Estudo Propolis Pasteurella

Efeito do extrato alcolico de prpolis sobre a Pasteurellamultocida in vitro e em coelhos

Regina Conceio Garcia1*, Marcos Eielson Pinheiro de S2, Hlio Langoni2 e SlviaRegina Cunha Funari1

1Centro de Cincias Agrrias, campus de Marechal Cndido Rondon, Universidade do Oeste do Paran, 85960-000, MarechalCndido Rondon, Paran, Brasil. 2Mdico Veterinrio. *Autor para correspondncia. e-mail: [email protected]

RESUMO. O ensaio in vitro objetivou avaliar o efeito do lcool PA e de diferentesconcentraes (5%, 10% e 15%) no Agar, do Extrato Alcolico de Prpolis (EAP), de trsregies do Estado de So Paulo, sobre a Pasteurella multocida, obtida a partir de swab nasal decoelhos. Por meio de outro ensaio, analisou-se o comportamento dessas bactrias em lavadotrqueo-brnquico de coelhos, alimentados com raes contendo lcool PA e diferentesconcentraes de EAP (0,1%; 0,2% e 0,3%). O lcool s foi efetivo na inibio dodesenvolvimento bacteriano in vitro na concentrao mais elevada, enquanto o EAP demonstrouefetividade em todas as concentraes. As amostras de prpolis das trs regies no diferiramentre si. No lavado trqueo-brnquico, o nmero de Unidades Formadoras de Colnias pormililitro no diferiu entre os tratamentos, porm houve uma tendncia de maior efetividade nostratamentos com EAP em relao ao lcool, acompanhando a ao in vitro.Palavras-chave: prpolis; Pasteurella multocida; coelhos.

ABSTRACT. Effect of alcohol extract of propolis on the Pasteurellamultocida in vitro and in the rabbits. The essay in vitro aimed to evaluate theeffect of alcohol and different concentrations (5, 10 and 15%) in the agar, of AlcoholicExtract of Propolis (AEP), from three regions of So Paulo State, Brazil, on Pasteurellamultocida, obtained from rabbits nasal swabs. In other essay the reaction of this bacteria wasobserved. In tracheal regions of rabbits, fed on diets with alcohol and AEP in differentconcentrations (0.1; 0.2 and 0.3%). The alcohol was only effective on the inhibition of thebacteria in vitro on highest concentration, while the AEP was effective in all concentrations.The propolis samples from three regions did not differ. In the other assay, there wasnt anydifference between treatments, but the AEP showed to be more active than alcohol againstPasteurella multocida, in the tracheal region of the rabbits, as to the action in vitro.Key words: propolis; Pasteurella multocida; rabbits.

IntroduoDe acordo com Cueto (1989), as plantas possuem

um eficiente poder protetor, sintetizando produtos deelevadas qualidades antimicrobianas e imunolgicas.As abelhas, com incrvel capacidade biosseletora,coletam as resinas de que necessitam e astransformam com uma enzima produzida por suasglndulas salivares, fornecendo-lhes cidos graxosinsaturados que potencializam as propriedadesteraputicas das resinas vegetais. Como exemplo, amolcula de pinocembrina, flavonide presente naresina de algumas rvores que, ao ser processadapelas abelhas, adquire um on que lhe facultapropriedades fotoinibidoras. Ainda segundo esseautor, a defesa antimicrobiana das plantas oprincpio geral que explica a natureza antimicrobianada prpolis. De acordo com Rojas (1989), o podergermicida da prpolis to marcante que, se algumanimal penetra na colmia, as abelhas, aps mat-lo,recobrem-no com prpolis, mumificando-o. Embora

seja utilizada desde a antiguidade como antibiticonatural, de acordo com Grange e Davey (1990), anatureza dos componentes antimicrobianos daprpolis ainda no foi elucidada, embora existamevidncias que apontem os flavonides e vriossteres do cido cafico (cido fenlico), comoresponsveis por esse efeito.

A composio qumica da prpolis varia deacordo com a origem botnica dos exsudatoscoletados pelas abelhas, como tem sido demonstradopor vrios autores, estudando prpolis de diferentesorigens geogrficas. Ghisalberti et al. (1977),analisando a composio bioqumica da prpolis doOeste da Austrlia, isolaram 4 flavononas nuncaisoladas e as associaram quelas encontradas emalgumas plantas comuns da regio, bem como Garcia-Vigueira et al. (1993), que, estudando a composioqumica da prpolis do Canad, relacionaram apinocembrina (flavonona), a crisina e a galangina(flavonas) ao Populus americano, enquanto a prpolis

Acta Scientiarum. Animal Sciences Maring, v. 26, no. 1, p. 69-77, 2004

originria do Populus europeu (Populus nigro)caracterizou-se pela presena de altos nveis de cidoscafico e isoferlico e seus steres.

