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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA,
NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Diversidade e bioprospecção de fungos associados às
macroalgas antárticas Monostroma hariotti Gain e
Porphyra endiviifolia (A. Gepp & E.S Gepp) Y.M.
Chamberlain
Laura Esteves Furbino
Ouro Preto
2012
Diversidade e bioprospecção de fungos associados às macroalgas
antárticas Monostroma hariotti Gain e Porphyra endiviifolia (A.
Gepp & E.S Gepp) Y.M. Chamberlain
Laura Esteves Furbino
Laura Esteves Furbino
Diversidade e bioprospecção de fungos associados às macroalgas
antárticas Monostroma hariotti Gain e Porphyra endiviifolia (A.
Gepp & E.S Gepp) Y.M. Chamberlain
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Biotecnologia, Núcleo de Pesquisa em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como
requisito parcial à obtenção do título de Mestre em
Biotecnologia.
Área de concentração: Biotecnologia Aplicada a
Processos
Linha de pesquisa: Bioprospecção de fungos
Orientador: Luiz Henrique Rosa
Co-orientador: Carlos Augusto Rosa
Ouro Preto, Minas Gerais
2012
Catalogação: [email protected]
F983D FURBINO, LAURA ESTEVES.
Diversidade e bioprospecção de fungos associados às macroalgas antárticas Monostroma
hariotti Gain e Porphyra endiviifolia (A. Gepp & E.S Gepp) Y. M. Chamberlain [manuscrito] /
Laura Esteves Furbino - 2012.
ix, 64f.: il., color; grafs.; tabs.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Henrique Rosa.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto.
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.
Área de concentração: Biotecnologia Aplicada a Processos e
ao Tratamento de Doenças.
1. Antártida - Teses. 2. Antártica (Região) - Teses. 3. Bioprospecção - Teses. 4. Fungos -
Teses. 5. Alga - Teses. 6. Biodiversidade - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II.
Título.
CDU: 582.26/.28(292.3)
Colaboradores:
1Carlos Leomar Zani
2Franciane Maria Pellizzari
3Nair Sumie Yokoya
4Tânia Maria de Almeida Alves.
1Laboratório de Química de Produtos Naturais. Centro de Pesquisa René Rachou, Fundação
Oswaldo Cruz. Belo Horizonte, Minas Gerais.
2Laboratório de Ficologia e Qualidade de Água do Mar (LAQUAMAR). Universidade
Estadual do Paraná. Paranaguá, Paraná.
3Instituto de Botânica, Secretaria de Estado do Meio Ambiente, Seção de Ficologia.
Universidade de São Paulo. São Paulo, São Paulo.
4Laboratório de Química de Produtos Naturais. Centro de Pesquisa René Rachou, Fundação
Oswaldo Cruz. Belo Horizonte, Minas Gerais.
i
AGRADECIMENTOS
À Deus, tão fiel mesmo tendo filhos tão infiéis. À Umbanda por me devolver a crença e a
espiritualidade. Às entidades pelas palavras simples mas nem por isso menos sábias.
Aos meus pais pela certeza do amor e por apoiarem as minhas escolhas.
A Ni, pelo privilégio de se ter duas mães.
Aos meus irmãos, Rena e Fá, pela relação que transcende os laços sanguíneos.
Ao meu marido, meu amor e melhor amigo.
Aos meus familiares, avó, tios e primos pela torcida.
Ao orientador Luiz Henrique Rosa agradeço pelo exemplo, paciência e credibilidade.
Obrigada por estar sempre presente e por ter me confiado um projeto de grande
responsabilidade.
Ao Carlos Augusto Rosa pela co-orientação, disponibilidade e acolhida. Obrigada pelos
ensinamentos.
À Silvana Queiroz e Susana Johann, por aceitarem compor a banca.
Aos amigos do laboratório de Biodiversidade, Taxonomia e Biotecnologia de Fungos pela
acolhida, e pela oportunidade de aprendizado e convivência.
Ao CNPq pela bolsa de mestrado concedida. A FAPEMIG pelo apoio financeiro;
Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Ouro Preto.
Aos amigos da biologia e às flores...é sempre bom contar com vocês.
Obrigada a todos pela torcida e orações! Que Deus retribua à vocês um caminho de muita paz
e luz.
ii
RESUMO
A produção de metabólitos bioativos por fungos marinhos têm sido alvo de grande interesse
por diferentes grupos de pesquisa, uma vez que os oceanos cobrem mais de 70% da superfície
da Terra e constituem um ambiente relativamente pouco explorado em relação à diversidade
biológica e química das comunidades microbianas. Os estudos sobre fungos associados às
macroalgas antárticas são escassos e muitas das espécies algícolas são endêmicas e/ou
adaptadas a essa região, podendo constituir uma fonte atrativa de novas espécies e metabólitos
de interesse biotecnológico. Os gêneros Porphyra C. Agardh e Monostroma Thuret incluem
espécies de grande importância econômica, utilizadas na indústria alimentícia, cosmética e
farmacêutica em vários países. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi conhecer a
diversidade de fungos associados às macroalgas Monostroma hariotti Gain e Porphyra
endiviifolia (A. Gepp & E.S Gepp) Y.M. Chamberlain ao longo de um gradiente latitudinal
em ilhas antárticas e avaliar o potencial destes fungos em relação à produção de metabólitos
com atividade biológica. As macroalgas foram coletadas nas Ilhas Elefante, Rei George e
Deception. Para isolamento dos fungos foram coletados fragmentos de 390 espécimes de
macroalgas. As amostras foram obtidas em substratos rochosos localizados na região entre
marés. Para o isolamento dos fungos foram utilizados fragmentos dos talos das algas, os quais
foram inoculados em placas de Petri contendo o meio Agar Marinho. No total foram obtidos
278 isolados de fungos; destes, 149 fungos filamentosos e 129 leveduras. Os isolados foram
agrupados em morfoespécies a partir das características macromorfológicas e confirmados
posteriormente por meio da técnica molecular de microsatélite utilizando o iniciador GTG’5.
Um representante de cada morfoespécie foi identificado por meio de sequenciamento de
regiões ITS e dos domínios D1/D2 do gene do rRNA para os fungos filamentosos e leveduras,
respectivamente. As espécies identificadas pertencem aos gêneros Antarctomyces,
Aspergillus, Cadophora, Candida, Cystofilobasidium, Cryptococcus, Geomyces,
Guehomyces, Meyerozyma, Metschnikowia, Oidiodendron, Penicillium, Rhodotorula e
Verticillium. Os estudos de diversidade indicaram que a composição da comunidade fúngica
das macroalgas são pouco similares e, também, que as espécies fúngicas apresentam baixa
especificidade quanto ao hospedeiro. Todos os fungos obtidos foram cultivados em Agar
marinho para obtenção dos extratos brutos, os quais foram avaliados quanto a atividade
antimicrobiana utilizando como alvo os micro-organismos: Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Candida albicans, C. krusei e Cladosporium sphaerospermum. Dos 218 extratos
iii
avaliados, oito apresentaram atividade antimicrobiana; destes, seis contra C. krusei, um contra
C. albicans e um contra C. sphaerospermum. O extrato do fungo Geomyces pannorum
UFMGCB 5987 apresentou atividade antimicrobiana considerada promissora (95,2%) frente
aos esporos de C. sphaerospermum. Além dos ensaios antimicrobianos os fungos foram
avaliados quanto à capacidade de degradar amido, carboximetilcelulose, xilana, proteína
(caseína) e éster. Setenta e um por centos dos isolados apresentaram pelo menos um tipo de
atividade enzimática, sendo a esterásica predominante (68%), seguida pelas atividades
amilásica (43%), proteásica (38%), celulolítica (13%) e xilanolítica (0,16%). Os resultados
obtidos neste trabalho sugerem a presença de uma comunidade de fungos adaptada às
condições extremas da Antártica, a qual pode exercer um papel ecológico significativo na
decomposição de matéria orgânica e na ciclagem de nutrientes; além disso, alguns destes
fungos podem representar uma fonte promissora de metabólitos bioativos de interesse
biotecnológico.
.
iv
ABSTRACT
The production of bioactive metabolites marine fungi have been of great interest by different
research groups because the oceans cover more than 70% of the surface and form a relatively
unexplored in relation to the diversity chemical and biological of microbial communities.
Studies on fungi in Antarctic seaweeds are scarce and many species algicolous are endemic
and/or adapted to this region may constitute an attractive source of new species and
metabolites of biotechnological interest. The genus Porphyra C. Agardh and Monostroma
Thuret include species of great economic importance, used in the food industry, cosmetics and
pharmaceuticals in various countries. In this context, the objective of this study was to
understand the diversity of algicolous fungi from Monostroma hariotti Gain and Porphyra
endiviifolia (A. Gepp & ES Gepp) YM Chamberlain along a latitudinal gradient in Antarctic
islands and evaluate the potential of these fungi for the production of metabolites with
biological activity. The algae were collected in the Islands Elephant, King George and
Deception. For isolation of fungi were collected fragments of 390 specimens of algae. The
samples were obtained on substrates located in the rocky intertidal region. To isolate the fungi
used were fragments of the stems of the seaweed, which were inoculated onto petri dishes
containing Marine Agar. In all 278 isolates were obtained from fungi, of which, 149
filamentous fungi and yeasts 129. The isolates were grouped into morphospecies from the
morphological features and later confirmed by the technique of molecular microsatellite
GTG'5 using primer. One representative from each morphospecies was identified by
sequencing ITS regions and domains D1/D2 rRNA gene for yeasts and filamentous
respectively. The species identified belong to the genera Antarctomyces, Aspergillus,
Cadophora, Candida, Cystofilobasidium, Cryptococcus, Geomyces, Guehomyces,
Meyerozyma, Metschnikowia, Oidiodendron, Penicillium, Rhodotorula and Verticillium. The
diversity studies indicated that the composition of the fungal seaweeds are somewhat similar,
and also that the fungal species and have low specificity to the host. All fungi obtained were
cultured in marine agar to obtain the crude extracts, which were evaluated for antimicrobial
activity using target microorganisms: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida
albicans, Candida krusei and Cladosporium sphaerospermum. Of the 218 extracts evaluated,
eight had antimicrobial activity, six against C. krusei, one against against C. albicans and one
against C. sphaerospermum. The extract of the fungus Geomyces pannorum UFMGCB 5987
had considered promising antimicrobial activity (95.2%). The fungi were tested for their
capacity to degrade starch, carboxymethyl cellulose, xylan, protein (casein) and ester.
Seventy-one per cent of isolates had at least one type of enzyme activity, being the esterase
predominant (68%), followed by amylase activity (43%), protease (38%), cellulolytic (13%)
and xylanolytic (0, 16%). The present results suggest the presence of a fungal community
adapted to extreme conditions of Antarctica, which may play a significant ecological role in
the decomposition of organic matter and nutrient cycling, in addition, some of these fungi
may represent a promising source of bioactive metabolites of biotechnological interest.
v
SUMÁRIO LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS....................................................................................................vi
LISTA DE FIGURAS..........................................................................................................................................viii
LISTA DE TABELAS............................................................................................................................................ix
1 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA ................................................................................................................ 1
2 REVISÃO DA LITERATURA.......................................................................................................................... 2
2.2 ANTÁRTICA ................................................................................................................................................ 2 2.3 MACROALGAS ANTÁRTICAS ....................................................................................................................... 3
2.3.1 Monostroma hariotti Gain ............................................................................................................... 4 2.3.2 Porphyra endiviifolia (A. Gepp & E.S Gepp) Y.M. Chamberlain .................................................... 4
2.4 DIVERSIDADE DE FUNGOS NA ANTÁRTICA ................................................................................................. 5 2.4.1 Fungos algícolas.............................................................................................................................. 6
2.4.1.1 Fungos marinhos como fontesde metabólitos biotivos .................................................................... 8 2.4.1.2 Fungos marinhos como fonte de enzimas ...................................................................................... 11
3 OBJETIVOS ..................................................................................................................................................... 12
3.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................................................................... 12 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................................................. 12
4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................................. 13
4.1 COLETAS DAS MACROALGAS ....................................................................................................................... 13 4.2 ISOLAMENTO E PRESERVAÇÃO DOS FUNGOS ............................................................................................ 15 4.3 CULTIVO DOS FUNGOS E PREPARO DOS EXTRATOS ................................................................................... 15
4.3.1 Fungos filamentosos ...................................................................................................................... 15 4.3.2 Leveduras ...................................................................................................................................... 16
4.4 ENSAIOS ANTIMICROBIANOS .................................................................................................................... 16 4.4.1 Determinação da atividade antifúngica ........................................................................................ 16 4.4.2 Determinação da atividade antibacteriana ................................................................................... 18
4.5 ENSAIOS ENZIMÁTICOS ............................................................................................................................ 19 4.6 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS ................................................................................................................... 20
4.6.1 Extração do DNA total dos fungos filamentosos ........................................................................... 20 4.6.2 Extração do DNA total das leveduras ........................................................................................... 21 4.6.3 PCR com iniciador (GTG)5 ........................................................................................................... 22
4.7 OBTENÇÃO DOS AMPLICONS .................................................................................................................... 22 4.7.1 Purificação dos amplicons ............................................................................................................ 23 4.7.2 Reação de sequenciamento ............................................................................................................ 24 4.7.3 Precipitação da reação de sequenciamento .................................................................................. 24 4.7.4 Análise computacional das sequências .......................................................................................... 25 4.7.5 Diversidade da comunidade fúngica: abundância, riqueza e equitabilidade ................................ 25
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................................................................... 26
5.1 COLETA E ISOLAMENTO DOS FUNGOS ALGÍCOLAS .................................................................................... 26 5.2 CULTIVO E OBTENÇÃO DOS EXTRATOS ETANÓLICOS ................................................................................ 28 5.3 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS ................................................................................................................... 28 5.4 DIVERSIDADE DA COMUNIDADE FÚNGICA ALGÍCOLA ............................................................................... 34 5.4 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA .................................................................................. 45 5.5 ATIVIDADE ENZIMÁTICA EXTRACELULAR ................................................................................................ 51
6 CONCLUSÕES .......................................................................................................................................... 54
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................................................ 55
vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AM: agar marinho
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool
CM: caldo marinho
cm: centímetro
CTAB: Brometo de cetil trimetilamonio
DMSO: Dimetilsulfóxido
DNA: Ácido desoxirribonucléico
dNTP: Desoxirribonucleotídeos fosfatados
EACF: Estação Antártica Comandante Ferraz
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético
EUA: Estados Unidos da América
g: grama
g/L: grama por litro
GPS: Global Positioning System
h: Hora
H2O: água
HCl: Ácido clorídrico
ICB: Instituto de Ciências Biológicas
IRR/FIOCRUZ: Instituto René Rachou/Fundação Oswaldo Cruz
ITS: Região transcrita interna
KH2PO4: Dihidrogenofosfato de potássio
LBEM: Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular
LQPN: Laboratório de Química de Produtos Naturais
m: metro
M: molar
MgCl2: cloreto de magnésio
MgSO4: Sulfato de magnésio
mg: miligrama
mg/mL: miligrama/mililitro
min: Minuto
vii
mL: Mililitro
mm: Milímetro
mM: Milimolar
mol/L : mol por litro
MTT: Brometo Tiazolil Azul de Tetrazólico
μg: Micrograma
μg/mL: micrograma/mililitro
μl: Microlitro
Na2HPO4: dihidrogenofosfato de sódio
NaCl: Cloreto de sódio
NCBI: National Center for Biotechnology Information
ng: nanograma
nm: Nanômetro
PCR: Reação em cadeia da polimerase
PEG: polietilenoglicol
pH: potencial hidrogeniônico
p.p.m: partes por milhão
pmol: Pico mol
p/v: peso por volume
rRNA: RNA ribossomal
r.p.m.: Rotações por minuto
s: Segundo
SDS: Dodecil sulfato de sódio
TBE: Tris borato
U: Unidade
UFMG: Universidade Federal de Minas Gerais
UFMGCB : Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de Minas
Gerais
UFOP: Universidade Federal de Ouro Preto
V: Volts
% : por cento
ºC: graus Celsius
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Monostroma hariotti Gain em substratos rochosos antárticos. ............................. 4
Figura 2 Porphyra endiviifolia (A. Gepp & E.S Gepp) Y.M. Chamberlain em substratos
rochosos antárticos. .......................................................................................................... 5
Figura 3 Estruturas moleculares (A) cefalosporina C e (B) ziconotida. .............................. 9
Figura 4 Modelo da disposição dos extratos e controles na placa de 96 poços utilizada
nos ensaios antifúngicos. ................................................................................................ 18
Figura 5 Modelo da disposição dos extratos e controles na placa de 96 poços utilizada
nos ensaios antibacterianos. ........................................................................................... 19
Figura 6 Fungos isolados das macroalgas antárticas Monostroma hariotti e Porphyra
endiviifolia. ...................................................................................................................... 26
Figura 7 Porcentagem de fungos isolados por área de coleta. ............................................ 27
Figura 8 Dendograma representando a similaridade entre a comunidade fúngica de
Porphyra endiviifolia das três ilhas antárticas. DE, Deception; EL, Elefante; RG,
Rei George. ...................................................................................................................... 42
Figura 9 Dendograma representado a similaridade da comunidade fúngica entre as ilhas
antárticas. DE, Deception; EL, Elefante; RG, Rei George. ......................................... 43
Figura 10 Dendograma representando a similaridade fúngica entre a comunidade
fúngicas de Monostroma hariotti das três ilhas antárticas. DE, Deception; EL,
Elefante; RG, Rei George. .............................................................................................. 44
Figura 11 Esquema representando o número de táxons compartilhados. ........................ 45
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Localização, número de espécimes, dados físico-químicos da água e
coordenadas onde Porphyra endiviifolia e Monostroma hariotti foram coletadas. .... 14
Tabela 2 Número de isolados de fungos algícolas obtidos por macroalgas e áreas de
coleta. ............................................................................................................................... 27
Tabela 3 Identificação molecular dos fungos algícolas, por meio da análise das
sequências da região ITS e dos domínios D1/D2 do gene do rRNA. .......................... 30
Tabela 4 Número de isolados e porcentagem de abundância dos fungos isolados. .......... 37
Tabela 5 Dados físico-químicos, abundância e diversidade dos fungos associados às
macroalgas Porphyra endiviifolia e Monostroma hariotii coletadas nas ilhas
antárticas. ........................................................................................................................ 39
Tabela 6 Atividade antimicrobiana dos extratos brutos obtidos dos fungos associados às
macroalgas antárticas. ................................................................................................... 49
Tabela 7 Atividade enzimática extracelular dos fungos algícolas. ..................................... 53
ii
1 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
Apesar das condições extremas e desafiadoras à sobrevivência dos organismos, o continente
antártico é conhecido por abrigar micro-organismos extremófilos em seus diferentes habitats,
como solo, rochas, lagos, aves, mamíferos e plantas. Embora nos últimos anos tenha
aumentado os estudos sobre micro-organismos nos ecossistemas antárticos e os estudos sobre
fungos derivados do ambiente marinho, a diversidade microbiana de fungos associados às
macroalgas é praticamente desconhecida. As algas desempenham um papel importante na
vida costeira marinha, na ciclagem de nutriente e na produção de metabólitos bioativos. Para
uma melhor compreensão sobre as macroalgas marinhas é necessário entender as interações
com outros componentes do ecossistema, tais como os fungos. Informações sobre a
diversidade e natureza das associações com os fungos são muito limitadas.
