extensão da bainha. Figura 8C - Aspecto geral do bordo de folha adulta. Figura 8D - Aspecto geral da nervura central. Cl: colênquima; Ct: cutícula; Eb: extensão de bainha; Epb: epiderme abaxial; Epa: epiderme adaxial; Es: Esclerênquima; Fl: floema; Fv: feixe vascular; Pl: parênquima lacunoso; Pp: parênquima paliçádico; Xi: xilema. Coloração: Figura 8A, azul de astra/fucsina básica. Figuras 8B, 8C e 8D, azul de Alcian/safranina.

52

Raques

As raques principal (Figura 9A) e secundária (Figura 9B) da M. nodosa, em secção

transversal, são convexas nas faces abaxiais e côncavas nas faces adaxiais, com duas

pequenas projeções laterais e apresentam a mesma organização estrutural. A epiderme é

unisseriada, revestida por cutícula espessa com flange cuticular; na região cortical, formada

por colênquima e parênquima, algumas células colenquimáticas apresentam paredes

periclinais internas e anticlinais lignificadas (Figura 9C). O sistema vascular encontra-se

envolto por bainha esclerenquimática e a região central preenchida por parênquima medular,

constituído por células de tamanhos variados (Figuras 9A, 9B e 9C).

Peciólulo e Pecíolo

Em secção transversal, o peciólulo da M. nodosa é côncavo na face adaxial, com duas

projeções laterais e convexo na abaxial, semelhante às raques (Figura 10A). O pecíolo é reto

ou côncavo na face adaxial e convexo na abaxial (Figura 10B). A organização estrutural do

peciólulo e pecíolo é semelhante e consiste de epiderme unisseriada revestida por cutícula

espessa, com flange cuticular; parênquima cortical constituído por quatro a oito camadas de

células; no pecíolo algumas células do parênquima cortical encontram-se parcialmente

lignificadas (Figura 10C). Calotas esclerenquimáticas (Figuras 10A, 10B e 10C) envolvem o

sistema vascular; na região central, o parênquima medular apresenta células de tamanhos

variados, algumas com paredes espessas evidenciando pontuações (Figura 10D).

53

A B

C Figura 9 - Raque principal e raque secundária da folha da Memora nodosa (Silva Manso) Miers, em secção transversal. Figura 9A - Aspecto geral da raque principal. Figura 9B - Aspecto geral da raque secundária. Figura 9C - Detalhe da organização estrutural da raque secundária. Ct: cutícula; Epb: epiderme abaxial; Epa: epiderme adaxial; Es: esclerênquima; Fl: floema; Pc: parênquima cortical; Pm: parênquima medular; Xi: xilema. Coloração: azul de Alcian/safranina.

54

A B

C D Figura 10 - Peciólulo e pecíolo da folha da Memora nodosa (Silva Manso) Miers, em secção transversal. Figura 10A - Aspecto geral do peciólulo. Figura 10B - Aspecto geral do pecíolo. Figura 10C - Detalhe da organização estrutural do pecíolo. 10D, detalhe do parênquima medular do pecíolo, evidenciando pontuações (setas). Ct: cutícula; Epb: epiderme abaxial; Es: Esclerênquima; Fl: floema; Pc: parênquima cortical; Pm: parênquima medular; Tg: tricoma glandular; Xi= xilema. Coloração: Figura 10A, azul de astra/fucsina básica; Figuras 10B, 10C e 10D, azul de Alcian/safranina.

55

Gavinhas

A gavinha da M. nodosa, em seção transversal, apresenta forma cilíndrica (Figura

11A), epiderme unisseriada com cutícula espessa, evidenciando flange cuticular; na região

cortical, subjacente à epiderme observam-se colênquima angular e parênquima. O cilindro

vascular apresenta calotas esclerenquimáticas (Figuras 11A e 11B) externamente ao floema;

a região central está preenchida por parênquima medular, com células de tamanhos variados

(Figura 11B).

A B Figura 11 - Gavinha da Memora. nodosa (Silva Manso) Miers, em secção transversal. Figura 11A - Aspecto geral. Figura 11B - Detalhe da estrutura organizacional. Cl: colênquima; Ct: cutícula; Ep: epiderme; Es: esclerênquima; Fl: floema; Pc: parênquima cortical; Pm: parênquima medular; Xi: xilema. Coloração: azul Alcian/safranina

Tricoma glandular com pedicelo curto, cabeça pluricelular, globosa ou alongada é

observado na face abaxial da lâmina do foliólulo e na face adaxial das raques principal,

secundária, no pecíolo e no peciólulo das folhas jovens e nas gavinhas (Figuras 12A e 12B).

Tricoma glandular peltado, com pedicelo curto, cabeça pluricelular são encontrados na face

adaxial da raque principal e da raque secundária das folhas jovens (Figura 12C). Tricomas

tectores simples, unicelular ou pluricelulares são observados nas raques e peciólulos das

folhas coletadas do 5oentrenó de planta nativa (Figura 12D).e nos foliólulos das folhas jovens.

56

A B

C D Figura 12 - Tricomas glandulares e tector das folhas da Memora nodosa (Silva Manso) Miers. Figura 12 A - Aspecto geral de um tricoma glandular com cabeça globosa na face adaxial do pecólulo. Figura 12B -.Aspecto geral de um tricoma glandular com cabeça alongada na lâmina foliar do foliólulo. Figura 12C - Aspecto geral de um tricoma glandular peltado na face adaxial da raque principal. Figura 12D - Detalhe de um tricoma tector simples na raque secundária. Coloração: Figura 12A, azul de astra/fucsina básica; Figuras 12B, 12C, e 12D, azul de Alcian/safranina.

Caule

Secções transversais do caule da M. nodosa cultivada, entre o segundo e terceiro

entrenós, mostram epiderme unisseriada com tricomas tectores simples, unicelulares e

bicelulares, relativamente curtos (Figura 13A); tricoma glandular com pedicelo curto, cabeça

volumosa e pluricelular (Figura 13B) e estômatos salientes (Figura 13C). O parênquima

cortical é constituído por quatro a cinco camadas de células; no cilindro vascular, os feixes

vasculares apresentam calotas esclerenquimáticas externas ao floema e, nessa fase de

desenvolvimento, observa-se câmbio interfascicular em início de atividade. Na região central,

parênquima medular, com células de tamanhos variados.

57

A

B C Figura 13 - Caule da Memora nodosa (Silva Manso) Miers, em secção transversal (planta cultivada). Figura 13A - Aspecto geral. Figura 13B - Detalhe da epiderme com tricoma glandular e tricomas tectores. Figura 13C - Detalhe de um estômato saliente e tricoma tector. Ep: epiderme; Est: estômato; Tg: tricoma glandular; Tt: tricoma tector. Coloração: azul de astra/fucsina básica.

Na região basal do caule de planta cultivada, em secção transversal, evidencia-se

estrutura secundária, porém epiderme com tricomas glandulares, tricomas tectores e

estômatos ainda é observada (Figura 14A, 14B e 14C). A periderme é de origem

subepidérmica, o parênquima cortical é constituído de células com paredes delgadas e

tamanhos variados (Figura 14C). Calotas esclerenquimáticas são observadas externamente ao

floema. O xilema secundário apresenta elementos de vaso predominantemente isolados, com

diâmetros variados e raios parenquimáticos unisseriados. No floema secundário os raios

parenquimáticos também são unisseriados (Figura 14D). A região medular é constituída por

58

células parenquimáticas com paredes delgadas e tamanhos variados (Figura 14B e 14D).

Grande quantidade de cristais pode ser observado nos parênquimas cortical e medular (Figura

14D e 14E, luz polarizada).

A B C

D E Figura 14 - Caule de Memora nodosa (Silva Manso) Miers, em secção transversal (região basal, planta cultivada). Figura 14 A - Aspecto geral do caule. Figura 14 B – Aspecto geral do caule evidenciando epiderme com tricoma glandular e tector, parênquima cortical e cilindro vascular em estrutura secundária. Figura 14 C – Detalhe da epiderme com estômato, periderme e parênquima cortical. Figura 14D – Detalhe dos cristais no parênquima cortical e medular (cabeças de setas) e dos raios parenquimáticos no xilema e floema. 14 E – Destaque para os cristais no parênquima cortical e medular sob luz polarizada. Es: esclerênquima; Est: estômato; Fl: floema; Pc: parênquima cortical; Per: periderme; Pm: parênquima medular; Tg: tricoma glandular Tt: tricoma tector; Xi: xilema. Coloração: azul de Alcin/safranina.

59

Secções transversais do caule de M. nodosa nativa, entre o sexto e sétimo entrenós

evidenciaram epiderme, parênquima cortical com paredes primárias delgadas e algumas com

espessamento secundário lignificado nas paredes anticlinais e periclinais internas (Figura 15A

e 15B). Presença de calota esclerenquimática externamente ao floema. Floema secundário

apresentando raios unisseriados e bisseriados e fibras organizadas em faixa horizontal. O

xilema apresenta elementos de vaso de diâmetros variados, predominantemente isolados, com

raios parenquimáticos unisseriados e bisseriados. Nessa fase de desenvolvimento xilema

primário é observado. Medula apresentando parênquima com células de tamanhos variados,

com paredes lignificadas (Figura 15C).

A B

C Figura 15 - Caule de Memora nodosa (Silva Manso) Miers, em secção transversal (planta nativa). Figura 15A – Aspecto geral do caule de planta nativa. Figura 15B – Destaque para a epiderme, parênquima cortical com células parcialmente lignificadas (cabeça de seta), calota esclerenquimática e sistema vascular. Figura 15C – Destaque para xilema secundário, primário e medula. Ep: epiderme; Es: esclerênquima; Est: estômato; Fl: floema; Pc: parênquima cortical; Pm: parênquima medular; Xip: xilema primário; Xis: Xilema secundário. Coloração: azul de Alcin/safranina.

60

Raiz

A raíz da M. nodosa cultivada (seis meses) em secção transversal, na região dos pêlos

absorventes, mostra estrutura primária. A epiderme é unisseriada e o parênquima cortical é

formado por várias camadas de células de tamanhos variados. O cilindro vascular apresenta

estrutura poliarca e a região central está preenchida por parênquima medular, constituído por

células de tamanhos variados (Figura 16A). Observa-se que o número de pólos xilemáticos

varia ao longo da raiz principal (Figuras 16A e 16B).

Secção transversal, no terço médio, de uma raiz cultivada (doze meses) evidencia

início de crescimento secundário, com periderme de origem superficial e endoderme com

estrias de Caspary (Figuras 17A e 17B). No cilindro vascular observam-se raios

parenquimáticos unisseriadas e bisseriados no floema e xilema secundários e vários pólos de

xilema primário; o parênquima medular mostra células com paredes delgadas e tamanhos

variados (Figura 17A). Em fase de desenvolvimento posterior, observam-se, no parênquima

cortical e floemático, ráfides em grande quantidade e estilóides.

Secção transversal no terço superior de uma raiz lateral de uma planta cultivada (12

meses) evidencia estrutura semelhante à raiz principal, porém com células do parênquima

medular esclerificadas (Figura 17C).

A raiz de uma planta adulta, em secção transversal no terço superior, evidencia

periderme e lenticelas, floema secundário com raios parenquimáticos que mostram de uma a

quatro séries de células e fibras em faixas horizontais (Figura 18A). Xilema secundário com

elementos de vaso de diâmetros variados, isolados ou em grupos de dois ou três, raios com

uma a quatro séries de células e grupos de fibras esclerenquimáticas dispostas em faixas

horizontais (Figura 18B).

61

A

B Figura 16 - Raiz da Memora nodosa (Silva Manso) Miers, em estrutura primária, secção transversal de planta com seis meses de cultivo. Figura 16A - Aspecto geral de uma raiz, na região dos pêlos absorventes.Figura 16B - Detalhe do cilindro central evidenciando seis pólos de xilema, endoderme e periciclo. En: endoderme; Fl: floema; MXi: metaxilema; Pa: pêlo absorvente; Pc: parênquima cortical; Pec: periciclo; Pm: parênquima medular. Coloração: azul de astra/fucsina básica.

62

A

B C Figura 17 - Raiz da Memora nodosa (Silva Manso) Miers, em secção transversal (planta cultivada). Figura 17A - Raiz principal em início de crescimento secundário, aspecto geral. Figura 17B - Detalhe da endoderme evidenciando estrias de Caspary. Figura 17C - Aspecto geral de uma raiz lateral., com destaque para células esclerificadas no parênquima medular. Ec: estrias de Caspary; En: endoderme; Es: esclerênquima; Fl: floema; MXi: metaxilema; Pc: parênquima cortical; Per: periderme; Pm: parênquima medular; Coloração: Figuras 17A e 17B, azul de astra/fucsina básica; Figura 17C, azul de Alcian/safranina.

63

A

B Figura 18 - Raiz da Memora nodosa (Silva Manso) Miers, em crescimento secundário avançado, em secção transversal (planta nativa). Figura 18A - Detalhe da periderme e região floemática. Figura 18B - Detalhe da região xilemática. Ca: câmbio vascular; Es: esclerênquima; Fl: floema; Pc: parênquima cortical; Pm: parênquima medular; Ra: raios. Coloração: azul de Astra/fucsina básica.

DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

A Memora nodosa é uma planta do Cerrado e que se perpetua em áreas onde a

vegetação nativa foi retirada e pode tornar-se indesejada. Em Goiás, é comum encontrá-la em

áreas de cerrado degradado e, nos últimos tempos, em áreas destinadas à agropecuária. Essas

características são similares às observadas em relação à Memora peregrina por Nunes (1999),

à Memora allamandiflora por Rodrigues et al. (2002) e a outras espécies da família

Bignoniaceae (DUARTE; JUNGERSEN, 2006; LORENZI, 2008; SOUZA; LOPES;

ALMEIDA, 2007).

Os caules jovens, eretos e sem ramificações, dispostos em grupos assemelham-se ao

bambu (Bambusa sp.), o que justifica a denominação popular de bambuzinho dada a essa

espécie.

64

As características macroscópicas das partes aéreas dos exemplares da M. nodosa,

analisados neste trabalho correspondem às descritas na Flora Brasiliensis (BUREAU;

SCHUMANN, 1897) para essa espécie. As características das folhas também se enquadram

na descrição para o gênero Memora realizada por Vidal (1978). Folhas com folíolos

pequenos, descritos por Proença, Oliveira e Silva (2000) para as folhas de M. nodosa foram

observados principalmente nas folhas dos caules ou ramos terminais quando as

inflorescências estão presentes. A variabilidade foliar, observada na espécie em estudo, foi

relatada por Seibert (1948) como freqüente nas trepadeiras da família Bignonicaceae e por

Vidal (1978) como característica do gênero Memora.

Caule com estrutura anômala, característico de várias espécies da família

Bignoniaceae (GENTRY, 1980), não foi observado na M. nodosa. Também não foi

constatada a presença de caule subterrâneo (NUNES, 1999) ou de rizomas (LORENZI, 2008)

relatados para a Memora peregrina. Quanto à estrutura subterrânea, observa-se na M. nodosa

um sistema radicular desenvolvido, composto por raiz pivotante. Estrutura radicular com

essas características foi observada por Rodrigues et al. (2002) na M. allamandiflora.

Segundo Seibert (1948), o uso das características florais para delimitação do gênero na

família Bignoniaceae não é apropriado. Barroso et al. (1999) também relatam que, nessa

família, nem sempre é fácil a determinação do gênero tomando-se por base apenas as

características do fruto e destacam a necessidade de se considerar também as informações

oferecidas pelas partes vegetativas da planta. Assim, em estudo sobre o uso de glândulas nas

considerações taxonômicas da família Bignoniaceae, Seibert (1948) destacou, para o gênero

Memora, a presença de glândulas no cálice e na corola. Em M. nodosa, observam-se

glândulas sobre as nervuras no terço superior do cálice. Na corola não se observam glândulas,

mas muitos tricomas glandulares na face interna do tubo, lobos e na base dos estames.

Diversos estudos relatam que os nectários extraflorais (NEFs) estão envolvidos na

proteção contra a herbivoria. A proteção contra herbívoros é dependente, em certos casos, da

interação benéfica entre as plantas e as formigas, sendo estás atraídas pelos produtos dos

NEFs (KOPTUR; RICO-GRAY; PALACIOS-RIO, 1998; OLIVEIRA; LEITÃO-FILHO,

1987). Em M. nodosa não foram observados NEFs, mas a presença de grande quantidade de

tricomas glandulares na corola, de glândulas no cálice e do disco nectarífero na base do ovário

da flor, pode ser a explicação para a grande quantidade de insetos que visitam a planta, em

especial as formigas.

A descrição dos frutos e das sementes da M. nodosa está de acordo com os relatados

por Barroso et al. (1999) para o gênero Memora.

