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12 Interbio v.11 n.2, Jul-Dez, 2017 - ISSN 1981-3775 SCHMITZ, Wanderlei Onofre; ESTEVÃO, Dirceu; CECCHINI, Rubens et al. ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E TOXICIDADE DO CHÁ VERDE (Camellia sinensis) ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND TOXICITY OF GREEN TEA (Camellia sinensis) SCHMITZ, Wanderlei Onofre 1 ; ESTEVÃO, Dirceu 2 ; CECCHINI, Rubens 2 ; FERREIRA, Dalva Trevisan 5 ; CAVASSIN, Emerson D. 4 ; SAITO, Alexandre 2 ; SARIDAKIS, Halha Ostrensky 3 Resumo Vários estudos vem sendo desenvolvidos para comprovar as atividades terapêuticas do chá verde ( Camélia sinensis L). Seus componentes, flavonóides e catequinas, que apresentam atividades: antioxidante, quimioprotetora, antiinflamatória, anticarcinogênica e antibacteriana. Este trabalho tem por objetivo avaliar o mecanismo de ação do extrato do chá verde (ECV), como agente antibacteriano e avaliar sua toxicidade. Para testar a atividade antibacteriana foram utilizandas 07 bactérias padrão e bactérias de origem hospitalar: Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 70063 -lactamase positiva, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 23212 e 22 cepas S. aureus sendo 11 sensíveis a oxacilina (MSSA) e 11 resistentes a essa droga (MRSA), isoladas de pacientes do Hospital Universitário de Londrina-PR. Nos testes de atividade hemolítica foram utilizados eritrócitos humanos e nos testes de hepatotoxicidade foram utilizados ratos submetidos por via oral a dose única de ECV (120 mg/Kg). Os resultados indicam que o chá verde apresenta atividade antibacteriana e ao mesmo tempo baixa toxicidade, na dose testada. Palavras chaves: Camellia sinensis, Chá Verde, flavonóides, catequinas, antibacteriano, toxicidade. Abstract Several studies have been developed to prove green tea (Camellia sinensis L) therapeutic activities. Tea components, flavonoids and catechins present activities: antioxidant, chemoprotector, anti-inflammatory, anticarcinogenesis and antibacterial. The work’s objective is evaluate the green tea extract (ECV) mechanism of action, as antibacterial agent and evaluate it toxicity. To antibacterial test activity were used 07 reference bacteria strain and hospital bacteria: Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 70063 -lactamase producer, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 23212 and 22 strain S. aureus 11 oxacillin susceptible (MSSA) and 11 oxacillin resistant (MRSA), isolated from patients of the University Hospital of Londrina-PR. For the tests of hemolytic activity in human erythrocytes and the hepatotoxicity tests in rats oral dose were used (120 mg/Kg). The results indicate that the green tea presents antibacterial activity and at the same time low toxicity, in the tested dose. Key words: Camellia sinensis, Green Tea, flavonoids and catechins, antibacterial, toxicity. 1 Doutor em Ciências da Saúde, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR, Brasil. 2 Departamento de Ciências Patológicas, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR, Brasil 3 Departamento de Microbiologia, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR, Brasil. 4 Departamento de Ciências da Saúde, Hospital Universitário de Londrina, Londrina-PR, Brasil 5 Departamento de Química, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR, Brasil

BIOPROSPECÇÃO DE MICRORGANISMOS PRODUTORES DE

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Interbio v.11 n.2, Jul-Dez, 2017 - ISSN 1981-3775

SCHMITZ, Wanderlei Onofre; ESTEVÃO, Dirceu; CECCHINI, Rubens et al.

ATIVIDADE ANTIBACTERIANA E TOXICIDADE DO CHÁ VERDE

(Camellia sinensis)

ANTIBACTERIAL ACTIVITY AND TOXICITY OF GREEN TEA (Camellia sinensis)

SCHMITZ, Wanderlei Onofre 1; ESTEVÃO, Dirceu 2; CECCHINI, Rubens 2; FERREIRA,

Dalva Trevisan 5; CAVASSIN, Emerson D. 4; SAITO, Alexandre 2; SARIDAKIS, Halha

Ostrensky 3

Resumo

Vários estudos vem sendo desenvolvidos para comprovar as atividades terapêuticas do chá verde (Camélia sinensis

L). Seus componentes, flavonóides e catequinas, que apresentam atividades: antioxidante, quimioprotetora,

antiinflamatória, anticarcinogênica e antibacteriana. Este trabalho tem por objetivo avaliar o mecanismo de ação do

extrato do chá verde (ECV), como agente antibacteriano e avaliar sua toxicidade. Para testar a atividade

antibacteriana foram utilizandas 07 bactérias padrão e bactérias de origem hospitalar: Escherichia coli ATCC 25922,

Klebsiella pneumoniae ATCC 70063 -lactamase positiva, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 23212 e 22 cepas S. aureus sendo 11 sensíveis a oxacilina (MSSA) e 11 resistentes a

essa droga (MRSA), isoladas de pacientes do Hospital Universitário de Londrina-PR. Nos testes de atividade

hemolítica foram utilizados eritrócitos humanos e nos testes de hepatotoxicidade foram utilizados ratos submetidos

por via oral a dose única de ECV (120 mg/Kg). Os resultados indicam que o chá verde apresenta atividade

antibacteriana e ao mesmo tempo baixa toxicidade, na dose testada.

Palavras chaves: Camellia sinensis, Chá Verde, flavonóides, catequinas, antibacteriano, toxicidade.