A evolução e sobrevivência destes fungos constantemente expostos a condições
extremas resultaram na seleção de organismos com diferentes níveis de adaptação e
possivelmente produtores de substâncias únicas com funções ecológicas diversas o que os
torna alvos promissores em estudos biotecnológicos. Por serem adaptados a condições
extremas, os fungos antárticos podem apresentar vias bioquímicas diferenciadas em
comparação com espécies presentes em ambientes tropicais e temperados e serem capazes de
produzir substâncias únicas como, por exemplo, enzimas ativas a baixas temperaturas; ou
ainda, a produção de metabólitos secundários bioativos, os quais podem ser utilizados como
protótipos para novos fármacos. Desta forma, o estudo da diversidade e potencial biotecnológico
da comunidade de fungos associados à macroalgas da Antártica é de grande importância para
ampliar as informações taxonômicas, distribuição biogeográfica e uso biotecnológico destes
micro-organismos extremófilos.
2
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Antártica
A Antártica é o continente mais meridional do planeta, localizado quase inteiramente dentro
do Círculo Polar Antártico. Possui uma superfície de 14 milhões de Km2, equivalente a 1,6
vezes a área do Brasil ou 10% das áreas emersas do globo. Seu território é circundado por um
tempestuoso oceano com milhares de icebergs e por onde se formam plataformas de gelo que
confundem com o contorno continental (BISCHOFF, 1996; FERREIRA, 2009). Compreende
um dos ambientes mais extremos da Terra. É um continente remoto e inóspito e o clima é o
mais frio e seco conhecido no planeta. Os ventos ultrapassam a velocidade de 100 km/h e a
temperatura anual varia de 15˚C no verão a -80˚C no inverno (CHILD & KELLY, 1990;
FERREIRA; 2009).
O continente Antártico é caracterizado pelo isolamento geográfico e climático e a
maior parte possui pouca ou nenhuma influência antrópica (RUISI et al., 2007; BRUNATI et
al., 2009). As condições que prevalecem são de baixas temperaturas, ciclos de congelamento
e degelo, alta incidência de radiação ultravioleta, baixa precipitação anual, fortes ventos e
baixa disponibilidade de água (ONOFRI et al., 2007; RUISI et al., 2007; SHIVAJI &
PRASAD, 2009), fatores considerados limitantes para a vida animal e vegetal (ONOFRI et
al., 2007).
Apesar das condições extremas encontradas, diferentes formas de vida estão presentes
no continente Antártico como bactérias, fungos, invertebrados, aves e mamíferos (RUISI et
al., 2007; ROSA et al., 2009; SHIVAJI & PRASAD, 2009). A fauna inclui mamíferos e aves
aquáticas. O animal mais importante para a cadeia alimenta é o krill, que alimenta baleias,
focas, pinguins e aves da região (CLARCK, 2005). A flora antártica é considerada primitiva e
as condições climáticas e a pouca espessura do solo dificultam a sobrevivência da maioria dos
vegetais. Por isso, a diversidade de espécies no continente é limitada a duas angiospermas,
Colobanthus quitensis e Deschampsia antarctica, e musgos. Por outro lado, o ambiente
marinho é ideal para proliferação de algas (BISCHOFF, 1996).
3
2.2 Macroalgas antárticas
As macroalgas são organismos multicelulares clorofilados que apresentam ampla distribuição
nas regiões litorâneas de todo o planeta (SILVA et al., 2008; GAMAL, 2010). De hábito
predominantemente aquático, podem apresentar-se como formas móveis ou sésseis, em
condição de vida livre ou em forma de colônias, com espécies epífitas ou parasitas. A grande
maioria das algas vive fixa a um substrato sólido, tais como rochas ou corais mortos, embora
algumas espécies apresentem adaptações para crescerem sobre o substrato não consolidado
como fundos areno-lodosos (SILVA et al., 2008). Elas representam uma parte altamente
produtiva do ecossistema marinho; além disso, incorporam energia solar, produzem o
oxigênio que é dissolvido na água e utilizado por outros organismos aquáticos, atuam no ciclo
dos elementos químicos, constituem fonte alimentar para animais onívoros e herbívoros,
fornecem habitat, refúgio e ambiente para reprodução de diversos organismos da biota
marinha, desempenhando funções ecológicas essenciais (ZUCCARO et al., 2008).
A diversidade e abundância das algas dependem de muitos fatores ambientais, tais
como temperaturas da água, penetração da luz e declinação sazonal solar (DHARGALKAR &
VERLECAR, 2009). Normalmente as algas são expostas a uma variedade de mudanças
simultâneas dos fatores abióticos, e estes são fundamentais para compreender o sucesso da
colonização destes organismos no ambiente antártico (GOMEZ et al., 2009).
As estações do ano em regiões polares são caracterizadas por curtos períodos de luz e
longos períodos de noite. A radiação solar anual é 30-50% menor do que em regiões de clima
temperado e a noite polar tem a duração de cerca de quatro meses em latitudes mais baixas.
As condições encontradas nesse ambiente são consideradas hostis para a maioria dos
organismos vivos. Apesar de apresentar baixa riqueza de espécies em comparação com as
regiões temperadas e tropicais (WIENCKE & CLAYTON, 2002), as macroalgas presentes na
Antártica são caracterizadas por uma extrema abundância dominadas principalmente por algas
pardas (GOMEZ et al., 2009; ZACHER et al., 2009) o que contrasta com a ausência de uma
flora terrestre diversificada no continente (ZIELINSKI, 1990). O forte isolamento da flora
ficológica do Oceano Antártico resultou em um alto grau de endemismo na Antártica e cerca
de 30% das espécies da região são endêmicas.
Devido às dificuldades de acesso e coleta, poucas informações taxonômicas estão
disponíveis e não há uma estimativa precisa da diversidade de macroalgas na Antártica
(CLAYTON, 1994). As espécies encontradas com maior frequência pertencem aos gêneros:
4
Acrosiphonia, Adenocystis, Ascoseira, Ballia, Cystosphaera, Curdiea, Desmarestia,
Enteromorpha, Georgiella, Gigartina, Gymnogongrus, Hildenbrandia, Himantothallus,
Iridaea, Leptophytum, Monostroma, Neuroglossum, Palmaria, Pantoneura, Phaeurus,
Phyllophora, Picconiella, Plocamium, Porphyra, Prasiola, Trematocarpus e Urospora
(WULLF et al., 2009).
2.2.1 Monostroma hariotti Gain
O gênero Monostroma Thuret (Chlorophyta) possui ampla distribuição mundial, com
biomassa concentrada em zonas subtropicais, temperadas e polares e inclui 28 espécies de
difícil identificação visual e de difícil taxonomia (PELLIZZARI et al., 2009). A maioria das
espécies deste gênero possui ampla utilização na indústria alimentícia, cosmética e
farmacêutica. Monostroma hariotii Gain é uma espécie com ocorrências para Argentina, Ilhas
Falkland e Ilhas Antárticas (OLIVEIRA et al., 2009). Monostroma hariotii (Figura 1) é uma
das algas mais conspícuas durante o verão da Baía do Almirantado, Ilha Rei George
(Península Antártica) e, como as demais macroalgas, faz parte do hábito alimentar ou serve de
substrato para muitas espécies de invertebrados bênticos (PELLIZZARI et al., 2009).
Figura 1 Monostroma hariotti Gain em substratos rochosos antárticos.
2.2.2 Porphyra endiviifolia (A. Gepp & E.S Gepp) Y.M. Chamberlain
Porphyra C. Agardh é uma macroalga marinha (Rhodophyta) representada por mais de 130
espécies distribuídas em todo o mundo. A maioria das espécies se estabelece em ambientes de
baixas temperaturas e condições climáticas severas, onde as outras macroalgas não
sobrevivem. Espécies de Porphyra crescem nas regiões entre-marés e é tolerante à
5
dessecação. O gênero inclui espécies de grande importância econômica e que são consumidas
como alimento humano em vários países. Assim, tolerância à dessecação juntamente com seu
alto valor econômico fazem deste gênero um alvo atraente para estudos (BRODIE et al.,
2008) (Figura 2).
Figura 2 Porphyra endiviifolia (A. Gepp & E.S Gepp) Y.M. Chamberlain em substratos
rochosos antárticos.
2.3 Diversidade de fungos na Antártica
Nos últimos anos, os ecossistemas antárticos têm sido investigados quanto à presença de
micro-organismos, como bactérias, arquéias, microalgas e, raramente, fungos (RUISI et al.,
2007). Os micro-organismos que se desenvolvem no ambiente extremo da Antártica são
considerados psicrófilos ou psicrotolerantes. Os psicrófilos são definidos como organismos
que possuem temperatura ótima de crescimento a ≥15°C e a temperatura máxima de
crescimento de 20°C (MORITA, 1975). Os psicrotolerantes são capazes de crescer a ≥5°C,
mesmo a temperatura ótima de crescimento sendo a 15°C ou mais. Apesar da maior parte dos
fungos antárticos ser considerada psicrófila (BRUNATI et al., 2009), acredita-se que ambos
desempenham um papel chave na biodegradação de matéria orgânica e ciclagem de nutrientes
neste ambiente (SHIVAJI & PRASAD, 2009), os quais são, frequentemente, estudados pelo
seu papel ecológico e potencial biotecnológico (KOGEJ et al., 2006; DE GARCÍA et al.,
2007).
A diversidade de fungos em ambientes antárticos é relativamente baixa quando
comparadas com águas de regiões tropicais e temperadas. Entretanto, uma variedade de
espécies de fungos é encontrada nos ambientes antárticos e novas espécies vêm sendo
descritas (VISHNIAC et al., 2006). De acordo com Onofri e colaboradores (2005), existe o
6
registro de 1.604 fungos na península Antártica, pertencentes a 135 gêneros e 232 espécies.
De acordo com Ruisi e cols (2007), a maioria dos fungos registrados nessa área são
anamórficos, têm ciclos de vida curtos, os quais limitam os custos metabólicos associados
com a reprodução sexual.
Estudos sobre fungos conduzidos na Antártica incluem principalmente espécies que
vivem no solo ou em madeiras históricas introduzidas na Antártica (ARENZ et al., 2006;
RUISI et al., 2007). Algumas espécies de fungos foram obtidas a partir de musgos
(BRADNER et al., 2000; TOSI et al., 2002) e associadas com as raízes das espécies de
plantas vasculares Deschampsia antarctica Desv.(Poaceae) e Colobanthus quitensis (Kunth)
Bartl. (Caryophyllaceae), únicas espécies de angiospermas existentes no continente.
A biota antártica, mais do que em outros continentes, é dominada e colonizada por
micro-organismos com diferentes níveis de adaptação. A habilidade dos micro-organismos
crescer e sobreviver nesses ambientes extremos da Antártica é resultado de uma série de
adaptações fisiológicas e moleculares, que refletem nas características estruturais e
bioquímicas desses organismos (FENICE et al., 1997; COWAN & TOW, 2004). Novas
espécies de fungos vêm sendo descritas a partir de amostras coletadas na Antártica, as quais
são consideradas endêmicas para este ecossistema. No entanto, há poucas informações ainda
sobre o papel ecológico desses fungos nesse ecossistema. De acordo com Rosa e cols (2010),
as condições climáticas extremas e o isolamento geográfico do continente antártico fazem
desse habitat um alvo de estudo bastante promissor, pois além de informações ecológicas e
taxonômicas, os fungos podem constituir uma fonte potencial de produtos biotecnológicos.
2.3.1 Fungos algícolas
Segundo Kohlmeyer & Kohlmeyer (1979), os fungos marinhos são divididos em dois grandes
grupos. O primeiro, definido como obrigatório, é representado por fungos que crescem e
esporulam exclusivamente em habitats marinhos ou estuarinos; o segundo, chamado de
facultativo, é representado por fungos que provenientes de águas continentais e ambientes
terrestres, os quais crescem e, possivelmente, esporulam em ambiente marinhos. A
diferenciação entre as micotas marinhas obrigatórias e facultativas é difícil uma vez que o
isolamento de fungos a partir de substratos marinhos não implica na comprovação que estes
micro-organismos sejam ativos no ambiente marinho. É possível isolar fungos terrestres
contaminantes, já que muitas espécies são halotolerantes, ou ainda, o fungo isolado pode estar
7
em uma forma dormente e que nas condições de cultivo em laboratório tornam-se viáveis
(JENSEN & FENICAL, 2002).
A ecologia dos fungos marinhos ainda é pouco conhecida quando comparada ao papel
ecológico dos fungos terrestres. No entanto, sabe-se que estes fungos são importantes na
ciclagem de nutrientes, principalmente, na decomposição de substratos lenhosos, herbáceos e
até mesmo de animais mortos nos oceanos (HYDE et al., 1998). Além disso, alguns são
capazes de estabelecer relações ecológicas com outros grupos, e outros são responsáveis por
doenças em animais marinhos e plantas (HYDE et al., 1998; BUGNI & IRELAND, 2004).
Fungos marinhos podem crescer em uma ampla variedade de substratos, como
madeira, sedimentos, areia, manguezais, corais, conchas de moluscos, invertebrados
marinhos, na superfície e na superfície e interior das algas (HYDE et al., 1998). Fungos
associados à macroalgas constituem um grupo diverso que inclui espécies simbiontes,
sapróbias, parasitas e patogênicas (KOLHMEYER & VOLKMANN-KOHLMEYER, 2003;
RAGHUKUMAR, 2006; SURYANARAYANAN, 2012). A parte externa das algas oferece
uma área protegida em um ambiente continuamente exposto a fatores de estresse como a
baixa concentração de nutrientes, dessecamento, salinidade e radiação UV. Macroalgas
saudáveis liberam parte do carbono fixado durante a fotossíntese na forma de uma secreção
chamada mucilagem, um substrato rico em carboidratos, lipídeos e peptídeos, o qual age
como um fator atrativo para os micro-organismos colonizadores (ZUCCARO & MITCHELL,
2005), como por exemplo, fungos. É neste ambiente que as interações entre fungos e
macroalgas têm início, a partir da ligação dos esporos e da invasão das hifas, levando à
colonização da alga. A invasão ocorre principalmente pela formação de hifas especializadas
com extremidade bifurcada que são capazes de penetrar na alga por meio da degradação
enzimática da parede celular ou exercendo pressão no ponto de contato. Outro ponto de
entrada de hifas inclui partes danificadas pela ação de animais epifíticos como anelídeos e
poliquetos (ZUCCARO & MITCHELL, 2005).
Várias estimativas do número de fungos marinhos foram propostas até o momento
(JONES, 2011). Jones e Mitchell (1996) estimaram 1.500 espécies, mas este número é
considerado subestimado. Jones (2011) relatou 549 fungos marinhos, sendo a maioria
Ascomycota. Considerando os fungos marinhos facultativos e derivados as estimativas
superam 10.000 táxons (JONES, 2011). Bugni e Ireland (2004) relataram que os fungos
isolados de algas representam a segunda maior fonte de fungos marinhos e inclui espécies dos
gêneros Acremonium, Alternaria, Antarctomyces, Aspergillus, Arthrinium, Aureobasidium,
8
Chadefaudia, Cladosporium, Cryptococcus, Fusarium, Geomyces, Haloguignardia,
Histopidicarpomyces, Leucosporidium, Metschnikowia, Oidiodendron, Penicillium,
Phaeosphaeria, Phoma, Retrostium, Rhodotorula, Spathulospora, Trichoderma e Pontogenia
(ZUCCARO et al., 2003; ZUCCARO & MITCHELL, 2005; LOQUE et al., 2010).
Considerando a diversidade de algas marinhas (número estimado de espécies de 9.500 para
12.500), um número muito maior pode ser esperado (JONES, 2011).
2.3.1.1 Fungos marinhos como fonte de metabólitos bioativos
Uma das propriedades mais importantes dos micro-organismos está associada à sua
capacidade metabólica de produzir uma grande variedade de moléculas bioativas com
potencial biotecnológico (SINGH et al., 2011). A necessidade por medicamentos capazes de
combater novas doenças e o aumento de linhagens resistentes a drogas antimicrobianas
estimulou a procura de novas fontes não convencionais de produtos naturais bioativos. Os
oceanos, que compreendem aproximadamente três quartos da superfície terrestre, representam
uma rica fonte de diversidade biológica e química, o qual acabou se tornando um ambiente
atraente para descoberta de organismos produtores de metabólitos biativos. O ambiente
marinho oferece uma grande variedade de fontes potenciais de fungos, incluindo sedimentos,
areia, troncos, madeira de mangue, água do mar, esponjas e outros invertebrados e macroalgas
(JENSEN & FENICAL, 2002).
Com os interesses voltados para os micro-organismos marinhos, fungos marinhos têm
se mostrado uma fonte rica e promissora de novos produtos naturais bioativos. A maioria
desses micro-organismos cresce em um habitat único e extremo e, portanto, têm a capacidade
de produzir metabólitos secundários incomuns. Acredita-se que estes metabólitos sejam uma
adaptação química pela competição por substrato. A produção desses metabólitos únicos por
fungos marinhos é mais provável devido à adaptação a um conjunto distinto de pressões
ambientais (BADHURY et al., 2006)
A utilização dos recursos marinhos permaneceu adormecida até meados dos anos de
1960, quando pesquisadores dos Estados Unidos, Europa e Japão começaram a coletar, extrair
e explorar a diversidade química da vida marinha (FENICAL, 2006). Desde então, têm sido
realizado esforços em todo o mundo visando o isolamento de novos metabólitos de
organismos marinhos (KELECOM, 2002).