65

Quanto às características anatômicas, verifica-se que a epiderme da face adaxial e

abaxial do foliólulo da M. nodosa apresenta células com paredes retas ou curvas, mais

delgadas e sinuosas na face abaxial. Esse dado está de acordo com o observado por Vidal

(1978) para o gênero Memora e com Rodrigues et al. (2002) que descreveram para M.

allamandiflora presença de células epidérmicas, da face adaxial, levemente onduladas e mais

espessas e da face abaxial, com formato irregular, devido a ondulações das paredes

anticlinais. A epiderme da face adaxial do foliólulo, das raques, peciólulo e pecíolo da M.

nodosa está revestida por cutícula espessa. Segundo Vannuci e Rezende (2003), cutículas

espessas ocorrem em plantas que vivem em ambientes secos, pois a impregnação de cutina

auxilia na redução da perda excessiva de água.

A folha da M. nodosa é hipoestomática, com estômatos predominantemente

paracíticos, embora também sejam observados estômatos anisocíticos e ciclocítico. Esses três

tipos de estômatos foram descritos por Metcalfe e Chalk (1979) para espécies da família

Bignoniaceae, enquanto Rodrigues et al. (2002) relataram a presença de estômatos paracíticos

na M. allamandiflora. A grande variedade morfológica e anatômica dos estômatos pode estar

associada a adaptações dos vegetais em locais com restrição de água (SENA; ZAIDAN;

CASTRO, 2007). O mesofilo da M. nodosa é dorsiventral, característica observada em

Pyrostegia venusta (Ker Gawl.) Miers (DUARTE; JUNGENSEN, 2007), Jacaranda

decurrens Chamisso, Anemopaegma arvense (Vell) Stellff. ex de Souza e Zeyheria montana

Mart. (MAURO et al., 2007) e M. allamandiflora (RODRIGUES et al., 2002), espécies da

família Bignoniaceae.

As raques primária e secundária, o pecíolo e o peciólulo da M. nodosa apresentam

características anatômicas comuns, como: epiderme unisseriada revestida por cutícula

espessa, sistema vascular envolvido por calotas esclerenquimáticas e parênquima medular

com células de tamanhos variados. Essas características também foram descritas por

Rodrigues et al. (2002) para a M. allamandiflora.

Segundo Vidal (1978), tricomas tectores e glandulares (discóides, elipsóides ou

capitado-peltado), variando de poucos a numerosos, esparsos ou dispersos em séries sobre as

nervuras, ocorrem em ambas as faces dos foliólulos das espécies do gênero Memora. Esse

dado foi constatado por Rodrigues et al. (2002) para a M. allamandiflora. Em M. nodosa,

tricomas glandulares com cabeça pluricelular globosa ou alongada, bem como, tricomas

tectores são observados nas folhas jovens. Nas folhas completamente expandidas foram

observados tricomas glandulares, em pequena quantidade, e cicatrizes de tricomas, facilmente

reconhecidas pela disposição radial das células da epiderme, o que dá a estrutura o aspecto de

66

roseta. Essas cicatrizes também fora descritas por Rodrigues et al. (2002) para M.

allamandiflora.

A M. nodosa (Silva Manso) Miers apresentou características morfoanatômicas comuns

às espécies de diferentes gêneros da família Bignoniaceae. Mas, observou-se que existem

características que contribuem para a identificação desse táxon. Morfologicamente: arbusto

com caules cilíndricos, flexíveis e agrupados em touceiras; raiz pivotante, profunda; folhas

opostas, recompostas com foliólulos lanceolados ou ovalado lanceolado, imparipenadas com

nodosidade no ponto de inserção dos folíolos e foliólulos; inflorescência racemosa, com flores

amarelo-ouro, disco nectarífero na base do ovário e glândulas no terço superior do cálice,

tricomas glandulares na face interna do tubo, lobos da corola e na base dos estames; fruto

septífrago, com abertura longitudinal, com réplum e sementes aladas. Anatomicamente:

parênquima paliçádico pluriestratificado ocupando mais da metade do mesofilo, cutícula

espessa, geralmente com flange cuticular, estômatos predominantemente paracíticos, tricomas

glandulares na face abaxial do foliólulo e nas demais estruturas da folha jovem; feixes

vasculares com calotas esclerenquimáticas espessas, muitas vezes unidas formando bainhas

esclerenquimáticas. Caule sem estrutura anômala.


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70

ARTIGO 2

COMPOSIÇÃO E VARIABILIDADE QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL DAS

FOLHAS DE Memora nodosa (SILVA MANSO) MIERS (BIGNONIACEAE)

71

RESUMO

O óleo essencial das folhas da Memora nodosa (Silva Manso) Miers coletadas em sete

localidades diferentes do Cerrado de Goiás e Minas Gerais, foi analisado por CG (DIC) e

CG/EM. O benzaldeído e o 1-octen-3-ol foram os principais constituintes. Os resultados

foram submetidos à Análise de Componentes Principais e Análise de Agrupamentos o que

possibilitou a distinção de duas classes diferenciadas em relação ao local da amostragem e aos

constituintes. A Classe I, constituída pela população de folhas de Goiânia-GO, Rio Verde-

GO, Nerópolis-GO e Uberlândia-MG com 1-octen-3-ol (7 ± 1,0% ) e o trans-2-hexenal (0,9 ±

0,3%) em teores mais elevados, como constituintes discriminantes. A Classe II, constituída

pelas folhas de Paraúna-GO, Senador Canedo-GO e Caldas Novas-GO, apresentou os mais

elevados teores de benzaldeído (93,1% ± 1%). Verificou-se uma forte correlação entre a

composição química dos óleos essenciais com a coordenada geográfica do local da

amostragem, sendo o 1-octen-3-ol produzido principalmente em biotipos com altitudes

elevadas.

Palavras-chave: Óleo essencial. Benzaldeído. 1-octen-3-ol. Variabilidade química.

72

INTRODUÇÃO

A família Bignoniaceae composta por 120 gêneros e cerca de 800 espécies apresenta

plantas lenhosas, arbustivas, arbóreas e trepadeiras (JOLY, 2002). As espécies dessa família

têm ampla distribuição nas regiões tropicais de todo o mundo, principalmente da América do

Sul e África, das quais algumas são cultivadas como ornamentais (GENTRY, 1980).

Em decorrência de modificações ambientais, espécies da família Bignoniaceae

tornaram-se invasoras, dentre as quais se destacam-se as integrantes do gênero Memora

(GRASSI et al., 2005; RODRIGUES et al., 2002).

No estado de Goiás (Brasil), a Memora nodosa (Silva Manso) Miers encontra-se

amplamente distribuída e é observada em áreas de Cerrado, à margem de rodovias e em

terrenos baldios (TRESVENZOL et al., 2005). Dados etnofarmacológicos descrevem o uso

das folhas e dos caules de M. nodosa, em forma de banho, na cicatrização de feridas e nas

úlceras externas (SILVA, 1998) e o uso das raízes, em forma de chá em dores abdominais e

em forma de banho, no tratamento de sarnas (SIQUEIRA,1988).

Uma amostra do óleo essencial obtido das folhas de M. nodosa coletadas na cidade de

Senador Canedo-GO apresentou atividade antimicrobiana para bactérias Gram-positivas e

Gram-negativas e Candida albicans (TRESVENZOLet al., 2007a); o extrato etanólico bruto

do lenho da raiz mostrou atividade antimicrobiana para bactérias Gram-positivas

(TRESVENZOL et al., 2007b).

Este estudo analisou a composição do óleo essencial de M. nodosa e avaliou a

variabilidade química dos óleos obtidos das folhas coletadas em sete localidades do Cerrado

brasileiro (Goiás e Minas Gerais).

MATERIAL E MÉTODOS

Material botânico

As amostras das folhas Memora nodosa foram coletadas em agosto e setembro/2006

em seu habitat natural, região de Cerrado, em seis cidades do estado de Goiás, Brasil: Caldas

Novas (17o42’53,5’’S, 48o39’24,7’’W, 687 m), Senador Canedo (16o45’1’’S, 49o07’50,6’’W,

717 m), Nerópolis (16o25’15,6’’S, 49o10’07,8’’, 818 m), Paraúna (16o57’35,6’’S,

73

50o25’42,4’’W, 626 m), Rio Verde (17o34’’ 09,7’’S, 40o40’09,7’’W, 620 m), Goiânia

(16o41’31,6’’S, 49o18’35,5’’W, 755 m); e em uma cidade do estado de Minas Gerais, Brasil:

Uberlândia (19o09’0,25’’S, 48o09’56,4’’W, 876 m). As amostras foram identificadas por um

dos autores (J.R.P.) e as exsicatas depositadas no Herbário da Universidade Federal de Goiás

com os seguintes registros 29978 (Uberlândia-MG), 29979 (Caldas Novas-GO), 29981

(Senador Canedo-GO), 29982 (Nerópolis-GO), 30272 (Paraúna-GO), 29860 (Rio Verde-GO),

29980 (Goiânia-GO).

Em cada cidade, folhas de vários indivíduos antes da floração foram coletadas, secas à

temperatura ambiente até peso constante e trituradas em moinho de faca. Amostras

constituídas por 200 g do pó das folhas foram submetidas à hidrodestilação em aparelho de

Clevenger modificado por 2 horas. Ao final de cada destilação, o óleo foi coletado, seco em

Na2SO4 anidro, transferido para frasco âmbar e guardado à temperatura de -18oC até a

realização das análises.

Análise do óleo essencial

As amostras do óleo essencial foram analisadas em um cromatógrafo gasoso Varian

(DIC) equipado com coluna capilar de sílica fundida CB-SIL-5CB (30 m × 0,25 mm de

diâmetro, filme com espessura de 0,25 µm) e a seguinte programação de temperatura:

60°−240°C a 3°C/min, até 280°C a 10°C/min e, finalmente, 280°C por 10 min. O N2 foi

usado como gás de arraste com fluxo de 1,0 mL/min, com o injetor em temperatura de 220oC

e o detector a 240°C. As amostras foram injetadas no modo split a uma razão de divisão de

1:20.

A análise em CG/EM foi realizada em um aparelho Shimadzu QP5050A usando uma

coluna capilar de sílica fundida SBP-5 (Shimadzu) (30 m × 0,25 mm; filme com 0,25 µm de

espessura, composto por 5% de fenilmetilpolisiloxano) e temperatura programada conforme

descrita anteriormente. O gás de arraste foi o He em uma razão de fluxo de 1,0 mL/min.; as

amostras foram injetadas no modo split a uma razão de divisão 1:20, com a temperatura do

injetor de 220°C. Os parâmetros significativos de operação do quadrupolo MS foram:

temperatura da interface 240°C; ionização por impacto de elétrons de 70 eV com intervalo de

massa entre 40-400 m/z em uma razão de amostragem de 1,0 scan/s. Os componentes do óleo

essencial foram identificados através da comparação dos índices de retenção e espectros de

massas com os dados contidos na literatura (ADAMS, 2007) e por comparação com

74

espectroteca própria do aparelho (NIST, 1998). Os índices de retenção foram calculados

através da co-injeção de uma série homologa de n-alcanos e aplicação da equação de Van Den

Dool e Kratz (1963)

Variabilidade química

A Análise do Componente Principal (PCA) foi aplicada para examinar as inter-

relações entre as populações e seus constituintes químicos, usando-se o pacote do software

SPAD.N (LEBART et al.,1994). A análise de agrupamentos foi empregada para estudar a

similaridade das amostras, considerando-se a distribuição dos constituintes. A técnica do

vizinho mais próximo, utilizando-se o algoritmo de Benzécri, também foi realizada para

verificar a similaridade entre as amostras (BENZÉCRI et al., 1980) e os agrupamentos

hierárquicos foram formados de acordo com o método de Variância Mínima de Ward

(WARD, 1963).

A Análise de Discriminante Canônico (ADC) foi realizada, usando-se o procedimento

SAS DISCRIM (SAS, 1996), para fazer a distinção entre as classes, considerando a

composição do óleo. O prognóstico da habilidade das funções discriminantes lineares foi

avaliado pela validação cruzada aplicada no SAS. Valores de p < 0,05 foram considerados

significativos.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os óleos essenciais obtidos das folhas de M. nodosa apresentaram coloração variando

de incolor a levemente amarelo, odor forte, irritante e rendimento de 0,1% a 0,3%. O óleo,

quando exposto à luz e ao ar, adquiriu, rapidamente, a coloração avermelhada, que se

intensificou com o passar do tempo.

Na Tabela 1, são apresentados os resultados da análise qualitativa e quantitativa, com

os constituintes voláteis listados em ordem de eluição na coluna SBP-5. No total, cinco

substâncias foram identificadas, perfazendo 97,5%-100% dos constituintes voláteis. Os

resultados obtidos pela Análise de Componentes Principais (PCA) indicaram uma grande

variabilidade na composição do óleo essencial, com aproximadamente 78% de retenção da

variação acumulada no primeiro plano fatorial.

75

Tabela 1 - Composição percentual dos constituintes químicos do óleo essencial das folhas de M. nodosa coletadas em sete localidades do Cerrado do Brasil Central

Compostos RI Uberlândia

Caldas Novas

Senador Canedo

Nerópolis

Paraúna

Rio Verde

Goiânia

Trans-2-hexenal 847 0,3% - - 1,2% 0,55% 1,1% 1,0%

Benzaldeído 958 89,6% 94,2% 91,8% 92,1% 93,3% 90,1% 89,8%

1-octen-3-ol 976 8,4% 3,3% 5,8% 6,75% 3,1% 5,5% 7,2%

3-octanol 993 0,3%

Linalool 1099 0,4% - 0,7% - 1,0% 0,7% 0,9%

Comp. não-

identificado

1317 1,3% 2,5% 1,4% - 2,0% 2,5% 1,0%

Composto não-identificado: MM: 133, m/z: 51 (58%), 63 (7%), 74 (12%), 77 (100%), 89 7%), 105 (98%), 106 (91%), 115 (16%), 133 (26%).

A Figura 1 mostra a posição relativa das populações e os constituintes discriminantes

em relação ao sistema de eixos originados pelo PCA. O constituinte discriminante

benzaldeído localiza-se na parte direita da PC-1, enquanto, o 1-octen-3-ol e o trans-2-hexenal,

em PC-2, ocupam os valores negativos da componente principal. Assim, duas classes

puderam ser obtidas: classe I, caracterizada pela composição química das folhas das

populações de Goiânia-GO, Rio Verde-GO, Nerópolis-GO e Uberlândia-MG contendo os

maiores teores de 1-octen-3-ol (7 ± 1,0%) (p<0,026) e trans-2-hexenal (0,9 ± 0,3%) (p<0,031)

e a classe II, composta pelas populações de Paraúna-GO, Senador Canedo-GO e Caldas

Novas-GO, com os mais elevados teores de benzaldeído (93,1 ± 1,0%) (p<0,025).

76

-2 0 2

-2

0

cluster IIcluster I

3-octanol

-1.2

trans-2-hexenal

1-octen-3-ol

benzaldehyde

-1.0

-0.6

1.00.6

0.0

0.0

PC-2b

PC-1b

Senador Canedo

Caldas Novas

Paraúna

Uberlândia

GoiâniaNerópolis

Rio Verde

PC-2

(26.

8%)a

PC-1 (50.7%)a

Figura 1 – Distribuição em classes dos constituintes químicos dos óleos essenciais da Memora nodosa Coletados no Cerrado do Brasil Central. Classe I ( ) e Classe II ( ). aEixos referentes aos escores dos locais das amostras. bEixos referentes aos escores dos constituintes do óleo (Tabela 1) com discriminantes variáveis representados por vetores partindo da origem. Os valores entre parênteses representam as porcentagens da variância retida, em cada Componente Principal da PCA.

A Análise de Discriminante Canônico foi realizada para avaliar a capacidade

discriminante dos constituintes químicos (Tabela 2), que possibilita, uma melhor diferenciação

entre as classes (WOLD; ERIKSSON, 1995). Os resultados indicaram que a primeira função

discriminante reteve 100% da variabilidade total, sendo possível predizer, com total precisão a

classificação correta das amostras nas classes originais pelo teste de validação cruzada. Essa

técnica envolve grande número de modificações dos dados originais, estima os parâmetros de

cada um desses dados modificados e, posteriormente, calcula a precisão das predições para

cada resultado do modelo. A classe I mostrou a mais alta correspondência com a função

discriminante (F1) devido à correlação positiva com o trans-2-hexenal, enquanto a classe II

esteve mais relacionada com a contribuição do benzaldeído.

77

Tabela 2 - Resumo da análise de discriminante canônico dos óleos essenciais da M. nodosa. A. Funções discriminates Autovalores Porcentagem Correlação Lambda F GL p relativa canônica de Wilks

F1 5,329 100,0 0,92 0,158 10,659 2,4 0.025

B. Coeficientes normalizados trans-2-Hexenal Benzaldeído

F1 0,89 - 0,95

C. Escores canônicos das médias das classes Classe I Classe II

F1 1,69 -2,25

D. Validação cruzada Porcentagem total de classificação correta Classe I Classe II Total 75 100,0 87,5 Número de amostras = 7; variáveis discriminantes: trans-2-hexenal e benzaldeido.

