Estudos clínico-moleculares de três famílias Pernambucanas ... · Prof. Dr. Marcos Antônio de Moraes Júnior, Dpto. de Genética, CCB, UFPE Leal GF. Estudos clínico-moleculares

Leal GF. Estudos clínico-moleculares de três famílias pernambucanas com microcefalia primária. ________________________________________________________________________________

1

Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências Biológicas

Curso de Doutorado em Ciências Biológicas

ESTUDOS CLÍNICO-MOLECULARES DE TRÊS

FAMÍLIAS PERNAMBUCANAS COM MICROCEFALIA PRIMÁRIA

Recife Outubro 2003


2

Centro de Ciências Biológicas Curso de Doutorado em Ciências Biológicas

Universidade Federal de Pernambuco

ESTUDOS CLÍNICO-MOLECULARES DE TRÊS FAMÍLIAS PERNAMBUCANAS COM

MICROCEFALIA PRIMÁRIA

Tese apresentada por Gabriela Ferraz Leal ao Curso de Doutorado em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (área de concentração: Genética).

Orientador: Prof. Elias Oliveira da Silva (Depto. Genética, UFPE)

Recife Outubro 2003


3

Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências Biológicas

Curso de Doutorado em Ciências Biológicas

ESTUDOS CLÍNICO-MOLECULARES DE TRÊS FAMÍLIAS

PERNAMBUCANAS COM MICROCEFALIA PRIMÁRIA

Comissão Examinadora

Membros titulares:

___________________________________________________________________ Prof. Dr. Elias Oliveira da Silva, Depto. de Genética, CCB, UFPE ___________________________________________________________________ Profa. Dra. Gisélia Alves Pontes da Silva, Depto. Materno-Infantil, CCS, UFPE ___________________________________________________________________ Prof. Dr. João Guilherme Bezerra Alves, Instituto Materno-Infantil de Pernambuco ___________________________________________________________________ Prof. Dr. José Ferreira dos Santos, Depto. de Genética, CCB, UFPE ___________________________________________________________________ Prof. Dr. Marcelo Moraes Valença, Depto. de Neuropsiquiatria, CCS, UFPE

Membros suplentes:

___________________________________________________________________ Profa. Dra. Rosilda dos Santos Silva, Dpto. de Genética, CCB, UFPE ___________________________________________________________________ Prof. Dr. Marcos Antônio de Moraes Júnior, Dpto. de Genética, CCB, UFPE


4

Aos pacientes e suas famílias, que têm

me ensinado genética clínica e, muitas vezes,

muito mais do que isso.


5

.

AGRADECIMENTOS

Às famílias estudadas neste trabalho, pela confiança e colaboração de tão boa vontade; Ao Prof. Elias Oliveira da Silva, por mais esta orientação, prolongamento de uma relação orientador/orientanda iniciada desde a época da minha graduação, quando uma de suas aulas me emocionou profundamente e me despertou para a genética médica; Aos Drs. Christopher Geoffrey Woods e Emma Roberts, da Unidade de Medicina Molecular do Hospital St James (Universidade de Leeds - Inglaterra), por disponibilizar o seu laboratório para o nosso trabalho e pela orientação nos estudos moleculares; Às Dras. Emma Roberts e Jacquelyn Bond, e a Daniel Hampshire, pela ajuda na iniciação com as técnicas de biologia molecular e os programas de bioinformática; A Dra. Andréa de Rezende Duarte, colega do Serviço de Genética Médica do Instituto Materno-Infantil de Pernambuco (IMIP), pela convivência agradável e troca de experiências; A Ana Emília Barros e Silva, pela ajuda na extração de DNA; À CAPES, pela concessão da bolsa de estudos para realização dos trabalhos laboratoriais na Universidade de Leeds (Inglaterra); À Fundação de Saúde Amaury de Medeiros (FUSAM), ao Hospital de Pediatria Helena Moura e ao Instituto Materno-Infantil de Pernambuco (IMIP), pela licença de trabalho concedida; A Dra. Alzira Maria Paiva de Almeida e Dr. Osvaldo Pompílio de Melo Neto, do Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães, pela concessão do laboratório de Microbiologia para realização das extrações de DNA; A Marcelo, pela companhia em viagens para obtenção de dados, mas, sobretudo, pela companhia na vida de todos os dias, tornando-a mais colorida e feliz.


6

SUMÁRIO

Pág.

AGRADECIMENTOS

RESUMO

ABSTRACT

I. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 13

II. REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................ 16

II.1. Microcefalia ............................................................................................... 17

II.2. Etiologia da microcefalia ........................................................................ 19

II.2.1. Microcefalia de etiologia ambiental ............................................................ 19

II.2.2. Microcefalia de etiologia genética ............................................................ 21

II.3. Microcefalia primária autossômica recessiva ................................................. 22

II.4. Mapeamento por homozigose/autozigose ............................................... .. 24

II.5. Aspectos moleculares da microcefalia primária autossômica recessiva 25

III. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................. 29

IV. ARTIGO 1 − Primary Microcephaly: a Clinical Perspective .............. 36

Abstract ............................................................................................................. 38

Introduction ............................................................................................................. 39

Head circumference measurement .......................................................................... 40

The diagnosis of primary microcephaly .............................................................. 42

Differential diagnosis of primary microcephaly .................................................. 43

Autosomal dominant microcephaly .............................................................. 44

Chromosome anomalies .......................................................................... 45

Microcephaly with normal intelligence ................................................... 45

Post-nataly developing microcephaly ................................................... 46

Classification of microcephaly ........................................................................... 47

Clinical findings in primary microcephaly ............................................................... 48

Genetics of primary microcephaly ........................................................................... 51

Primate evolution and primary microcephaly ................................................... 53

Conclusions .............................................................................................................. 54


7

References .............................................................................................................. 55

Table 1 .......................................................................................................... .... 62

V. ARTIGO 2 − A Novel Locus for Autosomal Recessive Primary

Microcephaly Maps to 13q12.2. .......................................................................... 63

Abstract (key points) ................................................................................................. 65

Introduction ............................................................................................................. 65

Materials and methods ..................................................................................... 66

Subjects ................................................................................................. 66

Molecular genetics ..................................................................................... 66

Results ............................................................................................................ 67

Discussion ............................................................................................................. 68

Acknowledgements ................................................................................................. 69

Electronic-Database Information ......................................................................... 69

References ............................................................................................................. 70

Table 1 ............................................................................................................. 73

Figure 1 ............................................................................................................. 74

Figure 2 ............................................................................................................. 75

Legends of figures ................................................................................................. 76

VI. ARTIGO 3 − Microcefalia Primária em Três Famílias Consangüíneas:

Estudos Clínicos e Moleculares .......................................................................... 77

Resumo ............................................................................................................. 80

Abstract ............................................................................................................. 81

Introdução ............................................................................................................. 82

Pacientes e métodos ................................................................................................. 83

Resultados ............................................................................................................. 83

Estudos clínicos ..................................................................................... 83

Estudos moleculares ..................................................................................... 85

Discussão ............................................................................................................. 85

Agradecimentos ................................................................................................. 88


8

Referências bibliográficas ..................................................................................... 88

Figura 1 ............................................................................................................. 91

Figura 2 ............................................................................................................. 92

Figura 3 ............................................................................................................. 93

Figura 4 ............................................................................................................. 94

Legendas das figuras ................................................................................................. 95

VII. CONCLUSÕES GERAIS ......................................................................... 96

VIII. AS PERSPECTIVAS ..................................................................................... 99

VIII. ANEXOS .........................................................................................................102

Normas das revistas

1. Journal of Medical Genetics ..................................................................................103

2. Jornal de Pediatria .........................................................................................................109


9

RESUMO

Três famílias consangüíneas pernambucanas (famílias 1, 2 e 3) com microcefalia

primária autossômica recessiva foram analisadas nos seus aspectos clínicos e, duas delas,

submetidas a estudos de ligação. A família 1, a mais extensa delas, continha oito afetados

(cinco homens e três mulheres, com idades variando entre 4 e 27 anos) com medidas de

perímetro cefálico entre 7 e 10 desvios-padrões abaixo da média populacional para idade e

sexo. Na família 2 havia cinco afetados (dois homens e três mulheres, com idades variando

de 14 a 25 anos) com medidas de circunferência craniana 4 desvios-padrões abaixo da

média. Todos os pacientes dessas duas famílias tinham saúde geral boa e parâmetros do

crescimento dentro dos limites da normalidade. A microcefalia acompanhava-se de retardo

mental moderado em todos eles, mas nenhuma outra alteração neurológica, dismorfia ou

malformação foi observada. Os pais tinham perímetro cefálico e inteligência normais.

Exame oftalmológico, estudo cromossômico (400 bandas) e eletroencefalograma realizados

em alguns pacientes foram normais e tomografia computadorizada de crânio-encéfalo não

evidenciou malformações cerebrais nem distúrbios de migração neuronal. Após excluir-se

ligação aos cinco locos já sabidamente associados à microcefalia primária autossômica

recessiva, foi realizada, em ambas as famílias, pesquisa genômica ampla com um painel de

365 marcadores microssatélites autossômicos espaçados a intervalos de 10 cM em média.

Na família 1 identificou-se, por meio do método de mapeamento por autozigose, um novo

loco (o sexto, denominado MCPH6 − microcephaly6) associado à microcefalia primária

autossômica recessiva. Na família 2, a análise dos 365 marcadores não revelou nenhuma

região de autozigose. Uma terceira família (a família 3), estudada do ponto de vista


10

clínico mas não analisada molecularmente, tinha dois afetados (um do sexo feminino e

outro do sexo masculino), com medidas de perímetro cefálico 6 e 8 desvios-padrões abaixo

da média, respectivamente. O rapaz tinha retardo mental moderado e a moça, atraso

profundo do desenvolvimento neuropsicomotor, o que sugeria que outra patologia pudesse

estar associada à microcefalia primária. Os três irmãos desses dois afetados tinham medida

de perímetro cefálico 2-3 desvios-padrões abaixo da média (limítrofe para microcefalia) e

nível intelectual variável: um deles apresentava inteligência normal e os outros dois, retardo

leve a moderado. O estudo dessas três famílias pernambucanas levou ao mapeamento de

um novo loco (o sexto) associado à microcefalia primária autossômica recessiva e revelou

que pelo menos mais um outro existe e aguarda identificação.

Palavras-chave: microcefalia, MCPH6, mapeamento por autozigose.


11

ABSTRACT

Three consanguineous families from Pernambuco (families 1, 2 and 3) with primary

autossomal recessive microcephaly were studied clinically, and two of them submitted to

linkage analysis. Family 1, the largest one, had eight affected individuals (five males and

three females, with ages varying between four and 27 years) with head circumference

measurements 7-10 SD below the expected mean for age and sex. Family 2 had five

microcephalic individuals (two males and three females with ages ranging from 14 to 25

years) with head circumference measurements 4 SD below the mean. In both families,

microcephaly was accompanied by mental retardation of moderate severity and no other

neurologic problem, dysmorphic feature or malformation. All the affected individuals were

in good he alth and had growth parameters within normal limits. The parents had normal

head circumference and intelligence. Ophthalmologic examination, standard lymphocyte

karyotype (400 bands) and electroencephalogram performed in patients from both families

were normal, and brain computed-tomography scan showed no cerebral malformations or

neuronal ectopia. After exclusion of linkage to the five known loci related to autosomal

recessive primary microcephaly, a genome trawl with 365 autosomal microssatelite

markers spaced at approximately 10 cM intervals was performed in both kindreds. By

autozygosity mapping a new locus (the sixth one, MCPH6 − microcephaly6) associated to

autosomal recessive primary microcephaly was identified in family 1, but in family 2 no

region of homozygosity was found. The third family (family 3), studied clinically but not

submitted to linkage analysis, had a boy and a girl affected with head circumference

measurements six and eight SD below the mean respectively. The boy presented mental

retardation of moderate severity while the girl had severe neuropsychomotor delay,

suggesting another disorder could be associated to primary microcephaly in this subject.


12

Their three siblings had head circumference measurements 2-3 SD below the expected

mean (boderline for microcephaly), but only one of them had normal intelligence whislt the

two others presented mental retardation of mild to moderate severity. The study of these

three families resulted in the mapping of a novel locus (the sixth one) for autosomal

recessive primary microcephaly and revealed that at least one more locus exist and awaits

identification.

Key words: microcephaly, MCPH6, autozygosity mapping.


13

I. INTRODUÇÃO _________________________________________________________________________


14

I. INTRODUÇÃO

A microcefalia é um sinal clínico que consiste de um perímetro cefálico com

medida com mais de três desvios-padrões abaixo da média populacional para idade e sexo 1

e pode ser encontrado em várias condições, de etiologia tanto ambiental quanto genética.2

Independentemente da sua causa, a microcefalia resulta sempre de um defeito no

desenvolvimento cerebral e acompanha-se, na grande maioria dos casos, de retardo mental.3

A microcefalia pode ocorrer como manifestação clínica isolada (microcefalia não-

sindrômica) ou vir acompanhada de outros defeitos morfológicos (microcefalia

sindrômica).

Na microcefalia primária, um dos subtipos de microcefalia de causa genética, a

redução do perímetro cefálico não está associada a outras malformações e o exame

neurológico não revela outras anormalidades além de retardo mental.4 5 Nessa condição, o

cérebro é simetricamente pequeno e não apresenta alterações estruturais.6 Seu padrão de

herança é, geralmente, o autossômico recessivo.

Cinco genes associados à microcefalia primária autossômica recessiva já foram

mapeados, confirmando-se, assim, as suspeitas prévias de que esta entidade apresentasse

importante heterogeneidade genética, e apenas famílias de origem paquistanesa,

marroquina e turca foram analisadas molecularmente até o momento.7 12 Recentemente,

dois dos cinco genes mapeados foram clonados.13 14

Três famílias consangüíneas pernambucanas com microcefalia primária foram

estudadas nos seus aspectos clínicos e duas delas submetidas a estudos de ligação a fim de

se verificar se apresentavam ligação a um dos cinco locos associados a esta condição já

conhecidos.


15

O mapeamento e a caracterização molecular dos genes causadores de microcefalia

primária, e a identificação de seus produtos e funções correspondentes, significarão uma

contribuição enorme à compreensão da evolução do cérebro humano e à compreensão da

patogênese da microcefalia, com implicações importantes para o aconselhamento genético.