O primeiro fármaco de origem marinha foi a ziconotida, um potente analgésico
extraído do gastrópode Conus magus (OLIVEIRA et al., 1987). O antibiótico cefalosporina C
9
(Figura 3) foi o primeiro composto obtido a partir do fungo marinho Cephalosporium sp.,
obtido de água marinha (BURTON & ABRAHAM, 1951, KELECOM, 2002).
Figura 3 Estruturas moleculares (A) cefalosporina C e (B) ziconotida.
Segundo Bugni e Ireland (2004), fungos derivados de esponjas detêm 33% do total de
metabólitos marinhos descobertos, seguidos pelos fungos algícolas com 24%. No entanto os
fungos algícolas superam os de poríferos em relação ao número de novos metabólitos
descobertos.
A descoberta de novas doenças, o fenômeno da resistência de micro-organismos frente
aos antimicrobianos, o elevado número de mortes causadas pelo câncer e doenças tropicais
negligenciadas ressalta a importância da realização de estudos de bioprospecção visando à
obtenção de novos produtos naturais para o desenvolvimento de novas drogas. Desta forma,
os fungos algícolas podem representar uma fonte atrativa para a descoberta de novas
substâncias.
11
2.3.1.2 Fungos marinhos como fonte de enzimas
Com o advento da biotecnologia tem havido uma crescente procura por enzimas com
novas propriedades de relevância industrial (ZHANG & KIM, 2011). Apesar das enzimas
ocorrerem em abundância em plantas e animais, as de origem microbiana representam
atualmente a fonte mais atraente devido à ampla diversidade bioquímica e variedade de
atividades catalíticas disponíveis, facilidade de manipulação genética, rendimentos
elevados e fornecimento regular (NIEHAUS et al., 1999; BUZZINI & MARTINI, 2002,
ZHANG & KIM, 2011; KASANA & GULATI, 2011). Enzimas microbianas são também
mais estáveis e a produção é relativamente mais conveniente e segura (KASANA &
GULATI, 2011).
Pesquisas recentes têm destacado o potencial de ambientes extremos e não
convencionais como fonte de isolamento e seleção de micro-organismos úteis para a indústria.
Estes micro-organismos são capazes de usar biopolímeros complexos como fonte de carbono,
pois são capazes de sintetizar enzimas extracelulares ativas em baixas temperaturas. A
complexidade de ambientes extremos, como o marinho e antártico, envolvendo alta
salinidade, alta pressão, baixas temperaturas e alta incidência de radiação UV, podem
contribuir para as diferenças significativas e características fisiológicas únicas entre as
enzimas geradas por micro-organismos marinhos psicrófilos e seus homólogos terrestres
(ZHANG & KIM, 2011).
Nos últimos anos, uma variedade de enzimas como proteases, amilases, pectinases,
quitinases e queratinases oriundas de micro-organismos antárticos foram relatadas, sendo a
maioria dos metabólitos isolados de bactéria (KRISHNAN et al., 2011). Poucos estudos
foram realizados com outros grupos de micro-organismos como, por exemplo, os fungos
(RAY et al., 1992). Além do interesse biotecnológico, o estudo sobre a micota antártica, que é
pouco documentada, trará informações fisiológicas necessárias para explicar o papel
ecológico dos fungos neste habitat.
12
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Caracterizar a comunidade de fungos associados à macroalgas Monostroma hariotti e
Porphyra endiviifolia presentes nas ilhas Rei George, Elefante e Deception, e avaliar o
potencial destes fungos em relação à produção de metabólitos com atividades biológicas e
enzimas de interesse industrial.
3.2 Objetivos específicos
Isolar fungos algícolas associados à Monostroma hariotti e Porphyra endiviifolia presentes
em três ilhas antárticas;
Depositar todos os isolados de fungos algícolas obtidos em uma coleção de cultura de
micro-organismos para preservação ex-situ da biodiversidade fúngica da Antártica;
Identificar todos os fungos por meio de metodologias moleculares;
Determinar os índices de diversidade e similaridade da comunidade de fungos associados
às macroalgas antárticas;
Cultivar todos os fungos obtidos, preparar seus extratos brutos e depositá-los em uma
coleção de extratos;
Avaliar a atividade antimicrobiana de todos os extratos em ensaios biológicos utilizando
bactéria e fungos de interesse clínico;
Determinar as atividades enzimáticas esterásica, amilásica , xilanásica , proteásica e
celulásica pelos fungos algícolas obtidos.
13
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Coletas das macroalgas
As coletas foram realizadas no Arquipélago Shetland do Sul, nas Ilhas Deception, Elefante e
Rei George. A localização das áreas de coleta foi determinada por coordenadas geográficas
obtidas por meio do Global Positioning System GPS – (Tabela 1). Em ambas as coletas os
dados físico-químicos da água foram determinados (salinidade, temperatura, oxigênio
dissolvido, condutividade). As macroalgas Porphyra endiviifolia (A.Gepp & E.S.Gepp)
Y.M.Chamberlain e Monostroma hariotti Gain foram coletadas em fevereiro e dezembro de
2010, no verão antártico. Para realização das coletas foram aprovadas as devidas licenças
junto ao Ministério do Meio Ambiente e Marinha do Brasil. Foram amostrados cinco
fragmentos de talo de 180 indivíduos de M. hariotti e 210 indivíduos de P. endiviifolia
(Tabela 1). Os talos aparentemente saudáveis de cada indivíduo foram armazenados em sacos
plásticos e processados no Laboratório de Química e Microbiologia da Estação Antártica
Comandante Ferraz (EACF) e Laboratório Úmido do Navio Oceanográfico Polar Comandante
Maximiliano. Uma exsicata representativa de cada macroalga encontra-se depositada no
herbário do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo.
14
Tabela 1 Localização, número de espécimes, dados físico-químicos da água e coordenadas onde Porphyra endiviifolia e Monostroma hariotti foram
coletadas.
Local de coleta/Macroalga N° de espécimes Sal EC (µS) Temp (°C) pH OD Coordenadas
Elefante
Porphyra endiviifolia 60 33,0 50,6 2,1 7,74 34,6 61°13.879’S; 055°21.613’W
Monostroma hariotii 60 35,2 55,4 2,1 8,24 100 61°07.935'S; 055°25.997'W
Rei George
Porphyra endiviifolia 60 32,8 27,23 0,5 7,74 100 62°05.163'S; 058°24.784'W
Monostroma hariotii 60 32,8 27,23 0,5 7,74 100 62°05.454'S; 058°24.334'W
Deception
Porphyra endiviifolia 90 32,1 49,89 3,7 7,49 79,9 62°55.192'S; 060°39.797'W
Monostroma hariotii 60 32,1 49,89 3,7 7,49 79,9 62°55.192'S; 060°39.797'W
Notas: Sal, salinidade; EC, condutividade; Temp, temperatura; OD, oxigênio dissolvido.
15
4.2 Isolamento e preservação dos fungos
Os talos das macroalgas foram lavados três vezes com água destilada esterilizada. Cinco
fragmentos de cada talo foram retirados com auxílio de pinça e tesoura esterilizadas e
posteriormente transferidos para placas de Petri contendo Agar Marinho (Marine
Broth/Himedia, Agar 2%, Glicose 2%) suplementado com 100 μg/mL de cloranfenicol
(Sigma/EUA) para inibir o crescimento de bactérias contaminantes. As placas foram
incubadas a 15ºC por um período de até 60 dias e os isolados foram purificados em novas
placas de Petri contendo meio Agar Marinho (AM).
Os isolados de fungos filamentosos obtidos foram preservados em duplicata em
glicerol 20% e armazenados a –80ºC. As leveduras obtidas, após 48h de crescimento em
Caldo Marinho (Marine Broth 2216/Himedia, 2% glicose), também foram preservadas em
glicerol 20 % e armazenadas a -80ºC. Todos os isolados foram depositados na Coleção de
Micro-organismos e Células do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de
Minas Gerais.
4.3 Cultivo dos fungos e preparo dos extratos
4.3.1 Fungos filamentosos
Os fungos filamentosos obtidos foram cultivados em placas de Petri contendo AM a 15ºC.
Após 15 dias de crescimento todo o meio de cultura e crescimento micelial de cada fungo
algícola foi macerado e transferido para tubo cônico de 50 mL, sendo então acrescidos de 25
ml de etanol P.A (Vetec). Os tubos foram incubados por 48 horas ao abrigo da luz. Os
sobrenadantes foram filtrados com auxílio de papel de filtro e posteriormente transferidos
para frascos de 30 ml e tubos de 1,5 mL. Todos os extratos obtidos foram secos em estufa a
37ºC e em seguida solubilizados em dimetisulfóxido (DMSO), a uma concentração de 20
mg/mL e 100 mg/mL e mantidos a -20ºC até utilização no ensaios biológicos.
16
4.3.2 Leveduras
As leveduras foram previamente crescidas em placas de Petri contendo AM a 15ºC e
transferidas para tubos contendo 3 mL de Caldo Marinho (CM) acrescido de 2% glicose e
incubados a 15ºC por 48h. Para obtenção dos extratos foram utilizadas microplacas de 24
poços contendo em cada poço 1 ml do meio AM. Em cada poço foram inoculados 100 μL do
CM com o crescimento das leveduras e incubadas a 15ºC por 15 dias. Após o período de
incubação, o meio de cultura com crescimento das leveduras foi macerado com auxílio de um
pistilo esterilizado e adicionado 1,5 mL de etanol PA em cada poço. Todas as microplacas
foram incubadas por 48 horas e o sobrenadante de cada poço foi transferido para tubos de 1,5
mL após serem filtrados com o auxílio de algodão. Os extratos obtidos foram secos em estufa
a 37ºC e em seguida solubilizados em DMSO, a uma concentração de 20 mg/mL e 100
mg/mL e mantidos a -20ºC até utilização nos ensaios biológicos. Todos os extratos obtidos
(fungos filamentosos e leveduras) foram depositados nas Extratotecas do Laboratório de
Química de Produtos Naturais do CPqRR/FIOCRUZ e do Laboratório de Biodiversidade,
Taxonomia e Biotecnologia de Fungos para os estudos de bioprospecção.
4.4 Ensaios antimicrobianos
A determinação da atividade antimicrobiana dos extratos foi avaliada pelo método de
microdiluição em placa de acordo com metodologia descrita no manual da Clinical and
Laboratory Standards Institute- CLSI, 2002 e 2005.
4.4.1 Determinação da atividade antifúngica
As linhagens de Candida krusei ATCC 6258 e Candida albicans ATCC 60193 foram
crescidos em agar Sabouraud (Difco/EUA) a 35oC por 24 horas. Cinco colônias foram
suspensas em solução salina (0,85%) esterilizada. A suspensão resultante foi homogeneizada
em agitador tipo vórtex e a absorbância foi medida em espectrofotômetro em comprimento de
onda de 530 nm ajustada a 70% de transmitância. Posteriormente a suspensão obtida foi
diluída 10 vezes em RPMI 1640 (INLAB Diagnostica) acrescido de 2% de glicose. O fungo
filamentoso Cladosporium sphaerospermum CCT 1740 foi crescido em BDA por 7-10 dias.
Preparou-se uma solução de esporos, a 15% de transmitância em salina (620 nm).
Posteriormente a solução foi diluída 50 vezes em RPMI 1640.
Para a realização dos ensaios antimicrobianos foram utilizadas placas de 96 poços de
fundo chato (TPP/Suíça). Todos os testes foram realizados em duplicata e os 96 poços
17
divididos como mostrado nas Figuras 4. Utilizou-se o meio de cultura sintético RPMI 1640
tamponado com ácido morfolinepropano sulfônico (MOPS) (Sigma/EUA), suplementado com
2% glicose, para as leveduras. Como controle positivo foi utilizado o antifúngico anfotericina
B (Sigma/EUA) para as leveduras e Benomyl para o fungo filamentoso. Em cada poço usado
para teste foi inoculado 25 µL de cada extrato dissolvido em DMSO e água deionizada
esterilizada, 25 µL de RPMI 1640 e 50 µL de inóculo. Ao final, o volume de cada poço foi de
100 µL, e as concentrações de DMSO de 0,25%; as drogas controle de 2 µg/mL para
anfotericina B e 1,16 µg /mL pra benomyl; e os extratos de 250 µg/mL.
As placas foram incubadas a 35oC para as leveduras por 24 horas e 25
oC para C.
sphaerospermum por 48 horas. Após a incubação das leveduras, em cada poço foi
acrescentado 10 µL de brometo tiazolil azul de tetrazólico (MTT/ AMRESCO – 5 mg/mL), o
conteúdo homogeneizado e as placas novamente incubadas a 35oC por 4 horas. Nas
mitocôndrias das células alvos, o MTT é metabolizado em formazan, revelando a presença de
células metabolicamente ativas. Após o metabolismo do MTT, foram adicionados 100
µL/poço de SDS/isopropanol (5%), que rompe a membrana celular dos micro-organismos
alvos e disponibiliza no meio o formazan. A leitura foi realizada por meio do método
colorimétrico do MTT em um leitor de microplaca VERSAmax (Molecular Devices) pelo
programa SoftmaxR Pro 5 (Molecular Devices), com a absorbância de 570 nm para leveduras.
Já para o fungo filamentoso não se utiliza MTT e a leitura é realizada em um leitor de
microplaca VERSAmax (Molecular Devices) pelo programa SoftmaxR Pro 5 (Molecular
Devices), com a absorbância de 620 nm. A absorbância dos poços testes foi comparada com a
absorbância do poço controle contendo apenas o microrganismo, sendo a porcentagem de
inibição calculada pela seguinte fórmula:
Porcentagem de Inibição:
Densidade óptica poço controle – DO poço tratado X 100
Densidade óptica do poço controle
Foram considerados promissores os extratos com valor de inibição igual ou maior que
60%.
18
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A BL EX1 EX9 EX17 EX25 EX33 EX41 EX49 EX57 EX65 EX73 DMSO
B BL EX2 EX10 EX18 EX26 EX34 EX42 EX50 EX58 EX66 EX74 DMSO
C BL EX3 EX11 EX19 EX27 EX35 EX43 EX51 EX59 EX67 EX75 DMSO
D BL EX4 EX12 EX20 EX28 EX36 EX44 EX52 EX60 EX68 EX76 DMSO
E CN EX5 EX13 EX21 EX29 EX37 EX45 EX53 EX61 EX69 EX77 CP
F CN EX6 EX14 EX22 EX30 EX38 EX46 EX54 EX62 EX70 EX78 CP
G CN EX7 EX15 EX23 EX31 EX39 EX47 EX55 EX63 EX71 EX79 CP
H CN EX8 EX16 EX24 EX32 EX40 EX48 EX56 EX64 EX72 EX80 CP
BL- Branco (RPMI 1640 + 2% glicose*) DMSO- Controle de DMSO 0,25%
(RPMI 1640/DMSO + Inóculo)
CN- Controle negativo (RPMI 1640 + inóculo) CP- Controle positivo
(RPMI 1640/droga + Inóculo)
EX- Extrato
*para leveduras
Figura 4 Modelo da disposição dos extratos e controles na placa de 96 poços utilizada nos
ensaios antifúngicos.
4.4.2 Determinação da atividade antibacteriana
Os isolados de Escherichia coli ATCC 11775, Staphylococcus aureus ATCC 12600 e
Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 foram crescidos em agar Muller-Hinton (Difco/EUA)
a 35oC por 24 horas. Uma alçada foi suspensa em solução salina 0,85% esterilizada. A
suspensão resultante foi homogeneizada em agitador tipo vórtex e a absorbância foi medida
em espectrofotômetro em comprimento de onda de 625 nm o que equivale a 0,08-0,1 de
transmitância. Posteriormente a suspensão obtida foi diluída 10 vezes em caldo Muller-
Hinton.
Para a realização dos ensaios antibacterianos foram utilizadas placas de 96 poços de
fundo chato (TPP/Suíça). Todos os testes foram realizados em duplicata e os 96 poços
divididos como mostrado na Figura 5. Utilizou-se o caldo Muller-Hinton. Como controle
positivo foi utilizado o antibacteriano cloranfenicol (Sigma/EUA). Em cada poço usado para
teste foi inoculado 25µL de cada extrato dissolvido em DMSO e água deionizada esterilizada,
25 µL de caldo Muller-Hinton e 50 µL de inóculo. Ao final, o volume de cada poço foi de 100
µL, e as concentrações de DMSO de 0,25%; a droga controle a 32 µg /mL e os extratos a 250
µg /mL.
As placas foram incubadas a 35oC por 24 horas. Após a incubação, em cada poço foi
acrescentado 10 µL de brometo tiazolil azul de tetrazólico (MTT/ AMRESCO – 5 mg/mL), o
19
conteúdo homogeneizado e as placas novamente incubadas a 35oC por 4 horas. Após o
metabolismo do MTT, foram adicionados 100 µL/poço de SDS/isopropanol (5%). A leitura
foi realizada por meio do método colorimétrico do MTT em um leitor de microplaca
VERSAmax (Molecular Devices) pelo programa SoftmaxR Pro 5 (Molecular Devices), com a
absorbância de 570 nm. A porcentagem de inibição foi calculada da mesma forma que nos
ensaios antifúngico. Foram considerados promissores os extratos com valor de inibição igual
ou maior que 60.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A BL EX1 EX9 EX17 EX25 EX33 EX41 EX49 EX57 EX65 EX73 DMSO
B BL EX2 EX10 EX18 EX26 EX34 EX42 EX50 EX58 EX66 EX74 DMSO
C BL EX3 EX11 EX19 EX27 EX35 EX43 EX51 EX59 EX67 EX75 DMSO
D BL EX4 EX12 EX20 EX28 EX36 EX44 EX52 EX60 EX68 EX76 DMSO
E CN EX5 EX13 EX21 EX29 EX37 EX45 EX53 EX61 EX69 EX77 CP
F CN EX6 EX14 EX22 EX30 EX38 EX46 EX54 EX62 EX70 EX78 CP
G CN EX7 EX15 EX23 EX31 EX39 EX47 EX55 EX63 EX71 EX79 CP
H CN EX8 EX16 EX24 EX32 EX40 EX48 EX56 EX64 EX72 EX80 CP
BL- Branco (Mueller-Hinton) DMSO- Controle de DMSO ,25%
(Mueller-Hinton /DMSO +inóculo)
CN- Controle negativo (Mueller-Hinton + inóculo) CP- Controle positivo
(Mueller-Hinton /droga + Inóculo)
EX- Extrato
Figura 5 Modelo da disposição dos extratos e controles na placa de 96 poços utilizada nos
ensaios antibacterianos.