Abstract

Several studies have been developed to prove green tea (Camellia sinensis L) therapeutic activities. Tea components, flavonoids and catechins present activities: antioxidant, chemoprotector, anti-inflammatory, anticarcinogenesis and

antibacterial. The work’s objective is evaluate the green tea extract (ECV) mechanism of action, as antibacterial

agent and evaluate it toxicity. To antibacterial test activity were used 07 reference bacteria strain and hospital

bacteria: Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 70063 -lactamase producer, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Salmonella typhimurium ATCC 14028,

Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 23212 and 22 strain S. aureus 11 oxacillin

susceptible (MSSA) and 11 oxacillin resistant (MRSA), isolated from patients of the University Hospital of

Londrina-PR. For the tests of hemolytic activity in human erythrocytes and the hepatotoxicity tests in rats oral dose

were used (120 mg/Kg). The results indicate that the green tea presents antibacterial activity and at the same time

low toxicity, in the tested dose.

Key words: Camellia sinensis, Green Tea, flavonoids and catechins, antibacterial, toxicity.

1Doutor em Ciências da Saúde, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR, Brasil. 2Departamento de Ciências Patológicas, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR, Brasil

3Departamento de Microbiologia, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR, Brasil.

4Departamento de Ciências da Saúde, Hospital Universitário de Londrina, Londrina-PR, Brasil

5Departamento de Química, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR, Brasil

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SCHMITZ, Wanderlei Onofre; ESTEVÃO, Dirceu; CECCHINI, Rubens et al.

Introdução

A bebida conhecida como chá é uma

infusão da planta Camellia sinensis L. Nos

países orientais é mais consumida na forma de

chá verde e a grande maioria dos estudos são

realizados com esta forma de chá. Além da

sua qualidade de estimulante leve e de

provocar a sensação de bem estar, muitos

componentes importantes, principalmente os

polifenóis, podem contribuir para suas

propriedades farmacológicas de antioxidante,

anti-radicais livres, quimioprotetor, anti-

cancerígeno, antiinflamatório, antialérgico,

hipocolesterolemiante, promotor imunológico,

quelante de metais, capacidade de se

complexar com macromoléculas (proteínas e

polissacarídeos), ação antibacteriana e

antiviral. Estas propriedades farmacológicas

estão diretamente relacionadas com a

estrutura química das catequinas e flavonóides

(COOK, SAMMAN, 1996; ANGHILERI,

THOUVENOT, 2000).

O chá verde contém as catequinas:

epicatequina (EC), epigalocatequina (EGC),

galato-3-epicatequina (ECG), galato-3-

epigalocatequina (EGCG) e flavonóides

(kempferol, quercetina, miricetina) que são os

principais componentes químicos terapêuticos

da C. sinensis. Outros componentes do chá

verde são: xantinas (cafeína, teofilina,

teobromina), teoflavinas (teoflavina, teo-

flavina-3-galato, teoflavina-3'-galato, teoflavi-

na-3,3'-digalato), taninos e saponinas

(teosaponinas). As catequinas correspondem a

aproximadamente 25% dos compostos

derivados das folhas secas do chá verde

(RICE-EVANS, MILLER, PAGANGA,

1996; ZUANAZZI in SIMÕES et al., 2002).

Embora, possua uma série de

atividades benéficas para o organismo, o chá

pode apresentar efeitos tóxicos. Apesar de

possuir menos cafeína que o café, sua

ingestão em excesso pode causar efeitos

colaterais como: insônia, estado de vigília,

nervosismo e taquicardia em indivíduos

sensíveis (MELLO; SANTOS in SIMÕES et

al., 2002). Devido a capacidade de se

complexar com íons metálicos, pode reduzir a

absorção do ferro (COOK, SAMMAN, 1996).

As folhas do chá verde apresentam altas

concentrações de alumínio e altas

concentrações de alumínio no sangue são

encontradas na doença de Alzheimer’s. No

entanto os países com alto consumo de chá

não apresentam altos índices de doença de

Alzheimer’s (TREVISATO, 2000). As

catequinas, assim como outros flavonóides,

podem sofrer oxidação e gerar radicais livres

(superóxido e peróxido de hidrogênio) através

da reação de Fenton (URIOS et al., 2003;

NAKAGAWA et al., 2002). Estes radicais

livres podem levar a lipoperoxidação de

membranas e lesão celular. A dosagem do

malondialdeido acético (MDA) e do

complexo ferro-xilenol laranja, são capazes de

medir a lipoperoxidação de membrana. A

lesão celular pode ser avaliada pela dosagem

de transaminases (AST/ALT) e o

histopatológico possibilita identificar qualquer

alteração morfológica das células.

Para compreender a toxicidade das

catequinas é preciso conhecer sua absorção,

distribuição e metabolismo, pois é em função

destes dados é que poderemos tecer uma

estratégia de uso terapêutico destes

compostos. Chen et al. (1997), propôs que a

EGCG é a fração mais rapidamente absorvida,

distribuindo se por todos os tecidos e

possuindo um tempo de meia vida maior que

das outras catequinas. Cai et al. (2002a)

verificaram que as baixas concentrações

sanguíneas das catequinas se devem a rápida

difusão tecidual e não ao efeito de primeira

passagem. Lee et al. (2002) demonstraram

tempos de meia-vida de 3.4 h para EGCG, 1.7

h para EGC e 2.0 horas para EC. Já Warden et

al. (2001) avaliaram a biodisponibilidade das

catequinas, em humanos e verificaram que as

concentrações plasmáticas de EGC, EC e

EGCG apresentaram picos em

aproximadamente 5 h. Portanto o baixo tempo

de meia-vida, sua baixa disponibilidade

plasmática e o rápido metabolismo das

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catequinas, constituem um problema para o

usa do chá verde como agente terapêutico.