Assim, esses conhecimentos poderão ser utilizados no diagnóstico pré-natal, na detecção de

heterozigotos, no estabelecimento de riscos genéticos, e no diagnóstico dos afetados.


16

II. REVISÃO DA LITERATURA _________________________________________________


17

II. REVISÃO DA LITERATURA

II. 1. Microcefalia

O termo microcefalia significa, a rigor, cérebro pequeno e microcrania, crânio

pequeno, entretanto considerando-se que o fator determinante do crescimento da caixa

óssea craniana é o aumento de volume do cérebro, os dois termos podem, muitas vezes, ser

considerados sinônimos. A microcefalia pode ocorrer em três diferentes situações: 1) a

capacidade de crescimento do cérebro está normal, mas as suturas cranianas fundem-se

precocemente e impedem o seu aumento de volume; 2) a capacidade de crescimento do

cérebro está diminuída e o crânio mantém-se pequeno e desproporcional à estatura, 3) a

capacidade de crescimento do cérebro está diminuída e o crânio mantém-se pequeno mas

proporcional à estatura (microcefalia relativa).15

As medidas de circunferência craniana consideradas normais, de acordo com a idade

e sexo do indivíduo, estão hoje representadas em gráficos, e considera-se que o perímetro

cefálico não aumenta após os 18 anos de idade. O gráfico construído por Nellhaus (1968)16

para ambos os sexos, do nascimento aos 18 anos de idade e com base em dados obtidos de

indivíduos caucasóides, negros americanos, japoneses, esquimós do Alasca e eslavos é um

dos mais usados. Este autor não encontrou diferenças inter-raciais significativas nas

medidas de perímetro cefálico, ao contrário de Palti e cols. (1983) 17 que observaram

diferenças entre raças e entre nacionalidades. Outro gráfico usado com freqüência é o de

Roche (1987),18 também construído para indivíduos do nascimento aos 18 anos, com base

em dados seriados obtidos de uma amostra de 888 crianças brancas americanas

pertencentes a diferentes classes sócio-econômicas. Os valores referentes ao primeiro ano

de idade são equivalentes àqueles obtidos por Nellhaus, contudo em idades mais avançadas,


18

os valores do gráfico de Roche, para o sexo masculino, são cerca de 0,5 a 1,5 vezes maiores

que aqueles do gráfico de Nellhaus. Quanto ao sexo feminino, os valores de Roche tendem

a ser discretamente mais elevados que os de Nellhaus. Tais diferenças poderiam ter

resultado da baixa condição sócio-econômica de vários indivíduos da amostra de Nellhaus,

ou poderiam ser conseqüência de mudanças seculares ou do uso de métodos diferentes,

pelos dois autores, para a aferição da circumferência craniana. Dados obtidos sobre o

crescimento do perímetro cefálico nos primeiros dois anos de vida, em uma amostra de

crianças brancas e negras americanas, 19 sugerem que os gráficos de Roche, embora

construídos apenas com dados sobre crianças brancas, poderiam ser também aplicáveis a

indivíduos negros americanos. Estudos sobre o crescimento da criança brasileira foram

realizados no município de Santo André (área metropolitana da Grande São Paulo). Os

dados de altura e peso foram obtidos para ambos os sexos, analisando-se uma amostra de

indivíduos de 3 a 239 meses de idade, entretanto os dados de perímetro cefálico foram

obtidos apenas para a faixa etária de 0 a 36 meses.20

O valor de perímetro cefálico representativo de microcefalia não é unânime entre os

autores: enquanto alguns consideram microcefalia uma medida de circunferência craniana

com pelo menos 2 desvios-padrões abaixo da média para idade e sexo, 5 21 outros

consideram-na uma medida de perímetro cefálico com mais de três desvios-padrões abaixo

do esperado.1 22 Esta última condição geralmente vem acompanhada de retardo mental,3

enquanto indivíduos com perímetro cefálico com 2-3 desvios-padrões abaixo do esperado

geralmente têm inteligência normal. Sells (1977), 23 analisando uma amostra de 1.006

estudantes com idades entre 5 e 18 anos e freqüentando escola normal, encontrou que

dezenove (1,9%) deles apresentavam perímetro cefálico com 2-3 desvios-padrões abaixo da

média, o que significa que tais medidas não necessariamente levam a deficiência


19

intelectual, considerando-se que apenas um dos 19 estudantes apresentava quociente

intelectual abaixo de 80 e nenhum necessitava de cuidados educacionais especiais. Quando

o cérebro é pequeno mas proporcional à estatura (microcefalia relativa), o desenvolvimento

mental também tende a ser normal.2

II. 2. Etiologia da Microcefalia

A microcefalia é um sinal clínico encontrado em inúmeras condições de origem

tanto ambiental quanto genética, podendo vir acompanhada de outros defeitos morfológicos

(microcefalia sindrômica ou complexa) ou não (microcefalia pura, não sindrômica). A

microcefalia de etiologia genética é também chamada microcefalia primária e a

microcefalia de causa ambiental, microcefalia secundária.6 Os termos microcefalia

primária e microcefalia secundária também têm sido usados para designar, respectivamente,

uma cabeça desproporcionalmente pequena desde o nascimento e uma cabeça de tamanho

normal ao nascimento e que se torna desproporcionalmente pequena posteriormente.15

II. 2. 1. Microcefalia de etiologia ambiental

A microcefalia de causa ambiental resulta de injúrias ao cérebro em

desenvolvimento no período fetal ou pós-natal precoce.6 Na Tabela 1 estão listadas

algumas causas ambientais de microcefalia com os correspondentes quadros clínicos.


20

Tabela 1. Alguns exemplos de microcefalia secundária, com os respectivos agentes

etiológicos e anomalias associadas.

_________________________________________________________________________ Agente etiológico Quadro clínico

Citomegalovírus (congênita) Microcefalia, retardo mental, espasticidade,

crise convulsiva, hepatoesplenomegalia, icterícia, anemia hemolítica, púrpura trombocitopênica, coriorretinite, calcificações intracranianas.24 25

Toxoplasma gondii (congênita) Microcefalia, retardo mental, deficiência de

crescimento pré e pós-natal, crise convulsiva, hepatoesplenomegalia, anemia, microftalmia, coriorretinite, calcificações intracranianas.26

Vírus da rubéola (congênita) Microcefalia, deficiência de crescimento pré e

pós-natal, surdez, catarata, glaucoma, retinopatia, anomalia cardíaca.27

Hipóxia perinatal Microcefalia, atraso do desenvolvimento

neuropsicomotor, crise convulsiva, paralisia cerebral.28

Exposição intra-uterina ao etanol Microcefalia, deficiência de crescimento pré e

pós-natal, atraso do desenvolvimento, fissuras palpebrais pequenas, epicanto, hipoplasia maxilar, mobilidade articular diminuída, anomalia cardíaca.29

Exposição intra-uterina à carbamazepina Microcefalia, deficiência de crescimento pré e

pós-natal, atraso do desenvolvimento, fissuras palpebrais oblíquas para cima, nariz pequeno, filtro naso-labial longo, unhas hipoplásicas.30

Exposição intra-uterina à hidantoína Microcefalia, retardo de crescimento pré e pós-

natal, atraso do desenvolvimento neuropsicomotor, hipertelorismo, epicanto, nariz curto e com raiz baixa, orelhas com implantação baixa e/ou malformadas, hipoplasia de unhas e falanges distais, macrostomia.31

Exposição intra-uterina à radiação Microcefalia, retardo mental.32


21

II. 2. 2. Microcefalia de etiologia genética

A microcefalia genética pode resultar de anomalias cromossômicas, alterações

monogênicas ou fazer parte de síndromes de etiologia ainda não esclarecida.4 Na tabela 2

são apresentados exemplos de formas sindrômicas de microcefalia, resultantes de

anomalias cromossômicas e mutações gênicas.

Tabela 2. Alguns exemplos de síndromes genéticas com microcefalia.

Síndrome

Fenótipo

Trissomia do cromossomo 18

Microcefalia, deficiência de crescimento, atraso neuropsicomotor, sobreposição do 2° sobre o 3° quirodáctilo e do 5° sobre o 4°, hipoplasia de unhas, esterno curto, anomalia cardíaca.33 34

Trissomia do cromossomo 13 Microcefalia, deficiência de crescimento, atraso neuropsicomotor, microftalmia, fissura labial e/ou palatal, polidactilia, unhas estreitas e hiperconvexas, calcanhares proeminentes, defeito de couro cabeludo em região parieto-occipital.35 36

Síndrome do “miado” ou cri-du-chat (deleção parcial do braço curto do cromossomo 5)

Microcefalia, deficiência de crescimento, atraso neuropsicomotor, choro semelhante a miado de gato, fissuras palpebrais oblíquas para baixo, hipertelorismo, epicanto.37 38

Síndrome de Seckel (herança autossômica recessiva)

Microcefalia, baixa estatura, nariz proeminente, orelhas malformadas e com implantação baixa, ausência de um par de costelas.39

Síndrome de Cockayne (herança autossômica recessiva)

Microcefalia, deficiência de crescimento pós-natal, escassez de panículo adiposo, aparência senil, retardo mental, ataxia, disartria, degeneração retiniana, surdez, fotossensibilidade.40


22

Síndrome de Dubowitz (herança autossômica recessiva)

Microcefalia, deficiência de crescimento pré e pós-natal, retardo mental, fissuras palpebrais pequenas e com telecanto lateral, ptose palpebral, blefarofimose, epicanto, micrognatia, eczema de face e áreas de flexão.41

Síndrome de Feingold (herança autossômica dominante)

Microcefalia, alterações de mãos e pés, fissuras palpebrais pequenas, narinas antevertidas, micrognatia, anomalias auriculares, atraso do desenvolvimento, atresia de esôfago/duodeno.42

Síndrome de Sutherland-Haan (herança ligada ao X)

Microcefalia, braquicefalia, baixa estatura, diplegia espástica, retardo mental, testículos pequenos.43

II. 3. Microcefalia Primária Autossômica Recessiva

A microcefalia primária autossômica recessiva é uma entidade nosológica com

quadro clínico composto de microcefalia e retardo mental leve a moderado, não associados

a outros sinais/sintomas neurológicos, dismorfias ou malformações.5 Os termos

microcefalia verdadeira e microcefalia pura têm sido usados como sinônimos de

microcefalia primária autossômica recessiva, contudo não tem havido concordância na

literatura quanto à definição do quadro clínico associado a estas expressões.45 Baraitser

(1997) 4 considera que indivíduos com microcefalia verdadeira ou pura apresentam cabeça

pequena não associada a outras malformações e não exibem problemas neurológicos com

exceção de retardo mental, contudo outros estudiosos, como por exemplo Accardo e

Whitman (1988),46 afirmam que indivíduos com microcefalia verdadeira não exibem


23

problemas neurológicos grosseiros, mas freqüentemente apresentam comportamento

hipercinético e distúrbio da coordenação motora fina. Roberts e cols.47 analisaram 56

famílias consangüíneas com microcefalia nas quais a redução de perímetro cefálico

acompanhava-se apenas de deficiência mental, não se observando outras alterações

neurológicas, distúrbios de crescimento nem dismorfias. O fato de este quadro clínico ter

sido encontrado em grande número de famílias e estar associado a mutações em locos

específicos levou Roberts e cols. a sugerirem que este fenótipo constitui um distúrbio

específico do neurodesenvolvimento e que o termo mais exato para defini-lo seria

microcefalia primária autossômica recessiva. Exames de ressonância nuclear magnética de

crânio-encéfalo têm demonstrado que, nesta condição, a redução da circunferência craniana

é conseqüência de uma diminuição simétrica de espessura do córtex cerebral, não se

observando alterações significativas do padrão dos giros cerebrais, alterações estruturais em

outras áreas do cérebro nem distúrbios de migração neuronal.48 Os afetados têm

desenvolvimento motor normal e condições de saúde geral boas, não apresentam crises

convulsivas e seu retardo mental varia de leve a moderado, permitindo a realização de

tarefas simples do dia-a-dia (como comer, vestir, tomar banho) e uma comunicação verbal

simplificada.4 A microcefalia primária autossômica recessiva é um diagnóstico de exclusão

e, para firmá-lo, é necessário que causas ambientais, cromossômicas e metabólicas de

microcefalia tenham sido investigadas e eliminadas. Na amostra estudada por Roberts e

cols.,47 as medidas de perímetro cefálico situavam-se entre 4 e 14 DP abaixo da média para

idade e sexo, assim esses autores consideram que na microcefalia primária autossômica

recessiva a medida do perímetro cefálico está pelo menos 4 DP abaixo do esperado. Esta

redução do perímetro cefálico é congênita e não progressiva: medidas de circunferência

craniana ao nascimento e aos 5-10 anos de idade, em 15 indivíduos da amostra de Roberts


24

et al., demonstraram que não houve variação no grau de microcefalia. Também não se

observou variação significativa no grau da microcefalia entre afetados de uma mesma

família. Estudando 13 famílias com microcefalia genética, Qazi e Reed 49 observaram que

11 dos 24 genitores e 11 dos 33 irmãos normais de afetados apresentavam retardo mental

sem microcefalia, e atribuíram esta alteração a um efeito do gene de microcefalia em

heterozigose, contudo nas famílias analisadas por Roberts e cols.47 nenhum dos genitores

ou irmãos de afetados tinham deficiência intelectual

Não há estudos relatando a incidência da microcefalia primária autossômica

recessiva conforme aqui definida. Komai, estudando microcefalia genética no Japão,

encontrou freqüência de 1/30.000, no entanto seus pacientes apresentavam retardo mental

grave, peso e estatura abaixo da média, crises convulsivas e alteração do sistema

piramidal.50

II. 4. Mapeamento por homozigose/autozigose

Em 1987, Eric S. Lander e David Botstein 51 propuseram uma estratégia para o

mapeamento de genes relacionados a traços autossômicos recessivos em famílias

consangüíneas. Tal estratégia − denominada mapeamento por homozigose − baseia-se na

hipótese de que regiões adjacentes ao loco a ser mapeado devem ser homozigotas por

descendência nos indivíduos que apresentam a característica autossômica recessiva em

análise. Uma região cromossômica é homozigota por descendência quando ambos os seus

alelos são herdados de um ancestral comum.

