ESTUDO QUÍMICO DE RECURSOS NATURAIS ......ESTUDO QUÍMICO DE RECURSOS NATURAIS RENOVÁVEIS DO ESTADO DE SERGIPE: Hancornia speciosa Gomes WESLEY FARIA GOMES SÃO CRISTÓVÃO – SERGIPE

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

ESTUDO QUÍMICO DE RECURSOS NATURAIS

RENOVÁVEIS DO ESTADO DE SERGIPE:

Hancornia speciosa Gomes

WESLEY FARIA GOMES

SÃO CRISTÓVÃO – SERGIPE

2010

WESLEY FARIA GOMES

ESTUDO QUÍMICO DE RECURSOS NATURAIS

RENOVÁVEIS DO ESTADO DE SERGIPE:

Hancornia speciosa GOMES

Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-

Graduação em Química da Universidade

Federal de Sergipe como parte dos

requisitos para obtenção do título de Mestre

em Química.

Orientador:

Prof. Dr. Paulo César de Lima Nogueira

Co-orientadora:

Profa. Dra. Valéria Regina de Souza Moraes

SÃO CRISTÓVÃO – SERGIPE

2010

Ao Senhor meu Deus por me conceder o dom da vida e ter

me dado a oportunidade de completar mais uma

etapa da minha vida profissional.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Aos meus pais, Leonildo Pereira Gomes e Elza Faria Gomes, pelo incentivo, amor,

carinho, repreensão. Saibam que vocês são responsáveis por grande parte dessa vitória.

Ao meu irmão Kley, pelo companheirismo, palavras de incentivo, e por sempre me

fazer acreditar que eu poderia chegar mais além do que imaginava.

A toda minha família que, sempre com palavras motivadoras, me ajudou a superar todos

os obstáculos dessa etapa. Sem contar a compreensão por algumas ausências em

reuniões familiares.

A todos os meus amigos por sempre estarem torcendo e orando pelas minhas

conquistas.

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal de Sergipe, através do Departamento de Química pela

oportunidade de execução deste trabalho.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela

concessão da bolsa de estudo.

Ao Prof. Dr. Paulo César de Lima Nogueira pela orientação. Sempre com palavras

sábias e motivadoras fez com que o meu estímulo e apreço pela pesquisa se renovasse a

cada dia.

À Profª. Drª Valéria Regina de Souza Moraes, pelos ensinamentos e palavras de

conforto e incentivo no decorrer deste trabalho.

Aos professores da graduação e pós-graduação do Departamento de Química da

Universidade Federal de Sergipe, por compartilharem um pouco de seus conhecimentos.

À Msc. Taís Santos Sampaio, pelos extratos das folhas e dos ramos da mangabeira.

Ao Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos, através do Prof.

Dr. Antônio Gilberto, pela aquisição dos espectros de Ressonância Magnética Nuclear.

À mestranda Maria Helena Verdan do Departamento de Química da Universidade

Federal do Paraná (DQ-UFPR) pela aquisição dos espectros de Infravermelho.

Ao Prof. Dr. Daniel Pereira Bezerra do Departamento de Fisiologia, do Centro de

Ciências Biológicas e da Saúde da UFS, pela análise de citotoxicidade in vitro e pelas

valiosas discussões.

A todos os meus amigos de graduação, em especial, Osmir Fabiano (pastor), Débora,

Alberto Martins, Juliana Paschoetto, Ricardo Carlos, Carla de Oliveira, Sandra Santana,

Márcia, Cléverton, por compartilharem os primeiros passos na Universidade.

Aos meus colegas de pós-graduação, em especial, Danny, Sandrinha, Cláudia, Rogério,

Márcia, Elissandro, Daniela Kubota, Amanda, pela amizade e companheirismo.

Aos meus companheiros de pesquisa, em especial, Hugo César, Adriano Aquino, Alan

Diego, Edenilson Niculau, Paloma Prata, Darlisson, por me auxiliarem nos momentos

em que mais precisei.

A todos os meus amigos do LABORGANICS, Lívia, Eraldo, Romário, Aline, Iara,

Thanany, Charlene, Pablo, pelo apoio e amizade.

E a todos os amigos e funcionários do Departamento de Química - UFS que direta ou

indiretamente, contribuíram para realização deste trabalho.

MOMENTOS

Há momentos na vida, Senhor, que penso em parar

Tantas coisas me abalam e me impedem de a Ti chegar

Noites vão e vem, mas pra mim nada mudou

Não posso esconder esse aperto em meu coração

Não posso mais ficar assim, ergo agora as minhas mãos

Teu servo, Senhor, te chama

Ouve a minha oração:

“Senhor meu Deus em Ti confio

Não me deixes confundido

Se os meus inimigos vierem contra mim

Que eu não tema os perigos que me enfrentam.”

Pr. Frank Sérgio Rodrigues dos Anjos

CURRICULUM VITAE

1. Dados Pessoais

Nome: Wesley Faria Gomes

Nome em citações bibliográficas: Gomes, W. F.

Naturalidade: Aracaju-SE

Data de Nascimento: 28/11/1984

2. Formação Acadêmica/Titulação:

2.1 Graduação

Curso: Licenciatura Plena em Química, Universidade Federal de Sergipe, UFS.

Ano de conclusão: 2007

2.2 Pós-graduação

2.2.1 Especialização

Curso: Didática e Metodologia no Ensino Superior, Faculdade Amadeus,

FAMA.

Ano de conclusão: 2008

3. Área de Atuação

Química Orgânica, Química dos Produtos Naturais

4. Produção Científica

4.1 Trabalhos em eventos

1. SANTOS, A. D. C.; JESUS, A. M.; ANJOS, C. S.; JESUS, J. R.; SILVA, T.

B.; SANTOS, D. S.; RIBEIRO, S. S; GOMES, W. F.; BEZERRA, D. P.;

COSTA, E. V.; MORAES, V. R. S.; ALVES, P. B.; PESSOA, C.;

MORAES, M. O.; COSTA-LOTUFO, L. V.; CARVALHO, A. A.;

NOGUEIRA, P. C. L. Avaliação da atividade citotóxica de plantas

medicinais do Estado de Sergipe. 33ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira

de Química – ASBQ, 2010.

2. GOMES, W. F.; NOGUEIRA, P. C. L.; SANTOS, A. C. D. Seasonal and

Drying Evaluation on Volatile composition from Leaves. In: II Brazilian

Conference on Natural Products and XXVIII Annual Meeting on

Micromolecular Evolution, 2009.

3. SANTOS, A. C. D.; NOGUEIRA, P. C. L.; GOMES, W. F.; SAMPAIO, T.

S. Estudo Químico de Recursos Naturais Renováveis do Estado de Sergipe:

Nutracêuticos da Mangaba. In: 19º Encontro de Iniciação Científica, 2009.

4. GOMES, W. F.; NOGUEIRA, P. C. L. Estudo Químico de Recursos

Naturais Renováveis do Estado de Sergipe: Hancornia speciosa Gomes. II

Encontro Sergipano de Química, 2009.

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS........................................................................................................i

LISTA DE TABELAS....................................................................................................vii

LISTA DE FLUXOGRAMAS.........................................................................................ix

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.......................................................................x

RESUMO.......................................................................................................................xiii

ABSTRACT...................................................................................................................xiv

INTRODUÇÃO

1. PRODUTOS NATURAIS E SUA BIODIVERSIDADE.......................................2

2. FAMÍLIA APOCYNACEAE.................................................................................5

3. HANCORNIA SPECIOSA GOMES......................................................................12

REVISÃO DA LITERATURA.......................................................................................17

OBJETIVOS

1. GERAL................................................................................................................27

2. ESPECÍFICOS.....................................................................................................27

PARTE 1: ESTUDO DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS DE HANCORNIA

SPECIOSA GOMES

1. CONSIDERAÇÕES GERAIS..............................................................................29

2. OBJETIVOS.........................................................................................................37

3. METODOLOGIA.................................................................................................39

3.1 OBTENÇÃO DO MATERIAL VEGETAL...................................................38

3.2 EXTRAÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL.........................................................38

3.3 IDENTIFICAÇÃO DOS COMPONENTES VOLÁTEIS.............................39

3.4 LEVANTAMENTO DOS DADOS METEOROLÓGICOS..........................42

3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA.............................................................................42

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................43

4.1 ANÁLISE DOS COMPONENTES VOLÁTEIS DAS FOLHAS DE H.

SPECIOSA......................................................................................................43

5. CONCLUSÕES....................................................................................................67

PARTE 2: ESTUDO FITOQUÍMICO DAS FOLHAS E DOS RAMOS DE

HANCORNIA SPECIOSA GOMES

1. CONSIDERAÇÕES GERAIS..............................................................................69

1.1 TRITERPENOS..............................................................................................70

2. OBJETIVOS.........................................................................................................77

3. METODOLOGIA.................................................................................................78

3.1 ISOLAMENTO DOS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS DAS

FOLHAS E DOS RAMOS DE H. SPECIOSA...............................................78

3.1.1 EQUIPAMENTOS.............................................................................78

(a) INFRAVERMELHO....................................................................78

(b) RMN 1H E 13C..............................................................................78

(c) PONTO DE FUSÃO....................................................................79

3.1.2 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS DAS FOLHAS E DOS RAMOS..79

3.1.3 ISOLAMENTO DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS DAS

FOLHAS E DOS RAMOS................................................................82

(a) PARTIÇÃO HEXÂNICA DO EXTRATO METANÓLICO

DAS FOLHAS.............................................................................82

(b) EXTRATO HEXÂNICO DOS RAMOS.....................................85

3.1.4 IDENTIFICAÇÃO POR CG/EM DA MISTURA DE

HIDROCARBONETOS PRESENTES NA FRAÇÃO HSF1............87

3.1.5 REAÇÃO DE TRANSESTERIFICAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO POR

CG/EM DOS ÉSTERES 3-β-O-ACIL LUPEOL (HSF7)..................88

4. RESULTADOS E DISCUSSÕES........................................................................90

4.1 SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DE HANCORNIA SPECIOSA GOMES.................90

4.1.1 ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DA FRAÇÃO FV1.......................90

4.1.2 ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DA FRAÇÃO HSF7...................102

4.1.3 ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DA FRAÇÃO HSF1...................120

5. CONCLUSÕES..................................................................................................134

PARTE 3: TESTES DE ATIVIDADE BIOLÓGICA...................................................135

1. CONSIDERAÇÕES GERAIS..........................................................................136

2. OBJETIVOS.....................................................................................................141

3. METODOLOGIA.............................................................................................142

3.1 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE.................................................................142

3.2 CITOTOXICIDADE....................................................................................143

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................................145

5. CONCLUSÕES................................................................................................152

CONSIDERAÇÕES FINAIS........................................................................................153

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................156

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estruturas da vincristina e vimblastina............................................................7

Figura 2: Fotos de espécimes de (a) Himatanthus sucuuba e (b) Plumeria rubra..........8

Figura 3: Substâncias isoladas do caule de Laseguea erecta..........................................9

Figura 4: Estruturas de triterpenos isolados do látex de Himatanthus sucuuba

(Apocynaceae).................................................................................................................10

Figura 5: Iridóides isolados do látex de H. sucuuba......................................................11

Figura 6: Foto de um espécime de Hancornia speciosa Gomes....................................12

Figura 7: Fotos (a) da Flor; e (b) dos Frutos de H. speciosa........................................13

Figura 8: Frutos com sementes secas da mangabeira....................................................14

Figura 9: Metabólitos secundários encontrados nas cascas de H. speciosa.................19

Figura 10: Estruturas químicas de proantocianidinas diméricas do tipo B: (1)

epicatequina-(4β→8)-catequina, (2) epicatequina-(4β→6)-catequina, e

proantocianidinas diméricas do tipo A: (3) epicatequina-(2β→7; 4β→8)

epicatequina.....................................................................................................................20

Figura 11: Substâncias isoladas do látex dos frutos de H. speciosa..............................21

Figura 12: Estruturas químicas dos ciclitóis..................................................................23

Figura 13: Possível rota biossintética de terpenóides via ácido mevalônico. (1)

Fosforilação sequencial do álcool primário para o difosfato. (2) ATP facilita a

eliminação. Não há nenhuma evidência de fosforilação da hidroxila terciária.............30

Figura 14: Rota biossintética de formação do Pirofosfato de Geranila........................31

Figura 15: Rotas biossintéticas do LPP e NPP.............................................................31

Figura 16: Possível rota biossintética do óxido de linalol. OPP=Difosfato..................33

Figura 17: Estruturas químicas do óxido de linalol na sua forma furânica e

pirânica...........................................................................................................................34

Figura 18: Rota biossintética do geraniol a partir do GPP..........................................34

Figura 19: Rota biossintética do α-terpineol a partir do LPP......................................35

Figura 20: Estruturas químicas do mentol e mentona..................................................35

i

Figura 21: Técnica da hidrodestilação utilizando aparelhagem do tipo Clevenger....39

Figura 22: Principais compostos identificados na análise de óleo essencial das folhas

de H. speciosa variando-se o tempo de secagem e época de colheita............................44

Figura 23: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM

(coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das folhas frescas e secas do mês de

janeiro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos

citados na Tabela 1..........................................................................................................47



fevereiro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos




março de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos




abril de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos




maio de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos




junho de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos


ii



julho de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos




agosto de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos




setembro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos

compostos citados na Tabela 2........................................................................................55



outubro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos




novembro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos




dezembro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos


Figura 35: Rendimento (%) do óleo essencial das folhas frescas e secas de H.

speciosa...........................................................................................................................60

Figura 36: Dados de precipitação total e média das temperaturas máxima e mínima do

município de São Cristóvão fornecidos pela Empresa de Desenvolvimento

Agropecuário de Sergipe (EMDAGRO) e pelo Sistema de Monitoramento

Agrometeorológico (AGRITEMPO), respectivamente....................................................60

iii

Figura 37: Percentagem de teor de água no solo nos meses de 2009 no município de

São Cristóvão, fornecidos pelo Sistema de Monitoramento Agrometeorológico

(AGRITEMPO)................................................................................................................61

Figura 38: Percentagens relativas do (Z)-3-hexenol nas folhas frescas e secas de H.

speciosa...........................................................................................................................62

Figura 39: Percentagens relativas do geraniol nas folhas frescas e secas de H.

speciosa...........................................................................................................................62

Figura 40: Dendograma representando a relação de dissimilaridade da composição

química das folhas frescas (F) e secas (S) de H. speciosa coletadas durante o ano de

2009.................................................................................................................................64

Figura 41: Dispersão dos percentuais dos constituintes químicos do óleo essencial das

folhas frescas de H. speciosa pelos CP-1 e CP-2............................................................65


folhas secas de H. speciosa pelos CP-1 e CP-2..............................................................66

Figura 43: Representação esquemática da biossíntese de triterpenos. E1=Esqualeno-

sintase. NADPH=Nicotinamida adenina dinucleotídeo-P [DEWIK, 2009; CABRAL,

2000]................................................................................................................................72

Figura 44: Estruturas químicas da betulina, ácido betunílico e lupeol.........................75

Figura 45: Esquema de fragmentação do lupeol............................................................76

Figura 46: Reação de metanólise ácida dos ésteres 3-β-O acil lupeol (HSF7).............88

Figura 47: Espectro de absorção na região do infravermelho (IV) (pastilha de KBr) da

fração FV1 isolada da partição hexânica do EMF de H. speciosa................................93

Figura 48: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da subfração FV1 isolada da

partição hexânica do EMF de H. speciosa......................................................................94

Figura 49: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da subfração FV1

isolada da partição hexânica do EMF de H. speciosa....................................................95



iv



Figura 52: Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da fração FV1 isolada do EHR de

H. speciosa.......................................................................................................................98

Figura 53: Ampliação do espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da fração FV1

isolada do EHR de H. speciosa.......................................................................................99

Figura 54: Ampliação do espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da fração FV1

isolada do EHR de H. speciosa.....................................................................................100

Figura 55: Estruturas de triterpenos identificados da partição hexânica do extrato

metanólico das folhas de H. speciosa............................................................................101


fração HSF7..................................................................................................................105

Figura 57: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF7 isolada do EHR

de H. speciosa................................................................................................................106

Figura 58: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF7






Figura 61: Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da fração HSF7 isolada do EHR

de H. speciosa................................................................................................................110

Figura 62: Rearranjo de McLafferty e ésteres metílicos..............................................111

Figura 63: Cromatograma de íons reconstituídos (m/z 74, m/z 103, m/z 426) (CG/EM)

dos ésteres metílicos obtidos após hidrólise da mistura de ésteres 3-β-acil do lupeol. A

numeração dos picos corresponde à tabela 05.............................................................112

Figura 64: Espectro de massas do tetradecanoato de metila (C15H30O2)....................113

Figura 65: Espectro de massas do hexadecanoato de metila (C17H34O2)....................113

Figura 66: Espectro de massas do 3-hidroxihexadecanoato de metila (C17H34O3).....114

Figura 67: Espectro de massas do octadecanoato de metila (C19H38O2).....................114

v

Figura 68: Espectro de massas do 3-hidroxioctadecanoato de metila (C19H38O3)......115

Figura 69: Espectro de massas do 3-hidroxiiocosanoato de metila (C21H42O3)..........115

Figura 70: Espectro de massas do docosanoato de metila (C23H46O2)........................116

Figura 71: Espectro de massas do 3-hidroxidocosanoato de metila (C23H46O3).........116

Figura 72: Espectro de massas do 3-hidroxidocosanoato de metila (C25H50O2).........117

Figura 73: Estruturas dos ésteres 3-β-O-acil lupeol isolados da fração HSF7 do

extrato hexânico dos ramos de H. speciosa..................................................................118

Figura 74: Principais compostos isolados de Parahancornia amapa.........................119


fração HSF1..................................................................................................................121

Figura 76: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF1 isolada do EHR

de H. speciosa................................................................................................................122





Figura 79: Cromatograma de íons totais da fração HSF1 isolada do extrato hexânico

de H. speciosa................................................................................................................125

Figura 80: Espectro de massas da estrutura 1 identificada da fração HSF1 isolada do










vi















Figura 92: Estruturas das substâncias encontradas na fração HSF1 isolada do

EHR...............................................................................................................................133

Figura 93: Estruturas de substâncias sequestradoras de radicais livres.....................137

Figura 94: Reação de redução do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH)..........138

Figura 95: Estruturas do taxol isolado da Taxus brevifolia (Taxaceae) e da

lasiodiplodina isolada da Euphorbia splendus (Euphorbiaceae).................................140

Figura 96: Estrutura química do pirogalol..................................................................142

Figura 97: Capacidade de sequestro de DPPH do óleo essencial das folhas frescas e

secas de H. speciosa......................................................................................................146

Figura 98: Capacidade de sequestro de DPPH dos extratos e partições de H.

speciosa.........................................................................................................................149

vii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Composição percentual relativa dos constituintes químicos encontrados nos

óleos essenciais das folhas de H. speciosa variando-se o tempo de secagem e época de

colheita nos meses de janeiro a junho/2009, através de CG/DIC...................................45

Tabela 2: Composição percentual relativa dos constituintes químicos encontrados nos

óleos essenciais das folhas de H. speciosa variando-se o tempo de secagem e época de

colheita nos meses de julho a dezembro/2009, através de CG/DIC...............................46

Tabela 3: Massas obtidas das partições dos respectivos extratos.................................81

Tabela 4: Frações reunidas da partição hexânica do EMF...........................................82

Tabela 5: Valores percentuais do gradiente utilizado na eluição da coluna.................83

Tabela 6: Frações reunidas da partição hexânica do EMF...........................................85

Tabela 7: Valores percentuais do gradiente utilizado na eluição da coluna.................86

Tabela 8: Comparação dos dados de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) e 13C (CDCl3, 100

MHz) das substâncias isoladas da fração FV1 com os dados obtidos na

literatura..........................................................................................................................91


MHz) das substâncias isoladas da fração HSF2 com os dados obtidos na

literatura........................................................................................................................103

Tabela 10: Substâncias identificadas (ésteres metílicos) após a reação de transesterificação da fração HSF2 isolada do EMR de H. speciosa............................112 Tabela 11: Principais compostos identificados da fração HSF1 isolados do EMR de H.

speciosa.........................................................................................................................126

Tabela 12: Valores percentuais de atividade sequestradora de radicais livres do óleo

essencial das folhas frescas e secas de H. speciosa......................................................146

Tabela 13: Valores percentuais de atividade sequestradora de radicais livres do BHT, dos extratos e suas respectivas partições......................................................................148 Tabela 14: Valores de CI50 do BHT, dos extratos e suas partições.............................148

Tabela 15: Valores percentuais de CI (capacidade inibitória) dos extratos de H.

speciosa frente aos agentes tumorais............................................................................150

viii

LISTA DE FLUXOGRAMAS

Fluxograma 1: Mapa filogenético da família Apocynaceae............................................6

Fluxograma 2: Procedimento para obtenção do óleo essencial de H. speciosa...........41

Fluxograma 3: Metodologia utilizada por SAMPAIO (2008) para obtenção dos

extratos metanólico e hexânico das folhas e dos ramos de H. speciosa.........................80

Fluxograma 4: Procedimento utilizado na obtenção dos extratos particionados das folhas e ramos de H. speciosa.........................................................................................81 Fluxograma 5: Processo de purificação da subfração FV1 da partição hexânica do

EMF de H. speciosa.........................................................................................................84

Fluxograma 6: Processo de purificação das frações HSF1 e HSF7 do EHR de H.

speciosa...........................................................................................................................87

ix

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

%AA Percentagem de Atividade Antioxidante

ACE Enzima Conversora de Angiotensina (Do inglês “Angiotensin Converting

Enzyme”)

ACP Análise dos Componentes Principais

ADP Difosfato de adenosina (Do inglês “Adenosine Diphosphate”)

ATCC Do inglês “American type culture collection”

ATP Trifosfato de adenosina (Do inglês “Adenosine Triphosphate”)

BHT Hidroxitolueno butilado (Do inglês “Butylated Hydroxytoluene”)

CA Do inglês “Cluster analysis”

CC Coluna cromatográfica

CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analítica

CI 50 Concentração inibitória média capaz de provocar 50% do efeito máximo

CG/EM Cromatografia Gasosa acoplada a um Espectrômetro de Massas

CG/DIC Cromatografia Gasosa acoplada a um Detector de Ionização de Chamas

DMAPP Pirofosfato de dimetilalila (Do inglês “Dimethylallyl Pyrophosphate)

DMSO Dimetilsulfóxido

DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (Do inglês “2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl”)

EHF Extrato hexânico das folhas

EHR Extrato hexânico dos ramos

EMF Extrato metanólico das folhas

EMR Extrato metanólico dos ramos

eV Elétron volts

FPP Pirofosfato de farnesila (Do inglês “Farnesyl Pyrophosphate”)

GPP Pirofosfato de geranila (Do inglês “Geranyl Pyrophosphate”)

HCT-8 Célula tumoral humana (Carcinoma de cólon)

Hz Hertz

x

IPP Pirofosfato de isopentenila (Do inglês “Isopentenyl Pyrophosphate”)

IR cal Índice de retenção calculado

IR lit Índice de retenção da literatura

ISO Do inglês “International standard organization”

IV Infravermelho

LPP Difosfato de linalila (Do inglês “Linalyl Diphosphate”)

MDA-MB-435 Célula tumoral humana (Melanoma)

MTT Brometo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólico (Do inglês “(3-

(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide”)

m/z Razão massa/carga

NADPH Fosfato de Nicotinamida adenina dinucleotídeo (Do inglês “Nicotinamide

Adenine Dinucleotide Phosphate”)

NCI Do inglês “National Cancer Institute”

NF-kB Fator de transcrição nuclear kappa B (Do inglês “Nuclear Factor kappa B”)

NPP Difosfato de nerila (Do inglês “Neryl Diphosphate”)

OE Óleo essencial

OMS Organização Mundial de Saúde

PAcEMF Partição Acetato de etila do extrato metanólico das folhas

PAcEMR Partição Acetato de etila do extrato metanólico dos ramos

PBEMF Partição butanólica do extrato metanólico das folhas

PBEMR Partição butanólica do extrato metanólico dos ramos

PDEMF Partição diclorometano do extrato metanólico das folhas

PDEMR Partição diclorometano do extrato metanólico dos ramos

P. F. Ponto de fusão

PHEMF Partição hexânica do extrato metanólico das folhas

PPM Partes por milhão

RDA Retro Diels-Alder

Rf Fator de retenção (do inglês “Retention factor”)

RMN 13C Ressonância magnética nuclear de carbono treze

xi

RMN 1H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio

SF-295 Célula tumoral humana (Glioblastoma)

TIC Cromatograma de Íons Totais (do inglês“Total Ion Chromatogram”)

UV Ultravioleta

xii

RESUMO

O presente trabalho descreve o estudo químico dos recursos naturais renováveis do

estado de Sergipe, onde foram analisadas as folhas e ramos da mangabeira, Hancornia

speciosa Gomes (Apocynaceae). Na primeira parte do trabalho foi investigada a

composição química dos voláteis das folhas variando-se o tempo de secagem e a época

de colheita. As análises através de CG/EM e CG/DIC permitiram verificar que, com a

secagem das folhas, houve um aumento significativo nas percentagens relativas de

alguns monoterpenos oxigenados como α-terpineol (0,08±0,20 - 3,89±1,78 nas folhas

frescas para 0,93±0,03 - 5,21±0,65 nas folhas secas), linalol (2,95±1,45 - 12,46±2,24

nas folhas frescas para 2,78±1,08 - 17,16±2,83 nas folhas secas), geraniol (1,04±0,34 -

12,80±1,23 nas folhas frescas para 25,67±6,45- 46,56±4,67 nas folhas secas), assim

como um decréscimo nas percentagens de alcoóis como (Z)-3-hexenol (46,81±3,27 -

78,45±7,75 nas folhas frescas para 10,70±4,87 - 19,15±4,28 nas folhas secas) e 1-

hexanol (1,65±0,33 - 10,15±0,80 nas folhas frescas para 0,07±0,05 - 4,59±1,55 nas

folhas secas). Nos meses com valores de índice de pluviometria e temperatura elevados

observou-se um maior rendimento de óleo essencial de H. speciosa. Na segunda parte

do trabalho, o estudo fitoquímico das folhas e dos ramos desta espécie permitiu a

identificação de 3 misturas. Destas uma mistura de triterpenos contendo α-amirina, β-

amirina e lupeol foi identificada da partição hexânica do extrato metanólico das folhas,

enquanto uma mistura contendo 9 ésteres 3-β-O-acil lupeol e uma outra mistura

contendo 12 n-alcanos foram identificadas do extrato hexânico dos ramos. A

determinação estrutural das substâncias foi baseada na análise dos dados

espectroscópicos obtidos. Na terceira parte do trabalho, foram realizados testes de

atividade antioxidante com os óleos essenciais das folhas frescas e secas, e com o

extrato metanólico das folhas e dos ramos e suas respectivas partições, onde foi

observada a boa capacidade de sequestrar radicais livres da partição butanólica do

extrato metanólico das folhas. Além da investigação da citotoxicidade dos extratos

hexânicos e metanólicos das folhas e dos ramos frente às linhagens de células tumorais

MDA-MB435 (mama - humano) e SF-295 (glioblastoma - humano) e HCT-8 (colon),

onde não foi observado um efeito inibitório.

