bioprospecção de plantas medicinais com atividade antimicrobiana

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA

MESTRADO EM ODONTOLOGIA PREVENTIVA E INFANTIL

GISLAINE SIMÕES PORTELA

BIOPROSPECÇÃO DE PLANTAS MEDICINAIS

COM ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTI-QUORUM SENSING

JOÃO PESSOA, 2011




Dissertação apresentada à

coordenação de Pós-graduação em

Odontologia do Centro de Ciências

da Saúde da Universidade Federal

da Paraíba, vinculado à linha de

pesquisa Fitoterapia aplicada à

Odontologia como requisita para a

obtenção do título de mestre.

Orientador: Prof. Dr. Fábio Correia Sampaio (UFPB)

Co-orientador: Prof. Dr. Franklin Delano Soares Forte (UFPB)

JOÃO PESSOA, 2011




Aprovada em ____de ______ de 2011.

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________

Prof. Dr. Fábio Correia Sampaio (UFPB)

ORIENTADOR

_____________________________________________

Prof. Drª. Edeltrudes de Oliveira Lima (UFPB)

MEMBRO

_____________________________________________

Prof. Drª Andréa Cristina Barbosa da Silva (UFCG)

MEMBRO

SUMÁRIO

1.INTRODUÇÃO................................................................................... 12

2 BIOFILME DENTAL.......................................................................... 14

2.1 Mecanismos de ação da comunicação bacteriana “quorum

sensing”...............................................................................................

18

2.2 Agentes antimicrobianos.............................................................. 22

2.2.1 Fitoterápicos com ação antimicrobiana........................................ 23

2.2.2 Fitoterápicos com ação anti - quorum sensing............................. 25

3.OBJETIVOS ...................................................................................... 27

3.1 Objetivo geral................................................................................. 27

3.2 Objetivos específicos.................................................................... 27

4. CAPÍTULOS...................................................................................... 28

4.1 Capítulo 1....................................................................................... 29

4.2 Capítulo 2....................................................................................... 44

4.3 Capítulo 3....................................................................................... 61

5 DISCUSSÃO...................................................................................... 77

6 CONCLUSÕES.................................................................................. 81

REFERÊNCIAS.. .................................................................................. 82

APÊNDICES.......................................................................................... 86

Apêndice 1.......................................................................................... 86

Apêndice 2.......................................................................................... 88

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Representação esquemática da formação do biofilme na

superfície do dente e as funções potenciais das interações

bacterianas.................................................................................................... 15

Figura 2- Cadeias de homoserinas lactonas aciladas.................................. 20

Figura 3-. Sistema de sinalização quorum sensing em bactérias gram-

negativas, encontrado no Vibrio fischeri....................................................

21

LISTA DE QUADROS

Quadro1-Fatores responsáveis pela quebra da homeostasia

microbiana................................................................................................

16

Quadro2- Lista de alguns metabólitos importantes encontrados em

plantas medicinais........................................................................................ 23

Capítulo 1

Quadro 1- Valores de CIM e CBM (μg/mL) dos EEB’s ensaiados frente à

patógenos orais.........................................................................................

35

Quadro 2- Determinação da presença de metabólitos secundários nos

EEB’s............................................................................................................. 36

Capítulo 2

Quadro 1- Valores de CIM e CBM (μg/mL) dos extratos e partições frente

ao S. mutans...........................................................................................

51


ao S. salivarius............................................................................................

52

Quadro 3 - Valores de CIM e CBM (μg/mL) dos extratos e partições frente

ao S. oralis. ............................................................................................ 53

Quadro 4 - Determinação da presença de metabólitos secundários nos

EEB’s...................................................................................................... 53

Capítulo 3

Figura 1- Representação da atividade anti-QS (1.goiabeira, 2.cajueiro)....

69


a E. coli. ........................................................................................................

70

Quadro 2- Halos de inibição da atividade anti-QS do EEB’s....................... 70

PORTELA, G.S. Bioprospecção de plantas medicinais com atividade

antimicrobiana e anti-quorum sensing.[Dissertação]. João Pessoa: Universidade

Federal da Paraíba; 2011. 88 p.

RESUMO

O objetivo desta pesquisa foi investigar a existência de compostos vegetais que

apresentem atividade antimicrobiana e anti-quorum sensing em micro-organismos

formadores de biofilmes bucais. As plantas utilizadas nesta pesquisa foram: Schinus

terebinthifolius Raddi (aroeira da praia); Lippia sidoides Scham (alecrim pimenta);

Abarema cochiliacarpos (Gomes) B. & J.W. Grimes (barbatimão); Anacardium

occidentale Linn (cajueiro); Psidium guajava Linn (goiabeira); Tabebuia avellanedae

Lorentz ex Griseb (ipê-roxo); Hymenaea courbaril L. (jatobá) e a Bowdichia virgiloides

Kunth (sucupira), Anadenanthera macrocarpa Benth (angico), Abarema cochiliacarpos

(Gomes) B. & J.W. Grimes (barbatimão), Ziziphus joazeiro Mart (joazeiro), Sida

cordifolia L. (malva branca), Chenopodium ambrosioides L. (mastruz), Punica

granatum L. (romã) e Zingiber officinale (gengibre). Os extratos de Schinus

terebinthifolius Raddi (aroeira da praia); Lippia sidoides Scham (alecrim pimenta);

Abarema cochiliacarpos (Gomes) B. & J.W. Grimes (barbatimão); Anacardium

occidentale Linn (cajueiro); Psidium guajava Linn (goiabeira); Tabebuia avellanedae

Lorentz ex Griseb (ipê-roxo); Hymenaea courbaril L. (jatobá) e a Bowdichia virgiloides

Kunth (sucupira), Abarema cochiliacarpos (Gomes) B. & J.W. Grimes (barbatimão),

Ziziphus joazeiro Mart (joazeiro) foram submetidos à partição com solventes em ordem

crescente de polaridade, hexano, diclorometano e acetato de etila. A atividade

antimicrobiana foi determinada pela técnica da microdiluição em caldo e utilizou o

modelo de QSIs (sistema Inibidor de Quorum Sensing) proposto por Rasmussen e

colaboradores (2005). Os resultados obtidos revelaram-se promissores para o

desenvolvimento de fitomedicamentos. A atividade anti-quorun sensing foi significante

para Abarema cochiliacarpos (Gomes) B. & J.W. Grimes (barbatimão); Anacardium

occidentale Linn (cajueiro); Psidium guajava Linn (goiabeira); e o fruto do Hymenaea

courbaril L. (jatobá). Os resultados suportam a hipótese que extratos e partições de

algumas plantas medicinais possuem atividade anti-quorum sensing como mecanismo

de atividade antimicrobiana.

Palavras-chave: Plantas medicinais, atividade antimicrobiana, quorum sensing, anti-

quorum sensing.

PORTELA, G.S. Bioprospecting of medicinal plants with antimicrobial activity and

anti-quorum sensing. [Dissertation]. João Pessoa: Universidade Federal da

Paraíba; 2011. 88 p.

ABSTRACT

The objective of this research was to investigate the existence of antimicrobial plant

compounds and anti-quorum sensing in oral biofilms. The plants used in this study

were: Schinus terebinthifolius Raddi (aroeira da praia); Lippia sidoides Scham (alecrim

pimenta); Abarema cochiliacarpos (Gomes) B. & J.W. Grimes (barbatimão);

Anacardium occidentale Linn (cajueiro); Psidium guajava Linn (goiabeira); Tabebuia

avellanedae Lorentz ex Griseb (ipê-roxo); Hymenaea courbaril L. (jatobá) e a

Bowdichia virgiloides Kunth (sucupira), Anadenanthera macrocarpa Benth (angico),

Abarema cochiliacarpos (Gomes) B. & J.W. Grimes (barbatimão), Ziziphus joazeiro

Mart (joazeiro), Sida cordifolia L. (malva branca), Chenopodium ambrosioides L.

(mastruz), Punica granatum L. (romã) and Zingiber officinale (gengibre). The extracts

were submitted in good yield to the partition with solvents in order of increasing

polarity, hexane, dichloromethane and ethyl acetate. The antimicrobial activity was

determined by the techniques of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum

bactericidal concentration (MBC) and use the model QSIs (Quorum Sensing Inhibitor

System) proposed by Rasmussen and colleagues (2005). The results proved promising

for the development of phytomedicines. The anti-quorun sensing was significant for

Abarema cochiliacarpos (Gomes) B. & JW Grimes (barbatimão), Anacardium

occidentale Linn (cajueiro), Psidium guajava Linn (goiabeira) and the fruit of Hymenaea

courbaril L. (Jatobá). The results support the hypothesis that extracts and partitions of

some medicinal plants have anti-quorum sensing activity as a mechanism of

antimicrobial activity.

Keywords: Medicinal plants, antimicrobial activity, quorum sensing, anti-quorum

sensing.

Dedico a Vó Enedina, Vó Alcina e Tia Lica,

pela determinação, bondade e amizade.

Saudades e grande admiração.

In memoriam

AGRADECIMENTOS,

Á Deus, por iluminar todos os meus passos;

Á Universidade Federal da Paraíba, instituição a qual tenho

grande orgulho de fazer parte;

Ao CNPq, por possibilitar o desenvolvimento da pesquisa;

Aos meus Pais, Maria e Portela por me apoiarem e serem a minha

referência de amor e união;

Aos meus irmãos, Gray, Greysielly e Giscard pelo o amor dedicado e

grande ajuda;

Aos meus sobrinhos Celyne, Clarisse e Leonardo estrelinhas presentes

nas nossas vidas, capazes de despertar a felicidade em qualquer

momento;

Ao meu noivo, Carlos; as palavras expressas são poucas para revelar

o quão é importante na minha vida, pelo o amor sincero,

companheirismo, incentivo constante, compreensão e dedicação;

Aos meus sogros, Marcos e Vânia, pelo carinho e também

participarem dessa caminhada;

A minha amiga Daniela, por dividir todos os momentos e ajuda

constante nesse universo da Fitoterapia;

As amigas do mestrado que tenho grande admiração, Consuelo e

Viviane;

A Allam, pela ajuda científica e disponibilidade cedida, e as

longas horas de conversas e piadas ribossomais;

A todos os alunos que compartinlham o LABIAL e estimam a vida

científica da Odontologia;

A todos os profissionais envolvidos no plantio e coleta das plantas;

A professora, Rita, pela identificação do material botânico;

A Nonato, inestimável auxilio no Laboratório de Tecnológia

Farmacêutica;

A todos que fizeram parte dessa grande caminhada;

Muito Obrigada!!!

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS,

Ao meu orientador, Prof. Dr. Fábio Correia Sampaio por me aceitar

como orientanda e dividir essa experiência comigo, sempre com o

seu ar de serenidade e palavras sábias, não repassou apenas

conhecimento, mas um exemplo de pessoa e mestre.

Apresentou-me o mundo diverso da Fitoterapia, como Odontóloga

me possibilitou maior conhecimento dessa especialidade tão

promissora da Odontologia;

Sou muito grata pela sua participação e dedicação em mais uma

etapa da minha vida acadêmica!

LISTA DE ABREVIATURAS

OMS Organização Mundial da Saúde

PNPIC Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares

PIC Polissacarídeo intracelular

PEC Polissacarídeo extracelular

pH Potencial hidrogeniônico

QS Quorum sensing

QSI Inibidor de quorum sensing

EEB Extrato etanólico bruto

DMSO Dimetilsulfóxido

SM Solução mãe

CIM Concentração Inibitória Mínima

CBM Concentração Bactericida Mínima

BHI Brain heart infusion

LB Luria-Bertani

IPTG Iso-propyl-thiogalactosidase

OHHL N-(beta-Ketocaproyl)-DL-homoserina lactona

1 INTRODUÇÃO

A Fitoterapia, palavra originária dos radicais gregos phyton (planta) e

therapia (tratamento), é um ramo da ciência, que utiliza plantas, drogas

vegetais e emulsões para o tratamento de enfermidades (SARTI; CARVALHO,

2004). Segundo Teske e Trenitini (1994), a fitoterapia é uma prática antiga. O

primeiro manuscrito conhecido a respeito desse tema é o Papiro de Ebers,

datado de 1500 a.C. Atualmente, as pesquisas realizadas com plantas

medicinais confirmam as indicações de usos tradicionais das plantas, indicando

a importância dos costumes populares como fontes de investigação de novos

produtos terapêuticos. Nesse sentido, os princípios ativos de algumas plantas

são bem conhecidos, ao passo que a composição química e mecanismos de

ação de alguns compostos naturais ainda são motivos de pesquisas.

Em 1978, a Organização Mundial da Saúde (OMS) reconheceu os

medicamentos de origem vegetal como recurso terapêutico (WORLD HEALTH

ORGANIZATION, 2001). No Brasil, apenas em 1995 passou a existir

normatização oficial sobre os medicamentos fitoterápicos (BENDAZZOLI,

1995). Em 2006, surge a política para o uso de plantas medicinais no serviço

público através da Portaria nº. 971, que aprovou a Política Nacional de Práticas

Integrativas e Complementares (PNPIC) no Sistema Único de Saúde (BRASIL,

2006).

No caso da odontologia, a regulamentação do uso de plantas medicinais

está inserida na resolução CFO-82/2008, no capítulo II, habilitando o

profissional ao uso da Fitoterapia na prática profissional, no resgate do saber

popular e no uso e aplicabilidade desta terapêutica na Odontologia.

Apesar do reconhecimento oficial da fitoterapia na Medicina e

Odontologia do Brasil, este vem acompanhado de uma lacuna na pesquisa

científica sobre plantas medicinais, pois o Brasil é um dos países com maior

biodiversidade vegetal do mundo, com cerca de 55 mil espécies catalogadas,

sendo aproximadamente apenas quatro mil destas reconhecidas como plantas

medicinais. Entretanto, só 8% das espécies vegetais brasileiras foram

estudadas em busca de moléculas bioativas (AMORIM et al., 2003; OLIVEIRA,

2006). No caso da Odontologia, o uso das plantas medicinais para problemas

da cavidade bucal é ainda limitado pelo desconhecimento dos profissionais

sobre este recurso terapêutico.

Uma vez que as plantas medicinais produzem um amplo espectro de

ações farmacológicas de grande interesse para a Medicina e Odontologia,

podemos destacar ações antiinflamatória, ansiolítica e antimicrobiana (ELVIN-

LEWIS, 1982; GEBARA; ZARDETTO; MATOS et al., 1997; XAVIER; RAMOS;

XAVIER FILHO, 1995). O estudo de plantas medicinais antimicrobianas não é

um fato recente, entretanto, apesar de antigo, o assunto é atual e relevante

devido ao aumento de resistência bacteriana e a necessidade de novos

antimicrobianos eficazes de baixo custo e com reduzidos efeitos colaterais

(COWAN, 1999; NIERO et al., 2003).