O objetivo deste trabalho é avaliar a

atividade antibacteriana do extrato etanólico

de chá verde (ECV) frente a diferentes

espécies de bactérias, em particular

Staphylococcus aureus, em doses não tóxicas

ou com toxicidade.

Ação Antibacteriana

Vários mecanismos são propostos para

explicar a atividade antibacteriana do chá

verde: inibição de síntese protéica da PBP2,

lesão de parede celular por inibição das

autolisinas e lesão de membrana através de

radicais livres (YAM, HAMILTON-MILLER,

SHAH, 1998, HAMILTON-MILLER, SHAH,

1999; ARAKAWA et al., 2004).

Com o objetivo de esclarecer a

atividade antibacteriana do chá muitos estudos

têm sido realizados. Já Toda et al. (1989)

descreveram a ação antibacteriana do chá

verde contra Staphylococcus aureus,

Staphylococcus epidermidis, Salmonella

typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella

enteritidis, Shigella flexneri, Shigella

dysenteriae, e Vibrio cholerae. Kubo, Muroi e

Himejima (1992), descreveram a ação

antibacteriana dos 10 principais óleos voláteis

do chá, contra Streptococcus mutans,

Propionibacterium acne, Pseudomonas

aeruginosa, Enterobacter aerogennes e

Escherichia coli. Foi ainda descrito que a

fração EGCG do chá verde, mostrou atividade

bacteriostática contra E. coli O157:H7

(enterohemorrágica) (OSAWA et al., 1999).

Bactérias isoladas de saliva e dentes

cariogênicos de humanos (Streptococcus

salivarius e S. mutans) foram testadas frente

ao chá verde e os autores observaram ação

inibitória do crescimento bacteriano

(RASHEED, HAIDER, 1998). Hamilton-

Miller (2001) demonstrou que vários

componentes do chá verde têm atividade

antibacteriana contra S. mutans e S. sobrinus e

impedem a aderência destas bactérias aos

dentes, sugerindo seu uso na prevenção de

cáries.

Yee, Koo e Szeto (2002) verificaram

que pacientes com consumo alto de chá verde

apresentam baixa taxa de infecção por

Helicobacter pilori, quando comparados com

pacientes que consomem pouco ou nenhum

chá (45% e 74% respectivamente).

TAKABAYASHI et al. (2004) administraram

20 mg/mL de chá verde diariamente, durante

10 dias a cobaias infectados com H. pilori.

Após esse tempo, os estômagos eram retirados

e amostras cultivadas, obtendo assim a

contagem de unidades formadoras de colônias

(CFU). O numero de CFU diminuiu

significativamente após o tratamento,

sugerindo efeito antibacteriano do chá em

infecção por H. pilori.

Vários componentes do chá

apresentam atividade antibacteriana,

especialmente contra S. aureus resistentes a

meticilina (MRSA). Em 1999, SHIOTA et al.

demonstrou ação sinérgica do chá verde com

a oxacilina em S. aureus MRSA e em cepas

de bactérias produtoras de -lactamase. Este

fenômeno pode ser explicado pela prevenção

de síntese de proteínas ligantes de penicilina

(PBP2) e inibição de secreção de -

lactamases respectivamente. West et al.

(2001) também relataram a capacidade do chá

verde de inibir o crescimento de S. aureus

MRSA e MSSA. Hamilton-Miller e Shah

(2000) isolaram um novo princípio ativo,

patenteado e chamado por eles de composto

“P”, que mostrou atividade contra S. aureus

MRSA.

Existe uma relação direta entre a

estrutura química dos flavonóides e

catequinas e sua atividade antibacteriana.

Aparentemente, flavonóides e catequinas com

dihidroxilação nas posições 2’- 4’ ou 2’- 6’ no

anel B e dihidroxilação nas posições 5-7 no

anel A apresentam maior atividade

antibacteriana contra S. aureus MRSA

(STAPLETON. TAYLOR, 2002). Uma

possível explicação para estes dados é que as

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catequinas possuem capacidade de se

complexar com membranas lipoprotéicas,

principalmente ECG e EGCG que são

melhores incorporadas as membranas

fosfolipídicas. A ação de altas concentrações

das catequinas pode causar lesão as estruturas

da membrana celular, desestabilizando a

membrana levando a atividade antibacteriana

(CATURLA et al., 2003).

Lee et al. (2003) realizaram um estudo

com bactérias patogênicas incluindo S. aureus

MRSA, S. aureus resistente a ciprofloxacina,

Enterococcus resistente a vancomicina e de P.

aeruginosa resistente a ciprofloxacina e

obtiveram atividade antibacteriana em

concentrações de 1.6 mg/mL para todas as

bactérias testadas. Os resultados obtidos por

diferentes autores sugerem que a ação

antibacteriana do chá verde pode ser eficiente,

no entanto, há necessidade de maiores estudos

para definir sua aplicação segura como

fármaco e/ou como inibidor da atividade

enzimática das -lactamase e outras enzimas

responsáveis pela resistência aos

antimicrobianos.