Segundo Marcucci (1995), em anlises deamostras de prpolis de diferentes partes do mundo,foi observado que a composio qumica daquelasamostras procedentes da Europa, sia e Amrica doNorte no foi muito varivel, pois as fontes floraisprincipais so algumas espcies de choupo,principalmente o preto (Populus nigro). Os maisimportantes componentes dessas amostras de prpolisforam os fenlicos: flavonides, cidos aromticos eseus steres (cerca de 50% do peso da prpolis).Entretanto, a composio qumica e a origem dasresinas da Amrica do Sul so de especial interessepela riqueza da flora, sendo que amostras da prpolisoriundas do Brasil e da Venezuela confirmaram apresena de compostos incomuns e os flavonides,por exemplo, foram muito pouco observados, sendomais comuns os cidos fenlicos.

Nieva Moreno et al. (1999) compararam amostrasde prpolis de quatro localidades de Almaicha delValle (provncia de Tucumn) e de Cerrillo (provnciade Santiago de Estero), uma outra regiofitogeogrfica da Argentina. A anlise cromatogrficadas amostras das regies de Almaicha del Valle foramsemelhantes entre si, mas diferiram da amostra deCerrillo, indicando diferenas quanto s composiesdas mesmas.

Investigando a composio qumica da prpolisbrasileira de regies diferentes, Marcucci (1999)encontrou vrios compostos novos, alguns deinteresse particular, especialmente um derivado docido cumrico, pois apresentou atividadeantibacteriana e antitumoral significativas. Estescompostos esto presentes em muitas amostras deregies diferentes no Brasil, e sua fonte o exsudatodas folhas de algumas espcies de Baccharis spp.(vassourinha ou alecrim-do-campo). De acordo com oautor, isso demonstra a importncia dos cidosfenlicos para a padronizao e controle de qualidadeda prpolis.

Em relao s propriedades biolgicas, suaatividade antibacteriana tem sido a mais estudada,sendo consenso entre os autores que a prpolis ativaprincipalmente contra bactrias Gram positivas,havendo, entretanto, atividade limitada contrabactrias Gram negativas. Fernandes Jr. et al. (1997)verificaram o efeito bactericida para Staphylococcusaureus entre 6 e 9 horas de exposio concentraode 2% (V/V) de EAP, e efeito bacteriosttico comconcentraes 0,5% e 1,5%. Porm, para Escherichiacoli, embora o efeito bactericida tambm fosseobservado entre 6 e 9 horas de exposio, foramnecessrias concentraes significativamente maiores(10% e 11%). Sforcin (1996), testando a atividadeantimicrobiana in vitro da prpolis sobre linhagensbacterianas isoladas de processos infecciosos

humanos, tambm constatou a inibio docrescimento de bactrias Gram positivas em baixasconcentraes (0,4 %), enquanto as Gram negativasforam menos susceptveis a este apiterpico, sendo aconcentrao mnima inibitria de 4,5% a 8%.

Entre as bactrias testadas, esto algumas espciesdos gneros: Staphylococcus, Enteroccocus,Streptococcus, Corynebacterium, Bacillus,Salmonella, Shiguella, Enteroabcter, alm deBranhamella catarrhalis, Sarratia marcencens,Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteusmirabilis, Prototheca zopfii, Rhodococcus equi,Geothrichum candidum, Klebsiella pneumoniae,entre outras (Rojas, 1989; Grange e Davey, 1990;Langoni et al., 1994; Fernandes Jr. et al., 1995, 1997;Tosi et al., 1996; Nieva e Moreno et al., 1999;Kujumgiev et al., 1999, entre outros). Grande partedessas bactrias demonstrou resistncia maioria dosantibiticos tradicionais.

Takaisi-Kikuni e Schilcher (1994), por meio demicro-calorimetria e de microscopia eletrnica,utilizando Streptococcus agalactiae, demonstraramque a prpolis inibiu o crescimento bacteriano porimpedir a diviso celular, desorganizando ocitoplasma, a membrana citoplasmtica e a paredecelular, causando uma lise bacteriana parcial einibindo a sntese protica. De acordo com os autores,ficou evidente que o mecanismo de ao da prpolissobre clulas bacterianas complexo e que no podeser feita uma simples analogia ao modo de ao dealguns antibiticos clssicos.

A Pasteurella multocida a bactria mais comumnos coelhos de laboratrio, mas, em situaes deestresse dos animais, por temperatura, umidade e peloprprio manejo, pode causar problemas de ordemrespiratria, reprodutiva e neurolgica, diminuindo odesempenho produtivo e reprodutivo dos mesmos (DeLong e Manning, 1994). Segundo os autores, muitasdessas manifestaes clnicas so refratrias aantibiticoterapia e no h relatos de estratgia devacinao que possa prevenir todas as manifestaesda doena.

O objetivo do presente estudo foi verificar aatividade in vitro da prpolis sobre a Pasteurellamultocida, bactria Gram negativa, bem comoobservar o efeito do extrato alcolico de prpolisadicionado rao, sobre bactrias do mesmo gneroe espcie, em coelhos adultos.