A avaliação pré-clínica de antimicrobianos bucais foi tradicionalmente

voltada para técnicas com microrganismos na forma planctônica. Por este

motivo, os recentes modelos de estudo em biofilmes sugerem reproduzir com

mais fidedignidade o estilo de vida dos microrganimos na cavidade bucal,

orofaringe e de alvéolos pulmonares (GUGGENHEIM et al., 2004; LEIBOVITZ,

2003; MARSH, 2004). A comprovação de que as expressões de genes em

Streptococcus mutans são diferentes entre células planctônicas e biofilmes

explicam em parte o fato dos antimicrobianos testados in vitro não

reproduzirem o mesmo desempenho in vivo (MARSH, 2004; SILVA, 2010).

A maioria dos microrganismos demonstra um comportamento

organizado, quando colonizam um hospedeiro eucariótico e produzem uma

série de fatores de virulência, que danificam tecidos e resultam em doenças.

Estes fatores de virulência podem ser mediados por auto-indutores liberados

no meio, e ativam o processo de comunicação celular conhecido por “quorum

sensing” (FUQUA; WINANS; GREENBERG, 1994).

Os mecanismos de quorum sensing entre bactérias vêm sendo

elucidados há menos de uma década, assim como poucos estudos científicos

foram realizados utilizando espécies vegetais nativas ou moléculas bioativas

isoladas nas atividades antimicrobiana e anti-quorum sensing em biofilmes. Por

este motivo, a bioprospecção de espécies vegetais com atividade

antimicrobiana e anti-quorum sensing em ecossistemas como biofilme dental

são relevantes, tornando o tema deste trabalho estratégico para o

desenvolvimento científico.

2 BIOFILME DENTAL

O biofilme bacteriano é uma comunidade microbiana tridimensional que

se adere seletivamente às superfícies dentárias, contidos em matriz orgânica

formada por substâncias da saliva e da dieta do hospedeiro e por polímeros

bacterianos (MARSH, 1995).

A formação e acumulação de biofilmes é o resultado de diversos

processos físicos e biológicos. Inicia-se com a deposição de glicoproteínas

salivares seguidas da adsorção das moléculas bacterianas e do hospedeiro

para formar a película adquirida, transporte das bactérias para a superfície dos

dentes cobertas pela película, uma fase reversível envolvendo as forças de

atração e repulsão eletrostática de van der Walls, uma fase irreversível

envolvendo alterações intermoleculares específicas entre adesinas bacterianas

e receptores do hospedeiro, co-agregação das bactérias já ligadas a

microrganismos e divisão celular levando a um crescimento confluente e a

formação do biofilme ( MARSH; MARTIN, 2005; HOJO et al., 2009; XAVIER et

al., 2003) (Figura 1).

No biofilme dental as bactérias não existem como entidades

independentes, mas como uma comunidade microbiana coordenada e

integrada metabolicamente (MARSH; BOWDEN, 2000). Esta interação oferece

enormes benefícios para os organismos participantes quando comparadas às

mesmas bactérias crescidas de forma planctônica, incluindo: uma faixa mais

ampla de habitat para crescimento, aumento na diversidade, eficiência

metabólica e uma maior resistência ao ambiente, aos agentes antimicrobianos

e às defesas do hospedeiro (MARSH; BOWDEN, 2000).

Figura 1- Representação esquemática da formação do biofilme na superfície do dente e as potenciais interações bacterianas. (Adaptado de Hojo et al., 2009).

A heterogeneidade e a grande densidade de bactérias dentro dos

biofilmes promovem alterações genotípicas e fenotípicas, através da liberação

de moléculas de sinalização no ambiente, induzindo a modificação da

expressão gênica (genes de virulência de exoenzimas, exopolissacarídeos) e

ao mesmo tempo, a aquisição de uma vantagem competitiva importante para a

sobrevivência e perpetuação em ambientes naturais, de alta competitividade

como a cavidade oral, e o intestino, onde coexistentem centenas de espécies

(SHEIE, PETERSEN, 2004).

A colonização bacteriana do epitélio bucal começa no nascimento,

sendo modificada quando ocorre a erupção dos dentes, surgindo novos locais

de retenção; onde espécies do grupo S. mitis, Neisseria, hemófilos e algumas

espécies de Actinomyces colonizam inicialmente os dentes e as superfícies da

mucosa oral (JENKINSON; LAMONT, 2005). Esses primeiros colonizadores

permitem a colonização de outras espécies como Veillonella, Porphyromonas,

Fusobacterium, Actinomyces e Streptococcus (JENKINSON; LAMONT, 2005).

Após a colonização inicial de cepas, principalmente aeróbica, o ambiente torna-

se propício para as cepas anaeróbicas. O crescimento inicial do biofilme é

facilitado por uma co-agregação seletiva entre as bactérias, como entre

Quadro 1- Fatores responsáveis pela quebra da homeostasia microbiana.

Streptococcus e Actinomyces, Veillonella e Streptococcus, Prevotella e

Actinomyces (MARSH; MARTIN, 2005).

As condições sob as quais se desenvolvem os biofilmes orais estão

intimamente ligadas à saúde geral e a biologia do hospedeiro. Na saúde, há um

equilíbrio ecológico entre o hospedeiro humano e os microrganismos indígenas

– homeostase microbiana (MARSH; PERCIVAL, 2006). Alguns fatores

imunológicos e não imunológicos predispõem à quebra da homeostase

microbiana, tornando o biofilme um agente etiológico associado às cáries e às

doenças periodontais (JENKINSON; LAMONT, 2005) (Quadro 1).

Fatores imunológicos Fatores não imunológicos

Deficiências em IgAs

Disfunção de neutrófilos

Mielossupressão induzida por quimioterapia

Mielossupressão induzida por infecção (AIDS)

Xerostomia

Antibióticos

Carboidratos da dieta

Baixo PH

Aumento do fluxo salivar

Contraceptivos orais

(Fonte: Marsh; Martin, 2005)

A cárie dentária e a doença periodontal são problemas de saúde bucal

comuns em todo o mundo. Elas ocorrem entre 50% e 99% das pessoas na

maioria das comunidades (OMS, 2001). A etiologia da cárie dentária difere da

doença periodontal, porque envolve bactérias distintas e diferentes modelos de

resposta ao hospedeiro. A cárie dentária é uma doença multifatorial, infecciosa,

transmissível e sacarose dependente. Necessita da interação entre

microrganismos patogênicos e dieta cariogênica, num hospedeiro que ofereça

um ambiente adequado, durante certo período de tempo. Está intimamente

ligada à introdução dos carboidratos refinados na dieta da população,

principalmente a sacarose, que é considerada o dissacarídeo mais cariogênico,

sendo este o mais presente na dieta familiar em quase todo o mundo

(LOESCHE, 2007).

Fejerskow e Manji (1990) demonstraram as relações entre o biofilme e

os múltiplos determinantes biológicos que influenciam a possibilidade de

desenvolvimento da lesão de cárie. O biofilme cresce rapidamente e muitas

bactérias do biofilme utilizam açúcares presentes na dieta (sacarose, glicose,

frutose e lactose) para seu metabolismo energético. Os carboidratos são

fermentados de modo direto, mas, na presença de grandes quantidades, são

armazenados na forma de polissacarídeos intra (PIC) e extracelulares (PEC). A

fermentação de carboidratos no metabolismo anaeróbio das bactérias resulta

na produção de ácidos, principalmente o ácido láctico. O aumento da

concentração do íon hidrogênio (pH ácido) causa subsaturação do cálcio e do

fosfato na fase fluida ao redor do dente, ocasionando o processo de

desmineralização dos tecidos dentais. Este pH ácido é um dos responsáveis

pela instalação no biofilme dental de uma comunidade microbiana acidúrica e

acidogênica (MARSH; MARTIN, 2005).

O pH próximo da neutralidade encontrado em biofilmes na ausência de

carboidratos significa um período de repouso onde há saturação de cálcio e

fosfato. Se os ataques ácidos forem muito freqüentes ou tiverem longa duração

em relação aos períodos de pH neutro, o resultado final será uma lesão

cariosa. O equilíbrio destes é determinado por diversos fatores como dieta;

padrão de ingestão de alimentos; a composição da saliva; a suscetibilidade da

superfície dental e a concentração de flúor no ambiente do biofilme dental. A

microbiota envolvida no início do processo carioso são os Streptococcus

mutans, enquanto os lactobacilos e A. Odontolyticus estão relacionados à

progressão de lesões no esmalte (JOHANSSON; BIRKHED, 1995).

A periodontite pode ser definida como uma infecção mista envolvendo

sítios únicos ou múltiplos na cavidade oral e levando à perda dos tecidos

periodontais de suporte. A gengivite é um processo infeccioso e inflamatório

limitado à gengiva. Estas doenças resultam da exposição do periodonto ao

biofilme que se acumula no dente para formar verdadeiras massas bacterianas

na margem gengival ou abaixo dela (ARMITAGE, 1999).

A etiologia bacteriana das doenças periodontais é complexa, com uma

grande variedade de microrganismos responsáveis pelo início e pela

progressão da doença. Embora mais de 400 espécies bacterianas diferentes

possam ser detectadas na cavidade oral, somente um número limitado pode

ser implicado como patógenos periodontais. Muitos destes microrganismos

podem também estar presentes em indivíduos sadios, podendo existir como

comensais e em harmonia com o hospedeiro (TROMBELI; TATAKIS, 2003)

Certos grupos de bactérias gram-negativas têm sido encontrados de

forma consistente em lesões periodontais. Entre elas, Porphyromonas

gingivalis, Prevotella intermedia, Campylobacter rectus, Bacteroides sp.,

Selenomonas sp. e espiroquetas tem sido associadas com periodontites

refratárias do adulto (KUMAR et al, 2003). Além disso, Actinobacillus

actinomycetemcomitans, Capnocytophaga sp., Prevotella intermedia e

Eikenella corrodens têm sido associadas com periodontite de início precoce.

Entretanto, alguns microrganismos gram-positivos anaeróbios como

Peptostreptococcus micros e certas espécies de Eubacterium têm sido

recentemente implicados em doenças periodontais destrutivas (BASCONES-

MARTINEZ; BASCONES-LLUNDAIN; CAMPO TRAPERO, 1998).

2.1 Mecanismos de ação da comunicação bacteriana “quorum sensing”

Na natureza, as bactérias apresentam-se como grupos coerentes

capazes de habitar nichos ecológicos diversos (SHAPIRO, 1998). Muitas

bactérias apresentam um sistema elaborado de comunicação entre células,

permitindo que uma dada espécie possa sentir, integrar e processar

informações do seu ambiente, comunicar-se umas com as outras e monitorar a

sua própria densidade populacional, ativando ou reprimindo a expressão

gênica. Este sistema de comunicação dependente de densidade populacional

em bactérias foi denominado de quorum sensing (QS) (FUQUA; WINANS;

GREENBERG, 1994). O quorum sensing é um mecanismo de transdução de

sinal pelo qual bactérias podem modular diversas funções celulares, dentre

elas esporulação, formação de biofilme, produção de bacitrocinas, expressão

de fatores de virulência, produção de antibióticos, pigmentação e

bioluminescência de acordo com a densidade populacional (SMITH;

FRATAMICO; NOVAK, 2004).

Segundo Schauder e Bassler (2001), este mecanismo de QS permite que

procariotos tenham comportamento similar a organismos multicelulares e traz

benefícios que não seriam alcançados por esses organismos como indivíduos.

Uma concentração de células é necessária para a produção suficiente de

fatores extracelulares capazes de influenciar o ambiente vizinho; um gasto

desnecessário de energia seria realizado se as bactérias começassem a

produzir estes fatores antes que uma população mínima fosse atingida

(GREENBERG, 2000). Em patógenos, por exemplo, uma expressão gênica de

fatores de virulência reduzida é mantida quando a densidade populacional

encontra-se baixa, evitando que o organismo hospedeiro inicie uma resposta

imune. Quando um número suficiente de bactérias é alcançado, há expressão

de genes de virulência e, assim, são capazes de vencer as defesas do

hospedeiro (DONABEDIAN, 2003).

Os estudos sobre quorum sensing foram iniciados no fim dos anos 60

pelos pesquisadores J. Woody Hastings e Ken H. Nealson. Eles estudaram a

regulação da bioluminescência na bactéria marinha Vibrio fischeri, que

apresenta uma relação simbiótica com animais marinhos tais como a lula.

Nessa relação, o hospedeiro usa a luz produzida pela bactéria, para atrair

presas e parceiros ou afugentar predadores, enquanto o V. fischeri obtém do

seu hospedeiro os nutrientes dos quais necessita (NEALSON et al., 1970).

Nos diferentes organismos que realizam o quorum sensing, o processo

segue, essencialmente, as mesmas etapas da bioluminescência do Vibrio

fischeri. Culturas densas de Vibrio fischeri liberam a molécula sinalizadora

envolvida que é uma N-(3-oxohexanoil) homoserina lactona (OHHL), os genes

regulatórios e estruturais necessários ao processo de luminescência (regulon

lux), estão localizados em um segmento de DNA de 9 kb (NEALSON et al.,

1970).

O regulon lux é composto por dois operóns que são transcritos em

direções opostas, sendo separados por uma região intergênica regulatória. Os

operóns são regulados por duas proteínas, a LuxI, responsável por produzir o

autoindutor OHHL e a LuxR que, ativada pelo autoindutor, após esse ter

entrado na célula, estimula a transcrição do operón da luciferase, surgindo a

luminescência (ASAD; OPAL, 2008; NEALSON et al., 1970).

A proteína LuxR é modular, sendo constituída por um domínio C-terminal

de ligação ao DNA e um domínio N-terminal de ligação OHHL. O gene luxI

produz OHHL e liga-se à proteína LuxR, ativando-a. Esta quando ativada liga-

se ao DNA, em um sítio específico, denominado lux box, que corresponde a

uma região de 20 nucleotídeos invertidos repetidos, situada entre os dois

operóns lux (ASAD; OPAL, 2008; NEALSON et al., 1970).

As células de V. fischeri produzem pequenas quantidades do autoindutor

em qualquer etapa de seu ciclo de vida, difundindo-se livremente através das

membranas da bactéria. Nestes estágios onde a população microbiana ainda é

pequena, está ocorrendo a ligação do autoindutor ao seu receptor, LuxR, no

entanto, tal ligação é ainda transiente. Com o crescimento da população

bacteriana, a quantidade de autoindutor também aumenta, até que atinge uma

concentração limiar, que dispara o processo, resultando na ativação da

transcrição dos operóns lux (ASAD; OPAL, 2008; NEALSON et al., 1970).

O complexo autoindutor-LuxR liga-se ao lux box e estimula a transcrição

dos operóns, promovendo uma maior síntese de autoindutor, de proteína LuxR

e de todo o aparato necessário à luminescência (Figura 2).