Material e Métodos

Reagentes

Agar e Caldo Muller-Hinton, TSB e

TSA (Tryptose Soy Broth and Agar),

oxacilina, alcool etílico absoluto, folhas secas

de C. sinensis, bactérias padrão: E. coli ATCC

25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 70063

(produtora de -lactamase), Klebsiella

pneumoniae ATCC 13883, P. aeruginosa

ATCC 27853, S. typhimurium ATCC 14028,

S. aureus ATCC 25923 e Enterococcus

faecalis ATCC 23212, 22 cepas de S. aureus,

Dietilnitrosamina (DEN), Cloreto férrico

1mM (FeCl3), ácido ascórbico 1mM, butanol

pureza HPLC, tampão Fosfato de K+

monobásico com NaCl 0,9% 10mM, Ácido

Tiobarbitúrico 1% (TBA), Sulfato de Ferro

(FeSO4 1mM), Ácido Sulfúrico H2SO4

(1mM), Xilenol Laranja (1mM), Metanol

HPLC, Hidroperóxido de Cumeno (CHP),

Tampão fosfato de K+ monobásico com NaCl

0,9% 10mM, papa de hemácias humanas de

doadores saudáveis, ECV dissolvido em

solução tampão fosfato de K+ monobásico

com NaCl 0,9% 10mM com pH de 7,4

(27mg/mL).

Preparo do Extrato das Folhas de C.

sinensis

O extrato etanólico de chá verde

(ECV) foi preparado a partir de folhas secas

de C. sinensis, adquiridas da Quimer Ervas

Medicinais. O extrato foi filtrado em papel de

filtro e concentrado em rota vapor, sendo

posteriormente utilizado em diferentes

concentrações adequadas aos vários testes

realizados.

Animais

Foram utilizados ratos Wistar machos

(·200g), divididos em dois grupos (n=6),

grupo G1 (controle negativo) e grupo G2

tratado com dose única via oral de ECV (120

mg/Kg). Os animais foram alojados em

gaiolas com temperatura, umidade relativa do

ar e ciclo de luz controlados com dieta sólida

e líquida ad libitum. O sangue dos animais foi

coletado por punção cardíaca e o soro

separado através de centrifugação a 2.500rpm

por 15 min. Os animais foram sacrificados,

por deslocamento cervical, os fígados

retirados para dosagem de Malondialdeido

Acético (MDA), Complexo de Fe(III)-Xilenol

Laranja e estudo histopatológico (HWA et al.,

2000; JUN et al., 2002; BAHAR, TAWFEQ,

ABU, 2003).

Protocolo Experimental

No protocolo experimental para os

ratos tratados com dose única de ECV (120

mg/Kg), foram utilizados ratos Wistar machos

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(·200g), sendo divididos em dois grupos (n =

6), sendo o grupo G2 tratado com dose única

de ECV (120 mg/Kg) e sacrificado em 24 hs

após dose única de DEN (200mg/Kg).

Animais tratados com dose única de ECV (120 mg/Kg)

0 Horas 24 Horas

G 1 (Controle)

0 Horas 24 Horas

G 2 (ECV 120 mg/Kg de animal)

Sacrifício

Salina

ECV (120 mg/Kg de animal)

Teste de Susceptibilidade

Foram utilizadas 07 bactérias padrão:

E. coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae

ATCC 70063 (produtora de -lactamase),

Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, P.

aeruginosa ATCC 27853, S. typhimurium

ATCC 14028, S. aureus ATCC 25923 e

Enterococcus faecalis ATCC 23212. O ECV

foi adicionado ao agar Muller-Hinton (MHA)

fundido e resfriado a 40C e vertido em placa

de Petri estéril (Técnica de Pour-plate). O

crescimento bacteriano (na fase logarítmica)

obtido após 3 h a 36 C, foi diluído e

alíquotas de 10·l das diluições foram

dispersadas sobre a superfície do meio +

ECV, de forma a obter um numero de

colônias passíveis de contagem. Como

controle de crescimento das bactérias foi

utilizado MHA sem adição de ECV. Todos os

testes foram realizados em duplicata. A leitura

foi realizada após incubação a 36 C por 12

hs, comparando o numero de UFC das placas

com ECV em relação ao controle.

Teste de Susceptibilidade de S. aureus

Foram utilizadas 22 cepas S. aureus,

11 meticilina-resistente (MRSA) e 11

meticilina-sensível (MSSA). As amostras

foram isoladas de pacientes provenientes do

Hospital Universitário (HU) de Londrina. A

metodologia utilizada foi a do experimento

anterior.

Determinação do Efeito Bactericida e/ou

Bacteriostático do ECV

As amostras de S. aureus acima

citadas foram cultivadas em caldo Muller-

Hinton (MHB) acrescido de diferentes

concentrações de ECV, associado ou não a

oxacilina (6 g/mL). Os testes e os controles

foram incubados a 36 C por 12 hs. A

avaliação da inibição do crescimento foi

realizada por comparação com os controles

negativo (sem ECV) e positivo (com

oxacilina). Uma alíquota de cada tubo foi

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plaqueada em MHA sem extrato para verificar

a atividade bactericida ou bacteriostática do

ECV e se a associação com oxacilina alterou

estas propriedades. As placas foram incubadas

a 36 C por 12 hs.

Curva de Crescimento Bacteriano

Foram selecionadas as amostras 6R S.

aureus MRSA e 6S MSSA, para curva de

crescimento em TSB (Tryptose Soy Broth)

acrescido ou não de ECV (1.000 g/mL). O

inóculo das bactérias foi preparado na fase

logarítmica, obtido após cultivo por 3 h a 36

C, o inóculo foi diluído para se obter a

concentração de 2 x 106 CFU/mL, 1 mL desta

diluição foi inoculado em 149 mL de TSB,

mantido em banho-maria a 36 C com

agitação. Uma alíquota de 3 mL foi retirada

dos frasco em cada um dos tempos 0, 2, 4, 6 e

12 hs, sendo 1 mL desta alíquota diluída em

9mL de salina estéril, sendo realizadas

diluições seriadas.