O termo autozigose significa homozigose de marcadores idênticos por descendência

e herdados de um ancestral comum recente, assim as expressões mapeamento por


25

homozigose e mapeamento por autozigose são sinônimas. Indivíduos afetados por doenças

autossômicas recessivas raras, em famílias consangüíneas, muito provavelmente

apresentam autozigose dos marcadores ligados ao loco da doença. Na época em que Lander

e Botstein propuseram esta técnica, os marcadores genéticos conhecidos eram muito pouco

informativos, contudo a identificação, na década de 90, de marcadores altamente

polimórficos, como por exemplo os polimorfismos de tamanho de cadeia simples, deu uma

nova dimensão à estratégia proposta por estes autores.

II. 5. Aspectos Moleculares da Microcefalia Primária Autossômica Recessiva

Em 1998, usando o princípio de mapeamento por homozigose e analisando uma

família consangüínea de origem paquistanesa, Jackson e cols.7 identificaram, em 8p22-pter,

o primeiro loco associado a microcefalia primária autossômica recessiva e denominaram-no

MCPH1 (microcephaly 1). Os afetados tinham perímetro cefálico medindo 5-9 DP abaixo

da média e apresentavam retardo mental leve a moderado. Estes autores também

demonstraram que a microcefalia primária autossômica recessiva apresentava

heterogeneidade de loco, uma vez que a análise de outras oito famílias, também

consangüíneas e de origem paquistanesa, revelou que apenas uma delas (com dois afetados)

apresentava ligação ao loco MCPH1. A região de homozigose comum a todos os afetados

das duas famílias compreendia uma região de 13 cM. Posteriormente, a genotipagem desses

afetados com um grande número de marcadores localizados em 8p23 permitiu que se

refinasse a região crítica até 2,1 Mb, intervalo onde se encontravam dois genes, o gene da

angiopoietina-2 e AX087870, gene ainda não caracterizado. Nenhuma mutação foi

detectada no primeiro, entretanto identificou-se, em todos os pacientes de ambas as

famílias, a troca de uma citosina por uma gruanina (C→G) no éxon 2 de AX087870, o que


26

cria um códon de parada prematuro e trunca a proteína codificada por este gene. Os

afetados eram homozigotos para tal mutação e os seus pais, heterozigotos, enquanto em

nenhum dos 202 alelos controle de origem paquistanesa encontrou-se a referida mutação.

Tanto o gene AX087870 quanto a proteína por ele codificada foram denominados

“microcefalina”. Experimentos de hibridização in situ com tecidos fetais de camundongo

confirmaram que a microcefalina expressa-se durante a neurogênese: no cérebro de feto de

camundongo, a microcefalina apresentou altos níveis de expressão no telencéfalo e, em

particular, nas paredes dos ventrículos laterais, região onde células progenitoras dividem-se

produzindo os neurônios que vão formar o córtex cerebral.13

O segundo loco associado à microcefalia primária autossômica recessiva foi

identificado em 19q13.1-13.2, também por meio do mapeamento por homozigose, em duas

famílias consangüíneas originárias do norte do Paquistão. Seus afetados tinham medidas de

perímetro cefálico com 4-7 DP abaixo da média e retardo mental leve a moderado. O gene

de MCPH2 ainda não foi clonado e o intervalo crítico mínimo, nessas duas famílias, é de

7,6 cM.8

O terceiro e quarto locos foram mapeados, respectivamente, em 9q34 e 15q15-q21,

usando-se a técnica de mapeamento por homozigose. O terceiro loco foi identificado em

uma família de origem paquistanesa e o quarto, em uma família marroquina. Em ambas as

famílias, os afetados tinham medidas de perímetro cefálico com cerca de 6 DP abaixo do

esperado e retardo mental leve a moderado. Na família paquistanesa, a região de

homozigose tem cerca de 12 cM e na marroquina, 5,3 cM. Os genes de MCPH3 e MCPH4

ainda não foram clonados.9 10

Usando-se também o princípio de autozigose, o quinto loco foi mapeado,

simultaneamente em uma família de origem turca e uma família do Paquistão, em 1q25-


27

q32. Na família originária da Turquia, os afetados tinham retardo mental moderado a grave

e suas medidas de perímetro cefálico situavam-se entre 6 e 8 DP abaixo da média. Na

família paquistanesa, a deficiência intelectual era moderada e os três indivíduos

microcefálicos apresentavam circunferência craniana medindo 5-7 DP abaixo da média.11

Cinqüenta e seis famílias com microcefalia primária autossômica recessiva (com um

total de 131 afetados, sendo 70 do sexo masculino e 61 do sexo feminino), todas originárias

do norte do Paquistão, foram genotipadas com marcadores microssatélites localizados nos

cinco locos associados a esta condição (MCPH1-MCPH5): duas famílias apresentaram

ligação com MCPH1; 10, com MCPH2; duas, com MCPH3; 24, com MCPH5; nenhuma

família segregou com MCPH4 e 18 famílias não apresentaram ligação com nenhum dos

cinco locos analisados. MCPH5 é, assim, o loco mais prevalente na população

paquistanesa. As medidas de perímetro cefálico dos afetados destas 56 famílias situavam-se

entre 4 e 14 DP abaixo da média e apresentavam pouca variabilidade intrafamiliar (em

torno de 1 DP). Não foi possível distinguir o fenótipo associado a cada um dos locos com

base apenas nos aspectos clínicos.47

A genotipagem das 24 famílias (com um total de 61 afetados) ligadas a MCPH5

com novos marcadores microssatélites permitiu que este loco fosse reduzido até 600 Kb.

Neste intervalo, encontravam-se quatro genes, três dos quais − um homólogo de

KIAA1089, um gene do tipo zinc-finger e o gene ASPM − poderiam estar envolvidos com

microcefalia. O quarto gene já se sabia estar associado à amaurose congênita de Leber. As

seqüências completas dos três genes candidatos foram determinadas e, nas quatro famílias

mais extensas ligadas a MCPH5, eles foram seqüenciados. Em todos os afetados,

identificaram-se, em ASPM, mutações em homozigose produzindo um códon de parada


28

prematura que truncava a proteína por ele codificada. ASPM é um ortólogo do gene asp de

Drosophila melanogaster, envolvido na formação e funcionamento do fuso mitótico de

neuroblastos embrionários. Alterações da sua proteína impedem que neuroblastos em

divisão celular progridam além da metáfase, prejudicando, assim, o desenvolvimento do

sistema nervoso central.14


29

III. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

_________________________________________________


30

III. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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36

IV. ARTIGO 1

Primary Microcephaly: a Clinical Perspective

Artigo a ser submetido ao Journal of Medical Genetics ________________________________________________________________________


37

Primary Microcephaly: a Clinical Perspective

Gabriela F Leal*, Emma Roberts#, C Geoffrey Woods#‡

*Instituto Materno-Infantil de Pernambuco (IMIP), Recife-PE, Brazil

#Molecular Medicine Unit, University of Leeds, St James's University Hospital, Leeds, UK

‡Department of Clinical Genetics, St James's University Hospital, Leeds, UK

Corresponding Author

C Geoffrey Woods

Molecular Medicine Unit

Clinical Sciences Building

St James's University Hospital

Beckett Street

Leeds LS9 7TF

England-UK

Tel: 0044 113 2065252

Fax: 0044 113 2444475

Email: [email protected]


38

Abstract

This clinical review of Primary Microcephaly draws on our experience of this condition in

the Northern Pakistani population in Yorkshire and the North-eastern Brazilian population,

and summarises the relevant literature. Primary Microcephaly is a clinical “diagnosis of

exclusion” that should be considered in any individual with the finding of congenital

microcephaly. The additional clinical findings are of mild to moderate mental retardation

and an easy-going, biddable manner which allows such individuals to be trained and

function at a higher level than may have been expected. The differential diagnoses to be

considered and need for observation until at least the age of 2 year before making the

diagnosis are discussed. The prevalence of Primary Microcephaly is not known. It seems to

be rare in Caucasians (less than 1 per 100,000) but higher in Asian and Arab populations.

Primary Microcephaly is usually considered to be an autosomal recessive disorder and had

been assumed to present genetic heterogeneity. This has now been established with the

identification of six autosomal loci: MCPH1 on 8p23, MCPH2 on 19q13, MCPH3 on 9q23,

MCPH4 on 15q, MCPH5 on 1q21, and MCPH6 on 13q12, with further loci known to await

detection. In the British Pakistani population, the MCPH5 locus is the most prevalent, and

in a Brazilian family the MCPH6 locus was mapped. The genes mutated in MCPH1 and

MCPH5 are microcephalin and ASPM respectively. The discovery of these genes and the

others implicated in Primary Microcephaly should allow prenatal and early post-natal

diagnosis, and, in consanguineous families, carrier identification. However, it may also give

us valuable insights into normal cerebral cortex growth (which is taken to an extreme in


39

primates, especially man) and the evolutionary cerebral changes that have distinguished us

from our nearest relatives, the higher primates.

Key words: primary microcephaly, mental retardation, heterogeneity, cerebral cortex

Introduction

The term “microcephaly” has become awkward as it is in use both to describe a

clinical finding and a diagnosis.1 2 “Microcephaly” should be reserved for use as a clinical

finding, that is a head circumference significantly less than expected for an individual’s age

and sex. There is a myriad of causes − both genetic and environmental − for an individual

to have “microcephaly”, but this article seeks to focus on the group of individuals with the

autosomal recessive disorder “Primary Microcephaly” (MCPH). This condition seems to be

rare in Caucasians (less than 1 per 100,000) 3 but its incidence is probably more elevated in

populations with a higher rate of consaguineous marriages.

The microcephaly in MCPH seems to be caused by a reduction in size in the

cerebral cortex, and is accompanied by mental retardation and no other neurological

problems, malformations or dysmorphic features. After the clinical features in Primary

Microcephaly are discussed here, an approach to eliminating potential differential

diagnoses is suggested.

To date six autosomal loci have been identified associated to Primary Microcephaly,

confirming the previous suspect of genetic heterogeneity of this condition. MCPH1, 2 and 3

were mapped in Northern Pakistani families; 4−6 MCPH4 in a Moroccan family; 7 MCPH5


40

in Northern Pakistani and Turkish families, 8 9 and MCPH6 in a Brazilian family.10 MCPH1

and MCPH5 genes have been cloned. 11 12 This clinical review is based on our experience

of this condition in the Northern Pakistani population of Yorkshire and the North-eastern

Brazilian population.

The neuro-developmental aetiology of Primary Microcephaly and the brain

evolution from the great apes to Homo sapiens sapiens are also discussed here as it could

be speculated that the genes involved with Primary Microcephaly could also have taken

part in the primates cerebral cortex evolution processes.

Head circumference measurement

Micrencephaly , theoretically, refers to a small brain, and microcephaly refers to a

small cranio, but, as Aicardi states, “in practice the two definitions, microcephaly and

micrencephaly, are equivalent”.2 We will use the term microcephaly throught this article to

mean a head circumference of at least –4 SD to the population mean for age and sex. 2 To

detect the clinical finding of microcephaly, a head circumference needs to be accurately

obtained and charted. Serial measurements and their analysis as standard deviations will tell

if microcephaly is congenital or post-nataly developed; and static, progressive or reducing.

Occipitofrontal head circumference is only imperfectly correlated with brain volume, but

whilst other methods have been used, it remains the common simple method for evaluating

brain size.2 The head size increases rapidly in the first few years of life driven by the

growth of the brain (the brain triples in weight from birth to 1 year of age), therefore the

need to chart measurements by age particularly carefully in the first few years of life.


41

A correct head circumference measurement is necessary for head size to be

assessed, particularly if this is being performed longitudinally. Head circumference is

measured around the head from encompassing the occipital bump, above ears and across

the brow- in the same plane as if the person was staring straight ahead. The largest

measurement should be taken by trying to slide the tape measure slightly up and down. A

cloth tape should be used, to reduce the possibility of tape stretching. It can be almost

impossible to get an accurate measurement in a child with significant microcephaly due to

the slope of the forehead with the apparent greatest head circumference being in the plane

of the orbits. Exuberant or platted hair can lead to an overestimate of the head

circumference. Scalp tumours, similarly, will lead to erroneous measurements, e.g.

cephaloheamatoma in the newborn.

The head circumference can then be recorded on a head circumference chart for the

appropriate sex (males head circumference is approximately 1cm greater than that of

females throughout life). Due to the rapid growth of the brain in pregnancy and early

childhood, the measurement is charted against age. This is particularly important in the

premature newborn: in a 36 week premature newborn, a head circumference of 32cm is

normal, but this head circumference size would be 3SD below the mean in an infant born at

term. Practically, it is not always possible to assess gestational age. Many charts are

available and all differ, although these differences are usually minor and only really of

importance in the first year of life. Charts are available for healthy and sick preterm infants.

13 14 We have generated a second pair of charts giving the number of standard deviations a

head circumference is below the expected mean for age and sex (these were calculated

using the data of Roche et al 15 and Nellhaus. 16


42

Head shape obviously affects head circumference and there are no specific charts

for children with the various types of craniosynostosis. Excepting turricepahly, the more

extreme the shape of the head the less intra-cerebral volume there will be for a given head

circumference. It is unclear whether there are racial differences in normal and below

normal head circumference. Such differences that have been recorded may all be explained

by differences in nutrition. Head circumference is said to vary independently of height and

weight (with the exception of severe intra-uterine growth retardation, in which weight, then

length, then head circumference reduce), so microcephaly should be readily clinically

apparent when growth parameters are within +3 to –3.

The diagnosis of Primary Microcephaly

Primary Microcephaly may be defined as an autosomal recessive disorder causing a

cerebral cortex of reduced size but of normal appearance on MRI and CAT scans. The

cerebral cortex reduction is congenital and the head circumference size ranges between –4

and –11 SD from the mean with no variation of the degree of microcephaly throughout life.

Affected individuals have normal build and stature and present no dysmorphic features. All

of them have static mental retardation of mild to moderate severity with no associated

motor retardation or other neurological abnormalities. The incidence of fits is not increased.

As standard medical enquiry and laboratory investigations reveal no cause for the

microcephaly, the diagnosis of Primary Microcephaly is therefore a “diagnosis of

exclusion”. This definition is arbitrary but there is some justification for its use in that it has


43

allowed us to ascertain and study 59 families (often with multiple affected individuals) and

map a number of gene loci for Primary Microcephaly.

To date there are no investigations that can confirm all the cases of Primary

Microcephaly, considering that only MCPH1 and MCPH5 genes have already been

identified, but those that can eliminate some of the differential diagnoses. Given the

number of differential diagnoses and the time needed for phenotypes to become apparent,

we would only provisionally diagnosis Primary Microcephaly before the age of two years.