Nos sistemas tipo LuxI-LuxR, as moléculas sinalizadoras são as OHHL,

que têm sido identificadas em um grande número de Proteobacterias. Estas

moléculas possuem uma cadeia de ácido graxo ligada a uma homoserina

lactonada via ligação amida (FUQUA; GREENBERG, 2002). As moléculas de

OHHLs podem variar de espécie para espécie ou mesmo dentro da própria

espécie (Figura 3). O comprimento da cadeia acila pode estar entre quatro e

16 carbonos, usualmente em número par. O carbono três da cadeia acila pode

ser uma carbonila, carregar uma hidroxila ou estar totalmente reduzido

(FUQUA; PARSEK; GREENBERG, 2001; FUQUA; GREENBERG, 2002). São

estas características da cadeia que conferem especificidade ao sistema

quorum sensing.

Figura 2 - Sistema de sinalização quorum sensing em bactérias gram-negativas, encontrado no Vibrio fischeri, aumento da OHHL no meio com alta densidade populacional. (Adaptado de www.che.caltech.edu/groups/fha/AHL2.jpg&imgrefurl.)

luxR luxI luxC luxD luxA luxB luxE

P

P

LuxR LuxI

luxR luxI luxC luxD luxA luxB luxE

P(+)

P

LuxR LuxI

LuxR LuxR

Luciferase

Luz

N-acil homoserina lactonas (OHHL)

Baixa densidade populacional Alta densidade populacional

Figura 3- Cadeias de homoserinas lactonas aciladas. (Fonte: Fuqua; Parsek; Greenberg, 2001)

Alguns gêneros de bactérias usam a mesma molécula OHHL, indicando

certo nível de sinalização cruzada entre espécies (WILLIAMS, 2007). Outras

bactérias, incluindo E. coli não sintetizam OHHLs mas expressam um

homólogo biosensor LuxR. Especula-se que este sistema permite a E. coli

detectar os sinais de comunicação de outras bactérias gram-negativas e

explorar essas informações para o seu próprio benefício (AHMER, 2004). Além

disso, esses mesmos sinais de detecção são utilizados para inibir ou ativar

programas de transcrição entre concorrentes cepas bacterianas e outras

espécies existentes no mesmo microambiente (BASSLER, 2002). A

comunicação pode ainda atravessar as fronteiras do reino, como moléculas

efetoras QS que podem alterar os programas de transcrição eucariótica,

encontrados em células epiteliais e células efetoras imunes (WILLIAMS, 2007;

SHINER; RUMBAUGH; WILLIAMS, 2005).

2.2 Agentes antimicrobianos

Apesar da produção de uma grande variedade de antibióticos nos últimos

tempos por indústrias químicas e farmacêuticas, cada vez mais tem sido

observado o aumento de microrganismos resistentes aos medicamentos

disponíveis no mercado, o que incentiva a busca por novas fontes de

substâncias com atividade antimicrobiana. Além disso, a alta incidência de

infecções, principalmente em indivíduos imunocomprometidos, aumenta a

importância da descoberta de compostos terapêuticos alternativos (PRASHAR

et al, 2003).

O controle do biofilme bacteriano dentro das diversas especialidades

odontológicas é de grande importância, pois aponta tanto para a prevenção,

como para o tratamento da cárie dentária e de doenças periodontais (COWAN,

1999). Dentre as substâncias químicas pesquisadas atualmente com o objetivo

de inibir a formação do biofilme dental, crescimento bacteriano, e

conseqüentemente a adesão de microrganismos à superfície dentária,

destacam-se os produtos de origem vegetal por se mostrarem potencialmente

eficazes no que se refere à sua atividade antimicrobiana sobre várias espécies

de microrganismos (GEBARA; ZARDETTO; MAYER, 1996).

2.2.1 Fitoterápicos com ação antimicrobiana

As propriedades antimicrobianas de substâncias extraídas de plantas

vêm sendo comprovadas recentemente pela ciência e, de acordo com

pesquisas realizadas em vários países, entre eles o Brasil, detentor de uma

grande biodiversidade. A maioria dos princípios ativos das plantas medicinais é

conferida por produtos do metabolismo secundário, como: terpenóides, óleos

essenciais, alcalóides, lectina, polipeptídios, substâncias fenólicas, taninos e

cumarinas. Estes são compostos importantes para a defesa e metabolismo da

planta e podem ser úteis para o homem como coadjuvante na proteção e

cicatrização dos tecidos bucais (O’KENNEDY; THORNES, 1997; ZHANG;

LEWIS, 1997; PORTELA et al.2011) (Quadro 2).

Metabólito Descrição Ação farmacológica Plantas

Alcalóides Bases orgânicas nitrogenadas, em particular de origem vegetal. Constituem o grupo mais diverso de produtos naturais.

antiinflamatória, antioxidante imunomoduladora, , diurética, antiespasmódica,antimicrobiana,anticancerígena; pode estimular ou deprimir um organismo

Arruda, romã, unha-de gato.

Flavonóides São substâncias que contribuem para a coloração das flores, frutos e folhas

Atividade antiinflamatória Alecrim-pimenta, Goiabeira, Quebra-pedra, girassol, urtiga branca.

Taninos São substâncias vegetais sólidas, geralmente acumuladas nas cascas ou nas raízes das plantas.

Adstringente, cicatrizante, antiinflamatório, antimicrobiano e anti-séptico

Barbatimão, Cajueiro, Goiabeira, Romã.

Cumarinas Substância derivada da lactona do ácido cis-hidroxicinâmico. É um agente aromatizante.

Profilático das tromboses. São substâncias vasodilatadores e antisepticas.

Guaco, figueira.

Saponinas São substâncias vegetais cuja solução aquosa tem a propriedade de fazer espuma abundante, quando agitada.

Atividade imunomoduladora e citoprotetora

Juá, tubérculos (inhame).

Óleos vegetais

Constituídas de glicerídios mistos. Principais fontes de odor nas várias partes das plantas: pétalas, cascas, folhas, etc.

Distúrbios respiratórios; antimicrobiana, antiviral, antiinflamatória e antitussígena.

Alecrim-pimenta, Eucalipto, Gengibre.

Quadro 2- Lista de alguns metabólitos importantes encontrados em plantas medicinais. (Fonte: Portela et al., 2011)

Os compostos isolados de plantas são substâncias cuja estrutura

química, com raras exceções, apresenta grandes diferenças estruturais em

relação aos antibióticos derivados de microrganismos. Estes agentes

antimicrobianos podem agir como reguladores do metabolismo intermediário,

ativando ou bloqueando reações enzimáticas, afetando diretamente uma

síntese enzimática seja em nível nuclear ou ribossomal, ou mesmo alterando

estruturas de membranas (SINGH; SHUKLA, 1984).

Rodrigues (1996) cita diversas árvores nativas conhecidas pela

etnofarmacologia por terem propriedades antimicrobianas, ao mesmo tempo

em que podem preencher critérios de preservação ambiental e manejo auto-

sustentável tais como: Anacardium occidentale (cajueiro), Pterodon

emarginatus (sucupira), Copaifera langsdorffii (copaíba), Anadenanthera

colubrina (angico), Myroxylon peruiferum (bálsamo-do-peru), Stryphnodendron

adstringens (barbatimão), Bixa orellana (urucum), Eugenia uniflora (pitanga),

Psidium guajava (goiabeira), Mimosa tenuiflora (tepezcuite), Ilex paraguariensis

(erva-mate), Ocotea odorifera (sassafrás), Hymenaea courbaril (jatobá),

Schinus terebinthifolia (aroeira), Genipa americana (jenipapo), Tabebuia

avellanedae (ipê-roxo) e Casearia sylvestris (guaçatonga).

Alves et al. (2009) avaliou e comprovou in vitro a atividade

antibacteriana, antifúngica e antiaderente do extrato hidroalcoólico da Schinus

terebenthifolia Raddi (aroeira) sobre espécies bacterianas (S.mutans, S. mitis,

S. sobrinus, S. sanguniis, L. casei) e fúngicas (Candida albicans, Candida

tropicalis e Candida krusei) de interesse na Odontologia.

Soares et al. (2006) avaliaram in vitro a atividade antibacteriana das

tinturas de Caesalpinia ferrea Martius (jucá), Schinus terebenthifolia Raddi

(aroeira), Zingiber officinale Roscoe (gengibre), Ocinum basilicum L (alfavaca.),

Apis mellifera L. (própolis), Punica granatum L. (romã) e hortelã da Coleus

amboinicus Lour.(folha graúda), sobre as linhagens de S. aureus, S. mutans, S.

sobrinus, S. mitis, S. sanguinis e L. casei e concluíram que as tinturas do jucá

(Caesalpinia ferrea Martius), da aroeira (Schinus terebenthifolia Raddi) e da

própolis (Apis mellifera L.) apresentaram uma significativa atividade

antibacteriana sobre S. mutans, S. sobrinus, S. mitis, S. sanguis, L. casei e S.

aureus, este o mais sensível dos microrganismos às tinturas estudadas.

2.2.2 Fitoterápicos com ação anti - quorum sensing

A descoberta de que diversos microrganismos utilizam quorum sensing

para controlar sua virulência revelou um alvo atraente para o desenvolvimento

de novas terapias antimicrobianas, entre as quais o uso de plantas com ação

antimicrobiana que possam atuar na inibição da comunicação bacteriana

(ADONIZIO; KONG; MATHEE, 2008).

Teplitski et al. (2000) comprovaram que algumas plantas,

particularmente o amendoim (Pisum sativum L.), podem secretar substâncias

que mimetizam sinalizadores químicos para bactérias gram-negativas,

incluindo a Pseudomonas aeruginosa, despertando a busca por inibidores de

quorum sensing em extratos vegetais.

Inibidores de quorum sensing entre espécimes vegetais terrestres é um

tema ainda recente no meio científico. Adonizio et al. (2006), investigou a

atividade anti-quorum sensing em 50 espécies vegetais da região Sul da

Flórida por meio de dois sistemas: Chromobacterium violaceum e

Agrobacterium tumefaciens. Os autores confirmaram a existência de atividade

anti-quorum sensing em seis plantas de cinco famílias: Conocarpus erectus L.

(Combretaceae), Chamaecyce hypericifolia (L.) Millsp. (Euphorbiaceae),

Callistemon viminalis (Sol. ex Gaertn.) G. Don (Myrtaceae), Bucida burceras L.

(Combretaceae), Tetrazygia bicolor (Mill.) Cogn. (Melastomataceae) e Quercus

virginiana Mill. (Fagaceae).

Em um modelo QSI (inibidor de quorum sensing), pesquisadores

dinamarqueses observaram que o extrato de alho (Allium sativum L.) reduziu a

tolerância da bactéria Pseudomonas aeruginosa a tobramicina

(Aminoglicosideo). Esta bactéria apresenta dois sistemas principais de

sinalizadores químicos, que codificam uma enzima responsável pela síntese de

acil-homoserina-lactona (OHHL) e uma proteína R que responde ao auto-

indutor (RASMUSSEN; GIVSKOV, 2006).

Koh e Tham (2011) testaram a atividade anti-quorum sensing de 10

ervas da medicina tradicional Chinesa sob as cepas do Chromobacterium

violaceum (CV026) e Pseudomonas aeruginosa (PA01). Oito das ervas

selecionados produziram os inibidores de quorum sensing : Prunus armeniaca,

Prunella vulgaris, Nelumbo nucifera, notoginseng Panax ginseng (raiz e flor),

Punica granatum, Catechu areca e Imperata cylindrica. Compostos que

interferem com o quorum sensing estão presentes nas ervas e são uma

potencial fonte de compostos para combater a bactérias patogênicas e reduzir

o desenvolvimento da resistência aos antibióticos.

No estudo de TAGANNA et al., (2011) o extrato metanólico das folhas de

Terminalia catappa revelou ação anti-quorum sensing. A fração estudada é rica

em taninos, metabólito secundário com ação antimicrobiana.

3 OBJETIVOS

3.1 Objetivo geral:

Investigar as atividades antimicrobiana e anti-quorum sensing de plantas

medicinais para o desenvolvimento de fitomedicamentos.

3.2 Objetivos específicos:

- Avaliar a atividade antimicrobiana de extratos e partições de plantas

medicinais frente à bactérias de interesse odontológico;

- Avaliar a atividade anti-quorum sensing dos extratos etanólicos brutos; em

modelo experimental para bactérias gram-negativas.

4 CAPÍTULOS

Esta dissertação está baseada no formato modificado para a dissertação

de Mestrado e permite a inserção de artigos científicos de autoria ou co-autoria

do candidato. Desta forma, foi baseada em três manuscritos em formato de

artigo.

4.1 Capítulo 1

Avaliação antimicrobiana de plantas medicinais

frente à Streptococcus sp. orais

Evaluation of antimicrobial medicinal plants

against oral Streptococcus sp.

Gislaine Simões Portela1; Fábio Correia Sampaio1; Rita Baltazar de Lima2;

Fernando Antônio Cavalcante Viana3

1 Departamento de Clínica e Odontologia Social, Centro de Ciências da

Saúde, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, Brasil.

2 Departamento de Sistemática e Ecologia, Universidade Federal da Paraíba,

João Pessoa, Brasil.

3 Laboratório de Tecnologia Farmacêutica, Universidade Federal da Paraíba,

João Pessoa, Brasil.

Autor para correspondência:

Gislaine Simões Portela

Departamento de Clínica e odontologia Social

Centro de Ciências da Saúde

Universidade Federal da Paraíba

Campus I, Castelo Branco, João Pessoa, Brasil

58051-900

Email: [email protected]

Resumo

Este estudo avaliou in vitro a atividade antimicrobiana de extratos etanólicos

brutos do Anadenanthera macrocarpa Benth (angico), Abarema cochiliacarpos

(Gomes) B. & J.W. Grimes (barbatimão), Ziziphus juazeiro Mart (juazeiro), Sida


granatum L. (romã) e Zingiber officinale (gengibre). A atividade antimicrobiana

foi determinada pela técnica da microdiluição em caldo para a determinação

das concentrações inibitória mínima (CIM) e bactericida mínima (CBM) sobre

as linhagens de S. mutans, S. salivarius e S. oralis. A análise fitoquímica

determinou a presença de metabólitos secundários responsáveis pela atividade

antimicrobiana. Todos os extratos inibiram os microrganismos ensaiados, a

CIM variou de 75,15 a 200,0 µg/ml. As folhas da Sida cordifolia L. (malva

branca) apresentaram a menor CIM frente ao S.mutans (UA159). A CBM dos

extratos variou de 83,5 a 350,0 μg/mL. A menor concentração foi representada

pela CBM do extrato da casca de Ziziphus juazeiro Mart (juazeiro) sobre

S.mutans (UA159). Os extratos testados cujas CIM’s menores que 100 μg/mL

sugerem estudos para desenvolvimento de agentes terapêuticos promissores

para o controle do biofilme dental cariogênico.

Palavras-chave: Plantas medicinais; concentração inibitória mínima;

patógenos orais.