Estas diluições foram semeadas em

placa de Petri com TSA (Tryptose Soy Agar)

estéril utilizando alça de Drigalsky, para

contagem de colônias viáveis. As placas

foram incubadas a 36 C por 12 hs. Os 2 mL

restantes da cultura foram levados para leitura

em espectrofotômetro (Varian 634 S) de

duplo feixe a 600nm, à temperatura ambiente,

obtendo a densidade óptica dos pontos da

curva de crescimento.

Determinação da Toxicidade Celular do

ECV em Hemácias Humanas

Foram utilizados dois frascos o

primeiro com 300L de papa de hemácia +

tampão fosfato (vol. final 30 mL), no segundo

papa de hemácia + tampão fosfato e 600L de

ECV (0,54 mg/mL de ECV). Uma alíquota de

3mL foi retirada a cada hora durante 6 hs, os

frascos ficaram em banho-maria a 37C, com

agitação de 7,5. A alíquota foi centrifugadas

por 5 min. a 2000rpm e o sobrenadante

retirado para leitura de hemólise em 540nm

(espectrofotômetro Varian 634 S) (ZHANG et

al., 1997; LENFANT, et al., 2000).

Dosagem das Enzimas AST e ALT

Analisaram-se as atividades das

enzimas aspartato e alanina aminotransferase

(AST/ALT) no soro dos animais através do

método de Reitman e Frankel (1957),

utilizando-se kits comerciais.

Dosagem de MDA

Os fígados pesados foram transferidos

para uma solução tampão fosfato de K+

monobásico com NaCl 0,9% 10mM na

proporção de 10mL de solução para cada 100

mg de fígado. Foram homogeneizados durante

30 seg. em homogeneizador ultra-turrax, sob

banho de gelo. O homogenato foi utilizado

para dosagem de MDA. O método de

dosagem de MDA foi utilizado para a

quantificação de lipoperóxidos formados.

A leitura da fase orgânica foi realizada

à temperatura ambiente em espectrofotômetro

(Varian 634 S) de duplo feixe de 535 a

572nm. Os níveis de lipoperoxidação são

expressos em nmoles de malondialdeído/g de

fígado (BUEGE, AUST, 1978; JENTZSCH et

al., 1990 modificado por CECCHINI et al.,

1990).

Dosagem de Xilenol Laranja

O método do Xilenol foi utilizado para

a quantificação de lipoperóxidos. Cada 100mg

de fígado foi homogeneizada em 10mL de

metanol HPLC, sob banho de gelo. Os tubos

foram centrifugados a 2.000g por 10 min em

centrifuga refrigerada (Janetzki K24), o

sobrenadante foi usado como amostra. Os

testes foram incubados por 24 h. a

temperatura ambiente. A leitura foi em 560nm

(Varian 634 S), após adicionou-se CHP e

incubado por 30 min. a temperatura ambiente

e ler novamente a 560nm. Os níveis de

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lipoperoxidação são expressos em nmoles de

CHP/g de fígado (HERMES-LIMA et al.,

1995).

Estudo Histopatológico em Fígado de Ratos

Os animais foram sacrificados por

deslocamento servical e os fígados removidos

e lavados com salina normal. Para o estudo

histopatológico foi utilizado um corte

transversal do lóbo medial, processado e

emblocados em parafina. Cortes de 5 m

foram feitos e posteriormente corados com

hematoxilina e eosina e observados ao

microscópio óptico.

Análise estatística

As análises descritivas de todas as

variáveis estudadas estão apresentadas como

média e o erro padrão da média (SE).

Empregando-se programa de análise

estatística computadorizada STATISTICA 6.0

(STAT SOFT), a comparação entre os grupos

foi realizada pela análise de variância

paramétrico (ANOVA), Teste T-Studant e

Teste de Tukey (HSD) para amostras

variáveis independentes. Todas as conclusões

estatísticas foram efetuadas em nível de 5%

de significância.

Resultados e Discussão

Na Tabela 1, podemos observar a ação

do ECV na inibição de crescimento das

bactérias padrão (104 UFC/mL), as bactérias

apresentam suscetibilidades diferentes ao

ECV, mesmo em doses diferentes o extrato

foi capaz de inibir o crescimento dessas

bactérias. O S. aureus, dentre as bactérias

testadas foi o mais sensível, apresentando

inibição total do crescimento na concentração

de 1.000 g/mL. Já a E. coli foi a mais

resistente sendo inibida parcialmente na

concentração de 4.000 g/mL, concentração

esta que inibiu totalmente as outras bactérias.

Pelos resultados observados o ECV

apresenta melhor atividade em bactérias gram

positivas, isso pode indicar que o fato da

diferença das paredes dessas bactérias esteja

diretamente associado ao mecanismo de ação

do ECV.

Um possível mecanismo de ação das

catequinas é devido a sua capacidade de se

ligar a peptídeos, pois a parede das bactérias

gram positivas são ricas em peptideoglicano e

em compensação a parede das gram negativas

ricas em lipopolissacarideos, e é

provavelmente devido a esta diferença que as

catequinas agem com maior eficiência em

bactérias gram positivas (ZHAO et al., 2001;

HU et al., 2001).