Material e mtodos

Coleta de prpolisForam coletadas amostras de prpolis de apirios

nos municpios de Luiz Antonio, de Marlia(Universidade de Marlia - Unimar) e de Botucatu(Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia -Unesp, localizado na Fazenda ExperimentalLageado), todos no Estado de So Paulo.


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A prpolis foi coletada de colnias de abelhasafricanizadas Apis mellifera L., alojadas em colmiasde madeira, modelo Langstroth.

A coleta foi realizada mediante a colocao dequadros extratores de prpolis entre o ninho e a tampadas colmias, no perodo de agosto a dezembro de1999. Assim que os espaos dos extratores forampreenchidos com prpolis pelas abelhas, essa foiraspada, colocada em sacos plsticos e armazenada aoabrigo da luz.

Preparo dos Extratos Alcolicos dePrpolis (EAP)

Foram preparadas tinturas de prpolis da seguinteforma: a prpolis foi pesada, triturada, colocada emuma vasilha de vidro e coberta com lcool etlico PA(90o GL), a 30% (peso/ peso). Essa vasilha foitampada hermeticamente e mantida por 10 dias temperatura ambiente, protegida da luz, sob agitaofreqente (Sforcin, 1996). Decorrido esse perodo, assolues foram filtradas e armazenadas protegidas daluz.

Para o ensaio da susceptibilidade bacteriana invitro, foram preparados extratos com as amostras deprpolis de cada regio a ser testada. O EAP,adicionado s raes para o teste in vivo, foipreparado a partir da mistura de amostras de prpolisdos apirios de Marlia e de Botucatu, citados acima.

Susceptibilidade de Pasteurella multocidafrente ao extrato alcolico de prpolis

Os testes para determinar a sensibilidade daPasteurella multocida ao EAP foram realizados nolaboratrio de Zoonoses Bacterianas e Fngicas doDepartamento de Higiene Veterinria e Sade Pblicada FMVZ - Unesp - Campus de Botucatu, Estado deSo Paulo.

Foram utilizadas amostras de Pasteurellamultocida isoladas em meio de gar sangue bovino a10%, incubadas a 37oC, por at 96 horas. As amostrasforam obtidas a partir de swabs nasais, de coelhos doSetor de Cunicultura da FMVZ. A identificao doreferido agente foi realizada de acordo com Qinn etal. (1994), verificando-se a produo de hemlise,crescimento em Agar MacConkey, produo de indol,de urease, ornitina descarboxilase e acidificao deglicose, lactose, sacarose, maltose e manitol, alm dascaractersticas morfolgicas e tintoriais, de acordocom a tcnica de Gram. O inculo de Pasteurellamultocida a ser utilizado foi padronizado naconcentrao de 5 x 105 unidades formadoras decolnias por mililitro (UFC/mL).

Foram testadas 3 diluies do EAP (V/V): 5%,10% e 15%, para cada uma das solues obtidas nastrs regies, e o grupo controle com 5%, 10% e 15%de lcool etlico PA, com 3 repeties por tratamento,em meio de Agar crebro-corao. O extrato ou olcool, nas diferentes concentraes, foi adicionado

ao meio de cultura ainda lquido temperatura de45oC, homogeneizando-se cuidadosamente sobmovimentos rotatrios, distribuindo-se em placas dePetri, em volume de 20mL. Aps controle deesterilidade at 24 horas a 37oC, foram adicionados0,1mL do inculo s placas, espalhando-o sobre asmesmas, com o auxlio de basto de vidro estril,incubando-se a 37oC, por at 72 horas, comobservao do desenvolvimento microbiano a cada 24horas.

Recuperao de Pasteurella multocidaaps a utilizao de raes contendoextrato alcolico de prpolis

Segundo De Long e Manning (1994), a infecopor essa bactria geralmente inicia-se na cavidadenasal, quando o animal portador, ento se propagapara outras partes do sistema respiratrio porextenso direta, ou para outras partes do corpo viasangnea. Tendo-se em vista essas observaes,optou-se por fazer uma amostragem da secreotraqueal dos animais, que oferece dados maisconfiveis relacionados contaminao dos mesmospor Pasteurella multocida, obtendo-se essa a partir delavado trqueo-brnquico.

Este ensaio foi realizado no Setor de Cunicultura daFMVZ-Unesp-Botucatu, utilizando-se 40 fmeas jovens,da raa Norfolk 2000, linhagem Botucatu, com idademdia de 97 4,18 dias e peso mdio de 3273,5 293,03kg,, no incio do experimento. Essas foramsubmetidas traqueotomia para obteno do lavadotraqueal, no Setor de Cunicultura. Os animais receberamcomo medicao pr-anestsica a Acepromazina a0,2mg/kg de peso vivo, via intramuscular, e Diazepan, a10mg/ kg de peso vivo, associado ao cloridrato deKetamina, a 4mg/kg de peso vivo, via intravenosa. Emseguida, realizou-se a traqueotomia e o lavado traquealfoi obtido injetando-se 3mL de soluo salina estril a0,9% (NaCl), por animal, via transtraqueal, utilizando-seseringa descartvel de igual volume e agulha 30x7,procurando-se recuperar pelo menos 1mL do inculo.