4.5 Ensaios enzimáticos
Todos os fungos algícolas foram avaliados quanto à capacidade de degradar amido,
carboximetilcelulose, xilana, proteína (caseína) e éster de acordo com os procedimentos
descritos por Buzzini e Martini (2002). As leveduras foram crescidas em AM a 15ºC por
aproximadamente 7 dias, a seguir cerca de cinco colônias foram suspensas em água
deionizada esterilizada. Em cada meio sólido foram inoculados 10 µl da solução. Para os
fungos filamentosos um disco de 5 mm do crescimento micelial de cada fungo foi inoculado
nos meios de cultivo. As placas foram incubadas a 15ºC e após 14 dias de cultivo, a presença
da atividade enzimática foi observada por meio da formação de halo ao redor da colônia.
Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
Atividade esterásica (EsA). A capacidade de hidrolisar ésteres foi avaliada no
seguinte meio (g/L): peptona, 10; NaCl, 5; CaCl2.H2O, 0,1; Agar, 20; Tween 80, 10; pH 6,8.
20
A presença da atividade esterásica foi notada por meio da formação de um halo precipitado
em torno da colônia.
Atividade amilásica (AmA). A capacidade de hidrolisar amido foi avaliada no
seguinte meio (g/L): YNB, 6,7; amido, 2; Agar, 20. Após o crescimento celular, as placas de
Petri foram cobertas com lugol. A formação de uma zona amarela em torno da colônia envolta
por uma coloração azul indica a atividade amilásica.
Atividade xilanásica (XiA). A capacidade de hidrolisar xilana foi avaliada em meio
contendo (g/L): YNB, 6,7; xilana, 10; Agar, 20. A atividade extracelular da enzima foi
avaliada por meio da formação de um halo mais claro em torno da colônia.
Atividade proteásica (PrA). A produção de protease extracelular foi determinada em
meio YEPG contendo caseína 20 g/L, pH 6,5. Uma zona clara em torno da colônia indica a
atividade proteásica.
Atividade celulásica (CeA). A produção de celulase foi detectada em meio contendo
(g/L): YEPG, 6,7; carboximetilcelulose, 5. Após o crescimento celular, a presença de celulase
extracelular foi detectada pelo método do vermelho Congo.
4.6 Identificação dos fungos
Todos os isolados de fungos foram agrupados de acordo com as características
macromorfológicas da colônia (coloração da colônia, borda, relevo, coloração do meio). Para
confirmação do agrupamento macromorfológico, os isolados foram submetidos à análise
molecular, por meio de PCR utilizando o iniciador (GTG)5. Entre os fungos que apresentaram
perfis moleculares distintos, um isolado foi selecionado para identificação molecular. Os
fungos filamentosos foram identificados por meio do sequenciamento da região espaçadora
transcrita interna (ITS1-5.8S- ITS2) do gene do RNA ribossomal e as leveduras, pelo
seqüenciamento dos domínios D1/D2 da subunidade maior do gene do RNA ribossomal.
4.6.1 Extração do DNA total dos fungos filamentosos
A extração do DNA total foi realizada de acordo com Rosa e colaboradores (2009). Os fungos
filamentosos foram crescidos por sete dias em Caldo Sabouraud e o crescimento micelial foi
transferido para tubos de 1,5 mL acrescidos de 400 μL de tampão de lise (Tris-HCL -
trishidroximetilaminometano 0,05 M, EDTA – ácido etilenodiamino tetraacético 0,005 M,
21
NaCL 0,1M e SDS – sódio dodecil sulfato 1%) e deixado a – 20ºC por aproximadamente 10
minutos. O micélio foi triturado com auxílio de esferas de aço (beads) e foram acrescidos 5
μL de Proteinase K (50 μg/mL). Após homogeneização, o tubo foi colocado por 30 minutos a
60ºC em banho seco. Após esta etapa, foram adicionados 162 μL de CTAB de Hoog (Tris
2M, NaCl 8,2%, EDTA 2M e CTAB 0,2%), seguido de homogeneização em vórtex e
incubação por 10 minutos a 65ºC. Em seguida, foram acrescentados 570 μL da mistura
clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). Após homogeneização, o tubo foi incubado por 30
minutos em gelo. Em seguida, o conteúdo foi centrifugado a 13.200 rpm por 10 minutos e o
sobrenadante foi transferido para um novo tudo de 1,5 mL, e acrescentado 10% do volume de
uma solução de acetato de sódio 3M. O tubo foi vertido para homogeneização, incubado a 0ºC
por 30 minutos e centrifugado a 13.200 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido
para um novo tubo, onde foi adicionado 50% do volume de isopropanol e centrifugado a
13.200 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi desprezado por inversão. A seguir, foram
adicionados 200 μL de etanol (Merck) 70% e a suspensão foi gentilmente homogeneizada.
Após este procedimento, a amostra foi centrifugada a 13.200 rpm por 5 minutos e o
sobrenadante desprezado por inversão, seguido de nova homogeneização com etanol 70% e
centrifugação. A amostra foi seca em temperatura ambiente, para evaporação do etanol, e 50
μL de Tris-EDTA (Tris-HCL 0,01M e EDTA 0,001M) foram adicionados e a mesma foi
incubada a 65ºC por 60 minutos para hidratação do DNA. As amostras foram armazenadas
em freezer a -20ºC.
4.6.2 Extração do DNA total das leveduras
Para extração do DNA total, os isolados de levedura foram crescidos em AM. Após o
crescimento, as colônias foram ressuspendidas em tubos de 0,6 mL com 100 μL de tampão de
lise (Tris-HCL – trishidroximetilaminometano 0,05 M, EDTA – ácido etilenodiamino
tetraacético 0,005 M , NaCL 0,1M e SDS – sódio dodecil sulfato 1%) e incubadas em banho
seco a 65ºC por 30 minutos. Em seguida foi adicionado 100 μL de
fenol:clorofórmio:isoamílico (25:24:1 – Sigma) aos tubos, homogeneizou-se em vórtex
durante 4 minutos e centrifugou-se a 14.000 rpm durante 15 minutos. O sobrenadante foi
retirado e transferido para novo tudo de 0,6 mL e adicionou-se 100 μL de etanol 70% (Merck)
refrigerado. O conteúdo foi homogeneizado e centrifugado a 14.000 rpm por 15 minutos. O
sobrenadante foi descartado e os tubos de 0,6mL incubados em temperatura ambiente para
22
evaporação do etanol. O DNA total foi ressuspendido em 50 μL de Tris-EDTA (Tris-HCL
0,01M e EDTA 0,001M) e armazenado em freezer a -20ºC.
4.6.3 PCR com iniciador (GTG)5
Para confirmação do agrupamento macromorfológico os isolados foram submetidos à análise
molecular, por meio de PCR utilizando o iniciador (GTG)5. A reação de PCR foi realizada em
um volume final de 25 μL contendo 1 μL de DNA (aproximadamente 100 ng/mL), 2 μL do
iniciador (GTG)5 μmol-1
(MWG Biotech), 2,5 μL de tampão de PCR 5X (Fermentas), 1,5 μL
de MgCl2 25mM, 1 μL de dNTP 10 mM, 0,3 μL de TaqDNA polimerase 5U (Fermentas) e o
volume final completado com água destilada estéril. As reações de PCR foram realizadas
utilizando o termociclador PCR (Eppendorf) sob as seguintes condições: desnaturação inicial
a 94ºC por 2 minutos, seguido por 40 ciclos de 45 segundos de desnaturação a 93ºC, 1 minuto
da anelamento a 50ºC e 1 minuto de extensão a 72ºC, e uma extensão final por 6 minutos a
72ºC. Os produtos de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1,5%, em
tampão TBE 0,5X, eluídos, em tampão de corrida 6X e Gel Red, durante aproximadamente 80
minutos a 80V. Os géis foram visualizados sob luz ultravioleta e fotografados pelo sistema de
foto-documentação de gel (Vilber Lourmat, France).
4.7 Obtenção dos amplicons
Para identificação molecular dos fungos filamentosos foram utilizados os iniciadores ITS1
(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4 (5’-TCCTCCGCTTGATATGC-3’) para
amplificação das regiões ITS do gene do rRNA, conforme descrito por White e colaboradores
(1990). A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada em um volume final de 50 μL
contendo 2 μL de DNA, 1 μL de cada iniciador ITS1 e ITS4 10 μmol-1
(MWG Biotech), 5 μL
de tampão de PCR 5X (Fermentas), 2 μL de MgCl2 25mM, 2 μL de dNTP 10 mM, 0,3 μL de
TaqDNA polimerase 5U (Fermentas) e o volume final completado com água destilada estéril.
As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador PCR (Eppendorf). O
programa consistiu de uma desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, seguido por 35 ciclos
de 1 minuto de desnaturação a 94ºC, 1 minuto da anelamento a 55ºC e 1 minuto de extensão a
72ºC, e uma extensão final por 5 minutos a 72ºC. Os produtos de PCR foram analisados por
eletroforese em gel de agarose 1%, em tampão TBE 0,5X, eluídos em tampão de corrida 6X e
Gel Red, durante aproximadamente 20 minutos a 120V. Os géis foram visualizados sob luz
23
ultravioleta e fotografados pelo sistema de foto-documentação de gel (Vilber Lourmat,
France).
Dentre as leveduras que apresentaram perfis moleculares distintos, um isolado foi
selecionado para o seqüenciamento da região D1/D2 da subunidade maior do gene do rRNA
utilizando os iniciadores NL-1 (5’- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) e NL-4 (5’-
GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’) segundo Lachance e colaboradores (1999). A reação de
PCR foi realizada em um volume final de 50 μL contendo: 2,0 μL de DNA, 1,0 μL de cada
iniciador NL1 e NL4 10 μmol-1 (MWG Biotech), 5,0 μL de tampão de PCR 5X (Fermentas),
2,0 μL de MgCl2 25 mM, 2,0 μL de dNTP 10mM, 0,2 μL de Taq DNA polimerase 5U
(Fermentas) e o volume final completado com água destilada estéril. As reações de PCR
foram realizadas sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 95ºC por 2 min, seguida
por 35 ciclos de: desnaturação a 95ºC por 15 segundos, anelamento a 54ºC por 25 segundos e
extensão a 72ºC por 20 segundos, seguida por extensão final a 72ºC por 10 min. Os produtos
de PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose 1%, em tampão TBE 0,5X,
corados em tampão de corrida 6X e Gel Red, durante aproximadamente 20 minutos a 120V.
Os géis visualizados sob luz ultravioleta e fotografados em um sistema de foto-documentação
de gel (Vilber Lourmat, France).
4.7.1 Purificação dos amplicons
Os amplicons gerados pela reação de PCR foram purificados utilizando-se polietilenoglicol
(PEG). Ao produto de PCR foi adicionado igual volume de solução de polietilenoglicol 20%
em NaCl 2,5M, que foi mantido em banho-maria à 37ºC por 15 minutos. O tubo foi
centrifugado a 13.500 rpm por 15 minutos e o sobrenadante foi retirado e descartado. A
seguir, foram adicionados 125 μL de etanol 70% resfriado a 4ºC. O tubo foi centrifugado a
13.500 r.p.m. por 5 minutos e o etanol foi retirado. O tubo foi deixado à temperatura ambiente
para evaporação de todo o excesso de etanol. Foram adicionados 10 μL de água deionizada
estéril e o conteúdo do tubo foi homogenizado em vórtex por 15 segundos. Em seguida, o
tubo foi incubado em banho- maria a 37ºC por 60 minutos. O produto obtido foi dosado em
NanoDrop ND 1000 (NanoDrop Technologies) para ser utilizado na reação de
sequenciamento.
24
4.7.2 Reação de sequenciamento
O sequenciamento foi realizado utilizando o Kit DYEnamicTM (Amersham Biosciences,
USA) em combinação com o sistema de sequenciamento automatizado MegaBACETM
1000,
no Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular (LBEM- UFMG). Para a reação de
sequenciamento formam utilizados 100-150 ng do DNA purificado, os reagentes presentes no
kit e iniciadores. A reação de PCR foi realizada em um volume final de 10 μL contendo 4 μL
do pré-mix (presente no kit de sequenciamento) e 1 μL do iniciador (5 μmol-1), completando-
se o volume final com água deionizada estéril. O programa consistiu de 36 ciclos de uma
desnaturação inicial a 95ºC por 25 minutos, seguido por 15 segundos de anelamento a 50ºC e
3 minutos de extensão a 60ºC. em seguida, os produtos da reação foram transferidos para uma
placa de sequenciamento de 96 poços para serem precipitados.
4.7.3 Precipitação da reação de sequenciamento
Para precipitação das reações de sequenciamento, 1 μL de acetato de amônio 7,5 M foi
adicionado em cada poço da placa de 96 poços. A solução de acetato de amônio foi
dispensada na parede lateral dos poços e a placa levemente batida sobre a bancada para que as
gotas do acetato de amônio se misturassem à reação. Em seguida, foram adicionados 28 μL de
etanol absoluto (Merck/EUA). A placa foi submetida à agitação em vórtex e incubada por 20
minutos à temperatura ambiente, protegida da luz. Após período de incubação, a placa foi
centrifugada por 45 minutos a 4000 rpm. O sobrenadante foi descartado virando-se a palca
sobre um papel absorvente. Em seguida, foram adicionados 150 μL de etanol 70%
(Merck/EUA). A placa foi novamente centrifugada por 15 minutos a 4000 rpm e o
sobrenadante foi então descartado. Para remoção do excesso de etanol, a placa foi invertida
sobre um papel absorvente, e submetida a um pulso em centrifuga a 900 rpm durante 1
segundo. Em seguida a placa foi mantida em repouso durante 20 minutos, protegida da luz,
para evaporação do etanol. O DNA das amostras precipitado em cada poço da placa foi então
ressuspendido em 10 μL de Loading buffer (presente no kit de sequenciamento). A placa foi
submetida à aitaçao em vórtex por 2 minutos, centrifugada por 1 segundo a 900 rpm e
armazenada a 4ºC, protegida da luz, até injeção das amostras no sistema automatizado
MegaBACETM
1000.
25
4.7.4 Análise computacional das sequências
As seqüências de DNA foram analisadas, comparando com as seqüências de cultura tipo
depositadas no GenBank, utilizando o programa BLASTn (Basic Local Alignment Search
Tool- versão 2.215 do BLAST 2.0) disponível no portal NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) desenvolvido pelo Nacional Center For Biotechnology.
Os isolados que apresentaram as sequências analisadas com similaridade ≥98% em relação às
sequências já depositadas no GenBank, foram considerados como pertencentes à mesma
espécie ou gênero; já aqueles que apresentaram sequências com similaridade ≤97%, foram
considerados como pertencentes ao mesmo gênero (ROSA et al., 2010).
4.7.5 Diversidade da comunidade fúngica: abundância, riqueza e equitabilidade
A porcentagem de abundância de cada táxon foi calculada e utilizada para determinar a
prevalência de cada táxon. Para avaliar a diversidade de espécies fúngicas foram utilizados os
índices de riqueza e equitabilidade de: (i) Shannon H = -Σ ni/n ln (ni/n) e (ii) Simpson’s = Σ
(ni/n)2, respectivamente, onde ni é o número de indivíduos do táxon i e n é o número total de
indivíduos. Para avaliar a similaridade entre as comunidades fúngicas de cada lago utilizou-se
o índice de Bray-Curtis (B) e o coeficiente de Sorensen (QS). O índice de Bray-Curtis (B)
varia de 0 a 1, sendo que 0 significa que as comunidades não compartilham nenhuma espécie
e 1 que compartilham todas as espécies na mesma frequência. O coeficiente de Sorensen (QS)
é representado pela fórmula: QS = 2C/(A+B), onde A e B representam o número de espécies
nas amostras A e B, respectivamente, e C o número de espécies compartilhadas pelas duas
amostras. Todos os resultados foram obtidos com 95% de confiança, e os valores de bootstrap
foram calculados a partir de 1000 repetições. Todos os índices foram calculados utilizando o
programa computacional PAST 1.90 (RYAN et al., 1995).
26
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Coleta e isolamento dos fungos algícolas
Um total de 390 espécimes de macroalgas foi amostrado (180 de Monostroma hariotti e 210
de Porphyra endiviifolia), totalizando 1.950 fragmentos de talos algais (5 fragmentos por
espécime). Todos os fragmentos foram lavados superficialmente com água do mar esterilizada
e transferidos para placas de Petri contendo agar marinho. Ao final do processo de isolamento
foram obtidos 278 isolados fúngicos, 149 fungos filamentosos e 129 leveduras (Figura 6).
Figura 6 Fungos isolados das macroalgas antárticas Monostroma hariotti e Porphyra
endiviifolia.
A ilha Rei George apresentou maior número de isolados (147), seguida das ilhas Elefante
(100) e Deception (31) (Figura7). A macroalga M. hariotti (Chlorophyta) apresentou maior
número de isolados (169 isolados) em comparação com P. endiviifolia (Rhodophyta) (109
isolados) (Tabela 2). De acordo com Suryanarayanan (2012), as macroalgas pardas e
vermelhas abrigam maior diversidade de espécies em relação as macroalgas clorófitas. Os
ciclos de vida curtos de algumas espécies de clorófitas e o crescimento lento das espécies
fúngicas podem ser responsáveis por estas abrigarem uma baixa diversidade de fungos
(ZUCCARO & MITCHEL, 2005). Neste estudo, a M. hariotti abrigou maior diversidade de
fungos, pois a espécie em estudo é naturalmente de crescimento lento (PELLIZZARI, 2009),
o que pode ter favorecido a colonização fúngica.
27
Figura 7 Porcentagem de fungos isolados por área de coleta.
Tabela 2 Número de isolados de fungos algícolas obtidos por macroalgas e áreas de coleta.