A minimum set of investigation would include MRI brain scan (CAT as well if intra-cranial

calcification is sought), full metabolic screening including maternal phenylketonuria,

clinical genetics opinion if referred by a Paediatric Neurologist and vice versa, and detailed

cytogenetic analysis.

Differential diagnosis of primary microcephaly

Using the definition of Primary Microcephaly stated above should lead to the

elimination of many causes of microcephaly. We would not regard anyone with a head

circumference of –1 to –3 SD as having Primary Microcephaly, considering that

individuals of normal intelligence and a head circumference of –3 SD have been reported.1 2

17-19 Therefore we would be guarded about diagnosing Primary Microcephaly in an

individual with a head circumference of –3 to –4SD. Discussion of syndromal disorders

involving microcephaly are not within the scope of this article but see LNDB, 20 Friede 21

and Bundey. 22 There are many non-genetic causes of microcephaly which need to, if

possible, be eliminated before considering the diagnosis of Primary Microcephaly. These


44

include prenatal exposure to ionising irradiation, drugs and chemical; materno-fetal

circulatory problems; and hypoxic-ischeamic insult. 23-27 Parental head circumference

should always be measured to detect autosomal dominant microcephaly or possible

dominantly inherited chromosome anomalies.

Autosomal dominant microcephaly

A number of families with apparent autosomal dominant microcephaly have been

described and it seems to be a heterogenous entity. The microcephaly appears to be

congenital and its severity as well as the mental retardation are usually of a lesser degree

than that observed in the autosomal recessive cases. Most affected individuals are reported

to have normal or borderline normal intelligence, or mild mental retardation. The families

described by Rossi and Battilana, 28 Rossi et al, 29 Ramirez et al, 30 and Merlob et al 31

presented microcephaly of −2.2 SD to −4.7 SD degree accompanied by normal intellectual

function and no physical anomalies. Haslam and Smith 32 reported four families with

microcephaly ranging from −2 SD to −4.2 SD and mild mental retardation. Autosomal

dominant microcephaly associated to moderate mental retardation seems to be rare, but it

has been reported. 33 During the evaluation of a child with microcephaly, parental head

circumference measurement and charting is essential, and it is usually assumed that head

circumference changes little after 18 years of age.


45

Chromosome anomalies

Chromosome anomalies can cause microcephaly, diminished intelligence and little

in the way of dysmorphic findings or congenital anomalies. In particular the terminal

deletions of the short arm of chromosome 8 − which are more frequent than previously

thought − must be actively sought. The phenotype associated with these deletions includes

microcephaly, mental retardation, behavioural problems, minor or absent facial anomalies,

and heart defects (characteristically endocardial cushion defects). The occurrence of

microcephaly and cardiac anomalies, and the severity of the mental retardation appear to be

directly related to the extent of the deletion. In patients with microscopically visible

del(8)(p23.1→pter), microcephaly (ranging between −2 SD and −4 SD) and/or cardiac

anomalies have been found, and the intellectual impairment is usually mild. 34 35 This small

del(8)(p23.1→pter) can easily be missed on standard chromosome analysis. 36 Doubtless

other subtle chromosome anomaly syndromes await description. The finding of subtle

dysmorphic features or congenital anomalies and a family history suggestive of a

translocation are of help in urging the physician not to overlook the chromosome anomalies

as the cause of microcephaly.

Microcephaly with normal intelligence

As stated previously, autosomal dominant microcephaly is usually accompanied by

normal intelligence or mild mental retardation but autosomal recessive microcephaly with

no mental impairment seems to be rare. Teebi 37 reported a large consanguineous Arab

kindred with nonsyndromal microcephaly and normal intelligence. The head circumference


46

measurement was between −6 and −8 SD from the mean. Two sibs described by Rizzo and

Pavone 38 − a girl and a boy born to normal nonconsanguineous parents − had severe

microcephaly and normal, borderline/normal intelligence respectively. Both had small ears,

markedly protruding midface, curved nose and severe retrognathia. A few other cases of

autosomal recessive microcephaly with normal intelligence have been reported. 39 We have

not seen any families in the Northern Pakistani or North-eastern Brazilian populations with

“Primary Microcephaly with normal intelligence”. The autosomal recessive Nijmegen

breakage syndrome should not cause diagnostic confusion. In this condition the head

circumference is 2 to 3 SD below the mean and the affected individuals have symptomatic

immune deficiency. Cytogenetic studies show a chromosome breakage pattern

indistinguishable from the one found in Fanconi anemia, ataxia telangiectasia and Bloom

syndrome, and immunological studies reveals humoral and cellular immune defects. 40

Post-nataly developing microcephaly

This is a difficult diagnostic grouping and clearly heterogeneous. It needs to be

considered when early head circumference measurements are not available. Affected

individuals have a normal head circumference at birth which falls through the centiles to –4

to –5 SD’s by 4 years of age and is associated with moderate to severe mental retardation.

Whilst an extensive differential diagnosis of metabolic and storage diseases, chromosome

anomalies and birth asphyxia needs to be eliminated, we have seen families with this

phenotype, non-progressive mental retardation and a probable autosomal recessive

inheritance pattern. Furthermore some families have the additional finding of spasticity and


47

others early onset tonic/clonic fits. Whilst this group needs further characterisation one

could also speculate that the aetiology is likely to be abnormalities in dendritic arborisation

and post-natal synapse formation.

Classification of microcephaly

A number of different methods exist for classifying microcephaly: by clinical

features, which include time of onset of the microcephaly and the presence or absence of

additional malformations or dysmorphic features; by CT/MRI scan appearance; by neuro-

pathology studies. Pure, non-syndromal or uncomplicated microcephaly is microcephaly

without associated anomalies whilst syndromal microcephaly implies development

disturbances elsewhere in the body besides the brain. In primary microcephaly the head is

disproportionately small at birth while in secondary microcephaly the head circumference

starts to fall below normal channels after birth. 41 Other authors, however, consider primary

microcephaly as genetic microcephaly, and secondary microcephaly as non-genetic

microcephaly. 42 Sometimes these two classification do not agree, for example in the case

of the families we have seen with a post-nataly developing microcephaly and an autosomal

recessive pattern of inheritance. Barkovich et al 43 44 have produced and revised a useful

classification of brain scan anomalies. Within this classification, children with Primary

Microcephaly would be regarded as having microcephaly vera, that is, small symmetrical

cerebral cortices with no structural anomalies (radial microbrain is the term used for a brain

in which all parts are symmetrically reduced in size, with a total weight of <500 g).

Existing clinical classifications include the terms microcephaly vera and true microcephaly.


48

True microcephaly refers to a genetic type of microcephaly (usually with an autosomal

recessive mode of inheritance) in which the head circumference is well below (at least 5-6

SD) the mean and a narrow, receding forehead is seen. The microcephaly is evident since

birth and there are no associated malformations. Early development is relatively normal and

individuals with this type of microcephaly do not exhibit gross neurological signs, but

seizures may occur in 1/3 of them. Most of the affected subjects are trainable and can

acquire at least a simplified language.45 Microcephaly vera incorporates children with

significant microcephaly which is thought to be genetic in aetiology, but the head

circumference need not have been abnormal at birth. The child can be significantly

retarded, and fits and other neurological problems such as spastic cerebral palsy may be

present.41 Primary Microcephaly fits only in part to the categories of true microcephaly or

microcephaly vera. In true microcephaly, an obligatory feature is the sloping forehead

which is absent in many of the families we have studied and, besides, this is also variable

within affected members of the same family. Sloping forehead is as well frequently seen in

individuals with extreme microcephaly (head circumference > −10SD) who are likely to

have brain scan anomalies. In microcephaly vera, the head circumference can be normal at

birth and the affected individual can present associated neurological problems, such as

cerebral palsy. In none of the families we have studied cerebral palsy was observed.

Clinical findings in Primary Microcephaly

Apart from those features listed in the definition there is little to tell. Appearance is

normal, except for the small head size. The forehead may be sloping, giving the appearance


49

of “true microcephaly”, however this is not specific to Primary Microcephaly as it is

certainly seen in other disorders with microcephaly of > −5 SD. Furthermore, our

experience is that within affected families some show this appearance while others with a

similar degree of microcephaly do not. There appears to be a tendency for the sloping

forehead appearance to lessen with age, possibly as brain growth slows and face continues

to grow, resulting that affected individuals often have a round shape head. The affected

children tend to be well behaved and are “biddable”, that is, compliant with instruction and

able to be taught skills of daily living, common sense safety and writing and reading. There

is no evidence that the degree of microcephaly − as judged by SD’s from the mean −

changes with age. Nor is there a sex difference. When comparing sucessive head

circumference measurements there is usually only a variation in the degree of microcephaly

of 1 SD.

Mothers do not report any difference between their pregnancies of affected and

unaffected children. We have been able to review or prospectively follow the ultrasound

scans of 3 affected pregnancies. In each one, brain appearance was normal throughtout the

pregnancy (as would be expected as post-natal brain scans are normal), however head

growth assessed by bi-parietal diameter and head circumference was normal until 28 weeks

and reduced by 36 weeks. Therefore in these cases there was a lack of continuing cerebral

cortex growth in the third trimester (see section Neuro-developmental Aetiology of Primary

Microcephaly). The corollary of this is that microcephaly evident by fetal ultrasound

scanning at 22 weeks is unlikely to be caused by Primary Microcephaly and poses a worse

prognosis.


50

Early milestones of alertness, smiling to parents and head control are often normal.

Later motor and social milestones are mildly delayed. Speech development is delayed as

may be expected for a child with mild to moderate mental retardation. No specific learning

or speech problems have been identified, however no detailed learning/psychological

profile has been performed, and this probably best awaits specific gene testing so that each

form of Primary Microcephaly can be analysed separately. The affected children have good

fine motor control, balance and grace in movements. They achieve well in sports compared

to other mental retarded children and do seem to have the “happy affect” talked of in the

literature.

In our study population we cannot comment on the incidence of epilepsy, as this

would be an exclusion criteria for our studies. However, it is our impression that whilst a

few children had febrile convulsions, epilepsy was uncommon both in the early years and

in adulthood. We have seen multiple affected families who had: 1) post-natally developing

microcephaly and early onset fits, or 2) congenital microcephaly with spasticity and fits,

but these are clearly distinguishable from Primary Microcephaly. Affected individuals

enjoy good health and do not seem prone to develop any specific medical conditions. Of the

older affected individuals − 40 years and over − 4/12 have become withdrawn, less

communicative and less mobile (but not spastic). Whether this is due to the underlying

condition or their lifestyle is unclear.

Within our study population we have encountered two families with findings similar

to Primary Microcephaly, but with the distinguishing features of 1) the degree of

microcephaly is more severe (-10 to –12 SD’s), 2) all have severe mental retardation and 3)

two of the four affected individuals have minor spasticity, and three of the four have


51

infrequent tonic/clonic fits. MRI brain scans on two of the four have been performed and

are normal (personal communication D Pfiltz). The families are linked to the 5 cM region

spanning the MCPH5 gene locus. For the time being we have designated these families as

having Extreme Primary Microcephaly. It is unclear whether this condition is allelic to

MCPH5 or a different disorder.

It has been stated that there may be a heterozygote effect of carrying a microcephaly

gene which consists of mild mental retardation and possibly a small head size. 46 We have

found no evidence for such a heterozygote effect in our 59 study families.

Genetics of Primary Microcephaly

The literature on this topic is difficult to interpret because of the heterogeneity of

“microcephaly vera” and the problems with microcephaly nomenclature, as detailed

previously. However, the inheritance of “microcephaly vera” is usually considered to be

autosomal recessive. 47 Primary Microcephaly is also usually autosomal recessive, and to

date no autosomal dominant families fulfilling the diagnostic criteria have been reported. A

family with an X-linked recessive disorder with the clinical features of microcephaly and

mental retardation but variable spastic diplegia has been documented, in which some

affected individuals are only microcephalic. 48

Microcephaly vera is rare, with Tolmie describing only one case in a Scottish

population of 2 million in a study of recurrence risk and prenatal diagnosis of

microcephaly. 51 The incidence of Primary Microcephaly is not known with certainty

considering that only two studies have been done to date. These studies suggest an


52

incidence of 1/30 000 to 1/250 000.3 50 In the Bradford area we know of 131 affected

individuals in a population of 486.400, giving a minimum incidence of 27/100.000.

Primary Microcephaly has been reported in many races, and seems more frequently in

consanguineous populations. Whether all genotypes of Primary Microcephaly are equally

represented in different ethnic groups awaits clarification.

The recurrence risks given to a couple who have had one child with a probable

diagnosis of primary microcephaly are empiric. The first figures used were those of Carter

and were one in eight to one in four. 51 Bundey 22 suggests that an autosomal recessive

recurrence risk is used if neuroradiological examination confirms symmetrical

microcephaly. We would also consider a risk of one in four correct if the family is

consanguineous and of Arab or Brazilian origin. Several research teams have sought and

found loci for Primary Microcephaly. That is in different families with apparently similar

children with a diagnosis of Primary Microcephaly genetic heterogeneity has been shown.

4-10 The research teams have used the principle of autozygosity mapping and multi-affected

consanguineous pedigrees to unambiguously define Primary Microcephaly loci. Six loci

have been described, designated MCPH1–6. At least one further locus awaits discovery, as

we ourselves have multi-affected consanguineous pedigrees not linked to any of the

described loci. The six loci are documented in Table 1. To date only MCPH1 and MCPH5

genes − microcephalin and ASPM respectively − have been identified.11 12 Prenatal

diagnosis and carrier testing could be offered using linkage analysis but the heterogeneity

of the disorder currently precludes this in all but exceptional families.


53

Primate Evolution and Primary Microcephaly

It is generally accepted that hominids (including man, Homo sapiens sapiens) and

the greater apes (gibbon, orang-outan, chimpanzee and gorilla) had a common ancestry.

The divergence of the species has occurred over the last 10 million years. The intervening

species between the gorilla/chimpanzee/hominid emergence 4 million years ago and

modern man have all become extinct. So the exact number of species and their evolutionary

relationship is unknown. However paleantological studies of fossil records suggest that

there have been at least 6 hominids, and that there has been a step-wise increase in brain

volume as the hominid species have diverged from a common ape/hominid ancestor.

Australopithecus, the most ancient hominid fossil found in the southern tip of Africa, is

believed to have lived about 3.8-3.6 million years ago and had a brain volume of 600cm3.