As amostras foram transportadas ao Laboratrioem isopor com gelo, e submetidas s diluies de 10-1e 10 -2, sendo que 0,1mL de cada diluio foi semeadoem placas contendo Agar sangue bovino (10%) eAgar Mac Conkey. As placas foram incubadas a 37oCe foram realizadas leituras aps 24, 48 e 72 horas, afim de serem observados o desenvolvimento e acontagem das unidades formadoras de colnias(UFC/mL).

Os animais foram devolvidos sedados srespectivas gaiolas e, em mdia 2 horas aps ainterveno, estavam ativos, alimentando-se ebebendo gua.

Foram realizadas 2 coletas de lavado traqueal poranimal, nos dias 1 de fevereiro e 9 de maro de 2000,ou seja, antes e aps o fornecimento das raestratadas, respectivamente.


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Fornecimento de raes tratadasO lcool e o Extrato Alcolico de Prpolis (EAP),

nas diferentes concentraes descritas abaixo, foramincorporados s raes no misturador de Premix,antes da peletizao das mesmas. Uma amostra doEAP foi enviada ao laboratrio de Bromatologia daFMVZ para anlise.

As raes foram preparadas e peletizadas nafbrica de raes da FMVZ, e sua composio podeser observada na Tabela 1.

Tabela 1. Composio percentual e qumica1 da rao decoelhos utilizada (categoria de reprodutores)

Ingredientes PorcentagemMilho modoFarelo de SojaFarelo de TrigoFeno de Brachiaria decumbensleo de sojaSalCalcrioFosfato biclcicoMistura mineral e vitamnica2

30,0033,021,55

27,532,990,890,592,730,70

Total 100,00Energia Digestvel (Kcal/kg)Protena Bruta (%)Fibra em Detergente Neutro (%)Fibra em Detergente cido (%)Ca (%)P (%)Metionina + Cistina

275018,8427,2215,841,100,800,60

1Composio qumica estimada com base nos valores tabelados dos alimentos (ValadaresFilho, 2000); 2Composio do Premix Suprevit*: cido flico - 100mg; antioxidante -40mg; cobre - 2400mg; coccidiosttico - 6,6g; colina - 25g; ferro - 16.000mg; iodo -200mg; mangans - 12.000mg; niacina - 6.000mg; selnio - 40mg; vitamina A - 1.400.000UI; vitamina B1 - 500mg; vitamina B12 - 2.500mg; vitamina B2 - 1.000mg; vitamina B6 -400mg; vitamina D3 - 250.000 UI; vitamina E - 7.000mg; vitamina K3 - 400mg; zinco -10.000mg; pantotenato de clcio - 2.000mg; veculo q.s.p. 1.000g.

As raes experimentais foram fornecidas a partirde 04/02/2000. O perodo de 4 dias, at 08/02/2000,foi considerado de adaptao, no se considerando osdados de consumo nas anlises estatsticas.

Os animais, aps a obteno do lavado traqueal,foram distribudos casualmente (8 repeties) em 5tratamentos, de acordo com o tipo de rao:

- Tratamento 1: grupo controle: rao pura;- Tratamento 2: lcool PA - 25,86mL/kg de

rao;- Tratamento 3: 8,62mL de Extrato Alcolico de

Prpolis (EAP)/ kg de rao - 1000 ppm ou0,1% de Extrato Seco de Prpolis (ESP);

- Tratamento 4: 17,24mL de EAP/ kg de rao -2000 ppm ou 0,2% de ESP;

- Tratamento 5: 25,86mL de EAP/ kg de rao -3000 ppm ou 0,3% de ESP.

O Extrato Alcolico de Prpolis foi preparadocomo descrito acima, porm a prpolis bruta foi umamistura daquelas obtidas nas regies de Botucatu e deMarlia. Quando o extrato estava pronto, foramtomadas 10 amostras de 10mL e colocadas emBeckers na estufa a 65oC por 72 horas e depois a105oC, at que seus pesos secos se estabilizassem(aproximadamente 5 dias). A mdia das 10 amostrasfoi de 116mg de extrato seco por mililitro de Extrato

Alcolico. Os clculos das quantidades de ExtratoAlcolico nos diferentes tratamentos foram feitos combase no peso do extrato seco. Sempre que for citadoum tratamento com determinada proporo de ExtratoAlcolico de Prpolis (0,1%; 0,2% ou 0,3%),subentende-se que essas propores so referentes aopeso de extrato seco de prpolis por quantidade derao (peso/ peso).

As raes tratadas foram fornecidas do dia 1 defevereiro ao dia 8 de maro de 2000, totalizando 37dias. Foram fornecidos 250g de rao por animal pordia, completando-se as sobras e, semanalmente,calculando-se o consumo pela diferena entre ofornecido e as sobras.