A análise de agrupamentos foi utilizada para estudar a similaridade da composição

químicas das amostras dos óleos essenciais da M. nodosa em relação ao local da coleta. O

dendrograma (Figura 2) mostra a relação entre os vizinhos mais próximos e evidencia a

similaridade na composição química dos óleos essenciais de M. nodosa, em relação ao local

de coleta, definida pelas classes I e II, de acordo com o método da minimização da variância

de Ward.

78

1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0

Euclidean distance

Senador Canedo

Caldas Novas

Paraúna

Nerópolis

Uberlândia

RioVerde

Goiânia

Sam

plin

g si

tes

Figura 2 - Dendrograma mostrando a relação de similaridade entre os vizinhos na composição química dos óleos da M. nodosa, obtido de acordo com o método da minimização da variância de Ward.

Adicionalmente, observou-se forte correlação entre a composição química dos óleos

essenciais com a coordenada geográfica do local de amostragem. O 1-octen-3-ol foi

principalmente produzido por biotipos de altitudes mais elevadas: Uberlândia (8,4%),

Nerópolis (6,75%), Goiânia (7,2%), Senador Canedo (5,8%), com coeficiente de correlação,

0,94; p < 0,05).

A variabilidade química dos óleos essenciais já está bem documentada e pode ocorrer

devido aos quimiotipos, fases de desenvolvimento da planta, fatores ambientais, tipo de

cultivo, entre outros fatores (SIMÕES et al., 2004).

A presença do benzaldeído no óleo essencial de M. nodosa pode estar relacionada com

mecanismos de defesa da planta contra a predação por microrganismos, insetos e herbívoros.

Essa afirmação encontra respaldo na literatura. Bezerra et al. (2006) concluíram que o

benzaldeído, presente no óleo essencial das raízes de Petiveria alliaceae (Phytolacaceae) era o

princípio ativo responsável pela atividade nematicida contra Meloidogyne incognita, um

fitoparasita que causa graves problemas à agricultura. Fasolin et al. (2007) verificaram que o

óleo essencial do Tanaecium nocturnom (Barb. Rodr.) Bur. & K. Shum. (Bignoniaceae), rico

em benzaldeído (88,4-96%) apresentou elevada toxicidade para larvas do besouro Tenebrio

molitor L.

Classe I

Classe II

79

No presente estudo foi possível especular que o polimorfismo químico da espécie M.

nodosa é apenas um fator que contribui para a diferença nos perfis dos óleos essenciais das

populações que crescem naturalmente em diferentes locais. Adaptações genéticas a um

ambiente específico é um outro fator que deve ser levado em consideração.


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82

ARTIGO 3

COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO ÓLEO ESSENCIAL E ATIVIDADE

ANTIMICROBIANA DA Memora nodosa (SILVA MANSO) MIERS

83

RESUMO

A Memora nodosa (Silva Manso) Miers é uma planta medicinal encontrada na região

do Cerrado brasileiro e utilizada popularmente como cicatrizante de feridas e no tratamento de

sarnas. Neste trabalho avaliaram-se a composição química e a atividade antimicrobiana do

óleo essencial obtido das folhas da M. nodosa e a atividade antimicrobiana dos extratos

etanólicos das folhas, caules e raízes e das frações obtidas do extrato das raízes. Na triagem

realizada pelo método de difusão em ágar, o extrato etanólico bruto das raízes apresentou

halos de inibição de 15 mm para Bacillus subtilis e Micrococcus roseus, 13 mm para

Staphylococcus aureus e 12 mm para Bacillus cereus. A concentração inibitória mínima

(CIM) do extrato etanólico bruto das raízes foi de 3,12 mg/mL para Staphylococcus

epidermides, M roseus e B. subtilis. Entre as frações obtidas do extrato das raízes, a fração

hexano apresentou CIM de 0,39 mg/mL contra M. roseus, Micrococcus luteus, Bacillus

cereus e Candida albicans. A fração diclorometano apresentou CIM de 0,39 mg/mL contra S.

epidermides, M. luteus, M. roseus, Bacillus cereus e B. subtilis. No óleo essencial, extraído

das folhas, da M. nodosa foram identificados o benzaldeído, como componente majoritário,

(91,5%) e o 1-octen-3-ol (6,0%), o linalol (0,8%), o 3-octanol (0,5%) e a mandelonitrila

(1,2%), como componentes minoritários. O óleo essencial apresentou CIM de 0,78 mg/mL a

1,56 mg/mL para bactérias Gram-positivas e C. albicans e 1,56 mg/mL a 3,12 mg/mL contra

bactérias Gram-negativas. Concluiu-se, com este estudo, que os extratos etanólicos obtidos

das folhas e caules não mostraram atividade antimicrobiana significativa contra os

microrganismos testados. O extrato etanólico das raízes apresentou atividade antimicrobiana

fraca, mas as frações hexano e diclorometano, obtidas desse extrato, mostraram atividade

antimicrobiana de moderada a forte contra bactérias Gram-positivas e Candida albicans. Os

extratos e as frações não mostraram atividade contra bactérias Gram-negativas. A maior

atividade antimicrobiana do óleo essencial das folhas de M. nodosa, quando comparado com o

benzaldeído, o componente majoritário, sugere ação sinérgica entre os componentes desse

óleo essencial.

Palavras-chave: Atividade antimicrobiana. Concentração inibitória mínima. Planta do

cerrado. Benzaldeído.

84

INTRODUÇÃO

A pesquisa de novos agentes antimicrobianos faz-se necessária em razão do

surgimento de microrganismos resistentes e de infecções oportunistas fatais associadas à

AIDS, à quimioterapia antineoplásica e aos transplantes (PENNA et al., 2001). Uma das

alternativas para o controle desses microrganismos é intensificar a busca de novas moléculas

com atividade antimicrobiana em plantas (LIMA, 2001; FERRONATO et al., 2007). Ostrosky

et al. (2008) relataram a importância desses estudos como primeiro screening na descoberta

da atividade farmacológica de novos agentes antimicrobianos, principalmente em um país

como o Brasil, que oferece imensa biodiversidade.

Infecções humanas, particularmente aquelas envolvendo pele e mucosas, constituem

sério problema de saúde, especialmente em países tropicais e subtropicais, sendo os fungos

dermatófitos e a levedura Candida spp os patógenos mais freqüentes (PORTILLO et al.

2001). O fungo Candida albicans é uma levedura oportunista que causa infecção sistêmica

em pessoas predispostas, comumente pacientes com o sistema imunológico comprometido ou

submetidos a tratamento prolongado com antibióticos (ZHANG et al., 2002). Entretanto, as

informações disponíveis sobre plantas medicinais ativas contra esse fungo, com raras

exceções, ainda não resultaram em formulações efetivas para o uso humano ou animal

(DUARTE, 2006).

No Brasil, várias espécies da família Bignoniaceae são utilizadas popularmente por

suas propriedades medicinais, muitas delas relacionadas com problemas cutâneos e

inflamatórios. Assim, Macedo e Ferreira (2004) relataram a utilização de espécies dos gêneros

Jacaranda, Tabebuia e Zeyheria em doenças na pele, por comunidades tradicionais da Bacia

do Alto Paraguai (MT). Siqueira (1988), estudando plantas do Cerrado, descreveu o uso de

Cybistax antisyphilitica Mart. como depurativo do sangue e no tratamento de cancro venéreo,

erupções na pele e úlceras; de Jacaranda brasiliana Pers. no tratamento de afecções cutâneas,

reumatismo e sífilis; de Zeyhera digitalis (Vell.) Hoehne em moléstias de pele e Memora

nodosa (Silva Manso) Miers no tratamento de feridas e úlceras externas. Agra, Freitas e

Barbosa-Filho (2007) destacaram o uso de Jacaranda caroba (Vell.) A. DC. no tratamento de

sífilis e úlceras e de Tabebuia avellanedae Lorenz ex Griseb. no tratamento de câncer,

problemas hepáticos e inflamações da pele. Apesar do reconhecimento da importância

etnofarmacológica da família Bignoniaceae muitas espécies dessa família ainda necessitam de

estudos farmacológicos e entre elas destacam-se as espécies do gênero Memora.

85

A Memora nodosa (Silva Manso) Miers é encontrada em região de Cerrado, com

ampla distribuição em Goiás, Minas Gerais e Mato Grosso (MOBOT, 2008; VIDAL, 1978).

Conhecida popularmente como carobinha, caroba-amarela e bambuzinho, essa planta é uma

espécie arbustiva, com flores amarelas (PROENÇA; OLIVEIRA; SILVA, 2000). Siqueira

(1988) relatou a utilização das folhas e dos caules de M. nodosa no tratamento de feridas e

úlceras externas. Silva (1998) descreveu a utilização do chá das raízes para dores abdominais

e na forma de banho, para o tratamento de sarnas. Estudos realizados por Tresvenzol et al.

(2005) evidenciaram a presença de heterosídeos saponínicos e flavonóides nas folhas, caules e

raízes e presença de óleo essencial nas folhas de M. nodosa.

Soares (2008) verificou que o extrato etanólico das folhas de M. nodosa apresentou

eficácia razoável na proteção contra ninfas do carrapato Amblyomma cajannense, responsável

pelo parasitismo de várias espécies de mamíferos, inclusive do homem. Esse carrapato é

considerado o principal vetor de Rickettsia rickettsii, agente causal da febre maculosa (DIAS;

MARTINS, 1939).

Este trabalho teve como objetivo determinar a composição química do óleo essencial

obtido das folhas da M. nodosa e avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos

brutos das folhas, caules e raízes, das frações obtidas das raízes e do óleo essencial dessa

planta.

MATERIAL E MÉTODOS

Material botânico

O material botânico, constituído por folhas, caules e raízes de Memora nodosa, foi

coletado no município de Senador Canedo-GO, Brasil (16o45’1’’S, 49o07’50,6’’W, 717 m),

no mês de janeiro de 2006. Uma exsicata foi depositada no herbário da Universidade Federal

de Goiás (UFG) sob o registro UFG- 29981. O material botânico foi fragmentado, seco em

estufa com circulação de ar à temperatura de 40˚C e triturado em moinho de facas até a forma

de pó para a preparação dos extratos etanólicos. Uma amostra das folhas foi seca à

temperatura ambiente, triturada e destinada à extração do óleo essencial.

86

Preparação dos extratos, frações e óleo essencial.

Os extratos etanólicos das folhas (EF), caules (EC) e raízes (ER) da M. nodosa foram

obtidos por maceração em etanol a 95%, seguida de concentração em rotaevaporador em

temperatura de 40˚C. O extrato etanólico das raízes (10 g) foi solubilizado em uma mistura

metanol/água (7:3) e extraído seqüencialmente com hexano (três aliquotas de 50 mL), com

diclorometano (três aliquotas de 50 mL) e com acetato de etila (três aliquotas de 50 mL) para

obtenção, após a concentração em rotoevaporador, das frações hexano (FH), diclorometano

(FD), acetato de etila (FAc) e aquosa (FA), segundo metodologia adaptada de Ferri (1996).

O óleo essencial das folhas foi obtido por hidrodestilação em aparelho de Clevenger

modificado, durante duas horas (COSTA, 2001).

Avaliação da atividade antimicrobiana

O perfil de susceptibilidade dos extratos etanólicos brutos foi investigado,

inicialmente, por meio do teste de difusão em meio sólido, empregando a técnica do poço em

dupla camada de acordo com Salvador et al. (2002) e Stefanello, et al. (2006), com pequenas

modificações. A concentração inibitória mínima (CIM) dos extratos etanólicos brutos e das

frações foi realizada pelo método de diluição em placa (NCCLS, 2003). Foram utilizadas nos

testes cepas padrão American Type Culture Collection (ATCC) e de isolados pertencentes à

bacterioteca do Laboratório de Bacteriologia Médica do Instituto de Patologia Tropical e

Saúde Pública da UFG.

Para a triagem utilizaram-se culturas de Staphylococcus aureus (ATCC 6538),

Micrococcus roseus (ATCC 1740), Bacillus cereus (ATCC 14576), Enterobacter cloacae

(HMA/FTA 502), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), Escherichia coli (ATCC 8739),

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Serratia marcescens (ATCC 14756) e Candida

albicans (NTC 2010). Para a determinação da CIM, além dos microrganismos citados

anteriormente foram utilizadas as bactérias Bacillus subtilis (6633), Bacillus

stearothermophylus (ATCC 1262), Micrococcus luteus (ATCC 9341), Staphylococcus aureus

(ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Escherichia coli 8739 e

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).

Os microrganismos foram cultivados em caldo tioglicolato (Difco), incubados a 37oC

por 24-48 horas e em seguida repicados em ágar simples inclinado (Difco). O inóculo foi

87

preparado em salina esterilizada com turbidez equivalente à metade da escala 1,0 de

MacFarland (NCCLS, 2003; DEUSCHLE et al., 2007).

Para a realização do teste de difusão em poço, as placas foram preparadas em duas

camadas. A camada base foi obtida pela adição de 20 mL de ágar Mueller Hinton (Difco) em

placas de 20 mm x 150 mm. Após a solidificação, uma segunda camada contendo 100 µL da

suspensão microbiana incorporada em 10 mL de ágar Mueller Hinton a 45oC, foi adicionada.

Orifícios com 5 mm de diâmetro foram confeccionados na superfície do ágar e a esses poços

adicionaram-se 10 µL dos extratos (EF, EC, ER) diluídos em DMSO 1:3 (p/v) e 10 µL de

dimetilsulfóxido (DMSO) como controle negativo. As placas com bactérias Gram-positivas

receberam como controle um disco de penicilina (Oxoid®10µg) e as com bactérias Gram-

negativas um disco de eritromicina (Oxoid® 15µg). As placas foram mantidas à temperatura

ambiente por duas horas para difusão dos extratos e, posteriormente incubadas a 37˚C por 24

horas para as bactérias e 48 horas para o fungo Candida albicans. Decorrido o período de

incubação, os halos de inibição do desenvolvimento microbiano foram mensuradas, em

milímetros. O experimento foi realizado em triplicata.

A CIM para os extratos, frações e óleo essencial foi realizada pela incorporação de

quantidades variadas das respectivas amostras, obtidas por diluições seriadas 1:2 em DMSO a

19 mL de ágar Mueller Hinton, de modo a se obterem placas com concentrações dos extratos

etanólicos brutos variando de 50 mg/mL a 1,50 mg/mL e de 12,5 mg/mL a 0,19 mg/mL para

as frações e óleo essencial. Para o controle do solvente, uma placa contendo 1,0 mL de

DMSO foi preparada nas mesmas condições. Os inóculos microbianos foram aplicados com

o auxílio do inoculador de Steers (STEERS; FOLTZ; GRAVES, 1959). As placas foram

incubadas a 37˚C por 24 horas para as bactérias e 48 horas para o fungo Candida albicans.

Foi considerada CIM a menor concentração dos extratos, frações e óleo essencial que

inibiram o desenvolvimento das bactérias e do fungo.


A amostra do óleo essencial obtido das folhas de M. nodosa foi analisada em um

cromatógrafo gasoso Varian (DIC) equipado com coluna capilar de sílica fundida CB-SIL-

5CB (30 m × 0,25 mm de diâmetro, filme com espessura de 0,25 µm) e com a seguinte

programação de temperatura: 60°−240°C a 3°C/min, até 280°C a 10°C/min e, finalmente,

280°C por 10 min. O N2 foi usado como gás de arraste com fluxo de 1,0 mL/min, com o

88

injetor em temperatura a 220oC e o detector a 240°C. As amostras foram injetadas no modo

split a uma razão de divisão de 1:20.

A análise em CG/EM foi realizada em um aparelho Shimadzu QP5050A usando uma

coluna capilar de sílica fundida SBP-5 (Shimadzu) (30 m × 0,25 mm; filme com 0,25 µm de

espessura, composto por 5% de fenilmetilpolisiloxano) e temperatura programada conforme

descrita anteriormente. O gás de arraste foi o He em uma razão de fluxo de 1,0 mL/min e o

modo split a uma razão de divisão de 1:20, com temperatura do injetor de 220°C. Os

parâmetros significativos de operação do quadrupolo MS foram: temperatura da interface de

240°C; ionização por impacto de elétrons de 70 eV, com intervalo de massa entre 40-400 m/z

em uma razão de amostragem de 1,0 scan/s. Os componentes do óleo essencial foram

identificados por comparação dos índices de retenção e espectros de massas com os obtidos

na literatura (ADAMS, 2007; ÔMURA; KUWAHARA; TANABE, 2002) e por comparação

com espectroteca própria do aparelho (NIST, 1998). Os índices de retenção foram calculados

pela co-injeção de uma série homóloga de n-alcanos e aplicação da equação de Van Den Dool

e Kratz (1963).

RESULTADOS

Avaliação da atividade antimicrobiana

Os extratos etanólicos das folhas, caules e raízes da M. nodosa foram obtidos com

rendimento de 12%, 5,5% e 4,2%, respectivamente.