Palavras-chave: Apocynaceae, Hancornia speciosa Gomes; compostos voláteis;

triterpenos; atividade antioxidante, citotoxicidade.

xiii

ABSTRACT

This work describes the chemical study of renewable natural resources of the State of

Sergipe, Brazil, in that we analyzed the leaves and branches of mangabeira, Hancornia

speciosa Gomes (Apocynaceae).This work is divided into 3 chapters. In the first part of

the research was investigated the volatile chemical composition from leaves varying the

drying time and harvest time. Analysis by GC/MS and GC/FID showed that there was a

significant increase in the content of some oxygenated monoterpenes according to the

drying of leaves, such as α-terpineol (0,08±0,20 - 3,89±1,78 in fresh leaves to 0,93±0,03

- 5,21±0,65 in dried leaves), linalool (2,95±1,45 - 12,46±2,24 in fresh leaves to

2,78±1,08 - 17,16±2,83 in dried leaves), geraniol (1,04±0,34 - 12,80±1,23 in fresh

leaves to 25,67±6,45- 46,56±4,67 in dried leaves), as well and a decrease in the relative

percentage of alcohols such as (Z)-3-hexenol (46,81±3,27 - 78,45±7,75 in fresh leaves

to 10,70±4,87 - 19,15±4,28 in dried leaves) and 1-hexanol (1,65±0,33 - 10,15±0,80 in

fresh leaves to 0,07±0,05 - 4,59±1,55 in dried leaves).In the months with higher rainfall

and temperature we observed a higher yield of essential oils from leaves of H. speciosa.

In the second part of the work, the phytochemical study of the leaves and branches of

this species allowed the isolation of 3 mixtures. Those containing a mixture of

triterpenes α-amyrin, β-amirin and lupeol were isolated from the hexane partition of

methanolic extract of the leaves, while a mixture of 9 3-β-O-acyl lupeol esters and

another mixture of n-alkanes were isolated from hexane extract of the

branches.Structure determination of the isolated compounds was based on analysis of

spectroscopic methods. In the third part, we evaluated the antioxidant activity of

essential oils from fresh and dried leaves, and the methanol extract of leaves and

branches and their partitioned extracts, which was seen to goodability to scavenge free

radicals butanol partition of the mathanol extract of leaves. We also investigate the

cytotoxic activity of hexane and methanol extracts of leaves and branches against cancer

cell lines MDA-MB-435 (melanoma) and SF-295 (brain) and HCT-8 (human colon

carcinoma), which was not observed an inhibitory effect.

Keywords: Apocynaceae; Hancornia speciosa Gomes; volatile compounds; triterpenes,

antioxidant activity, citotoxicity.

xiv

P á g i n a | 1

INTRODUÇÃO

P á g i n a | 2

INTRODUÇÃO

1. PRODUTOS NATURAIS E SUA BIODIVERSIDADE

Nos últimos anos, vem sendo observado um grande interesse no isolamento de

compostos bioativos de plantas, principalmente pela dificuldade de produção e

comercialização de medicamentos úteis na forma sintética além da possibilidade de

serem utilizados como protótipos na síntese de compostos mais eficazes e/ou menos

tóxicos [HOSTETTMANN et al., 2003]. As plantas, fungos, insetos, organismos

marinhos e bactérias são fontes importantes de substâncias biologicamente ativas, sendo

que a maioria dos fármacos em uso clínico ou são de origem natural ou foram

desenvolvidos por síntese química planejada a partir de produtos naturais (metabólitos

secundários). Estes por sua vez são micromoléculas produzidas por um organismo vivo,

mas que não são primordiais para a sua sobrevivência, ao contrário das macromoléculas

(proteínas, ácidos nucléicos e polissacarídeos) que compõem a base de um organismo

[CANNELL, 2008].

Nesse contexto, as plantas produzem centenas de micromoléculas para a sua

defesa, regulação e adaptação, sendo, portanto, biologicamente ativas. Muitas

substâncias produzidas por plantas possuem atividade contra insetos, fungos, bactérias,

patógenos em geral, como uma forma de defesa principalmente nos ambientes tropicais

e equatoriais onde a biodiversidade de microorganismos e insetos é extensa [SANTOS,

2005].

Muitos metabólitos secundários se notabilizaram como matérias-primas valiosas

para a produção de inúmeros medicamentos comprovando que a parceria entre

especialistas na área medicinal e químicos de produtos naturais é estratégica para a

descoberta de fármacos inovadores [CANNELL, 2008]. Sendo assim, muitas pesquisas

estão sendo desenvolvidas com espécies da flora brasileira na busca por novas

substâncias com atividades biológicas, contando com o apoio do NCI (Instituto

Nacional do Câncer - EUA), OMS (Organização Mundial da Saúde) e o Ministério da

Saúde, onde essa parceria torna-se importante no momento atual, quando a idéia de

P á g i n a | 3

modificação genética de plantas para a produção de substâncias de interesse necessita de

equipamentos modernos, novas técnicas e ensaios biológicos práticos, eficientes e de

baixo custo.

A importância dos produtos naturais, entretanto, vai além de sua utilização na

medicina e alcança vastos campos de aplicação, tornando-se importantes fontes de

comercialização agregando valores econômicos cada vez maiores aos produtos finais

que os contém (nutracêuticos, cosmecêuticos, agrocêuticos) [SANTOS, 2005]. Os

modernos avanços das técnicas cromatográficas e espectroscópicas podem ser

considerados uns dos principais responsáveis por esta situação, pois têm fornecido

ferramentas para a purificação e análise estrutural que atingiram níveis extraordinários

de sensibilidade e sofisticação, fazendo com que o estudo da bioatividade de diversos

metabólitos secundários se tornasse importante [COLEGATE et al., 2008].

O Brasil é considerado o país com maior biodiversidade no planeta, com ca.

55.000 espécies nativas distribuídas nos seis biomas. A sua biodiversidade é

considerada uma fonte de substâncias biologicamente ativas e sua preservação é

fundamental tanto pelo valor intrínseco dessa imensa riqueza biológica como pelo seu

enorme potencial como fonte de novos fármacos, a qual vem despertando a cobiça de

laboratórios de pesquisa das empresas farmacêuticas localizadas, em sua ampla maioria,

ao norte do Equador. O país possui cerca de 10% de todos os organismos descritos e

aproximadamente 22% de todas as Angiospermas, distribuídas principalmente nas

regiões Amazônica, Mata Atlântica e Cerrado, e é detentor de uma flora riquíssima,

considerada uma fonte imensa de metabólitos secundários, que podem ser utilizados

para diferentes aplicações [BARREIRO & BOLZANI, 2009].

O nordeste brasileiro é ocupado em sua maioria por uma vegetação típica de

semi-árido, caatinga, possuindo cerca de 600 espécies de plantas registradas, onde 180

são endêmicas, com várias espécies reconhecidas pela população local pelo seu uso

como medicamento natural e alternativo [Da SILVA, 2003]. O estado de Sergipe é

caracterizado não só por vegetação típica de caatinga, mas também por remanescentes

de mata atlântica (incluindo os mangues e as restingas), com muitos elementos do

cerrado do Brasil Central e vegetação de campos rupestres ainda pouco explicada.

Nestes ambientes, encontram-se plantas de reconhecida atividade biológica pela

P á g i n a | 4

população local, bem como espécies de ocorrência endêmica, algumas ainda

desconhecidas pela ciência, tanto do ponto de vista botânico, químico, farmacológico e

econômico. Esses aspectos, aliados à degradação dos ecossistemas, estimulam pesquisas

em produtos naturais e tornam urgente o estabelecimento de programas para promover o

levantamento desta riqueza nativa, na busca de contribuir efetivamente para o

desenvolvimento auto-sustentável da região, oferecendo ao estado uma alternativa de

elevado potencial econômico [DRUMOND et al., 2000].

P á g i n a | 5

2. FAMILIA APOCYNACEAE

A família Apocynaceae foi estabelecida por Adanson em 1768 sob o nome de

Apocyna, a qual englobava Apocynaceae e Asclepiadaceae como uma única família.

Posteriormente Jussieu (1789) modificou o termo “Apocyna” para “Apocineae”, sem

alterar a sua circunscrição e, a partir daí, vem sendo citado como autor da família na

maioria dos trabalhos. Atualmente, com o avanço da biologia molecular, uma nova

fonte de dados foi disponibilizada para os taxonomistas a fim de verificar a consistência

das classificações tradicionais propostas para as diversas famílias de Angiospermas. O

primeiro estudo filogenético para Apocynaceae foi realizado por SENNBLAD &

BREMER (1996) que, ao estudarem gêneros de Apocynaceae e Asclepiadaceae,

verificaram uma proximidade filogenética entre as famílias, demonstrando a

artificialidade das classificações propostas até o momento [AGUIAR, 2009]. Essa

proximidade taxonômica deve-se a presença dos vasos laticíferos e de glicosídeos

cardiotônicos, os quais não são encontrados nas outras famílias dessa ordem [KOCH,

1994].

Com base nas novas propostas de filogenia entre Apocynaceae e Asclepiadaceae,

ENDRESS & BRUYNS, 2000 corroboraram com a união das duas famílias e sugeriram

a divisão da família em cinco subfamílias: Rauvolfioideae Kostel, Apocynoideae

Burnett, Periplocoideae R. Br. ex Endl., Secamonoideae Endl. e Asclepiadoideae R. Br.

ex Burnett. Sendo que a subfamília Rauvolfioideaeestá subdividida em 9 tribos:

Alstonieae, Alyxieae, Carisseae, Hunterieae, Melodineae, Plumerieae,

Tabernaemontaneae, Vinceae e Willughbeieae.A tribo Willughbeieae está representada

por 18 gêneros: Ancylobotrys, Bousigonia, Chamaeclitandra, Clitandra, Couma,

Cyclocotyla, Cylindropsis, Dictyophleba, Hancornia, Lacmellea, Landolphia,

Leuconotis, Orthopichonia, Pacouria, Parahancornia, Saba, Vahadenia e Willughbeia

(Fluxograma 1; p.6) [SIMÕES, 2000].

P á g i n a | 6

SUBFAMÍLIA TRIBO GÊNERO

Fluxograma 1: Mapa filogenético da família Apocynaceae.

APOCYNACEAE

APOCYNOIDEAE

RAUVOLFIOIDEAE

ALSTONIEAE ANCYLOBOTRYS

BOUSIGONIA

CHAMAECLITANDRA

CLITANDRA

COUMA

CYCLOCOTYLA

CYLINDROPSIS

DICTYOPHLEBA

LACMELLEA

WILLUGHBEIEAE

HUNTERIEAE

CARISSEAE

ALYXIEAE

PERIPLOCOIDEAE

HANCORNIA

WILLIGHBEIA

VAHADENIA

SABA

PARAHANCORNIA

PACOURIA

ORTHOPICHONIA

LEUCONOTIS

LANDOLPHIA

ASCLEPIADOIDEAE

SECAMONOIDEAE

VINCEAE

TABERNAEMONTANEAE

PLUMERIEAE

MELODINEAE

FAMÍLIA

Plantas da família Apocynaceae estão incluídas fil

Gentiales e subclasse Asteridae

evoluídas e são caracterizadas normalmente pela presença de látex. Essa família contém

aproximadamente 5100 espécies

predominantemente nos trópicos e subtrópicos e são menos

temperadas. Na flora brasileira são catalogadas como

espécies distribuídas em 41 gêneros, sendo 32 destes encontrados apenas na Amazônia

[PEREIRA et al., 2007]. As plantas pertencentes a esta família são conhecidas pelo seu

potencial como medicamento natural e alternativo

alcalóides em várias espécies

medicina popular [RAHMAN

(Figura 1; p.7), isoladas de

câncer [PHILLIPSON, 2001

(Figura 2a; p.8), popularmente conhecida como

como fungicida, antianêmico,

decocções feitas com cascas de

usadas como purgativo, bactericida, antitumora

[BARRETO et al., 2007].

Vincristina Vimblastina

Figura 1: Estruturas da vincristina e v

P á g i n a |

Apocynaceae estão incluídas filogeneticamente na ordem

Asteridae, sendo consideradas como espécies dicoti


espécies distribuídas em 450 gêneros, sendo encontradas

predominantemente nos trópicos e subtrópicos e são menos frequentes em regiões

temperadas. Na flora brasileira são catalogadas como Apocynaceae

em 41 gêneros, sendo 32 destes encontrados apenas na Amazônia

As plantas pertencentes a esta família são conhecidas pelo seu

como medicamento natural e alternativo, sendo caracterizada pela presença de

pécies, sendo que algumas delas com ampla utilização na

RAHMAN et al., 2004]. Como exemplo a vincristina

isoladas de Catharanthus roseus, que são usadas no tratamento de

PHILLIPSON, 2001], além do látex de Himatanthus sucuuba

popularmente conhecida como sucuba, sucuuba e janaguba, utilizada

como fungicida, antianêmico, antiinflamatório e no tratamento de câncer

decocções feitas com cascas de Plumeria rubra (Apocynaceae) (Figura

purgativo, bactericida, antitumoral e no tratamento de doenças venéreas

Vincristina Vimblastina

: Estruturas da vincristina e vimblastina.

P á g i n a | 7

ogeneticamente na ordem

sendo consideradas como espécies dicotiledôneas bem


sendo encontradas

entes em regiões

mais de 400

em 41 gêneros, sendo 32 destes encontrados apenas na Amazônia

As plantas pertencentes a esta família são conhecidas pelo seu

, sendo caracterizada pela presença de

algumas delas com ampla utilização na

incristina e vimblastina

que são usadas no tratamento de

(Apocynaceae)

sucuba, sucuuba e janaguba, utilizada

câncer. Infusões e

Figura 2b; p.8) são

tratamento de doenças venéreas

P á g i n a | 8

(a) (b)

Himatanthus sucuuba Plumeria rubra

Figura 2: Fotos de espécimes de (a) Himatanthus sucuuba e (b) Plumeria rubra

[FINDMEACURE].

O estudo fitoquímico de espécies representantes dos gêneros desta família pode

conduzir à descoberta de novas fontes de substâncias naturais ativas uma vez que são

frequentemente citadas em trabalhos de revisão sobre plantas com atividades

farmacológicas e medicinais [De CARVALHO et al., 2006]. Neste sentido, há vários

trabalhos publicados sobre o estudo fitoquímico de espécies da família Apocynaceae,

onde podemos citar estudos realizados por De CARVALHO et al. (2006) que isolaram,

do caule de Laseguea erecta (Apocynaceae), substâncias tais como: lupeol (1), α-L-

tevetosil-digitoxigenina (2), escopoletina (3) e pinoresinol (4) (Figura 3; p.9). Por outro

lado, existem poucos trabalhos publicados que tratam do estudo químico do látex desta

família. De MIRANDA et al. (2000) realizaram um estudo químico e biológico do látex

de H. sucuuba, de onde foram isolados alguns triterpenos, tais como: acetato de

lupeloíla (5), α-amirina (6) e cinamato de lupeoíla (7) (Figura 4; p.10), sendo este

último o que apresentou atividade antiinflamatória. Já BARRETO et al. (2007) isolaram

P á g i n a | 9

alguns iridóides do látex de H. sucuuba, tais como: Ácido 15-desmetilisoplumierídeo

(8), Ácido desmetilplumierídeo (9), plumierídeo (10), isoplumierídeo (11) (Figura 5;

p.11).

HO

H

H

H

O

O

OH

O

O

MeO

HO

OH

O O

MeO

HO

OMe

OH

O

OH

H

HHMeO

HO

(1) (2)

(3) (4)

Figura 3: Substâncias isoladas do caule de Laseguea erecta.

P á g i n a | 1 0

O

HO

H3CH

HH

HO

H

H

H

(5) (6)

O

H

H

O

HH

(7)

Figura 4: Estruturas de triterpenos isolados do látex de Himatanthus sucuuba

(Apocynaceae).

P á g i n a | 1 1

O

COOR

OO

O

OH

O

OH

OHOH

HO

O

COOR

OO

OOH

O

OH

OHOH

HO

(8) R=H (9) R=H

(11) R=CH3 (10) R=CH3

Figura 5: Iridóides isolados do látex de H. sucuuba.

P á g i n a | 1 2

3. HANCORNIA SPECIOSA GOMES

A mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) (Figura 6; p.12) pertence à classe

Dicotyledoneae, ordem Gentianales, família Apocynaceae, subfamília Rauvolfioideae,

tribo Willughbeieae, gênero Hancornia contendo apenas esta espécie, a qual foi descrita

por Gomes em 1812 [LEDERMAN et al., 2000]. São aceitas seis variedades botânicas

de H. speciosa: H. speciosa variedade speciosa, H. speciosa variedade maximilliani A.

DC., H. speciosa variedade lundii A. DC., H. speciosa variedade cuyabensis Malme, H.

speciosa variedade gardneri A. DC. Muell. Arg. e a H. speciosa variedade pubescens

(Nees. et Martius) Muell. Arg. Essas variedades são diferenciadas por características

morfológicas, principalmente relacionadas à folha e à flor. A variedade pubescens e

gardneri diferenciam-se pela primeira possuir folhas pubescentes, e a segunda, folhas

glabras [RIZZO & FERREIRA, 1990].

Figura 6: Foto de um espécime de Hancornia speciosa Gomes [Prof. Dr. Paulo César

de Lima Nogueira].

P á g i n a | 1 3

H. speciosa é uma árvore encontrada naturalmente no Brasil e sua distribuição

ocorre com maior abundância nas áreas de tabuleiros e baixadas litorâneas do Nordeste,

sendo o estado de Sergipe um dos maiores produtores nacionais. Esta espécie é uma

planta arbórea de porte médio, possuindo de 2 a 10 m de altura, podendo chegar até 15

m, dotada de copa irregular, tronco tortuoso, bastante ramificado e áspero; ramos lisos e

avermelhados, exsudando látex em toda a sua extensão [SILVA JUNIOR, 2004]. A

casca da árvore é escura e fendilhada; suas folhas são opostas, simples, pecioladas,

inteiras, oblongas, agudas, coriáceas, brilhantes e glabras; sua inflorescência possui de 1

a 7 flores perfumadas e de coloração branca (Figura 7a; p.13). Seus frutos (Figura 7b;

p.13) do tipo baga são elipsóides ou arredondados, com 2,0 a 6,0 cm de comprimento,

exocarpo amarelo, com manchas avermelhadas, polpa carnoso-viscosa, ácida, bastante

doce com aroma bastante agradável e cheio de suco leitoso quando verdes, contendo

geralmente de 2 a 15 sementes discóides, com 7 a 8 mm de diâmetro, castanho claras,

delgadas e rugosas [SOUSA et al., 2005].

(a) (b)

Figura 7: Fotos (a) da Flor; e (b) dos Frutos de H. speciosa [SAMPAIO, 2008].

As sementes da mangabeira (Figura 8; p.14) são consideradas recalcitrantes, isto

é, não suportam ressecamento, perdendo rapidamente o poder germinativo assim que

são retiradas do fruto; portanto, sua semeadura deverá ser feita no máximo em quatro

P á g i n a | 1 4

dias. Procedendo-se assim, pode-se obter aproximadamente 90% de germinação

[VIEIRA NETO, 2002]. A semente da mangabeira é o único meio que se tem usado

para a obtenção de mudas, devendo-se lavar bem as sementes para remover a polpa,

pois ela tem ação inibidora sobre a germinação e o poder germinativo das sementes

reduz rapidamente entre o quarto e oitavo dia após a extração das mesmas [SILVA,

2010].

A escolha do substrato e da temperatura adequada para o teste de germinação da

maioria das espécies nativas são requisitos ainda desconhecidos, resultando em diversos

trabalhos que tratam da interação do substrato e da temperatura para condução de testes

de germinação e vigor de sementes de espécies frutíferas e florestais. Já SOARES et al.,

2007, utilizando os substratos areia, vermiculita e areia mais vermiculita, na germinação

de sementes de mangaba observaram que as sementes apresentaram elevada taxa de

germinação, independente do tipo de substrato utilizado.

Figura 8: Frutos com sementes secas da mangabeira [SAMPAIO, 2008].

O potencial para o aproveitamento da mangabeira é bastante variado, entretanto,

apenas os frutos apresentam um valor comercial significativo. No Nordeste, é uma das

mais requisitadas produtoras de matéria-prima para a indústria entre as frutas nativas

P á g i n a | 1 5

dessa região, devido aos excelentes aroma e sabor dos seus frutos, sendo utilizada,

sobretudo, para a fabricação de sucos e polpas congeladas. Além dessas formas, o fruto

da mangabeira ainda é consumido in natura e utilizado para a fabricação de doces,

geléias, licores, xaropes, vinhos e vinagres [LEDERMAN et al., 2000].