Anlises estatsticasOs dados referentes ao teste de susceptibilidade in

vitro de Pasteurella multocida s diferentesconcentraes de prpolis de diferentes regies foramcomparados estatisticamente pelo Teste do Qui-quadrado.

Os dados referentes ao nmero de unidadesformadoras de colnias de Pasteurella multocida pormililitro de lavado trqueo-brnquico dos coelhosforam transformados, por meio da aplicao dologaritmo de (x + 5), visando-se a uma maiorhomogeneizao dos mesmos. Os dados dostratamentos foram comparados por meio de testesestatsticos no-paramtricos de Kruskal-Wallis e asmdias das duas pocas por meio do teste deWilcoxon, com 5% de probabilidade.

O delineamento foi inteiramente casualizado, com5 tratamentos e 8 repeties por tratamento.

Resultados e discusso

Susceptibilidade de Pasteurella multocidafrente ao extrato alcolico de prpolis

Os resultados do teste de susceptibilidade dePasteurella multocida in vitro ao lcool e aos extratosalcolicos com prpolis de trs localidades do estadode So Paulo, nas trs concentraes estudadas,encontram-se na Tabela 2.

Tabela 2. Pasteurella multocida: estudo da susceptibilidade invitro, frente ao lcool e ao extrato alcolico de prpolis, de trsregies do estado de So Paulo, em trs diferentes concentraes(5%, 10% e 15% - V/ V) no meio de cultura (inculo: 5 x 105unidades formadoras de colnias)

TratamentosConcentraes Tempo de leitura

( % ) 24 horas 48 horas 72 horasResultado

Finallcool 5 0 0 0 0

10 0 0 0 015 + + + +

Prpolis de 5 + ++ ++ ++Botucatu 10 ++ ++ ++ ++

15 ++ ++ ++ ++Prpolis de 5 ++ ++ ++ ++Marlia 10 ++ ++ ++ ++

15 ++ ++ ++ ++Prpolis de 5 ++ ++ ++ ++


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Luiz Antonio 10 ++ ++ ++ ++15 ++ ++ ++ ++

Obs: Os graus de inibio esto simbolizados por: 0 - sem inibio (incontveis UFC); + -inibio parcial (256 UFC/mL); ++ - inibio total (sem crescimento de colnias).

Pela tabela pode-se observar que as duasconcentraes mais baixas de lcool no meio Agar(5% e 10%) no inibiram o desenvolvimentobacteriano e a concentrao mais elevada (15%)inibiu apenas parcialmente, enquanto os extratosalcolicos, independentemente da concentrao nomeio (5%, 10% ou 15%), inibiram completamente ocrescimento bacteriano.

Estes dados foram comparados estatisticamentepelo Teste do Qui-quadrado, visto que, para a maioriados tratamentos, no houve desenvolvimento decolnias e, quando houve, o nmero de colniasformadas foi extremamente elevado e estas foramconfluentes, impossibilitando sua contagem. O testeindicou diferena significativa (c= 6,0), ao nvel de5% de significncia, entre os graus de inibio dedesenvolvimento de colnias de bactrias nos meioscom lcool e aqueles com extrato alcolico deprpolis, nas trs concentraes testadas.

Esses resultados esto de acordo com aquelesobservados por Sforcin (1996), que verificou que olcool etlico PA apresentou ao inibitria sobre ocrescimento bacteriano apenas na concentrao de15%, valor muito acima do obtido com EAP, sendode 8% a Concentrao Inibitria Mnima (CIM) maiselevada, observada para Escherichia coli eSalmonella typhimurium. Concluiu que a atividadeantibacteriana verificada no ensaio foi devidaexclusivamente aos componentes da prpolis. NievaMoreno et al. (1999) tambm no observaram efeitoantibacteriano do etanol (80%), tanto pela tcnica dadifuso em discos de papel, como pela anlise debioautografia de contato, enquanto para os extratosetanlicos de prpolis o aumento da inibio foiproporcional ao aumento das concentraes doextrato.

Quanto ao efeito do extrato alcolico de prpolissobre a Pasteurella multocida, Sforcin (1996)tambm observou inibio do crescimento debactrias Gram negativas frente a esse extrato,embora em concentraes mais elevadas do que asnecessrias para inibir as bactrias Gram positivas.Enquanto a CIM do extrato alcolico de prpolis paraStaphylococcus aureus foi de 0,40%, paraPseudomonas aeruginosa, essa concentrao foi emtorno de 5,70% e, tanto Escherichia coli quantoSalmonella typhymurium, demonstraram-se maisresistentes, com CIM de 8%. Nesse experimento, oEAP concentrao de 5% inibiu o desenvolvimentode colnias de P. multocida.

Os extratos preparados com prpolis dos trsdiferentes municpios do estado de So Paulo noapresentaram diferenas entre si, com relao inibio do crescimento de Pasteurella multocida.