O controle negativo mostrou que o DMSO não interferiu no padrão de susceptibilidade

dos microrganismos testados. Em relação aos controles positivos, observou-se que todas as

bactérias Gram-positivas testadas foram sensíveis à penicilina, com halos de inibição

variáveis. Quanto às bactérias Gram-negativas testadas, apenas o Enterobacter aerogenes não

desenvolveu halo de inibição sob a ação da eritromicina.

Entre os extratos etanólicos brutos, o extrato da raiz (ER) foi o que apresentou melhor

atividade antimicrobiana, com halos de inibição de 15 mm para Bacillus subtilis e

Micrococcus roseus, 13 mm para Staphylococcus aureus e 12 mm para Bacillus cereus.

Quanto a CIM os melhores resultados foram 3,12 mg/mL para S. epidermides, M. roseus e B.

subtilis e CIM de 6,25 mg/mL para S. aureus (ATCC 6539), M. roseus, B. cereus e C.

albicans (Tabela 1).

89

Tabela 1 - Concentração inibitória mínima e halo de inibição para os extratos etanólicos brutos das folhas, caules e raízes de M. nodosa .

EF EC ER Antibióticos MICRORGANISMOS CIM

mg/mL (Halo-mm)

CIM mg/mL

(Halo-mm)

CIM mg/mL

(Halo-mm)

(Halo-mm)

Bactérias Gram-positivas não esporuladas

Penicilina 10µg

Staphylococcus aureus ATCC 25923 25 (-) 50 (-) 6,25 (-) - Staphylococcus aureus ATCC 6538 50 (11) 50 (9) 6,25 (13) 18 Staphylococcus epidermidis ATCC 12229

25 (-) 25 (-) 3,12 (-) -

Micrococcus roseus ATCC 1740 12,5 (10) 6,25 (12) 3,12 (15) 20 Micrococcus luteus ATCC 9341 50 (-) 12,5 (-) 6,25 (-) - Bactérias Gram-positivas esporuladas Bacillus cereus ATCC 14576 12,5 (10) 6,25 (9) 6,25 (12) 12 Bacillus stereathermophylus ATCC 1262 50 (-) 25 (-) 12,5 (-) - Bacillus subtilis (atropheus) 6633 12,5 (T) 12,5 (9) 3,12 (15) 37 Bactérias Gram-negativas Eritromicina

15µg Enterobacter cloacae HMA/FTA 502 50 (N) 50 (N) 50 (N) 8 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 50 (N) 50 (N) 50 (N) N Escherichia coli ATCC 8739 50 (-) 50 (-) 50 (-) - Escherichia coli ATCC 11229 50 (N) 50 (T) 50 (T) 18 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 50 (9) 25 (10) 12,5 (11) 11 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 50 (-) 50 (-) 25 (-) - Serratia marcescens ATCC 14756 50 (N) 50 (N) 50 (N) 14 Fungo Candida albicans NTC 2010 50 (T) 50 (T) 6,25 (9) - T: traços; N: não houve halo de inibição; (-): não-testado; EF: extrato etanólico folhas; EC: extrato etanólico caule; ER = extrato etanólico das raízes.

Como o extrato etanólico das raízes foi o que apresentou melhor atividade

antimicrobiana, quando comparados aos extratos etanólicos das folhas e caules, ele foi

fracionado e as CIM das frações determinadas.

Para as frações obtidas do extrato etanólico bruto das raízes, o rendimento foi de 10%

(fração hexano), 16,6% (fração diclorometano), 9,6% (fração acetato de etila) e 62,3% (fração

aquosa).

As frações hexano e diclorometano foram ativas contra bactérias Gram positivas e

contra o fungo Candida albicans. Para a fração hexano foi obtida a CIM de 0,39 mg/mL

contra as bactérias M. roseus, M. luteus e B. cereus e contra o fungo C. albicans. Para a fração

diclorometano, a CIM foi de 0,39 mg/mL contra as bactérias S. epidermides, M. luteus, M.

roseus, B. cereus e B. subtilis (Tabela 2).

Tabela 2 - Concentração inibitória mínima para as frações (FH, FD, FAc, FA) das raízes da M. nodosa.

90

MICRORGANISMOS

FH CIM

(mg/mL)

FD CIM

(mg/mL)

FAc CIM

(mg/mL)

FA CIM

(mg/mL) Bactérias Gram-positivas não esporuladas

Staphylococcus aureus ATCC 6538

1,56 3,25 12,5 > 12,5

Staphylococcus aureus ATCC 25923

0,78 0,78 12,5 > 12,5

Staphylococcus epidermidis ATCC 12229

1,56 0,39 3,12 > 12,5

Micrococcus roseus ATCC 1740 0,39 0,39 3,12 > 12,5 Micrococcus luteus ATCC 9341 0,39 0,39 12,5 > 12,5 Bactérias Gram-positivas esporuladas

Bacillus cereus ATCC 14576 0,39 0,39 12,5 > 12,5 Bacillus stereathermophylus ATCC 1262

1,56 3,12 > 12,5 > 12,5

Bacillus subtilis (atropheus) 6633 0,78 0,39 3,15 > 12,5 Bactérias Gram-negativas Enterobacter cloacae HMA/FTA 502

> 12,5 > 12,5 > 12,5 > 12,5

Enterobacter aerogenes ATCC 13048

> 12,5 > 12,5 > 12,5 > 12,5

Escherichia coli 8739 > 12,5 > 12,5 > 12,5 > 12,5 Escherichia coli ATCC 11229 > 12,5 > 12,5 > 12,5 > 12,5 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

12,5 12,5 6,25 > 12,5

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

12,5 12,5 6,25 > 12,5

Serratia marcescens ATCC 14756 > 12,5 > 12,5 > 12,5 > 12,5 Fungo Candida albicans NTC 2010 0,39 0,78 > 12,5 > 12,5 FH: fração hexano; FD: fração diclorometano; FAc: fração acetato de etila; FA: fração aquosa.


O óleo essencial extraído das folhas da M. nodosa apresentou odor forte e

desagradável, com rendimento de 0,2% .

Por meio da análise qualitativa (CG/EM) e quantitativa (CG/DIC) foram detectados

seis componentes no óleo essencial da folhas da M. nodosa, perfazendo 100% dos

constituintes voláteis, dos quais o benzaldeído foi o componente majoritário (Tabela 3). A

identificação do componente mandelonitrila foi realizada por comparação do espectro de

massa obtido do óleo essencial com o espectro de massa de amostra autêntica relatada na

literatura (ÔMURA; KUWAHARA; TANABE, 2002).

91

Tabela 3 - Composição química do óleo essencial das folhas de M. nodosa.

Compostos Índice de retenção Porcentagem Benzaldeído 958 91,5% 1-octen-3-ol 975 6,0% 3-octanol 994 0,5% Linalol 1099 0,8% Mandelonitrila 1316 1,2%

Como o óleo essencial das folhas da M. nodosa apresentou o benzaldeído como

componente majoritário, ao avaliar-se a atividade antimicrobiana desse óleo essencial,

avaliou-se também a atividade antimicrobiana do análogo sintético do benzaldeído (PA).

O óleo essencial obtido das folhas da M. nodosa apresentou CIM de 0,78 mg/mL para

as bactérias M. luteus e B. subtilis e CIM de 1,56 mg/mL a 3,12 mg/mL para os demais

microrganismos. Para o benzaldeído (Sigma), obteve-se a CIM de 1,56 mg/mL para as

bactérias M. luteus, B. stereathermophylus, B. subtilis e E. coli (ATCC 9739) e a CIM

variando de 3,12 mg/mL a 6,25 mg/mL para os demais microrganismos (Tabela 4).

Tabela 4 - Concentração inibitória mínima do óleo essencial das folhas da M. nodosa e do benzaldeído (Sigma)

Bactérias Gram-positivas não esporuladas Óleo essencial CIM (mg/mL)

Benzaldeído CIM (mg/mL)

Staphylococcus aureus ATCC 6538 1,56 3,12 Staphylococcus aureus ATCC 25923 1,56 3,12 Staphylococcus epidermidis ATCC 12229 1,56 3,12 Micrococcus roseus ATCC 1740 1,56 3,12 Micrococcus luteus ATCC 9341 0,78 1,56 Bactérias Gram-positivas esporuladas Bacillus cereus ATCC 14576 1,56 3,12 Bacillus stereathermophylus ATCC 1262 1,56 1,56 Bacillus subtilis (atropheus) 6633 0,78 1,56 Bactérias Gram-negativas Enterobacter aerogenes ATCC 13048 3,12 6,25 Escherichia coli ATCC 9739 1,56 1,56 Escherichia coli ATCC 11229 3,12 3,12 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 3,12 3,12 Serratia marcescens ATCC 14756 3,12 3,12 Fungo Candida albicans NTC 2010 1,56 3,12

92


Na avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos brutos das folhas,

caules e raízes realizou-se, inicialmente, uma triagem empregando o método de difusão em

meio sólido. Em relação ao halo de inibição, Duarte (2006) ressaltou que não existe um

consenso entre os pesquisadores em relação ao nível de inibição aceitável para os extratos

vegetais. A obtenção de halos de inibição menores para os extratos vegetais, quando

comparados com antibióticos padrão, é normal visto que os extratos vegetais apresentam

grande diversidade de constituintes e, nessas misturas, substâncias com atividades

antimicrobianas podem estar presentes em concentrações muito pequenas, inferiores ao do

antibiótico padrão. Neste experimento, os extratos que produziram halos de inibição de 8 mm

a 13 mm foram considerados moderadamente ativos e os com halo ≥ 14 mm foram

considerados como muito ativos (MOTHANA; LINDEQUIST, 2005; KARAMAN et al.,

2001).

Fennel et al. (2004) relataram que as diferentes metodologias empregadas para a

avaliação da atividade antimicrobiana, os diferentes microrganismos e cepas e as diferentes

concentrações usados nos testes dificultam a comparação do perfil de susceptibilidade

antimicrobiano de produtos naturais. Aligianis et al. (2001) utilizando o método da diluição

em caldo para a determinação da CIM sugeriram uma faixa de valores para definir o potencial

antimicrobiano. Assim, para esses pesquisadores a CIM ≤ 500 µg/mL corresponderia a

inibição forte; a CIM entre 600 µg/mL a 1500 µg/mL a inibição moderada; e CIM ≥ 1600

µg/mL, a inibição fraca.

Considerando os parâmetros propostos por Aligianis et al. (2001), verificou-se o

extrato etanólico do caule mostrou fraca atividade contra as bactérias Micrococcus roseus e

Bacillus cereus e o extrato etanólico das raízes da M. nodosa apresentou fraca atividade

antimicrobiana contra a maioria das bactérias Gram-positivas e contra o fungo Candida

albicans. O que o extrato etanólico das folhas da M. nodosa não apresentou atividade

antimicrobiana contra aos microrganismos testados e nenhum extrato mostrou-se efetivo

contra bactérias Gram-negativas. Quanto às frações obtidas das raízes da M. nodosa

observou-se que as frações hexano e diclorometano apresentaram potencial antimicrobiano

variando de bom (CIM de 0,39 mg/mL) a moderado (CIM de 0,78 mg/mL a 1,56 mg/mL)

contra bactérias Gram-positivas esporuladas e não-esporuladas e contra o fungo C. albicans.

A relevante atividade antimicrobiana verificada para as frações hexano e

diclorometano contrapõe-se à fraca atividade do extrato etanólico bruto das raízes. Esse

93

resultado sugere a importância do screening dos extratos e das respectivas frações para a

consideração sobre a atividade biológica de determinada espécie vegetal. No estudo realizado

com o extrato etanólico das raízes da M. nodosa pode-se concluir que as substâncias com

atividades antimicrobianas estão concentradas nas frações hexano e diclorometano, que

compõem menos de 30% desse extrato.

As atividades antimicrobianas de outras espécies da família Bignoniaceae foram

analisadas e observaram-se resultados semelhantes aos obtidos para os extratos brutos da M.

nodosa. Owolabi, Omogbai e Obasuyi (2007) estudaram a atividade antimicrobiana do extrato

etanólico bruto da Kigelia africana (Lam.) Benth. contra isolados clínicos das bactérias E.

coli, S. aureus, P. aeruginosa e contra o fungo C. albicans. Os resultados mostraram CIM de

5,2 mg/mL a 7,3 mg/mL para S. aureus e 6,4 mg/mL a 9,5 mg/mL para C. albicans. Não

houve inibição do crescimento das bactérias E. coli e P. aeruginosa. Zatta et al. (2007)

avaliaram a atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos brutos da Jacaranda decurens

Cham. e obtiveram CIM de 2,18 mg/mL a 4,37 mg/mL para bactérias Gram-positivas e de

8,75 mg/mL a 35 mg/mL para bactérias Gram negativas. Haque et al. (2006) estudando a

atividade antimicrobiana de Stereospermum chelonoides pelo método de difusão em disco,

obtiveram halos de inibição considerados moderados para as bactérias Gram-positivas e

Gram-negativas e para os fungos C. albicans, Aspergillus niger e Saccharomyces cereviseae.

Rasadah e Houghton (1998) avaliaram a atividade antimicrobiana de algumas espécies da

família Bignoniaceae e constataram que os extratos brutos de todas as espécies estudadas

mostraram potencial antimicrobiano contra as bactérias Gram-positivas, B. subtilis e S.

aureus. Desses extratos, o obtido do caule da Tabebuia spectabilis foi o que apresentou maior

atividade antimicrobina. Pouca ou nenhuma atividade foi observada contra as bactérias Gram-

negativas E. coli e P. aeruginosa e contra o fungo C.albicans. Em relação às substâncias

isoladas de Bignoniaceae, Gafner et al. (1996) relataram que as naftoquinonas isoladas das

raízes de Newbouldia laevis mostraram atividade antimicrobiana contra os fungos

Cladosporium cucumerinum e C. albicans e contra as bactérias B. subtilis e E. coli.

A menor atividade dos agentes antimicrobianos contra as bactérias Gram-negativas

pode ser explicada pela maior complexidade da parede estrutural dessas bactérias, que é

constituída por membrana plasmática interna e membrana celular externa, separadas por uma

camada de glicopeptídeos, as quais, juntas, servem de obstáculo aos agentes antimicrobianos

(HOLLEY; PATEL, 2005). Segundo Denyer e Maillard (2002), os lipopolissacarídeos da

membrana externa dessas bactérias possuem carga negativa, responsável em grande parte pela

94

impermeabilidade aos antimicrobianos, pois a penetração de moléculas hidrofóbicas é lenta e

a de moléculas hidrofílicas fica limitada ao tamanho dos canais definidos pelas porinas.

No óleo essencial obtido das folhas da M. nodosa o benzaldeído destacou-se como

componente majoritário (91,5%). Embora esse composto já tenha sido descrito como

componente de outros óleos essenciais (FLAMINI; TEBANO; CIONI, 2007; BEZERRA et

al., 2006; SEN-SUNG et al., 2006, YOUNG-CHEOL et al., 2005; SHENG-YAN; PIN-FUN;

SHANG-TZEN, 2005), apenas no óleo essencial das folhas de Tanaecium nocturnum (Barb.

Rodr.) Bareau & K. Schum., outra espécie da família Bignoniaceae, ele foi encontrado em

porcentagem tão elevada (96%) (GOTTLIEB et al. 1981). Dos demais componentes do óleo

essencial das folhas da M. nodosa, o linalol está presente no óleo essencial de grande

variedade de plantas (Citrus sinensis L., Citrus aurantium L Cinnamomum zeylanicum Nees,

Croton cajucara Benth., Jacaranda copaia (Aubl.) D. Don, Salvia sclarea L., Hyptis conferta

Pohl ex Benth.), em proporções variadas (CHAVES et al., 2006, CUNHA, 2005; FERREIRA

et al., 2005; ZAGHBI; ANDRADE; MAIA, 2000). O 1-octen-3-ol foi encontrado no óleo

essencial de Jacaranda copaia (Aubl.)D. Don (14,6%) e Adenocalymma alliaceum Miers

(3%), duas espécies da família Bignoniaceae, mas pode ser detectado, em pequenas

porcentagens, em espécies de outras famílias, o mesmo ocorrendo com o 1-octanol (DUARTE

et al., 2005; ZAGHBI; ANDRADE; MAIA, 2000). Quanto à mandelonitrila, nos

levantamentos bibliográficos realizados, sua presença só havia sido relatada no óleo essencial

do T. nocturnum (FAZOLIN, et al., 2007a; PIMENTEL et al., 2008).

O óleo essencial extraído das folhas da M. nodosa mostrou atividade de moderada a

fraca contra bactérias Gram-positivas (CIM de 0,78 mg/mL), Gram-negativas (CIM de 1,56

mg/mL) e contra o fungo C. albicans (CIM de 1,56 mg/mL). Comparando-se as atividades

antimicrobianas do óleo essencial das folhas da M. nodosa e do benzaldeído, constatou-se que

a atividade deste último é menor, sugerindo, portanto, ação sinérgica entre o benzaldeído e os

demais componentes do óleo, os álcoois 1-octen-3-ol, 1-octanol, linalol e a mandelonitrila.