Nas indústrias de polpa de Sergipe, verifica-se que a mangaba é a mais vendida

dentre os mais de 20 sabores geralmente produzidos, sendo responsável por

aproximadamente 25% das vendas. A polpa de mangaba, juntamente com as de cajá e

graviola são os carros-chefes, impulsionando a venda dos demais sabores. Para não

deixar faltar esse precioso produto na entressafra, há indústrias que possuem câmaras

frias exclusivamente para o armazenamento da mangaba. A mesma medida pode ser

verificada nas sorveterias e lanchonetes, onde o sorvete e o suco desta fruta são os mais

consumidos [ALVES et al., 2003].

A mangaba é uma fruta rica em diversos elementos e em sua composição

encontramos as vitaminas A, B1, B2 e C, além de ferro, fósforo, cálcio e proteína. Ela é

constituída de polpa (77%), casca (11%) e semente (12%). No entanto, apenas a polpa

assume posição de destaque no aspecto comercial, por apresentar um bom valor

nutritivo, com teor protéico (0,7 g/100 g de polpa) superior ao da maioria das espécies

frutíferas. O seu valor energético, em cada 100 g de fruta, é de 43 calorias [SILVA

JUNIOR, 2004; SOUSA et al., 2005].

O número de estudos sobre alimentos que possuem benefícios potenciais para a

saúde tem apresentado um acelerado crescimento em todo o mundo. Pesquisas recentes

têm confirmado o que naturalistas acreditam há muito tempo: existem ingredientes

específicos nos alimentos que apresentam importantes atividades biológicas no

organismo, além do aspecto nutricional [DRUMOND et al., 2000]. Desta forma, muitas

frutas apresentam substâncias com ação medicinal, e seu uso como medicamento é um

hábito utilizado pela humanidade há mais de 5.000 anos [CRAVEIRO & CRAVEIRO,

2003]. Na medicina popular, H. speciosa é usada de várias formas: o decocto da raiz,

junto com o “quiabinho” (Manihot tripartita), para tratar a hipertensão; a infusão das

folhas para cólica menstrual e contra gripe [ALMEIDA et al., 1998]. A casca da árvore

possui propriedades adstringentes, cura doenças internas, protege os pulmões, fígado e

também serve para tratamentos de perda de peso. O suco leitoso do fruto e o látex do

P á g i n a | 1 6

caule são usados como medicamento caseiro para tratamento de tuberculose, úlcera,

dermatose, verrugas, hematomas, inflamações diversas, diarréia e herpes [FRANCO et

al., 2008].

Valendo-se da importância terapêutica da mangabeira, faz-se necessária uma

maior atenção com relação a sua produção. Uma das principais preocupações dos

produtores de frutas da região nordeste do Brasil é a agregação de valor às fruteiras

regionais, as quais são geralmente produzidas em regime extrativista. No entanto, o

potencial deste mercado cresce a cada dia devido à busca de diversificação da oferta, em

virtude do interesse cada vez maior dos consumidores [ALVES et al., 2003]. Desta

forma, acredita-se que o conhecimento químico e bioquímico dos metabólitos

secundários presentes nas partes renováveis da mangabeira (folhas e ramos) e seu

emprego como insumo para as indústrias farmacêutica, de alimentos e/ou de cosméticos

poderia ser uma alternativa para agregar valor ao fruto, melhorar a renda dos produtores

da região e contribuir para diminuição da devastação desta espécie.

P á g i n a | 1 7

REVISÃO DA

LITERATURA

P á g i n a | 1 8

REVISÃO DA LITERATURA

Em nosso levantamento bibliográfico, utilizando-se os “sites” de busca Web of

Science e Chemical Abstracts através do SciFinder, bem como o Banco de Teses da

CAPES, encontramos poucos estudos fitoquímicos sobre H. speciosa. Um deles relata a

análise dos componentes voláteis dos frutos obtidos através da hidrodestilação,

mostrando que os componentes principais variam de acordo com o estádio de

maturação, podendo-se observar o predomínio de ésteres, álcoois e furfural nos frutos

maduros, enquanto que nos frutos verdes, os principais componentes observados foram

o cis-óxido de linalol, trans-óxido de linalol e linalol. Já na composição química dos

voláteis dos frutos “de vez” há um predomínio tanto de ésteres, álcoois e furfural,

quanto de cis-óxido de linalol, trans-óxido de linalol e linalol [SAMPAIO &

NOGUEIRA, 2006]. Já RODRIGUES et al. (2006) isolaram alguns metabólitos

secundários das cascas de H. speciosa, tais como: ácido gálico (12), 2,7-diidroxixantona

(13), ácido 3-cafeoilquínico (14), ácido 5-cafeoilquínico (15), 2,7- dimetoxixantona

(16), cis-clorogenato de metila (17), trans-clorogenato de metila (18), e do ácido 4-

hidroxi-3,5-dimetoxibenzóico (ácido siríngico) (19) (Figura 9; p.19). Além disso,

RODRIGUES et al. (2007) investigaram os compostos polifenólicos (Figura 10; p.20)

presentes na infusão das cascas de H. speciosa na tentativa de realizar uma identificação

direta dos metabólitos secundários presentes nas matrizes, onde foi observada a

presença de proantocianidinas diméricas do tipo B: epicatequina-(4β→8)-catequina

(20), epicatequina-(4β→6)-catequina (21), e proantocianidinas diméricas do tipo A:

epicatequina-(2β→7; 4β→8)-epicatequina (22).

P á g i n a | 1 9

HO O

RO

OH

OR

HO

R3O

OH

OR2

CO2R1

O

O

ORRO

OH

OH

CCC

O

H

H

OH

OH

CCC

O

H H

12 R=H18 R=CH3

13 R=H4 R=CH3

x =

y =

14 R1=H; R2=x; R3=H15 R1=H; R2=H; R3=x16 R1=CH3; R2=y; R3=H17 R1=CH3; R2=x; R3=H

Figura 9: Metabólitos secundários encontrados nas cascas de H. speciosa.

P á g i n a | 2 0

O

OH

O

OH

HO

OH

OH

OH

OH

OH

HOOH

OH

OH

HOOH

OHO

OH

O

OH

HO

OH

OHOH

OH

HO

OHO

O

O

HO

HO

OH

OH

OH

(19)

(20)

(21)

Figura 10: Estruturas químicas de proantocianidinas diméricas do tipo B: (1) epicatequina-(4β→8)-catequina, (2) epicatequina-(4β→6)-catequina, e proantocianidinas diméricas do tipo A: (3) epicatequina-(2β→7; 4β→8)-epicatequina.

Num estudo fitoquímico do látex dos frutos de H. speciosa feito por SAMPAIO

(2008) foram identificadas 12 substâncias: 3-β-O-hexadecanoato de lupeoíla (22), 3-β-

O-3’-hidroxihexadecanoato de lupeoíla (23), 3-β-O-9-octadecenoato de lupeoíla (24), 3-

β-O-octadecanoato de lupeoíla (25), 3-β-O-3’-hidroxioctadecanoato de lupeoíla (26), 3-

β-O-3’-hidroxiicosanoato de lupeoíla (27), 3-β-O-3’-hidroxidocosanoato de lupeoíla

(28), α-amina (29), β-amirina (30), lupeol (31), 3-β-O-3’,5’-diidroxiicosanoato de

lupeoíla (32) e a sacarose na sua forma peracetilada (33) (Figura 11; p.21).

P á g i n a | 2 1

O

H

H

H

OR1

n

(22) R1=H; n=12(25) R1=H; n=14(23) R1=OH; n=12(26) R1=OH; n=14(27) R1=OH; n=16(28) R1=OH; n=18

O

H

H

H

O

7 5

(24)

HO H

H

H

HO H

H

H

HO

H

H

H

(29) (30) (31)

O

H

H

H

OOHOH

14

O

O

OAcO

AcO

CH2OAc

AcO

AcO

OAcCH2OAc

CH2OAc

(32) (33)

Figura 11: Substâncias isoladas do látex dos frutos de H. speciosa.

Também foram poucos, mas recentes, os relatos encontrados sobre os estudos de

atividade biológica desta espécie. Neste sentido, podemos citar um estudo preliminar de

ANDRADE (2002), o qual verificou a atividade gastroprotetora do extrato etanólico das

cascas de H. speciosa. Enquanto que MORAES et al. (2008) estudaram as propriedades

etnofarmacológicas da mangabeira, analisando o extrato hidroalcoólico e infusão das

cascas de H. speciosa, como indicações gastroprotetoras e ações contra

Helicobacterpylori. Já COSTA et al. (2008) estudaram a atividade antimicrobiana do

P á g i n a | 2 2

extrato etanólico das folhas de H. speciosa, onde foi observado efeito inibitório frente

bactérias Gram-positivas: Staphylococcus aureus ATCC 6538 e Staphylococcus

epidermidis ATCC 12228 e Gram-negativas: Escherichia coli B4 e Pseudomonas

aeruginosa B8. BRAGA et al. (2010) estudaram o extrato etanólico das folhas de H.

speciosa como substrato na preparação de medicamentos para tratamento de distúrbios

cardiovasculares, hipertensão arterial, aterosclerose, estenose, isquemia cardíaca e

cerebral, usando a enzima conversora angiotensina I (ACE), onde uma fração do extrato

de H. speciosa foi incorporada na cultura de células endoteliais intactas de ratos. Os

resultados mostraram um efeito vasodilatador de forma significativa apenas na camada

endotelial das artérias, devido à liberação de óxido nítrico. Esses resultados foram

semelhantes aos encontrados por FERREIRA et al. (2007) que demonstraram o efeito

do extrato etanólico das folhas frente à inibição da ACE, bem como sua ação como

vasodilatador. Estudos realizados por SAMPAIO (2008) demonstraram um efeito

antioxidante significativo do látex dos frutos verdes de H. speciosa em ratos. SANTOS

et al. (2006) realizaram testes de ação antimicrobiana com o óleo essencial das folhas de

H. speciosa frente bactérias Gram-positivas: Bacillus subtillis ATCC 6633, Bacillus

bulgaricus ATCC 11842, Enterococcus faecalis ATCC 4883, Staphylococcus aureus

ATCC 29737, Gram-negativas: Pseudomonas aeruginosa ATCC 19424, Salmonella

enteritidis ATCC 13076 Escherichia coli ATCC 10536 e Serratia marcescens, bem

como com o fungo Candida albicans ATCC 10231 pelo método dedifusão em placa,

não se observando nenhuma atividade antimicrobiana. Por outro lado, ENDRINGER et

al. (2009) demonstraram a atividade inibitória de ciclitóis, tais como: L-(+)-bornesitol

(34), ácido quínico (35), per-O-acetil-L-(+)bornesitol (36), mio-inositol (37), xilo-

inositol (38) (Figura 12; p.23), isolados do extrato etanólico das folhas de H. speciosa

frente à enzima NF-kB (Fator de transcrição nuclear kB), sendo o L-(+)-bornesitol e o

ácido quínico, os ciclitóis responsáveis por essa atividade.

P á g i n a | 2 3

HO

HOHO

OH

O

HO

OO

O

O

O

O

O

O

O

HOHO

HO

OHOH

OHHO

HOHO

OH

OH

OH

OH

HO

HO

OH

OH

O

1 23

4 5

Figura 12: Estruturas químicas dos ciclitóis.

Existem alguns trabalhos sobre armazenamento e propagação das sementes de H.

speciosa, onde se tornam importantes devido a sua espécie não ter sido ainda

domesticada. De acordo com KOSTER (1991), os métodos de conservação e

armazenamento de sementes recalcitrantes são baseados na manutenção do teor de água

elevado. Existe um limite para o teor de água valor mínimo abaixo do qual não há dano à

germinação de sementes recalcitrantes. No conteúdo de água elevado, há muitas reações

metabólicas e de desenvolvimento de microrganismos, que impedem a redução da

temperatura. Assim, o teor de água das sementes recalcitrantes e temperatura de

armazenamento deve ser reduzida até perto do teor de água crítico mínimo.

O estudo sobre o armazenamento de sementes de mangabeira em substratos e

temperaturas diferentes onde foram desenvolvidas técnicas de vitrificação e

micropropagação dessa espécie foi realizado por SILVA (2010). SOARES et al. (2009)

estudaram o efeito de diferentes concentrações e valores de pH na germinação in vitro

de sementes dos frutos maduros de H. speciosa, onde o efeito de diferentes meios de

cultura, variando-se a concentração e nível de pH, foi avaliado. Os estudos

demonstraram que a maior porcentagem de germinação de sementes de mangabeira in

vitro foi obtida com a utilização dos meios de cultura WPM e MS/2, suplementados

com 15,0 g/L de sacarose, 0,2 mg/Lde ácido giberélico e com pH corrigido para 5,8.

34 35 36

37 38

P á g i n a | 2 4

Utilizando-se da mesma linha de pesquisa, LÉDO et al. (2007) analisaram as condições

mais favoráveis para o crescimento inicial da mangabeira em diferentes meios de

germinação in vitro, onde as sementes foram inoculadas em tubos de ensaio contendo

tratamentos diferentes, sendo que todos em meio básico, e foi observado que, quanto ao

comprimento da raiz principal, o meio de cultura constituído de 2,0 g/L de carvão

ativado proporcionou maior crescimento quando comparado com os demais

tratamentos. Por outro lado, GANGA et al. (2009) avaliaram a variação genética e

estimaram os parâmetros genéticos de crescimento da mangabeira, onde foi observado

que as variedades botânicas cuyabensis e gardneri apresentaram melhores índices de

crescimento, tanto no diâmetro do caule quanto na altura da planta. Já Da SILVA et al.

(2009) avaliaram o efeito de diferentes substratos na produção de mudas da mangabeira

em sacos plásticos, onde 5 substratos foram avaliados seguindo os seguintes

parâmetros: porcentagem de germinação, índice de velocidade de emergência,

porcentagem de mortalidade, altura da planta (cm), diâmetro do caule (mm),

comprimento da raiz (cm), relação número de folhas/planta, índice de clorofila, massa

seca da parte aérea, raiz e planta inteira (g/planta). Os resultados demonstraram que os

substratos contendo esterco bovino eram recomendados para a produção de mudas de

mangabeira em sacos plásticos.

Com relação aos estudos realizados sobre o armazenamento dos frutos,

CARNELOSSI et al. (2009), avaliaram as variações na qualidade físico-química dos

frutos da mangaba, onde os frutos armazenados diretamente a 24 ºC demonstraram uma

queda acentuada em vitamina C e os frutos que foram mantidos inicialmente em 6 ou 8

ºC não mostraram nenhuma diferença significativa na qualidade físico-química durante

o armazenamento.

Com relação à química do látex desta espécie, MALMONGE et al. (2008)

fizeram um estudo comparativo sobre as propriedades tecnológicas do látex e borracha

natural da mangabeira e Hevea brasiliensis (seringueira), onde foi observado que

valores de plasticidade e viscosidade foram aproximadamente os mesmos para ambas

espécies. Posteriormente, MALMONGE et al. (2010) compararam o látex da

mangabeira e da seringueira no que diz respeito ao seu comportamento térmico, por

termogravimetria (TG), afim de obter parâmetros cinéticos (ordem de reação, fator

exponencial e energia de ativação) do processo de decomposição. Os resultados

P á g i n a | 2 5

indicaram algumas diferenças no comportamento térmico da borracha natural de H.

speciosa comparado ao da borracha natural da H. brasiliensis: a ordem de reação para a

mangabeira no início da degradação foi superior à ordem da seringueira, e a energia de

ativação, bem como o fator pré-exponencial apresentaram a mesma tendência,

aumentando com o aumento do grau de conversão, mantendo-se praticamente constante.

Sendo assim, esses estudos demonstraram que o látex de H. brasiliensis é mais estável

termicamente que o látex de H. speciosa.

P á g i n a | 2 6

OBJETIVOS

P á g i n a | 2 7

OBJETIVOS

O presente trabalho foi dividido em 3 partes, sendo que a primeira trata do estudo

do óleo essencial das folhas de H. speciosa. A parte 2 relata o estudo fitoquímico das

folhas e ramos desta espécie. Por fim, na parte 3 foram realizados testes de atividade

antioxidante e citotoxicidade do óleo essencial das folhas, bem como dos extratos das

folhas e ramos da mangabeira.

1. GERAL

Isolar e identificar os constituintes químicos das partes renováveis (folhas e

ramos) de Hancornia speciosa Gomes, bem como verificar atividade biológica do óleo

essencial, extratos e suas partições.

2. ESPECÍFICOS

• Determinar a composição química dos compostos voláteis das folhas de H. speciosa

de acordo com a época de colheita e o tempo de secagem;

• Isolar e identificar os metabólitos secundários do extrato metanólico das folhas e do

extrato hexânico dos ramos de H. speciosa;

• Determinar o potencial antioxidante do óleo essencial das folhas (frescas e secas), do

extrato metanólico das folhas e dos ramos e suas respectivas partições;

• Verificar a citotoxicidade in vitro dos extratos das folhas e dos ramos da mangabeira

em 3 linhagens de células tumorais;

P á g i n a | 2 8

PARTE 1: ESTUDO DO ÓLEO

ESSENCIAL DAS FOLHAS DE

Hancornia speciosa GOMES

P á g i n a | 2 9

PARTE 1: ESTUDO DO ÓLEO ESSENCIAL DAS FOLHAS

DE Hancornia speciosa

1. CONSIDERAÇÕES GERAIS

Os óleos essenciais (OE) são produtos voláteis obtidos por processos físicos e

podem ser encontrados em todas as estruturas vegetais, sendo mais frequente em folhas,

flores, frutos e raízes [YUNES et al., 2009]. Os OE assim eram chamados pelos

alquimistas, pois se acreditava que estes óleos compunham a essência da matéria. Sabe-

se hoje que esses óleos transmitem odores e sabores devido à presença de compostos

químicos voláteis obtidos de tecidos vegetais. Cada componente de um OE tem um

perfil característico e cada aroma e sabor é uma combinação dos perfis de seus

constituintes. Sendo assim, a utilização de OE requer minuciosa caracterização química

e avaliação de possíveis modificações na sua composição, devido a diferentes origens

geográficas e condições climáticas. Esses óleos podem ser constituídos desde um

componente dominante, como no caso do citronelal, no OE de Eucalyptus citriodora, do

linalol no óleo de Aniba roseadora, ou eugenol no óleo de Syzygium aromaticum, ou ser

constituído de algumas centenas de substâncias em quantidades variáveis. A natureza

química dos inúmeros componentes desses óleos é relativamente limitada, mas os

arranjos que podem assumir os esqueletos carbônicos e as posições variáveis de

determinados grupamentos tornam incrível o número de substâncias odoríferas, cada

uma delas assumindo a sua individualidade [SPEZIALI, 2008].

Estes óleos são constituídos por substâncias de baixo peso molecular,

principalmente misturas de fenilpropanóides e terpenóides, especificamente

monoterpenos e sesquiterpenos, embora diterpenos também possam estar presentes.

Além destes, uma variedade de hidrocarbonetos alifáticos (lineares, ramificados,

saturados ou insaturados), ácidos, alcoóis, aldeídos, ésteres acíclicos, lactonas e

compostos com nitrogênio e enxofre também foram identificados em OE [SIANI et al.,

2000].

P á g i n a | 3 0

Os terpenóides encontrados no óleo essencial apresentam grande variabilidade

estrutural e são derivados de unidades de 5 átomos de carbono. A biossíntese dos

terpenos acontece por dois caminhos diferentes: O caminho do mevalonato no

citoplasma das células e o caminho do metil eritritol nos plastídios das células

[DEWICK, 2009].

A redução no número de átomos de carbono do ácido mevalônico para 5 átomos

pode ser explicada por várias reações, começando com a fosforilação do álcool

primário, resultando em difosfato de ácido mevalônico e a descarboxilação-desidratação

seguem então para formação de pirofosfato de isopentenila (IPP) e pirofosfato de

dimetilalila (DMAPP). Apesar de uma terceira molécula de ATP ser necessária para

esta última transformação, não há nenhuma evidência de fosforilaçãoda hidroxila

terciária, embora isso possa converter a hidroxila em um grupo de saída melhor (Figura

13; p.30) [DEWICK, 2009].

HO2COH

OH2x ATP

HO

OOH

PHO

O

OH

O ADP

ATP/-CO2

OPPHH

H

OPP

Ácido mevalônico

Pirofosfato de isopentenila Pirofosfato de dimetilalila

(1) (2)

Figura 13: Possível rota biossintética de terpenóides via ácido mevalônico. (1) Fosforilação seqüencial do álcool primário para o difosfato. (2) ATP facilita a eliminação. Não há nenhuma evidência de fosforilação da hidroxila terciária.

A biossíntese dos terpenos prossegue com a formação da ligação carbono-carbono

que envolve a ionização do DMAPP transformando-o em cátion alílico que é

adicionado sobre a ligação dupla do IPP. Forma-se um carbocátion terciário que perde

um próton e forma uma dupla ligação trans (E). Neste caso o composto formado, que é

IPP DMAPP

OPP

P á g i n a | 3 1

precursor de vários monoterpenos, é o pirofosfato de geranila (GPP), (Figura 14; p.31)

[NICARETA, 2006; DEWICK, 2009].

OPP OPPHH

OPPHH

OPP

OPPE

DMAPP Cátion alílico IPP

GPP

- H+

Figura 14: Rota biossintética de formação do Pirofosfato de Geranila.

O difosfato de linalila (LPP) e o difosfato de nerila (NPP) são isômeros do GPP, e

são susceptíveis de serem formados a partir do mesmo pela ionização do cátion alílico,

permitindo uma mudança na inserção do grupo difosfato (ao carbono terciário em LPP)

ou uma mudança na estereoquímica na dupla ligação (para Z em NPP) (Figura 15;

p.31).

OPP

OPP

OPP

OPP

E Z

GPP LPP NPP

Estabilidade do cátion geranila Estabilidade do cátion nerila

OPP

Figura 15: Rotas biossintéticas do LPP e NPP.

≡

P á g i n a | 3 2

Estes três compostos, por relativamente ligeiras alterações, podem dar origem a

uma série de monoterpenos lineares encontrados como componentes dos óleos voláteis

usados como aromatizantes em perfumaria e cosméticos. A ciclização não seria

esperada em GPP, a estereoquímica E da ligação dupla é desfavorável para a formação

do anel. NPP ou LPP, no entanto, possuem estereoquímica favorável com formação do

carbocátion (α-terpineíla e mentoíla). É conveniente, portanto, considerar as espécies

envolvidas na ciclização como um cátion alílico deslocalizado fortemente vinculado ao

ânion difosfato, e a formação da ligação seguinte devido à proximidadede elétrons π da

dupla ligação [DEWICK, 2009].

O linalol é um dos mais importantes álcoois utilizados como fragrância e

aromatizantes, por ser estável em meio alcalino, também é utilizado como fragrância na

fabricação de sabões e detergentes [SERCHELI, 1996]. A formação do linalol (Figura

16; p.33) se dá pela hidratação do cátion nerila. Uma proposta para a biossíntese do

óxido de linalol consiste na hidroxilação do linalol pela ação das enzimas do citocromo

P-450 via intermediário 6,7 epóxido de linalol. Além desta, outra alternativa que pode

ser levada em consideração é a auto-oxidação do linalol, pela sua exposição ao oxigênio

do ar, que também conduz ao óxido de linalol [De BARROS, 2009].

P á g i n a | 3 3

OPP

OPP

OH

OPP

OH

O(1)

(2)

O

HO

O

HO

H2O

GPP

Cátion nerila Linalol Epóxido de linalol

NPPLPP

(1)

(2)

Óxido de linalol (furanóide)

Óxido de linalol (piranóide)

(1)

(2)

Figura 16: Possível rota biossintética do óxido de linalol. OPP=Difosfato.

O fato de sua biossíntese envolver poucas etapas pode contribuir para sua

presença em concentrações razoáveis no óleo essencial de algumas plantas, fazendo

com que o mesmo apareça em sua forma furânica e pirânica, além de serem largamente

utilizados por seu característico odor de rosas (Figura 17; p.34) [SERCHELI, 1996].