Abstract

This study evaluated the in vitro antimicrobial activity of crude ethanolic extracts

of Anadenanthera macrocarpa Benth (angico), Abarema cochiliacarpos



granatum L. (romã) and Zingiber officinale (gengibre). The antimicrobial activity

was determined by the techniques of minimum inhibitory concentration (MIC)

and minimum bactericidal concentration (MBC) on strains of S. mutans, S.

salivarius and S. oralis. The phytochemical screening to determine the

presence of secondary metabolites responsible for antimicrobial activity. All

extracts inhibited the microorganisms tested, the MIC ranged from 75.15 to

200.0 µg /ml. The leaves of Sida cordifolia L. (malva branca) showed the lowest

MIC against the S. mutans. The MBC of the extracts ranged from 83.5 to 350.0

µg/ mL. The lowest concentration was represented by MBC of the extract from

the bark of Ziziphus juazeiro Mart (juazeiro) compared to S. mutans. The

extracts tested with MIC less than 100 µg/mL suggest the development of

promising therapeutic agents for the control of cariogenic biofilm

Keywords: Medicinal plants; minimum inhibitory concentration; oral pathogens.

Introdução

Os microrganismos específicos da doença cárie fazem com que o

biofilme dental, seja constituído por uma microbiota anaeróbica, gram-positiva e

sacarolítica. Esta microbiota é representada basicamente pelos Streptococcus,

que possuem papel importante na ecologia bucal uma vez que representam

cerca de 20% da microbiota total e podem corresponder até 80% dos

colonizadores das superfícies dos dentes durante as primeiras 24h de

formação do biofilme dental (JENKINSON; LAMONT, 1997).

O Streptococcus mutans é considerado o principal agente etiológico no

desenvolvimento da cárie de superfície lisa, não são bons colonizadores

primários dos dentes, uma vez que há outros estreptococcus bucais como S.

sanguis, S. mitis, S.gordonii, S. salivarius e S. oralis que apresentam adesinas

de maior afinidade à película adquirida (NCCLS, 2003).

A desorganização do biofilme dentário em formação é um fator

importante na prevenção da cárie e doença periodontal. Frente às limitações

dos métodos mecânicos de higiene, inúmeras substâncias químicas vêm sendo

pesquisadas, com o objetivo de inibir a formação do biofilme dental,

crescimento bacteriano, e consequentemente a adesão de microrganismos à

superfície dentária (KORNMAN, 1986; RODRIGUES JÚNIOR, 1998). Dentre

estas substâncias, atualmente se destacam os produtos de origem vegetal, por

se mostrarem potencialmente eficazes no que se refere à sua atividade

antimicrobiana sobre várias espécies de microrganismos (BHAKUNI et al.,

1974; GEBARA; ZARDETTO; MAYER, 1996).

Estudos sobre a ação anticariogênica de polifenóis extraídos de plantas

têm sido relatados nas últimas décadas (KAKIUCHI et al., 1996). Os extratos

da romã, cajueiro, sanguinarina, tomilho e malva têm demonstrado ação

antibacteriana e antiaderente in vitro, sobre os microrganismos gram-positivos

e gram-negativos (NAQVI; KHAN; VOHORA, 1991; PESSINI et al., 2003;

MICHELIN et al., 2005); Streptococcus mutans, S. mitis, S. sanguis têm

apresentado grande sensibilidade ao extrato da romã (Punica granatum) no

que se refere ao crescimento e à capacidade de aderência sobre a superfície

dental (PEREIRA, 2006).

Objetivando-se avaliar a atividade antimicrobiana de extratos etanólicos

brutos do Anadenanthera macrocarpa Benth (angico), Abarema cochiliacarpos



granatum L. (romã) e Zingiber officinale (gengibre), sobre espécies

pertencentes a diferentes grupos de Streptococcus sp., inerentes à microbiota

da cavidade oral de humanos, selecionou-se S. mutans, S. salivarius e S.

oralis para serem avaliados. E através do screening fitoquimico determinar a

presença de metabólitos secundários.

Material e métodos

Obtenção do Vegetal

Foram coletados 3-6 kg de material vegetal, este foi desidratado em

estufa com ar circulante (38 oC, 48-72 horas), triturado em moinho (tipo Harley).

A droga vegetal foi submetida à maceração utilizando-se etanol a 80% por até

6 dias. O solvente foi evaporado em rota evaporador até fornecer o extrato

etanólico bruto (EEB). As atividades de análise morfológica dos espécimes e

identificação foram realizadas no Laboratório de Botânica do Departamento de

Sistemática e Ecologia da Universidade Federal da Paraíba, Campus I, João

Pessoa-PB.

Avaliação da atividade antimicrobiana

Foram utilizadas as seguintes cepas padrão: Streptococcus mutans

(UA159), Streptococcus oralis (ATCC10557), Streptococcus salivarius

(ATCC7073). As linhagens bacterianas foram adquiridas junto ao Instituto

Oswaldo Cruz (FIOCRUZ-RJ).

A Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida

Mínima (CBM) dos EEB’s foram testadas em modelo experimental de diluição

em fase líquida (microdiluição em caldo) conforme descrito pela NCCLS (2003)

e modificada por Andrews (2001). Os EEB’s foram avaliados nas

concentrações de 400 a 20µg/mL. Como controle positivo utilizou-se a solução

de digluconato de clorexidina (Sigma, Steinheim, Alemanha) nas

concentrações de 0,0115 a 5,9 µg/mL. O controle de esterilidade do meio,

extrato e da cultura foram realizados. Padronizou-se o inoculo com o valor

correspondente a 0,5 da escala de McFarland (1,5 x 108 células/mL =108

UFC/mL).

Após o preenchimento de todos os poços, as microplacas foram seladas

com parafilme e incubadas a 37 °C por 24 horas. Após o período de incubação,

adicionou-se 30 µL de resazurina (Sigma, Steinheim, Alemanha) preparado em

solução aquosa (0,01%), em cada orifício da microplaca.

As placas foram re-incubadas por mais 1 h para se fazer a leitura visual.

A indicação de cor rosa foi indicativa de transformação de resazurina em

resorfurina, sendo interpretada como presença de células viáveis. As fileiras

equivalentes da CIM e sem corantes foram utilizadas para incubação em BHI

ágar, para confirmar a presença de bactérias viáveis e determinar a

concentração bactericida mínima (CBM).

Análise fitoquímica preliminar

Os extratos foram submetidos à triagem fitoquímica preliminar para

detecção das principais classes de metabólitos secundários através de reações

químicas que resultam no desenvolvimento de coloração e/ou precipitado,

característico para cada classe de substâncias (MATOS, 1997; SIMÕES et al.,

2004).

Resultados

No quadro 1 observa-se que todos os extratos testados inibiram os

microrganismos ensaiados, a CIM variou de 75,15 a 200,0 µg/ml,

ultrapassando os valores da CIM padrão de 100 µg/ml (RIOS; RECEIO, 2005).

A menor CIM foi representada pelo o extrato das folhas da Sida cordifolia L.

(malva branca) frente ao S. mutans (UA159). Os extratos de Anadenanthera

macrocarpa Benth (angico), Abarema cochiliacarpos (Gomes) B. & J.W. Grimes

(barbatimão), Ziziphus juazeiro Mart (juazeiro), Sida cordifolia L. (malva

branca), Chenopodium ambrosioides L. (mastruz) e Punica granatum L. (romã)

apresentaram valores de CIM menor que 100 µg/ml frente às cepas de S.

mutans (UA159). A Concentração Bactericida Mínima (CBM) dos extratos

variou de 83,5 a 350 μg/mL. A menor CBM foi representada pela casca de

Ziziphus juazeiro Mart (juazeiro) frente ao S.mutans (UA159).

A triagem fitoquímica preliminar dos EEB’s estão presentes no quadro 2,

revelando a presença de alcalóides, esteróides livres, taninos, flavonóides e

saponinas. Os extratos de Anadenanthera macrocarpa Benth (angico),

PLANTAS S. mutans S. oralis S. salivarius

CIM CBM CIM CBM CIM CBM

Angico 91,85 91,85 200,0 350,0 200,0 350,0

Barbatimão 91,85 150,0 200,0 200,0 200,0 350,0

Juazeiro 83,5 83,5 200,0 300,0 200,0 350,0

Malva Branca 75,15 100,0 150,0 200,0 200,0 350,0

Mastruz 83,5 100,0 150,0 300,0 200,0 350,0

Romã 83,5 100,0 150,0 250,0 200,0 350,0

Gengibre 150,0 150,0 200,0 250,0 150,0 300,0

Quadro 1- Valores de CIM e CBM (μg/mL) dos EEB’s ensaiados sobre streptococos orais.

Abarema cochiliacarpos (Gomes) B. & J.W. Grimes (barbatimão), Ziziphus

juazeiro Mart (juazeiro) e Punica granatum L. (romã) apresentaram acentuada

presença de taninos.

Discussão

A atividade antimicrobiana dos produtos naturais avaliados neste estudo

tem sido descrita na literatura científica (ALVES, 2009; GONÇALVES et al.,

2005; LEAL et al., 2003; PEREIRA et al., 2006; SANTOS et al., 2009; SOUSA

et al., 1991). Todos os extratos apresentaram atividade antimicrobiana, sendo

as cepas de S. mutans (UA159) a mais sensível.

Os resultados do quadro 1 foram obtidos a partir da menor concentração

do extrato capaz de inibir o crescimento do microrganismo-teste; esse valor é

conhecido como Concentração Inibitória Mínima (CIM). A CIM pode ser

determinada pela a microdiluição em caldo, observando a ação da rezasurina.

Tal substância é um indicador de óxido-redução, utilizado para revelar

PLANTAS Alcalóides Esteróides Taninos Flavonóides Saponinas

Angico - ++ +++ ++ ++

Barbatimão - ++ +++ ++ _

Juazeiro - ++ +++ + +++

Malva Branca - ++ ++ _ _

Mastruz - ++ - +++ ++

Romã + + +++ ++ +

Gengibre - ++ - + +

Quadro 2- Determinação da presença de metabólitos secundários nos EEB’s.

- Ausente, + Pouco, ++ Moderado, +++ Acentuado.

alteração de pH no meio, determinado pelo crescimento bacteriano

(MONTEJANO et al., 2005). Devido à presença de compostos pigmentados

(taninos hidrolisáveis, antocianinas), a mensuração visual da CIMs obtidas

neste estudo, podem ficar comprometidas. Desta forma, para uma adequada

avaliação de viabilidade celular, a determinação de CIM seria complementada

por leitura de fluorescência.

A técnica de microdiluição em caldo apresenta vantagens sobre o método

de difusão em ágar, pois vários fatores podem se tornar fontes de erros, tais

como: composição, preparação e espessura do meio de cultura; densidade do

inóculo incorreta; uso de swab com excesso de caldo para inoculação das

placas; temperatura e tempo de incubação inadequada; interações entre o

antimicrobiano e o meio de cultura; utilização errada da atmosfera de CO2

quando necessária, leitura prematura, erro na medida das zonas de inibição ou

uso de culturas mistas ou contaminadas (SILVA et al., 1999)

A falta de padronização de métodos in vitro para testes antimicrobianos

de extratos de plantas tem levado a variações nos resultados entre grupos de

pesquisa. Isso compromete comparações diretas de resultados surgindo falsas

conclusões sobre a eficácia de extratos como agentes antimicrobianos

(SARKER et al., 2007).

Rios e Receio (2005) citam que CIM menor ou igual a 100 µg/ml

apresentam uma atividade antimicrobiana promissora para o uso como

fitomedicamentos. Dentre os resultados obtidos, os extratos com CIM inferior a

100 µg/ml temos: Anadenanthera macrocarpa Benth (angico), Abarema

cochiliacarpos (Gomes) B. & J.W. Grimes (barbatimão), Ziziphus juazeiro Mart

(juazeiro), Chenopodium ambrosioides L. (mastruz) e Punica granatum L.

(romã) e Sida cordifolia L. (malva branca); frente ao S. mutans (UA159).

A Sida cordifolia L. (malva branca) avaliada neste estudo apresentou a

melhor atividade antimicrobiana com uma CIM de 75,15 µg/ml sobre o S.

mutans. Estes dados são importeantes, pois se sabe que a espécie

Streptococcus mutans é encontrada em mais de 80% dos indivíduos, e exibe

uma maior cariogenicidade em superfícies lisas devido à maior produção de

glucanos insolúveis (GEBARA, ZARDETO, MAYER, 1996).

Na odontologia, plantas como a malva (Malva sylvestris), vêm sendo

testadas no controle de crescimento e aderência de bactérias presentes no

biofilme dental. A romã (Punica granatum) tem seu uso muito difundido na

odontologia, e estudos demonstraram sua potencialidade devido à ação

bactericida e bacteriostática sobre bactérias gram-positivas e gram-negativas

constituintes do biofilme dental (PEREIRA et al., 2006). O barbatimão

(Stryphnodendron adstringens Mart.), o angico (Anadenanthera macrocarpa

Benth) também apresentam estas propriedades podendo ser adjuvantes no

controle mecânico do biofilme dental (SOARES et al. , 2008).

Os resultados de ensaios farmacológicos comprovam que o juazeiro

(Ziziphus juazeiro Mart) apresenta efeito mais eficaz na diminuição da placa

dental do que os dentifrícios convencionais, desestabilizando a placa dental e

exercendo uma ação antimicrobiana sobre S. mutans, resultante da escovação

dos dentes com uma suspensão aquosa a 1 % da entrecasca pulverizada.

Essa experiência foi feita visando à validação do uso de preparações de

juazeiro em odontologia (SOUSA et al., 1991).

A ação antimicrobiana do gengibre não foi tão eficiente, com uma CIM

acima de 100µg/ml frente às cepas de S. mutans. Esse resultado está em

concordância com os resultados de Soares et al. (2006), Leal et al. (2003).

Alzoreky e Nakahara (2003) cujos estudos demonstraram que óleos e extratos

do Zingiber officinalle apresentaram ação inibitória reduzida em bactérias orais.

Os resultados da ação antimicrobiana variaram de acordo com as cepas

testadas, os resultados de CIM variaram de 150,0 a 200,0 µg/ml para os S.

salivarius. Esse dado pode ser um fator positivo, pois esses microrganismos

são considerados probióticos na cavidade oral, produzem bacteriocinas e

inibem o crescimento de S. mutans (BURTON et al., 2006; OGAWA et al.,

2011). Assim, extratos que apresentam melhor ação para o S.mutans e não

para o S.salivarius, são propícios para o desenvolvimento de fitomedicamentos

para uso odontológico.

Alguns dos extratos estudados estão incorporados a produtos utilizados

na higiene oral com a vantagem de não apresentarem efeitos colaterais, sendo

relatados apenas uma pequena ardência, com possibilidade de erosão na

mucosa, quando comparados a produtos sintéticos (MORAN et al., 1992).