Devido a sua especial sensibilidade ao

ECV testes com concentrações menores foram

realizadas com cepas S. aureus MRSA e

MSSA. Os resultados se encontram na Tabela

2, onde pode se observar que o ECV é

aparentemente mais eficaz na inibição do

crescimento de bactéria MRSA, pois na

concentração de 750 g/mL 100% das

bactérias foram inibidas total ou parcial, já

todas as MSSA foram 100% resistentes ao

ECV, nestas concentrações, portanto a

Concentração Inibitória Mínima (MIC) foi de

750 g/mL para os MRSA e de 1.000 g/mL

para os MSSA.

O mecanismo de ação do ECV pode

ser através da desestabilização da sua parede

celular se ligando aos peptídeos, mas a

aparente ação especifica sobre MRSA, podem

estar diretamente ligado as alterações

encontradas na sua parede como a expressão

de PBP2 que é produzida pelo MRSA e que

permita esta bactéria “escapar” da ação do

oxacilina, por tanto as catequinas podem ter

uma ação mais especifica as bactérias que

expressem PBP2 (YAM et al., 1998).

Page 8: BIOPROSPECÇÃO DE MICRORGANISMOS PRODUTORES DE

19

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SCHMITZ, Wanderlei Onofre; ESTEVÃO, Dirceu; CECCHINI, Rubens et al.

Tabela 1 – Teste de inibição de crescimento de bactérias padrão. Foram utilizadas bactérias (104 UFC/mL), sendo o

ECV adicionado ao MHA em placa de Petri e alíquotas foram dispersadas sobre a superfície do MHA + ECV, os testes foram realizados em duplicata e o resultado foi por comparação com o controle negativo. (I - inibição total do

crescimento 100%; IP - inibição parcial do crescimento 99 -50%; R – Resistente inibição inferior a 50%)

Inibição do Crescimento de Amostras de S. aureus MSSA e MRSA em Presença de

Diferentes Concentrações de ECV

ECV

750 g/mL 1.000 g/mL 1.500 g/mL

Inibição Total (I) 0/11S

8/11R

3/11S

11/11R

11/11S

11/11R

Inibição Parcial (IP) 0/11S

3/11R

4/11S

0/11R

0/11S

0/11R

Resistência (R) 11/11S

0/11R

4/11S

0/11R

0/11S

0/11R

Tabela 2 - Teste de inibição de crescimento de S. aureus MRSA e MSSA. Foi utilizadas cepas isoladas de pacientes

do Hospital Universitário, (11-MRSA) e (11-MSSA), na concentração de 104 UFC/mL, sendo o ECV adicionado ao

MHA em placa de Petri e alíquotas foram dispersadas sobre a superfície do MHA + ECV, os testes foram realizados

em duplicata e o resultado foi por comparação com o controle negativo.

Inibição do Crescimento de Amostras de Bactérias Padrões em Presença de Diferentes

Concentrações de ECV

ECV

Bactérias 1.000 g/mL 2.000 g/mL 3.000 g/mL 4.000 g/mL 5.000 g/mL

Pseudomonas

aeruginosa

ATCC 27853

R

I

I

I

I

Escherichia

coli

ATCC 25922

R

IP

IP

I

I

Klebsiella

pneumoniae

ATCC 13883

IP

I

I

I

I

Klebsiella

pneumoniae

ATCC 70063

IP

IP

I

I

I

Staphylococcus

aureus

ATCC 25923

I

I

I

I

I

Salmonella

tiphymurium

ATCC 14028

IP

I

I

I

I

Enterococcus

faecalis

ATCC 23212

R

IP

IP

I

I

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20

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SCHMITZ, Wanderlei Onofre; ESTEVÃO, Dirceu; CECCHINI, Rubens et al.

0 2 4 6 8 10 12

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

bbb

b

a

a

a

a

A

a **

** ** **

CF

U / m

L (

log

10

)

Time (hr)

S

S + ECV

0 2 4 6 8 10 12

5

6

7

8

9

10

11

12

bbb

b

a

a

a

a

B

**

** ** **

a

CF

U / m

L (

log

10

)

Time (hr)

R

R + ECV

0 2 4 6 8 10 12

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

b

b

a

a

a

D

a

a

CF

U / m

L (

log

10)

Time (hr)

S

R

0 2 4 6 8 10 12

4,75

5,00

5,25

5,50

5,75

6,00

6,25

C

aaaa

ba

CF

U / m

L (

log

10

)

Time (hr)

S + ECV

R + ECV

Pelos resultados já obtidos sabe-se que

o ECV age muito bem sobre o S. aureus, mas

para saber se ter uma visão mais dinâmica de

como seria este efeito optou-se por uma Curva

de Crescimento Bacteriano (Fig. 1). Para a

curva selecionou se uma cepa de cada grupo

(6R/6S). As bactérias foram inoculadas em

TSB acrescido ou não de ECV. Uma alíquota

foi retirada nos tempos 0, 2, 4, 6 e 24 hs, estas

alíquotas foram diluída e semeadas em TSA,

para contagem de colônias viáveis. As curvas

de crescimento marcadas com a letra a e b

demonstram claramente serem diferentes

entre si e o efeito bacteriostático do ECV

sobre as cepas bacterianas, foi

estatisticamente significativo (** p<0,01). O

ECV inibe o crescimento das bactérias, mas

aparentemente não tem capacidade bactericida

sobre as bactérias testadas, este fato

confirmaria a ação das catequinas como

agentes desestabilizadores que impediriam a

divisão das bactérias, mas não seria capaz de

provocar sua morte.