P á g i n a | 3 4

O

HO

OHO

O

HO

OHO

cis-óxido de linalol (piranóide) cis-óxido de linalol (furanóide)

trans-óxido de linalol (piranóide) trans-óxido de linalol (furanóide)

Figura 17: Estruturas químicas do óxido de linalol na sua forma furânica e pirânica.

O geraniol pode ser sintetizado pelas plantas a partir do ácido mevalônico. A

adição de água ao GPP forma o geraniol (Figura 18; p.34).

OPPOHH2O

GPP cátion geranila GeraniolFigura 18: Rota biossintética do geraniol a partir do GPP.

O α-terpineol é um monoterpeno oxigenado que tem sido isolado de uma

variedade de fontes, tais como: óleo de pinho e óleo de petitgrain. A sua formação se dá

pelo ataque da água sofrido pelo cátion mentoíla (Figura 19; p.35).

P á g i n a | 3 5

OPP

OPP

OH

H2O

LPP cátion alílico deslocalizado cátion mentoíla/α-terpineíla α-terpineol

Figura 19: Rota biossintética do α-terpineol a partir do LPP.

Dentre as principais atividades farmacológicas já atribuídas aos OE destacam-se:

antimicrobiana, antiinflamatória, antioxidante, anticolinesterástica, anti-helmíntica,

antiparasitária, analgésica, sedativa, antitumoral, entre outras [SIMÕES et al., 2007].

De acordo com a família as quais pertencem, as diversas espécies de plantas

acumulam esses elementos voláteis em órgãos anatômicos específicos, os quais estão

associados a várias funções necessárias à sobrevivência do vegetal em seu ecossistema,

exercendo um papel fundamental na defesa contra microrganismos e predadores, e

também na atração de insetos e outros agentes polinizadores [SIANI et al., 2000].

Existem alguns trabalhos demonstrando que a toxicidade de alguns compostos

dos OE constitui uma proteção contra predadores. Mentol e mentona (Figura 20; p.35),

por exemplo, são inibidores do crescimento de vários tipos de larvas. Também existem

evidências de que alguns insetos utilizam OE sequestrados de plantas para defenderem-

se de seus predadores [SIMÕES et al., 2007].

OH

H

O

Mentol Mentona

Figura 20: Estruturas químicas do mentol e mentona.

P á g i n a | 3 6

As aplicações fitoterápicas e industriais dos OE e, consequentemente, a

importância econômica de sua produção, têm direcionado os estudos sobre secagem

para a obtenção de composições que atendam às exigências do mercado. Com este

objetivo, BLANK et al. (2002) estudaram o efeito da secagem de folhas de Melissa

officinalis no teor e na composição do OE. Observou-se que a produção desse óleo não

foi significativamente afetada, mas os teores dos seus componentes de interesse,

geranial e neral, foram influenciados positivamente pela secagem. MARTINS et al.

(2000) também recomendam a secagem para maximizar a obtenção de citral a partir de

folhas de capim-limão (Cymbopogon citratus D.C.Stapf.). Por outro lado, EHLERT et

al. (2000) relataram um efeito negativo da secagem de folhas de alfavaca-cravo

(Ocimum gratissimum), a qual provoca perda do OE e de seus constituintes de interesse

comercial. REIS et al. (2006), analisaram o efeito da secagem das folhas no OE de

citronela, demonstrando que houve uma mudança na composição química comparando-

se as plantas frescas e secas. Já a secagem realizada a diferentes condições de

temperatura não provocou mudanças na composição química do óleo de citronela,

observando-se que não houve uma diminuição nas percentagens relativas dos principais

componentes químicos presentes no óleo (citronelal, citronelol, geraniol, eugenol e

elemol).

A composição química dos OE de uma planta é determinada geneticamente, mas

pode ser influenciada por fatores abióticos, tais como luz, sazonalidade, temperatura,

níveis de nutrição e água, entre outros [SIMÕES et al., 2005]. A baixa intensidade

luminosa geralmente diminui a produção de monoterpenos. Pequenas variações diárias

de temperaturas estimulam a produção de terpenóides, enquanto que valores extremos

causam a sua redução. Os índices de precipitação não seguem um padrão, variando sua

influência entre as espécies. A chuva contínua pode resultar na perda de substâncias

hidrossolúveis das folhas e raízes por lixiviação, enquanto que o aumento do teor de

nitrogênio e fósforo no solo pode favorecer o maior rendimento do óleo essencial

[LOPES & NETO GOBBO, 2007].

P á g i n a | 3 7

2. OBJETIVOS

Nesta parte do trabalho objetivamos investigar a composição química do óleo

essencial das folhas frescas e secas da mangabeira em diferentes épocas do ano.

P á g i n a | 3 8

3. METODOLOGIA

3.1. Obtenção do material vegetal

As folhas de H. speciosa foram obtidas a partir de um espécime encontrado no

Campus da Universidade Federal de Sergipe (UFS) no município de São Cristóvão – SE

(S 10º 55’ 43” W 37º 55’ 14”). As coletas ocorreram nos meses de janeiro a dezembro

de 2009, entre 09 e 10 horas da manhã. A espécie foi identificada pelo botânico Clóvis

Roberto Pereira Franco. Material testemunha encontra-se depositado no Herbário do

Departamento de Biologia da UFS, sob o registro ASE n° 13630.

3.2. Extração do óleo essencial

O OE foi extraído das folhas frescas e secas a temperatura ambiente por 5 dias,

através da técnica de hidrodestilação, utilizando-se aparelhagem tipo Clevenger (Figura

21; p.39). As folhas (100 g) foram trituradas e misturadas com 2 L de água destilada em

um balão de fundo redondo (3 L), onde a extração foi realizada em triplicata.

Após 3 horas de extração, os compostos voláteis foram separados da água pela

extração com diclorometano (CH2Cl2) (3x15 mL). A fase orgânica foi seca com sulfato

de sódio anidro (Na2SO4) e logo em seguida foi filtrada. A solução foi inicialmente

concentrada à pressão reduzida em um evaporador rotatório e, posteriormente

submetida a fluxo de gás nitrogênio até volume final de 0,5 mL (Fluxograma 2; p.41).

P á g i n a | 3 9

Figura 21: Técnica da hidrodestilação utilizando aparelhagem do tipo Clevenger

[Wesley Gomes].

3.3. Identificação dos componentes voláteis

Os componentes voláteis foram analisados por CG/EM utilizando um aparelho

Shimadzu-QP5050A equipado com coluna capilar de sílica fundida DB-5 (30 m x 0,25

mm x 0,25 µm) e por CG/DIC utilizando um equipamento Shimadzu GC-17A, sob uma

coluna capilar de sílica fundida DB-5MS com 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm de filme.

A temperatura da coluna foi programada de 40 ºC (4 min) aumentando para 220

°C a 4 °C/min e, em seguida, aquecida até 280 °C a 20 °C/min. As temperaturas do

injetor e detector foram 250 ºC e 280 ºC, respectivamente. O gás de arraste foi o Hélio

(1,2 mL/min). O volume de injeção foi de 0,5 µL. O espectrômetro de massas operou

com velocidade de 0,50 scans.seg-1 na faixa de m/z 40-550.

P á g i n a | 4 0

Os índices de retenção foram obtidos injetando uma mistura de C8-C20 de

hidrocarbonetos lineares (n-alcanos). A identificação dos compostos foi feita com base

nos índices de retenção [VAN DEN DOOL & KRATZ, 1963] e na comparação

computadorizada dos espectros de massas adquiridos com aqueles armazenados no

banco de dados de espectros de massas do sistema CG/EM (NIST107, NIST21,

WILEY8) e com outros espectros de massas da literatura [ADAMS, 2007].

A percentagem de cada componente foi determinada pela área do componente

dividida pela área total de todos os componentes presentes na mistura [ADAMS, 2007].

P á g i n a | 4 1

Fluxograma 2: Procedimento para obtenção do óleo essencial de H. speciosa.

Coleta das folhas

Frescas Secas

(5 dias ao ar)

Óleo/Água

Fase orgânica Solução Aquosa

Óleo essencial Análise CG/EM Identificação

Shimadzu, QP5050A, coluna ZB-5MS 30m

Separação CH2Cl2 (3x15mL)

1.Na2SO4

2.Filtração 3.Rotaevaporador 4.Gás Nitrogênio (0,5mL)

Hidrodestilação 3h Extração em aparelho tipo Clevenger

P á g i n a | 4 2

3.4. Levantamento dos dados meteorológicos

Os dados meteorológicos de temperatura, índice pluviométrico e teor de água no

solo foram obtidos a partir dos registros da Empresa de Desenvolvimento Agropecuário

de Sergipe (EMDAGRO), bem como pelos registros fornecidos pelo Sistema de

Monitoramento Agrometeorológico (AGRITEMPO). Os dados foram tabulados e

utilizados, para fins de comparação, com as variações quantitativas observadas para o

óleo essencial de H. speciosa.

3.5. Análise estatística

As análises multivariadas da composição química do óleo essencial das folhas

frescas e secas de H. speciosa, tais como: análises de arranjos (grupo) baseadas na

dissimilaridade de indivíduos (Cluster Analysis; CA) e Análise dos Componentes

Principais (ACP) foram realizadas utilizando o software comercial XLSTAT versão

2010 (2010) da empresa Microsoft Corporation®, bem como o software comercial

STATISTICA versão 9 (2010) da empresa Statsoft®.

P á g i n a | 4 3

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Análise dos compostos voláteis das folhas de Hancornia speciosa

A análise dos compostos voláteis das folhas nos permitiu verificar que existem

variações tanto no rendimento quanto na composição química do óleo (Figura 23-34;

p.47-58; Tabela 1; p.45; Tabela 2; p.46), levando em consideração o tempo de

secagem e época de colheita.

Com a análise dos constituintes voláteis (Figura 22; p.44) foi possível identificar

22 compostos de diferentes classes (59% alcoóis, 27% aldeídos, 5% cetonas e 9%

ésteres). Com a secagem das folhas verificou-se um aumento significativo nas

percentagens relativas de alguns monoterpenos oxigenados como α-terpineol (0,08±0,20

- 3,89±1,78 nas folhas frescas e 0,93±0,03 - 5,21±0,65 nas folhas secas), linalol

(2,95±1,45 - 12,46±2,24 nas folhas frescas e 2,78±1,08 - 17,16±2,83 nas folhas secas),

geraniol (1,04±0,34 - 12,80±1,23 nas folhas frescas e 25,67±6,45- 46,56±4,67 nas

folhas secas), assim como um decréscimo nas percentagens de alcoóis como (Z)-3-

hexenol (46,81±3,27 - 78,45±7,75 nas folhas frescas e 10,70±4,87 - 19,15±4,28 nas

folhas secas), 1-hexanol (1,65±0,33 - 10,15±0,80 nas folhas frescas e 0,07±0,05 -

4,59±1,55 nas folhas secas).

P á g i n a | 4 4

OH OH

(Z)-3-hexenol 1-hexanol

F. Fresca:46,81±3,27 – 78,45±7,75 F. Fresca:1,65±0,33 – 10,15±0,80

F. Seca:10,24±4,37 – 19,15±4,28 F. Seca:0,07±0,05 – 4,59±1,55

OHOH

Geraniol Linalol

F. Fresca:2,95±1,45 – 12,46±2,24 F. Fresca:1,04±0,34 – 12,80±1,23

F. Seca:2,95±1,45 – 17,16±2,83 F. Seca:25,67±6,45 – 46,56±4,67

O

H

OH

O

H

OH

cis-óxido de linalol trans-óxido de linalol

F. Fresca:0,14±0,04 – 4,33±0,15 F. Fresca:0,31±0,03 – 7,01±0,79

F. Seca:0,88±0,35 – 6,36±1,67 F. Seca:2,33±1,09 – 16,43±4,73

Figura 22: Principais compostos identificados na análise de óleo essencial das folhas de H. speciosa variando-se o tempo de secagem e época de colheita.

P á g i n a | 4 5

Tabela 1: Composição percentual relativa dos constituintes químicos encontrados nos óleos essenciais das folhas de H. speciosa variando-se o

tempo de secagem e época de colheita nos meses de janeiro a junho/2009, através de CG/DIC.

* IRcal= Índice de retenção calculado; IRlit= Índice de retenção da literatura [ADAMS, 2007]. a (forma furânica) b(forma pirânica)

Compostos IRcal IR lit Jan/09 (%) Fev/09 (%) Mar/09 (%) Abr/09 (%) Mai/09 (%) Jun/09 (%)

Frescas Secas Frescas Secas Frescas Secas Frescas Secas Frescas Secas Frescas Secas

1 (Z)-2-Penten-1-ol 760 765 1,69±1,15 0,61±1,16 1,57±1,17 0,99±1,10 1,28±1,06 1,29±1,17 2,01±1,08 0,81±1,05 1,54±1,59 0,70±1,03 2,10±1,25 1,08±1,12

2 Hexanal 801 801 0,42±1,14 0,73±0,39 0,71±1,15 0,55±1,14 0,21±1,08 1,23±1,14 0,65±1,22 0,54±1,03 0,74±1,23 0,85±1,37 1,22±1,04 0,71±1,12

3 (E)-2-Hexenal 850 855 0,31±1,14 2,19±1,75 0,17±1,05 3,42±1,25 0,61±0,31 3,85±0,25 7,34±0,85 0,84±1,05 3,00±2,45 0,87±0,26 1,32±0,81 1,82±0,45

4 Furfural 834 836 0,16±1,14 0,11±1,07 0,08±1,04 0,11±1,05 0,04±1,23 0,08±1,34 0,08±0,23 0,70±1,08 0,12±0,27 0,18±0,05 1,34±2,85 1,02±1,11

5 (Z)-3-Hexenol 853 850 70,87±6,61 14,91±5,35 76,72±1,53 19,15±4,28 78,45±7,75 11,97±1,44 67,89±8,25 10,70±4,87 60,54±5,93 17,20±2,93 46,81±3,27 12,77±1,96

6 (Z)-2-Hexenol 860 859 1,71±1,09 0,17±1,05 1,87±0,44 0,38±0,07 1,29±0,50 1,54±0,24 0,79±0,06 0,18±0,86 1,99±0,95 0,50±0,06 4,44±0,27 0,15±0,26

7 1-Hexanol 868 863 10,15±0,80 1,63±1,40 6,13±2,42 1,88±2,33 3,41±2,35 3,65±2,15 3,19±1,64 1,17±1,17 2,78±0,79 1,85±0,75 4,08±2,16 0,81±0,21

8 (2E, 4E)-Hexadienal 911 907 0,39±0,16 0,15±0,06 0,33±0,04 0,08±1,23 0,26±0,05 0,06±1,33 0,08±0,07 0,17±0,45 0,52±0,23 0,21±0,55 0,76±0,02 1,22±0,11

9 6-metil, 5-hepten-2-ona 985 981 0,56±0,11 1,31±0,14 0,10±0,02 0,07±0,02 0,08±0,04 0,59±0,25 0,16±0,03 0,38±0,17 0,89±0,34 0,48±0,23 0,65±0,03 1,39±0,18

10 Benzenoacetaldeído 1040 1036 0,52±0,15 0,11±0,15 0,72±0,26 0,42±0,27 0,15±0,02 1,90±0,66 0,69±0,60 0,37±0,17 0,27±0,15 0,09±0,06 1,51±0,57 0,12±0,08

11 cis-óxido de linalola 1070 1067 0,27±0,12 4,78±0,03 1,50±0,26 2,18±0,54 0,14±0,04 2,28±0,16 0,22±0,07 5,18±0,69 2,43±0,56 3,43±1,13 2,86±1,10 6,36±1,67

12 trans-óxidode linalola 1086 1084 0,32±0,11 10,21±2,45 0,60±0,05 4,85±1,65 0,31±0,03 4,35±1,06 0,48±0,30 16,43±4,73 5,17±0,02 6,32±2,65 4,19±0,57 10,37±2,44

13 Linalol 1101 1095 8,08±2,68 17,16±2,83 2,95±1,45 7,90±0,62 3,98±0,88 7,19±1,37 7,45±1,11 2,78±1,08 3,09±1,60 6,63±1,24 5,02±2,52 5,90±1,69

14 Álcool feniletílico 1110 1106 0,25±0,38 0,95±1,11 0,15±0,67 1,12±0,56 0,13±0,49 0,82±0,14 0,31±0,12 3,69±0,51 0,29±0,77 0,68±0,13 2,50±0,03 1,11±0,08

15 cis-óxido de linalolb 1169 1170 0,17±0,56 1,00±0,25 0,08±0,17 0,93±0,05 0,04±0,31 0,27±0,13 0,15±0,39 1,28±0,45 0,18±0,56 0,77±0,21 0,08±0,18 1,57±0,04

16 trans-óxido de linalolb 1173 1173 0,28±0,55 1,68±0,09 0,28±0,34 2,35±0,36 0,14±0,45 0,78±0,12 0,16±0,23 4,76±1,75 0,25±0,08 2,85±0,63 0,31±0,11 4,61±2,34

17 Salicilato de metila 1189 1190 0,10±0,18 1,87±0,27 0,08±0,23 1,22±0,11 0,04±0,18 1,44±0,54 0,17±0,22 2,28±0,31 1,09±0,45 2,87±0,90 1,00±0,65 1,85±1,10

18 α-Terpineol 1193 1186 0,21±0,04 1,29±0,21 0,51±0,16 1,15±0,03 0,76±0,23 0,95±0,49 0,32±0,05 1,86±0,32 1,10±0,28 1,17±0,07 1,54±0,56 1,13±0,08

19 Geraniol 1249 1249 1,04±0,34 28,06±5,46 2,57±0,25 43,14±7,95 2,63±0,23 46,56±4,67 1,45±0,43 34,65±3,82 10,96±1,21 44,14±5,27 12,80±1,23 29,98±3,56

20 Antranilato de metila 1338 1337 0,02±0,45 7,40±2,06 0,04±0,15 5,01±0,66 0,04±0,56 1,21±0,24 0,05±0,10 2,61±0,31 0,04±0,08 0,64±0,55 0,06±0,11 13,79±2,35

21 (E)-2-Decenal 1262 1260 0,25±0,05 0,11±0,08 0,22±0,07 0,08±0,04 0,09±0,55 0,03±0,11 0,19±0,35 0,06±0,20 0,06±0,16 0,04±0,17 0,16±0,08 0,05±±0,19

22 Eugenol 1360 1366 0,22±0,10 0,66±0,55 0,18±0,06 0,59±0,15 0,38±0,10 1,04±0,75 0,19±0,11 0,64±0,55 0,08±0,04 0,34±0,22 0,41±0,20 1,01±0,08

TOTAL 97,99 97,09 97,56 97,57 94,46 93,08 93,33 95,91 97,13 92,79 95,16 98,82

P á g i n a | 4 6

Tabela 2: Composição percentual relativa dos constituintes químicos encontrados nos óleos essenciais das folhas de H. speciosa variando-se o

tempo de secagem e época de colheita nos meses de julho a dezembro/2009, através de CG/DIC.

* IRcal= Índice de retenção calculado; IRlit= Índice de retenção da literatura [ADAMS, 2007]. a (forma furânica) b(forma pirânica).

Compostos IRcal IR lit Jul/09 (%) Ago/09 (%) Set/09 (%) Out/09 (%) Nov/09 (%) Dez/09 (%)

Frescas Secas Frescas Secas Frescas Secas Frescas Secas Frescas Secas Frescas Secas

1 (Z)-2-Penten-1-ol 760 765 0,59±0,06 0,90±0,07 0,82±0,74 1,31±0,08 0,72±0,68 0,45±0,35 1,45±0,22 0,81±0,74 1,33±0,12 0,48±0,18 0,70±1,00 0,29±0,47

2 Hexanal 801 801 0,75±0,21

0,27±0,05

0,59±0,55

0,08±0,19 1,58±0,11

0,60±0,52

0,93±0,85

0,21±0,35 0,76±0,65

0,28±0,07

0,76±0,12

0,48±0,08

3 (E)-2-Hexenal 850 855 2,94±0,51

3,11±0,87

1,50±0,39

8,61±1,04

3,71±0,61

3,00±1,55

6,21±1,65

0,34±0,15 0,71±0,27

0,54±0,13

5,13±0,11

3,63±0,63

4 Furfural 834 836 0,06±0,14 0,15±0,23 0,06±0,02

1,66±0,32

0,93±0,84

2,49±0,92

0,31±0,08 0,95±0,85

0,48±0,13

1,31±0,14

1,47±0,95 0,49±0,04

5 (Z)-3-Hexenol 853 850 70,09±9,94

17,34±4,88

65,44±5,71

17,46±4,43

50,94±5,27

14,66±2,25

62,06±3,11

12,75±1,45

61,33±3,66

10,86±0,97

62,83±6,98

10,24±4,37

6 (Z)-2-Hexenol 860 859 3,14±1,07

2,74±0,08

2,84±1,28

3,38±0,83

4,46±2,02

0,92±0,84

3,51±2,16

0,71±0,33 4,18±0,50

1,56±0,20

0,70±1,23

0,30±0,04

7 1-Hexanol 868 863 4,07±0,73

3,88±0,65

3,39±1,85

4,59±1,55

2,67±0,51

0,07±0,05

4,73±2,39

0,08±0,23 1,65±0,33

0,10±0,06

2,15±0,45

0,73±0,85

8 (2E, 4E)-Hexadienal 911 907 0,10±0,05

0,06±0,18 0,55±0,42

0,05±0,19 1,03±0,95

0,03±0,11 1,01±0,22 0,34±0,12 0,67±0,10

0,27±0,22 0,06±0,67

0,14±0,25

9 6-metil, 5-hepten-2-ona 985 981 0,77±0,35 0,41±0,16 1,34±0,11

1,47±0,81 0,31±0,22 0,48±0,14 0,29±0,13 0,11±0,27 0,07±0,02

1,47±0,14

0,05±0,57

0,08±0,16

10 Benzenoacetaldeído 1040 1036 0,69±0,21 1,23±0,55

1,23±0,56

1,31±0,42 0,16±0,04 0,62±0,28

0,81±0,33 1,60±1,55

0,71±0,63

3,16±1,05

1,67±0,87 0,13±0,03

11 cis-óxido de linalola 1070 1067 0,65±0,57

1,29±0,15

0,92±0,84

0,88±0,35

2,28±2,22

3,45±1,99

1,45±0,22

4,70±0,50

0,97±0,67

6,32±2,65

4,33±0,15

6,17±0,85

12 trans-óxidode linalola

1086 1084 2,78±0,67

5,26±0,81

1,55±0,33

2,33±1,09

7,01±0,79

6,95±0,17

2,43±0,12

5,69±0,61

1,48±0,97

2,70±1,50

5,22±0,68

7,24±1,43

13 Linalol 1101 1095 5,12±0,55

9,46±2,87

4,51±0,84

5,92±2,73

12,46±2,24

8,97±0,72

4,12±0,55

6,57±1,72

4,88±2,67

4,84±1,94

5,95±1,52

10,27±3,51

14 Álcool feniletílico 1110 1106 2,02±0,31 0,97±0,17 0,82±0,73

2,15±0,16

1,25±0,25

3,90±0,29

1,69±0,12

3,31±0,09

2,79±0,68

3,89±1,78

2,33±0,15

1,23±0,08

15 cis-óxido de linalolb 1169 1170 0,11±0,18 0,94±0,03

0,30±0,12 0,90±0,86

0,25±0,11 1,51±0,16

0,12±0,25 3,88±0,67

0,27±0,08 3,00±0,66

0,31±0,22 0,77±0,46

16 trans-óxido de linalolb 1173 1173 0,27±0,18 2,79±0,55

0,67±0,35 3,49±1,65

0,81±0,11 3,05±1,65

0,93±0,21 6,77±1,10

0,98±0,22 5,66±1,15

1,01±0,37 3,06±1,25

17 Salicilato de metila 1189 1190 0,28±0,19 2,29±0,08

0,61±0,22 3,80±1,12

0,77±0,30 2,89±1,66

1,16±1,09 7,27±1,61

0,28±0,15

2,91±0,69

1,33±1,07 4,02±1,56

18 α-Terpineol 1193 1186 0,08±0,20 0,93±0,03

0,11±0,22 1,99±1,68

0,89±0,31 2,40±2,95

0,83±0,73

5,21±0,65

3,89±1,78

3,44±2,05

0,22±0,32

1,54±0,55

19 Geraniol 1249 1249 4,09±0,89 37,28±2,35

10,61±1,49

30,60±7,61

4,54±1,13

28,76±4,38

3,31±0,65

25,67±6,45

6,78±1,22

29,61±6,05

2,32±1,05

35,41±2,53

20 Antranilato de metila 1338 1337 0,03±0,09 3,08±0,26

0,02±0,20 5,43±1,89 0,04±0,16 8,44±1,65

0,04±0,22 7,89±4,75

0,05±0,15 9,50±2,73

0,04±0,18 9,79±2,95

21 (E)-2-Decenal 1262 1260 0,34±0,04

0,29±0,08 0,23±0,15

0,31±0,11 1,61±0,19

0,21±0,06 0,06±0,25

0,18±0,04 0,33±0,35

0,11±0,22 0,31±0,18 0,08±0,21

22 Eugenol 1360 1366 0,15±0,20 0,65±0,15

0,11±0,23 0,35±0,11

0,35±0,12 1,67±0,56

0,81±0,20 2,89±1,66

0,34±0,10 1,46±0,71

0,06±0,13 0,11±0,35

TOTAL 98,47 95,32 98,22 98,07 98,77 95,52 98,26 97,47 94,93 93,47 98,95 96,20

P á g i n a | 4 7

5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

1 2 5

1 5 0

1 7 5

2 0 0

Inte

nsid

ade

rela

tiva

(%)

t ( m in )

T IC - F o lh a s f r e s c a s T IC - F o lh a s s e c a s

Figura 23: Comparação dos cromatogramas de íons totais (TIC) obtidos por CG/EM (coluna DB-5MS 30m) representativo dos voláteis das

folhas frescas e secas do mês de janeiro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 1.