A atividade do benzaldeído contra microrganismos, nematódios e insetos está relatada

na literatura e pode estar relacionada com mecanismos de defesa da planta contra predadores.

Bezerra et al. (2006) concluíram que o benzaldeído, presente no óleo essencial das raízes da

Petiveria alliaceae era o princípio ativo responsável pela ação nematicida contra Meloidogyne

incognita. Fasolin et al. (2007a) verificaram que o óleo essencial da Tanaecium nocturnum,

contendo benzaldeído como componente majoritário, apresentou elevada toxicidade contra as

larvas do besouro Tenebrio molitor L. Em outro estudo, Sen-Sung et al. (2006) avaliaram a

atividade antifúngica do benzaldeído e verificaram que este apresentou IC50 > 500 µg/mL

95

contra Laetiporus sulphureus, de 291 µg/mL a 309 µg/mL contra Lenzites betulina e de 485

µg/mL a 505 µg/mL contra Trametes versicolor. Hyun-Kyung, Jun-Ran e Young-Joon (2004)

verificaram que o benzaldeído apresenta atividade acaricida (1,93 µg/cm2) contra Tyrophagus

putrecentiae. Quanto aos demais componentes do óleo essencial das folhas da M. nodosa, a

ação antisséptica do linalol foi descrita por Simões e Spitzer (2004) como superior ao do

próprio fenol. Nenhum relato foi encontrado sobre a atividade antimicrobiana do 1-octen-3-ol

e do 1-octanol.

Outro componente do óleo essencial das folhas da M. nodosa que merece atenção é a

cianidrina mandelonitrila. Embora esse composto esteja presente em pequena quantidade

(1,2%), sua hidrólise libera ácido cianídrico, substância muito tóxica para os organismos

vivos. Fazolin et al. (2007b) relataram que o ácido cianídrico, liberado pela hidrólise da α-

(benziloxi)-mandelonitrila e mandelonitrila, presentes no óleo essencial da Tanaecium

nocturnum (88,4% de benzaldeído), pode ser o responsável pela atividade inseticida desse

óleo sobre o gorgulho do milho (Sitophilus zeamanis Motsch.).

Pimentel et al. (2008) observaram que a concentração de madelonitrila no óleo

essencial do caule da Tanaecium nocturnum teve redução significativa com a secagem (de

13,21% para 2,11%), com uma correlação inversa em relação aos teores de benzaldeído, que

aumentaram de 71,61% para 83,16%. Segundos esses autores dados, semelhantes foram

obtidos em outros trabalhos que relataram a conversão de mandelonitrila em benzaldeído com

liberação de HCN, promovida pela temperatura e atividade enzimática, visto que a

madelonitrila liase, catalisadora da reação, apresenta atividade máxima entre 35oC e 40oC.

O relato de Soares (2008) sobre a moderada atividade repelente do extrato etanólico

das folhas da M. nodosa sobre o carrapato Amblyomma cajannense leva-nos a questionar se

essa atividade está relacionada com a presença do benzaldeído e da mandelonitrila no extrato

etanólico das folhas e se o efeito repelente poderia ser maior, se o extrato etanólico fosse

preparado com folhas frescas. Assim, verifica-se a necessidade de mais estudos sobre o óleo

essencial da M. nodosa, visando avaliar a influência da temperatura na porcentagem de

benzaldeído e mandelonitrila, bem como na avaliação do potencial das folhas dessa planta

como inseticida natural.

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102

ARTIGO 4

AVALIAÇÃO DA AÇÃO DOS EXTRATOS ETANÓLICOS DAS FOLHAS E RAÍZES

DA Memora nodosa (SILVA MANSO) MIERS NA CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS

CUTÂNEAS EM RATOS.

103

RESUMO

A Memora nodosa (Silva Manso) Miers é uma planta medicinal encontrada na região

do Cerrado brasileiro. As folhas e caules dessa planta são utilizados popularmente para

tratamento de feridas e úlceras externas, enquanto as raízes são empregadas para dores

abdominais e no tratamento da sarna. Neste trabalho avaliou-se a atividade cicatrizante das

soluções aquosas a 2% preparadas com os extratos etanólicos das folhas (EF) e das raízes

(ER) da M. nodosa. Para isso utilizou-se 54 ratos divididos em três grupos (tratados com ER,

EF e controle), subdivididos em três subgrupos (n=6) para avaliação do processo de

cicatrização no 4o, 7o e 14o dias do pós-operatório (PO). Uma ferida de 10 mm de diâmetro foi

realizada na região dorsal-cervical dos ratos e tratadas, diariamente, com EF, ER e controle

(água destilada). As feridas foram fotografadas logo após o procedimento cirúrgico e no 4o, 7o

e 14o dias do PO, quando do sacrifício dos animais, para a avaliação da contração da área

lesada. Fragmentos foram retirados para avaliação histológica e submetidos à coloração pela

hematoxilina-eosina, picro-sírius e imunoistoquímica para VEGF. A avaliação pela

imunoistoquímica mostrou atividade angiogênica dos grupos tratados com EF e ER, em

relação ao grupo controle, no 7o dia do PO. Não houve diferença estatisticamente significante

na contração das feridas entre os grupos tratados com EF e ER e o controle no 4o, 7o e 14o dias

do pós-operatório (PO). Entretanto, pode-se constatar pela análise macroscópica e histológica,

que o grupo tratado com a solução aquosa a 2%, preparada com o extrato das raízes,

apresentou reepitelização mais rápida da área lesada. A alantoína, isolada do extrato etanólico

das raízes, pode ser considerada o princípio ativo responsável pela aceleração na

reepitelização. O grupo de animais tratados com EF não apresentou atividade cicatrizante, em

relação ao grupo controle, nas condições do experimento.

Palavras-chave: Cicatrização de feridas. Alantoína. Atividade angiogênica.

104

INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas, verificaram-se grandes avanços na compreensão dos diversos

fatores e fenômenos relacionados com o processo de reparação tissular, bem como no

desenvolvimento de novos recursos e tecnologias no tratamento de feridas. Entretanto, muito

ainda precisa ser descoberto, em especial para ser utilizado em países subdesenvolvidos, onde

a incidência e a prevalência de lesões crônicas são muito elevadas, principalmente em

portadores de diabetes (MALDELBAUM; DI SANTIS; MALDELBAUM, 2003a).

No Brasil, as alterações na integridade da pele conhecidas como úlceras agudas e

crônicas constituem sério problema de saúde pública. Estima-se que as lesões crônicas nos

pés e nas pernas acometam 10% dos pacientes diabéticos e que cerca de 3% da população

brasileira, ou seja, em torno de quatro milhões de pessoas, seja portadora de lesões crônicas

ou tenham algum tipo de complicação no processo de cicatrização. Alguns trabalhos mostram

que o impacto psíquico, social e econômico da cronificação de lesões, em especial as úlceras

dos pés e das pernas, representa a segunda causa de afastamento do trabalho no Brasil

(BRASIL, 2002; MALDELBAUM; DI SANTIS; MALDELBAUM, 2003a, 2003b). Gupta et

al. (2004), em um estudo epidemiológico sobre a prevalência de feridas agudas e crônicas na

Índia, verificaram que 10,55/1000 habitantes apresentaram feridas agudas e 4,48/1000

habitantes, apresentaram feridas crônicas e que a maior incidência das feridas ocorria nos

membros inferiores.

Dessa forma, tem-se voltado a atenção para a investigação de estratégias terapêuticas

efetivas, acessíveis e alternativas na cicatrização de feridas. A maioria desses estudos tem sido

desenvolvida com modelos in vitro, como a cultura de células de fibroblastos, queratinócitos e

células endoteliais. Embora esses modelos tenham seus méritos, a validação farmacológica de

uma planta medicinal depende da demonstração de seus efeitos em animais ou no homem

(KRISHNAN, 2006). Assim, vários estudos visando comprovar a ação cicatrizante de plantas

medicinais utilizando modelos animais estão descritos na literatura (CASTELO BRANCO

NETO et al. 2006; MARCHINI et al. 1988; MIRANDA 2001).

A Memora nodosa (Silva Manso) Miers é uma planta do Cerrado cujas folhas e caules

têm indicação popular como cicatrizante de feridas e úlceras externas e as raízes, no

tratamento de dores abdominais e sarnas (SILVA, 1998, SIQUEIRA, 1988).

A prospecção fitoquímica evidenciou a presença de saponinas e flavonóides nas raízes

e óleo essencial, saponinas e flavonóides nas folhas da M. nodosa (TRESVENZOL et al.,

2005). Estudo realizado por Tresvenzol et al. (2007) mostrou que os extratos etanólicos das

105

folhas, dos caules e das raízes dessa planta não apresentaram toxicidade aguda, via oral, para

ratos na dose de 2000 mg/kg.

Visando ampliar os estudos sobre essa espécie, essa pesquisa tem como objetivo

avaliar a atividade cicatrizante dos extratos etanólicos obtidos das folhas e raízes da M.

nodosa em feridas cutâneas em ratos.

MATERIAL E MÉTODOS

Material botânico

O material botânico (folhas e raízes) foi coletado na região de Senador Canedo, Goiás

Brasil, no mês de janeiro de 2006 e foi identificado pelo Professor Heleno Dias Ferreira da

Universidade Federal de Goiás (UFG). A exsicata foi depositada no Herbário da UFG sob o

registro 29981.

Preparação dos extratos etanólicos brutos

O material foi seco em estufa com ventilação forçada a 40oC e triturado em moinho de

facas até a obtenção dos respectivos pós.

Os extratos das folhas e raízes da M. nodosa foram obtidos por maceração em etanol a

95%, em temperatura ambiente, e concentrados em rotaevaporador a 40ºC (FERRI, 1996).

Isolamento e identificação de princípio ativo

Do extrato etanólico das raízes foi isolado por recristalização em etanol: água (1:1) um

sólido cristalino branco. Para a identificação desse composto foram utilizadas técnicas

espectrométricas de ressonância magnética nuclear (RMN C13, H1) e Infravermelho (IV). Os

espectros foram analisados e comparados com dados da literatura e com os espectros de um

similar sintético PA (Sigma).

Atividade cicatrizante

Foram utilizados, neste estudo, 54 ratos (Rattus novergicus albinus) da linhagem

Wistar, fêmeas, com 60 dias de idade, peso entre 160g a 190 g no início do experimento,

106

provenientes do Biotério Central da UFG. O trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisas Médica Humana e Animal do Hospital das Clínicas/UFG, sob o protocolo no

188/07.

Os animais foram adaptados no Biotério do Núcleo de Estudos e Pesquisas Tóxico-

farmacológicas da Faculdade de Farmácia/UFG, por um período de dez dias e mantidos em

gaiolas individuais de polipropileno, forradas com maravalha, sob condições ambientais

controladas (temperatura 22oC ± 2oC, umidade relativa do ar de 50% a 70% e fotoperíodo

claro/escuro de 12 horas). Água e ração foram oferecidos aos animais ad libitum.

Os animais foram pesados e divididos, de forma aleatória, em 3 grupos de 18 animais

cada. Cada grupo foi dividido em três subgrupos (n=6), para serem estudados de acordo com

o seguinte protocolo de avaliação:

Grupo 1: Controle, animais tratados com água destilada durante 4 dias (C1), 7 dias (C2) e 14

dias (C3), pós-operatório (PO).

Grupo 2: EF, animais tratados com solução aquosa do extrato etanólico das folhas a 2%, por

4 dias (EF1), 7 dias (EF2) e 14 dias (EF3), PO.

Grupo 3: ER, animais tratados com solução aquosa do extrato etanólico das raízes a 2% , por

4 dias (ER1), 7 dias (ER2) e 14 dias (ER3), PO.

Para o procedimento cirúrgico os animais foram anestesiados (IM) com cloridrato de

cetamina na dosagem de 70 mg/kg, associado ao sedativo, analgésico e relaxante muscular

cloridrato de xilazina na dosagem de 10 mg/kg (PACHALY, 2006). Após a anestesia, o

animal foi posicionado em decúbito ventral e submetido a epilação na região dorsal-cervical.

Uma ferida circular, com 10 mm de diâmetro, foi confeccionada com um punch metálico na

região epilada, de forma a retirar-se apenas a pele do animal.

Logo após a cirurgia e diariamente, no mesmo horário, 100 µL das soluções testes EF

e ER e do controle foram instiladas nas feridas dos animais.

Os animais foram examinados diariamente quanto ao aspecto geral, oportunidade em

que se procedia à avaliação macroscópica da ferida, observando-se a presença ou ausência de

hemorragia, exsudato e crosta e registrando-se os dados em fichas individuais.

Os animais foram pesados e sacrificados em câmara de CO2 após o 4o, o 7o e o 14o dia

PO, conforme protocolos preconizados por Lopes et al. (2005) e Garros et al. (2006).

Para a análise morfométrica, as feridas foram fotografadas nos dias zero, 4, 7 e 14 do

PO, utilizando-se uma câmara digital (Sony MPEGMOVIE VX) adaptada a um tripé e

mantida a uma distância constante de 27 cm da ferida. As imagens foram transferidas para um

microcomputador e analisadas utilizando-se o software Image J 1.3.1 (NIH, EUA). Para

107

avaliar o grau de contração da área da ferida foi utilizada a fórmula seguinte, segundo relatado

por Al-Watban e Andres (2003) e Oliveira et al. (2000).

Contração relativa da ferida (%) = (Área lesada inicial – Área contraída) x 100

Área lesada inicial

Para a avaliação histológica, um fragmento de cada ferida foi retirado, fixado em

formol tamponado a 10%, processado e corado com Hematoxilina e Eosina (HE), de acordo

com Luna (1968). Os cortes histológicos também foram submetidos à coloração com ácido

pícrico/vermelho da Síria (picro-sírius) (LÓPEZ; ROJKIND, 1985).

Os parâmetros avaliados pela coloração HE foram: infiltrado inflamatório

(polimorfonucleares ou mononucleares), fibrina, hemorragia e hiperemia no 4o dia e no 7o dia

PO. Para a semiquantificação desses parâmetros adotaram-se os escores propostos por

Biondo-Simões et al. (2006): ausente (0%), discreto (até 25%), moderado (de 25% a 50%) e

acentuado (> 50%). Para a reepitelização utilizaram-se os escores total e parcial, avaliados no

14o dia PO. A semiquantificação do colágeno utilizando os escores propostos por Biondo-

Simões et al. (2006), no 4o, 7o e 14o dias PO, foi realizada pela observação da intensidade da

cor alaranjada das fibras coradas com picro-sírius e analisadas sob luz polarizada.

Para a análise imunoistoquímica, cortes de 5 µm foram distendidos em lâminas

histológicas silanizadas (3-aminopropil-triethoxisilane, Sigma). Após a desparafinização e a

reidratação dos cortes, as lâminas foram colocadas em solução de citrato pH 6,0, em banho-

maria a 95°C, por 30 minutos. Em seguida, as lâminas foram incubadas com albumina bovina

(BSA) a 3% em câmara úmida, à temperatura ambiente, por uma hora e posteriormente

tratadas com anticorpo primário, VEGF (147) (Santa Cruz Biotechnology – 507), na diluição

1:500, em câmara úmida a 4oC, por toda a noite. Após esta etapa, instilou-se sobre as lâminas

o complexo estreptoavidina-biotina-peroxidase (kit LSAB – Dako K0690), em câmara úmida,

à temperatura ambiente, por 20 minutos. A reação foi revelada com solução de

diaminobenzidina (DAB), durante um minuto. Solução de PBS (tampão fosfato-salino) foi

utilizada para as lavagens entre as etapas. Os cortes foram, então, contracorados com

hematoxilina de Mayer, por 30 segundos, e as lâminas montadas com resina sintética (Sigma

Aldrich, USA) e lamínulas histológicas.

A leitura das lâminas foi realizada com auxílio do sistema de análise digital de

imagem. A contagem do número de vasos sanguíneos na área da ferida foi realizada

utilizando-se planimetria por contagem de pontos com o auxílio do software GIMP 2.4.3. Um

108

retículo quadrangular composto por 25 pontos foi superposto à imagem histológica e foram

contados apenas os vasos nas intersecções presentes no campo visual, conforme modelos

propostos por Ribattii et al. (2000) e Prado et al. (2006).

Análise estatística

Os resultados foram submetidos a tratamento estatístico utilizando-se o programa

GraphPad InStat (Version 3.05 for Windows). Para a análise das variáveis paramétricas foi

utilizado o teste t pareado e para as variáveis não-paramétricas, o teste de Kruskal-Wallis e o

pós-teste de Dunn. Os resultados foram considerados estatisticamente significantes quando p

< 0,05 (SAMPAIO, 1998).