Local da coleta(Ilhas)
Espécie de macroalga Deception Elefante Rei George Total
Porphyra endiviifolia 21 70 18 109
Monostroma hariotti 10 30 129 169
Total 31 100 147 278
Apesar do primeiro fungo marinho, Mycosphaerella pelvetiae, ter sido coletado da
alga Pelvetia em 1915 (SUTHERLAND, 1915) e estudos iniciais terem sidos realizados por
Webber (1967), Kohlmeyer (1967) e Schatz (1980), poucos trabalhos foram realizados até o
momento com o objetivo de caracterizar a comunidade de fungos associados às macroalgas.
Diferentes estudos foram realizados com o objetivo de caracterizar a comunidade fúngica nos
ecossistemas da Antártica (DEL FRATE & CARETTA 1990; ADAMS et al., 2006; ARENZ
et al., 2006; CONNELL et al., 2006; KOSTADINOVA et al., 2009, LOQUE et al., 2010,
ROSA et al., 2009, ROSA et al., 2010 VAZ et al., 2011, SANTIAGO et al., 2012). No
entanto, apenas um trabalho foi realizado, até o momento, a partir de macroalgas neste
continente. Loque e cols (2010) estudaram a composição da comunidade fúngica de três
macroalgas antárticas: Adenocystis utricularis (Bory de Saint-Vincent) Skottsberg
Phaeophyta, Desmarestia anceps Montagne Phaeophyta e Palmaria decipiens (Reinsch)
R.W. Ricker Rhodophyta. A partir de 60 espécimes de macroalgas e 180 fragmentos de talos
algais, 27 fungos filamentosos e 48 leveduras foram obtidos em meio Agar batata dextrosado
preparado com água do mar preparada artificialmente no laboratório. Zuccaro e cols (2003)
obtiveram 116 isolados a partir de macroalgas de regiões temperadas. Solis e cols (2010)
coletaram 48 talos das macroalgas Kappaphycus alvarezii e K. striatum nas Filipinas e
28
obtiveram 144 isolados fúngicos. Suryanarayanan e cols (2010) estudaram a micobiota de 25
macroalgas da costa de Tamilnadu, na Índia e obtiveram 75 espécies fúngicas. Considerando
o alto número de espécimes amostradas no presente estudo, o número de isolados obtidos é
menor que o número de isolados obtidos por Loque e cols (2010) e em estudos de regiões
temperadas.
5.2 Cultivo e obtenção dos extratos etanólicos
O processo de produção de extratos brutos de micro-organismos constitui uma etapa
importante para detecção de substâncias bioativas. Diferentes técnicas de cultivo e produção
de extratos microbianos já foram descritas. Entre estas etapas destacam-se o tipo de meio de
cultura e o processo fermentativo utilizado (cultivos em condições de fermentação líquida e
sólida). A utilização de técnicas de fermentação em meio sólido (Solid State Fermentation -
SSF), a qual foi utilizada neste estudo, possui a vantagem da maior facilidade na recuperação
dos metabólitos produzidos e aumento do rendimento (ROSA et. al., 2011). Além disso,
diferentes solventes com diferentes polaridades são utilizados para extração dos metabólitos
secundários bioativos, tais como acetato de etila (ROSA et al., 2003; PHONGPAICHIT et al.,
2006), diclorometano (SETTE et al., 2006; MACÍAS- RUBALCAVA et al., 2010), metanol
(BRUNATI et al., 2009; VAZ et al., 2009), hexano (MUTHUVELAN & RAJA, 2008) e
etanol (GAMBOA et al., 2001).
No presente trabalho, os fungos foram cultivados em meio sólido (Agar Marinho) para
obtenção dos extratos dos fungos algícolas. O etanol foi utilizado como solvente para
obtenção dos extratos dos fungos algícolas devido à sua polaridade e afinidade por moléculas
de baixo peso molecular (metabólitos secundários) e alguns metabólitos de médio peso
molecular, tais como peptídeos. Além disto, o etanol possui baixa toxicidade quando
comparado a outros solventes.
5.3 Identificação dos fungos
Os fungos algícolas identificados pertencem a 10 classes distintas; sendo 70% pertencente ao
filo Ascomycota, 20% Basidiomycota e 10% Zygomycota. O filo Ascomycota foi representado
neste estudo por sete classes distintas, sendo estas: Ascomycetes, Dothideomycetes,
Eurotiomycetes, Hyphomycetes, Letiomycetes, Saccharomycetes e Sordariomycetes. O filo
Zygomycota foi representado pela classe Zygomycetes e o filo Basidiomycota pelas classes
29
Microbotrymycetes e Tremellomycetes. Zuccaro e cols (2008) relataram que a macroalga
Fucus serratus abriga fungos pertencentes às classes Halosphaeriaceae (Ascomycota),
Lulworthiaceae (Ascomycota), Hypocreales (Ascomycota) e Dothideomycetes (Ascomycota).
De acordo com Adams e cols (2006) os fungos isolados com maior frequência na Antártica
são os fungos Ascomycota assim como nas macroalgas (SURYANARAYANAN, 2012). A
recorrência do isolamento de fungos ascomicetos tem como hipótese principal a adaptação
dos esporos ao ambiente aquático, que pode facilitar a sua flutuabilidade na coluna d’água e a
aderência aos substratos, atribuindo aos fungos desse filo uma alta recuperação em técnicas
dependentes de cultura (MENEZES et al., 2010).
Os táxons identificados no presente trabalho estão listados na Tabela 4. Doze gêneros
de fungos filamentosos foram encontrados: Antarctomyces Stchigel & Guarro, Aspergillus P.
Micheli ex Haller, Cadophora Lagerb. & Melin, Cladosporium Link, Dipodascus Lagerheim,
Emericella Berkeley, Geomyces Traaen, Mortierella Coemans, Oidiodendron Robak,
Penicillium Link, Thelebolus Tode e Verticillium Nees. Foram identificados oito gêneros de
leveduras: Candida Berkhout, Cryptococcus Kützing, Cystofilobasidium Oberwinkler &
Bandoni, Guehomyces Fell & Scorzetti, Metschnikowia Kamienski, Meyerozyma Kurtzman &
M. Suzuki, Leucosporidium Fell, Statzell, I.L. Hunter & Phaff e Rhodotorula F. C. Harrison.
30
Tabela 1 Identificação molecular dos fungos algícolas, por meio da análise das sequências da região ITS e dos domínios D1/D2 do gene do rRNA.
Hospedeiro/Ilha UFMGCBa N°de
isolados
Espécie referência [GenBank accession
number]
Identidade
(%)
Gaps Sugestão de identificação
Elefante
Porphyra endiviifolia 5976 1 Aspergillus sydowii [JN851041] 99 2/261 Aspergillus sp.
5973 1 Antarctomyces psychrotrophicus
[GU004189]
93 21/509 A. psychrotrophicus
5966 24 Cadophora malorum [GU004209] 99 2/250 C. malorum
5946 1 Cladosporium cucumerinum [HM148071] 96 16/495 Cladosporium sp.
5940 1 Emericella nidulans [AY452983] 99 0/382 E. nidulans
5943 15 Geomyces pannorum [DQ189229] 99 0/494 G. pannorum
6025 1 Mortierella sp. [HQ533829] 99 2/562 Mortierella sp.
5937 1 Oidiodendron truncatum [FJ914713] 99 2/458 O. truncatum
5925 17 Penicillium chrysogenum [JN561259] 100 0/439 P. chrysogenum
5992 2 Penicillium commune [JN368450] 91 46/571 Penicillium sp.
31
5938 5 Penicillium commune [JN676122] 99 1/505 P. commune
6286 6 Penicillium steckii [HM469415] 99 5/416 P. steckii
6027 2 Thelebolus microsporus [GU004196] 96 2/319 Thelebolus sp.
Monostroma hariotii
6002 2 Aspergillus versicolor [HM776414] 98 5/500 Aspergillus sp.2
6008 1 Cladosporium sp. [HM999949] 99 0/483 Cladosporium sp.
6000 2 Geomyces pannorum [DQ189229] 99 0/493 G. pannorum
5998 4 Penicillium chrysogenum [JN561259] 99 2/495 P. chrysogenum
6020 1 Penicillium citrinum [EU645682] 99 2/491 Penicillium sp2.
6001 3 Penicillium commune [JN368450] 99 1/527 P. commune
6024 1 Penicillium crustosum [JN021543] 99 1/491 Penicillium sp3.
6023 1 Penicillium islandicum [FJ872071] 97 3/510 Penicillium sp4.
6006 12 Penicillium steckii [HM469415] 100 0/514 P. steckii
Rei George
Porphyra endiviifolia 6031 1 Dipodascus australiensis [HQ115737] 99 3/329 D. australiensis
5954 8 Geomyces pannorum [DQ189229] 99 1/491 G. pannorum
32
GP46L1 5 Metschnikowia australis [MAU76526] 99 0/490 M. australis
6033 2 Penicillium chrysogenum [JN561259] 100 0/512 P. chrysogenum
Monostroma hariotii MH-57.1 1 Candida sake [FR819699] 98 4/209 C. sake
MH-3.3 1 Cryptococcus adeliensis [JN400752] 97 8/401 C. adeliensis
MH-1.2 18 Cryptococcus albidosimilis [GU460168] 100 0/558 C. albidosimilis
MH-11.2 5 Cryptococcus victoriae [JN544032] 99 4/566 C. victoriae
MH-50.2 2 Cystofilobasidium infirmominiatum
[JN181013]
99 0/564 C. infirmominiatum
MH-33.1 22 Guehomyces pullulans [GQ202976] 99 1/578 G. pullulans
MH-34.1 1 Leucosporidium scottii [JN544033] 99 1/342 L. scottii
MH-47.1 35 Metschnikowia australis [MAU76526] 99 3/458 M. australis
MH-23.1 2 Meyerozyma guilliermondii [JF766631] 98 5/249 M. guilliermondii
MH-38.2 7 Rhodotorula laryngis [DQ640477] 99 1/571 R. laryngis
MH-24.3 1 Rhodotorula minuta [FJ515244] 98 2/573 Rhodotorula sp.
MH-1.3 3 Rhodotorula mucilaginosa [JN417631] 99 3/541 R. mucilaginosa
Deception
Porphyra endiviifolia 6030 1 Aspergillus flavus [FJ011545] 99 1/513 Aspergillus sp.3
33
5955 1 Geomyces pannorum [JF311913] 99 4/477 G. pannorum
P172.L1 3 Meyerozyma guilliermondii [JF766631] 100 10/569 M. guilliermondii
5932 1 Penicillium chrysogenum [JN561259] 100 0/439 P. chrysogenum
5958 4 Penicillium commune [JN676122] 99 1/510 P. commune
Monostroma hariotii 5995 1 Geomyces pannorum [DQ189229] 99 3/517 G. pannorum
6311 Verticillium antillanum [AJ292392] 96 7/278 Verticillium sp.
6292 2 Verticillium leptobactrum [AB214657] 98 0/461 V. leptobactrum
aUFMGCB = Coleção de Cultura de Microrganismos e Células da Universidade Federal de Minas Gerais.
34
5.4 Diversidade da comunidade fúngica algícola
A abundância dos táxons fúngicos associados as macroalgas P. endiviifolia e M. hariotii
mostrada na Tabela 4. O cálculo da abundância de cada táxon foi realizado a partir do
total de 232 fungos identificados. Os gêneros encontrados com maior freqüência foram
Cadophora, Cryptococcus, Geomyces, Guehomyces, Metschnikowia e Penicillium. O
gênero Penicillium foi prevalente com 25,4% do total de isolados identificados. A
espécie Penicillium chrysogenum foi a mais isolada deste gênero (40,7%), seguida por
Penicillium steckii (30,5%); ambas as espécies foram encontradas nas duas macroalgas
estudadas, no entanto apenas P. chrysogenum foi encontrado nas algas coletadas nas três
ilhas. O gênero Penicillium é encontrado desde os trópicos até regiões polares e é
considerado cosmopolita (MCRAE et al., 1999). Algumas espécies de Penicillium têm
sido isoladas de diferentes amostras antárticas, como solo, sedimento de lagos, musgos
e aves, além de amostras de água de glaciais e gelo do Ártico (BAUBLIS et al., 1991;
MCRAE et al., 1999; GUNDE-CIMERMAN et al., 2003; BRUNATI et al., 2009). As
espécies do gênero Penicillium são consideradas generalistas, o pode que explicar a
colonização de diferentes macroalgas não relacionadas taxonomicamente (ZUCCARO
et al., 2008, SURYANARAYANAN, 2012). No continente antártico, uma espécie do
gênero (Penicillium sp.) foi obtida também a partir do talo da macroalga Adenocystis
utricularis (LOQUE et al., 2010). Estes resultados mostram que espécies do genero
Penicillium são encontradas comumente colonizando os talos de algas da Antártica.
A espécie mais abundante foi Metschnikowia australis (17,2%). Metschnikowia
australis é uma levedura indígena do continente antártico e já foi encontrada na água do
mar e sedimento marinho da Antártica (FELL et al., 1968, VAZ et al., 2011), associada
aos talos das macroalgas A. utricularis, D. anceps e P. decipiens (LOQUE et al., 2010)
e do estômago do krill antártico Euphausia superba (DONACHIE & ZDANOWSKI,
1998). Esta espécie foi obtida em ambas as macroalgas amostradas no presente estudo,
mas apenas nas amostras da ilha Rei George.
No presente estudo, o gênero Geomyces apresentou 11,6% de abundância.
Geomyces pertence à família Myxotrichaceae (Ascomycota). As espécies deste gênero
são generalistas e de ampla distribuição em ambientes frios e também exibem alta
tolerância a baixas temperaturas, dessecação e alta salinidade. De acordo com Arenz e
cols (2006) as espécies do gênero Geomyces em geral são capazes de colonizar e utilizar
35
diferentes fontes de carbono. Estes fungos foram isolados como os mais abundantes em
amostras de madeira em decomposição da Antártica por Blanchette e cols (2010).
Geomyces pannorum é um dos fungos mais freqüentemente relatados da Antártica
(ARENZ et al.; 2011). Loque e cols (2010) obtiveram 21 isolados de G. pannorum
dentre os 27 fungos filamentosos isolados de três macroalgas antárticas. A espécie
também foi isolada por Zuccaro e cols (2008) a partir da macroalga Fucus serratus
coletada no nordeste da ilha de Helgoland, Alemanha. A presença de G. pannorum em
diferentes macroalgas pode ser explicada pela capacidade de tolerância deste fungo às
condições extremas encontradas na Antártica. Além disso, a associação com algas na
Antártica pode indicar que este fungo tem um papel importante na decomposição e
ciclagem de nutrientes destas espécies de algas (LOQUE et al., 2010). Geomyces
pannorum foi a espécie comum a ambas macroalgas, e, juntamente com P.
chrysogenum foram as únicas espécies isoladas das três ilhas antárticas.
A espécie Cadophora malorum foi isolada apenas da macroalga P. endiviifolia
oriunda da ilha Elefante e representou 10% do total de isolados identificados. Espécies
de Cadophora são amplamente distribuídas no continente Antártico (ARENZ &
BLANCHETTE, 2011) e já foram isoladas a partir de diferentes substratos antárticos
tais como sítios históricos (ARENZ & BLANCHETTE, 2011), em associação com
líquens e musgos (MÖLLER & DREYFUSS, 1996; TOSI et al, 2002), madeira e papel
(ARENZ et al., 2006.) e angiospermas antárticas (SANTIAGO et al., 2012). De acordo
com Blanchette e cols. (2010), algumas espécies de Cadophora parecem ter uma
distribuição circumpolar na Antártica e no Ártico sugerindo uma adaptação ao ambiente
polar.De acordo com Shivaji & Prasad (2009), Cryptococcus é o gênero de levedura
mais abundante no continente antártico e frequente em diferentes locais e substratos. No
presente estudo, o gênero Cryptococcus representou 10,4% das espécies identificadas e
foi o gênero de levedura basidiomicética mais frequente. O gênero foi representado
pelas espécies C. adeliensis, C. albidosimilis e C. victoriae. sendo que todas estas
espécies já foram isoladas de vários substratos da Antártica (LOQUE et al. 2010, VAZ
et al. 2011).
Por outro lado, os táxons Antarctomyces psychotrophicus, Aspergillus sp.,
Aspergillus sp.3, Candida sake, Cladosporium sp., Cladosporium sp.1, C. adeliensis, D.
australiensis, E. nidulans, L. scotti, Mortierella sp., O. truncatum, Penicillium sp.2,
Penicillium sp.3, Penicillium sp.4, Rhodotorula sp., e Verticillium sp. foram menos
abundantes nas algas estudadas no presente trabalho. Apesar de pouco abundantes,
36
todos os gêneros já foram isolados a partir de diferentes substratos antárticos.
Antarctomyces psychrotrophicus é citado como endêmico da Antártica, sendo já isolado
a partir de amostra de solo da Ilha Ross e dos lagos antárticos (GONÇALVES, 2011).
Loque e cols (2010) isolaram pela primeira vez essa espécie a partir de um substrato
vivo, a macroalga A. utricularis, coletada na Baía do Almirantado, Península Antártica.
Aspergillus é um gênero que contém espécies cosmopolitas normalmente isoladas a
partir do solo, detritos de plantas, e como endofítico (ROSA et al., 2010). Na Antártica,
o gênero já foi isolado a partir de solo ornitogênico (WICKLOW, 1968) e da
angiosperma Colobathus quitensis (ROSA et al., 2010). O gênero é frequentemente
encontrado em diferentes macroalgas já que algumas espécies do gênero são
generalistas e capazes de suportar os metabólitos tóxicos produzidos pela alga
(SURYANARAYANAN, 2012). Candida sake ocorre em diferentes ambientes
aquáticos, incluindo lagoas, algas, o solo da costa, lagos e fezes de pinguins de
ambiente antárticos (GOTO et al., 1969, VAZ et al., 2011 ). Cladosporium é
considerado cosmopolita e tem sido isolado a partir de diferentes substratos no
continente Antártico, como madeira em decomposição, sedimento de lagos, solo, em
fezes ou associados a aves, amostras de gelo, água de lagos e associados a musgos e
liquens (ELLIS-EVANS, 1985; DEL FRATE & CARETTA, 1990; VISHNIAC, 1996;
ARENZ & BLANCHETTE, 2009; BRUNATI et al., 2009; BLANCHETTE et al.,
2010). Assim como Aspergillus e Penicillium, Cladosporium é um gênero
frequentemente associado a diferentes macroalgas (SURYANARAYANAN, 2012).