Homo erectus lived between 1.5 and 0.2 million years ago, and his brain volume increased

from 850 to 1200cm3. The most recent Homo erectus − the ones who lived between 0.4 and

0.2 million of years ago − had such a modern appearance that they can be considered Homo

sapiens. After 0.2 million of years ago the hominids brain volume reached 1400cm3, the

same size seen in men today. It is thought, nevertheless, to exist differences in the relative

size of parts of the cerebral cortex, with Neanderthals having a larger motor strip – because

of their greater muscle bulk − and humans a larger frontal cortex. It has been assumed that

the increase in brain size of the hominid species has lead to our increased intelligence

(which may be broadly defined as “adaptability to environment”) and our unprecedented

spread to inhabit all parts of the earth (something not achieved by any other creature). This

increase in brain size has occurred over a relatively short period of time.52


54

The major differences between higher primates and other primates is larger relative

brain size and shoulder anatomy allowing under branch travel and greater general arm

manouverability and use. Homo sapiens and higher primates seem to differ in 1) the ability

to speak with changes both in the larynx and in the parts of the brain needed to exert

exquisite breath control, 2) the loss of a tail and 3) the size of our cerebral cortex. Most

changes of a size or specialisation of a part of an organism occur because of dominant

mutations in a number of genes that become fixed in the population. It may then be

hypothesised that the genes causing the autosomal recessive disorder of Primary

Microcephaly may be the same genes that have lead to the increase in human cerebral

cortex size. If so Primary Microcephaly may be viewed as an evolutionary disease – one in

which a key step in the differential development of a human from an ancestral species

cannot occur because of a gene mutation.

Conclusions

The diagnosis of Primary Microcephaly should only be made if diagnostic criteria

are met and known differential diagnosis are sought and eliminated. The majority of the

cases will have an autosomal recessive inheritance, with the resultant one in four risk of a

further affected child. Prenatal diagnosis is not available and fetal ultrasound scanning only

detects a reduction in expected head circumference after 28 weeks. The condition is rarely

reported in Caucasians, but seems more common in those of Asian and possibly Arab

origin. The condition exhibits genetic heterogeneity with six loci identified to date. Prenatal

diagnosis (to detect a recurrence of the disorder), post-natal diagnosis (to identify the


55

disorder from the many differential diagnoses) and carrier testing (in consaguineous

families in which the disease is known to occur) may all become possibilities once the

MCPH genes are identified (to date only MCPH1 and MCPH5 genes have been identified).

It has been speculated, without any evidence, that the genes that cause Primary

Microcephaly wouls be involved in the “encephalisation” of the recently evolved hominid

species, culminating in the human cerebral cortex, three times that of our closest relatives

the chimpanzee and gorilla.

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62

Table 1

The six known loci for autosomal recessive primary microcephaly

Primary microcephaly locus

Chromosomal location Ethnicity of family Reference

MCPH1 8p23.1 Northern Pakistani Jackson et al., 1998

MCPH2 19q13 Northern Pakistani Roberts et al., 1999

MCPH3 9q34 Northern Pakistani Moynihan et al., 2000

MCPH4 15q14 Moroccan Jamieson et al., 1999

MCPH5 1q31.3 Northern Pakistani

Turkish

Pattison et al., 2000

Jamieson et al., 2000

MCPH6 13q12.2 Brazilian Leal et al., 2003


63

V. ARTIGO 2

A Novel Locus for Autosomal Recessive Primary Microcephaly

(MCPH6) Maps to 13q12.2

Artigo publicado no Journal of Medical Genetics 2003;40:540-542. ________________________________________________________________________________________


64

A Novel Locus for Autosomal Recessive Primary Microcephaly (MCPH6)

Maps to 13q12.2

Gabriela F Leal, MD*, Emma Roberts, PhD‡, Elias O Silva, PhD*#, Suzana M R Costa,

MD*, Daniel J Hampshire, BSc‡, C Geoffrey Woods, FRCP‡

*Instituto Materno-Infantil de Pernambuco (IMIP), Recife-PE, Brazil

‡Molecular Medicine Unit, University of Leeds, St James’s University Hospital, Leeds,

LS9 7TF, UK

#Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE, Brazil

Corresponding Author

C Geoffrey Woods

Molecular Medicine Unit

Clinical Sciences Building

St James's University Hospital

Beckett Street

Leeds LS9 7TF

England-UK

Tel: 0044 113 2065252

Fax: 0044 113 2444475

Email: [email protected]


65

Key points

• Autosomal recessive primary microcephaly (MCPH) is a genetic disorder in which an

affected subject is born with a head circumference >3 SD below the expected mean and is

mentally retarded.

• We report a novel locus (MCPH6) mapped to chromosome 13q12.2 in a Brazilian family.

• The minimal critical region spans 6 Mb between markers AL139378GT17 and D13S1244

with a maximum two point lod score of 6.25.

Microcephaly is the clinical finding of a head circumference measurement greater than

three standard deviations (SD) below the population mean for age and sex. It is usually

accompanied by mental retardation and there are many diagnoses with both environmental

and genetic aetiologies.1 Autosomal recessive primary microcephaly (MCPH) (MIM

251200) is a disorder in which affected subjects are born with a small head circumference,

explained by a cerebral cortex of reduced size, and are mentally retarded. The brain is

structurally normal and, apart from the intellectual impairment, there are no other

significant neurological problems, dysmorphic features, or malformations.2,3 In a study

carried out in the Netherlands,4 the incidence of MCPH was approximately 1/250 000 but it

is probably greater in populations with a high rate of consanguineous marriages. MCPH has

been shown to be genetically heterogeneous with the identification of five loci: MCPH1 on

8p23,5 MCPH2 on 19q13,6 MCPH3 on 9q34,7 MCPH4 on 15q15-q21,8 and MCPH5 on

1q31.9 10 MCPH1, 2 and 3 were mapped in Northern Pakistani families, MCPH4 in a


66

Moroccan family, and MCPH5 in Northern Pakistani and Turkish families. Here we report

the identification by autozygosity mapping11 of a novel locus for primary microcephaly,

MCPH6, in a North-Eastern Brazilian family.

MATERIALS AND METHODS

Subjects

The consanguineous family had eight affected subjects (five males and three females, DNA

available from seven subjects), with ages varying between four and 27 years (fig 1), in four

sibships (fig 2). The head circumference of all affected subjects was noted to be small at

birth and between 7-10 SD below the expected mean when examined by us. All had mental

retardation of moderate severity: the three adults and the adolescent affected were unable to

read or write but could speak simple phrases and had basic self-care skills. With the

exception of intellectual impairment, there were no other neurological problems (including

fits) and motor development had been normal. All eight were in good health and had

growth parameters within normal limits. They were not dysmorphic and no syndrome

diagnosis could be made. No past medical history or environmental causes could be found

to explain the finding of microcephaly. The parents had normal head circumference and

intelligence. Ophthalmologic examination, standard lymphocyte karyotype (400 bands),

and electroencephalogram performed in four affected subjects were normal, and brain scans

in two showed no cerebral malformations or neuronal ectopia.

Molecular genetics

Linkage to the five known MCPH loci was ruled out (data not shown). An autosomal

chromosome screen for regions of shared homozygosity was performed on seven of the


67

eight affected subjects and their parents with the CHLC/Weber Human Screening Set

version 8 (Research Genetics), which contains 365 autosomal microsatellite repeat markers

spaced at approximately 10 cM intervals. PCR amplification of all markers was performed

according to the manufacturer’s specifications using a Roboseq 4200 (MWG BioTech Ltd).

Amplified markers were pooled and electrophoresed on an ABI Prism 377 gene sequencer

(Applied Biosystems) on 4.2% polyacrylamide gels, at 3000 V and 52°C, for 2.5 hours.

Fragment length analysis was undertaken using the ABI Prism Genescan and Genotyper

1.1.1 analysis packages.

RESULTS

A single region of homozygosity common to all seven microcephalic subjects was

identified on chromosome 13q defined by markers D13S787 and D13S1304. Further

refinement of the region was conducted using the following markers selected from the ABI

Linkage Mapping Panel Version I (Applied Biosystems), the Todd Panel,12 and the

Marshfield Linkage Maps: cen – D13S175 – D13S1275 – D13S787 – D13S221 –

D13S1304 – D13S1254 – D13S1244 – D13S217 – D13S120 – D13S171 – D13S1493 – tel.

This defined a shared homozygous region on chromosome 13 at band q12.2 with meiotic

crossovers between markers D13S175-D13S1275 and D13S1254-D13S1244, with the

centromeric and telomeric boundaries of a 9cM region being defined by D13S175 and

D13S1244. Information regarding marker order and relative distances was obtained from

the Marshfield Linkage Maps. The marker order obtained from the Marshfield Linkage

Maps was in agreement with that derived from analysis of the current draft human genome

data.


68

A fully penetrant autosomal recessive mode of inheritance and a disease gene

frequency of 0.003 were assumed. Owing to the complexity of the family structure, equal

allele frequencies were assumed for each marker when calculating the LOD scores and the

maximum number of alleles was set at 4. Pedigree allele inconsistencies were identified

using PedCheck.13 Two point analysis was performed using the LINKAGE analysis

programs14 at θ=0 for markers in the critical region and results are shown in table 1 with the

highest lod score at 6.25 for marker D13S1275.

Novel microsatellite markers to refine the region further were designed using the

Human Genome Browser and the Primer3 program, and designated [human BAC accession

number] [microsatellite repeat unit] [number of unit repeats in the reference BAC], for

example, AL356285TG25 (fig 2). These allowed us to redefine the centromeric boundary

marker as AL139378GT17.

DISCUSSION

Haplotype and LOD score analysis both suggest that the chromosome region 13q12.2,

designated the MCPH6 locus, contains a gene which when mutated causes autosomal

recessive primary microcephaly. Within the larger MCPH6 region of 9 cM there is the

potential candidate gene, fibroblast growth factor 9 (FGF9). In the nervous system of mice,

FGF9 is produced mainly by neurones and may have a role in glial cell growth and

differentiation during development.15 16 The redefinition of the region to 6 cM using novel

microsatellite markers flanking FGF9 resulted in the exclusion of this gene (fig 2). We now

therefore consider that the gene causing this form of autosomal recessive primary

microcephaly must lie within this smaller region of approximately 6 Mb. To date, only the


69

MCPH1 gene, microcephalin, and the MCPH5 gene, ASPM, have been identified.17 18

Future identification of the MCPH6 gene may be aided by an insight into how these

proteins function and interact within the human brain, such as mitotic spindle activity in the

case of ASPM. The discovery of MCPH genes will lead to a greater understanding of

normal and abnormal human fetal cerebral cortex growth, giving potential insights into the

question of how the mammalian cerebral cortex evolved and has become so predominant in

humans, and the wherewithal to offer diagnostic, prenatal, and carrier testing for affected

families.

Acknowledgements

We express our gratitude to the members of the family studied. This work has been funded

by CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior), FACEPE

(Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco), the Wellcome

Trust, and the West Riding Medical Research Trust. We thank the Research Center Aggeu

Magalhães (CPqAM) for permitting us to use their equipment for DNA extraction and the

staff of HGMP for computational assistance.

Electronic-Database Information

URLs for data in this article are as follows:

Center for Medical Genetics, Marshfield Medical Research Foundation available at

http://research.marshfieldclinic.org/genetics/ (for genetic linkage maps).

Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim


70

Human Gene Nomenclature Database, HUGO Gene Nomenclature Committee:

http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/

The draft human genome browser: http://genome.cse.ucsc.edu/

For primer creation (for novel microsatellite markers): http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-

bin/primer/primer3_www.cgi.

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73

Table 1

Two point lod scores at θ = 0 for each marker defining the MCPH6 region at 13q12.2

Marker LOD score at θ = 0

D13S175 - ∞

D13S1275 6.25

D13S787 5.9

D13S221 3.87

D13S1304 2.75

D13S1254 4.29

D13S1244 2.31


74

Figure 1


75

Figure 2


76

LEGENDS OF FIGURES

Figure 1

Six of the eight affected subjects with ages between 4 and 27 years with a diagnosis of

autosomal recessive primary microcephaly.

Figure 2

Genotypes for eight markers used in the study at 13q12.2 arranged centrosome to qter.

Unaffected sibs have been omitted for clarity. Marker order was taken from the Marshfield

linkage map. The boxed region shows the shared region of homozygosity in affected

individuals. The FGF9 gene, indicated by an arrow, is flanked by markers AL139378GT21

and AL139378GT17 and hence is excluded as a candidate gene from the commom

homozygous region in affected subject


77

VI. ARTIGO 3

Microcefalia Primária em Três Famílias Consangüíneas:

Estudos Clínicos e Moleculares

Artigo submetido ao Jornal de Pediatria ________________________________________________________________________


78

Microcefalia Primária em Três Famílias Consangüíneas: Estudos Clínicos

e Moleculares

Primary Microcephaly in Three Consanguineous Families: Clinical and Genetic Studies

Título abreviado: Microcefalia genética em três famílias consangüíneas.

Gabriela F. Leal 1, Elias O. Silva 2

1Mestre em Genética. Médica do Serviço de Genética Médica do Instituto Materno-Infantil

de Pernambuco (IMIP), Recife-PE. Email: [email protected]

2Doutor em Genética. Médico-fundador do Serviço de Genética Médica do Instituto

Materno-Infantil de Pernambuco (IMIP), Professor Adjunto do Departamento de Genética

da Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE.Email: [email protected]

Ambos os autores possuem currículo cadastrado na plataforma Lattes do CNPq e

contribuíram igualmente na realização deste trabalho.

Endereço para correspondência e para contatos pré-publicação:

Dra. Gabriela F. Leal

Serviço de Genética Médica

Instituto Materno-Infantil de Pernambuco

Rua dos Coelhos, 300 - Boa Vista

50070-550 Recife-PE Brasil

Tel: (81) 34132100 Fax: (81) 34237772 Email: [email protected]


79

Fonte financiadora: FACEPE (Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de

Pernambuco) e CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior)

Número de palavras do texto, excluindo-se referências bibliográficas e legendas de figuras: 2.062.


80

Resumo

Objetivo: descrever os aspectos clínicos de três famílias consangüíneas pernambucanas

com microcefalia primária e os aspectos moleculares de uma delas (família 2).