Bochechos consolidados no mercado como o Malvatricin®/Lab. Daudt Oliveira

LTDA possuem na sua formulação a malva, o Fitogargarejo®/Farmácia

Homeopática ação relacionada à presença do gengibre e da romã. Drumond et

al. (2004) ao compararem a CIM desses bochechos sobre bactérias

cariogênicas obtiveram melhor resultado para o Malvatricin® frente a todas as

linhagens.

A determinação da presença de metabólitos secundários através do

screening fitoquímico revela quais as propriedades exibidas pelo extrato. A

maioria dos extratos analisados apresentou taninos em maior quantidade,

sendo provável que o tanino seja o principal constituinte antimicrobiano no

extrato da planta, mas estudos futuros devem esclarecer se há um efeito

sinérgico de outras moléculas responsáveis pela atividade antimicrobiana.

A presença de saponinas nos extratos do angico, juazeiro e romã

revelam atividade surfactante, promovendo uma menor coagregação das

bactérias e facilitando a penetração de antimicrobianos. Os extratos de angico,

barbatimão, juazeiro e romã apresentam flavonóides, estes podem apresentar

certa atividade antiflamatória.

A análise fitoquímica dos extratos podem apresentar diferenças entre

plantas da mesma espécie botânica, de acordo com as diferentes regiões. As

discrepâncias nos resultados das comparações qualitativas e até quantitativas

dos metabólitos deve-se a aspectos relacionados à solo, clima, coleta de

material, temperatura, reagentes químicos, dentre outros (MATOS, 1997).

Conforme Cechinel e Yunes (1998), o estudo químico de plantas

necessita de alguns cuidados que, devem ser considerados, em alguns casos,

como a falta de experiência, que leva a erros que tanto podem comprometer os

resultados experimentais, como requerer maior tempo e recursos e não atingir

os objetivos almejados.

Conclusões

Todos os extratos apresentaram atividade antimicrobiana frente às

espécies de Streptococus sp. presentes na cavidade oral. Os extratos da Sida

cordifolia L. (malva branca), Anadenanthera macrocarpa Benth (angico),

Abarema cochiliacarpos (Gomes) B. & J.W. Grimes (barbatimão), Ziziphus

juazeiro Mart (juazeiro), Sida cordifolia L. (malva branca), Chenopodium

ambrosioides L. (mastruz) e Punica granatum L. (romã) apresentaram valores

de CIM menores que 100 µg/ml frente às cepas de S. mutans (UA159). As

análises fitoquímicas fornecem informações relevantes à cerca da presença de

metabólitos secundários nas plantas, para que assim possa chegar ao

isolamento de princípios ativos importantes na produção de novos

fitomedicamentos. Os resultados obtidos mostram ser de grande valia a

realização de pesquisas in vivo, para que desta forma, os extratos possam ser

utilizados, clinicamente, no controle e na prevenção de formação do biofilme

dental.

Referências

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4.2 Capítulo 2

Potencial antimicrobiano de extratos e partições de plantas

medicinais sobre patógenos orais.

Antimicrobial potential of extracts and partitions

of medicinal plants on oral pathogens.

Gislaine Simões Portela1; Fábio Correia Sampaio1; Daniela Correia Cavalcante

Souza1; Allan dos Reis Albuquerque 1





Departamento de Clínica e Odontologia Social




58051-900


Resumo

A cavidade oral abriga uma complexa comunidade de microrganismos que

podem estar aderidos aos dentes, à mucosa epitelial ou formando biofilme. As

plantas medicinais têm merecido a atenção de pesquisadores de vários países,

já que podem inibir o crescimento bacteriano por diferentes mecanismos

quando comparados aos antimicrobianos sintéticos, justificando a pesquisa em

questão. Avaliamos extratos etanólicos brutos (EEB’s) e partições da plantas

nativas do Brasil. A atividade antimicrobiana foi determinada pelas técnicas da

concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM)

sobre as linhagens de: Streptococcus mutans (UA159), Streptococcus

salivarius (ATCC7073), Streptococcus oralis (ATCC10557). E através do

screening fitoquimico determinou a presença de metabólitos secundários. Os

resultados obtidos foram promissores para todas as espécies vegetais e as

fases hexânica e diclorometano revelaram alto potencial para

fitomedicamentos. Esses dados indicam a necessidade da ampliação do

conhecimento sobre as espécies de plantas com potencial antimicrobiano, além

de se testar extratos mais purificados e com propriedades farmacológicas

ativas contra organismos microbianos.

Palavras-chave: Atividade antimicrobiana, plantas medicinais, bactérias

planctônicas.

Abstract

The oral cavity have a complex community of microorganisms that may be

attached the teeth, epithelial mucosa or forming biofilm. Medicinal plants have

attracted the attention of researchers from several countries, since they can

inhibit bacterial growth by different mechanisms compared to antimicrobials

synthetics, explaining the research in question. We evaluated crude ethanolic

extracts and partitions of the native plants of Brazil. The antimicrobial activity

was determined by the techniques of minimum inhibitory concentration (MIC)

and minimum bactericidal concentration (MBC) on strains of Streptococcus

mutans (UA159), Streptococcus salivarius (ATCC7073), Streptococcus oralis

(ATCC10557). And through the phytochemical screening to determine the

presence of secondary metabolites. The results were promising for all plant

species and stages hexane and dichlorometthane showed high potential for

phytomedicines. These data indicate the need to expand knowledge about the

species of plants with antimicrobial potential, and to test more purified extracts

and pharmacological properties active against microbial organisms.

Keywords: Antimicrobial activity, medicinal plants, planktonic bacteria.

Introdução

A cavidade bucal apresenta diversos nichos ecológicos que são

colonizados por microrganismos, permitindo a sobrevivência de uma

diversidade de bactérias, vírus e fungos (SOCRANSKY et al., 1998).

Atualmente, cerca de 1000 diferentes espécies de microrganismos já foram

detectadas na cavidade bucal de seres humanos, e grande parte dessas

espécies encontram-se organizadas na forma de biofilme (WILSON, 2004).

O biofilme é uma comunidade microbiana tridimensional que se adere

seletivamente às superfícies dentárias, contidos em matriz orgânica formada

por substâncias da saliva e da dieta do hospedeiro e por polímeros bacterianos

(MARSH, 1995).

A colonização da cavidade bucal é influenciada diretamente pela película

adquirida; uma camada acelular constituída de proteínas, glicoproteínas e

lipídios (MARCOTTE; LAVOIE, 1998). A película adquirida é formada pela

saliva imediatamente após a profilaxia dos dentes, e pode favorecer a adsorção

de microrganismos à superfície dentária (MARSH, 1995). Se as condições

forem favoráveis, os colonizadores primários, primeiros microrganismos a

aderirem à película adquirida, podem multiplicar-se no substrato e formar

micro-colônias (RICKARD et al., 2003).

Os Streptococcus do grupo mutans são os principais agentes etiológicos

do desenvolvimento da cárie de superfície lisa, considerado um fator crítico no

desenvolvimento do biofilme cariogênico, devido à produção de ácidos que

proporcionam diminuição do pH do biofilme, aumentando a possibilidade de

desmineralização dos tecidos dentários (O’TOOLE; KAPLAN; KOLTER, 2000).

O biofilme dental em cada etapa do seu desenvolvimento adquiri novas

espécies, dentre estas Streptococcus salivarius, Streptococcus oralis,

Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis,

Streptococcus sobrinus e Lactobacillus casei; que com sua patogenicidade irão

provocar danos ao esmalte e tecido gengival (PERES, 2003).

A remoção mecânica do biofilme é um fator importante na prevenção da

cárie e doença periodontal. No entanto, existem dificuldades na remoção feita

pelo próprio paciente (ADDY; SLAYNE; WADE, 1992; STEFANI; LIMA, 1996).

Considerando a importância dessa desorganização e as dificuldades de manter

os indivíduos motivados para realizar uma adequada limpeza da cavidade

bucal, é válido e necessário associar aos procedimentos mecânicos também

métodos químicos para o controle do biofilme dental (CASTRO, 2001).

Inúmeras substâncias químicas vêm sendo pesquisadas, com o objetivo

de inibir a formação do biofilme dental, crescimento bacteriano, e

consequentemente a adesão de microrganismos à superfície dentária

(RODRIGUES JÚNIOR, 1998). Dentre estas substâncias, atualmente se

destacam as pesquisas com produtos naturais em odontologia em busca por

novos produtos com maior atividade farmacológica, com menor toxicidade e

mais biocompativeis, além de apresentarem custos mais acessíveis à

população (CASTILHO; MURATA; PARDI, 2007).

Com base no uso e conhecimento popular, o importante crescimento

mundial da fitoterapia dentro de programas preventivos e curativos tem

estimulado a avaliação da atividade de diferentes extratos de plantas para o

controle do biofilme dentário, bem como de outras afecções bucais (BUFFON

et al., 2001).

O reconhecimento da fitoterapia como prática complementar à saúde

bucal ocorreu oficialmente a partir da publicação da resolução do CFO-

82/2008. Desta forma, a atuação do CD como fitoterapeuta ficou possibilitada

ser realizada tanto no âmbito particular como no sistema público de saúde.

Apesar dos avanços na legalização da prática profissional em fitoterapia, a

grande maioria dos profissionais desconhece os recursos terapêuticos

advindos de plantas medicinais e de fitoterápicos (SOYAMA, 2007).

Desta forma, propusemo-nos a avaliar o efeito antibacteriano in vitro de

extratos etanólicos brutos (EEB’s) e partições de plantas nativas do Brasil,

sobre as linhagens de Streptococcus mutans (UA159), Streptococcus salivarius

(ATCC7073), Streptococcus oralis (ATCC10557) e através do screening

fitoquimico determinar a presença de metabólitos secundários.

Material e métodos


As plantas nativas do Brasil selecionadas foram Schinus terebinthifolius

Raddi (aroeira da praia); Lippia sidoides Scham (alecrim pimenta); Abarema

cochiliacarpos (Gomes) B. & J.W. Grimes (barbatimão); Anacardium

occidentale Linn (cajueiro); Psidium guajava Linn (goiabeira); Tabebuia


Bowdichia virgiloides Kunth (sucupira).

Foram coletados 2-6 kg de material vegetal, preferencialmente folhas,

flores, frutos e cascas,esta última quando a espécie for lenhosa. Amostras de

material fértil foram acondicionadas em sacos plásticos, para posterior

prensagem, desidratação e herbarização. Para a espécie Hymenaea courbaril

L. (jatobá) utilizou-se a casca e o fruto. As atividades de laboratório, análise

morfológica dos espécimes e identificação, foram realizadas no Laboratório de

Botânica do Departamento de Sistemática e Ecologia da Universidade Federal

da Paraíba, Campus I, João Pessoa-PB. As exsicatas foram incorporadas ao

acervo do Herbário JPB.

O material vegetal coletado foi desidratado em estufa com ar circulante

(38 oC, 48-72 horas), triturado em moinho (tipo Harley). A droga vegetal foi

submetida à maceração utilizando-se etanol a 80% por até 6 dias. O solvente

foi evaporado em rota evaporador até fornecer o extrato etanólico bruto (EEB).

Visando uma semi-purificação das substâncias através de suas polaridades os

EEB’s foram particionados em um funil de separação após ser diluído com

água: metanol (3:7, v/v), a fase aquosa foi submetida a partições em ordem

crescente de polaridade com os seguintes solventes: hexano, diclorometano e

acetato de etila, sendo a solução residual a solução hidroalcoólica.


Foram utilizadas as seguintes cepas padrão: Streptococcus mutans

(UA159), Streptococcus salivarius (ATCC7073), Streptococcus oralis

(ATCC10557). As linhagens bacterianas foram fornecidas peloInstituto

Oswaldo Cruz (FIOCRUZ-RJ).


Mínima (CBM) dos EEB’s e partições foram testadas em modelo experimental

de diluição em fase líquida conforme descrito pela NCCLS (2003) e modificada

por Andrews (2001). Os EEB’s e partições foram avaliados nas concentrações

de 400 a 20 µg/mL. Como controle positivo utilizou-se a solução de digluconato

de clorexidina (Sigma, Steinheim, Alemanha) nas concentrações de 0,0115 a

5,9 mg/mL. Realizou-se o controle de esterilidade do meio, extrato e da cultura.

Padronizou-se o inoculo com o valor correspondente a 0,5 da escala de

McFarland (1,5 x 108 células/mL =108 UFC/mL).

Após o preenchimento de todos os poços, as microplacas foram seladas

com parafilme e incubadas a 37 °C por 24 horas. Após o período de incubação,

adicionou-se 30 µL de resazurina (Sigma, Steinheim, Alemanha) preparado em

solução aquosa (0,01%) em cada orifício.


A indicação de cor rosa será indicativa de transformação de resazurina em



ágar para confirmar a presença de bactérias viáveis e determinar a


Análise fitoquímica preliminar

Os extratos foram submetidos à triagem fitoquímica preliminar para

detecção das principais classes de metabólitos secundários através de reações

químicas que resultam no desenvolvimento de coloração e/ou precipitado,

característico para cada classe de substâncias (MATOS, 1997; SIMÕES et al.,

2004).

Resultados

A CIM dos extratos e partições variou de acordo com a cepa testada. Os

resultados do quadro 1 foram obtidos com a avaliação da sensibilidade do S.

mutans. A CIM variou de 35,0 a 150,0µg/ml e CBM 45,0 a 150,0 µg/ml. Os

valores obtidos com CIM menor ou igual a 100 µg/ml correspondem a CIM

padrão, concentração indicativa para a produção de fitomedicamentos (RIOS;

RECEIO, 2005). A menor CIM foi observada para a fase hexânica do fruto do

jatobá com 35,0 µg/ml.

PLANTAS EEB F. hexânica F.diclorometano F. acetato de etila

Solução Hidroalcoolica

CIM CBM CIM CBM CIM CBM CIM CBM CIM CBM

Aroeira da praia 83,50 83,5 91,85 150,0 100,0 150,0 150,0 200,0 100,0 150,0

Alecrim pimenta 75,15 75,15 91,85 150,0 91,85 150,0 150,0 150,0 100,0 200,0

Barbatimão 91,85 150,0 91,85 91,85 150,0 150,0 150,0 150,0 150,0 150,0

Cajueiro 83,50 91,85 50,0 66,8 75,15 83,5 58,45 66,8 58,45 66,8

Goiabeira 75,15 150,0 83,50 100,0 91,85 150,0 150,0 150,0 100,0 100,0

Ipê-roxo 83,5 83,5 150,0 150,0 150,0 150,0 150,0 200,0 150,0 150,0

Jatobá (Casca) 91,85 150,0 75,15 75,15 91,85 100,0 150,0 200,0 100,0 200,0

Jatobá (Fruto) 83,5 83,5 35,00 45,0 58,45 66,8 91,85 100,0 91,85 91,85

Sucupira 91,85 100,0 83,5 100,0 100,0 150,0 91,85 91,85 91,85 100,0

Quadro 1 - Valores de CIM e CBM (μg/mL) dos extratos e partições sobre o S. mutans.