Alguns autores tm estudado a correlao entre aatividade biolgica da prpolis e suas diferentescomposies, de acordo com suas regies de origem.Boudorova-Krasteva et al. (1997) avaliaram aprpolis extrada na rea de Produo de Apiculturada Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia deBotucatu, local onde foi realizado o presente estudo, eisolaram 6 compostos individuais, sendo que 3 delestm sido encontrados por outros autores em diferentesespcies de Baccharis (gnero muito difundido naAmrica do Sul) e, de acordo com Marcucci (1999),esto presentes em muitas amostras de prpolis doBrasil. Parte da prpolis utilizada neste experimento,da regio de Botucatu, provavelmente tenhacomposio qumica semelhante a esta discutida pelosautores acima, j que Sforcin (1996), utilizandoprpolis desse mesmo local, obtidas em 4 diferentespocas do ano, no observou diferenas significativasentre elas, quanto ao biolgica, e que a flora localno sofreu severas alteraes nos ltimos anos.

Essa semelhana de ao antimicrobiana entreprpolis de diferentes municpios da regio Sudesteest de acordo, de certa forma, com uma tendnciaobservada por alguns autores, como Moura et al.(1999), que no observaram grande variao no perfilcromatogrfico de amostras de prpolis da regioSudeste do Brasil, e tambm verificaram que todas asamostras inibiram mais o crescimento deStaphylococcus aureus do que de Streptococcusmutans. Kujumgiev et al. (1999) avaliaram aatividade anti-bacteriana de extrato alcolico e leosvolteis de prpolis de diferentes regies geogrficas:Bulgria, Albnia, Monglia, duas localidades doEgito, quatro localidades do Brasil (Rio Claro eLimeira - SP, Prudentpolis - PR e Pacajus - CE),duas localidades das Ilhas Canrias, alm de duasamostras brasileiras coletadas por abelhas sem ferro(gnero Meliponas). Embora uma amostra de extratoalcolico e de leo voltil de prpolis das IlhasCanrias e de uma das amostras coletadas porMeliponas no Brasil tenham mostrado atividadeantibacteriana ligeiramente maior, concluram que, demaneira geral, a atividade antibacteriana foisemelhante, independentemente de suas diferentescomposies bioqumicas, atribuindo as propriedadesanti-bacterianas da prpolis no a uma ou outrasubstncia isolada, mas s diferentes combinaesdelas, presentes nas diferentes amostras.

Alencar et al. (1999), considerando outra regiogeogrfica brasileira que apresenta grandediversidade de vegetao, analisaram a composioqumica e a atividade biolgica de prpolis dediferentes cidades da regio Nordeste do Brasil, everificaram que suas composies variaram de acordocom o tipo de vegetao local, e tambm que asamostras de prpolis da mata atlntica mostrarammaior atividade antimicrobiana frente aStaphylococcus aureus e Streptococcus mutans,


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sendo, entretanto, superadas, em termos de aoantioxidante, pelas prpolis originrias da caatingabaiana. Comparando diferentes regies brasileiras,Koo et al. (1999) verificaram que os perfiscromatogrficos das amostras da regio Sudesteforam nitidamente diferentes daqueles das amostrasda regio Sul, e a atividade antibacteriana do extratoetanlico do Rio Grande do Sul foi de 4 a 8 vezesmais potente que a de Minas Gerais.

Recuperao de Pasteurella multocidaaps a utilizao de rao contendo extratoalcolico de prpolis

Uma amostra do Extrato Alcolico incorporado rao foi enviada ao laboratrio de Bromatologia daFMVZ para anlise. A composio bromatolgica(em 100% de matria seca) foi a seguinte: 17,84% dematria seca; 1% de protena bruta; 96,06% deextrato etreo e 0,42% de minerais.

Considerando-se o desenvolvimento de colniasde Pasteurella multocida na regio trqueo-brnquicados coelhos testados, os dados referentes ao nmerode Unidades Formadoras de Colnias (UFC)/mL deinculo obtido desta regio (duas diluies), antes eaps o fornecimento das raes contendo trs nveisde Extrato Alcolico de Prpolis (EAP) e lcool,esto resumidos na Tabela 3. Os dados referem-se aonmero de UFC/mL nas placas, com diluio doinculo a 10-2, uma vez que em 10-1 as colnias foramincontveis. Os resultados dos testes no-paramtricos de Kruskal-Wallis e de Wilcoxontambm so apresentados na mesma tabela. A anliseno-paramtrica foi realizada em funo dos dadosno se ajustarem aos critrios exigidos para a anlisede varincia.