Pacientes e métodos: três famílias consangüíneas pernambucanas, não relacionadas

biologicamente, com microcefalia primária foram estudadas. Os heredogramas e a história

clínica dos afetados foram construídos com base em informações obtidas de seus pais e

outros parentes. Exame físico foi realizado em todos os afetados, seus genitores e na quase

totalidade dos irmãos normais dos afetados. DNA genômico dos afetados da família 2 e de

seus pais foi usado em reações de PCR (polimerase chain reaction) com primers

elaborados para amplificar marcadores microssatélites ligados aos locos já conhecidos de

microcefalia primária. Os marcadores amplificados foram submetidos a eletroforese e seus

alelos analisados.

Resultados e conclusões: nas três famílias, os afetados apresentavam perímetro cefálico

muito reduzido acompanhado de retardo mental e apenas uma paciente (da família 3)

manifestava outras alterações neurológicas, mas sem dismorfias associadas. Estudos

moleculares demonstraram que a microcefalia primária, na família 2, não apresentava

ligação com nenhum dos locos associados a esta condição já mapeados, sugerindo a

existência de pelo menos mais um gene determinante de microcefalia primária.


81

Abstract

Objective: describe the clinical findings in three consanguineous families from Pernambuco

with primary microcephaly, and the molecular studies in one of them (family 2).

Patients and methods: three consanguineous families from Pernambuco, not related one to

another and with primary microcephaly, were studied. The genealogical data and the

clinical history of the affected individuals were obtained from their parents and other

family members. All the affected subjects, almost all their normal siblings, and their parents

were clinically examined. Genomic DNA from the microcephalic persons of family 2 and

from their parents was used in PCR (polimerase chain reaction) reactions with primers

designed to amplify microsatellite markers linked to the known primary microcephaly loci.

Amplified markers were electrophoresed and analysed.

Results and conclusions: in the three families, all the affected subjects presented a small

head circumference with accompaning mental retardation, and only one patient (of family

3) showed other neurological problems. None of the microcephalic individuals had

dysmorphic features. Molecular studies on family 2 revealed that the microcephaly in this

family was not linked to any of the already known primary microcephaly loci, what

suggests that at least one more locus exist associated to this condition.


82

Introdução

Considera-se que um indivíduo apresenta microcefalia quando a medida de seu perímetro

cefálico situa-se mais de três desvios-padrões (DP) abaixo da média populacional para

idade e sexo1. A microcefalia é um sinal clínico encontrado em vários distúrbios com

etiologia ambiental e/ou genética, podendo estar acompanhado de outros defeitos

morfológicos (forma sindrômica) ou não (microcefalia não-sindrômica). Hipóxia perinatal,

infecções congênitas (tais como rubéola, citomegalovirose, toxoplasmose e herpes-virose

tipo 2), exposição intra-uterina a radiação ionizante e a drogas (como álcool e hidantoína), e

fenilcetonúria materna são algumas das causas ambientais de microcefalia 2, 3. A

microcefalia geneticamente determinada pode resultar de alterações monogênicas,

anomalias cromossômicas ou distúrbios multifatoriais 4.

A microcefalia primária (MP) (microcefalia pura, isolada) é uma forma de

microcefalia genética com padrão autossômico recessivo de herança. Os indivíduos

afetados apresentam redução do perímetro cefálico − como conseqüência de uma

diminuição na espessura do córtex cerebral − associado a retardo mental, não se observando

dismorfias, malformações ou outras alterações neurológicas significativas4. A microcefalia

primária é geneticamente heterogênea, com seis locos mapeados previamente em regiões

cromossômicas específicas: MP1 em 8p23 5, MP2 em 19q13 6, MP3 em 9q34 7, MP4 em

15q15-q21 8, MP5 em 1q31 9,10 e MP6 em 13q12.2 11.

Neste trabalho, relatamos os resultados de um estudo clínico-molecular envolvendo

três famílias pernambucanas consangüíneas com microcefalia primária.


83

Pacientes e métodos

As três famílias estudadas não são biologicamente relacionadas. A família 1 é originária do

sertão pernambucano; a 2, do agreste e a família 3 é proveniente da região metropolitana do

Recife. As figuras 1, 2 e 3 representam os heredogramas dessas famílias. As informações

genealógicas foram obtidas com a colaboração de vários membros das famílias, e exame

físico foi realizado em todos os afetados, seus genitores e na quase totalidade dos irmãos

dos afetados. Análise cromossômica com bandeamento G (400 bandas), exame

oftalmológico, tomografia computadorizada crânio-encefálica, eletroencefalograma e testes

para infecções congênitas foram realizados em diversos pacientes das três famílias.

Os estudos moleculares foram realizados com DNA genômico dos afetados da

família 2 e de seus pais. O DNA, obtido a partir de leucócitos do sangue periférico, foi

usado em reações de PCR (polimerase chain reaction) com primers marcados com

fluorescência e elaborados para amplificar marcadores microssatélites ligados aos locos

MP1-MP6. Os marcadores amplificados foram submetidos a eletroforese em seqüenciador

ABI Prism 377 (Applied Biosystems) e análise de tamanho dos seus alelos foi realizada

com os programas de computador ABI Prism Genescan e Genotyper (versão 1.1.1)

(Applied Biosystems).

Resultados

Estudos clínicos

A família 1 continha oito afetados vivos (cinco do sexo masculino e três do feminino), com

idades entre quatro e 27 anos, distribuídos em quatro irmandades (Fig. 1). Na família 2

havia cinco indivíduos microcefálicos vivos (dois masculinos e três femininos), com idades

variando de 15 a 25 anos e distribuídos em duas irmandades (Fig. 2). Na família 3, eram


84

afetados um rapaz e uma moça com 16 e 15 anos de idade respectivamente (Fig. 3). A Fig.

4 mostra fotografia de um paciente de cada família. Todos os afetados das três famílias

nasceram a termo, não havendo intercorrências dignas de nota durante as gestações.

Quando examinados, os pacientes das famílias 1 e 2 apresentavam medidas de perímetro

cefálico com 7-10 e 4-6 DP abaixo da média respectivamente, e, em ambas as famílias, o

retardo mental era moderado. Os adultos e adolescentes afetados não sabiam ler nem

escrever, mas falavam frases simples e tomavam banho, vestiam-se e alimentavam-se

sozinhos. Na família 3, o indivíduo III-4 tinha medida de perímetro cefálico com 6 DP

abaixo da média e retardo mental moderado: conhecia o alfabeto mas não aprendeu a

ler/escrever, apesar de freqüentar escola desde os seis anos de idade. Sua irmã afetada (III-

5) apresentava perímetro cefálico com 8 DP abaixo da média e deficiência mental grave:

não falava palavras inteligíveis, nem tinha controle esfincteriano. Os irmãos III-1, III-2 e

III-3 apresentavam perímetro cefálico com 2-3 DP abaixo da média e nível intelectual

variável − III-1 era intelectualmente normal, enquanto III-2 e III-3 manifestavam retardo

leve (ambos freqüentaram escola desde os seis anos de idade, mas liam precariamente e

foram reprovados várias vezes). Todos os afetados das famílias 1 e 2, assim como o afetado

III-4 da família 3, eram eumórficos, com estatura normal e sem outros problemas

neurológicos além do déficit intelectual. A adolescente afetada III-5 da família 3 também

era eumórfica, mas apresentava espasticidade generalizada. Os genitores de todos os

afetados eram normocéfalos e intelectualmente normais. Análise cromossômica, exame

oftalmológico, eletroencefalograma e testes para infecções congênitas não revelaram

alterações. A tomografia computadorizada crânio-encefálica apenas confirmou a presença

de microcefalia, não tendo sido observadas outras anormalidades.


85

Estudos moleculares

A análise de tamanho dos alelos dos marcadores microssatélites ligados aos locos MP1-

MP6 mostrou que nenhum desses seis locos representavam regiões de homozigose na

família 2, excluindo-se assim a possibilidade de que a microcefalia, nesta família, fosse

causada por mutações em homozigose em gene localizado em um desses seis locos.

Discussão

Descrevemos aqui três famílias consangüíneas com microcefalia genética, com padrão de

herança autossômico recessivo. Todos os afetados apresentavam redução importante do

perímetro cefálico acompanhada de retardo mental, na ausência de

dismorfias/malformações e apenas uma paciente (III-5/família 3) manifestava outros

problemas neurológicos. Além disso, apresentavam desenvolvimento motor normal (com a

exceção de III-5/família 3), eram bem-humorados e tinham convívio social fácil, o que está

de acordo com a observação de que, na microcefalia primária autossômica recessiva, as

habilidades sociais parecem bem menos comprometidas do que as cognitivas. Outras

características encontradas que ajudam a firmar o diagnóstico dessa anomalia são a

presença de consangüinidade, a ausência de um fator ambiental causador de microcefalia, a

história de gestação e parto sem intercorrências, e o achado, na tomografia crânio-

encefálica, de um cérebro simetricamente pequeno mas sem alterações estruturais 4,12.

Os estudos moleculares que realizamos com a família 1 (Leal et al.11) − a primeira

família brasileira com microcefalia primária analisada molecularmente − resultaram no

mapeamento do sexto loco gênico determinante desta condição na região cromossômica

13q12.2. O primeiro gene foi mapeado em 1998 em uma família paquistanesa5 e,

posteriormente, outros quatro foram identificados em outras famílias 6-10. Os genes de MP1


86

e MP5 já foram clonados. A MP1 é causada por mutações em homozigose no gene

microcefalina, que apresenta altos níveis de expressão nas paredes dos ventrículos laterais,

onde células progenitoras dividem-se e originam neurônios que migram para formar o

córtex cerebral 13. Em MP5, mutações em homozigose ocorrem no gene ASPM (abnormal

spindle-like microcephaly associated), envolvido na formação e no funcionamento do fuso

mitótico nos neuroblastos da fase embrionária. Alterações da proteína codificada por esse

gene impedem que neuroblastos em divisão celular progridam além da metáfase,

prejudicando, assim, o desenvolvimento do sistema nervoso central 14.

A análise molecular dafamília 2, ao revelar que a microcefalia, nesta família, não

estava ligada a nenhum dos seis locos mapeados previamente, sugere a existência de um

novo gene associado à microcefalia primária autossômica recessiva aguardando

identificação. Considerando-se a complexidade do desenvolvimento do cérebro, um

processo que envolve um balanço da proliferação, migração e apoptose neuronais 15, já era

esperado que a microcefalia primária apresentasse importante heterogeneidade genética,

entretanto esta heterogeneidade de locos não é acompanhada de uma heterogeneidade

fenotípica correspondente, porquanto todas as famílias em que se mapearam os diferentes

locos apresentavam quadros clínicos bastante semelhantes, não sendo possível, com base

apenas em dados clínicos, diferenciar-se as seis formas entre si 16.

Na família 3, o paciente III-4 apresentava quadro típico de microcefalia primária,

mas sua irmã afetada manifestava retardo neuropsicomotor grave com espasticidade

generalizada, o que viabiliza a hipótese de patologia associada, ainda que não identificada.

Analisando 48 casos (19 familiais, distribuídos em nove famílias, e 29 casos isolados) de

microcefalia não-sindrômica com provável modo de herança autossômico recessivo,

Tolmie et al.17 observaram que sete dos casos isolados e cinco das nove famílias com mais


87

de um afetado apresentavam microcefalia acompanhada de espasticidade e/ou crises

convulsivas, e que a severidade da microcefalia e da espasticidade variava entre as famílias

e também entre irmãos afetados. Contudo, essas famílias, assim como a família 3 aqui

descrita, não foram estudadas com técnicas de DNA. A análise molecular dessas famílias

poderia esclarecer se, eventualmente, genes determinantes de microcefalia estariam

etiologicamente implicados na ocorrência de manifestações neurológicas adicionais. Outro

aspecto relevante relativo à família 3 é o fato de que os irmãos III-1, III-2 e III-3

apresentavam medidas de perímetro cefálico nos limites inferiores de normalidade e dois

deles (III-2 e III-3) exibiam deficiência mental leve, enquanto os perímetros cefálicos de

seus genitores situavam-se em torno da média populacional. Assim, julgamos pertinente

questionar se os fenótipos desses três indivíduos representam manifestações suaves de

mutação em homozigose em um dos genes determinantes de microcefalia primária, ou

manifestações do gene mutante em heterozigose. Esta questão poderia ser elucidada com a

análise molecular desta família, que ainda não foi realizada.

Casais com crianças portadoras de microcefalia são freqüentemente encaminhados

aos serviços de genética médica para avaliação diagnóstica e aconselhamento e uma parcela

substancial dessas crianças consiste de casos esporádicos de microcefalia isolada. Não é

surpreendente que esses casos representem problemas especiais para o aconselhamento

genético. Havendo apenas uma criança afetada na família, sem anomalias associadas que

permitam o diagnóstico de síndrome específica e sem consangüinidade parental, torna-se

difícil discernir se a causa da microcefalia é genética ou ambiental. O mapeamento e a

caracterização molecular dos genes causadores de microcefalia, e a identificação de seus

produtos e funções correspondentes, constituem uma contribuição extraordinária à

compreensão da patogênese da microcefalia. E esses conhecimentos poderão ser utilizados


88

no diagnóstico pré-natal, na detecção de heterozigotos, e no diagnóstico e − possivelmente

no futuro − tratamento dos afetados.

Agradecimentos

Agradecemos às famílias estudadas pela confiança e colaboração, e à CAPES

(Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e à FACEPE (Fundação

de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco) pelo suporte financeiro. As análises

moleculares foram realizadas na Unidade de Medicina Molecular do Hospital St James’s

(Universidade de Leeds - Inglaterra) sob a supervisão dos Drs. Christopher G. Woods e

Emma Roberts, a quem dispensamos agradecimentos especiais.

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91

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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

21 5 6 7 8 109 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 24

1 2 3 4 5

3,4 22,23

= Homem normal; = Mulher normal; = Afetados; = Propósito; = Aborto espontâneo;

= Casamento consangüíneo.

Fig. 1


92

1

1

32 4 6 9 128 117 10

3 421

21 3 4

1 2

Fig. 2


93


94


95

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1

Heredograma da família 1.

Figura 2


Figura 3


Figura 4

Fotografias da região crâniofacial de três pacientes: IV-12 (família 2), III-5 (família 3) e

VI-5 (família 1).