RESULTADOS

Quando o extrato etanólico das raízes da M. nodosa foi concentrado, observou-se a

presença um sólido amarelado aderido às paredes do balão. Esse sólido apresentou baixa

solubilidade em etanol e razoável solubilidade em água. O sólido foi retirado com o auxílio de

uma espátula e recristalizado, obtendo-se cristais levemente amarelos. Após a análise dos

espectros de IV, RMN-H1, RMN-C13 o composto foi identificado como sendo a alantoína. Os

espectros foram comparados com dados da literatura (SOUZA et al. 2004; FERREIRA et al.,

2000) e com o espectro de IV de uma amostra de alantoína PA. Destacaram os seguintes

dados espectrais: IV (KBr, cm-1) 3439,89, 3344,19, 3220,73, 1781,81, 1717,46, 1661,88,

1603,55, 1540. RMN- 1H (DMSO, δ, J)300MHz: 10,55(s, H-1), 8,07(s, H-3), 6,91-6,88 (d, H-

6, J=8,4Hz), 5,80(s, H-8), 5,25(d, H-4, J=8,1Hz). RMN-13C (DMSO, δ)75MHz: C-2(157,57),

C-5(173,84), C-4(62,62), C-7(157,00).

Avaliação dos animais

Não foi constatada perda de peso, auto-agressão ou irritabilidade nos animais durante

o período definido para o experimento.

Em relação à área da ferida observou-se decréscimo significante ao longo do tempo,

mais acentuado entre o 7o dia e 14o dia PO, tanto para o grupo controle, quanto para os grupos

tratados com Memora nodosa. No 4o dia PO, observou-se que no grupo controle, quatro ratos

109

apresentaram crostas delgadas, vermelhas, com exsudação serosanguinolenta e dois com

crostas mais espessas, castanho-escuras e secas. No grupo EF, todos os ratos apresentaram

feridas com crostas mais espessas, quando comparadas às do grupo controle, e cor castanho-

escuras. Desses ratos, em cinco detectou-se exsudação serosanguinolenta. No grupo ER, todos

os ratos apresentaram feridas com crostas delgadas, com coloração vermelho-escuras. Desses

ratos, observou-se exsudação sanguinolenta nas feridas de apenas três ratos. No 7o dia PO

todos os grupos apresentaram crostas espessas de cor castanho-escuras (Figura 1), com pouca

ou nenhuma exsudação. Entre o 10o e o 12o dia PO observaram-se várias crostas se

destacando e sendo substituídas por outras de menor tamanho.

Controle EF ER 4o

7o

Figura 1 – Macroscopia das feridas na derme dos ratos dos grupos tratados com C,

EF e ER no 4o e 7o dia PO. C: controle (água destilada). EF: solução a 2% do extrato etanólico das folhas da M. nodosa ER: solução a 2% do extrato etanólico das raízes da M. nodosa.

Não houve diferença significativa na contração relativas das feridas entre os grupos

tratados (EF e ER) e o grupo controle (C) no 4o e 7o dias (Tabela 1, Figura 2).

Tabela 1 - Valores médios e desvio padrão da contração relativa das feridas cutâneas em ratos (%) (n=6) do grupo controle C e dos grupos tratados EF e ER nos 4º e 7º dias PO.

Dias PO Grupos 4º 7º

Controle 36,6 ± 7,7 42,2 ± 9,1 EF 29,8 ± 13,3 50,2 ±14,6

ER 44,9 ± 11,5 31,0 ± 17,6

Teste t pareado (P > 0,05). C - Controle (água destilada). EF - Solução a 2% do extrato etanólico das folhas da M. nodosa. ER - Solução aquosa a 2% do extrato etanólico das raízes da M. nodosa.

110

0

10

20

30

40

50

60

70

4d 7d

CEFER

Figura 2 – Médias da contração das feridas cutâneas em ratos (%) (n=6) no 4º dia e 7o dia PO. Teste t pareado (p > 0,05). C - Controle (água destilada). EF - Solução a 2% do extrato etanólico das folhas da M. nodosa. ER - Sol. aquosa a 2% do extrato etanólico das raízes da M. nodosa.

No 14o dia PO observaram-se, nas regiões das feridas, pequenas crostas ou cicatrizes

em todos os grupos de ratos (Figura 3). Constatou-se a presença de crostas na pele de cinco

ratos do grupo controle e em quatro do grupo EF. No grupo ER, foram observadas crostas em

dois ratos e cicatrizes em quatro (três com reconstituição parcial dos pêlos).

C EF ER 14o

Figura 3 – Macroscopia das feridas na derme de ratos dos grupos tratados com C, EF e ER no 14o dias PO. C - Controle (água destilada). EF - Solução a 2% do extrato etanólico das folhas da M. nodosa. ER - Solução aquosa a 2% do extrato etanólico das raízes da M. nodosa.

Avaliação histológica

Não foram observadas diferenças significativas entre o grupo controle e os grupos

tratados EF e ER quanto às variáveis fibrina, hiperemia, hemorragia e infiltrado inflamatório

no 4o dia e 7o dia PO (Tabela 2, Figuras 4A a 4D).

111

Tabela 2 – Medianas das variáveis histológicas avaliadas no 4º dia e 7o dia PO dos grupos de ratos tratados com C, EF, ER (n=6).

Variáveis histológicas 4o dia PO 7o dia PO C EF ER C EF ER Fibrina 3,0 3,0 2,0 3,0 3,0 2,0

Hiperemia 2,5 2,0 3,0 2,0 2,0 2,0

Hemorragia 3,0 3,0 3,0 2,5 2,0 2,0

Infiltrado inflamatório (PMN)

3,0 3,0 3,0 3,0 2,5 2,5

Teste Kruskal-Wallis ( p > 0,05). C-Controle (água destilada). EF - Solução aquosa a 2% do extrato etanólico das folhas da M. nodosa. ER - Solução aquosa a 2% do extrato etanólico das raízes de M. nodosa.

Figura 4 – Fotomicrografias da derme de ratos do grupo tratado com “C” no 4o dia do pós-operatório (n=6). Figura 4A - Panorâmica da região da ferida evidenciando crosta espessa (seta) e infiltrado inflamatório (cabeça de seta). Figura 4B - Detalhe da área com hemorragia. Figura 4C - Detalhe do infiltrado de polimorfonucleares. Figura 4D - Detalhe da rede de fibrina (seta). C - controle (água destilada). Coloração HE

No 14o dia PO, observou-se, na análise macroscópica, a presença de crosta e na

avaliação histológica observou-se, predominantemente, nos grupos controle e EF, a presença

de crosta com reepitelização total e hiperplasia do epitélio com predominância da camada

A B

C D

112

espinhosa (Figura 5A e 5B); colágeno acentuado, hiperemia e infiltrado de mononucleares

discretos. No grupo ER a análise microscópica confirmou os achados da análise

macroscópica, onde se observou a reepitelização total, a hiperplasia do epitélio com

predominância da camada espinhosa em todos os animais e os anexos (folículo piloso e

glândulas) sendo reconstituídos em três animais (Figura 5B); colágeno acentuado e infiltrado

de mononucleares discreto, na derme.

Figura 5 – Fotomicrografias da derme de ratos dos grupos tratados com C e ER no 14o dia do pós-operatório (n=6). Figura 5A – Panorâmica da epiderme de ratos do grupo controle evidenciando reepitelização com crosta (seta). Figura 5B – Panorâmica da epiderme de ratos do grupo tratado com ER evidenciando reepitelização com início da reconstituição dos anexos (seta). Figura 5C – Controle (água destilada). ER - Solução aquosa a 2% do extrato etanólico das raízes da Memora nodosa. Coloração HE.

Não foi observada diferença significativa na quantidade de colágeno dos grupos EF e

ER, em relação ao grupo controle, no 4o, 7o e 14o dias PO (Tabela 3, Figuras 6A a 6C).

Tabela 3 – Médias e desvio padrão da variável colágeno ao 4o, 7º e 14o dias do PO dos grupos C, EF e ER.

Colágeno Controle EF ER 4o dia PO 0,83 ± 0,4 0,83 ± 0,7 1,16 ± 0,4 7o dia PO 1,33 ± 0,81 1,5 ± 0,5 1,66± 0,5 14o dia PO 2,83 ± 0,4 2,83 ± 0,4 2,66 ± 0,51 ANOVA, Teste de Tukey (p > 0,05). C- Controle (água destilada), EF- Solução aquosa a 2% do extrato etanólico das folhas de M. nodosa. ER- Solução aquosa a 2% do extrato etanólico das raízes da M. nodosa .

A B

113

Figura 6 – Fotomicrografias da derme de ratos do grupo tratado com ER evidenciando colágeno (n=6). Figura 6A - 4o dia PO. Figura 6B – 7o dia PO. Figura 6C-14o dia PO. ER- Solução aquosa a 2% do extrato etanólico da raiz. Coloração: Picro-sírius sob luz polarizada.

Imunoistoquímica

Na planimetria digital por contagem de pontos realizada na derme de ratos tratados

com as soluções aquosas a 2% do extrato etanólico das folhas (EF) e das raízes (ER) da M.

nodosa, no 7o dia PO, observou-se aumento no número de vasos sanguíneos desses ratos em

relação aos do grupo controle (água destilada), cuja diferença verificada foi significativa entre

os grupos EF e ER em relação ao controle (Tabela 4, Figura 7 e 8).

A B

C

114

Tabela 4 - Mediana do número de vasos sanguíneos na derme de ratos tratados com C, EF e ER, no 7º dia do pós-operatório (n=6).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

Tratamentos

Medianas do número de

vasos sanguíneos

CEF ER

Figura 7 - Mediana do número de vasos sanguíneos na derme de ratos tratados com C, EF e ER no 7o dia PO (n=6). Teste de Kruskal-Wallis (p<0,05). C-Controle (água destilada). EF- Solução a 2% do extrato etanólico das folhas da M. nodosa .ER- solução aquosa a 2% do extrato etanólico das raízes da M. nodosa.

Tratamentos 7o dia PO C EF ER Medianas 1,0 3,0* 4,0* Teste de Kruskal-Wallis e pós-teste de Dunn *p<0,05. C- Controle (água destilada), EF- Solução aquosa a 2% do extrato etanólico das folhas de M. nodosa. ER - Solução aquosa a 2% do extrato etanólico das raízes de M. nodosa .

*

*

115

Figura 8 - Fotomicrografia da derme de ratos tratados com C, EF e ER no 7° dia do pós-operatório evidenciando vasos sanguíneos com marcação positiva para VEGF (setas) (n=6). HIQ. A- Controle solvente (água destilada). B - Solução aquosa a 2% do extrato etanólico das folhas da Memora nodosa. C - Solução aquosa a 2% do extrato etanólico das raízes da Memora nodosa.


A cicatrização de feridas ocorre em três fases ou períodos sobrepostos: fase inicial,

exsudativa ou inflamatória, fase proliferativa e fase de remodelação ou maturação. Cada uma

dessas fases é caracterizada pela presença de infiltrados de células em locais específicos, e

isso ocorre de forma integrada e coordenada por mediadores químicos, no sentido de otimizar

o reparo. Segundo Hosgood (2006), as características macroscópicas dos estágios da

inflamação e do debridamento para uma ferida aberta incluem coágulo sanguíneo, exsudato

serosanguinolento e superfície sem tecido de granulação. Quanto à concentração de

polimorfonucleares, ela é alta no início do processo inflamatório e vai diminuindo com a

evolução da cicatrização (SANCHES NETO et al., 1993). Durante a formação do novo tecido

acontece a proliferação fibroblástica e a angioblástica (angiogênese). Na fase de fibroplasia,

que se inicia cerca de 48 horas após a lesão, surgem os fibroblastos que se multiplicam e

produzem componentes como a substância fundamental e o colágeno. Paralelamente, a

formação de novos vasos propicia maior aporte de nutrientes, gases e células inflamatórias

(CASTELO BRANCO NETO et al., 2006; DE NARDI et al., 2004; HOSGOOD, 2006;

RUBIN et al. 2006). Assim, de modo geral, o principal parâmetro avaliado na cicatrização de

feridas em modelos animais é a redução do tamanho da ferida, normalmente expressa em

termos de área. As análises histológicas do tecido de granulação e epidermal complementam a

avaliação (KRISHNAN, 2006).

AA BB CC

116

No planejamento deste experimento constatou-se não haver tamanho padrão para as

feridas realizadas em modelos animais visando avaliar a cicatrização. Entretanto, o tamanho

da ferida definiu, para os pesquisadores, os intervalos e o período máximo de observação do

reparo da lesão (CASTELO BRANCO NETO et al., 2006; LOPES et al., 2005; SANTOS et

al., 2006; SPERONI et al., 2002). Cross et al. (1995) destacaram que o stress físico e

metabólico provocados por feridas grandes, em animais pequenos, deve ser considerado, pois

influencia no resultado dos estudos. Assim, neste experimento optou-se por feridas com 10

mm de diâmetro e uma avaliação macroscópica e microscópica da lesão no 4o dia, no 7o dia e

no 14o dia do PO, conforme relatado por Oliveira et al. (2000). Ratos da linhagem Wistar

foram escolhidos para o experimento devido à facilidade de manuseio e acomodação e à

maior resistência às agressões cirúrgicas e processos infecciosos (GARROS, et al., 2006). A

ferida foi realizada na região dorsal-cervical para dificultar o contato do animal (lambida) e o

auto-canibalismo (KASHYAP et al., 1995).

Neste trabalho, a área da ferida na derme dos ratos diminuiu gradativamente com a

evolução do processo de cicatrização nos três grupos e não houve diferença significativa

quanto à contração relativa das áreas das feridas, no 4o dia e no 7o dia PO. Contudo, a

observação dos valores médios, obtidos na mensuração da contração das feridas, permitiu

concluir que a retração centrípeta foi beneficiada, especialmente no 4o dia PO para o grupo

tratado com ER (solução aquosa a 2% do extrato das raízes da M. nodosa) e no 7o dia PO,

para o grupo tratado com EF (solução aquosa a 2% do extrato aquoso das folhas da M.

nodosa) em relação ao grupo tratado com o controle (água destilada).

As características macroscópicas da fase inflamatória descritas por Hosgood (2006),

foram observadas no 4o dia PO e confirmadas pela avaliação histológica para os grupos C, EF

e ER. Na fase proliferativa constatou-se aumento do número de vasos sanguíneos na derme

dos ratos dos grupos tratados com EF e ER, no 7o dia PO, em relação ao grupo tratado com o

controle. Verificou-se também que o grupo tratado com ER apresentou maior atividade

angiogênica que o grupo tratado com EF. Moon et al. (1999) constataram que o β-sitosterol,

isolado do gel de Aloe vera L., mostrou atividade angiogênica sobre a membrana

corialantóide de ovos embrionados de galinha. O β-sitosterol detectado na fração hexano

obtida das raízes da M. nodosa pode estar relacionado com a atividade angiogênica observada

para o grupo tratado com ER. Em relação à quantidade de colágeno, constatou-se que ele

aumentou progressivamente à medida que o reparo da lesão foi se processando, porém sem

diferença significativa entre o grupo controle e os grupos tratados com EF e ER. No 14o dia

117

do PO, o colágeno, predominantemente do tipo I, foi observado de forma acentuada nos três

grupos.

Segundo Modolin e Bovilacqua (1985), no final da fase proliferativa ocorre a

reepitelização da lesão, que é controlada pela chalona, um complexo glicoprotéico que

estimula a atividade mitótica epitelial. Neste estudo, não se detectou diferença significativa

entre os epitélios dos ratos tratados com água destilada e os tratados com solução aquosa a 2%

do extrato etanólico das folhas da M. nodosa. Entretanto, para o grupo ER verificou-se que a

reepitelização foi mais precoce, pois a maioria dos animais não apresentava crosta sobre a

nova epiderme e os anexos já estavam se desenvolvendo. Esse fato pode estar relacionado

com a presença da alantoína, pois esse composto estimula a proliferação celular, levando a

uma rápida reepitelização da pele lesada (MERCK COSMÉTICOS, 2006; MERCK INDEX,

1989). Estudos mostraram que a alantoína auxiliou na reparação de feridas cirúrgicas

(WILLITAL; HEINE, 1994) e no tratamento da psoríase (SCOTT; DUNN; GOA, 2001). O

FDA (U. S. Food and Drug Administration) aprova a utilização da alantoína em cremes na

concentração de 0,5% a 2%, como produto de não-prescrição, para tratamento de pequenos

cortes, arranhados, escoriações, queimaduras, queimaduras pelo sol ou pelo frio; na prevenção

e proteção da pele e dos lábios contra rachaduras, irritações e ressecamentos (ALLANTOIN,

2008). Embora não existam relatos da utilização popular das raízes da M. nodosa como

cicatrizante de feridas, a presença da alantoína pode estar contribuindo na restauração da pele

lesada em resposta ao prurido provocado pelo agente etiológico da sarna, o que justificaria sua

utilização popular.