Mortierella é um gênero comumente encontrado na Antártica (ADAMS et al., 2006) e
parece ser um táxon adaptado a ambientes com baixas temperaturas (SOGONOV &,
VELIKANOV, 2004).
37
Tabela 4 Número de isolados e porcentagem de abundância dos fungos isolados.
A diversidade de espécies nos diferentes locais de coleta foi avaliada pelos
índices de diversidade: Shannon (H’) e Simpson (Tabela 5). O índice de Shannon
relaciona dois componentes de diversidade, a riqueza de espécies e a equitabilidade,
atribuindo maior peso ao primeiro componente (SHANNON & WEAVER, 1949). De
forma que, quanto maior for o valor do índice, maior a riqueza de espécies e, quanto
menor o valor do índice, menor a riqueza de espécies. As macroalgas da ilha Elefante
Local de coleta e número de isolados
Deception Elefante Rei George Abundância (%)
Antarctomyces sp. - 1 - 0,4
Aspergillus sp - 1 - 0,4
Aspergillus sp.2 - 2 - 0,8
Aspergillus sp.3 1 - - 0,4
Cadophora malorum - 24 - 10
Candida sake - - 1 0,4
Cladosporium sp. - 1 - 0,4
Cladosporium sp.1 - 1 - 0,4
Cryptococcus adeliensis 1 - - 0,4
Cryptococcus albidosimilis - - 18 7,8
Cystofilobasidium
infirmominiatum
- - 2 0,8
Cryptococcus victoriae - - 5 2,2
Dipodascus australiensis - - 1 0,4
Emericella nidulans - 1 - 0,4
Geomyces pannorum 2 17 8 11,6
Guehomyces pullulans - - 22 9,5
Leucosporidium scotti - - 1 0,4
Metschnikowia australis - - 40 17,2
Meyerozyma guilliermondii 3 - 2 2,2
Mortierella sp. - 1 - 0,4
Oidiodendron truncatum - 1 - 0,4
Penicillium commune 4 8 - 5,2
Penicillium chrysogenum 1 21 2 10,3
Penicillium steckii - 18 - 7,8
Penicillium sp. - 2 - 0,8
Penicillium sp.2 - 1 - 0,4
Penicillium sp.3 - 1 - 0,4
Penicillium sp.4 - 1 - 0,4
Rhodotorula laryngis - - 7 3
Rhodotorula mucilaginosa - - 3 1,3
Rhodotorula sp. - - 1 0,4
Thelebolus sp. - 2 - 0,8
Verticillium leptobactrum 2 - - 0,8
Verticillium sp. 1 - - 0,4
Total 15 (6,5%) 104 (44,8%) 113 (48,7%) 232 (100%)
38
apresentaram os maiores índices, H’= 1,9 para P. endiviifolia e H’ = 1,8 para M.
hariotti. A macroalga Monostroma hariotti presente na ilha Rei George também
apresentou o mesmo índice (H’ = 1,8). Os valores encontrados podem ser explicados,
uma vez que o índice de Shannon atribui maior peso a riqueza de espécies e, pelo fato
desses terem apresentado o maior número de táxons. Da mesma forma M. hariotti
presente em Deception apresentou o menor número de táxons e consequentemente o
menor índice H’ (1).
O índice de Simpson também foi utilizado para calcular a diversidade da
comunidade fúngica das algas amostradas. Esse índice indica a probabilidade de dois
indivíduos retirados ao acaso da comunidade pertencer a espécies diferentes, atribuindo
assim maior peso para a equitabilidade (SIMPSON, 1949). Portanto, quanto mais alto
for o índice, maior a probabilidade de os indivíduos serem da mesma espécie, ou seja,
maior a dominância e menor a diversidade. O maior índice foi encontrado nas ilhas
Elefante e Rei George (0,8), para P. endiviifolia e M. hariotti, respectivamente,
indicando a presença de dominância de alguns táxons e menor diversidade.
Aparentemente, não foi possível inferir sobre a diversidade e composição da
comunidade fúngica através dos dados físico-químicos já que os valores encontrados
foram semelhantes para as três ilhas amostras.
39
Tabela 5 Dados físico-químicos, abundância e diversidade dos fungos associados às macroalgas Porphyra endiviifolia e Monostroma hariotii
coletadas nas ilhas antárticas.
Ilhas/macroalgas
Elefante Rei George Deception
P. endiviifolia1 M. hariotii
2 P. endiviifolia M. hariotii P. endiviifolia M. hariotii
Número de táxons 13 9 4 12 5 3
Número de isolados 77 27 16 98 10 4
Shannon H 1,9 (1,6/2,1)3 1,8 (1,2/1,9) 1,1 (0,7/1,3) 1,8 (1,5/1,9) 1.4 (0,7 /1,6) 1 (0/1)
Simpson’s 0,8 (0,7/0,8) 0,7 (0,6/0,8) 0.6 (0,4/0,7) 0,8 (0,7/0,8) 0,7 (0,5/0,8) 0.6 (0/0,6)
Salinidade 33 35,2 32,8 32,8 32,1 32,1
Condutividade 50,6 55,4 27,23 27,23 32,1 32,1
Temperatura 2,1 2,1 0,5 0,5 3,7 3,7
pH 7,74 8,24 7,74 7,74 7,49 7,49
Oxigênio dissolvido 34,6 100 100 100 79,9 79,9 1Porphyra endiviifolia;
2Monostroma hariotii;
3Os valores em parênteses representam os valores mínimos e máximos, respectivamente, com um
intervalo de confiança de 95% e valor de bootstrap calculado com 1.000 repetições.
40
A similaridade entre as comunidades de fungos dos lagos amostrados foi
estimada utilizando-se o coeficiente de Sorensen (QS) e o índice de Bray-Curtis (B). O
coeficiente de Sorensen é utilizado para dados binários (presença ou ausência); atribui
mais peso sobre as ocorrências comuns do que em desencontros, e utiliza valores entre 0
(nenhuma similaridade) e 1 (similaridade absoluta) (KREBS, 1999). O índice de Bray-
Curtis (B) atribui maior peso a abundância das espécies, de forma que os valores mais
próximos de 0 indicam que as comunidades não compartilham nenhuma espécie e os
valores próximos de 1 indicam que as comunidades compartilham todas as espécies
com a mesma abundância (BRAY & CURTIS, 1957). As algas coletadas nas ilhas
Deception e Elefante apresentaram maior similaridade para os dois índices (Figura 8) e
compartilharam apenas três táxons (Figura 11), sendo estes, G. pannorum, P.
chrysogenum e P. commune. Doze táxons foram exclusivos da ilha Rei George, 15 da
ilha Elefante e três de Deception. As algas das ilhas Rei George e Elefante
compartilharam apenas dois táxons, sendo estes P. chrysogenum e G. pannorum. Estas
espécies foram as únicas comuns às algas coletadas nas três ilhas antárticas. Para a
macroalga P. endiviifolia (Figura 9), utilizando-se o QS (Figura 9A), a maior
similaridade ocorreu entre as ilhas Rei George e Deception, o que não se repetiu para o
B (Figura 9B), onde Rei George e Elefante apresentaram maior similaridade. Essa
diferença ocorre, pois o índice de Sorensen atribui mais peso às ocorrências comuns, já
Bray-Curtis à abundância de espécies.
A comunidade fúngica de M. hariotti apresentou maior similaridade entre as
ilhas Deception e Elefante para ambos os coeficientes (Figura 10), e compartilharam
apenas o fungo filamentoso G. pannorum (Figura 10). A comunidade fúngica associada
à M. hariotti coletada na ilha Rei George não compartilhou nenhuma espécie com as
comunidades das ilhas Elefante e Deception. Algumas espécies foram compartilhadas
entre as macroalgas, no entanto, os valores obtidos dos índices variaram de 0-0,3;
valores muito próximos a um, indicando que as comunidades de fungos das macroalgas
são pouco similares.
Desde o início do século XX tem sido proposto que os micro-organismos
possuem uma distribuição ubíqua. Essa hipótese sugere que os micro-organismos se
dispersam facilmente e, como conseqüência não existe o isolamento geográfico entre
populações (FINLAY & CLARKE, 1999). A dispersão é o movimento de populações
para pontos distantes dos locais de origem. Compreende não só o transporte físico de
uma região para outra, mas também o estabelecimento e a colonização de novas regiões
41
geográficas por populações emigrantes (RAMETTE & TIEDJE, 2007). Desta forma,
como os micro-organismos geralmente não apresentam limitação pela dispersão, a
presença de um determinado micro-organismo em um ambiente estaria relacionada a
fatores locais, tais como pH, temperatura, salinidade, nutrientes, entre outros, sendo
então, o ambiente responsável pela estruturação das comunidades (BEISNER et al.,
2006, MAZARIS et al., 2010). Apesar dos fatores que determinam a diversidade e a
distribuição dos fungos algícolas não serem conhecidos, as condições ambientais
parecem ser responsáveis pela seleção das espécies fúngicas que colonizam as
macroalgas, já que a comunidade fúngica das macroalgas apresentou pouca
similaridade. As espécies fúngicas que colonizam as macroalgas parecem então,
apresentar poucas espécies dominantes, uma baixa especificidade ao hospedeiro sendo
estas capazes de colonizar espécie de macroalgas taxonomicamente não relacionadas.
42
A
B
Figura 8 Dendograma representando a similaridade entre a comunidade fúngica de
Porphyra endiviifolia das três ilhas antárticas. DE, Deception; EL, Elefante; RG, Rei
George.
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4 2.8 3.2 3.6 4
0
0.12
0.24
0.36
0.48
0.6
0.72
0.84
0.96
Similaridade
DE RG EL
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4 2.8 3.2 3.6 4
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
Similaridade
RG DE EL
43
A
B
Figura 9 Dendograma representado a similaridade da comunidade fúngica entre as
ilhas antárticas. DE, Deception; EL, Elefante; RG, Rei George.
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4 2.8 3.2 3.6 4
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Similaridade
DE EL RG
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4 2.8 3.2 3.6 4
0
0.12
0.24
0.36
0.48
0.6
0.72
0.84
0.96
Similaridade
DE EL RG
44
A
B
Figura 10 Dendograma representando a similaridade fúngica entre a comunidade
fúngicas de Monostroma hariotti das três ilhas antárticas. DE, Deception; EL,
Elefante; RG, Rei George.
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4 2.8 3.2 3.6 4
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1 DE EL RG
Similaridade
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4 2.8 3.2 3.6 4
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1 DE EL RG
Similaridade
45
Figura 11 Esquema representando o número de táxons compartilhados.
5.4 Determinação da atividade antimicrobiana
No presente estudo, 218 extratos dos fungos algícolas foram avaliados para atividade
antimicrobiana a uma concentração de 250 μg/mL. Os extratos que apresentaram inibição do
crescimento dos micro-organismos alvos ≥60% foram considerados candidatos para novos
estudos e para o isolamento dos metabólitos ativos. Dentre os extratos avaliados, oito (0,04%)
foram ativos contra pelo menos um dos alvos testados (Tabela 6). Nenhum extrato foi
considerado promissor em relação à inibição das bactérias alvo. Os extratos de Geomyces
pannorum UFMGCB6029, Guehomyes pullulans UFMGMH4.1, Metschnikowia australis
UFMGMH19.2 e UFMGNH24.2, Metschnikowia australis UFMGMH40.1 e UFMGMH50.3
foram ativos contra C. krusei, levedura oportunista resistente aos antifúngicos fluconazol
(PELLETIER et al., 2005) e, alguns isolados, a anfotericina B (KROMERY & BARNES,
2002). Espécies do gênero Geomyces, isoladas de sedimento e água de lagos antárticos,
também apresentaram atividade antifúngica contra C. albicans, Cryptococcus neoformans e
Paracoccidioides brasiliensis (BRUNATI et al., 2009, GONÇALVES, 2011). No presente
46
trabalho, o isolado UFMGCB6031, identificado como Dipodascus australiensis, apresentou
atividade contra C. albicans e o isolado Geomyces pannorum UFMGCB5987 atividade
promissora contra C. sphaerospermum. O maior número de isolados fúngicos considerados
ativos foi obtido de algas coletadas na Ilha Rei George (62%), seguido da Ilha Elefante
(38%). Os fungos obtidos das macroalgas coletadas na ilha Deception não apresentaram
atividade antimicrobiana. A macroalga Monostroma hariotti apresentou maior número de
extratos promissores (75%).
75%
25%
Monostroma hariotti Porphyra endiviifolia
62%
38%
0%
Rei George Elefante Deception
Figura 12 Porcentagem de fungos ativos por macroalga e área de coleta.
47
Trabalhos de triagem utilizando fungos presentes em ambientes tropicais como fonte
de metabólitos bioativos mostram que a porcentagem de atividade pode variar de
aproximadamente 10 a 40% (ROSA et al., 2003; HUANG et al., 2008; VAZ et al., 2009;
VIEIRA et al., 2012; SANTIAGO et al., 2012). No presente estudo, a porcentagem de
extratos ativos produzidos pelos fungos algícolas foi menor quando comparados com os
resultados de Brunati e cols (2009), Gonçalves (2011) e Santiago e cols (2012), este resultado
está abaixo da faixa limite exibida em outros trabalhos de bioprospecção de isolados fúngicos
quanto à atividade antimicrobiana.
Os metabólitos secundários, ou produtos naturais, podem ser definidos como
substâncias de baixo peso molecular, normalmente produzidos em resposta a condições
ambientais específicas, compostos por variadas e sofisticadas estrutura química que,
geralmente, são produzidos somente na fase estacionária do crescimento (ROBINSON et al.,
2001, ROSA et al., 2011). A composição do meio de cultura tem um grande impacto no
crescimento e produção de metabólitos secundários (BODE et al., 2002; NIELSEN et al.,
2004; BÉRDY, 2005;). As condições ótimas para o crescimento e produção de metabólitos
podem variar em níveis intra ou interespecífico. Além de fatores gerais como fonte de
carbono, nitrogênio, temperatura, areação e tempo de cultivo, alguns micro-organismos
requerem estimulação por moléculas sinais provenientes de outros micro-organismos
(LARSEN et al., 2005). O meio de cultivo é fundamental para a produção de metabólitos
secundários. Alterações na composição do meio de cultivo ou a adição de certos inibidores e
precursores ao meio aumentam ou induzem a síntese de metabólitos pelo fungo
(SURYANANYANAN, 2012). Do mesmo modo, o co-cultivo dos fungos marinhos com
outros micro-organismos marinhos ativa os clusters dos genes silenciados do fungo
permitindo que este sintetize novos metabólitos (BRAKHAGE & SCHROECKH, 2011). Oh e
cols (2007) relataram que o fungo marinho Emericella sp. sintetiza emericelamidas quando
co-cultivado com o actinomiceto marinho Salinispora arenicola devido ao aumento da
expressão do gene da emericelamida. Similarmente, Pestalotia sp. sintetiza pestalona, um
potente antibiótico contra Staphylococcus aureus meticilina-resistente, quando cultivado com
uma bactéria marinha (CUETO et al., 2001). Assim, a presença e a produção de metabólitos
secundários podem estar diretamente relacionadas ao habitat e interação direta com seu
hospedeiro, ou as atividades funcionais desses fungos estão relacionados com outras
propriedades biológicas e por essa razão, não se pode excluir a possibilidade de que esses
micro-organismos tenham alguma atividade biológica diferente das investigadas neste estudo.
48
Neste trabalho utilizou-se o Agar marinho como meio de isolamento e cultivo. Este meio é
relativamente seletivo para os micro-organismos marinhos, no entanto, este meio pode não ter
sido favorável à produção de metabólitos antimicrobianos pelos fungos isolados das
macroalgas estudadas. A utilização de outros meios de cultura poderia levar a resultados
diferentes dos encontrados no presente trabalho quanto a a atividade antimicrobiana dos
fungos estudados.
49
Tabela 6 Atividade antimicrobiana dos extratos brutos obtidos dos fungos associados às macroalgas antárticas.
Porcentagem de inibição (%)
Bactérias Leveduras Fungo filamentoso
Táxon UFMGCB1 E. coli S. aureus P. aeruginosa C. albicans C. krusei C. sphaerosperum
Geomyces pannorum 5987 0 0 ± 2 0 ± 5 57,8 ± 50 29,2 ± 23 95,2 ± 116
Geomyces pannorum 6029 0 0 ± 3 0 ± 3 28,9 ± 13 60,6 ± 1 0
Dipodascus australiensis 6031 0 0 0 ± 4 70,7 ± 192 41,5 ± 5 0
Guehomyes pullulans MH4.1 0 0 0 ± 4 41,6 ± 6 63,9 ± 0 29 ± 40
Não identificado MH19.2 0 0 ± 1 0 ± 6 22,1 ± 21 62,7 ± 15 0
Metschnikowia australis MH24.2 0 0 0 ± 1 34,5 ± 1 60,8 ± 4 0
Metschnikowia australis MH40.1 0 0 0 ± 2 35,5 ± 1 61,3 ± 1 0
Metschnikowia australis MH50.3 0 0 ± 1 0 0 62,2 ± 3 41,2 ± 15
Controles Clo2 100 ±4,9 97,7±121 83±6,2 - - -
Anfo B3 - - - 100±53 100±12,5 -
Ben4 - - - - - 94,5±96,5
50
Nota: E. coli, Escherichia coli; S. aureus, Staphylococcus aureus; P. aeruginosa, Pseudomonas aeruginosa; C. albicans, Candida albicans; C. krusei,
Candida krusei; C. sphaerosperum, Cladosporium sphaerospermum. 1UFMGCB, Coleção de Cultura de Micro-organismos e Células da Universidade
Federal de Minas Gerais. 2Clo, droga antibacteriana controle, cloranfenicol.
3Anf B, droga antifúngica usada contra leveduras, anfotericina B.
4Ben,
droga antifúngica usada contra fungos filamentosos, benomil
51
5.5 Atividade enzimática extracelular
Diferentes enzimas tem sido relatadas a partir de micro-organismos antárticos, sendo a
maioria de origem bacteriana (KRISHNAN et al., 2011) e poucas de origem fúngica (RAY et
al. 1992). A atividade extracelular enzimática desempenha um papel importante na
degradação de macromoléculas, já que os produtos da degradação podem ser posteriormente
absorvidos pelas células ou disponibilizados para outros micro-organismos na cadeia
alimentar.