Figura 1 - Curva de Crescimento Bacteriano Associado ou Não ao ECV. Foram selecionadas S. aureus MRSA e MSSA (2 x 106 CFU/mL), que foram inoculadas em 149 mL de TSB (Tryptose Soy Broth) acrescido ou não de ECV

(1.000 g/mL). Uma alíquota foi retirada nos tempos 0, 2, 4, 6 e 12 hs. Sendo semeadas para contagem de colônias viáveis. A Curva de crescimento da cepa S. aureus 6S em presença e ausência de ECV. B Curva de crescimento da

cepa S. aureus 6R em presença e ausência de ECV. C Curva de crescimento da cepa S. aureus 6S e 6R na presença

de ECV. D Curva de crescimento da cepa S. aureus 6S e 6R na ausência de ECV. (** p<0,01, os pontos das curvas

marcadas com a letra a e b são diferentes entre si).

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Determinação do Efeito Bactericida e/ou Bacteriostático do ECV Associado a Oxacilina (6 g/mL) em S.

aureus MRSA

ECV Oxacilina

(6 g/mL)

1.000 g/mL

+ Oxa. 6 g/mL

1.500 g/mL

+ Oxa. 6 g/mL

Inibição Total (I)

0/11R

3/11R

9/11R

Inibição Parcial (IP)

0/11R

7/11R

2/11R

Resistência (R)

11/11R

0/11R

0/11R

Tabela 3 - Determinação do efeito bactericida e/ou bacteriostático. As amostras de S. aureus MRSA (104

UFC/mL) foram cultivadas em (MHB) com ECV, associado ou não a oxacilina (6 g/mL). A avaliação da inibição do crescimento foi realizada por comparação com os controles negativo (sem ECV) e positivo (com oxacilina). Uma

amostra de cada tubo foi plaqueada em MHA para verificar a atividade bactericida ou bacteriostática.

0 1 2 3 4 5 6

0

4

8

12

16

20

24

aa

aa **

bb b b

b

a

aa

a

a

He

mo

lis

e (

% )

Tempo ( hrs )

Tampao

ECV + Tampao

Figura 2- Teste de toxicidade do ECV em hemácias humanas de doadores saudáveis. Foram utilizados dois frascos,

o primeiro com hemácia + tampão fosfato e no segundo foi acrescentado ECV (0,54 mg/mL), de onde se retirou uma

alíquota a cada hora para testar uma possível ação hemolítica do ECV através de geração de radicais livres (**

p<0,01, os pontos das curvas marcadas com a letra a e b são diferentes entre si).

Devido aos resultados anteriores, ficou

claro a necessidade de confirma o efeito

bacteriostático do ECV, e se sua associação

com oxacilina poderia alterar estes resultados.

Portanto, S. aureus MRSA (104 UFC/mL)

foram cultivadas em MHB, com diferentes

concentrações de ECV, associado ou não a

oxacilina (6 g/mL). As amostras foram

plaqueadas (MHA) para verificar a atividade

bactericida ou bacteriostática de ECV

associado ou não com oxacilina. Os resultados

confirmaram que a ação do ECV

isoladamente é bacteriostática, pois inibia o

crescimento das bactérias em caldo, mas ao

serem plaqueadas em MHA, elas voltavam a

crescer. Já ao ser associado a oxacilina o

extrato passou a ter um efeito bactericida,

sendo capaz de eliminar as bactérias no caldo,

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que ao serem plaqueadas mostraram uma

diminuição no número de bactérias (Tabela

3). A resistência a oxacilina isoladamente

pelos MRSA é devido a produção de -

lactamase, (todas as cepas testadas produzem

-lactamase), portanto um mecanismo

possível de explicar a ação da oxacilina em

bactérias resistentes é que as catequinas

podem agir sobres as enzimas -lactamase,

inibindo sua ação e com isso possibilitando a

ação da oxacilina nas bactérias (YAM et al.,

1998). Outro dado interessante encontrado por

Stapleton et al. (2004), é que dentre as

catequinas do chá verde a ECG é a mais

eficiente na capacidade de modular a ação das

-lactamase e que o EGCG e a segunda

catequina em eficiência, estes dados podem

estar diretamente relacionados com a

capacidade destas catequinas de se

incorporarem na membrana celular, Caturla et

al. (2003) descreveram esta capacidade das

catequinas se incorporarem em membranas

celulares e que ECG e depois EGCG eram as

catequinas que mais profundamente se

incorporavam as membranas celulares.

G1 (AST) G2 (AST) G1 (ALT) G2 (ALT)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

b

a

b

a

U/L

Grupos de Animais

AST / ALT

Figura 3- A dosagem das atividades enzimáticas da AST e ALT. O grupo G1 é o controle negativo e o G2 foi

tratado com dose única de ECV (120mg/Kg). O sangue dos animais foi coletado por punção cardíaca e as atividades

das enzimas foram analisadas através do método de Reitman e Frankel (1957), utilizando-se kits comerciais (os

grupos marcados com a letra a e b são semelhantes entre si) (n = 6).

Demonstrada a capacidade do ECV de

agir sobre bactérias, é importante saber se o

extrato pode apresentar afeitos tóxicos, pois

agentes antioxidantes podem se auto-oxidar e

gerar radicais livres, que podem levar a lesões

celulares importantes. Na Fig. 2 o ECV foi

incubado com hemácias humanas durante 6

hs, para testar uma ação hemolítica através de

geração de radicais livres. Tendo, na verdade

aparentemente protegido as hemácias contra a

hemólise provocada pelo tampão fosfato, que

pode ser visualizado na curva a. Isso pode

ocorrer devido a capacidade das catequinas de

se ligarem a membrana citoplasmática das

células e com isso estabilizando estas

estruturas inibindo assim a hemólise causada

pelo tampão fosfato (** p<0,01, os pontos das

curvas marcadas com a letra a e b são

diferentes entre si). Portanto, as catequinas

aparentemente não geram radicais livres com

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Interbio v.11 n.2, Jul-Dez, 2017 - ISSN 1981-3775

SCHMITZ, Wanderlei Onofre; ESTEVÃO, Dirceu; CECCHINI, Rubens et al.