Os resultados do quadro 2 foram obtidos com a avaliação da

sensibilidade do S. salivarius. A CIM variou de 150,0 a 250,0µg/ml e CBM

200,0 a 400,0 µg/ml. A CIM para os extratos e partições foram acima de 100

µg/ml.

Os resultados do quadro 3 foram obtidos com a avaliação da

sensibilidade do S. oralis. A CIM variou de 100,0 a 250,0 µg/ml e CBM 200,0 a

400,0 µg/ml. A CIM de 100 µg/ml foi obtida para as fases hexânica do

barbatimão e diclorometano da aroeira da praia.

A triagem fitoquímica preliminar dos EEB’s estão presentes no quadro 4,

revelando a presença de alcalóides, esteróides livres, taninos, flavonóides e

saponinas. Os extratos que apresentaram presença de taninos e/ou alcalóides

possuem potencial antimicrobiano.


Solução hidroalcoolica


Aroeira da praia 200,0 350,0 200,0 350,0 200,0 350,0 200,0 350,0 200,0 350,0

Alecrim pimenta 200,0 350,0 200,0 200,0 250,0 250,0 200,0 400,0 200,0 400,0

Barbatimão 200,0 350,0 200,0 350,0 200,0 350,0 150,0 350,0 200,0 350,0

Cajueiro 150,0 250,0 150,0 300,0 200,0 250,0 200,0 350,0 200,0 300,0

Goiabeira 200,0 200,0 200,0 350,0 200,0 350,0 200,0 350,0 200,0 350,0

Ipê-roxo 150,0 200,0 200,0 350,0 200,0 350,0 200,0 350,0 200,0 350,0

Jatobá (Casca) 200,0 350,0 200,0 350,0 250,0 400,0 200,0 400,0 250,0 400,0

Jatobá (Fruto) 200,0 350,0 150,0 300,0 200,0 350,0 200,0 350,0 200,0 350,0

Sucupira 200,0 350,0 250,0 400,0 200,0 400,0 200,0 400,0 200,0 400,0

Quadro 2- Valores de CIM e CBM (μg/mL) dos extratos e partições frente ao S. salivarius.


Solução hidroalcoolica


Aroeira da praia 200,0 350,0 200,0 350,0 100,0 250,0 200,0 350,0 200,0 350,0

Alecrim pimenta 200,0 250,0 200,0 200,0 200,0 200,0 200,0 300,0 200,0 400,0

Barbatimão 200,0 350,0 100,0 150,0 250,0 250,0 150,0 250,0 200,0 350,0

Cajueiro 150,0 350,0 200,0 300,0 200,0 300,0 250,0 250,0 200,0 300,0

Goiabeira 150,0 250,0 200,0 350,0 250,0 350,0 250,0 300,0 200,0 350,0

Ipê-roxo 150,0 250,0 250,0 300,0 150,0 300,0 250,0 350,0 200,0 350,0

Jatobá (Casca) 200,0 350,0 200,0 300,0 250,0 300,0 200,0 250,0 250,0 350,0

Jatobá (Fruto) 150,0 300,0 150,0 250,0 200,0 300,0 250,0 250,0 200,0 350,0

Sucupira 150,0 250,0 250,0 300,0 250,0 300,0 200,0 300,0 200,0 250,0

PLANTAS Alcalóides Esteróides Taninos Flavonóides Saponinas

Aroeira da praia - ++ ++ ++ ++

Alecrim pimenta - + ++ +++ +

Barbatimão - ++ +++ ++ -

Cajueiro - +++ +++ +++ ++

Goiabeira - ++ +++ ++ -

Ipê-roxo - ++ - ++ +

Jatobá - + - +++ ++

Sucupira ++ +++ +++ ++ ++

Quadro 3 - Valores de CIM e CBM (μg/mL) dos extratos e partições frente ao S. oralis.

- Ausente, + Pouco, ++ Moderado, +++ Acentuado.

Quadro 4 - Presença de metabólitos secundários nos EEB’s.

Discussão

Os fitofármacos têm assumido um papel importante como meio terapêutico

complementar na Odontologia, mediante das suas propriedades antimicrobianas

frente às afecções bucais, principalmente as decorrentes do biofilme dental

(BHAKUNI, 1974; GEBARA; ZARDETTO; MAYER, 1996; PEREIRA, 1998).

O método utilizado neste estudo para determinar a atividade

antimicrobiana foi a microdiluição em caldo, onde os agentes antimicrobianos

são testados em diluições consecutivas, e a menor concentração capaz de

inibir o crescimento de um organismo é considerada como a Concentração

Inibitória Mínima (CIM) (NCCLS, 2003).

Segundo Andrews (2001), as CIM's são consideradas excelentes

ferramentas para determinar a susceptibilidade dos organismos aos

antimicrobianos e, portanto, usadas para julgar o desempenho de todos os

outros métodos de susceptibilidade.

Rios; Receio e Villar (1988) na tentativa de solucionar a falta de uniformidade

nos critérios de seleção para o estudo da atividade antimicrobiana de plantas

medicinais propuseram métodos padrão para o estudo de extratos de plantas e de

óleos essenciais, bem como de seus compostos isolados, sendo estes os métodos

de difusão, diluição e bioautografia. Sugerem também que CIM até 100 µg/ml

corresponde à concentração do extrato com possibilidade de transformação em

fitomedicamentos (RIOS; RECEIO, 2005).

Os resultados obtidos frente ao S. mutans revelaram que todos os extratos

etanólicos brutos apresentaram atividade antimicrobiana, sendo as CIM’s inferior a

100 µg/ml. Os EEB’s do alecrim-pimenta e do ipê-roxo apresentaram as melhores

CIM de 75,15 µg/ml. Estes resultados corroboram com outros estudos (ANÍBAL,

2007; BOTELHO et al., 2007; MATOS, 2000; SILVA et al., 2008).

De acordo com Matos (1998), o alecrim é composto por flavonóide, fenóis,

óleos vegetais e terpenóides. O extrato apresenta alta atividade antimicrobiana e

antioxidante provavelmente devido à presença de compostos fenólicos e terpenóides

(DEL-CAMPO et al., 2000, COWAN, 1999). Del-Campo et al. (2000) revelaram que

bactérias gram-positivas são mais sensíveis ao extrato de alecrim, semelhante com

o presente estudo.

O ipê-roxo é rico em saponinas, flavonóides, cumarinas e naftoquinona,

metabóltitos que contribuem com a atividade antibacteriana

(D’ALBUQUERQUE, 1968; WAGNER et al., 1989). Martins (2000) indica o

uso da casca do ipê roxo como adstringente, podendo ser usada em processos

infecciosos e inflamatórios.

Ao avaliarmos as partições sobre os S. mutans, a fase hexânica apresentou a

menor CIM para o fruto do jatobá, com 35 µg/ml. O cajueiro apresentou a menor CIM

para as fases diclrometano, acetato de etila e solução hidroalcoólica. Pode-se

destacar a importância dos resultados, pois o Streptococcus mutans é o principal

responsável pela formação da cárie em humanos.

Os resultados da ação antimicrobiana para os S. salivarius variaram de 150,0

a 250,0 µg/ml. Esse dado pode ser um fator positivo, pois esses microrganismos são

considerados probióticos na cavidade oral, produzem bacteriocinas e inibem o

crescimento de S. mutans (BURTON et al., 2006; OGAWA et al., 2011). Assim,

extratos que apresentam melhor ação para o S.mutans e não para o S.salivarius,

são propícios para o desenvolvimento de fitomedicamentos para uso odontológico.

As fases hexânica do barbatimão e fase diclorometano para da aroeira da

praia apresentaram atividade antimicrobiana com CIM de 100,0 µg/ml frente ao S.

oralis. Esse dado torna-se relevante, pois atua sobre um colonizador primário do

biofilme, além da sua concentração ser propícia para o uso em formulações

odontológicas.

Segundo Auricchio e Bacchi (2003), quando se comparam estudos de

atividade antimicrobiana de extratos de plantas medicinais, é notória a dificuldade de

comparação entre os resultados, pois as variáveis vão dos aspectos climáticos que

exercem influência na composição química, como o estágio de desenvolvimento do

vegetal quando da sua coleta, parte da planta estudada, forma de preparar o

material para estudo e, principalmente, os protocolos seguidos nos experimentos

Em uma revisão de artigos publicados sobre atividade antimicrobiana de

plantas medicinais, Rios e Receio (2005) revelaram que o maior problema com as

pesquisas ainda continua sendo a falta de uniformidade nos critérios selecionados

para estudar a atividade. Isso freqüentemente leva a relevantes contradições entre

os resultados obtidos por diferentes grupos e até para o mesmo autor estudando a

mesma amostra com diferentes métodos.

No ambiente oral, os antimicrobianos têm sua eficácia substancialmente

reduzida in vivo por causa das diferentes espécies de microrganismos encontradas

neste local, e também devido à coagregação entre as espécies bacterianas e à

complexa estrutura da placa dental. Quando ocorre a formação de biofilme, a

penetração do antibiótico in vivo se faz lenta ou parcialmente, gerando acúmulo dos

nutrientes e seus metabolitos que alteram o ambiente local, ocorrendo uma redução

do crescimento do biofilme, que leva a um decréscimo da sensibilidade aos

antibióticos e algumas bactérias adquirem resistência (EICK et al., 2004). Este

mesmo processo de redução da sensibilidade dos microrganismos aos

antimicrobianos, devido ao ambiente em que estão presentes, pode ser

desencadeado com os extratos vegetais. Esta observação é importante, pois as

cepas laboratoriais podem não expressar a mesma virulência ou resistência quando

comparadas com as cepas isoladas da cavidade oral ou de outros locais (DUARTE

et al., 2003). Por isso, estudos farmacológicos também devem ser feitos para se

determinar a melhor concentração em que o extrato vegetal possa ser utilizado,

após o isolamento do composto ativo.

A despeito do potencial antimicrobiano de plantas através do uso de

seus extratos brutos, essas pesquisas – por apresentarem um caráter

multidisciplinar – necessitam, para serem assumidas com segurança, da

conjunção de dados provenientes de outras áreas, como: químicas, botânicas,

farmacológicas, etc. Somente com a soma desses conhecimentos será

possível considerar o real potencial de extratos vegetais como agentes

antimicrobianos.

Em análises fitoquímicas, quando não se conhece o conteúdo do

material a ser analisado, costuma-se submeter o material vegetal a sucessivas

extrações, com solventes de polaridade crescente, conseguindo-se assim uma

extração fracionada em que as diferentes frações contêm compostos de

polaridade também crescente (SIMÕES et al. 2005). Por isso, nesse estudo

utilizou-se inicialmente, hexano capaz de separar ácidos graxos;

diclorometano capaz de extrair substâncias lipofílicas, como aldeídos, óleos

fixos, ceras e alcalóide, seguido da extração com acetato de etila obtendo

compostos flavonóides, cumarinas e por fim temos a solução hidroalcoólica

capaz extrair de saponinas e taninos.

A atividade antimicrobiana dos extratos foi determinada através da

presença de falavanóides para todas as amostras; taninos para os extratos de

aroeira da praia, alecrim pimenta, barbatimão, cajueiro, goiabeira. Os

alcalóides foram obtidos nos extratos de sucupira.

Tendo em vista a grande variedade de moléculas bioativas presentes

nos extratos e partições, estas podem ser matéria-prima para antimicrobianos

orais. Apesar dos avanços nas pesquisas in vitro necessita-se de avaliação in

vivo, como também a maior informação dos profissionais da saúde para

indicação no consultório odontológico. Apesar de a fitoterapia ser uma

especialidade da Odontologia os profissionais devem ser capacitados a utilizá-

la da forma mais segura e eficaz.

Conclusões

Os resultados obtidos neste estudo mostrou a importância das

indicações terapêuticas das plantas medicinais como complementar na clínica

odontológica, uma vez que os extratos e fases apresentam potencial atividade

antimicrobiana sobre os microrganismos presentes no biofilme supragengival.

Os extratos testados apresentaram grande potencial fitoterapêutico, e as fases

hexânica e diclorometano foram importantes por possibilitar maior isolamento

de compostos biotaivos, assim sua importância para o desenvolvimento de

fitomedicamentos.

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4.3 Capítulo 3

Plantas medicinais nativas do Brasil com atividade

anti - Quorum sensing

Medicinal plants native to Brazil with Quorum sensing inhibitors activity

Gislaine Simões Portela1; Fábio Correia Sampaio1; Daniela Correia Cavalcante

Souza1; Allan dos Reis Albuquerque 1





Departamento de Clínica e Odontologia Social




58051-900


Resumo

A Comunicação bacteriana ou quorum sensing (QS), controla a patogênese de

muitos microrganismos. Compostos Anti-QS surgem como alternativa ao

desenvolvimento da resistência bacteriana. Analisamos oito plantas nativas do

Brasil utilizando o biosensor E.coli Lac+ para avaliar a atividade anti-QS, e

determinamos atividade antimicrobiana frente a cepa Escherichia coli. Todos os

extratos revelaram atividade antimicrobiana, sendo a fase hexânica do fruto do

jatobá com CIM de 83,5 µg/ml. A atividade anti-QS dos extratos sugerem

maior ação para o barbatimão, goiabeira, cajueiro e fruto do jatobá. Mediante o

envolvimento na expressão da virulência de patógenos, o controle deste

mecanismo tornou-se um alvo atraente e promissor para o desenvolvimento de

novas terapias antimicrobianas.

Palavras-chave: Plantas medicinais, atividade antimicrobiana, quorum

sensing, anti-quorum sensing.

Abstract

The bacterial communication or quorum sensing (QS) controls the

pathogenesis of many microorganisms. Anti-QS compounds emerge as an

alternative to development of bacterial resistance. We analyzed eight plants

native to Brazil using the biosensor E.coli Lac + to evaluate the anti-QS activity,

and determine antimicrobial activity against Escherichia coli strain. All extracts

showed antimicrobial activity, and the hexane phase of the fruit of jatoba with

MIC of 83.5 µg / ml. The anti-QS extracts suggest a greater share for the

barbatimão, goiabeira, cajueiro and jatobá fruit. Through the involvement in the

expression of virulence of pathogens, control of this mechanism has become an

attractive and promising target for the development of new antimicrobial

therapies.

Keywords: Medicinal plants, antimicrobial activity, quorum sensing, anti-

quorum sensing.

Introdução

O surgimento de microrganismos resistentes tem como causa principal o

mau uso dos antibióticos, que não são causadores diretos de resistência, mas

selecionam microrganismos resistentes, ao agirem sobre os sensíveis e

possibilitarem aos resistentes se desenvolverem e ocuparem o lugar da

população sensível. Ou ainda bactérias sensíveis podem adquirir genes de

resistência, provenientes de outras espécies (JANSEN et al., 2006).