A atividade enzimática extracelular dos fungos associados às macroalgas da Antártica
é mostrada na Tabela 7. Cento e trinta e um isolados (71%) apresentaram pelo menos uma
atividade extracelular enzimática para os substratos testados. A atividade esterásica foi a mais
expressa, sendo positiva para 68% dos isolados, seguida pelas atividades amilásica (43%),
proteásica (38%), celulolítica (13%) e xilanolítica (0,16%). A atividade esterásica é bem
difundida e documentada para os fungos. Fenice e cols (1997) avaliaram a produção de
enzimas extracelulares de fungos antárticos e a atividade esterásica também foi a atividade
predominante. O considerável percentual de atividade amilásica pode estar associado ao fato
de que as macroalgas acumulam amido nos cloroplastos como substância de reserva. Dentre
os cinco isolados testados de Aspergillus, quatro (80%) foram positivos para produção de
protease e 3 (60%) para esterase. Dezesseis isolados de Cadophora malorum foram avaliados
e 50 e 70% apresentaram atividades amilásica e esterásica, respectivamente. Dos 24 isolados
de Geomyces pannorum avaliados, 24 (100%) apresentou atividade esterásica, 13 (54%)
amilásica, 11 (46%) proteásica e 3 (13%) celulásica. Quanto aos isolados do gênero
Penicillium 67% apresentaram atividade amilásica, 51% esterásica e 98% esterásica. A
levedura Guehomyces pullulans produziu todas as enzimas avaliadas. Fungos que produzem
um número grande de diferentes enzimas podem ter versatilidade nutricional, o que aumenta
a capacidade de colonizar diferentes ambientes, aumentando as chances de sobrevivência em
ambientes desfavoráveis (COOKE & WHIPPS, 1980). Antarctomyces sp. e Mortierella sp.
não foram capazes de hidrolisar nenhum dos substratos avaliados. Quarenta e dois por cento
das linhagens de Cryptococcus albidosimilis foram capazes de degradar celulose. Tendo em
vista que a parede celular das macroalgas é composta principalmente por celulose, C.
albidosimilis, levedura isolada da macroalga M. hariotti, pode estar associada ao processo de
decomposição desta macroalga no ambiente antártico. Os fungos filamentosos são os mais
utilizados industrialmente na produção de celulases, principalmente dos gêneros Aspergillus,
52
Trichoderma, Humicola, Penicillium, Fusarium e Phanerochaete (SINGHANIA et al., 2010),
entretanto, poucas leveduras tem sido descritas como produtoras de celulases extracelulares.
O fato de uma proporção significativa de fungos ser capaz de hidrolisar compostos naturais,
tais como lipídios, proteínas, amido e celulose sugere que estas linhagens são
metabolicamente adaptadas a ambientes frios e têm um papel ecológico significativo na
decomposição de matéria orgânica e na ciclagem de nutrientes. Além disso a produção destas
enzimas pelos fungos isolados reforça a hipótese que estes micro-organismos possuem papel
relevante na decomposição do material algal, e portanto, na ciclagem de nutrientes nos
ambientes estudados.
53
Tabela 7 Atividade enzimática extracelular dos fungos algícolas.
N°i: número de isolados; Xil: atividade xilolítica; Cel: atividade celulolítica; Ami: atividade
amilolítica; Pro: atividade proteolítica, Est: atividade esterásica
Táxons
Número de isolados positivos a
15°C
N°i Xil Cel Ami Pro Est
Antarctomyces sp. 1 0 0 0 0 0
Aspergillus 5 0 0 1 4 3
Candida sp. 1 0 0 0 1 0
Cadophora malorum 16 0 0 8 0 12
Cladosporium sp. 1 0 0 0 0 1
Cryptococcus adeliensis 1 0 1 0 0 0
Cryptococcus albidosimilis 12 0 5 1 1 4
Cryptococcus victoriae 4 0 1 0 0 2
Cystofilobasidium informominiatum 2 0 0 1 1 1
Dipodascus australiensis 1 0 0 0 0 0
Geomyces pannorum 24 0 3 13 11 24
Guehomyces pullulans 21 3 9 19 18 20
Metschnikowia australis 34 0 2 2 7 3
Mortierella sp. 1 0 0 0 0 0
Oidiodendron truncatum 1 0 0 0 0 1
Penicillium 51 0 2 34 26 50
Meyerozyma guilliermondii 3 0 0 0 0 1
Rhodotorula laryngis 1 0 0 1 0 1
Rhodotorula mucilaginosa 3 0 0 0 0 1
Rhodotorula sp. 1 0 0 0 0 1
Número total de isolados testados 184
Número de isolados positivos para as atividades
testadas
3 23 80 69 125
54
6 CONCLUSÕES
Considerando o papel ecológico das macroalgas e fungos nos ecossistemas costeiros e
antárticos, conhecer a diversidade, a distribuição e a ecologia dos fungos algícolas é de
grande importância. Além disso, esses micro-organismos podem ser utilizados como fonte
de substâncias bioativas de grande interesse biotecnológico. Assim, a partir do estudo
sobre a diversidade e bioprospecção de fungos associados às macroalgas Monostroma
hariotti e Porphyra endiviifolia, é possível concluir que:
As macroalgas presentes na Antártica constituem um potencial substrato de micro-
organismos, o que reforça a importância de novos estudos sobre a diversidade,
ecologia e biotecnologia de fungos algícolas.
Metschnikowia australis foi a espécie predominante neste estudo, uma levedura
amplamente distribuída nos ecossistemas antárticos e já isolada de talos de outras
macroalgas antárticas.
O gênero predominante de leveduras foi Cryptococcus, o qual é considerado
abundante nos ecossistemas antártico e frequentemente isolado de diferentes
substratos.
Os ensaios enzimáticos revelaram que a atividade esterásica foi prevalente entre os
fungos. Além disso, uma proporção significativa de fungos foi capaz de hidrolisar
diferentes substratos o que sugere que estes fungos são metabolicamente adaptados a
ambientes frios e podem desempenhar um papel ecológico significativo na
decomposição de matéria orgânica e na ciclagem de nutrientes.
Apenas nove extratos etanólicos foram ativos contra os alvos testados, um número
relativamente baixo quando comparado a outros trabalhos semelhantes. As condições
de cultivo e o meio de cultura Agar marinho podem não ter estimulado a produção de
metabólitos bioativos pelos fungos algícolas obtidos. Apesar disso, alguns extratos
motraram-se promissores para estudos futuros de bioprospecção.
55
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADAMS, B. J.; BARDGETT, R. D.; AYRES, E.; WALL, D. H.; AISLABIE, J.;
BAMFORTH, S.; BARGAGLIF, R.; CARYG, C.; CAVACINIH, P.; CONNELLI, L.;
CONVEYJ, P.; FELLK, J. W.; FRATIL, F.; HOGGM, I. D.; NEWSHAM, K. K.;
O’DONNELLN, A.; RUSSELLO, N.; SEPPELTP, R. D.; STEVENS, M. I. Diversity and
distribution of Victoria Land biota. Soil Biology & Biochemistry, v. 38, p. 3003-3018,
2006.
ARENZ, B.E.; BLANCHETTE, R.A. Distribution and abundance of soil fungi in Antarctica
at sites on the Peninsula, Ross Sea Region and McMurdo Dry Valleys. Soil Biology &
Biochemistry v. 43, p. 308-315, 2011
ARENZ, B. E.; HELDA, B. W.; JURGENSA, J. A.; FARRELLB, R. L.; BLANCHETTE, R.
A. Fungal diversity in soils and historic wood from the Ross Sea Region of Antarctica. Soil
Biology & Biochemistry, v. 38, p. 3057-3064, 2006.
ARENZ, B. E. & BLANCHETTE R. A. Investigations of fungal diversity in wooden
structures and soils at historic sites on the Antarctic Peninsula. Canadian Journal of
Microbiology, v. 55, p. 46-56, 2009.
BAUBLIS, J. A.; WHARTON, R. A. J.; VOLZ, P. A. Diversity of micro-fungi in an
Antarctic dry valley. Journal of Basic Microbiology, v. 31, p. 11-20, 1991.
BEISNER, B.E; PERES-NETO, P.R; LINDSTRÖM, E.S.; BARNETT, A. & LONGH, M.L.
The Role of Environmental and Spatial Processes in Structuring Lake Communities from
Bacteria to Fish. Ecology, v.87, p. 2985-2991, 2006.
BÉRDY, J. Bioactive Microbial Metabolites. The Journal of Atibiotics, v. 58, p. 1-26, 2005.
BHADURY, P.; MOHAMMAD, B. T.; WRIGHT, P. C. The current status of natural
products from marine fungi and their potential as anti-infective agents. J Ind Microbiol
Biotchnol, v. 33, p. 325-337, 2006.
BLANCHETTE, R. A.; HELD, B. W.; Arenz, B. E.; JURGENS, J. A.; BALTES N. J.;
DUNCAN, S. M.; FARRELL, R. L. An Antarctic Hot Spot for Fungi at Shackleton's
historic Hut on Cape Royds. Microbial Ecology, v. 60, p. 29-38, 2010.
BISCHOFF, V. ANTÁRTICA. Trabalho de pesquisa apresentado como requisito para a
obtenção do diploma de aprovação do curso superior de Defesa Continental- Colégio
Interamericano de Defesa. Washington D. C., 1996.
BODE, H. B.; BETHE, B.; HOLFS, R.; Big effects from small challenges: possible ways to
explore natue’s chemical diversity. ChemBioChem, p. 619-627, 2002.
BRADNER, J. R.; SIDHU, R. K.; SKOTNICKI, M. L.; SELKIRK, P. M.; NEVALAINEN,
K. M. H. A new microfungal isolate, Embellisia sp., associated with the Atarctic moss Bryum
argentum. Polar Biology, v. 23, p. 730-732, 2000.
56
BRAKHAGE; A. A., SCHROECKH, V. Fungal secondary metabolites- strategies to activate
silent clusters. Fungal Genetic Biology, v. 48, p. 15-22, 2010.
BRAY, J. R. AND J. T. CURTIS. An ordination of upland forest communities of southern
Wisconsin. Ecological Monographs, v. 27, p. 325-349, 1957.
BRODIE, J., MOERTENSEN, A.M., RAMIREZ, M.A., RUSSELL, S., RINKEL, B. Making
the links: towards a global taxonomy for the red algal genus Porphyra (Bangiales,
Rhodophyta). Journal Applied Phycology, v. 20, p. 939-949, 2008.
BRUNATI, M.; ROJAS, J. L.; SPONGA, F.; CICILIATO, I.; LOSI, D.; GÖTTLICH, E.; DE
HOOG, S.; GENILLOUD, O.; MARINELLI, F. Diversity and pharmaceutical screening of
fungi from benthic mats of Antarctic lakes. Marine Genomics, v. 2, p. 43-50, 2009.
BUGNI, T.S.; IRELAND, C. M. Marine-derived fungi: a chemically and biologically diverse
group of microorganisms. Natural Products Reports, v. 21, p. 143–163, 2004.
BURTON, H. S.; ABRAHAM, E. P. Isolation of antibiotics from a species of
cephalosporium. Cephalosporins P1, P2, P3, P4, and P5. Biochemistry, v. 50, p. 168-174,
1951.
BUZZINI, P., MARTINI, A. Extracellular enzymatic activity profiles in yeast and yeast-like
strains isolated from tropical environments. Journal of Applied Microbiology, v. 93, p. 1020-
1025, 2002.
CHILD, JACK; KELLY, PHILIP. GEOPOLÍTICA, INTEGRACÍON Y CONFLICTO EN
EL Cono Sur y la Antártida, p. 1-10, 1990.
CLARK, M. Genomics: applications to Antarctic ecosystems. Polar Biology, v. 28, p. 351-
365, 2005.
CLAYTON M.N. Evolution of the Antarctic benthic algal flora. Journal Phycology, v. 30, p.
897–904, 1994.
CONNELL, L.; REDMANC, R.; CRAIGA, S.; RODRIGUEZB, R. Distribution and
abundance of fungi in the soils of Taylor Valley, Antarctica. Soil Biology & Biochemistry, v.
38, p. 3083-3094, 2006.
COOKE, R.C., WHIPPS, J.M. Evolution of modes of nutrition in fungi parasitic on terrestrial
plants. Biology Reviews, v.55, p. 341-362, 1980.
CUETO, M.; JENSEN, P. R.; KAUFFMAN, C.; FENICAL, W.; LOBKOVSKY, E.;
CLARDY, J. Pestalone, a new antibiotic produced by a marine fungus in response to bacterial
challenge. Journal of Natural Products, v .64, p. 1444–1446, 2001.
COWAN, D. A.; TOW, L. A. Endangered Antartic Environments. Annual Review of
Microbiology, v. 58, p. 649-690, 2004.
DE GARCIA, V.; BRIZZIO, S.; LIBKIND, D.; BUZZINI, P.; VAN BROOCK, M.
Biodiversity of cold adapted yeasts from glacial meltwater Rivers in Patagonia, Argentina.
57
Federation of European Microbiological Societies (FEMS) Microbiology Ecology , v. 59, p.
331-341, 2007.
DEL FRATE, G. & CARETTA, G. Fungi isolated from Antarctic material. Polar Biology, v.
11, p. 1-07, 1990.
DHARGALKAR, V.K.; VERLECAR, X.C. Southern Ocean seaweeds: a resource for
exploration in food and drugs. Aquaculture, v. 287, n.1, p. 229 - 242, 2009.
DONACHIE, S. P.; ZDANOWSKI, M.K. Potential digestive function of bacteria in krill
Euphausia superba stomach. Aquat Microb Ecol, v. 14, p. 129-136, 1998.
ELLIS-EVANS, J. C. Fungi from maritime Antarctic freshwater environments. British
Antarctic Survey, v. 68, p. 37-45, 1985.
FELL, J. W.; HUNTER, I. L. Isolation of heterothallic yeast strains of Metschnikowia
Kamienski and their mating reaction with Chlamydozyma Wickerham. Antonie van
Leeuwenhoek, v. 34, p. 365-376, 1968.
FENICAL, W. Marine pharmaceuticals, past, presente and future. Oceanography, v.19, p.110-
119, 2006.
FENICE, M., SELBMANN, L., ZUCCONI, L., ONOFRI, S. Production of extracellular
enzymes by antarctic fungal strains. Polar Biology, v. 17, p-275-280, 1997.
FERREIRA, F. O sistema do Tratado da Antártica: evolução do regime e seu impacto na
política externa brasileira, 2009.
FINLAY, B.J.; CLARKE, K.J. Ubiquitous dispersal of microbial species. Nature, p. 400-
828, 1999.
GAMAL, A. Biological importance of marine algae. Saudi Pharmaceutical Journal, v. 18, p.1-
25, 2010.
GAMBOA, M.A. & BAYMAN, P. Communities of endophytic fungi in leaves of tropical
timber tree (Guarea guidonia: Malvaceae). Biotropica, v. 33, p.352-360, 2001.
GÓMEZ, I., WULFF, A., ROLEDA, M., HUOVINEN, P., KARSTEN, U., QUARTINO, M.,
DUNTON, K., WIENCKE, C. Light and temperature demands of marine benthic microalgae
and seaweeds in polar regions. Botanica marina, v.52, p.593-608, 2009.
GONÇALVES, V. N. Diversidade e bioprospecção de fungos presentes em lagos Antárticos.
Dissertação de Mestrado. Universidade Federal de Minas Gerais, 2011.
GOTO, S.; SUGIYAMA, J.; IIZUKA, H. Manual of Soil Fungi, 1969.
GUNDE-CIMERMAN, N.; SONJAK, S.; ZALAR, P.; FRISVAD, J. C.; DIDERICHSEN, B.;
PLEMENITAS, A. Extremophilic fungi in arctic ice: a relationship between adaptation to low
temperature and water activity. Physics and Chemistry of the Earth, v. 28, p. 1.273-1.278,
2003.
58
HUANG, W.Y.; CAI, Y.Z.; HYDE, K.D.; CORKE, H.; SUN, M. Biodiversity of endophytic
fungi associated with traditional Chinese medicinal plants. Fungal Diversity, v.33, p.61-75,
2008.
HYDE, K.D.; JONES, E.B.G.; LEAÑO, E., POINTING; S.B., POONYTH;
A.D.; VRIJMOED, L.L.P. Role of fungi in marine ecosystems. Biodiversity and
Conservation, v.7, p. 1147-1161, 1998.
JENSEN, P.R., FENICAL, W.. Fungi in marine environments. Fungal diversity, v.7, p.293–
315, 2002.
JONES, E. B. G. Fifty years or marine mycology. Fungal diversity, v. 50, p. 73-112, 2011.
JONES, E. B. G.; MITCHELL, J. I. Biodiversity of marine fungi. Nat Ist Chem Slovenia Nat
Comm UNESCO, Ljubljana, p. 31-42, 1996.
KASANA, R. C.; GULATI, A. Cellulases from psychrophilic microorganisms: a review.
Journal of Basic Microbiology, V. 51, P. 1-8, 2011.
KELECOM, A. Secondary metabolites from marine microorganisms. Anais da Academia
Brasileira de Ciências, v.74, p.151-170, 2002.
KIRK, P. M.; CANNON, P.F.; DAVID, J. C.; STALPERS, J. A. Ainsworth & Bisby’s
Dictionary of the Fungi, 2001.
KOGEJ, T.; CENE, G.; VOLKMANN, M.; GORBUSHINA, A. A.; GUNDECIMERMAN,
N. Mycosporines in Extremophilic Fungi – Novel Complementary Osmolytes. Environmental
Chemistry, v. 3, p. 105-110, 2006.
KOHLMEYER, J. Intertidal and phycophilous fungi from Tenerife (Canary Islands). Trans Br
Mycol Soc, v. 50, P. 137–147, 1967.
KOHLMEYER, J. AND B. VOLKMANN-KOHLMEYER.. Marine ascomycetes from algae
and animal hosts. Botanica Marina, v. 34, p. 1–35, 2003.
KOHLMEYER, J., KOHLMEYER, E. Marine mycology: The higher fungi. Academic Press,
1979.