5

7 13

5

7 11

12

13

16

19

20

P á g i n a | 4 8

5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

1 2 5

1 5 0

1 7 5

2 0 0

Inte

nsid

ade

rela

tiva

(%)

t (m in )



folhas frescas e secas do mês de fevereiro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 1.

5

7

5

13

11 12

13

20

19

7

P á g i n a | 4 9

5 10 15 20 25 30

0

25

50

75

100

125

150

175

200

Inte

nsid

ade

rela

tiva

(%)

t (m in)


folhas frescas e secas do mês de março de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 1.

5

5

7

7

13

10

13

12 11

19

P á g i n a | 5 0

5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

1 2 5

1 5 0

1 7 5

2 0 0

Inte

nsid

ade

rela

tiva

(%)

t (m in )



folhas frescas e secas do mês de abril de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 1.

5

7 13

5

7 11

13

12

19

16

20

P á g i n a | 5 1

5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

1 2 5

1 5 0

1 7 5

2 0 0

Inte

nsid

ade

rela

tiva

(%)

t ( m in )

T IC - F o lh a s f r e c a s T IC - F o lh a s s e c a s


folhas frescas e secas do mês de maio de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 1.

5

5

7

7 10

11 12 13

13 20

19

P á g i n a | 5 2

5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

1 2 5

1 5 0

1 7 5

2 0 0

Inte

nsid

ade

rela

tiva

(%)

t ( m in )



folhas frescas e secas do mês de junho de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 1.

7

5

5

7

13

13

12 11

19

19

20

16 17

22

P á g i n a | 5 3


folhas frescas e secas do mês de julho de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 2.

5

7 12

11

13

17

19

22 20

7 13 19

5

5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

1 2 5

1 5 0

1 7 5

2 0 0

Inte

nsid

ade

rela

tiva

(%)

t ( m in )

T I C - F o lh a s f r e s c a s T I C - F o lh a s s e c a s

P á g i n a | 5 4

5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

1 2 5

1 5 0

1 7 5

2 0 0

Inte

nsid

ade

rela

tiva

(%)

t (m in )



folhas frescas e secas do mês de agosto de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 2.

5

5

7

7 10

11 12

13

13

19

P á g i n a | 5 5


folhas frescas e secas do mês de setembro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 2.

5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

1 2 5

1 5 0

1 7 5

2 0 0

Inte

nsid

ade

rela

tiva

(%)

t ( m in )

T I C - F o lh a s f r e s c a s T I C - F o lh a s s e c a s

5

5

14

12

13 16

19

11

20

P á g i n a | 5 6

5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

1 2 5

1 5 0

1 7 5

2 0 0

Inte

nsid

ade

rela

tiva

(%)

t (m in )



folhas frescas e secas do mês de outubro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 2.

5

7

5

7

13

12 11

17

19

20

P á g i n a | 5 7

5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

1 2 5

1 5 0

1 7 5

2 0 0

Inte

nsid

ade

rela

tiva

(%)

t ( m in )



folhas frescas e secas do mês denovembro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 2.

5

14

5

11 12

13

17 20

19

P á g i n a | 5 8

5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

1 2 5

1 5 0

1 7 5

2 0 0

Inte

nsid

ade

rela

tiva

(%)

t ( m in )



folhas frescas e secas do mês de dezembro de H. speciosa. O número de picos corresponde à identificação dos compostos citados na Tabela 2.

5

5

11

12

13

14

16

19

20

P á g i n a | 5 9

Os rendimentos do OE das folhas frescas variaram de 0,11% a 0,53% e das folhas

secas variaram de 0,10% a 0,51% (Figura 35; p.60). Analisando os dados climáticos do

período, observou-se que tanto a diminuição do índice de precipitação (ppm), quanto

temperaturas mais elevadas (Figura 36; p.60) favorecem o aumento do teor do óleo

essencial das folhas de H. speciosa. Na Figura 35; p.60, pôde-se observar que os teores

de óleo essencial foram superiores na estação seca em relação à estação chuvosa. Estes

resultados são semelhantes aos obtidos por MATTOS (2000) e CRUZ (1999), que

trabalharam com hortelã-japonesa (Mentha arvensis) e hortelã-rasteira (Mentha villosa),

respectivamente. Nestes trabalhos, também se considerou a intensidade luminosa e a

temperatura como os principais fatores responsáveis pelo aumento da produção de óleo

essencial na estação seca. Pôde-se atribuir este fato ao aumento da temperatura e,

principalmente, da intensidade luminosa durante a estação seca. Estes fatores ambientais

atuam diretamente em processos primários, como fotossíntese e respiração, e podem

influenciar indiretamente a produção de metabólitos secundários, cuja biossíntese

depende de produtos do metabolismo primário. Foi observado também que os meses de

maio e junho apresentaram maiores valores percentuais de teor de água no solo, sendo

que nesses meses observou-se um menor teor de óleo essencial. Já onde houve uma

menor disponibilidade de água no solo, foi observado um maior teor de óleo essencial

(Figura 37; p.61). Os resultados obtidos com relação à secagem das folhas também se

assemelham aos estudos feitos por De BARROS et al. (2009), onde o maior teor de óleo

essencial de Lippia alba (Mill.) N. E. Brown (Verbenaceae) foi obtido nas estações

com menor índice de precipitação e quando as temperaturas médias se mantiveram

elevadas.

P á g i n a | 6 0

Figura 35: Rendimento (%) do óleo essencial das folhas frescas e secas de H. speciosa.

Figura 36: Dados de precipitação totale média das temperaturas máxima e mínima do município de São Cristóvão fornecidos pela Empresa de Desenvolvimento Agropecuário de Sergipe (EMDAGRO) e pelo Sistema de Monitoramento Agrometeorológico (AGRITEMPO), respectivamente.

0,33

0,38

0,42

0,29

0,15

0,26

0,32

0,11

0,19

0,46 0,46

0,53

0,390,37

0,44

0,26

0,13

0,22

0,29

0,1

0,15

0,51

0,45

0,49

jan/09 fev/09 mar/09 abr/09 mai/09 jun/09 jul/09 ago/09 set/09 out/09 nov/09 dez/09

Folhas Frescas Folhas secas

P á g i n a | 6 1

Figura 37: Percentagem de teor de água no solo nos meses de 2009 no município de São Cristóvão, fornecidos pelo Sistema de Monitoramento Agrometeorológico (AGRITEMPO).

Os nossos resultados mostraram uma variação significativa nas percentagens dos

principais constituintes do OE das folhas de H. speciosa com relação ao tempo de

secagem, tendo-se uma inversão dos componentes majoritários. Nos meses de fevereiro

e março de 2009, onde foram observadas temperaturas consideravelmente elevadas

(32,6 ºC e 33,0 ºC, respectivamente) houve uma maior percentagem do (Z)-3-hexenol

(composto majoritário encontrado no OE das folhas frescas) (76,72±1,53 e 78,45±7,75,

respectivamente) (Figura 38; p.62). Enquanto que no OE das folhas secas, o geraniol

(composto majoritário) obteve maiores percentagens nos meses de março e maio

(45,14±0,95 e 46,56±2,67, respectivamente) (Figura 39; p.62). A volatilização do (Z)-

3-hexenol durante a secagem provavelmente foi o fator responsável por seu baixo

conteúdo frente aos constituintes das folhas secas.

2,3 0,4 0,4

15,6

61,1

51,1

20,7

8,14,4

1,4 0,33,7


teor de água no solo %

P á g i n a | 6 2

Figura 38: Percentagens relativas do (Z)-3-hexenol nas folhas frescas e secas de H.

speciosa.

Figura 39: Percentagens relativas do geraniol nas folhas frescas e secas de H.

speciosa.

A influência da sazonalidade na composição química dos óleos essenciais varia

de acordo com a espécie. RANDRIANALIJAONA et al. (2005) avaliaram a influência

da sazonalidade na composição química do óleo essencial de Lantana camara L.

(Verbenaceae) coletadas em Madagascar e constatou que, ao longo do ano, a

70,8776,72 78,45

67,89

60,54

46,81

70,0965,44

50,94

62,06 61,33 62,83

14,9119,15

11,97 10,717,2

12,7717,34 17,46 14,66 12,75 10,86 10,24


Folhas frescas Folhas secas

1,04 2,57 2,63 1,45

10,9612,8

4,09

10,61

4,54 3,316,78

2,32

28,06

43,14

46,56

34,65

44,14

29,98

37,28

30,628,76

25,67

29,61

35,41


Folhas frescas Folhas secas

P á g i n a | 6 3

composição química do óleo permaneceu estável. Entretanto, estudos sobre óleo

essencial das folhas e cascas do tronco de Aniba canelilla (Kunth) Mez. (Lauraceae)

demonstraram grande influência da sazonalidade [TAVEIRA et al., 2003], onde dos

constituintes majoritários no período chuvoso, o 1-nitro-2-feniletano atingiu valores

próximos a 95%, enquanto que o metileugenol permaneceu abaixo de 18%. Pelo

contrário, no período seco o 1-nitro-2-feniletano decresceu para 39%, enquanto que o

metileugenol atingiu 45%. De maneira semelhante, os óleos de Lippia Alba (Mill.) N. E.

Brown (Verbanaceae) sofreram influência de fatores ambientais relacionados a

diferentes épocas do ano [SILVA et al., 2006].

A análise de agrupamento (cluster analysis) é uma ferramenta excelente para

análise preliminar de dados, sendo útil para determinar a semelhança entre objetos e

identificar amostras anômalas. Esta análise foi realizada através de duas etapas: na

primeira etapa foi gerada uma matriz de distância (dissimilaridade) entre os indivíduos e

na segunda, foi aplicado um algoritmo de agrupamento na matriz que identifica e reúne

grupos homogêneos, os quais podem ser visualizados em forma de dendrograma. Para a

análise foi utilizada a distância euclidiana, pois é a medida de dissimilaridade mais

utilizada para calcular distância genética, sendo sensível às correlações e restrita a

variáveis independentes.

Através da análise multivariada, foram definidos dois grupos classificados e

agrupados de acordo com a composição química e diferenciados pela análise de

agrupamento nos 12 meses de colheita (Figura 40; p.64).

Considerando as dissimilaridades na composição química dos óleos, os

agrupamentos foram subdivididos como Grupo I: Folhas Frescas (G-I) e Grupo II:

Folhas Secas (G-II). Este primeiro foi caracterizado por apresentar maiores

percentagens relativas de (Z)-3-hexenol (G-I: 65,33%; G-II: 15,42%). O Grupo II foi

caracterizado principalmente por apresentar maiores valores percentuais de geraniol (G-

I: 5,09%; G-II: 32,49%).

P á g i n a | 6 4

Figura 40: Dendograma representando a relação de dissimilaridade da composição

química das folhas frescas (F) e secas (S) de H. speciosa coletadas durante o ano de

2009.

Os dados quantitativos da composição química do óleo essencial das folhas

frescas (Figura 41; p.65) e secas (Figura 42; p.66) de H. speciosa foram submetidos à

Análise de Componentes Principais (ACP). A percentagem de informação dos dados

originais das amostras do óleo essencial das folhas frescas, obtida após ACP foi de

34,14% no primeiro componente principal (CP-1), que está positivamente relacionado

ao (Z)-3-hexenol (r = 0,84), antranilato de metila (r = 0,50) e 1-hexenol (r = 0,42) e

relaciona-se negativamente ao hexanal (r = -0,87), trans-óxido de linalol (furanóide; r =

-0,84), e geraniol (r =-0,47). Nas amostras de óleo extraído das folhas secas, o

componente principal primário representa 31,35% das informações e está ligado

positivamente ao 1-hexanol (r = 0,78), geraniol (r = 0,64) e (E)-2-hexenal (r = 0,58). Já

os compostos cis-óxido de linalol (piranóide; r = -0,91), α-terpineol (r = -0,85) e álcool

feniletílico (r = -0,82), projetam-se negativamente ao componente principal primário.

SET F

NOV FJUN F

OUT FJAN F

FEV FMAR F

MAI FJUL F

AGO FABR F

DEZ FAGO S

MAR SJUL S

JAN SDEZ S

FEV SMAI S

SET S

OUT SNOV S

ABR SJUN S

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Dissimilaridade

Dendrograma

P á g i n a | 6 5

O componente principal secundário (CP-2) explica 14,41% e 22,22% das

informações totais nas amostras do óleo essencial das folhas frescas e secas,

respectivamente. Neste primeiro grupo de amostra, o CP-2 está positivamente ligado ao

cis-óxido de linalol (piranóide; r = 0,47), benzenoacetaldeído (r = 0,45) e cis-óxido de

linalol (furanóise; r = 0,43); e negativamente ligado ao (2E, 4E)-hexadienal (r = -0,68),

(Z)-2-hexenol (r = -0,66) e eugenol (r = -0,65). Já nas amostras do óleo essencial das

folhas secas, o CP-2 está positivamente ligado ao trans-óxido de linalol (furanóide; r =

0,79), cis-óxido de linalol (furanóide; r = 0,65) e hexanal (r = 0,59) e negativamente

ligado ao (Z)-2-hexenol (r = -0,90), (E)-2-decenal (r = -0,82) e benzenoacetaldeído (r =

-0,66).


folhas frescas de H. speciosa pelos CP-1 e CP-2.

Análise dos Componentes Principais (ACP)

(Z)-2-Penten-1-ol

Hexanal

(E)-2-HexenalFurfural

(Z)-3-Hexenol

(Z)-2-Hexenol

1-Hexanol

(2E, 4E)-Hexadienal

6-metil, 5-hepten-2-ona

Benzenoacetaldeídocis-óxido de linalol (furanóide)

trans-óxido de linalol (furanóide)

LinalolÁlcool feniletílico

cis-óxido de linalol (piranóide)

trans-óxido de linalol (piranóide)

Salicilato de metila

a-Terpineol

Geraniol

Antranilato de metila(E)-2-Decenal

Eugenol

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0

CP-1: 34,14%

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

CP

-2: 1

4,41

%

(Z)-2-Penten-1-ol

Hexanal

(E)-2-HexenalFurfural

(Z)-3-Hexenol

(Z)-2-Hexenol

1-Hexanol

(2E, 4E)-Hexadienal


Benzenoacetaldeídocis-óxido de linalol (furanóide)


LinalolÁlcool feniletílico


trans-óxido de linalol (piranóide)

Salicilato de metila

a-Terpineol

Geraniol

Antranilato de metila(E)-2-Decenal

Eugenol

P á g i n a | 6 6


folhas secas de H. speciosa pelos CP-1 e CP-2.

Análise dos Componentes Principais

(Z)-2-Penten-1-ol

Hexanal

(E)-2-Hexenal

Furfural

(Z)-3-Hexenol

(Z)-2-Hexenol

1-Hexanol

(2E, 4E)-Hexadienal


Benzenoacetaldeído

cis-óxido de linalol (furanóide)


Linalol

Álcool feniletilico

-óxido de linalol (piranóide)

-óxido de trans-linalol (piranóide)

Salicilato de metilaa-Terpineol

GeraniolAntranilato de metila

(E)-2-Decenal

Eugenol

-1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0

CP-1: 31,35%

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0C

P-2

: 22,

22%

(Z)-2-Penten-1-ol

Hexanal

(E)-2-Hexenal

Furfural

(Z)-3-Hexenol

(Z)-2-Hexenol

1-Hexanol

(2E, 4E)-Hexadienal


Benzenoacetaldeído

cis-óxido de linalol (furanóide)


Linalol

Álcool feniletilico


trans-óxido de trans-linalol (piranóide)

Salicilato de metilaa-Terpineol

GeraniolAntranilato de metila

(E)-2-Decenal

Eugenol

P á g i n a | 6 7

5. CONCLUSÕES

Os estudos realizados sobre os componentes voláteis das folhas de H. speciosa

nos permitiram observar mudanças na composição química e nas percentagens relativas

de alguns componentes. Com relação ao tempo de secagemverificou-se um aumento

significativo nas percentagens relativas de alguns monoterpenos oxigenados como α-

terpineol (0,08±0,20 - 3,89±1,78 nas folhas frescas e 0,93±0,03 - 5,21±0,65 nas folhas

secas), linalol (2,95±1,45 - 12,46±2,24 nas folhas frescas e 2,78±1,08 - 17,16±2,83 nas

folhas secas), geraniol (1,04±0,34 - 12,80±1,23 nas folhas frescas e 25,67±6,45-

46,56±4,67 nas folhas secas) nas folhas secas, assim como um decréscimo nas

percentagens de alcoóis como (Z)-3-hexenol (46,81±3,27 - 78,45±7,75 nas folhas

frescas e 10,70±4,87 - 19,15±4,28 nas folhas secas), 1-hexanol (1,65±0,33 - 10,15±0,80

nas folhas frescas e 0,07±0,05 - 4,59±1,55 nas folhas secas).

Os dados meteorológicos de índice de precipitação total, temperatura e teor de

água no solo (Figuras 36-37; p.60-61), nos permitiram analisar a variação no teor e nas

percentagens relativas dos componentes voláteis do óleo essencial da mangabeira, onde

observou-se que os teores de óleo essencial foram superiores na estação seca em relação

à estação chuvosa. Nos meses onde foram observadas temperaturas consideravelmente

elevadas houve uma maior percentagem do (Z)-3-hexenol nas folhas frescas.

A análise multivariada nos permitiu verificar a presença de 2 grupos distintos na

análise da composição química do óleo essencial das folhas de H. speciosa: G-I (folhas

frescas) e G-II (folhas secas), sendo caracterizados por seus constituintes majoritários

((Z)-3-hexenol e geraniol, respectivamente). A análise dos Componentes Principais

(ACP) nos permitiu observar a alta correlação dos compostos majoritários [(Z)-3-

hexenol (r = 0,84), geraniol (r = 0,64)] tantos das folhas frescas quanto das secas, com

seus respectivos componentes principais.

P á g i n a | 6 8

PARTE 2: ESTUDO FITOQUÍMICO DAS

FOLHAS E DOS RAMOS DE Hancornia

speciosa GOMES

P á g i n a | 6 9

PARTE 2: ESTUDO FITOQUÍMICO DAS FOLHAS E DOS RAMOS

DE Hancornia speciosa GOMES


O uso de espécies vegetais para tratamento e cura de doenças remonta ao início da

civilização, desde que o homem aprendeu a manusear e modificar os produtos naturais

para o próprio benefício. Esta prática milenar ultrapassou todas as barreiras e obstáculos

durante o processo evolutivo e chegou até os dias atuais, sendo amplamente utilizada

por grande parte da população mundial, como fonte eficaz de recurso terapêutico.

As espécies vegetais têm contribuído de forma significativa para o fornecimento

de metabólitos secundários, muitos destes de grande valor agregado devido às suas

aplicações como medicamentos, cosméticos, alimentos e agroquímicos. Vários desses

metabólitos constituem-se em modelos para o desenvolvimento de medicamentos

sintéticos modernos ou de fármacos imprescindíveis. A busca de novas substâncias

bioativas em plantas é a esperança mais concreta para a cura de diversos males e um dos

caminhos mais promissores para a criação de novos medicamentos [PINTO et al.,

2002].

É característica dos vegetais a elevada capacidade biossintética desses

metabólitos secundários, tanto em relação ao número como a diversidade em uma

mesma espécie. Assim por serem fatores de interação entre organismos, os metabólitos

secundários, frequentemente, apresentam atividades biológicas interesantes. Pelo

elevado número e grande diversidade desses metabólitos eles têm despertado interesse

de pesquisadores de vários campos da ciência que vêem neles uma promissora fonte de

novas moléculas potencialmente úteis aos homens [MACHADO, 2007].

Em geral, alguns órgãos de plantas, principalmente as folhas, são recobertos

externamente por uma camada fina de cera, que desempenha grande importância

biológica nas relações entre planta e meio ambiente em que esteja inserida. Por

P á g i n a | 7 0

definição, ceras cuticulares são substâncias hidrofóbicas da superfície das plantas, que

podem ser removidas por uma breve imersão em solvente orgânico, como clorofórmio e

hexano. Elas são misturas complexas de compostos de cadeias longas (>C18), tais como

ácidos graxos, hidrocarbonetos, álcoois, aldeídos, cetonas, ésteres e compotos fenólicos

[SILVA, 2007].

1.1. Triterpenos

Os triterpenos (C30) apresentam diversas propriedades medicinais, destacando-se

os efeitos antiinflamatórios, analgésicos, cardiovasculares e antitumorais e são baseados

em seis unidades de isopreno e biossinteticamente são derivados de esqualeno [CSEKE

et al., 2006], um composto que foi isolado pela primeira vez do fígado de tubarão, e

posteriormente encontrado também no fígado de ratos, em fungos e óleos de sementes

de Amarantáceas. A cadeia de 30 carbonos do esqualeno é formada a partir da

condensação de duas unidades de pirofosfato de farnesila (FPP) e envolve a enzima

esqualeno-sintase. A condensação requer a remoção de dois grupos fosfato e a adição de

um hidreto proveniente de NADPH na posição C-1. Um intermediário desse processo é

o pirofosfato de pré-esqualeno, isolado do fígado de rato cuja formação é representada

como um ataque da ligação dupla (C2’-C3’) de uma molécula de FPP e posterior

formação de um cátion terciário, seguida da perda de um hidrogênio e formação do anel

do ciclopropano, originando o pirofosfato de pré-esqualeno. O cátion ciclobutano é um

intermediário formado a partir da perda de um difosfato de pré-esqualeno gerando assim

um cátion primário desfavorável, que via rearranjo de Wagner-Meerwin causa a

expansão do anel e gera um carbocátion secundário. Por fim, a ligação entre C-1 e C-3’

é rompida e um hidrogênio vindo do NADPH é adicionado em C-1 finalizando-se

assim, a formação do esqualeno (Figura 43; p.72). A formação de sistemas de anéis

triterpênicos cíclicos a partir do esqualeno inicia-se com a oxidação do composto

isoprenóide a esqualeno-2,3-epóxido. O anel epóxido é rompido pela ação de prótons

formando o grupo hidroxila no carbono 3 e uma carga positiva no carbono 2. O 3-

hidroxi-esqualeno formado cicliza-se espontaneamente. O número e a conformação dos

anéis formados dependem das dobras da cadeia do esqualeno. O cátion esteróide sofre

P á g i n a | 7 1

rearranjo de Wagner-Meerwein alargando o anel. Depois fecha-se um anel adicional

seguido de rearranjamento de Wagner-Meerwein, em que novamente ocorre

alargamento construindo o anel. Esta estrutura, cátion lupenil, é o material de partida

para a síntese dos triterpenos pentacíclicos das séries lupano, friedelano, oleano e ursano

por eliminação de prótons. A ciclização do esqueleno também origina o triterpeno

lanosterol, que leva a formação dos esteróides (C27), ou seja, os triterpenos modificados

contendo o anel tetracíclico do sistema lanosterol após a perda a perda dos grupos

metila das posições C-4 e C-14 [DEWIK, 2009; CABRAL, 2000].