Outro mecanismo de resistência deve-se a possibilidade dos

microrganismos produzirem enzimas como as beta-lactamases, que destroem

antibióticos beta-lactamicos, expulsam o medicamento da célula bacteriana por

bombas de efluxo, impedindo-o de alcançar o sitio de ação, modificam a

estrutura da parede celular de forma que esta não contenha os locais de

ligação aos antibióticos ou ainda sofrem mutações e reduzem o número de

porinas, dificultando a entrada do antibiótico (TENOVER, 2006).

As β-lactamases podem ser detectadas em bactérias gram-positivas e

gram-negativas, dentre elas a Escherichia coli, compreende um grupo de

bactérias gram negativas aeróbias que habitam o trato intestinal de humanos e

animais. A espécie apresenta diversos sorotipos, ou seja, variações

antigênicas. Cada sorotipo é capaz de causar diferentes infecções entéricas,

urinárias e bacteremias nosocomiais, utilizando diferentes combinações de

fatores de virulência (MARRS; ZHANG; FOXMAN, 2005).

A formação de biofilmes contribui para a resistência aos antibióticos, e

consiste na adesão de bactérias a uma matriz polimérica formada por

exopolissacarideo, que desenvolve uma comunidade complexa, dinâmica,

formada por uma ou mais espécies de bactérias e ao atingirem a fase clímax

são capazes de perceberem a presença das células vizinhas, através de

autoindutores, e realizam uma comunicação celular denominada quorum-

sensing (QS) (BERRE et al., 2006; SMITH, 2005). Os estudos sobre quorum

sensing foram iniciados no fim dos anos 60 pelos pesquisadores J. Woody

Hastings e Ken H. Nealson. Eles estudaram a regulação da bioluminescência

na bactéria marinha Vibrio fischeri, que apresenta uma relação simbiótica com

animais marinhos tais como a lula. Nessa relação, o hospedeiro usa a luz

produzida pela bactéria, para atrair presas e parceiros ou afugentar

predadores, enquanto o V. fischeri obtém do seu hospedeiro os nutrientes dos

quais necessita (NEALSON et al., 1970).

A luminescência só é observada quando as bactérias colonizam os

órgãos dos hospedeiros e ao aumentar o número de bactérias no meio, elas

são capazes de perceber a densidade celular através da detecção da

concentração do auto-indutor. Ao atingir uma concentração limite de auto-

indutor este é suficiente para disparar o processo de transcrição gênica (SWEM

et al., 2009).

Os auto-indutores envolvidos nesse processo podem ser de diferentes

naturezas químicas, em organismos gram-negativos, as moléculas

sinalizadoras, são derivadas da N -acil homoserina lactona (OHHL) e sua

regulação se dá por meio das proteínas homólogas LuxI e LuxR. A primeira

proteína atua como uma enzima (OHHL sintetase) e a segunda, quando se liga

a OHHL, forma o complexo OHHL-LuxR, responsável pela ativação e

expressão de inúmeros genes. Em gram-positivos, normalmente os

autoindutores correspondem a pequenos peptídeos (hepta ou octapeptídeos).

Estes peptídeos são geralmente secretados por transportadores ligados a ATP.

Alguns interagem com sensores de quinases ligados à membrana que

transportam um sinalizador através da membrana, outros são transportados

para dentro da célula por permeases de oligopeptídeos, onde então interagem

com receptores intracelulares (ROCHA- ESTRADA et al., 2010; SWEM et al.,

2009).

Em sistemas de QS via OHHL’s, a variação na cadeia acil (comprimento

da cadeia, grau de oxidação e saturação) pode conferir alguma especificidade

a estes sistemas de comunicação. Dessa forma, parece haver alguma

comunicação cruzada entre bactérias pertencentes a gêneros diferentes. Parte

desta comunicação cruzada pode representar uma maneira pela qual as

bactérias adquirirem informação acerca da população total, permitindo uma

resposta a competidores ou associados potenciais (WILLIAMS, 2007). A E. coli

não sintetiza OHHL’s mas expressam um homólogo biosensor LuxR.

Especula-se que este sistema permite a E. coli detectar os sinais de

comunicação de outras bactérias gram-negativas e explorar essas informações

para o seu próprio benefício (AHMER, 2004).

Vários patógenos bacterianos realizam QS, incluindo Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides, Yersinia, Burkholderia e Enterococcus

spp., além de outros patógenos clinicamente importantes como os

estafilococos e estreptococos (ASAD; OPAL, 2008).

A bactéria gram-positiva, Streptococcus mutans, um dos principais

patógenos da cárie dentária, realizam o quorum-sensing através da liberação

de peptídeos mediadores da expressão gênica. O sistema de sinalização

envolve pelo menos seis produtos de genes codificados comCDE, comAB e

comX (CVITKOVITCH et al., 2003). O gene OMCC codifica um peptídeo

precursor, que ao ser clivado e exportado liberaram um peptídeo de

sinalização, 21 amino-ácido ou peptídeos competência estimulante (CSP).

Através do quorum-sensing, descobriu-se que o peptídeo competência-

estimulante (CSP) era necessária para a adequada formação de biofilme de S.

mutans além da suas características de virulência (LI et al., 2001).

O fenômeno de quorum-sensing permite as bactérias regular diversas

funções celulares como luminescência, formação de biofilmes, produção de

antibióticos, expressão de fatores de virulência e motilidade. O conhecimento

dessa “linguagem bacteriana” e consequentemente a sua inibição pode resultar

na descoberta de novas substancias eficazes no tratamento de infecções

(ADONIZIO et al., 2006).

Compostos inibibidores de QS podem fornecer uma alternativa ao

tratamento de infecções resistentes a antibióticos. O inibidores de QS podem

alterar a via de ligação ou produção de autoindutores, a macroalga vermelha,

Delisea pulchra, foi investigada por suas propriedades anti-incrustantes, possui

furanonas halogenados, compostos que bloqueiam a via OHHL’s inibindo

competitivamente e desestabilizando o LuxR (MANEFIELD; TUNER, 2002).

Assim, propusemos avaliar a atividade antimicrobiana de oito plantas

nativas do Brasil em modelo planctônico sobre cepas de E.coli sp. e, através

do biossensor E.coli lac+ determinar a ação anti-quorum sensing.

Material e métodos


As plantas nativas do Brasil selecionadas foram Schinus terebinthifolius

Raddi (aroeira da praia); Lippia sidoides Scham (alecrim pimenta); Abarema

cochiliacarpos (Gomes) B. & J.W. Grimes (barbatimão); Anacardium

occidentale Linn (cajueiro); Psidium guajava Linn (goiabeira); Tabebuia


Bowdichia virgiloides Kunth (sucupira).

Foram coletados 1-6 kg de material vegetal, preferencialmente folhas,

flores, frutos e casca. Para a espécie Hymenaea courbaril L (jatobá) utilizou-se

a casca e o fruto. As atividades de laboratório, análise morfológica dos

espécimes e identificação, foram realizadas no Laboratório de Botânica do

Departamento de Sistemática e Ecologia da Universidade Federal da Paraíba,

Campus I, João Pessoa-PB. As exsicatas foram incorporadas ao acervo do

Herbário JPB.

O material vegetal coletado foi desidratado em estufa com ar circulante

(38 oC, 48-72 horas), triturado em moinho (tipo Harley). Depois a droga vegetal

foi submetida à maceração utilizando-se etanol a 80% por até 6 dias. O

solvente foi evaporado em rota evaporador até fornecer o extrato etanólico

bruto (EEB). Visando uma semi-purificação das substâncias através de suas

polaridades os EEB’s foram particionados em um funil de separação após ser

diluído com água:metanol (3:7, v/v). A fase aquosa obtida foi submetida a

partições com os solventes em ordem crescente de polaridade: hexano,

diclorometano e acetato de etila, sendo a solução residual a solução

hidroalcoólica.



Mínima (CBM) dos EEB’s e partições foram testadas em modelo experimental

de diluição em fase líquida (microdiluição em caldo) conforme descrito pela

NCCLS (2003) e modificada por Andrews (2001), utilizando a cepa de E.coli

(ATCC25922). Os EEB’s e partições foram avaliados nas concentrações de

400 a 20 µg/mL. Como controle positivo utilizou-se a solução de digluconato de

clorexidina (Sigma, Steinheim, Alemanha) nas concentrações de 0,0115 a 5,9

mg/mL. Realizou-se o controle de esterilidade do meio, extrato e da cultura.

Padronizou-se o inoculo com valor correspondente a 0,5 da escala de

McFarland (1,5 x 108 células/mL =108 UFC/mL).

Após o pré-enchimento de todos os poços, as microplacas foram

seladas com parafilme e incubadas a 37 °C por 24 horas. Após o período de

incubação, adicionou-se 30 µL de resazurina (Sigma, Steinheim, Alemanha)

preparado em solução aquosa (0,01%) em cada orifício.


A indicação de cor rosa será indicativa de transformação de resazurina em



ágar para confirmar a presença de bactérias viáveis e determinar a


Avaliação da atividade anti-quorum sensing

A metodologia para os testes de avaliação anti-quorum sensing seguiu o

modelo de QSIs (sistema Inibidor de Quorum Sensing) proposto por

Rasmussen e colaboradores (2005) (RASMUSSEN et al., 2005). Este sistema

de detecção de QSI foi desenvolvido pela clonagem do sistema LuxR do Vibrio

fischeri em uma cepa de E. coli lac+ (pUC18Not-luxR-PluxI::phlA, ApR). As

bactérias E. coli lac+ forão cultivadas em meio de cultura Luria-Bertani – caldo

suplementado com 0,5% de glicose, 0.5% de solução de ácido casamino e

ampicilina 500 mg/mL; e incubadas por 16 horas a 37°C sob forte agitação de

200-250 rpm. Após incubação, 1 mL do inóculo diluído (A600nm= 0,6) e

adicionado a 225 mL de BT-agar enriquecido com: glicose a 20%, ácido

casamino a 20%, A10 (controlador de pH), 100 mM IPTG (Iso-propyl-

thiogalactosidase), 50 µL Ampicilin (500 mg/mL), 50 µL 1 mM OHHL [N-(beta-

Ketocaproyl)-DL-homoserina lactona], x-gal (40 mg/mL). As amostras de EEB’s

foram diluídas em água deionizada (1:1v/v), e 25 µL destas foram pipetas para

poços em amostras duplicadas. Após incubação (30°C, 24 h) a confirmação da

atividade anti-quorum sensing foi realizada em câmara de luz UV. Halos de

inibição indicarão atividade anti-quorum sensing (RASMUSSEN et al., 2005;

SAMPAIO, 2008).

Resultados

De acordo com os ensaios realizados, cepas de E. coli foram sensíveis a

todos os extratos etanólicos brutos e partições. A CIM variou de 83,5 a 200,0

µg/ml. A fase hexânica do fruto do jatobá apresentou CIM de 83,5 µg/ml. Os

valores obtidos com CIM menor ou igual a 100 µg/ml correspondem a CIM

padrão, concentração indicativa para a produção de fitomedicamentos (RIOS;

RECEIO, 2005). Os resultados para a CBM variou de 100 a 400 µg/ml (Quadro

1).

Todos os extratos etanólicos brutos apresentaram atividade anti- quorum

sensing, com halos de inibição variando de 2 a 5 mm (Figura 1). Os maiores

halos encontrados foram para os extratos de barbatimão, goiabeira, cajueiro e

o fruto do jatobá (Quadro 2).

Figura 1- Representação da atividade anti-QS (1.goiabeira, 2.cajueiro).

PLANTAS EEB F. Hexânica F. diclorometano F. Acetato de etila S.hidroalcooolica


Aroeira da praia 200,0 350,0 150,0 350,0 150,0 350,0 150,0 350,0 200,0 250,0

Alecrim pimenta 200,0 350,0 150,0 200,0 150,0 350,0 150,0 200,0 150,0 350,0

Barbatimão 200,0 300,0 200,0 300,0 200,0 350,0 150,0 300,0 200,0 350,0

Cajueiro 200,0 350,0 150,0 200,0 150,0 250,0 150,0 300,0 150,0 250,0

Goiabeira 200,0 350,0 200,0 350,0 200,0 350,0 200,0 300,0 150,0 350,0

Ipê-roxo 200,0 300,0 150,0 350,0 150,0 350,0 150,0 350,0 150,0 350,0

Jatobá (Casca) 200,0 350,0 200,0 300,0 200,0 400,0 200,0 350,0 200,0 350,0

Jatobá (Fruto) 200,0 350,0 83,5 100,0 200,0 400,0 150,0 350,0 150,0 150,0

Sucupira 150,0 350,0 200,0 350,0 200,0 350,0 200,0 400,0 200,0 350,0

Planta Halo de inibição (mm) Atividade QSIs

Aroeira da praia 2 Baixa

Alecrim pimenta 2 Baixa

Barbatimão 5 Alta

Cajueiro 5 Alta

Goiabeira 5 Alta

Ipê-roxo 3 Moderada

Jatobá (Casca) 3 Moderada

Jatobá (Fruto) 5 Alta

Sucupira 2 Baixa

Quadro 1 - Valores de CIM e CBM (μg/mL) dos extratos e partições sobre a E. coli.

Quadro 2 – Halos de inibição da atividade anti-QS do EEB’s.

Discussão

Embora a indústria farmacêutica tenha desenvolvido um grande número

de novos antibióticos nas três últimas décadas, a resistência a essas drogas

pelos microrganismos aumentou. Em geral, as bactérias têm habilidade

genética para transmitir e adquirir resistência às drogas, as quais são utilizadas

como agentes terapêuticos. Devido ao número de pacientes hospitalizados,

que estão com seu sistema imunológico suprimido, e às novas espécies

bacterianas multi-resistentes, novas infecções podem ocorrer nos hospitais,

resultando num alto índice de mortalidade (COHEN, 1992). O aumento

prevalente de microrganismos multi-resistentes, assim como o aparecimento de

efeitos indesejáveis de algumas drogas, faz com que a busca por novos

agentes antimicrobianos seja uma importante estratégia para o

estabelecimento de terapias alternativas para infecções de difícil tratamento

(PEREIRA et al., 2006).

Por muito tempo, as plantas tem sido uma valiosa fonte de produtos

naturais para a saúde humana, principalmente nos últimos anos em que as

terapias naturais vêm sendo intensivamente estudadas. O uso de compostos

vegetais com finalidade farmacêutica está crescendo gradualmente no Brasil

(SANTOS et al., 1995). Assim, o uso dos extratos de plantas e produtos

fitoquímicos, ambos com propriedades antimicrobianas conhecidas, podem ter

grande significado no tratamento terapêutico.

Muitas plantas têm sido usadas devido às suas características

antimicrobianas, que fazem parte da síntese de seus metabólitos como um

composto secundário. Esses compostos são conhecidos pelas suas

substâncias ativas, como compostos fenólicos, que fazem parte dos óleos

essenciais, assim como os taninos (NASCIMENTO et al., 2000).