KOSTADINOVA, N.; KRUMOVA, E.; TOSI, S.; PASHOVA; ANGELOVA, M. Isolation
and identification of filamentous fungi from Island Livingston, Antarctica. Biotechnology &
biotechnological, v. 23, p. 267-270, 2009.
KREBS, C.J. Ecological Methodology, 1999.
KRISHNAN, A.; ALIAS, S.A.; WONG, C.; PANG, K.; CONVEY, P. Extracellular hydrolase
enzyme production by soil fungi from King George Island, Antarctica. Polar Biology, v.34, p.
1535-1542, 2011.
59
KROMERY, V.A.; BARNES, A.J. Non-albicans Candida spp. causing fungemia:
pathogenicity and antifungal resistance. Journal of Hospital Infection, v. 50, p. 243–260,
2002.
LACHANCE, M.A., BOWLES, J.M., STARMER, W.T., BARKER, J.S.F.. Kodamaea
kakaduensis and Candida tolerans, two new ascomycetous yeasts species from Australian
Hibiscus flowers. Canadian Journal of Microbiology, v. 45, p. 172-177, 1999.
LARSEN, T.; SMEDGAARD, J.; NIELSEN, K.; HANSEN, M.; FRISVAD, J. Phenotypic
taxonomy and metabolite profiling in microbial drug discovery. Natural Product Reports, v.
22, N. 6, p. 672-695, 2005.
LOQUE, C.P. Fungos algícolas associados à macroalgas do litoral do Paraná e Península
Antártica. Dissertação de mestrado. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Universidade
Federal de Ouro Preto, 2009.
LOQUE, C. P.; MEDEIROS, A. O.; PELLIZZARI, F. M.; OLIVEIRA, E. C.; ROSA, C. A.;
ROSA, L. H. Fungal community associated with marine macroalgae from Antarctica. Polar
Biology, v. 33, p. 641-648, 2010.
MACÍAS-RUBALCAVA, M.L.; HERNÁNDEZ-BAUTISTA, B.E.; OROPEZA, F.;
DUARTE, G.; GONZÁLEZ, M.C.; GLENN, A.E.; HANLIN, R.T.; ANAYA, A.L.
Allelochemical Effects of Volatile Compounds and Organic Extracts from Muscodor
yucatanensis, a Tropical Endophytic Fungus from Bursera simaruba. Journal of Chemical
Ecology, v. 36, p. 1122-1131, 2010.
MARINELLI, F.; BRUNATI, M.; SPONGA, F.; CICILIATO, I.; LOSI, D.; VAN TRAPPEN,
S.; GÖTTLICH, E.; DE HOOG, S.; ROJAS, J. L.; GENILLOUD, O. Biotechnological
exploitation of heterotrophic bacteria and filamentous fungi isolated from benthic mats of
Antarctic lakes. Microbial Genetic Resources and Biodiscovery, p. 163-184. 2004.
MAZARIS A.D.; MOUSTAKA-GOUNI M.; MICHALOUDI E & BOBORI D. 2010.
Biogeographical patterns of freswater microand macroorganisms: a comparison between
phytoplankton, zooplankton and fish in the Eastern Mediterranean. Journal of Biogeography,
v. 37, p. 1341-1351.
MCRAE, C. F.; HOCKING, A. D.; SEPPELT, R. D. Penicillium species from terrestrial
habitats in the Windmill Islands, East Antarctica, including a new species, Penicillium
antarcticum. Polar Biology, v. 21, p. 97-111, 1999.
MENEZES, C.B.A.; BONUGLI-SANTOS, R.C.; MIQUELETOO, P.B.; PASSARINI,
M.R.Z.; SILVA, C.H.D.; JUSTO, M.R.; LEAL, R.R.; FANTINATTI-GARBOGGINI, F.;
OLIVEIRA, V.M.; BERLINCK, R.G.S.; SETTE, L.D. Microbial diversity associated with
algae, ascidians and sponges from the north coast of São Paulo state, Brazil, Microbiological
Research, v. 165, p. 466-482, 2010.
MÖLLER, C.; DREYFUSS, M. M. Microfungi from Antarctic lichens, mosses and vascular
plants. Mycologia, v. 88, p. 922–933, 1966.
MORITA, R. Y. Psychrophilic bactéria. Bacteriological Reviews, v. 39, p-144-167, 1975.
60
MUTHUVELAN, B.; RAJA, R.B. Studies on the efficiency of different extraction procedures
on the anti microbial activity of selected medicinal plants. World Journal of Microbiology and
Biotechnology, v. 24, p. 2837-2842, 2008.
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARD -
NCCLS. Método de referência para testes de diluição em caldo para determinação da
sensibilidade de leveduras à terapia antifúngica: norma aprovada. V. 22, n. 15, 2002.
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARD -
NCCLS. Método de referência para testes de diluição em caldo para determinação da
sensibilidade a terapia antifúngica dos fungos filamentosos: Norma aprovada. V. 22, n. 16,
2002.
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARD - NCCLS.
Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos por Diluição para
Bactéria de Crescimento Aeróbico: Norma Aprovada. V. 23, n. 2, 2005.
NIEHAUS, F., BERTOLDO, C., KAHLER, M., ANTRANIKIAN, G. Extrmophiles as a
source of novel enzymes for industrial application. Appl Microbiol Biotechnol, v.51, p. 711-
729, 1999.
NIELSEN, K. F; SMEDSGAARD, J.; LARSEN, T. O; LUND, F.; THRANE, U.; FRISVAD,
J. C. Chemical identification of fungi: metabolite profiling and metabolomics. Fungal
biotechnology in agricultural, food, and environmental application., p19–35, 2004.
OH, D.C.; KAUFFMAN, C.A.; JENSEN, P.R, W. Induced production of emericellamides A
e B from the marine-derived fungus Emericella sp. in competing co-culture, Journal of natural
products, v.70, p. 515-520, 2007.
OLIVEIRA, E.C.; ABSHER, T.M.; PELLIZZARI, F.M.; OLIVEIRA, M.C. The seaweed
flora of Admiralty Bay, King George Island, Antarctic. Polar Biology, v. 32, p. 1639-1647,
2009.
OLIVERA, B. M., CRUZ, L. J; DE SANTOS, V.; LECHEMINANT, G. W; GRIFFIN, D.;
ZEIKUS, R.; MCINTOSH, J. M.; GALYEAN, R.; VARGA, J.; GRAY, W. R.; RIVIER, J.
Neuronal calcium antagonists. Discrimination between calcium channel subtypes using toxin
from Conus magus venom. Biochemistry, v. 26, p. 2086-2090, 1987.
61
ONOFRI, S. A,; SELBMANN, L. A.; DE HOOG, G. S. B, GRUBE, M. C.; BARRECA, D.
A.; RUISI, S. A.; ZUCCONI, L. Evolution and adaptation of fungi at boundaries of life.
Advances in Space Research, v. 40, p.1657-1664, 2007.
ONOFRI, S.; ZUCCONI, L.; SELBMANN, L.; TOSI, S.; BARRECA, D.; RUISI, S.;
FENICE, M. Studies on Antarctic fungi. Polarnet Technical Report. Scientific And Technical
Report Series, p. 49-52, 2005.
PHONGPAICHIT, S.; RUNGJINDAMAI, N.; RUKACHAISIRIKUL, V.; SAKAYAROJ, J.
Antimicrobial activity in cultures of endophytic fungi isolated from Garcinia species. FEMS
Immunology and Medical Microbiology, v. 48, p. 367-372, 2006.
PELLETIER, R.; ALARIE, I.; LAGACÉ, R., WALSH, T.J. Emergence of disseminated
candidiasis caused by Candida krusei during treatment with caspofungin: case report and
review of literature. Medical Mycology, V. 43, P559-64, 2005.
PELLIZZARI, F.M.; ABSHER, T.M.; OLIVEIRA, E.C., OLIVEIRA, M.C.. Morfo-anatomia
e taxas de crescimento da macroalga Monostroma hariotii (Chlorophyta) da Baía do
Almirantado. XII Congresso Brasileiro de Ficologia. Brasília, 2009.
RAGHUKUMAR, C. (2006). Algal-fungal interactions in the marine ecosystem: symbiosis to
parasitism. In: Recent Advances on Applied Aspects of Indian Marine Algae with Reference to
Global Scenario, Vol. I (ed. A. Tewari), Central Salt and Marine Chemicals Research
Institute, Bhavnagar: 366- 385.
RAMETTE, A. & TIEDJE, J.M. Biogeography: an emerging cornerstone for understanding
prokaryotic diversity ecology, and evolution. Microbial Ecology, v. 53, p. 197-207, 2007.
RAY, M. K.; DEVI, K. U.; KUMAR, G. S.; SHIVAJI, S. Extracellular Protease from the
Antarctic Yeast Candida humicola. Applied And Environmental Microbiology, v. 58, p.
1918-1923, 1992.
ROBINSON, T.; SINGH, D.; NIGAN. P. Solid-state fermentation: a promising microbial
technology for secondary metabolites production. Applied Microbiology and Biotechnology,
Vol.55, p. 284-289, 2001.
ROSA, L. H. ; JOHANN, S. ; ROSA, C. A. Basidiomycetes Mushrooms of Brazilian
Tropical Rainforests: Biodiversity and Biological Applications. In: Sophie Andres and Niko
Baumann. (Org.). Mushrooms: Types, Properties and Nutrition. Hauppauge NY: Nova
Science Publishers, v. 1, p. 1-10, 2011.
ROSA, L. H.; MACHADO, K. M. G.; JACOB, C. C; CAPELARI, M.; ROSA, C. A, ZANI,
C. L. Screening of Brazilian Basidiomycetes for Antimicrobial Activity. Memórias do
Instituto Oswaldo Cruz, v. 98, p. 967-974, 2003.
ROSA, L. H.; VAZ, A. B. M.; CALIGIORNE, R. B.; CAMPOLINA, S.; ROSA, C. A.
Endophytic fungi associated with the Antarctic grass Deschampsia antarctica Desv.
(Poaceae). Polar Biology, v 32, p. 161-167, 2009.
62
ROSA, L. H.; VIEIRA, M. L. A.; SANTIAGO, I. F.; ROSA, C. A. Endophytic fungi
community associated with the dicotyledonous plant Colobanthus quitensis (Kunth) Bartl.
(Caryophyllaceae) in Antarctica. Federation of European Microbiological Societies (FEMS)
Microbiology Ecology, v. 73, p.178-189, 2010.
RYAN, G. S.; HARPER, D. A. T.; WHALLEY, J. S. PALSTAT, Statistics for
Palaeontologist. Chapman & Hall, London, 1995.
RUISI, S.; BARRECA, D.; SELBMANN, L.; ZUCCONI, L.; ONOFRI, S. Fungi in
Antarctica. Reviews in Environmental Science and Biotechnology, v. 6, p. 127-141, 2007.
SANTIAGO, I. F.; ALVES, TÂNIA M. A. ; RABELLO, ANA ; SALES JUNIOR,
POLICARPO A. ; ROMANHA, ALVARO J. ; ZANI, CARLOS L.; ROSA, CARLOS A. ;
ROSA, LUIZ H. Leishmanicidal and antitumoral activities of endophytic fungi associated
with the Antarctic angiosperms Deschampsia antarctica Desv. and Colobanthus quitensis
(Kunth) Bartl.. Extremophiles (Tokyo. Print), v. 16, p. 95-103, 2012.
SETTE, L. D.; PASSARINI, M. R. Z., DELARMELINA, C. SALATI, F.; DUARTE, M. C.
T. Molecular characterization and antimicrobial activity of endophytic fungi from coffee
plants. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 22, p.1185-1195, 2006.
SCHATZ , S. Taxonomic revision of two Pyrenomycetes associated with littoral-marine green
algae. Mycologia, v. 72, p. 110–117, 1980.
SHANNON, C. E., W. WEAVER. The Mathematical Theory of Communication. Urbana,
University of Illinois Press, 117 pp, 1949.
SHIVAJI, S. & PRASAD, G. S. Antarctic Yeasts: Biodiversity and Potential Applications.
Yeast Biotechnology: Diversity and Applications. Satyanarayana, T. & Kunze, G. (eds.) v,
2009, p. 3-18, 2009.
SILVA, E.V., MARCELINO, B.F., SANTOS, S.A., BARZA, E.C. N, FONTES JÚNIOR,
W.S., ANJOS, F.B.R. Avaliação da distribuição de macroalgas encontradas nas praias
de barra de Catuama – Pernambuco. Oceanografia e mudanças globais. Simpósio
Brasileiro de Oceanografia, p. 67-82, 2008.
SIMPSON, E. H. Measurement of diversity. Nature, v. 163, 1949.
SINGH, J., DUBEY, A., SINGH, R. Antarctic terrestrial ecosystem and role of pigments in
enhaced UV- radiations. Rev Environ Sci Biotechnol, v.10, p.63-77, 2011.
SINGHANIA, R. R.; SUKUMARAN, R. K.; PATEL, A. K.; LARROCHE, C.; PANDEY, A.
Advancement and comparative profiles in the production technologies using solid-state and
submerged fermentation for microbial cellulases. Enzyme and Microbial Technology, v.46,
p.541-549, 2010.
SOGONOV, M. V.; VELIKANOV, L. L. Soil microfungal communities. In: Onipchenko VG,
ed. Alpine ecosystems in the Northwest Caucasus. Dordrecht: Kluwer p 271- 283, 2004.
63
SOLIS, M. J. L.; DRAEGER, S.; DELA CRUZ, T.E.E. Marine-derived fungi
from Kappaphycus alvarezii and K. striatum as potential causative agents of ice-ice disease in
farmed seaweeds. Botanica Marina, v. 53, p. 587-594, 2010.
SURYANARAYANAN, T. S. Fungal endosymbionts of seaweeds. Prog Mol Subcell Biol, v.
53, p. 53-60, 2012.
SURYANARAYANAN, T. S.; VENKATACHALAM, A.; THIRUNAVUKKARASU, N.
Internal microbiota of marine macroalgae from Tamilandu coast: distribution, diversity and
biotechnological potential. Botanica Marina, v. 53, p-457-468, 2010.
SUTHERLAND, G. K. New marine fungi on Pelvetia. New Phytology, v. 14, p. 33-42, 1915.
TOSI, S.; CASADO, B.; GERDOL, R.; CARETTA, G. Fungi isolated from Antarctic mosses.
Polar Biology, v. 25, p. 262-268, 2002.
VAZ, A. B. M.; MOTA, R. C.; BOMFIM, M. R. Q.; VIEIRA, M. L. A.; ZANI, C. L.; ROSA,
C. A.; ROSA, L. H. Antimicrobial activity of endophytic fungi associated with Orchidaceae
in Brazil. Canadian Journal of Microbiology, v.55, p. 1381-1391, 2009.
VAZ, A.B.M. ; ROSA, L.H. ; VIEIRA, M. L. ; DE GARCIA, V. ; BRANDÃO, L. R. ;
TEIXEIRA, L.C.R.S. ; MOLINÉ, M. ; LIBKIND, D. ; VAN BROOCK, M. G. ; ROSA, C.
A. The diversity, extracellular enzymatic activities and photoprotective compounds of yeasts
isolated in Antarctica.. Brazilian Journal of Microbiology, v. 43, p. 1-2, 2011.
VISHNIAC, H.S.. Biodiversity of yeasts and filamentous microfungi in terrestrial
Antarctic ecosystems. Biodiversity and Conservation, v. 5, p. 1365-1378, 1996.
VISHNIAC, H. Yeast biodiversity in the Antarctic. Biodiversity and Ecophysiology of
Yeasts, The Yeast Handbook, first edn, p. 419-440. Edited by C. A. Rosa & G. Peter.
Heidelberg: Springer, 2006.
WEBBER, F. C. Observations on the structure, life history and biology of Mycosphaerella
ascophylli. Transactions of the British Mycology Society, v. 50, p. 583–601, 1967.
WICKLOW, D. T. Aspergillus fumigatus fresenius isolated from ornithogenic soil collected
at Hallett station, Antarctica. Canadian Journal of Microbiology, v. 14, p. 717–719.
WIENCKE, C., CLAYTON, M. Antarctic seaweeds. A.R.G Gantener Verlag, 2002.
WIENCKE, C.; M.N. CLAYTON, I.; GOMEZ, K.; IKEN, U.; LUDER, C. D.; AMSLER, U.;
KARSTEN, D., HANELT, K.; BISCHOF, K.; DUNTON. 2007. Life strategy, ecophysiology
and ecology of seaweeds in polar water. Reviews in Environmental Scince and
Biotechnology, v. 6, p. 95–126.
WHITE, T. J.; BRUNS, T.; LEE, S.; TAYLOR, J. Amplification and direct sequencing of
fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: INNIS, M. A.; GELFAND, D. H.;
SNINSKY, J. J.; WHITE, T. J. (Eds.) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications.
San Diego: Academic Press, p. 315-322, 1990.
64
WULFF, A., K.; IKEN, M.L.; QUARTINO, A.; AL-HANDAL, C.; WIENCKE; CLAYTON,
M. N. Biodiversity, biogeography and zonation of marine benthic micro- and macroalgae in
the Arctic and Antarctic. Botanica Marina, v. 52, p.491–507, 2009.
ZACHER, K.; RAUTENBERGER, R.; HENELT, D.; WULFF, A.; WIENCKE, C. The
abiotic environment of polar marine benthic algae. Botanica Marina, v. 52, p. 483-490.
ZHANG, C., KIM, S. Research and Application of Marine Microbial Enzymes: Status and
Prospects. Marine drugs, v.8, p.1920-1934, 2011.
ZIELINSKI, K. Bottom macroalgae of the Admiralty Bay (King George Island, South
Shetlands, Antarctica). Polish Polar Research, v.11, p.95–131, 1990.
ZUCCARO, A., MITCHELL, J.I. Fungal communities of seaweeds. The fungal community,
CRC Press, p. 533-579, 2005.
ZUCCARO, A., SCHOCH, C.L, SPATAFORA, J.W, KOHLMEYER, J., DRAEGER, S.,
MITCHELL, J.I. Detection and identification of fungi intimately associated with the
brown seaweed Fucus serratus. Applied of Environmental Microbiology, v.74, p.931-941,
2008.
ZUCCARO A., SCHULZ B., MITCHELL, J.I. Molecular detection of ascomycetes
associated with Fucus serratus. Mycology Research, v.107, p.1451-1466, 2003.