P á g i n a | 7 2

PPO

1'

2'

3'

1

FPP

Cátion alílico

FPP

H HOPP

E1

H OPP

H

H

H

N ADPH

HH

Pirofosfato de pré-esqualeno

Esqualeno

1' 2'

31

- H

Figura 43: Representação esquemática da biossíntese de triterpenos. E1=Esqualeno-

sintase. NADPH=Nicotinamida adenina dinucleotídeo-P [DEWIK, 2009; CABRAL,

2000].

P á g i n a | 7 3

CONTINUAÇÃO DA FIGURA 43.

HH

HO

HO

H

H

H

H

HO

H

H

H

HO

H

H

H

HO

H

H

H

HO

H

H

H

Cátion Lupenil

Lanosterol

Cátion esteróide

O2

NADPH

A betulina, o ácido betulínico e o lupeol (Figura 44; p.75), são exemplos de

triterpenos pertencentes à classe dos lupanos. A betulina é o triterpeno mais abundante

na natureza, também é o precursor na biossíntese do ácido betulínico, o composto

biologicamente mais ativo deste grupo. Estes compostos têm apresentado várias

P á g i n a | 7 4

atividades biológicas, entre as quais, vale destacar, a atividade antiinflamatória

[CABRAL, 2000].

Em trabalhos de GEETHAT & VARALAKSHMI (2001), o lupeol e o seu éster,

linoleato de lupeloíla, são citados como sendo os responsáveis pelas atividades:

antiinflamatória, antinoceptiva, antipirética e anti-ulcerogênica. No trabalho em questão

tais compostos foram comparados com o fármaco indometacina (um medicamento

antiinflamatório não esteróide usado no tratamento contra artrite), como controle,

mostrando que os mesmos possuem efeito similar ao que é produzido por esta droga.

Em estudos realizados por SAMPAIO (2008) foi observado o isolamento de uma

mistura de triterpenos contendo lupeol, α-amirina e β-amirina e ésteres 3-β-O-acil

lupeol. Já nos estudos feitos por MACHADO (2007) pôde-se observar o isolamento do

lupeol a partir do extrato etanólico das folhas frescas de Euphorbia tirucalli L., onde

pôde ser identificado pelo seu espectro de massas. O espectro mostrou um pico em m/z

426, que corresponde ao pico do íon molecular. Foram observados outros picos que são

típicos de triterpenos pentacíclicos, principalmente os de maiores intensidades como m/z

218, m/z 207, m/z 203 e m/z 189 (Figura 45; 76)

P á g i n a | 7 5

OH

HO

H

H

HH

COOH

HO H

H

HH

HO

H

H

HH

Betulina Ácido betulínico

Lupeol

Figura 44: Estruturas químicas da betulina, ácido betunílico e lupeol.

P á g i n a | 7 6

HO

H

H

HH

HO

- H2O- CH3

RDA RDA

m/z 426

m/z 207 m/z 218

m/z 189 m/z 203

Figura 45: Esquema de fragmentação do lupeol.

P á g i n a | 7 7

2. OBJETIVOS

Nesta parte do trabalho objetivamos isolar e identificar os metabólitos

secundários presentes no extrato metanólico das folhas e no extrato hexânico dos ramos

de H. speciosa.

P á g i n a | 7 8

3. METODOLOGIA

3.1. ISOLAMENTO DOS METABÓLIOS SECUNDÁRIOS DAS FOLH AS E DOS

RAMOS DE H. SPECIOSA

3.1.1. Equipamentos

(a) INFRAVERMELHO

Os espectros de absorção na região do Infravermelho foram registrados em um

espectrofotômetro Biorad, modelo FTS-3500 GX com transformada de Fourier

utilizando-se pastilhas comprimidas de brometo de potássio anidro (KBr), pertencente

ao Departamento de Química, Setor de Ciências Exatas, Universidade Federal do

Paraná (DQ-UFPR).

(b) RMN 1H e 13C

Os espectros de RMN 1H e 13C (totalmente desaclopado) unidimensionais das

frações HSF1 e HSF7 foram obtidos em um espectrômetro Brucker, modelo DRX400

de 9,4 Tesla (T), observando 1H a 400 MHz e 13C a 100 MHz, pertencente ao

Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos (DQ/UFSCar). Os

experimentos foram realizados a temperatura ambiente, sendo as amostras solubilizadas

em clorofórmio (CDCl3) deuterado, utilizando como referência interna o

tetrametilsilano (TMS). Os deslocamentos químicos (δ) são indicados em ppm e as

constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz).

Os espectros de ressonância magnética nuclear 1D para a subfração FV1 foram

registrados em um aparelho Brucker Avance 400, operando a 9,4 Tesla (T), observando 1H a 400MHz e 13C a 100 MHz, pertencente ao Departamento de Química da

P á g i n a | 7 9

Univesidade Federal do Paraná (DQ/UFPR). A amostra foi solubilizada em clorofórmio

deuterado (CDCl3), utilizando o tetrametilsilano (TMS) como padrão de referência

interna. Os deslocamentos químicos foram expressos em ppm (δ) e as constantes de

acoplamento (J) foram registradas em Hertz (Hz).

(c) PONTO DE FUSÃO

Os valores das faixas de fusão,foram determinados em um aparelho digital da

Microquímica (Modelo MQAPF-301), pertencente ao Departamento de Química da

Universidade Federal de Sergipe (DQI/UFS). Os valores obtidos em graus centígrados

não foram corrigidos.

3.1.2. Obtenção dos extratos das folhas e dos ramos

Do extrato metanólico das folhas (EMF) (5,08 g) e extrato metanólico dos ramos

(EMR) (2,34 g) de H. speciosa, previamente preparado por SAMPAIO (2008)

(Fluxograma 3; p.80), foram obtidos oito extratos a partir da extração líquido-líquido

com solventes de polaridades distintas (Tabela 3; p.81) utilizando a metodologia

modificada de SAMPAIO (2008) (Fluxograma 4; p.81).

P á g i n a | 8 0

Fluxograma 3: Metodologia utilizada por SAMPAIO (2008) para obtenção dos extratos

metanólico e hexânico das folhas e dos ramos de H. speciosa.

Extrato hexânico das folhas (EHF; 13,1 g) e extrato hexânico dos ramos (EHR; 6,5 g)

Posteriormente foram imersos separadamente em metanol (1,0 L)

Folhas (301,9 g) e ramos (235,4 g) de H. speciosa secas em estufa à 40°C (48 h)

As folhas e os ramos foram triturados e imersos separadamente em hexano (1,0 L)

Extrato metanólico das folhas (EMF; 34,3 g) e extrato metanólico dos ramos (EMR; 28,6 g)

P á g i n a | 8 1

1-MeOH/Água(8:2)

2-(3x100 mL) Hexano

1-40% do volume de H2O

2-(3x100 mL) CH2Cl2

1-Evaporador Rotatório

2-(3x100 mL) AcOEt

1-(3x100mL) n-butanol

Fluxograma 4: Procedimento utilizado na obtenção dos extratos particionados das folhas e ramos de H. speciosa.

Tabela 3: Massas obtidas das partições dos respectivos extratos.

Solvente EMR EMF

Hexano 81,3 mg 388,0 mg

Diclorometano 355,7 mg 258,5 mg

Acetato de Etila 330,8 mg 179,9 mg

Butanol 1028,6 mg 274,7 mg

EMF(5,08 g) e EHR (2,34 g)

Extrato Diclometano

Extrato Hidroalcóolico

Extrato Hidroalcóolico Extrato Hexânico

Extrato Acetato de etila

Extrato Hidroalcoólico Extrato Butanólico

Extrato Hidroalcóolico

P á g i n a | 8 2

3.1.3. Isolamento dos constituintes químicos das folhas e dos ramos

(a) Extrato metanólico das folhas (EMF) – Partição hexânica

A partição hexânica do EMF (388 mg) foi submetida a uma coluna

cromatográfica (CC) em sílica-gel (6,98 g), à pressão ambiente. A eluição da coluna

iniciou-se com 100 % de hexano, aumentando-se a polaridade do eluente pela adição de

proporções crescentes de acetato de etila e finalizando com metanol (Tabela 5; p.83).

Foram coletadas 79 frações (5 mL cada), posteriormente reunidas em 9 grupos (Tabela

4; p.82), com base nos seus respectivos valores de RFs (fatores de retenção), quando

analisadas por CCDA (Cromatografia em Camada Delgada Analítica) empregando-se

cromatofolhas de alumínio (20x20 cm) recobertas com sílica gel com indicador de

flurorescência em UV254 e 366 nm, da marca Macherey-Nagel. A revelação das substâncias

presentes nas placas cromatográficas foi feita por irradiação em lâmpada de UV254 e 366

nm, onde as placas foram mergulhadas a uma solução de p-anisaldeído (álcool etítilo

absoluto, ácido sulfúrico, p-anisaldeído e ácido acético na proporção de 90:5:5:1) e

subsequente aquecimento com uma pistola aquecedora (Fluxograma 5; p.84).

Tabela 4: Frações reunidas da partição hexânica do EMF.

Código Frações Massa (mg) Característica morfológica

FH1 1 – 16 5,3 Sólido branco amorfo




FH5 37 – 43 19,2 Sólido branco cristalino


FH7 47 - 48 5,0 Óleo verde



P á g i n a | 8 3

Tabela 5: Valores percentuais do gradiente utilizado na eluição da coluna.

Frações Reunidas Gradiente

1-11 100% hexano

12-22 1%

23-33 2%

34-44 5%

45-55 10%

56-66 20%

67-77 50%

A fração 37-43 (FH5; 19,2 mg) foi purificada em uma coluna de sílica gel,

obtendo-se a subfração FV1 (sólido branco cristalino; 15,1 mg). A subfração FV1 (p.f.:

155,6-158,3 °C; sólido branco cristalino; 15,1 mg) obtida da partição hexânica do EMF

foi analisada por IV e RMN de 1H e 13C.

P á g i n a | 8 4

Partição Líquido-líquido

Fluxograma 5: Processo de purificação da subfração FV1 da partição hexânica do

EMF de H. speciosa.

Extrato metanólico das folhas de H. speciosa (5,08 g)

Partição hexânica (388,0 mg)

CC em sílica gel (9 frações reunidas)

A fração 37-43 (FH5; 19,2 mg) foi purificada em uma coluna de sílica gel, obtendo-se a subfração FV1

(sólido branco cristalino; 15,1 mg)

A subfração FV1 foi enviada para análise em IV, RMN 13C e 1H

P á g i n a | 8 5

(b) Extrato Hexânico dos Ramos (EHR)

Parte do extrato hexânico dos ramos de H. speciosa (2,50 g) foi purificada

utilizando-se cromatografia em coluna empacotada com sílica gel (110 g), sob as

mesmas condições realizadas no procedimento anterior. A eluição da coluna iniciou-se

com 100% de hexano, aumentando-se a polaridade do eluente pela adição de proporções

crescentes de acetato de etila e finalizando-se com metanol (Tabela 7; p.86;

Fluxograma 6; p.87). Foram coletadas 350 frações (5 mL cada), posteriormente

reunidas em 13 grupos (Tabela 6; p.85), com base nos respectivos valores de RFs,

quando analisadas por CCDA. As frações 1-137 (HSF1; 21,1 mg; p.f.: 54,8-56,2 °C) e

199-215 (HSF7; 157,2; p.f.: 49,1-51,7 °C) obtidas do EHR foram analisadas por IV e

RMN de 1H e 13C.

Tabela 6: Frações reunidas da partição hexânica do EMF.

Código Frações Massa (mg) Característica morfológica

HSF1 1 – 137 21,1 Cera esbranquiçada

HSF2 138 – 166 54,5 Sólido branco amorfo



HSF5 183 – 190 31,9 Sólido branco cristalino


HSF7 199 – 215 157,2 Sólido branco cristalino

HFS8 216 – 221 8,7 Sólido branco amorfo




HSF12 278 – 296 63,8 Óleo verde

HSF13 297 – 350 67,8 Óleo verde

P á g i n a | 8 6

Tabela 7: Valores percentuais do gradiente utilizado na eluição da coluna.

Frações Reunidas Gradiente

1-30 100% hexano

31-60 1%

61-96 2%

97-114 3%

115-156 4%

157-178 5%

178-198 10%

199-237 15%

238-277 20%

278-296 30%

297-332 40%

333-350 50%

P á g i n a | 8 7

Fluxograma 6: Processo de purificação das frações HSF1 e HSF7 do EHR de H.

speciosa.

3.1.4. Identificação por CG/EM da mistura de hidrocarbonetos presentes

na fração HSF1

Os hidrocarbonetos foram identificados através de CG/EM empregando-se um

cromatográfo Shimadzu-QP5050A equipado com coluna capilar de sílica fundida DB-5

(30 m x 0,25 mm x 0,25 µm). A temperatura da coluna foi programada de 260ºC (2

min) aumentando para 320°C a 10°C/min, permanecendo estável nessa temperatura por

7 minutos. As temperaturas do injetor e detector foram 250ºC e 280ºC, respectivamente.

O gás de arraste foi o Hélio (1,2 mL/min). O volume de injeção foi de 0,5 µL. O

espectrômetro de massas operou com velocidade de 0,50 scan.seg-1 na faixa de m/z 40-

600.

Extrato hexânico dos ramos de H. speciosa (2,50 g)

CC em sílica gel (13 frações reunidas)

As frações 1-137 (HSF1; 21,1 mg) e 199-215 (HSF7; 157,2 mg) foram enviadas para análise em IV, RMN

13C e 1H

P á g i n a | 8 8

A identificação dos compostos foi feita com base na comparação


banco de dados de espectro de massas do sistema CG/EM (NIST107, NIST21 e

WILEY8) e com outros espectros de massas da literatura [ADAMS, 2007].

3.1.5. Reação de transterificação e identificação por CG/EM dos ésteres 3-

β-O-acil lupeol (HSF7)

Parte da mistura contendo os ésteres 3-β-O-acil lupeol (50,0 mg) foi aquecida à

60 °C sob agitação em 10% HCl/MeOH (3mL) por 8h. Após resfriamento, a solução foi

extraída com CH2Cl2 (3x10 mL). A fase orgânica foi lavada inicialmente com solução

NaHCO3 10% e depois com H2O, seca com Na2SO4 anidro e concentrada em

evaporador rotatório fornecendo lupeol e uma mistura de ésteres metílicos os quais

foram analisados por CG/EM (Figura 46; p.88).

O

H

H

HH

OR1

n

R1= H; OH

n

+

HCl/MeOH

60°C

OMe

OR1

HO

H

H

HH

Figura 46: Reação de metanólise ácida dos ésteres 3-β-O acil lupeol (HSF7).

P á g i n a | 8 9

Os ésteres 3-β-O-acil lupeol foram identificados através de CG-EM empregando-

se um cromatográfo Shimadzu-QP5050A equipado com coluna capilar de sílica fundida

DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm). A temperatura da coluna foi programada de 80 ºC

(2 min) aumentando para 270 °C a 15 °C/min, permanecendo por 15 min. As

temperaturas do injetor e detector foram 250 ºC e 280 ºC, respectivamente. O gás de

arraste foi o Hélio (1,2 mL/min). O volume de injeção foi de 0,5 µL. O espectrômetro

de massas operou com velocidade de 0,50 scan.seg-1 na faixa de m/z 40-550.

A identificação dos compostos foi feita com base na comparação


banco de dados de espectro de massas do sistema CG-EM (NIST107, NIST21 e

WILEY8) e com outros espectros de massas da literatura [ROUT et al., 2005; TAKACS

et al., 2001; ZHAO et al., 2006].

P á g i n a | 9 0


4.1. SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DE HANCORNIA SPECIOSA GOMES

4.1.1. Elucidação estrutural da fração FV1

A fração FV1 foi obtida a partir do fracionamento por cromatografia em coluna

da partição hexânica do EMF de H. speciosa e apresentou-se como um sólido branco

cristalino (15,1 mg), solúvel em clorofórmio e acetato de etila.

Pela análise do espectro de absorção na região do infravermelho (IV) (Figura 47;

p.93), observaram-se as bandas referentes ao estiramento da ligação O-H emν3375 cm-

1; ao estiramento da ligação C-H de grupos metílicos e metilênicos na região de

absorção entre ν2944 cm-1 eν2853 cm-1.

Pela análise do espectro de RMN 1H (Figuras 48-51; p.94-97; Tabela 8; p.91)

observou-se a presença de seis singletos referentes às metilas de esqueleto lupânico em

δ 0,78; 0,83; 0,97; 1,03; 0,95; 0,80 ppm, correspondentes às metilas angulares em C-23,

C-24, C-25, C-26, C-27, C-28, respectivamente, e um singleto em δ 1,68 ppm

correspondendo à metila vinílica em C-30 (Figura 48; p.94). A presença de um

multipleto em δ 3,24-3,17 ppm, refere-se ao hidrogênio carbinólico em C-3 (Figura 49;

p.95). A presença de um triplo dubleto em δ 2,38 ppm refere-se ao hidrogênio do C-19

(Figura 50; p.96). Os hidrogênios da posição C-29 (dupla terminal) foram evidenciados

pela presença de um duplo dubleto em δ 4,57 ppm (1H, J= 2,3 e 1,3 Hz) referente ao H-

29a, e um dubleto em δ 4,69 ppm (1H, J= 1,2 Hz) referente ao H-29b (Figura 51;

p.97). Foram observados 2 tripletos de hidrogênios vinílicos centrados em δ 5,18 ppm

(1H, J= 3,6 Hz) e δ 5,12 ppm (1H, J= 3,5 Hz), atribuídos a hidrogênios ligados a

carbonos olefínicos de esqueleto ursano e oleano, respectivamente.

P á g i n a | 9 1

Em relação ao espectro de RMN 13C totalmente desacoplado (Figuras 52-54;

p.98-100; Tabela 8; p.91), foram observados característicos para estes triterpenos em: δ

145,1 ppm e δ 121,7 ppm para oleanos; em δ 139,6 ppm e δ 124,4 ppm para ursanos.

Além disso, foram observados sinais em δ 19,3 ppm relativo ao grupo metila ligado a

carbono sp2 de esqueleto lupânico. Sinais em δ 79,0; 47,7; 151,0; 109,3 ppm referentes

aos carbonos C-3, C-19, C-20 e C-29 respectivamente, comprovando com mais precisão

a presença de um triterpeno.


MHz) das substâncias isoladas da fração FV1 com os dados obtidos na literatura [De

SOUZA et al., 2001; SAMPAIO, 2008].

Carbono 13C(ppm) 1H (ppm) 13C(ppm)Lit 1H (ppm)Lit

1 38,7 38,7 --

2 27,4 27,4 --

3 79,0 (sinal lupânico) 3,24-3,17 78,9 3,25-3,18

4 38,8 38,8 --

5 55,3 55,3 --

6 18,3 18,3 --

7 34,3 34,2 --

8 40,7 40,8 --

9 50,5 50,4 --

10 37,2 37,1 --

11 20,9 20,9 --

12 124,4 5,12 124,4 5,13

13 139,6 139,5 --

14 42,9 43,0 --

15 27,4 27,4 --

16 35,6 35,5 --

17 42,9 42,9 --

18 48,3 48,2 --

19 47,7 (sinal lupânico) 2,38 47,9 2,38

20 151,0 (sinal lupânico) 150,9 --

P á g i n a | 9 2

21 29,8 29,8 --

22 39,6 40,0 --

23 28,0 0,78 28,0 0,77

24 15,4 0,83 15,4 0,84

25 16,2 0,97 16,1 0,97

26 15,7 1,03 15,9 1,02

27 14,6 0,95 14,5 0,95

28 18,0 0,80 18,0 0,80

29a 109,3 (sinal lupânico) 4,57 109,3 4,57

29b 109,3 4,69 109,3 4,69

30 19,3 1,68 19,3 1,69

P á g i n a | 9 3

Figura 47: Espectro de absorção na região do infravermelho (IV) (pastilha de KBr) da fração FV1 isolada da partição hexânica do EMF de H. speciosa.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

60

70

80

90

100

110

120

130

110711

88

1013

880

1042

1380

1456

1600

1638

2360

2871

2853

2944

3375

Tra

nsm

itânc

ia (

%)

Número de onda (cm-1)

P á g i n a | 9 4

HO HO

HO

Figura 48: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da subfração FV1 isolada da partição hexânica do EMF de H. speciosa.

p p m ( f 1 )0 .01 .02 .03 . 04 . 05 .06 .07 .0

7.26

14

4.68

88

4.68

33

4.56

95

4.56

63

4.56

37

4.56

05

3.24

33

3.22

92

3.21

63

3.20

48

3.19

24

3.17

72

3.16

46

2.41

03

2.39

58

2.38

27

2.36

81

2.35

54

2.34

06

1.92

45

1.90

81

1.89

83

1.67

87

1.38

80

1.38

51

1.35

98

1.25

38

1.07

09

1.02

95

1.00

95

0.99

74

0.96

62

0.95

38

0.94

32

0.87

09

0.82

84

0.80

030.

7877

0.75

94-0

.000

5

0.99

0.99

1.74

1.19

4.85

48.07

49.82

P á g i n a | 9 5

Figura 49: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da subfração FV1 isolada da partição hexânica do EMF de H. speciosa.

p p m ( f1 )3 .1 2 53 .1 5 03 .1 7 53 .2 0 03 .2 2 53 .2 5 0

3.2

433

3.2

292

3.2

163

3.2

048

3.1

924

3.1

772

3.1

646

1.74

P á g i n a | 9 6


p p m ( f1 )2 .3 2 52 .3 5 02 .3 7 52 .4 0 02 .4 2 5

2.41

03

2.39

58

2.38

27

2.36

81

2.35

54

2.34

06

1.19

P á g i n a | 9 7


p p m ( f 1 )4 . 5 2 54 . 5 5 04 . 5 7 54 . 6 0 04 . 6 2 54 . 6 5 04 . 6 7 54 . 7 0 04 . 7 2 5

4.68

88

4.68

33

4.56

95

4.56

63

4.56

37

4.56

05

0.99

0.99

P á g i n a | 9 8

H O H O

H O

Figura 52: Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da fração FV1 isolada do EHR de H. speciosa.

p p m ( t1 )02 55 07 51 0 01 2 51 5 01 7 52 0 0

151.

03

124.

44

109.