96

VII. CONCLUSÕES GERAIS _________________________________________________________________________


97

CONCLUSÕES GERAIS

Os estudos clínicos de três famílias consangüíneas pernambucanas com microcefalia

primária e a análise molecular de duas delas permitiram as seguintes conclusões:

a) A microcefalia primária é uma entidade nosológica geneticamente heterogênea.

b) Um novo gene associado à microcefalia primária autossômica recessiva (o sexto loco)

foi mapeado em 13q12.2 na família 1 estudada neste trabalho.

c) Os estudos moleculares com a família 2 indicam a existência de pelo menos mais um

gene autossômico recessivo relacionado com microcefalia primária aguardando

identificação.

d) A microcefalia primária é uma entidade nosológica bem definida em que os afetados

apresentam medida de perímetro cefálico com pelo menos 4 desvios-padrões abaixo da

média para idade e sexo e retardo mental associado, na ausência de dismorfias,

malformações ou outros problemas neurológicos além da deficiência intelectual. Contudo,

não se pode excluir de todo a possibilidade de que, eventualmente, genes determinantes de

microcefalia primária estejam etiologicamente implicados na ocorrência de manifestações

neurológicas adicionais.


98

e) Mutações em homozigose em genes para microcefalia primária resultam, comumente,

em microcefalia associada a retardo mental. Entretanto, pode-se questionar se retardo

mental leve associado a um perímetro cefálico no limite inferior de normalidade não seria,

em alguns casos, uma manifestação suave de mutação em homozigose em um desses genes,

ou, alternativamente, uma manifestação do gene mutante em heterozigose.


99

VIII. AS PERSPECTIVAS _________________________________________________________________________


100

AS PERSPECTIVAS

Com os estudos que realizamos neste projeto, surge a perspectiva de darmos

continuidade a esta linha de pesquisa envolvendo as seguintes questões:

a) Por meio da análise dos genes candidatos existentes na região de 6 cM onde se encontra

mapeado o sexto loco de microcefalia primária autossômica recessiva chegar-se-á à

identificação (clonagem) de mais um gene relacionado a esta condição. A eventual

identificação de outras famílias ligadas a este sexto loco poderá permitir o refinamento do

intervalo de 6 cM e, assim, facilitar a identificação/clonagem de mais um gene de

microcefalia primária.

b) Análises de ligação com membros da família 2 empregando-se outros marcadores

autossômicos microssatélites além dos 365 já utilizados na triagem genômica inicial,

provavelmente revelará mais um loco relacionado à microcefalia primária autossômica

recessiva.

c) A análise molecular da família 3 estudada neste trabalho poderá definir se

genes determinantes de microcefalia primária podem estar etiologicamente implicados na

ocorrência de manifestações neurológicas outras além de microcefalia com retardo mental.

Além disso, a análise desta família poderá esclarecer se retardo mental leve associado a um

perímetro cefálico no limite inferior de normalidade não seria, em alguns casos, uma


101

manifestação suave de mutação em homozigose em um desses genes, ou, alternativamente,

uma manifestação do gene mutante em heterozigose.

d) Além das três famílias estudadas neste trabalho há, no Serviço de Genética Médica do

Instituto Materno-Infantil de Pernambuco (IMIP), outras famílias matriculadas com quadro

clínico de microcefalia primária. Estudos de ligação com estas famílias poderão revelar

outros locos associados a esta condição.


102

IX. ANEXOS

_________________________________________________


103

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How to submit your manuscript to JMG

(updated 13th December 2002)

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The Journal of Medical Genetics publishes original research and reviews relevant to medical genetics. The journal particularly encourages submissions on the molecular basis of human disease, human cancer genetics, the clinical manifestations of genetic disorders, applications of molecular genetics to medical practice, and the systematic evaluation of such applications. The journal attempts


104

to handle the review process and publication as expeditiously as possible. The review process is usually completed within 4 weeks (mean 20 days), but can take longer in some instances. Accelerated publication is available where warranted by scientific urgency and importance. Submissions are accepted only on the understanding that they have not been and will not be published elsewhere, and are subject to editorial revision.

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1. Consent All identifiable photographs of patients should be accompanied by written permission for use. Pedigrees, particularly those containing information on people who maybe presymptomatic carriers of later onset disease, should, as far as possible, be anonymised. Patient consent forms can be downloaded from JMG Bench>Press Author Area. These can be uploaded as supplemnetal files or faxed to the Editorial Office (Fax: +44 (0)20 7383 6668)

2. Ethical approval The critical assessment of submitted papers will include ethical considerations; documentary evidence (where relevant) of ethical committee review and approval will be very helpful.

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4. Referees: Authors are welcome to suggest people up to 4 independent reviewers competent to act as referees. Although the journal may not use the suggested referees on that occasion, they will be added to our database. Conversely, authors' wishes on those whom they would prefer not to referee their work will be respected.

Categories of contributions

1. Original papers Represent a substantial body of laboratory or clinical work. The study should be presented in sections, namely:

1. Abstract Should be concise and informative and in 200-250 words, summarise the problem being considered in the study, how the study was performed, the salient results


105

and the principal conclusions of the study. Structured abstracts (in the format used by e.g. the British Medical Journal and the Journal of the American Medical Association) have been shown to be more useful to readers, and their use is encouraged when possible.

2. Key words (maximum of five) These should be given beneath the abstract.

3. Introduction: Description of the background that led to the study.

4. Methods: Details relevant to the conduct of the study. Statistical methods should be clearly explained at the end of this section.

5. Results: Work should be reported in SI units. Undue repetition in text and tables should be avoided. Comment on validity and significance of results is appropriate but broader discussion of their implications should be placed in the next section.

6. Discussion: The nature and findings of the study are placed in context of other relevant, published data. Subheadings that aid clarity of presentation are encouraged.

7. Data access: Reference should be made to availability of detailed data, either through public databases or otherwise, and to availability of materials used for reported investigations. It is generally expected that genomic and similar data should be lodged in appropriate public databases at or before the time of publication. Authors are encouraged to make DNA or cell lines available to other workers. Mutation information: it is recommended that all mutations in any gene be deposited in existing public databases

8. Acknowledgments and affiliations: People with direct involvement in the study but not included in authorship may be acknowledged. The source of financial support and industry affiliations of all those involved should be stated.

9. References: In accordance with the Vancouver agreement these are cited by the numerical system and listed in the order cited in the text, not in alphabetical order by authors' names (In the text, the reference number should be given between square brackets on the line, not superscript.) All authors should be listed. Journal titles are abbreviated in accordance with the style of Index Medicus e.g Tomlinson IP, Beck NE, Homfray T, Harocopos CJ, Bodmer WF. Germline HNPCC gene variants have little influence on the risk for sporadic colorectal cancer. J Med Genet 1997;34:39-42


106

10. Figures should be be numbered consecutively in Arabic numerals. Legends should be typed on a separate sheet.

Black and white illustrations (artwork) should be supplied as (or "exported as") EPS files. Black and white images (photographs) should be supplied as TIFF files, to a minimum of 300 dpi.

Colour images should be formatted as TIFF files, or high quality JPEG files. TIFF files should not exceed 2MB at a minimum resolution of 600 dpi. If you choose a higher resolution your image size should be reduced accordingly to keep the file under 2MB. nb. Scanners may automatically increase image size at a higher resolution.

ALL IMAGES SHOULD BE SUBMITTED TO BENCH>PRESS AS SEPARATE FILES AND NOT EMBEDDED IN THE TEXT.

Please note that the BMJ Publishing Group does not accept powerpoint figures. Hardcopies of the figures may be required by reviewers or if the paper is accepted for publication.

11. Tables should not be included in the body of the text but should uploaded as separate files, each numbered with Arabic numerals. A legend should be provided above the table.

Where possible, tables should be submitted in the same format as your article and as a separate file (DO NOT embed your table(s) in your article). Please note: Bench>Press CANNOT accept Excel files. In extreme circumstances, Excel files can be uploaded as supplementary files, however, we advise against this. Tables should be self-explanatory, and the data they contain must not be duplicated in the text or figures.

12. Illustrations: Colour illustrations can be accepted; however, authors are asked to pay part of the cost. The price for colour in JMG is 72 UK pounds plus VAT per image. We charge authors for origination costs and not for printing costs.

13. Nomenclature: Current standard international nomenclature should be adhered to: Chromosomes: ISCN 1995. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Mitelman F (ed); S Karger, Basel, 1995 Genes: For human genes, use genetic notation and symbols approved by the HUGO Nomenclature Committee. Approved gene symbols may be obtained prior to submission from: Dr Sue Povey, HUGO Nomenclature Committee, The Galton Laboratory University College, London, UK. E-mail :[email protected], Fax: +44 171-387-3496. For nomenclature guidelines, see White et al., 'Guidelines for Human Gene Nomenclature' (Genomics 1997;45:468-471). The Gene Name Proposal form may be completed on the Nomenclature Web page:


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http://www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature/. Human gene names and loci should be written in italicised capital letters and Arabic numerals. Protein products are not italicised. For mouse nomenclature, refer to the International Committee on Standardised Genetics Nomenclature for Mice: http://www.informatics.jax.org/support/nomen/. Enzymes: Enzyme nomenclature: recommendations of the nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry. New York: Academic Press, 1992. Information also available on URL http://expasy.hcuge.ch/sprot/enzyme.html

2. Short reports

A brief communication presenting laboratory or clinical work, collected case reports, or single case reports of clinical or scientific significance. Reports of single mutations at loci which have already been documented will be published only if they are of unusual clinical or biological interest. The format can be identical to Original papers (see above) but in some circumstances the main body of the text may be better presented without division into sections. Brevity and clarity are always likely to enhance the chance of a manuscript being accepted for publication.

3. Review articles

Authors are welcome to discuss possible topics for review directly with the Editor. Submissions of review articles of the type that were published previously in the "Syndrome of the month" format are welcome.

4. Hypothesis articles

Contributions which present an interesting theory, discussed in relation to published data, are welcome.

5. Letters to the Editor

This section includes brief descriptions of significant clinical or laboratory findings. There is no formal word limit on Letters to the Editor and abstracts are not required. However, authors are encouraged to divide the letter into subheadings (e.g. methods, results etc.) as appropriate. In addition, authors may wish to add a textbox summarising their findings. Letters relating to or responding to previously published items in the journal will be shown to those authors, where appropriate.

6. Online mutation reports

OMRs provide an opportunity to publish interesting human gene mutations in a concise format. Human gene mutations may be interesting because of their nature, their epidemiology, the associated phenotype etc. On line publishing provides easy access and expedites publication. On-line mutation reports are intended to publish disease-causing mutations in known genes. In principle these should be significant new mutations (e.g. missense mutations that might provide insights into critical


108

protein domains, founder mutations, mutations associated with an unusual phenotype etc). Known mutations can only be included if important additional information is given (e.g. functional analysis of the mutant protein). The number of mutations reported will depend on the significance of the mutations described and the number of mutations reported previously. However if >20 mutations are known it is expected that OMRs will contain at least 5 new mutations. Avoid figures that do not contribute to the understanding of the mutation, such as sequence electropherograms or SSCP gels. More complex and informative figures such as Southern or northern blots are encouraged. Tables summarizing previously reported mutations are encouraged. Include Genbank numbers for reference sequences. Mutation information: it is recommended that all mutations in any gene be deposited in existing public databases

For more information please request the OMR guidelines from the JMG Editorial Office

Proofs

One page proof will be sent to the author submitting the paper and alterations on the proof, apart from printer's errors, are not permitted. Reprints may be ordered when the proof is returned. Commercial reprints: contact Nadia Gurney-Randall (Tel: +44 (0)20 8346 1339; Fax: +44 (0)20 8371 9314; Email: [email protected]).

A complimentary copy of the journal will be sent to the corresponding author on publication. Where the contribution is electronic-only, the author will receive a toll-free link to their article online


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JORNAL DE PEDIATRIA

Normas de Publicação

Informações Gerais

O Jornal de Pediatria é a publicação científica da Sociedade Brasileira de Pediatria (SBP), com circulação regular desde 1934. Atualmente, sua versão impressa em língua portuguesa atinge quase 20.000 leitores e instituições no Brasil e em toda a América Latina. Todo o conteúdo do Jornal de Pediatria está disponível em português e inglês no site http://www.jped.com.br, que é de livre acesso. O material publicado se destina a elevar o padrão da prática pediátrica e do atendimento médico de crianças e adolescentes em geral, bem como a promover o debate sobre a saúde.

O Jornal de Pediatria aceita a submissão de artigos originais, relatos de casos, artigos especiais e cartas ao editor em português, espanhol e inglês. Os artigos originalmente escritos em português e inglês são publicados, na versão impressa, em português e, no site, em português e inglês. Os artigos escritos em espanhol são publicados, na versão impressa, na língua original e, no site, em português e em inglês, com uma versão em PDF na língua original.

Editoriais e comentários, que geralmente referem-se a artigos selecionados, são encomendados a autoridades em áreas específicas. O Conselho Editorial poderá considerar a publicação de comentários submetidos espontaneamente.

Da mesma forma, profissionais de reconhecida experiência em assuntos de interesse especial para os leitores são em geral convidados a escrever artigos de revisão, que são avaliações críticas e ordenadas da literatura em relação a temas de importância clínica, com ênfase em fatores como causas e prevenção de doenças, seu diagnóstico, tratamento e prognóstico. Metanálises se incluem nesta categoria. Autores não convidados podem também submeter previamente ao Conselho Editorial uma proposta de artigo de revisão, com um roteiro. Se aprovado, o autor pode desenvolver o roteiro e submetê-lo para publicação. Artigos de revisão devem limitar-se a 6.000 palavras, excluindo referências e tabelas. As referências bibliográficas deverão ser atuais e em número mínimo de 30.

Artigos originais incluem estudos controlados e randomizados, estudos de testes diagnósticos e de triagem e outros estudos descritivos e de intervenção, bem como pesquisa básica com animais de laboratório. O texto deve ter entre 2.000 e 3.000 palavras, excluindo tabelas e referências; o número de referências não deve exceder a 30.