Com relação aos resultados obtidos para a atividade antimicrobiana a

fase hexânica do fruto jatobá apresentou uma CIM de 83,5 µg/ml,

apresentando possibilidade de transformação em fitomedicamentos, de acordo

com Rios e Receio (2005). Segundo Lorenzi e Matos (2002) essa espécie

vegetal é utilizada popularmente como carminativa, sedativa e adstringente, o

chá da casca é recomendado para diarréia, disenteria e cólicas intestinais.

Uma revisão dos metabólitos secundários identificados nessa espécie

demonstrou que diterpenos, xiloglucanas, galactomananas, oligossacarídeos e

alguns tipos de ácidos graxos são os principais metabólitos presentes nesses

vegetais (LIMA ; OLIVEIRA; BUCKERIDG , 2003; TINÉ; CORTELAZZO;

BUCKERIDG, 2000).

Os resultados obtidos no modelo planctônico podem qualificar o agente

para tratamentos de infecções biofilme-dependentes ou desqualificá-lo, caso

esses testes demonstrem resultados negativos (COSTERTON et al., 1987). Os

dados dos extratos testados sobre a cepa de E.coli podem sugerir efeito em

biofilme. Assim, ao testarmos na inibição do auto-indutor OHHL estamos

propondo uma atuação em nível de comunidade bacteriana.

Este estudo apresentou oito extratos de plantas medicinais com

atividade anti-QS, sendo os extratos de barbatimão, goiabeira, cajueiro e fruto

do jatobá apresentaram uma maior halo inibição, com 5mm.

Outros estudos revelam a ação anti QS, como a ação do Pisum sativum

(ervilha) e mudas de exsudados da raiz produz inibição QS

(TEPLITSKI et al., 2000). O Alho (Allium sativum), cenoura (Daucus carota),

camomila (Matricaria sp.), nenúfar (Nymphaea sp.) e diversas pimentas

(Capsicum spp.) possuiem atividade anti-QS contra uma cepa modificada Luxi-

GFP (RASMUSSEN et al., 2005). O Alho pode inibir a formação de biofilme em

P. aeruginosa (RASMUSSEN et al., 2005).

Huber et al. (2004) citam ação anti-QS moderada para frutas como

framboesa, mirtilo, amora-preta, amora, uva, e ervas como tomilho, gengibre,

manjericão, couve orégano, açafrão. No entanto, nenhum dado foi obtido em

um modelo animal in vivo, nem compostos ativos dos extratos foram

purificados.

Conclusões

Sistemas de quorum sensing surgem como um novo tratamento

estratégico contra patógenos bacterianos. Inibidores desta comunicação

bacteriana célula a célula podem oferecer um novo tratamento contra infecções

resistentes. Novas drogas que interferem com a virulência microbiana e

formação de biofilme seria uma adição bem-vinda ao arsenal terapêutico contra

patógenos bacterianos. Como QS não atua sobre o crescimento e/ou parede

celular das bactérias toran-se um fator menos sensível a resistência bacteriana.

Dentre os extratos analisados os que sugerem maior ação anti-QS são

barbatimão, goiabeira, cajueiro e fruto do jatobá.

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5 DISCUSSÃO

O nosso trabalho teve como finalidade ressaltar a importância da

bioprospecção de produtos naturais, que consiste na exploração e investigação

de recursos provenientes da fauna e da flora, a fim de identificar princípios

ativos para a obtenção de novos produtos e processos com vistas à

comercialização (ARTUSO, 2002). Nessa acepção, a bioprospecção não é uma

atividade nova na história humana, desde seus primórdios, a humanidade

experimenta os recursos biológicos disponíveis na natureza e procura obter, a

partir destes recursos, novos objetos, utensílios e medicamentos para sua vida

diária.

A atividade biológica de plantas medicinais tem sido objeto de intensa

investigação científica. Plantas superiores e aromáticas são amplamente

utilizadas na medicina popular, uma vez que apresentam amplo espectro de

atividade e inibição comprovada contra bactérias e fungos (HULIN et al, 1998).

A maioria dessas propriedades é conferida por produtos do metabolismo

secundário, como terpenóides, compostos fenólicos e taninos, que também na

forma pura exibem atividade (ADAN et al, 1998).

Trabalhos recentes sobre a atividade antimicrobiana de extratos e óleos

essenciais mostram o grande potencial de aplicação de plantas nativas de

diversas regiões do mundo. No Brasil, estudos com a mesma finalidade são de

grande importância, uma vez que plantas medicinais são utilizadas em várias

áreas da saúde como forma complementar de tratamento. Além disso, nosso

país apresenta uma rica biodiversidade, devendo-se considerar o custo mais

baixo destas formas terapêuticas em relação a medicamentos industrializados.

As plantas investigadas foram selecionadas a partir de abordagens

etnofarmacobotânicas prévias e da atual lista do RENISUS (Relação Nacional

de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS), foram avaliadas as espécies

preferencialmente nativas e com registro de atividade antimicrobiana

(OLIVEIRA, 2006; XAVIER; RAMOS; XAVIER FILHO, 1995). A Relação

Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (Renisus) apresenta 71

plantas medicinais nacionais e exóticas que possuem potencial para gerar

produtos de interesse ao SUS (ALBUQUERQUE; HANAZAKI, 2006; SILVA;

ANDRADE, 2005).

A coleta de material botânico foi realizada em diversas áreas, como o

campus I da UFPB, o horto de plantas medicinais do Laboratório de

Tecnologias Farmacêuticas (LTF) da UFPB, o Núcleo de Pesquisa e

Processamento de Alimentos (NUPPA/UFPB), na Mata de Jacarapé – próximo

a Estação Experimental da EMEPA (Empresa Estadual de Pesquisa

Agropecuária da Paraíba) e nos sítios Paturi e Mamuaba, pertencentes ao

município de Pedra de Fogo/PB.

Amostras de material fértil foram encaminhadas para o Laboratório de

Botânica do Departamento de Sistemática e Ecologia da Universidade Federal

da Paraíba, Campus I, João Pessoa-PB para a análise morfológica dos

espécimes e identificação. As exsicatas foram incorporadas ao acervo do

Herbário JPB (Apêndice 1).

Após a secagem, desidratação e prensagem as plantas sofreram

maceração exaustiva com etanol a 80%, sendo o solvente evaporado em rota

evaporador. As amostras que obtiveram um bom rendimento do EEB foram

submetidas a uma semi-purificação das substâncias através de suas

polaridades, realizando partições em ordem crescente de polaridade com os

seguintes solventes: hexano, diclorometano e acetato de etila (Apêndice 2).

Os EEB’s do barbatimão, gengibre, juazeiro, malva branca, mastruz e

romã obtiveram um rendimento abaixo de 100g, não sendo viável a partição

com solventes em ordem crescente de polaridade. O extrato de angico apesar

de um rendimento de 590,4 g não realizamos a partição, pois não houve

formação de fases entre os solventes diclorometano e acetato de etila, assim

realizamos os testes de sensibilidade antimicrobiana apenas com o EEB.

A seleção dos microrganismos do grupo Streptococcus se deve a

importância do desenvolvimento da cárie dental e a escolha da E. coli por estar

presente em diversas infecções resistentes ( MARRS; ZHANG;FOXMAN,

2005). Além disso, possuem relativa facilidade de cultivo em diversos meios e

por estas cepas terem sido testadas previamente com antimicrobianos

derivados de produtos naturais (PEREIRA et al., 2006; VELOSO, 2006;

VASCONCELOS et al., 2006). A cepa de E. coli lac+ (cedida por Givskov

M.,DTU, Dinamarca) também foi objeto de avaliação, para a determinação da

atividade anti-QS (RASMUSSEN et al., 2005).

A avaliação antimicrobiana seguiu o modelo planctônico da microdiluição

em caldo (NCCLS, 2003). A CIM corresponde à menor concentração do

extrato capaz de inibir o microrganismo. Este método apresenta a vantagem de

ser quantitativo, podendo ser usado para amostras hidrossolúveis e

lipossolivéis (REIS, RECEIO , 1988). A CBM é a quantidade mínima de agente

antimicrobiano necessário para inviabilizar a célula microbiana, ou seja,

provocar danos irreversíveis a célula bacteriana, sendo possível avaliar se o

composto é bacteriostático ou bactericida (BARON; FINEGOLD, 1990)

As cepas de S. mutans foram as mais sensíveis aos extratos estudados,

sendo obtido uma CIM favorável para a produção de fitomedicamentos paras

os extratos de aroeira da praia, alecrim pimenta, angico, barbatimão, cajueiro,

gengibre, goiabeira, ipê-roxo, jatobá, juazeiro, malva branca, mastruz, romã e

sucupira. Os extratos submetidos à partição também apresentaram atividade

antimicrobiana.

As bactérias ao se organizarem em biofilmes são capazes de realizar

comunicação celular, porém ainda não está totalmente elucidado esse

processo. Os tipos de moléculas potenciais que as bactérias produzem e às

quais respondem para se adaptarem em seu ambiente, incluindo ambientes

competitivos, ainda são poucos exploradas e o número de moléculas

sinalizadoras identificadas é crescente (KELLER; SURETTE, 2006).

A comunicação celular, quorum sensing (QS) desempenha uma função

central na fisiologia e no desenvolvimento de organismos vivos. Mesmo

organismos celulares, como as bactérias frequentemente coordenam suas

atividades de forma semelhante a entidades multicelulares (SHAPIRO, 1998).

Essa coordenação necessariamente requer a comunicação célula-célula, o que

ocorre por meio da produção e liberação de compostos celulares específicos

por células individuais. O acúmulo extracelular desses sinais denota a

presença de população relativamente densa e faz com que as células

apresentem um comportamento coordenado (FUQUA et al., 1994).

O QS bacteriano é um fenômeno comum que oferece o acesso a

nutrientes ou a nichos ambientais favoráveis, permite que as bactérias

organizem respostas ofensivas contra hospedeiros eucarióticos, além de

otimizar a capacidade das bactérias de se diferenciarem em formas mais bem

adaptadas a sobreviverem em ambientes hostis, onde as condições de

crescimentos são restritivas (SWIFT et al., 2001)

Existe um grande interesse em desenvolver sistemas para interromper

ou manipular o processo de sinalização célula-célula em bactérias, utilizando-

se compostos análogos ou antagonistas de QS ou, ainda, enzimas que

degradem as moléculas sinalizadoras, a fim de alterar comportamentos

regulados por QS. A aplicação desses antagonistas poderia ser útil para

controlar o crescimento ou inibir os mecanismos de virulência das bactérias em

diferentes ambientes (SMITH et al., 2004).

A avaliação anti quorum-sensing dos extratos de plantas nativas do

Brasil, revelou ação inibidora para o crescimento da bactéria mesmo com a

presença no meio de cultura de OHHL, sendo os extratos de barbatimão,

goiabeira, cajueiro e fruto do jatobá, a apresentarem acentuada atividade anti-

QS.

Este estudo corrobora a importância dos dados de levantamentos

etnofarmacológicos na seleção de plantas para triagem de bioatividade. Os

resultados apresentam uma expressiva contribuição para a caracterização da

atividade antimicrobiana de extratos e partições de plantas da flora brasileira

utilizados na medicina tradicional. Sugerimos futuras pesquisas destas plantas

em modelo de biofilme de fluxo contínuo, a fim de simular a ação

antimicrobiana e anti-quorum sensing. Para assim, desenvolver sustâncias

testes para bochechos e sua possível comercialização.

De um modo geral, observa-se uma carência de estudos com modelos

experimentais que avaliam atividade anti-quorum sensing de compostos

naturais. A realização de trabalhos de bioprospecção possibilita a identificação

de espécies vegetais que forneçam princípios ativos que atuam minimizando

ou controlando a virulência de biofilmes microbianos.

6 CONCLUSÕES

Através dos resultados obtidos, foi possível concluir que:

1. Todos os extratos etanólicos brutos apresentaram atividade antimicrobiana

frente à bactérias bucais, sendo a cepa de S. mutans menos resistente;

2. As fases hexânicas e diclorometano apresentaram melhor atividade

antimicrobiana, sendo a fase hexânica do fruto do Hymenaea courbaril

L.(jatobá) a apresentar melhor ação frente à cepa de S. mutans;

3. Os melhores resultados para a inibição do quorum sensing foram os EEB’s

de A. cochilocarpos (Gomes) B. & J.W. Grimes (barbatimão), Psidium

guajava Linn (goiabeira), Anacardium occidentale Linn. (cajueiro) e o fruto

do Hymenaea courbaril L. (jatobá);

4. As espécies vegetais Schinus terebinthifolius Raddi (aroeira da praia),

Lippia sidoides Scham (alecrim pimenta), Anadenanthera macrocarpa

Benth (angico), A. cochilocarpos (Gomes) B. & J.W. Grimes (barbatimão),

Anacardium occidentale Linn. (cajueiro), Psidium guajava Linn (goiabeira),

Tabebuia avellanedae Lorentz ex Griseb (ipê-roxo), Hymenaea courbaril

L.(jatobá), Ziziphus joazeiro Mart (juazeiro), Sida cordifolia L. (malva

branca), Chenopodium ambrosioides L (mastruz), Punica granatum Linn

(romã) e Bowdichia virgiloides Kunth (sucupira) apresentaram eficácia para

elaboração de fitomedicamentos antimicrobianos.

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APÊNDICES

Apêndice 1 - Exsicatas confeccionadas e número do registro

Apêndice 2- Rendimento dos EEB’s.

N Nome científico Nome popular Peso da planta seca (g)

Peso do EEB (g)

1* Schinus terebinthifolius Raddi

Aroeira da praia 222,47 128,56

2* Lippia sidoides Scham Alecrim pimenta

1410,00 112,61

3 Anadenanthera macrocarpa Benth

Angico 2455,00 590,40

4* Abarema cochiliacarpos (Gomes) B. & J.W. Grimes

Barbatimão 319,31 199,71

5* Anacardium occidentale Linn

Cajueiro 255,29 160,73

6 Zingiber officinale

Gengibre 305,00 37,19

7* Psidium guajava Linn Goiabeira

1301,00 469,0

8* Tabebuia avellanedae Lorentz ex Griseb

Ipê-roxo 1399,00 120,47

9 Hymenaea courbaril L. Jatobá 1740,00 (casca) 2087,00 (fruto)

389,0 (casca) 189,30 (fruto)

10 Ziziphus juazeiro Mart Juazeiro

1020,00 99,76

11 Sida cordifolia L.

Malva Branca 665,00 53,17

12 Chenopodium ambrosioides L.

Mastruz 1200,00 62,47

13* Punica granatum L. Romã

1300,00 99,1

14 Bowdichia virgiloides Kunth

Sucupira 1840,00 101,30

Documents

bioprospecção de plantas medicinais com atividade antimicrobiana