35

79.0

4

77.3

6

77.0

4

76.7

3

59.0

9

55.3

2

50.4

7

48.3

3

48.0

2

47.7

4

43.0

4

42.8

6

41.5

6

40.8

6

40.0

4

39.7

0

39.6

4

38.8

1

38.7

3

38.6

1

38.0

8

37.1

7

35.6

1

34.3

1

32.9

6

31.2

9

29.8

8

29.7

4

28.7

9

28.1

3

28.0

2

27.4

5

27.3

1

26.6

5

25.1

723

.40

21.4

420

.96

19.3

418

.35

18.0

417

.51

16.1

616

.01

15.6

615

.41

14.5

8

P á g i n a | 9 9

Figura 53: Ampliação do espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da fração FV1 isolada do EHR de H. speciosa. p p m ( t1 )

3 2 .53 5 .03 7 .54 0 .04 2 .5

43.0

4

42.8

6

41.5

6

40.8

6

40.0

4

39.7

0

39.6

4

38.8

1

38.7

3

38.6

1

38.0

8

37.1

7

35.6

1

34.7

6

34.3

1

33.3

8

32.9

6

P á g i n a | 1 0 0

Figura 54: Ampliação do espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da fração FV1 isolada do EHR de H. speciosa.

p pm ( t1 )22 .525 .027 .530 .0

31.2

9

29.8

8

29.7

4

28.7

9

28.1

3

28.0

2

27.4

5

27.3

1

26.6

5

25.1

7

23.4

0

21.4

4

20.9

6

P á g i n a | 1 0 1

Com base nas análises de infravermelho (Figura 47; p.93) e RMN 1H (Figuras

48-51; p.94-97) e 13C (Figuras 52-54; p.98-100), foi comprovada que a elucidação

estrutural da fração FV1 indica a presença de uma mistura de triterpenos pertencente à

classe dos oleanos, ursanos e lupanos (α-amirina, β-amirina e Lupeol) (Figura 55).

HO HO

HO

Figura 55: Estruturas de triterpenos identificados da partição hexânica do extrato

metanólico das folhas de H. speciosa.

α-amirina β-amirina

Lupeol

P á g i n a | 1 0 2

3.1.2. Elucidação estrutural da fração HSF7

A fração HSF7, obtida através do fracionamento por coluna cromatográfica do

EHR de H. speciosa, apresentou-se como um sólido branco amorfo (157,2 mg), solúvel

em clorofórmio e acetato de etila.

Pela análise do espetro de absorção na região do infravermelho (IV) (Figura 56;

p.105), foram observadas bandas referentes à: O-H ν3504 cm-1; -CH3ν 2920 cm-1; -CH2

ν 2850 cm-1; carbonila de éster em ν 1730 cm-1; C=C ν 1705 cm-1 e (CH2)nν 721 cm-1.

Na análise dos sinais no espectro de RMN 1H (Figuras 57-60; p.106-109

Tabela 9; p.103) foi evidenciada a presença de sete singletos referentes às metilas de

esqueleto do tipo lupânico em δ 0,85; 1,03; 0,84; 0,88; 0,94; 0,79 ppm, correspondentes

às metilas angulares em C-23, C-24, C-25, C-26, C-27, C-28, respectivamente, e uma

metila em δ 1,68 ppm correspondendo à metila vinílica em C-30 (Figura 58; p.107). A

presença de um multipleto em δ 2,52-2,36 ppm (Figura 59; p.108) referente ao

hidrogênio do C-19. A presença de um multipleto em δ 4,57-4,52 ppm (Figura 60;

p.109), indica a presença de diferentes grupos acila ligados ao átomo de carbono

carbinólico em C-3. Os hidrogênios da posição C-29 (dupla terminal) foram

evidenciados pela presença de um multipleto em δ 4,57-4,51 ppm referente ao H-29a, e

um dubleto em δ 4,69 ppm (1H, J= 2,0 Hz) referente ao H-29b (Figura 60; p.109).

Além destes sinais foi observado, um singleto largo em δ 1,25 ppm (Figura 57; p.106)

relativo aos hidrogênios metilênicos da porção acila ligada ao carbono carbinólico em

C-3.

Em relação ao espectro de RMN 13C totalmente desacoplado (Figura 61; p.110

Tabela 9; p.103), foi observado sinais característicos de esqueletos do tipo lupânico em

δ 81,4; 48,0; 150,9 e 109,3 ppm, referentes aos carbonos: C-3, C-19, C-20 e C-29

respectivamente. Além destes, valores em δ 172,9 ppm, referente ao carbono C-1’

(Figura 61; p.110), são característicos de uma carbonila do tipo éster. A presença de

P á g i n a | 1 0 3

ésteres hidroxilados na fração HSF7, pode ser evidenciada pelo sinal em δ 68,2 ppm

(Figura 61; p.110), relativo ao carbono C-3’, contendo um grupo hidroxila.

Tabela 9: Comparação dos dados de RMN 1H (CDCl3, 500 MHz) e 13C (CDCl3, 100 MHz) das substâncias isoladas da fração HSF2 com os dados obtidos na literatura [SAMPAIO, 2008]. Carbono 13C(ppm) 1H (ppm) 13C(ppm)Lit 1H (ppm)Lit

1 38,3 38,3 --

2 23,7 23,7 --

3 81,4 4,57-4,51 81,4 4,57-4,52

4 37,4 37,8 --

5 55,4 55,4 --

6 18,2 18,2 --

7 34,2 34,2 --

8 40,8 40,8 --

9 50,3 50,3 --

10 37,7 37,7 --

11 20,9 20,9 --

12 25,1 25,1 --

13 38,0 38,0 --

14 42,8 42,8 --

15 27,4 27,4 --

16 35,5 35,5 --

17 43,0 43,0 --

18 48,3 48,3 --

19 48,0 2,52-2,36 48,0 2,52-2,32

20 150,9 150,9 --

21 29,8 29,8 --

22 40,0 40,0 --

23 28,0 0,85 28,0 0,85

24 15,9 1,03 15,9 1,03

25 16,1 0,84 16,1 0,84

P á g i n a | 1 0 4

26 16,6 0,88 16,6 0,88

27 14,5 0,94 14,5 0,94

28 18,0 0,78 18,0 0,79

29 a 109,4 4,57-4,51 109,4 4,57-4,52

29 b 109,4 4,68 109,4 4,69

30 19,3 1,68 19,3 1,68

1` 172,9 172,9 --

2` 41,6 41,6 2,34-2,29

3` 68,2 1,25 68,2 1,25

4` 36,6 1,25 36,5 1,25

5` 25,5 1,25 25,5 1,25

6’ 29,7-29,4 1,25 29,7-29,4 1,25

7’ 29,7-29,4 1,25 29,7-29,4 1,25

8’-17’ 29,7-29,4 1,25 29,7-29,4 1,25

18’ 31,9 1,25 31,9 1,25

19’ 22,7 1,25 22,7 1,25

20’ 14,1 0,94 14,1 0,92

P á g i n a | 1 0 5

Figura 56: Espectro de absorção na região do infravermelho (IV) (pastilha de KBr) da fração HSF7.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

40

50

60

70

80

90

100

547

100711

1611

4611

8212

52

1705

1641 72

1

885

979

1381

1465

1730

2360

2850

2920

3504

3558

Tra

nsm

itânc

ia (

%)


P á g i n a | 1 0 6

O

OR1

HH

H

H

n

R1 = H; OH

Figura 57: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF7 isolada do EHR de H. speciosa.

p p m ( f 1 )0 . 01 . 73 . 35 . 06 . 78 . 31 0 . 0

7.26

03

4.68

89

4.68

33

4.57

27

4.56

95

4.56

71

4.56

38

4.55

53

4.53

24

4.51

49

3.98

81

2.90

92

2.90

17

2.52

44

2.51

64

2.48

39

2.47

59

2.4

242

2.40

97

2.40

21

2.38

35

2.36

66

2.36

16

1.92

43

1.91

93

1.91

19

1.89

95

1.89

14

1.68

35

1.65

81

1.65

09

1.59

15

1.39

58

1.28

21

1.25

48

1.03

330.

9439

0.88

000.

8555

0.84

050.

7882

1.00

2.22

1.25

1.03

1.282.31

2.10

73.19

37.79

P á g i n a | 1 0 7

Figura 58: Ampliação do espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF7 isolada do EHR de H. speciosa.

p p m ( f1 )0 .6 70 .8 31 .0 01 .1 71 .3 31 .5 01 .6 71 .8 3

1.91

93

1.91

19

1.89

95

1.89

14

1.86

51

1.68

35

1.65

81

1.65

09

1.59

15

1.39

58

1.28

21

1.25

48

1.03

33

0.94

39

0.88

00

0.85

55

0.84

05

0.78

82

2.10

73.19

37.79

P á g i n a | 1 0 8


p p m ( f1 )2 .3 02 .4 02 .5 02 .6 02 .7 02 .8 02 .9 0

2.90

92

2.90

17

2.52

44

2.51

64

2.48

39

2.47

59

2.42

42

2.40

97

2.40

21

2.38

35

2.36

66

2.36

16

1.03

1.28

2.31

P á g i n a | 1 0 9


p p m ( f1 )3 .9 04 .0 04 .1 04 .2 04 .3 04 .4 04 .5 04 .6 04 .7 0

4.68

89

4.68

33

4.57

27

4.56

95

4.56

71

4.56

38

4.55

53

4.53

24

4.51

49

3.9

881

1.00

2.22

1.25

P á g i n a | 1 1 0

Figura 61: Espectro de RMN 13C (CDCl3, 100 MHz) da fração HSF7 isolada do EHR de H. speciosa.

SpinWorks 2.5:

PPM 160.0 150.0 140.0 130.0 120.0 110.0 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0

172

.870

4

150

.932

8

109

.352

0

81

.448

5

77

.319

2

77

.001

6

76

.684

4

68

.215

5

55

.372

5

50

.325

4

48

.277

4

47

.992

5

42

.985

7

42

.827

5

41

.614

6

40

.839

7

39

.987

7

38

.346

9

38

.027

9

37

.797

1

37

.073

5

36

.564

0

35

.557

8

34

.180

9

31

.919

6

29

.822

6 29

.689

6 29

.558

4 29

.356

6

28

.016

0

27

.426

4

25

.460

6

25

.079

5

23

.750

2

22

.685

0

20

.941

4

19

.282

3

18

.191

6

17

.991

8

16

.583

8

16

.143

7

15

.965

2

14

.512

5

14

.113

2

-0

.0161

file: E:\Espectros janeiro2010\Valeria_HSF2\2\fid expt: <zgpg30>transmitter freq.: 100.643483 MHztime domain size: 32768 pointswidth: 23474.18 Hz = 233.240919 ppm = 0.716375 Hz/ptnumber of scans: 11711

freq. of 0 ppm: 100.632886 MHzprocessed size: 32768 complex pointsLB: 3.000 GB: 0.0000

O

OR1

HH

H

H

n

R1 = H; OH

P á g i n a | 1 1 1

Os grupos acila nos ésteres (Tabela 10; p.112) foram identificados através de

análise por CG/EM dos ésteres metílicos preparados pela reação de transesterificação do

produto natural. Os espectros de massas (Figura 64-72; p.113-117) dos 9 principais

picos observados no cromatograma (Figura 63; p.112) foram analisados a partir dos

íons característicos: m/z 74 e 87 e m/z 103 usados para caracterizar as porções acila. O

pico mais característico de ésteres alifáticos de cadeia linear (m/z 74) aparece devido ao

rearranjo de McLafferty (Figura 62; p.111), com quebra da ligação β em relação ao

grupo C=O. O pico m/z 87 corresponde ao íon [CH2CH2COOCH3]+. O pico m/z 103

indica a presença de hidroxila na cadeia, evidenciando a presença de ésteres

hidroxilados. O íon RC≡O+ é característico dos ésteres, e no caso de ésteres metílicos

ele é observado em M-31 [SILVERSTEINet al., 2007; PAVIA, et al., 2001]. Na

ausência do íon molecular para ésteres derivados de ácidos graxos contendo um grupo

hidroxila em C-3’ utilizou-se o íon [M-18] correspondente a perda de uma molécula de

água.

RO

RHO

R'

O

RO CH2

H

R'

O+

RO CH

H

R'

-RHC=CH2

m/z 74R'=HR=CH3

Figura 62: Rearranjo de McLafferty e ésteres metílicos.

P á g i n a | 1 1 2

Figura 63: Cromatograma de íons reconstituídos (m/z 74, m/z 103, m/z 426) (CG/EM) dos ésteres metílicos obtidos após hidrólise da mistura de ésteres 3-β-acil do lupeol. A numeração dos picos corresponde à tabela 05.

Tabela 10: Substâncias identificadas (ésteres metílicos) após a reação de transesterificação da fração HSF7 isolada do EMR de H. speciosa.

N° do

pico

Composto TR

(min)

IRCal IRLit m/z

1 Tetradecanoato de metila 7.292 1723 1723a 242

2 Hexadecanoato de metila 9.517 1925 1927b 270

3 3-hidroxihexadecanoato de

metila

11.108 2078 - 286

4 Octadecanoato de metila 11.600 2127 2128a 298

5 3-hidroxioctadecanoato de

metila

13.067 2281 - 314

6 3-hidroxiiocosonoato de

metila

14.883 2483 - 342

7 Docosanoato de metila 15.242 2529 2530c 354

8 3-hidroxidocosanoato de

metila

16.542 2689 - 370

9 Tetracosanoato de metila 16.858 2730 2731c 382 * TR=Tempo de retenção; IRcal= Índice de retenção calculado; IRlit= Índice de retenção da literatura; a[ROUT et al., 2005]; b[TAKACS et al., 2001]; c[ZHAO et al., 2006];

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.00.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

(x100,000)

1

2

4

5

6

7

3 8 9

P á g i n a | 1 1 3

m/z

Figura 64: Espectro de massas do tetradecanoato de metila (C15H30O2).

m/z

Figura 65: Espectro de massas do hexadecanoato de metila (C17H34O2).

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 2400

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

74

57

43

87

160 24219997 211136123

40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 2700

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

%

74

43 87

55

69 143270

199 227129101 185157 241171115 213 256

P á g i n a | 1 1 4

m/z

Figura 66: Espectro de massas do 3-hidroxihexadecanoato de metila (C17H34O3).

m/z

Figura 67: Espectro de massas do octadecanoato de metila (C19H38O2).

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

43

55

74 2076916487

111115 143 187 286

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

%

74

43

41

1436997 255129 199 298

111 213157 185 227 241 269166

P á g i n a | 1 1 5

m/z

Figura 68: Espectro de massas do 3-hidroxioctadecanoato de metila (C19H38O3).

m/z

Figura 69: Espectro de massas do 3-hidroxiiocosanoato de metila (C21H42O3)

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

43

41

103

7182 96

124 264152 199138 166 180 223213 296243 279

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

%

43

10355

71

83

292113 138 227178 251151 324193 342208

P á g i n a | 1 1 6

m/z

Figura 70: Espectro de massas do docosanoato de metila (C23H46O2).

m/z

Figura 71: Espectro de massas do 3-hidroxidocosanoato de metila (C23H46O3).

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110%

74

43 87

143354129

11049 157 221 323267177 192 251341

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

%

10343

55 7496

123 321166 194151 255 269218 315 368295

P á g i n a | 1 1 7

m/z

Figura 72: Espectro de massas do 3-hidroxidocosanoato de metila (C25H50O2).

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

43

74

57 382143

339119 15316592 199 291271 309241

P á g i n a | 1 1 8

Com base nos dados espectoscópicos (IV, RMN 1H e 13C) e na reação de

transesterificação com posterior análise CG/EM, obtidos na determinação estrutural dos

ésteres do triterpeno lupeol presentes na mistura, sugerimos as estruturas dos 9

compostos da fração HSF7 como sendo: 3-β-O-tetradecanoato de lupeoíla (1), 3-β-O-

hexadecanoato de lupeoíla (2), 3-β-O-3’-hidroxihexadecanoato de lupeoíla (3), 3-β-O-

octadecanoato de lupeoíla (4), 3-β-O-3’-hidroxioctadecanoato de lupeoíla (5), 3-β-O-

3’-hidroxiiocosonoato de lupeoíla (6), 3-β-O-docosanoato de lupeoíla (7), 3-β-O-3’-

hidroxidocosanoato de lupeoíla (8), 3-β-O-tetracosanoato de lupeoíla (9) (Figura 73;

p.118).

H

H

HH

OR

n

R=H(1) n=10(2) n=12(4) n=14(7) n=18(9) n=20

R =OH(3) n=12(5) n=14(6) n=16(8) n=18

Figura 73: Estruturas dos ésteres 3-β-O-acil lupeol isolados da fração HSF7 do extrato hexânico dos ramos de H. speciosa.

Estes resultados são semelhantes aos observados por SOBRINHO et al. (1991) e

CARVALHO et al. (2001), que identificaram vários triterpenos a partir da casca, do

látex e das raízes de Parahancornia, que é um gênero quimiotaxonomicamente mais

próximo de Hancornia, pertencendo à mesma ordem (Gentianales), à mesma família

P á g i n a | 1 1 9

(Apocynaceae), à mesma subfamília (Rauvolfioideae) e a mesma tribo (Willughbeieae).

Esses triterpenos identificados são semelhantes aos que foram isolados por SAMPAIO

et al. (2008), tais como: lupeol (1), ésteres 3-β-O-acil lupeol (3, 4, 4A, 5, 5A, 5B), β-

amirina (6), α-amirina (8), e seus derivados acetilados (2, 7, 9), β-sitosterol (10),

estigmasterol (11) e β-sitosterona (12) (Figura 74; p.119).

RORO

R2R1

HO

HO

O

1 R=H2 R=Ac3R=

O

n(n=20,22,24,26)

4R=

O OR1

(n=16,18,20,22)

R1 =H4A R1=Ac

5R=

O OR1 OR2

n

n

R1=R2=H (n=14,16)5A R1=R2=Ac5B R1, R2=CMe2

6 R=R1=H, R2=Me7 R=Ac, R1=H, R2=Me8 R=R2=H, R1=Me9 R=Ac, R1=Me, R2=H

10

1112

RO

Figura 74: Principais compostos isolados de Parahancornia amapa.

P á g i n a | 1 2 0

3.1.3. Elucidação Estrutural da fração HSF1

A fração HSF1 foi obtida através do fracionamento por cromatografia em coluna

do EHR de H. speciosa e apresentou-se como uma cera esbranquiçada (21,1 mg),

solúvel em hexano e clorofórmio.

No espectro de absorção na região do infravermelho (IV) da fração HSF1,

(Figura 75; p.121), destacaram-se as bandas de absorção em ν2918 cm-1 e ν 2848 cm-1,

característicos de estiramento da ligação C-H de grupos metílicos e metilênicos

(deformação axial). As bandas referentes à deformação angular simétrica da ligação C-

H para grupos metilênicos aparecem na região de absorção entre ν1474 cm-1 e ν1461

cm-1. Absorções em ν 731 cm-1 e ν 719 cm-1 correspondem à deformação angular

assimétrica de ligação C-H de grupamentos metilênicos, onde ocorre com maior

frequência em carbonos de cadeia linear de sete ou mais átomos de carbono.

Com a análise dos sinais no espectro de RMN 1H (Figura 76; p.122) pôde-se

observar a presença de um pico intenso em δ 1,25 ppm, referente a hidrogênios

metilênicos (Figura 77; p.123); e a representação do grupo metílico terminal em δ 0,89-

0,86 ppm (Figura 78; p.124);

P á g i n a | 1 2 1

Figura 75: Espectro de absorção na região do infravermelho (IV) (pastilha de KBr) da fração HSF1.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 50020

30

40

50

60

70

80

90

2957

731

1474

719

1461

2359

2848

2918

Tra

nsm

itânc

ia (

%)


P á g i n a | 1 2 2

Figura 76: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 400 MHz) da fração HSF1 isolada do EHR de H. speciosa.

p p m ( t 1 )0 . 01 . 73 .35 . 06 . 78 .31 0 .01 1 .7

7.25

81

1.54

43

1.25

55

0.89

67

0.88

03

0.86

28

0.00

00

P á g i n a | 1 2 3


p p m ( t1 )0 .8 31 .0 01 .1 71 . 3 31 . 5 01 . 6 7

1.5

443

1.2

555

0.8

967

0.8

803

0.8

628

P á g i n a | 1 2 4


p p m ( t 1 )0 . 8 31 . 0 01 . 1 71 . 3 31 . 5 01 . 6 7

1.54

43

1.25

55

0.89

67

0.88

03

0.86

28

P á g i n a | 1 2 5

Os espectros de massas (Figuras 80-91; p.127-132) dos 12 principais picos

observados no cromatograma (Figura 79; p.125) foram analisados a partir do íon

molecular de cada componente. O pico de íon molecular de um hidrocarboneto linear

saturado é sempre observado em compostos de cadeia longa, embora com baixa

intensidade. A sequência de fragmentação é caracterizada por aglomerados de picos

afastados uns dos outros por 14 unidades de massa (-CH2) [SILVERSTEIN et al.,

2007].

Figura 79: Cromatograma de íons totais da fração HSF1 isolada do extrato hexânico de H. speciosa.

3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

(x10,000,000)

TIC

12

3 4 5

6 7

8

9

10

11

12

P á g i n a | 1 2 6

Pôde-se identificar pelos espectros de massas os seguintes hidrocarbonetos

alifáticos (Tabela 11; p.126; Figura 92; p.133).

Tabela 11: Principais compostos identificados da fração HSF1 isolados do EMR de H.

speciosa.

N° do pico Nomenclatura Fórmula estrutural Massa molecular

1 Docosano C22H46 310

2 Tricosano C23H48 324

3 Tetracosano C24H50 338

4 Pentacosano C25H52 352

5 Hexacosano C26H54 366

6 Heptacosano C27H56 380

7 Octacosano C28H58 394

8 Nonacosano C29H60 408

9 Triacontano C30H62 422

10 Hentriacontano C31H64 436

11 Dotriacontano C32H66 450

12 Tritriacontano C33H68 464

P á g i n a | 1 2 7

m/z


extrato hexânico dos ramos de H. speciosa.

m/z



50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

57

4371

85

99113 127 141

155 310169 197183 217 253238 269

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

57

71

8541

99113 127 155141

325217170 201 253239 285267 302

P á g i n a | 1 2 8

m/z



m/z



50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

57

43

71

85

99113

141 155 183169 338225210 281253239 295 319

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

57

43

71

85

113

126 141 168 225197 352239 267253183 309 338296

P á g i n a | 1 2 9

m/z



m/z



50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

57

43

71

85

113127 141 169 183 197 211 281 366253 267239 309 324 342

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

%

57

43

71

99

113 127155 211169 183 225 268 380358282253 338311

P á g i n a | 1 3 0

m/z



m/z



50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

57

43

71

99 113127

169 207183155 253225 394309 356322281 337

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110%

57

43

71

11399141

155169 233 408195 337 357295250

P á g i n a | 1 3 1

m/z



m/z



50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

57

43

85

99

127141183 281225211 423169 310252 351337 380 401

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

%

57

43

85

99

127141 169183 225211 253 295309267 436379351 393337 417

P á g i n a | 1 3 2

m/z



m/z



25.0 50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

57

43 71

99

207141 281127 169 225 351249 393308 451415

50.0 75.0 100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.00

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%

57

43

85

113155 183 211 281253 295 323 379 464421

P á g i n a | 1 3 3

CH3

CH3CH3

CH3CH3CH3

CH3CH3

18

CH3

CH3CH3CH3 29 28

27

26 25 24

23 22 21

20 19

Docosano Tricosano Tetracosano

Pentacosano Hexacosano Heptacosano

Octacosano Nonacosano Triacontano

Hentriacontano Dotriacontano Tritriacontano

(1) (2) (3)

(4) (5) (6)

(7) (8) (9)

(10) (11) (12)

Figura 92: Estruturas das substâncias encontradas na fração HSF1 isolada do EHR.

P á g i n a | 1 3 4

4. CONCLUSÕES

A análise dos metabólitos secundários das folhas e dos ramos de H. speciosa nos

proporcionou a caracterização de 22 substâncias. A identificação de uma mistura de

triterpenos (α-amirina, β-amirina e lupeol), isolada da partição hexânica do EMF, se deu

através de técnicas espectroscópicas (IV, RMN 1H e 13C) e seus resultados foram

comparados com os da literatura [De SOUZA et al., 2001; SAMPAIO, 2008]. Com a

análise dos dados espectroscópicos dos ésteres 3-β-O acil lupeol isolados do EHR,

pôde-se observar um triterpeno possuindo uma cadeia lateral, que foi identificada

através de CG/EM, depois de submetido a uma reação de transesterificação. Esses

compostos foram identificados como sendo: 3-β-O-tetradecanoato de lupeoíla, 3-β-O-

hexadecanoato de lupeoíla, 3-β-O-3’-hidroxihexadecanoato de lupeoíla, 3-β-O-

octadecanoato de lupeoíla, 3-β-O-3’-hidroxioctadecanoato de lupeoíla, 3-β-O-3’-

hidroxiicosanoato de lupeoíla, 3-β-O-docosanoato de lupeoíla, 3-β-O-3’-

hidroxidocosanoato de lupeoíla, 3-β-O-tetracosanoato de lupeoíla. Além disso, uma

mistura de n-alcanos isolada do EHR sendo identificada por CG/EM como sendo:

docosano, tricosano, tetracosano, pentacosano, hexacosano, heptacosano, octacosano,

nonacosano, triacontano, hentriacontano, dotriacontano, tritriacontano.