Tabela 3. Pasteurella multocida: mdias e desvios-padro dosnmeros de unidades formadoras de colnias por mililitro delavado traqueal de coelhos (8 por tratamento), alimentados comraes com diferentes quantidades de Extrato Alcolico dePrpolis - EAP (clculo sobre o extrato seco - peso /peso), ou comlcool, antes e aps o fornecimento das mesmas. Os nmeros entreparnteses referem-se aos dados transformados por log (x + 5),para efeito de anlise estatstica

Tratamentos Antes do fornecimento das raesUnidades formadoras

de colnias/mL

Aps o fornecimento das raesUnidades formadoras

de colnias/mLControle 118,50 250,08

(1,3629 0,8362)150,25 401,62 (1,2792 0,7799)

lcool 306,12 749,61 (1,5125 0,9319)

313,87 484,94 (1,6020 1,0780)

0,1% EAP 275,12 624,36 (1,6037 0,9093) a

3,50 4,11 (0,8852 0,2087) b

0,2% EAP 184,12 513,94 (1,1078 0,8541) a

186,12 526,04 (1,0182 0,8715) b

0,3% EAP 120,63 326,41 (1,1291 0,8038)

4,63 9,21 (0,8827 0,2738)

Geral 200,90 504,74 (1,3432 0,8469)

131,67 367,44 (1,1334 0,7436)

Obs: As diferenas entre os tratamentos no foram significativas pelo teste de Kruskal-Wallis; Letras diferentes na mesma linha indicam diferenas significativas entre as duaspocas, pelo teste de Wilcoxon, com P < 0,04224 e P < 0,02799, respectivamente para osdois tratamentos (0,1 e 0,2% EAP)

Pode-se observar a grande variabilidade dos dadospelos altos valores de desvios-padro estimados, tantoquando so considerados todos os dados, comoquando se consideram os valores observados dentrode cada tratamento. Pelo teste de Kruskal-Wallis, noforam encontradas diferenas significativas entre asmdias dos tratamentos aps o fornecimento deraes tratadas, porm, quando foram comparados ostratamentos controle e 0,2% de EAP, bem como estecom o lcool, as diferenas observadas (12,13 e12,50, respectivamente) aproximaram-se bastante dadiferena mnima significativa (15,94), ao nvel de5%.

Os testes de Wilcoxon, comparando as mdiasentre pocas, em cada tratamento, indicaram quehouve uma reduo significativa no nmero deUFC/mL de Pasteurella multocida no lavado trqueo-brnquico dos animais que receberam raes com0,1% de EAP (significncia de 4,22%) e 0,2% deEAP (2,8%), no diferindo para os outrostratamentos, embora os que receberam tratamentocom 0,3% tambm tenham apresentado uma tendnciade reduo.

Estes resultados, at certo ponto, confirmam osobtidos para a anlise do efeito do EAP sobre aPasteurella multocida in vitro, discutidos no itemanterior, os quais demonstraram que esse extrato, nasconcentraes testadas, foi efetivo na inibio docrescimento bacteriano, enquanto o lcool PA,utilizado como solvente, s demonstrou atividadeparcial na concentrao mais elevada. Assim, tanto invitro quanto in vivo, o extrato alcolico de prpolisfoi mais efetivo que o solvente utilizado (lcool)contra o desenvolvimento dessa bactria Gramnegativa, demonstrando o efeito antimicrobiano daprpolis.

Outro ponto importante a ser considerado nestaanlise que, durante o perodo experimental, osanimais foram submetidos ao estresse, j que foramrealizados dois lavados trqueo-brnquicos e trscoletas de sangue (discutidas em outro trabalho), almda mudana alimentar. O estresse dos animais, deacordo com De Long e Manning (1994), podedesencadear problemas de ordem respiratria,reprodutiva e neurolgica, provocados pelaPasteurella multocida, embora esta seja uma bactriacomum nos coelhos, pertencente a microbiota doaparelho respiratrio superior. Nesse aspecto, ofornecimento de extrato alcolico de prpolis podeter atuado na preveno desses quadros, uma vez que,mesmo sob situaes que causam estresse, os animaisque receberam os extratos, nas concentraes 0,1% e0,2%, apresentaram reduo na carga bacterianatrqueo-brnquica.

Os resultados obtidos nesse estudo esto deacordo com dados da literatura referentes anlise invitro, j citados acima, embora a maioria dos autorestenha demonstrado a efetividade da prpolis contra


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bactrias Gram positivas. Poucos trabalhos, porm,tm discutido o efeito da prpolis sobre bactrias emanimais, especialmente quando se trata de bactriasGram negativas.

Considerando-se algumas doenas fatoriais dosanimais, que podem ser desencadeadas por estresse,Rodriguez et al. (1989) observaram o efeito clnicodo produto NB-2, preparado a partir da prpolis,sobre a pneumonia de bezerros, geralmenteprovocada por microrganismos como Klebsiella sp.,Escherichia coli, Salmonella sp., Pasteurellamutocida, Arcanobacterium pyogenes, IBR, PI3 eleveduras. Tanto com administrao subcutnea,quanto por via intramuscular, em casos agudos ecrnicos, concluram que o produto apresentoueficcia teraputica e efeito antibitico. Fumero et al.(1989) compararam os tratamentos com NB1, outroproduto comercial base de prpolis, com aoximicina, sobre a sndrome diarrica em bezerros,em um local com foco ativo de salmonelose ecolibacilose. Os resultados indicaram umarecuperao de 100% dos animais tratados com NB,s 72 horas, e para a oximicina, efeitos maisretardados e maior nmero de tratamentos.