Vários estudos relatando o uso tópico de fitoterápicos na cicatrização de feridas estão

descritos na literatura científica, alguns deles com resultados diferentes quanto ao potencial de

reparação de lesões cutâneas, para uma mesma planta. Miranda (2001) constatou retardo na

retração cicatricial em feridas cutâneas de ratos utilizando tintura de arnica (Solidago

microglossa DC). Entretanto Facury Neto (2001) administrou o extrato aquoso liofilizado de

arnica em ratos, por via intraperitoneal, e constatou sua atividade cicatrizante em feridas

cutâneas. Martins et al. (2003) não obtiveram melhoria na cicatrização de feridas cutâneas de

eqüinos tratados com soluções hidroalcoólicas de calêndula (Calendula officinalis L.) e de

barbatimão (Stryphnodendrum barbadetiman (Vellozo) Martius. Por outro lado, os efeitos

cicatrizantes da tintura e do gel de calêndula e do barbatimão, isolados ou associados, foram

constatados com Jorge Neto (1996) no tratamento de pacientes com queimaduras e úlceras

varicosas crônicas. Oliveira et al. (2000) relataram que as formulações com gel de natrosol

contendo extrato das folhas de Symphytum officinale L. (confrei) apresentaram atividade

118

cicatrizante sobre feridas cutâneas de ratos, enquanto as formulações preparadas com água

destilada não mostraram nenhuma atividade. Os autores consideraram que o ressecamento das

crostas, observado nas feridas tratadas com a formulação aquosa, pode ter prejudicado a

cicatrização. Segundo os pesquisadores, essa conclusão foi possível pela avaliação

macroscópica das feridas e pela constatação de que o gel de natrosol utilizado como controle

apresentou melhor atividade cicatrizante que a formulação aquosa contendo o extrato com o

confrei. Essa afirmação encontra respaldo na literatura, pois nos últimos anos, a manutenção

da umidade na região lesada é um dos objetivos dos procedimentos terapêuticos que visam à

cicatrização de feridas (MALDELBAUM; DI SANTIS; MALDELBAUM, 2003b)

Pode-se concluir com este trabalho que a solução aquosa preparada com o extrato

etanólico das raízes da M. nodosa apresentou potencial cicatrizante em feridas cutâneas de

ratos. A solução aquosa preparada com o extrato das folhas da M. nodosa não contribuiu para

o reparo das lesões, nas condições testadas. Os diferentes resultados já relatados para o

confrei, calêndula e barbatimão, plantas conhecidas por suas propriedades cicatrizantes

mostram a necessidade de novos experimentos empregando as folhas da M. nodosa antes de

um posicionamento sobre a ineficácia dessa utilização no tratamento de úlceras e feridas

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124

ARTIGO 5

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE LEISHMANICIDA, TOXICIDADE AGUDA E

CITOTOXICIDADE DA Memora nodosa (SILVA MANSO) MIERS

125

RESUMO

A leishmaniose é uma doença infecciosa, não contagiosa, causada por diferentes

espécies de protozoários parasitas do gênero Leishmania, sendo de difícil tratamento. Este

trabalho teve como objetivo avaliar a atividade leishmanicida e a toxicidade aguda dos

extratos e frações obtidos de Memora nodosa (Silva Manso) Miers em ratos, camundongos e

Artemia salina. Os extratos etanólicos brutos das folhas e das raízes de M. nodosa mostraram

atividade leishmanicida contra formas promastigotas de Leishmania chagasi com IC50 93,2

µg/mL e IC50 de 95,87 µg/mL, respectivamente. A fração hexano obtida do extrato hexano

das raízes mostrou IC50 de 13,51 µg/mL. A mistura do β-sitosterol e do estigmasterol isolada

da fração hexano, apresentou IC50 de 69,79 µg/mL e pode estar contribuindo, em sinergismo

com outros compostos, para a ação leishmanicida da fração hexano. Os extratos etanólicos das

folhas e das raízes e a fração hexano obtida das raízes de M. nodosa não apresentaram

toxicidade para ratos, camundongos e citotoxicidade para Artemia salina. Pode-se concluir

que a fração hexano obtida das raízes de M. nodosa apresentou ação contra formas

promastigotas de Leishmania chagasi e com a vantagem de não apresentar toxicidade nos

modelos utilizados.

Palavras-chave: Leishmnania chagasi. Toxicidade aguda. Atividade leishmanicida. Artemia

salina.

126

INTRODUÇÃO

A leishmaniose é uma doença infecciosa, não contagiosa, causada por diferentes

espécies de protozoários parasitas do gênero Leishmania, que são transmitidos ao homem

através de insetos vetores hematófagos, os flebotomíneos (DORVAL.et al. 2006).

A leishmaniose ocorre em várias partes do mundo, principalmente em populações da

África, Ásia e América Latina e afeta mais de 12 milhões de pessoas, com elevado índice de

morbidade e mortalidade. Nos últimos anos a leishmaniose visceral reapareceu de forma

preocupante em todo o mundo e se apresenta como doença oportunista em paciente com

AIDS (WHO, 2002; AHUA et al., 2006).

A leishmaniose visceral (calazar) compromete o fígado, baço, medula óssea e

sistema reticuloendotelial. A leishmaniose tegumentar apresenta variantes e pode ser dividida

em leishmaniose cutânea localizada, cutânea difusa e cutânea-mucosa. Essas manifestações

dependem da espécie de parasita, bem como da resposta imune do indivíduo afetado

(HERWALDT, 1999). No Brasil ocorre tanto a leishmaniose visceral como a tegumentar.

Ambas as formas são endêmica nas regiões Norte e Nordeste e epidemias urbanas foram

observadas, nos últimos anos, em várias cidades. A letalidade da leishmaniose visceral passou

de 3,6% em 1994 para 6,7% em 2004, o que representa um incremento de 85% (BRASIL,

2006).

A leishmaniose visceral é causada pela Leishmania donovani na Índia, Ásia e África,

pela Leishmania infantum ou Leishmania chagasi na região mediterrânea, parte sul e central

da Ásia e na América do Sul. Outras espécies, como a Leishmania tropica e Leishmania

amazonensis, são eventualmente causadoras de leishmaniose visceral em áreas tropicais

(DESJEUX, 2004). A Leishmania amazonensis é muito comum no Brasil e tem sido

associada a todas as formas de doença, principalmente a forma cutânea (LEON et al., 1992).

O parasita existe em duas formas: a forma promastigota (flagelada) dentro do

flebótomo fêmea, que é o vetor, e a forma amastigota dentro de um mamífero hospedeiro. As

formas amastigotas são parasitas intracelulares de macrófagos, raramente de outras células,

onde se multiplicam dentre de um vacúolo fagolisossômico (GUERIN, 2002). Em geral, as

vítimas dessa doença apresentam sistema imune deficiente e não conseguem eliminar os

parasitos através dos mecanismos naturais de defesa. A localização intracelular do parasito

dificulta o tratamento da leishmaniose, que é realizada utilizando antimoniais pentavalentes,

anfotericina B e pentamidinas. Essas drogas são tóxicas e provocam efeitos adversos como

alterações cardíacas, renais, pancreáticas e hepáticas dificultando a adesão ao tratamento

127

(BEZERRA et al, 2006). Além disso, esses medicamentos são de alto custo, de difícil

administração e nos últimos tempos estão se mostrando ineficazes devido à resistência dos

parasitos (BRASIL, 2006; MURRAY, et al., 2000; NAKAMURA et al., 2006). Novas drogas,

como o miltefosine, têm demonstrado eficácia no tratamento da leishmaniose visceral, mas

também apresentam elevada toxicidade (SINDERMANN et al, 2004). A dificuldade em

relação à terapêutica atual tem conduzido a estudos visando a utilização de produtos naturais.

O Brasil é conhecido pela exuberância e variedade de sua flora e muitas dessas plantas

são usadas na medicina popular sem qualquer base científica. Nos últimos anos várias plantas

medicinais têm sido submetidas à screening buscando alternativa para o tratamento de

doenças causas por protozoários, como a malária. Esses estudos estão sendo complementados

por outros direcionados para a detecção de plantas com atividade leishmanicida (BEZERRA

et al, 2006; FERREIRA et al., 2004; KVIST et al., 2006; MOREIRA et al., 2002; MOREIRA

et al., 2007; NAKAMURA et al, 2006, RANGEL et al. 2007; RATH et al. 2003; ROCHA et

al. 2005; ZANOL et al. 2007).

O uso popular, e mesmo tradicional, não é suficiente para validar as plantas medicinais

como medicamentos eficazes e seguros e sua preconização, ou autorização oficial como

medicamento, devem ser fundamentadas em evidências experimentais que comprovem que o

risco a que se expõem aqueles que as utilizam é suplantado pelos benefícios do seu uso A

avaliação desse risco/benefício é a finalidade dos estudos farmacodinâmicos e toxicológicos

pré-clínicos e clínicos de medicamentos (LAPA et al., 2004).

A Organização Mundial de Saúde (OMS) visando orientar a avaliação toxicológica de

medicamentos fitoterápicos elaborou o “Guidelines for the assessment of herbal medicine” e o

“Research guideliness for evaluating the safety and efficacy of herbal medicines” (WHO,

2000; WHO, 1993). As diretrizes da OMS não têm força de lei em nenhum país, mas

influenciam fortemente na elaboração de legislações nacionais. No que se refere à realização

de ensaios toxicológicos pré-clínicos de substâncias químicas, os critérios para sua realização

estão bem especificados, por exemplo, nas normas da Organization of Economic Co-

Operation and Development (OECD, 2001). A toxicidade aguda manifesta-se imediatamente

ou com até 14 dias após a exposição de uma dose única de um xenobiótico por ingestão,

inalação ou através da pele de animais e do homem. O propósito dos testes de toxicidade

aguda é identificar uma dose claramente tóxica, sub-letal ou letal, identificar os órgãos alvos

da substância em estudo, bem como gerar um banco de dados para seleção de doses em testes

subseqüentes de toxicidade (BRESOLIN; FILHO, 2003).

128

Uma outra metodologia para investigar a toxicidade é o ensaio de letalidade para

larvas de Artemia salina, um camarão de água salgada que apresenta grande sensibilidade às

mais variadas substâncias (SANCHES-FORTUN; SAN-BARRERA; BAROHONA-

GOMARIZ, 1995). Esse teste se popularizou a partir da década de 90 por ser de baixo custo,

fácil execução e por apresentar boa correlação com outras metodologias (LHULLIER;

HORTA; FALKENBERG, 2006) e é empregado em avaliações toxicológicas pré-clínicas

para determinar os valores de dosagem letal média (DL50), sendo considerado um método de

triagem alternativo para validação de toxinas e extratos brutos (LEWAN et al., 1992).

A Memora nodosa é uma planta encontrada no bioma Cerrado, cujas folhas e caules

têm indicação popular no tratamento de feridas e úlceras externas e as raízes nas dores

abdominais e sarna (SILVA, 1998; SIQUEIRA, 1988). A prospecção fitoquímica dessa planta

evidenciou a presença de flavonóides e saponinas nas folhas e raízes (TRESVENZOL et al.,

2005).

Este estudo tem como objetivo avaliar a atividade leishmanicida dos extratos

etanólicos brutos e das frações obtidos das folhas e das raízes de M. nodosa sobre formas

promastigotas de Leishmania chagasi, verificar a toxicidade aguda dos extratos etanólicos das

folhas e raízes e da fração hexano obtida das raízes em ratos e camundongos e sua

citotoxicidade para Artemia salina.

METODOLOGIA

Material botânico

O material botânico, constituído por folhas e por raízes da Memora nodosa, foi

coletado no município de Senador Canedo-GO (16o45’1’’S, 49o07’50,6’’W, 717 m), em

janeiro de 2006. Uma exsicata foi depositada no herbário da UFG sob registro no 29981.

Obtenção dos extratos brutos e frações

O material botânico foi fragmentado, dessecado em estufa com circulação de ar à

temperatura de 40˚C e triturado em moinho de facas até forma de pó.

Os extratos etanólicos das folhas (EF) e raízes (ER) foram obtidos por maceração em

etanol a 95% (4:1) à temperatura ambiente, seguido de concentração em rotaevaporador à

129

temperatura de 40˚C. Esses extratos foram solubilizados em uma mistura metanol/água (7:3) e

extraídos seqüencialmente com hexano (3x), diclorometano (3x) e acetato de etila (3x) para

obtenção das frações hexano (FH), diclorometano (FD), acetato de etila (FAc) e água (FA)

das folhas e das raízes, segundo metodologia adaptada de Ferri (1996).

Cromatografia em coluna da fração hexano das raízes de M. nodosa

Os extratos etanólicos brutos e as respectivas frações foram submetidos aos ensaios

biológicos e a fração hexano obtida do extrato das raízes foi submetida a cromatografia em

coluna de adsorção (sílica gel 60, 70-230 mesh, Merck), empregando diferentes sistemas

eluentes [hexano (100%), hexano:acetato de etila (98:2), (95:5), (90:10), (85:15), (80:20),

(75:25), (70:30), (70:40), (50:50), (30:70), acetato de etila (100%), acetato de etila:metanol

(50:50) e metanol (100%)]. As frações eluídas foram analisadas por cromatografia de camada

delgada (CCD) e reunidas em 30 subfrações. As frações 135 a 158, eluídas com

hexano:acetato de etila (70:30), foram reunidas (~360 mg) e recristalizadas em metanol

obtendo-se S1. A CCD de S1 empregando hexano:acetato de etila (11:4) como fase móvel e

vanilina sulfúrica seguida de aquecimento como revelador, evidenciou apenas uma mancha. O

espectro de infravermelho (IV) de S1 foi realizado em espectrômetro Perkin Elmer e os

espectros de ressonância magnética (RMN-1H e RMN-13C) em espectrômetro Mercury plus

da VARIAN.

Avaliação da atividade leishmanicida in vitro

As formas promastigotas de Leishmania chagasi (cepa 6445) foram fornecidas pelo

Dr. Gustavo Romero do Laboratório de Leishmaniose do Núcleo de Medicina Tropical da

Universidade de Brasília e mantidas criopreservadas, até o momento do uso.

Os parasitos foram cultivados em meio de McNeal, Novy e Nicolle (meio NNN) a

22oC por sete dias e posteriormente, no meio de Schneider (Sigma) suplementado com 20%

de soro fetal bovino inativado (Sigma).

Ensaio preliminar (screening) para Leishmania chagasi

Para avaliar o efeito de M. nodosa no crescimento das formas promastigotas de L.

chagasi, os extratos etanólicos brutos e das frações obtidos das folhas e raízes dessa planta

130

foram solubilizados em dimetilsulfóxido (DMSO) de forma a obter-se uma solução estoque

de 200 µg/mL.

Em uma placa de cultura celular com 96 poços foram colocados meio de Schneider

suplementado estéril e os protozoários, em fase logarítmica de crescimento, de forma a se

obter um inóculo com 106 parasitos/mL. Em seguida foram adicionados os extratos etanólicos

e as frações de forma a se obter, em cada poço, concentração de 100 µg/mL. Para o controle

positivo foi utilizado miltefosina, meio de cultura, DMSO e os parasitos e, para o controle

negativo, DMSO a 1%, meio de cultura e os parasitos. A placa foi incubada por 48 h a 22oC e

após esse período, o movimento dos parasitos nos poços foi avaliado utilizando microscópio

invertido, em comparação com os controles positivo e negativo. Os resultados foram

expressos de acordo com Weniger et al. (2001) em:

Atividade zero (inativo): quando 100% dos parasitos se movimentam.

Atividade + (pouco ativo): quando mais de 50% dos parasitos se movimentam.

Atividade ++ (ativo): quando menos de 50% dos parasitos se movimentam.

Atividade +++ (muito ativo): quando 100% dos parasitos estão imóveis.

Os experimentos foram realizados em triplicata e apenas as amostras que se mostraram

muito ativas (morte de 100% dos parasitos) foram selecionados para o teste de diluição

seriada visando à determinação da concentração inibitória de 50% (IC50).

Determinação da concentração inibitória 50% (IC50) contra Leishmania chagasi

Em uma placa de cultura celular de 96 poços foram colocados meio de cultura e uma

suspensão de formas promastigotas, em fase logarítmica de crescimento, de forma a se obter

106 parasitos/mL. Em seguida os extratos selecionados pela triagem foram submetidos a uma

diluição seriada de forma a obter-se concentrações variando de 100 µg/mL a 1,56 µg/mL e a

placa foi incubada por 48 h a 22o C. Para controle positivo foi utilizado miltefosina e para

controle negativo DMSO a 1%. Após esse período a análise dos parasitos nos poços foi

realizada por meio de microscópio invertido e foi adicionado 20 µL de MTT (brometo de 3-

(4,5-dimetiltiazol)-2,5-difeniltetrazolium) na concentração de 5 mg/mL. A placa foi incubada

a 25oC, por 4 h, protegida da luz. Posteriormente, 100 µL de sulfato de dodecil sódio (SDS) a

10% foi adicionado a todos os poços para liberação dos cristais de formazan. A leitura da

placa foi realizada em leitor de placa de Elisa em λ 570 nm. O experimento foi realizado em

quadruplicata. Para o cálculo do IC50 foi utilizado o método de regressão linear com auxilio

do Software Excel (CAMACHO et al., 2001).