P á g i n a | 1 3 5

PARTE 3: TESTES DE

ATIVIDADE BIOLÓGICA

P á g i n a | 1 3 6

PARTE 3: TESTES DE ATIVIDADE BIOLÓGICA


A atividade antioxidante é de grande utilidade na conservação de alimentos e

também em qualquer outro tipo de produto que contenha em sua composição um

substrato lipídico. A constatação desta atividade em óleos essenciais, além de ser

interessante do ponto de vista de conservação de produtos farmacêuticos ou

alimentícios, também pode representar uma possibilidade de uso na terapêutica. O

potencial antioxidante está relacionado com uma série de atividades farmacológicas,

uma vez que compostos com propriedades antioxidantes exercem um efeito protetor

frente a diferentes danos biológicos [YUNES, et al., 2009].

Sabe-se bem que radicais oxigenados, ou espécies reativas de oxigênio estão

envolvidas em várias doenças patológicas como câncer, problemas cardiovasculares,

artrite, inflamações e doenças do fígado [SILVA et al., 2005].

O estresse oxidativo dentro do organismo se dá quando a geração de radicais

livres é maior que a de substâncias antioxidantes. As consequências deste estresse são

peroxidação dos lipídios da membrana celular e a oxidação de proteínas. Os danos

causados pelas espécies reativas de oxigênio incluem mutação do DNA, oxidação

protéica e peroxidação de lipídios, contribuindo para o desenvolvimento de câncer,

diabetes, arterioclorose, inflamação e envelhecimento precoce [FINKEL &

HOLBROOK, 2000].

As substâncias antioxidantes atuam sobre as espécies reativas de oxigênio e

outros radicais livres, inibindo ou inativando seus efeitos. Estas podem agir bloqueando

a formação dos radicais livres ou interagindo com estes, inativando-os. Portanto, os

antioxidantes são definidos como qualquer substância capaz de doar elétrons para um

radical livre, inativando-o, tornando-o um composto quimicamente estável. Os métodos

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de avaliação desta atividade avaliam o efeito de diferentes concentrações de substâncias

antioxidantes em concentrações conhecidas de radicais livres ou comparam a ação de

diversos agentes oxidantes em sistemas celulares, usando sempre substâncias de

referência, tais como as vitaminas C e E, o BHT (Hidroxitolueno butilado) (Figura 93;

p.137), a quercitina, a rutina, entre outros. Um método que se destaca pela sua

simplicidade e capacidade de avaliar a atividade antioxidante de determinadas

substâncias, em condições de temperatura ambiente, usando um radical livre estável foi

desenvolvido por BLOIS (1958) e utiliza o radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazila)

e tem sido amplamente utilizado como um método químico para a investigação do

potencial antioxidante de produtos naturais, particularmente para extratos de plantas

medicinais.

O

CH3

HO

H3C

CH3

CH3

CH3CH3 CH3 CH3

OH

C(CH3)3(CH3)C

CH3

O

OH

O

HO OHH

H

OH

Vitamina E

BHT Vitamina C

Figura 93: Estruturas de substâncias sequestradoras de radicais livres.

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O DPPH é um radical livre estável que, na presença de um antioxidante doador de

hidrogênio, pode ser reduzido em meio alcoólico, formando difenil picrilhidrazina

(Figura 94; p.138). Esta redução pode ser verificada mediante espectrofotometria a 517

nm, pela diminuição da absorbância, com simultânea mudança de coloração violeta

escura original, para amarela clara. Ou seja, quanto mais DPPH for reduzido, menor a

coloração violácea, consequentemente maior a atividade antioxidante da solução testada

[CONTRERAS, 2007].

N

N

NO2O2N

NO2

N

NH

NO2O2N

NO2

+ RH

(máxima absorção em 517 nm) (Diminuição na absorção a 517 nm)

2,2-difenil-1-picrilhidrazila 2,2-difenil-1-picrilhidrazina

Figura 94: Reação de redução do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH).

Por ter se tornado um sinônimo de mortalidade e dor, o câncer é uma das doenças

que mais preocupa a população. Na maioria dos países desenvolvidos, se constitui na

segunda causa de morte da população, superado somente pelas doenças

cardiovasculares. Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS)

surgem a cada ano nove milhões de novos casos e cinco milhões de pessoas vão a óbito

em decorrência do câncer. No entanto esses índices estão subestimados pelas

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dificuldades de notificação e registro dessa patologia em muitos países

subdesenvolvidos [De CARVALHO, 2006; De ALMEIDA et al., 2005].

Pesquisas realizadas têm demonstrado que algumas plantas apresentam

substâncias com atividade anticâncer, podendo-se citar o taxol isolado da Taxus

brevifolia (Taxaceae) e a lasiodiplodina da Euphorbia splendus (Euphorbiaceae)

(Figura 95; p.140). Entre os medicamentos antitumorais de origem vegetal, destacam-

se os derivados e os correspondentes produtos naturais produzidos pelas espécies

Catharanthus roseus ou Vinca rosea (Apocynaceae), Camptotheca acumata

(Nyssaceae) e Podophyllum peltatum e P. Emodi (Berberidaceae) [BARREIRO, 1990;

BRAZ FILHO, 2010].

A Vinca rosea (Apocynaceae) é utilizada pela população de Madagascar no

tratamento do diabetes. Durante testes de atividade hipoglicemiante, os extratos dessa

espécie produzem granulocitopenia em consequência da supressão da medula óssea dos

animais, sugerindo avaliação em modelos de leucemias e linfomas. A confirmação da

atividade nesses modelos levou ao isolamento dos alcalóides vimblastina e vincristina

que, atualmente, são de grande utilidade no tratamento de leucemias, linfomas e câncer

testicular. Outra descoberta importante na área de câncer foi o paclitaxel (taxol), onde

estudos clínicos revelaram que essa substância era capaz de regredir o câncer de mama e

de ovário, resistentes à terapia tradicional. Como essa substância teria que ser extraída

de espécies que levam décadas para o seu crescimento, a introdução dessa droga na

terapêutica teve que esperar pelo desenvolvimento da síntese química e pela descoberta

de precursores obtidos de fontes renováveis [De CARVALHO, 2006].

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O

ONHO

OH O

O

O

OHO

OH

O

O

OMe

HO

O

O

Taxol Lasiodiplodina

Figura 95: Estruturas do taxol isolado da Taxus brevifolia (Taxaceae) e da lasiodiplodina isolada da Euphorbia splendus (Euphorbiaceae).

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2. OBJETIVOS

Nesta parte do trabalho objetivamos verificar o potencial antioxidante do óleo

essencial das folhas de H. speciosa, dos extratos das folhas e dos ramos e suas

respectivas partições; bem como realizar testes de citotoxicidade in vitro em 3 linhagens

de células tumorais com intuito de verificar o potencial antitumoral dos extratos desta

espécie.

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3. METODOLOGIA

3.1. Atividade Antioxidante

Para a análise da atividade antioxidante foram preparadas soluções metanólicas de

DPPH 22,5 µg/ml, onde foram misturadas com as substâncias testes (óleo essencial das

folhas frescas e secas, EMF, EMR, PDEMR, PDEMF, PAcEMR, PAcEMF, PBEMR, PBEMF)

em 4 concentrações diferentes (10; 5; 2,5 e 1,25 mg/mL para o óleo essencial e 1; 0,5;

0,250; 0,125 mg/mL para os extratos). Neste ensaio utilizou-se pirogalol (Figura 96;

p.142) (0,5% em MeOH) como substância referência com poder de sequestrar 100%

dos radicais. O experimento foi realizado em triplicata.

OH

OH

OH

Pirogalol

Figura 96: Estrutura química do pirogalol.

O espectrofotômetro foi monitorado com uma solução de MeOH e como branco

utilizou-se uma solução metanólica de DPPH. O BHT foi utilizado como substância de

referência da atividade sequestradora de radical livre e o declínio da concentração do

radical foi monitorado por espectrofotometria no visível em λ = 517 nm, após 30 min. A

Equação 1 foi utilizada para calcular a atividade antioxidante (%AA) das amostras, e

com os valores obtidos foi construído um gráfico de %AA X Concentração (mg/mL).

Para o cálculo do CI50 (capacidade de sequestrar 50% dos radicais livres) foi

utilizada a equação da reta, substituindo o valor de y por 50 para obtenção da

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concentração da amostra com capacidade de reduzir 50% do DPPH [De MIRANDA &

FRAGA, 2006].

% AA = 100 x ∆h Equação 1: Cálculo da capacidade sequestradora de radicais livres.

Onde:

∆h = h2 – h1

h2 = absorbância controle (DPPH + MeOH)

h1 = absorbância teste (DPPH + substância teste)

3.2.Citotoxicidade

O teste de citotoxidade in vitro dos extratos hexânico emetanólico das folhas e

dos ramos de H. speciosa foram realizados em colaboração com o Laboratório de

Oncologia Experimental da UFC (Universidade Federal do Ceará), através da parceria

com o Prof. Dr. Daniel Pereira Bezerra (DFS/UFS). Essa análise faz parte de um

screening inicial para determinação do potencial antitumoral destas amostras.

As linhagens tumorais utilizadas, MDA-MB435 (mama - humano) e SF-295

(glioblastoma - humano) e HCT-8 (colon) foram cedidas pelo Instituto Nacional do

Câncer (EUA), tendo sido cultivadas em meio RPMI 1640, suplementados com 10 % de

soro fetal bovino e 1% de antibióticos, mantidas em estufa a 37 ºC e atmosfera contendo

5% de CO2. As amostras foram diluídas em DMSO puro estéril. Os extratos foram

testados na concentração de 50 µg/mL. Para determinação da CI50, as amostras foram

testadas em concentrações crescentes em diluição seriada [PESSOA, 2000].

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As células foram plaqueadas na concentração de 0,1 x 106 células/mL para as

linhagens MDA/MB-435 e SF-295, e 0,7 x 105 cél/mL para a linhagem HCT-8. As

placas foram incubadas por 72 horas em estufa a 5% de CO2 a 37 °C. Ao término deste,

as mesmas foram centrifugadas e o sobrenadante removido. Em seguida, foram

adicionados 150 µL da solução de MTT (sal de tetrazolium), e as placas foram

incubadas por 3h. A absorbância foi lida após dissolução do precipitado com 150 µL de

DMSO puro em espectrofotômetro de placa a 595 nm [MOSMANN, 1983].

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A verificação da atividade antioxidante foi realizada mediante a medição da

absorbância a 517 nm do extrato ou óleo essencial com solução de DPPH (coloração

violeta intensa). À medida que o DPPH foi reduzido, observou-se a diminuição da

coloração violeta, que é consequência da captura da captura de radicais livres, e

formação de uma coloração amarelada. O radical livre absorve a 517 nm e um

decréscimo nesse comprimento de onda ocorre pela estabilização do radical através do

recebimento de um hidrogênio radicalar da espécie antioxidante, que é indicada pela

mudança de cor. Valores com concentrações maiores sequestram radicais livres com

maior eficiência [SANTOS, 2005].

A utilização de metanol para monitorar o espectofotômetro, pode ser justificada

através de estudos feitos por SHARMA & BHAT (2009), onde analisaram alguns

parâmetros utilizados em trabalhos de atividade antioxidante (branco, tempo de

incubação, concentração das amostras). Foi feita uma comparação com a absorbância do

etanol, do metanol, e uma solução tampão de metanol. Foi constatado que valores de

absorbância das amostras diluídas em metanol e metanol em solução tampão eram

maiores que os das amostras diluídas em etanol.

A Figura 97; p.146 mostra a curva que representa a cinética de consumo do

DPPH pelo óleo essencial das folhas frescas e secas de H. speciosa. Utilizando a

equação desta curva calculou-se o CI50. Para elaborar a curva, utilizaram-se os

resultados das três determinações para cada concentração, visando obter um modelo

estatístico mais confiável. Quanto menor o valor de CI50, maior é a atividade

antioxidante do extrato analisado. Os valores da capacidade sequestradora de radicais

livres (%AA) do óleo essencial das folhas frescas e secas de H. speciosa em diferentes

concentrações podem ser observados na Tabela 12; p.146.

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Tabela 12: Valores percentuais de atividade sequestradora de radicais livres do óleo

essencial das folhas frescas e secas de H. speciosa.

C (mg/mL) %AA OE Folhas secas %AA OE Folhas frescas

10 28,92 8,53

5 18,43 5,70

2,5 10,31 4,25

1,25 6,31 3,53

Figura 97: Capacidade de sequestro de DPPH do óleo essencial das folhas frescas e secas

de H. speciosa.

y = 2,5636x + 3,9773

R² = 0,9868

y = 0,5728x + 2,8155

R² = 0,9999

0

5

10

15

20

25

30

35

0 2 4 6 8 10

Folhas secas Folhas frescas Linear (Folhas secas) Linear (Folhas frescas)

(%)

AA

C (mg/mL)

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O CI50, ou seja, a concentração de óleo essencial necessária para reduzir 50% do

DPPH adicionado foi 17,95 mg/mL para as folhas secas e 82,37 mg/mL para as folhas

frescas.

Pôde-se observar na Figura 97; p.146 que as folhas secas (CI50 = 17,95 mg/mL)

apresentaram atividade de sequestro do DPPH expressivamente superior as folhas

frescas (CI50 = 82,37 mg/mL) que pode estar relacionada a presença do antranilato de

metila e de eugenol, que são compostos fenólicos, bons sequestradores de radicais

livres.

A Figura 98; p.148 ilustra o gráfico da capacidade sequestadora de radicais livres

do padrão de BHT, dos extratos e suas respectivas partições. Os valores de %AA das

respectivas amostras, analisadas em diferentes concentrações, podem ser observados na

Tabela 13; p.148. Pode-se observar a proximidade da partição butanólica do EMF em

relação ao padrão BHT e também os elevados valores de CI50 (Tabela 14; p.148) para

as partições de diclorometano.

A análise do potencial antioxidante dos extratos metanólico das folhas e dos

ramos e suas respectivas partições (diclorometano, acetato de etila e butanol) foi

realizada com os mesmos parâmetros utilizados na análise dos óleos essenciais.

Observou-se que as partições de diclorometano (PDEMF e PDEMR) de ambos os extratos

não apresentaram muita atividade em relação ao BHT.

A análise da partição butanólica do extrato metanólico das folhas (PBEMF) pode

ser destacada por apresentar uma maior capacidade antioxidante frente aos extratos e

partições analisadas, sendo um valor de CI50 próximo ao observado para o padrão BHT.

Foi observada uma grande diferença no valor de CI50 entre as partições acetato de etila

dos extratos metanólicos das folhas e dos ramos (PAcEMF e PAcEMR). A partição

butanólica do EMR (PBEMR) apresentou uma boa atividade antioxidante. O extrato

metanólico das folhas (EMF) apresentou uma maior capacidade de sequestrar radicais

livres do que o extrato metanólico dos ramos (EMR) que pode ser explicada pela

presença de um número maior de compostos fenólicos (sequestradores de radicais

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livres) presentes no EMF e que podem estar relacionados à boa atividade antioxidante

da sua partição butanólica.

Tabela 13: Valores percentuais de atividade sequestradora de radicais livres do BHT, dos extratos e suas respectivas partições.

C (mg/mL) BHT PDEMR PDEMF PAcEMR PAcEMF PBEMR PBEMF EMF EMR

1 73,1 5,8 8,2 50,3 11,1 40,3 65,5 30,1 25,4

0,5 50,7 3,6 4,8 27,2 5,4 22,5 35,3 17,1 12,2

0,25 31,1 2,4 2,5 15,1 3,4 12,2 20,7 9,3 7,8

0,125 16,7 1,9 1,7 7,6 2,4 4,9 11,0 5,0 3,9

Tabela 14: Valores de CI50 do BHT, dos extratos e suas partições.

Amostras CI50 (mg/mL)

BHT 0,58

EMF 1,52

EMR 2,03

PDEMF 6,58

PDEMR 10,77

PAcEMF 4,92

PAcEMR 0,98

PBEMF 0,74

PBEMR 1,23

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Figura 98: Capacidade de sequestro de DPPH dos extratos e partições de H. speciosa.

y = 62,06x + 13,807

R² = 0,9619

y = 4,5201x + 1,3119

R² = 0,9989

y = 7,4703x + 0,8315

R² = 0,9963

y = 48,19x + 2,5076

R² = 0,9984

y = 9,9757x + 0,9177

R² = 0,9918

y = 39,462x + 1,494

R² = 0,9931

y = 61,47x + 4,3287

R² = 0,9988

y = 28,402x + 2,0855

R² = 0,9965

y = 24,078x + 1,0651

R² = 0,9943

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

(%)

AA

C (mg/mL)

Sequestro do DPPHBHT

PDEMR

PDEMF

PAcEMR

PAcEMF

PBEMR

PBEMF

EMF

EMR

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A análise de citotoxicidade pelo método do MTT vem sendo utilizada no

programa de screening do National Cancer Institute dos Estados Unidos (NCI), que

testa mais de 10.000 amostras a cada ano [SKEHAN et al., 1990]. É um método rápido,

sensível e barato. Foi descrita primeiramente por MOSMAN (1983), tendo a capacidade

de analisar a viabilidade e o estado metabólico da célula. É uma análise colorimétrica

baseada na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de

tetrazolium (MTT) em azul de formazan, a partir de enzimas mitocondriais presentes

somente nas células metabolicamente ativas. O estudo citotóxico pelo método do MTT

permite definir facilmente a citotoxicidade, mas não o mecanismo de ação [BERRIDGE

et al., 1996].

Os valores da capacidade de inibição dos extratos hexânicos e metanólicos das

folhas e dos ramos de H. speciosa não revelaram citotoxicidade frente aos agentes

tumorais testados (Tabela 15; p.150). Segundo o Instituto Nacional do Câncerdos

EUA, o screening inicial para extratos brutos é realizado numa concentração de 50

µg/mL para selecionar os extratos que apresentam substancial efeito antiproliferativo,

com inibição de pelo menos 85% de proliferação da célula tumoral [MESQUITA et al.,

2009].

Dentre os extratos testados, o EHF destaca-se por ter obtido maiores valores

percentuais de inibição do crescimento celular (CI%) frente às linhagens tumorais

MDAMB-435 e SF-295 (19,59% e 29,67%, respectivamente). Já a analise de inibição

percentual frente ao agente tumoral HCT-8, o extrato metanólico das folhas obteve

maiores valores percentuais de inibição (25,61%).

Tabela 15: Valores percentuais de CI (capacidade inibitória) dos extratos de H. speciosa frente aos agentes tumorais.

Amostras MDAMB-435 (CI%) SF-295 (CI%) HCT-8 (CI%)

EHF 19,59% 29,67% 10,33%

EMR -3,47% 15,67% 18,58%

EHR 10,87% 23,67% 2,69%

EMF 17,43% 16,77% 25,61%

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Os resultados obtidos neste trabalho corroboram com os estudos feitos por

SANTOS (2005), onde o lupeol estava presente na partição hexânica do extrato

etanólico das folhas de Prunus myrtifolia L., e os valores de CI% da partição hexânica

num screening incial frente às celulas tumorais MDAMB-435, SF-295 e HCT-8 foram

muito abaixo de 85%.

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5. CONCLUSÕES

Os testes de atividade antioxidante nos permitiram verificar que o óleo essencial

das folhas secas de H. speciosa possui uma maior habilidade em sequestrar radicais

livres do que o óleo essencial das folhas frescas. Com relação aos extratos e partições

testadas, pôde-se verificar um potencial antioxidante elevado da partição butanólica do

extrato metanólico das folhas de H. speciosa, onde observou-se valores próximos ao

padrão BHT.

Os valores da capacidade de inibição dos extratos hexânicos e metanólicos das

folhas e dos ramos de H. speciosa não revelaram citotoxicidade frente aos agentes

tumorais testados, onde todas as amostras testadas apresentaram valores de capacidade

inibitória muito abaixo de 85%.

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CONSIDERAÇÕES

FINAIS

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CONSIDERAÇÕES FINAIS

O estudo dos componentes voláteis das folhas frescas e secas de H. speciosa

permitiu verificar mudanças na composição química e nas percentagens relativas de

alguns componentes tanto na secagem das folhas, quanto na variação da época de

colheita. Com relação ao tempo de secagemverificou-se um aumento significativo nas

percentagens relativas de alguns monoterpenos oxigenados como α-terpineol (0,08±0,20

- 3,89±1,78 nas folhas frescas e 0,93±0,03 - 5,21±0,65 nas folhas secas), linalol

(2,95±1,45 - 12,46±2,24 nas folhas frescas e 2,78±1,08 - 17,16±2,83 nas folhas secas),

geraniol (1,04±0,34 - 12,80±1,23 nas folhas frescas e 25,67±6,45- 46,56±4,67 nas

folhas secas) nas folhas secas, assim como um decréscimo nas percentagens de alcoóis

como (Z)-3-hexenol (46,81±3,27 - 78,45±7,75 nas folhas frescas e 10,70±4,87 -

19,15±4,28 nas folhas secas), 1-hexanol (1,65±0,33 - 10,15±0,80 nas folhas frescas e

0,07±0,05 - 4,59±1,55 nas folhas secas). Os dados meteorológicos (índice de

precipitação total, temperatura e teor de água no solo) nos permitiram verificar que

houve mudanças decorrentes no rendimento e nas percentagens relativas dos

componentes majoritários do óleo essencial da mangabeira.

O estudo fitoquímico de H. speciosa permitiu a identificação de 3 misturas, sendo

uma mistura de triterpenos contendo α-amirina, β-amirina e Lupeol da partição hexânica

do EMF e uma mistura de ésteres 3-β-O acil lupeol provenientes do EHR, os quais

foram identificados como sendo: 3-β-O-tetradecanoato de lupeoíla, 3-β-O-

hexadecanoato de lupeoíla, 3-β-O-3’-hidroxihexadecanoato de lupeoíla, 3-β-O-

octadecanoato de lupeoíla, 3-β-O-3’-hidroxioctadecanoato de lupeoíla, 3-β-O-3’

hidroxiicosanoato de lupeoíla, 3-β-O-docosanoato de lupeoíla, 3-β-O-3’

hidroxidocosanoato de lupeoíla, 3-β-O-tetracosanoato de lupeoíla. Além disso, uma

mistura de n-alcanos provenientes do EHR foi identificada por CG/EM como sendo:

docosano, tricosano, tetracosano, pentacosano, hexacosano, heptacosano, octacosano,

nonacosano, triacontano, hentriacontano, dotriacontano, tritriacontano.

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Nos testes de atividade biológica verificou-se que o óleo essencial das folhas

desta espécie não apresentou uma boa capacidade de sequestrar radicais livres, sendo

que o óleo essencial das folhas secas possui um CI50 maior do que o óleo das folhas

frescas. Com relação aos extratos e suas partições podemos notar que o EMF possui

uma maior atividade antioxidante que o EMR, e que a partição butanólica do EMF

possui boa atividade antioxidante, comparável ao padrão BHT que possui um potencial

antioxidante considerável. Os valores da capacidade de inibição dos extratos hexânicos

e metanólicos das folhas e dos ramos de H. speciosa não revelaram citotoxicidade frente

aos agentes tumorais testados, onde todas as amostras testadas apresentaram valores de

capacidade inibitória muito abaixo de 85%.

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REFERÊNCIAS

BIBLIOGRÁFICAS

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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