Em relao a protozorios, Hollands et al. (1984,1988 e 1989) testaram a atividade da prpolis sobrecoccidiose em coelhos, provocada por protozoriosdo gnero Eimeria, administrando extrato alcolicode prpolis a 2% ou 3%, via oral, na gua. Noprimeiro trabalho, testaram em 18 coelhos, por 15dias e observaram uma reduo significativa daintensidade da doena, medida pela presena deoocistos nas fezes nos animais tratados, sendo que oextrato a 3% foi mais efetivo nessa reduo emrelao quela observada nos animais do grupocontrole (lcool a 95o). No segundo experimento, osautores compararam a prpolis e sulfonamidas(sulfametazina e sulfaquinoxalina), habitualmenteutilizadas como coccidiostticos em coelhos,utilizando 12 animais, e verificaram reduessignificativas na intensidade da coccidiose, nos 2grupos tratados com as sulfonamidas (0,1% e 0,2%) ecom prpolis (3%), aps o tratamento, no havendoreduo no grupo controle (lcool a 95o). No terceirotrabalho, os autores acompanharam a mortalidade e aincidncia de diarria em 80 coelhos, 40 tratados compropolina e 40 no grupo controle (lcool a 95o),observando um perodo de recuperao duas vezesmaior dos animais do grupo controle em relao aosanimais tratados, sendo as mortalidades de 10% e30%, respectivamente, nos animais dos gruposcitados. Concluram que a propolina pode serutilizada para combater a coccidiose, sendo umtratamento mais econmico, aumentando aprodutividade pela reduo na mortalidade. Moura etal. (1998) tambm testaram o efeito do fornecimentode prpolis (0mL, 4mL, 8mL, 12mL e 16mL desoluo hidroalcolica de prpolis/litro de gua)

como coccidiosttico, a coelhos dos 40 dias aos 90dias de idade, comparando com a robenidina (0,1%na rao e gua pura) e verificaram que o ltimotratamento foi mais eficiente como coccidiostticoque o primeiro, embora o aumento na concentraoda soluo hidroalcolica de prpolis, adicionada gua de beber, tenha reduzido linearmente o nmerode oocitos de Eimeria spp. por grama de fezes.

Mazzuco et al. (1996) testaram a utilizao daprpolis e do lcool etlico no controle de Salmonellasp, em raes avcolas. A adio da prpolis (2%) sraes artificialmente contaminadas foi realizadapulverizando-se as solues sobre as mesmas, jprontas, e realizando-se a homogeneizao manual.Foi analisada a presena de bactrias nos cecos, sendoque, segundo os autores, somente a prpolis emsoluo alcolica apresentou ao sobre a bactria,enquanto a prpolis em p e em soluo aquosa noexerceram efeito sobre a mesma. Os autoresatriburam o efeito bactericida ao lcool da soluo.

No experimento da susceptibilidade daPasteurella multocida frente aos extratos alcolicosde prpolis, in vitro, o efeito da prpolis, nasconcentraes testadas, contra o desenvolvimentodessas bactrias Gram negativas foi evidente, uma vezque o lcool utilizado como solvente demonstrou umabaixa atividade contra a mesma bactria. Osresultados obtidos sobre as mesmas bactrias,alojadas na regio trqueo-brnquica dos coelhos,quando estes receberam raes com prpolis, tambmdemonstraram sua efetividade. De maneira geral,esses resultados sugerem que a prpolis pode serutilizada para auxiliar no controle dessa bactriaGram negativa, freqente nas cuniculturas, a qualpode levar a prejuzos, principalmente em situaesde estresse dos animais, como em mudanas bruscasde temperatura e umidade relativa do ar. Como foidiscutido por De Long e Manning (1994), no existevacina que possa prevenir esta doena e a mesma temdemonstrado resistncia antibioticoterapia.

Poderiam ser realizados outros experimentos,simulando-se situaes de estresse trmico, porexemplo, e, de preferncia, com a inoculaocontrolada dessa bactria em diferentes grupos deanimais, de forma a se obter maior homogeneidadedentro de cada grupo, para que se pudesse realmenteconfirmar a efetividade da prpolis sobre apasteurelose em coelhos. Alm disso, deve ser feitoum levantamento de custos em relao aosquimioterpicos geralmente utilizados, de forma a serecomendar a utilizao deste produto natural nacunicultura.

ConclusoA prpolis demonstrou ao contra a Pasteurella

multocida in vitro, e atuou tambm sobre essabactria nos coelhos, quando fornecida incorporada s


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raes, tendendo a reduzir o nmero de unidadesformadoras de colnias dessa bactria Gram negativa,em nvel trqueo-brnquico dos animais.

Dessa forma, nas condies testadas, a prpolismostrou-se favorvel como auxiliar no controle daPasteurella multocida nos coelhos, uma vez que,principalmente em situaes de estresse dos animais,os sintomas respiratrios, reprodutivos e neurolgicosprovocados por essa doena tm causado prejuzosem algumas cuniculturas.

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Documents

Estudo Propolis Pasteurella