23

grande facilidade, pois se gerassem radicais

livres, estes teriam lesionado as membranas

dos eritrócitos e provocando a hemólise,

assim a geração de radicais livres pelas

catequinas não aparenta ser um dos principais

mecanismo de ação das catequinas em

bactérias por exemplo, pois para a geração de

livres pelas catequinas seria necessário a

presença de ferro para ocorrer a reação de

Fenton e com isso gerar radicais livres

(hidroperoxidos) (ARAKAWA et al., 2004;

NAKAGAWA et al., 2004).

Figura 4 – Dosagem de MDA (A) e Xilenol Laranja (B)dos grupos G1 e G2. O grupo G1 é o controle negativo e o

G2 foi tratado com dose única de ECV. Os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical e seus fígados

retirados para preparo do homogenato com 100 mg de fígado (os grupos marcados com a letra a são semelhantes

entre si) (n = 6).

Figura 5 – Estudo Histopatológico do Fígado dos Ratos. Corte G1 da região centro-lobular do fígado dos animais

controles normais, não demonstrando alteração patológica do tecido observado. Corte G2 é da região centro-lobular

do fígado dos animais tratados com dose única de ECV, demonstrando claramente alteração patológica de

degeneração reversível no tecido observado. Coloração de hematoxilina e eosina no aumento de 100X e no quadro

em destaque aumento de 400X no microscópio óptico.

G1 G2

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

A

a

a

MD

A (

nm

ol/

g F

igad

o)

Grupos de Animais

MDA

G1 G2

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

B

aa

Xil

en

ol

( n

mo

l C

HP

/g F

igad

o)

Grupos de Animais

Xilenol

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SCHMITZ, Wanderlei Onofre; ESTEVÃO, Dirceu; CECCHINI, Rubens et al.

O próximo passo foi utilizar o ECV

em um experimento com ratos tratados com

dose única de ECV, para avaliar a lesão

celular hepática. Para avaliar a extensão do

dano celular dosou-se AST/ALT, na

peroxidação de lipídio avaliou-se MDA e

Xilenol e o Histopatológico foi utilizado para

demonstrar qualquer alteração da morfologia

celular. Na Fig 3, temos a dosagem das

enzima AST e ALT, onde os grupos marcadas

com a mesma letra a e b são semelhantes

entre si.

Na Fig.4 A temos a dosagem de MDA

que também não demonstrou diferenças

estatisticamente significativas entre os grupos,

indicando não haver lipoperoxidação nos

hepatócitos tratados com ECV nesta

concentração, portanto o ECV não foi capaz

de gerar radicais livres na Fig. 4 B a dosagem

do Xilenol apresentou resultados semelhantes

entre si, estes resultados vem corroborar com

os resultados da curva de hemólise indicando

que não houve formação de radicais livres e

lipoperoxidação das membranas celulares

tratadas com ECV, (todos os grupos marcadas

com a mesma letra a são semelhantes entre

si).

Na Fig. 5 temos o corte G1 da região

centro-lobular do fígado dos animais controles

normais, não demonstrando alteração

patológica do tecido observado. Já na Fig. 5 o

corte G2, temos a região centro-lobular do

fígado dos animais tratados com dose única de

ECV, demonstrando claramente alteração

patológica de degeneração reversível no

tecido observado. Fica claro que doses

elevadas de ECV podem alterar a morfologia

das células hepáticas, provavelmente devido a

capacidade das catequinas de se ligarem a

membrana plasmática das células

desestabilizando estas estruturas e levando a

alterações estruturais e causando

degenerações reversíveis, mas estas alterações

são consideradas reversíveis e é até

relativamente comum encontrar lesões desse

tipo em animais que usam doses terapêuticas

de medicamentos de uso corriqueiro como por

exemplo o paracetamol.

Conclusão

Estes estudos sugerem que o ECV

apresentada boa atividade antibacteriana

contra todas as bactérias testas,

principalmente as gram positivas,

provavelmente devido a capacidade das

catequinas do ECV de se ligarem aos

peptideoglicanos que são encontrados na

parede das bactérias gram positivas. Sendo

sua atividade bacteriostática frente às

bactérias testadas, mas quando associado a

oxacilina passou a ter atividade bactericida

frente as cepas de S. aureus MRSA. Um

possível mecanismo que explicar esta ação da

oxacilina em bactérias resistentes é que as

catequinas podem agir sobres às enzimas -

lactamase, inibindo sua ação e com isso

possibilitando a ação da oxacilina nas

bactérias e a uma aparente ação mais eficiente

sobre MRSA, podem estar relacionada com a

expressão de PBP2, indicando uma afinidade

maior a estas bactérias. Além de que o ECV

apresentou baixa toxicidade, o extrato vegetal

do chá verde ou seus componentes podem ser

compostos promissores no tratamento e na

prevenção de patologias de fundo bacteriano.

Com os resultados obtidos esperamos que no

futuro possa-se determinar um possível

emprego deste composto como adjuvante no

tratamento de infecções bacterianas,

especialmente pelo S. aureus MRSA.

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