131

O mesmo procedimento foi realizado com o composto S1 isolado da fração hexano

obtida das raízes.

Avaliação da toxicidade aguda em ratos e camundongos

O experimento foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisas Médica Humana e

Animal do Hospital das Clínicas/UFG, sob o protocolo no 057/07.

Para a avaliação da toxicidade aguda utilizaram-se ratos Wistar (Ratus norvegicus) de

ambos os sexos, com peso médio de 250 g, oriundos do biotério da Universidade Federal de

Goiás e camundongos (Mus musculus) linhagem Black C57, fêmeas, peso médio de 24 g,

oriundos do biotério da UNICEUB - Centro Universitário de Brasília.

Os animais foram pesados e divididos de forma aleatória, em número de três por caixa,

e adaptados no Biotério do Núcleo de Estudos e Pesquisas Tóxico-Farmacológicas da

Faculdade de Farmácia/UFG, por um período de dez dias sob condições ambientais

controladas (temperatura 22oC ± 2oC, umidade relativa do ar de 50% a 70% e fotoperíodo

claro/escuro de 12 horas). Água e ração foram oferecidos aos animais ad libitum, exceto nas

quatro horas que antecederam à administração das amostras.

A investigação da toxicidade aguda seguiu, em linhas gerais, as diretrizes da OECD

(2001) para teste de classe de dose aguda tóxica (Guideline 423) e observou-se as

recomendações da Resolução-RE no 90/2004 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária

(BRASIL, 2004).

Os extratos etanólicos das folhas e raízes e a fração hexano obtida das raízes de M.

nodosa foram solubilizadas em água/DMSO 5% de forma a não exceder 1 mL/100 g de peso

corporal dos animais. As soluções foram administradas por via oral, através de gavagem.

Os ratos receberam uma dose única de 2000 mg/kg dos extratos etanólicos das folhas e

das raízes. Os camundongos receberam uma dose única de 2000 mg/kg dos extratos

etanólicos das folhas, das raízes e da fração hexano. Posteriormente, outros grupos de

camundongos receberam uma dose única de 5000 mg/kg dos extratos etanólicos das folhas e

das raízes. Grupos tratados apenas com o veículo foram incluídos como controle negativo.

Os animais foram observados a intervalos variados no dia da administração (10 min.,

30 min., 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas 12 horas e 24 horas) e, a partir de então, diariamente

até o 14o dia. Foram feitas observações comportamentais sistemáticas (screening hipocrático)

e as intensidades dos eventos tabulados de zero a quatro, assim discriminados: ausente (0),

raro (1), pouco (2), moderado (3), intenso (4) de acordo com o modelo proposto por Malone e

132

Robichaud (1962) e Malone (1977). A quantidade de excretas e o consumo de água e ração

foram avaliados a cada 72 horas.

No 14o dia, os ratos foram sacrificados em câmara de CO2 e os camundongos por

deslocamento cervical, obedecendo aos princípios éticos de experimentação animal, propostos

pelo COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal). Após o sacrifício dos animais,

os órgãos (fígado, baço e rins) foram removidos e analisados a vista desarmada. Fragmentos

desses órgãos foram retirados para avaliação histológica. Esses fragmentos foram fixados em

formol tamponado a 10% por 24 horas, processados, os cortes histológicos corados com

hematoxilina-eosina (HE) e a análise realizada em fotomicroscópio óptico (LEICA, DMLS).

Bioensaio da letalidade para larvas de Artemia salina

A metodologia utilizada para avaliação da atividade citotóxica para larvas de Artemia

salina foi padronizada de acordo com os métodos descritos por Blizzard et al. (1989) e

Takahashi et al (1989).

Os ovos de Artemia salina foram incubados em solução salina (3,5% de sal marinho),

sob iluminação e aeração constante, a 30ºC por 48 horas para a eclosão das larvas. Soluções

estoque (10.000 µg/mL) foram preparadas com os extratos etanólicos brutos das folhas, das

raízes e da fração hexano obtida das raízes de M. nodosa em salina/DMSO 2%. Uma diluição

seriada foi realizada e 1,0 mL de cada amostra em estudo, nas concentrações 10.000, 5000,

2500, 1250, 625, 312,5 e 156,7 µg/mL, foi colocada em tubos de ensaio. A cada tubo

adicionou-se 10 larvas de Artemia salina e os tubos foram mantido sob iluminação e aeração

constante, a 30ºC por 24 horas. Um tubo contendo água/DMSO a 2% foi utilizado como

controle negativo. Após esse período os náupilos mortos ou com perda de movimento foram

contados para a determinação da porcentagem de mortalidade das larvas em cada

concentração analisada. O experimento foi realizado em triplicata e o cálculo da DL50 foi

realizada por regressão linear dos resultados obtidos.

RESULTADOS

Os extratos etanólicos das folhas e raízes de M. nodosa foram obtidos com rendimento

de 12% e 4,2%, respectivamente.

133

OH

H

H H

1

3 5

28

26

27

24

2120

1911

9

7

15

17

18

13

OH

H

H H

1

3 5

28

26

27

24

2120

1911

9

7

15

17

18

13

22

23

22

23

Em média, o rendimento para as frações obtidas do extrato bruto das folhas foi de:

17,7% para a FH, 16,2% para FD, 15,2% para FAc e 50,9% para FA. Para as frações obtidas

das raízes o rendimento foi de 10% para FH, 16,6% para FD, 9,6% para FAc e 62,3% para

FA.

O composto S1 (160 mg), isolado da fração hexano obtida das raízes de M. nodosa, se

apresentou como um sólido branco amorfo ou cristalino. Dos espectros de IV e RMN-H1 e

RMN-C13 destacaram-se: IV (KBr, cm-1): 3434 (OH), 2961 (C-H), 2866 (C-H), 1463 (C=C)

1400 (C=C), 1382 (CH3). RMN-1H (CDCl3,δ,J)300MHz: 0,70-1,01 (s, H das metilas C-18,

C-19 do β-sitosterol e estigmasterol), 3,53(m, H-3), ~ 5,0(dd, H-23, J=8,4 e 15Hz), ~5,1(d, H-

22, J=8,4 E 15 Hz), 5,36(d largo H-6). RMN 13C (CDCl3, δ)75MHz: C-3(71,80), C-

6(121,72), C-5(140,73), C-22(138,32), C-23(129,23). Após a análise dos dados espectrais e

comparação com dados da literatura (GOULART et al., 1993) o composto S1 foi identificado

como sendo a mistura de β-sitosterol e estigmasterol (Figura 1).

1 2

β-Sitosterol Estigmasterol

Figura 1 - Estrutura química de S1, mistura do β-sitosterol e do estigmasterol

No screening contra formas promastigotas de L. chagasi, o extrato etanólico das folhas

e o extrato etanólico das raízes demonstraram forte atividade leishmanicida (atividade +++ na

concentração de 100 µg/mL) sendo submetidos ao teste para determinação da IC50. O extrato

etanólico das folhas apresentou IC50 de 93,2 µg/mL e o extrato etanólico das raízes IC50 de

95,87 µg/mL.

Após o screening das frações hexano, diclorometano, acetato de etila e aquosa das

folhas e das raízes de M. nodosa contra formas promastigotas de L. chagasi, verificou-se que

apenas a fração hexano das raízes apresentou forte atividade leishmanicida, sendo submetida

134

ao teste para determinação da IC50. A fração hexano apresentou IC50 de 13,51 µg/mL e foi

submetida a cromatografia em coluna. A mistura de β-sitosterol e estigmasterol apresentou

forte atividade leishmanicida quando submetida ao screening e apresentou IC50 de 69,79

µg/mL.

Durante todo o período de observação dos animais submetidos à avaliação da

toxicidade aguda nenhuma morte foi registrada. Também não foram observados sinais de

toxicidade nas 24 horas após a administração das amostras, assim como durante todo o

período previsto para a experimentação. Não foram detectadas variações de sensibilidade

intraespecíficas e interespecíficas. A necropsia dos animais não evidenciou nenhuma alteração

macroscópica. Na avaliação histológica não foram observadas alterações, em relação ao grupo

controle, nos animais (ratos e camundongos) tratados com os extratos etanólicos das folhas e

das raízes e fração hexano das raízes, na dose de 2000 mg/kg. Na análise histológica dos

camundongos tratados com o extrato das raízes na dose de 5000 mg/kg foi observado no

fígado foco inflamatório discreto, com predomínio de polimorfonucleares. Nos camundongos

tratados com o extrato etanólico das folhas na dose de 5000 mg/kg observou-se no fígado,

degeneração hidrópica acentuada, foco inflamatório moderado com predomínio de

polimorfonucleares. Nenhuma alteração histológica foi observada no baço e nos rins.

No experimento com Artemia salina verificou-se que a DL50 para o extrato etanólico

das folhas foi 6250 µg/mL, para o extrato etanólico das raízes 2250 µg/mL e para a fração

hexano obtida das raízes 2440 µg/mL.


Neste estudo avaliou-se a habilidade dos extratos etanólicos e frações obtidos das

folhas e das raízes de M. nodosa em provocar a morte de formas promastigotas de Leishmania

chagasi, um protozoário que provoca leishmaniose visceral no homem. O extrato etanólico da

raiz apresentou IC50 de 95,87 µg/mL e a fração hexano obtida desse extrato IC50 de 13,51

µg/mL. A ação leishmanicida obtida com a fração hexano estimulou o isolamento de

componentes dessa fração buscando identificar as substâncias responsáveis pela atividade

contra L. chagasi. A mistura de β-sitosterol e estigmasterol mostrou atividade leishmanicida,

porém inferior à fração hexano, portanto ela pode estar colaborando com a atividade

leishmanicida em sinergismo com outras substâncias presente nessa fração.

135

Diversos compostos químicos, isolados de extratos vegetais, têm comprovada

atividade leishmanicida sobre formas promastigotas e/ou amastigotas de Leishmania em

ensaios in vitro, em concentrações variadas. Atividade leishmanicida de terpenóides,

aminoglicosteróides e aminoesteróides, naftoquinonas, chalconas, glicosídios iridóides,

flavonóides, lignanas e alcalóides estão descritos na literatura (BEZERRA et al., 2006;

ROCHA et al., 2005). Ferreira et al. (2004) obtiveram IC50 de 47 µg/mL sobre formas

promastigotas para a fração contendo os alcalóides totais da espécie Aspidosperma

ramiflorum. Delorenzi et al. (2001) avaliaram o potencial leishmanicida da coranaridina, um

alcalóide isolado do caule de Peschiera australi e obtiveram IC50 de 12,5 µg/mL na inibição

das formas promastigotas e amastigotas de L. amazonensis. O óleo essencial da casca do caule

de Croton cajucara apresentou IC50 de 8,3 ng/mL sobre formas promastigotas e 22 ng/mL

sobre as amastigotas, enquanto o linalool, obtido desse óleo apresentou IC50 de 4,3 ng/mL

sobre promastigotas e 15,5 ng/mL sobre amastigotas (ROSA et al., 2003). Outros estudos

evidenciaram potencial leishmanicida de extratos vegetais. Nakamura et al. (2006) relataram

IC50 de 167 µg/mL para o extrato hidroalcoólico das folhas de Piper regnellii (Miq.) C. DC.,

enquanto a fração hexano apresentou IC50 de 21,5 µg/mL e a fração acetato de etila, IC50 de

30 µg/mL contra formas promastigotas de Leishmania amazonensis. Bezerra et al.(2006), ao

avaliarem a atividade leishmanicida dos extratos hidroalcoólicos obtidos das folhas de nove

plantas medicinais contra formas promastigotas de L. amazonensis, obtiveram IC50 de 29,5

µg/mL para Julocroton triqueter (Lam.) Didr. var. triqueter, 32,9 µg/mL para Dicorisandra

sp e 43,6 µg/mL para Tephrosia cineria (L) Pers.. Moreira et al. (2007) relataram que a

Stachytarpheta cayennensis, uma planta utilizada popularmente para lesões provocadas por

Leishmania sp apresentou IC50 de 73,7 µg/mL para Leishmania brasiliensis e IC50 de 382,5

µg/mL para L. amazonensis (Rich.) Vahl. Baseando-se nessas pesquisas pode-se concluir que

a atividade leishmanicida do extrato etanólico da raiz de M. nodosa (IC50 de 95,87 µg/mL) e

da fração hexano obtida desse extrato (IC50 de 13,51 µg/mL) encontrada no presente estudo é

significativa.

No que se refere à toxicidade aguda oral foi utilizado, nesse experimento, o método de

classe de dose aguda tóxica (Acute toxic class method – OECD 423). Esse método preconiza

o uso de três animais do mesmo sexo por dose e dependendo da mortalidade a utilização de

doses intermediárias da substância teste. Na avaliação da toxicidade aguda dose única, por via

oral, em ratos e camundongos, os extratos etanólicos das folhas e das raízes e a fração hexano

das raízes foram classificados na classe 5 (2000 mg/kg< LD50< 5000 mg/kg), ou seja,

substâncias de muito baixa toxicidade.

136

Em relação a Artemia salina, Meyer et al. (1982) classificaram os extratos etanólicos

brutos como tóxicos quando a DL50< 1000 µg/mL e não-tóxicos quando a DL50> 1000

µg/mL. Baseando-se nesses parâmetros e usando o mesmo teste, o presente trabalho não

detectou citotoxicidade dos extratos etanólicos das folhas e das raízes e da fração hexano da

M. nodosa.

Pode-se concluir que a fração hexano obtida das raízes de M. nodosa apresentou ação

contra formas promastigotas de Leishmania chagasi, com a vantagem de não apresentar

toxicidade nos modelos utilizados. A mistura de β-sitosterol e o estigmasterol apresentou

atividade contra formas promastigotas de L. chagasi e pode estar contribuindo, em sinergismo

com outros compostos para a atividade leishmanicida observada na fração hexano. Estudos

visando isolar novos compostos, assim como avaliar a atividade da fração hexano e dos

compostos isolados sobre formas amastigotas de L. chagasi e de outros gêneros de

Leishmania, serão realizados posteriormente.

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141

CONCLUSÕES GERAIS

142

CONCLUSÕES GERAIS

Este trabalho contribuiu para o conhecimento da morfologia da Memora nodosa (Silva

Manso) Miers e forneceu parâmetros anatômicos que poderão auxiliar na identificação

botânica dessa planta medicinal.

A análise dos óleos essenciais das folhas de M. nodosa de seis regiões de Cerrado de

Goiás (Goiânia, Senador Canedo, Nerópolis, Parauna, Rio Verde, Caldas Novas) e

uma de Minas Gerais (Uberlândia) indicaram quimiovariabilidade e possibilitou a

distinção de duas classes diferenciadas em relação aos constituintes e o local da

amostragem. Verificou-se forte correlação entre a composição química dos óleos

essenciais com a coordenada geográfica, sendo o 1-octen-3-ol produzido

principalmente por biotipos com altitudes elevadas.

O óleo essencial obtido das folhas da M. nodosa apresentou o benzaldeido (91,7%)

como componente majoritário, além de 1-octen-3-ol (6,0%), linalol (0,8%), 3-octanol

(0,5%) e mandelonitrila (1,2%). O óleo essencial das folhas de M. nodosa mostrou

atividade antimicrobiana moderada contra bactérias Gram-positivas e C. albicans. A

maior atividade antimicrobiana do óleo essencial, quando comparado com o

benzaldeído, o componente majoritário sugere uma ação sinérgica entre os

componentes do óleo.

O extrato etanólico das raízes de M. nodosa possuiu fraca atividade antimicrobiana,

enquanto as frações hexano e diclorometano obtidas desse extrato mostraram ação

antimicrobiana que variou de boa a moderada contra bactérias Gram-positivas e o

fungo Candida albicans.

O extrato etanólico obtido das folhas de M. nodosa, em solução a 2%, apresentou

atividade angiogênica no 7o dia de tratamento, mas não mostrou atividade cicatrizante

em feridas cutâneas de ratos. O extrato etanólico das raízes de M nodosa, em solução

a 2%, mostrou atividade angiogênica no 7o dia de tratamento e acelerou a

reepitelização das feridas cutâneas de ratos. A ação sobre a reepitelização pode ser

atribuída à alantoína, isolada desse extrato.

143

Os extratos etanólicos das folhas e das raízes de M. nodosa mostraram atividade

leishmanicida sobre formas promastigotas de Leishmania chagasi com IC50 93,2

µg/mL e IC50 de 95,87 µg/mL, respectivamente. A fração hexano obtida do extrato

hexano das raízes mostrou IC50 de 13,51 µg/mL. O β-sitosterol e o estigmasterol

foram isolados da fração hexano e apresentaram IC50 de 69,79 µg/mL e pode estar

contribuindo para a ação leishmanicida da fração hexano.

Os extratos etanólicos das folhas e das raízes e a fração hexano obtida das raízes de M.

nodosa não apresentaram toxicidade aguda para ratos, camundongos, nem

citotoxicidade para Artemia salina.

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