Relatos de casos tratam de pacientes ou situações singulares, doenças raras ou nunca descritas, assim como formas inovadoras de diagnóstico ou tratamento. O texto é composto por uma introdução breve que situa o leitor quanto à importância do assunto e apresenta os objetivos da apresentação do(s) caso(s); por um relato resumido do caso; e por comentários que discutem aspectos relevantes e comparam o relato com a literatura. O número de palavras deve ser inferior a 2.000, excluindo referências e tabelas. O número máximo de referências é 15. Recomenda-se não incluir mais de duas figuras. Artigos especiais são textos não classificáveis nas categorias acima, que o Conselho Editorial julgue de especial relevância para a saúde da criança. Sua revisão admite critérios próprios, não havendo limite de tamanho ou exigências prévias quanto à bibliografia. Cartas ao editor são altamente estimuladas. Em princípio, devem comentar, discutir ou criticar artigos publicados no Jornal de Pediatria, mas também podem versar sobre outros temas


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médicos de interesse geral. Também são bem-vindos comunicados de investigação de assuntos relevantes, cujo conteúdo não seja suficientemente desenvolvido para ter sua publicação como artigo original. Recomenda-se tamanho máximo de 1.000 palavras, incluindo referências bibliográficas, que não devem exceder a seis. Sempre que possível, uma resposta dos autores será publicada junto com a carta.

Instruções para envio de material para publicação

O Jornal de Pediatria dá preferência ao envio de material submetido à publicação por correio eletrônico (e-mail), desde que não contenha desenhos ou fotografias digitalizados. Caso o artigo inclua figuras que necessitem ser digitalizadas, o material pode ser enviado por correio comum.

Instruções para envio de material por e-mail:

1. Enviar para: [email protected]

2. Assunto: Escrever o título abreviado do artigo

3. Corpo da mensagem: Deve conter o título do artigo e o nome do autor responsável pelos contatos pré-publicação, seguidos de uma declaração em que os autores asseguram que: a) o artigo é original; b) nunca foi publicado e, caso venha a ser aceito pelo Jornal de Pediatria, não será publicado em outra revista; c) não foi enviado a outra revista e não o será enquanto sua publicação estiver sendo considerada pelo Jornal de Pediatria; d) todos os autores participaram da concepção do trabalho, da análise e interpretação dos dados, de sua redação ou revisão crítica e que leram e aprovaram a versão final; e) não foram omitidas informações sobre quaisquer ligações ou acordos de financiamento entre os autores e companhias ou pessoas que possam ter interesse no material abordado no artigo; f) todas as pessoas que fizeram contribuições substanciais para o artigo, mas não preencheram os critérios de autoria, são citados nos agradecimentos, para o que forneceram autorização por escrito; e reconhecem que a Sociedade Brasileira de Pediatria passa a ter os direitos autorais, caso o artigo venha a ser publicado. (Obs.: Caso o artigo seja aceito para publicação, será solicitado o envio desta declaração com a assinatura de todos os autores.)

4. Arquivos anexados: Anexar dois arquivos separados, contendo respectivamente: (a) resumo, palavras-chave, abstract, keywords, texto e referências bibliográficas, (b) tabelas e gráficos. Esses arquivos devem permitir a leitura pelos programas do Microsoft Office® (Word, Excel e Access).

Instruções para envio de material por correio comum:

1. Enviar para: Jornal de Pediatria Av. Carlos Gomes, 328 - conj. 304 Porto Alegre, RS CEP 90480-000

2. 2. Incluir uma carta de submissão, assinada por todos os autores, assegurando que: a) o artigo é original; b) o artigo nunca foi publicado e, caso venha a ser aceito pelo Jornal de Pediatria, não será publicado em outra revista; c) não foi enviado a outra revista e não o será enquanto sua publicação estiver sendo considerada pelo Jornal de Pediatria; d) todos os autores participaram da concepção do trabalho, da análise e interpretação dos dados, de sua redação ou revisão crítica e que leram e aprovaram a versão final; e) não foram omitidas informações sobre quaisquer ligações ou acordos de financiamento entre os autores e companhias ou pessoas que possam ter interesse no material abordado no artigo; f) todas as pessoas que fizeram contribuições substanciais para o artigo, mas não preencheram


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os critérios de autoria, são citados nos agradecimentos, para o que forneceram autorização por escrito; e reconhecem que a Sociedade Brasileira de Pediatria passa a ter os direitos autorais, caso o artigo venha a ser publicado.

3. O Jornal de Pediatria não se responsabiliza pelo eventual extravio de originais; os autores devem guardar cópia de seus trabalhos enquanto sua publicação estiver sendo considerada pelo Jornal de Pediatria.

4. O original deve ser enviado em três cópias impressas em folha de papel branco, tamanho A4 (210x297mm), com margens de 25mm em ambos os lados, espaço duplo em todas as seções; fonte Times New Roman, tamanho 11; páginas numeradas no canto superior direito, a começar pela página de rosto. Não usar recursos de formatação, tais como cabeçalhos e rodapés. Utilizar preferencialmente Microsoft Word®; caso seja usado um programa diferente, empregar o formato ASCII.

5. Enviar uma cópia do original em disquete ou CD (não usar discos "zip"), que contenha apenas arquivos relacionados ao artigo.

Diretrizes para a Preparação do Original

Orientações gerais: O original - incluindo tabelas, ilustrações e referências bibliográficas - deve estar em conformidade com os "Requisitos Uniformes para Originais Submetidos a Revistas Biomédicas", publicado pelo Comitê Internacional de Editores de Revistas Médicas1-4 (ver a última atualização, de outubro de 2001, disponível em http://www.jped.com.br/port/normas/normas_07.asp). Cada seção deve ser iniciada em nova página, na seguinte ordem: página de rosto, resumo em português, resumo em inglês, texto, agradecimentos, referências bibliográficas, tabelas (cada tabela completa, com título e notas de rodapé, em página separada), gráficos (cada gráfico completo, com título e notas de rodapé em página separada) e legendas das figuras.

A seguir, as principais orientações sobre cada seção:

Página de rosto: (a) título do artigo, conciso e informativo, evitando termos supérfluos e abreviaturas; evitar também a indicação do local e da cidade onde o estudo foi realizado, exceto quando isso for essencial para a compreensão das conclusões; (b) versão exata do título para o idioma inglês; (c) título abreviado (para constar na capa e topo das páginas), com máximo de 50 caracteres, contando os espaços; (d) primeiro e último nome de cada um dos autores e iniciais dos nomes intermediários; (e) titulação mais importante de cada autor; (f) endereço eletrônico de cada autor; (g) informar se cada um dos autores possui currículo cadastrado na plataforma Lattes do CNPq; (h) a contribuição específica de cada autor para o estudo; (i) instituição ou serviço ao qual o trabalho está vinculado; (j) nome, endereço, telefone, fax e endereço eletrônico do autor responsável pela correspondência; (k) nome, endereço, telefone, fax e endereço eletrônico do autor responsável pelos contatos pré-publicação; (l) fonte financiadora ou fornecedora de equipamento e materiais, quando for o caso; (m) contagem total das palavras do texto, excluindo referências bibliográficas, tabelas e legendas das figuras.

Resumo em português: O resumo deve ter no máximo 250 palavras ou 1.400 caracteres, evitando o uso de abreviaturas. O resumo deve ser apresentado também em inglês. Todas as informações que


112

aparecem no resumo devem aparecer também no artigo. O resumo deve estruturado5, conforme descrito a seguir:

Artigo original: Objetivo: Informar por que o estudo foi iniciado e quais foram as hipóteses iniciais, se houve alguma. Definir precisamente qual foi o objetivo principal e informar somente os objetivos secundários mais relevantes. Métodos: Informar sobre o delineamento do estudo (definir, se pertinente, se o estudo é randomizado, cego, prospectivo, etc.), o contexto ou local (definir, se pertinente, o nível de atendimento, se primário, secundário ou terciário, clínica privada, institucional, etc.), os pacientes ou participantes (definir critérios de seleção, número de casos no início e fim do estudo, etc.), as intervenções (descrever as características essenciais, incluindo métodos e duração) e os critérios de mensuração do desfecho. Resultados: Informar os principais dados, intervalos de confiança e significância estatística. Conclusões: Apresentar apenas aquelas apoiadas pelos dados do estudo e que contemplem os objetivos, bem como sua aplicação prática, dando ênfase igual a achados positivos e negativos que tenham méritos científicos similares.

Artigo de revisão: Objetivo: Informar por que a revisão da literatura foi feita, indicando se ela enfatiza algum fator em especial, como causa, prevenção, diagnóstico, tratamento ou prognóstico. Fontes dos dados: Descrever as fontes da pesquisa, definindo as bases de dados e os anos pesquisados. Informar sucintamente os critérios de seleção de artigos e os métodos de extração e avaliação da qualidade das informações. Síntese dos dados: Informar os principais resultados da pesquisa, sejam quantitativos ou qualitativos. Conclusões: Apresentar as conclusões e suas aplicações clínicas, limitando generalizações aos domínios da revisão.

Relato de caso: Objetivo: Informar por que o caso merece ser publicado, com ênfase nas questões de raridade, ineditismo ou novas formas de diagnóstico e tratamento. Descrição: Apresentar sinteticamente as informações básicas do caso, com ênfase nas mesmas questões de ineditismo e inovação. Comentários: Conclusões sobre a importância do relato para a comunidade pediátrica e as perspectivas de aplicação prática das abordagens inovadoras.

Abaixo do resumo, fornecer de três a seis descritores, que são palavras-chave ou expressões-chave que auxiliarão a inclusão adequada do resumo nos bancos de dados bibliográficos. Empregar descritores integrantes da lista de "Descritores em Ciências da Saúde" 6,7, elaborada pela BIREME e disponível nas bibliotecas médicas ou na Internet (http://decs.bvs.br/). Se não houver descritores adequados na referida lista, usar termos novos. Para traduzir os descritores, utilizar a lista de "Medical Subject Headings", publicada pela U.S. National Library of Medicine, do National Institute of Health, e disponível em http://www.nlm.nih.gov/mesh/meshhome.html. Abreviaturas Devem ser evitadas, pois prejudicam a leitura confortável do texto. Quando usadas, devem ser definidas ao serem mencionadas pela primeira vez. Jamais devem aparecer no título e nos


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resumos.

Texto O texto dos artigos originais deve conter as seguintes seções, cada uma com seu respectivo subtítulo: (a) Introdução: deverá ser curta, citando apenas referências estritamente pertinentes para mostrar a importância do tema e justificar o trabalho. Ao final da introdução, os objetivos do estudo devem ser claramente descritos. (b) Métodos: deve descrever a população estudada, a amostra, critérios de seleção, com definição clara das variáveis e análise estatística detalhada, incluindo referências padronizadas sobre os métodos estatísticos e informação de eventuais programas de computação. Procedimentos, produtos e equipamentos utilizados devem ser descritos com detalhes suficientes que permitam a reprodução do estudo. É obrigatória a inclusão de declaração de que todos os procedimentos tenham sido aprovados pelo comitê de ética em pesquisa da instituição a que se vinculam os autores ou, na falta deste, por um outro comitê de ética em pesquisa indicado pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa do Ministério da Saúde8. (c) Resultados: devem ser apresentados de maneira clara, objetiva e em seqüência lógica. As informações contidas em tabelas ou figuras não devem ser repetidas no texto. Usar gráficos em vez de tabelas com um número muito grande de dados. (d) Discussão: deve interpretar os resultados e compará-los com os dados já existentes na literatura, enfatizando os aspectos novos e importantes do estudo. Discutir as implicações dos achados e suas limitações, bem como a necessidade de pesquisas adicionais. As conclusões devem ser apresentadas no final da discussão, levando em consideração os objetivos do trabalho. Relacionar as conclusões aos objetivos iniciais do estudo, evitando assertivas não apoiadas pelos achados e dando ênfase igual a achados positivos e negativos que tenham méritos científicos similares. Incluir recomendações, quando pertinentes. O texto de artigos de revisão não obedece a um esquema rígido de seções. Sugere-se uma introdução breve, em que os autores explicam qual a importância da revisão para a prática pediátrica, à luz da literatura médica. Não é necessário descrever os métodos de seleção e extração dos dados, passando logo para a sua síntese, que, entretanto, deve apresentar todas as informações pertinentes em detalhe. A seção de conclusões deve correlacionar as idéias principais da revisão com as possíveis aplicações clínicas, limitando generalizações aos domínios da revisão. O texto de relatos de caso deve conter as seguintes seções, cada uma com seu respectivo subtítulo: (a) Introdução: apresenta de modo sucinto o que se sabe a respeito da doença em questão e quais são as práticas de abordagem diagnóstica e terapêutica, por meio de uma breve, porém atual, revisão da literatura. (b) Descrição do(s) caso(s): o caso é apresentado com detalhes suficientes para o leitor compreender toda a evolução e seus fatores condicionantes. Quando o artigo tratar do relato de mais de um caso, sugere-se agrupar as informações em uma tabela, por uma questão de clareza e aproveitamento do espaço. Evitar incluir mais de duas figuras. (c) Discussão: apresenta correlações do(s) caso(s) com outros descritos e a importância do relato para a comunidade pediátrica, bem como as perspectivas de aplicação prática das abordagens inovadoras. Agradecimentos Devem ser breves e objetivos, somente a pessoas ou instituições que contribuíram significativamente para o estudo, mas que não tenham preenchido os critérios de autoria. Integrantes da lista de agradecimento devem dar sua autorização por escrito para a divulgação de seus nomes, uma vez que os leitores podem supor seu endosso às conclusões do estudo. Referências bibliográficas


114

As referências bibliográficas devem ser numeradas e ordenadas segundo a ordem de aparecimento no texto, no qual devem ser identificadas pelos algarismos arábicos respectivos entre parênteses. Devem ser formatadas no estilo Vancouver, de acordo com os exemplos listados a seguir: 1. Artigo padrão Morris SS, Grantham-McGregor SM, Lira PI, Assuncao AM, Ashworth A. Effect of breastfeeding and morbidity on the development of low birthweight term babies in Brazil. Acta Paediatr 1999;88: 1101-6. Se houver mais de 6 autores, cite os seis primeiros nomes seguidos de "et al".

2. Livro Lawrence RA. Breastfeeding. 5th ed. St. Louis (MO): CV Mosby; 1999.

3. Capítulo de livro Howard CR. Breastfeeding. In: Green M, Haggerty RJ, Weitzman M, editors. Ambulatory pediatrics. 5th ed. Philadelphia: WB Saunders; 1999. p.109-16.

4. Teses e dissertações Kaplan SJ. Post-hospital home health care: the elderly's access and utilization [tese de doutorado]. St. Louis (MO): Washington Univ.; 1995.

5. Trabalho apresentado em congresso ou similar (publicado) Blank D, Grassi PR, Schlindwein RS, Mello JL, Eckert GE. The growing threat of injury and violence against youths in southern Brazil: A ten year analysis. Abstracts of the Second World Conference on Injury Control; 1993 May 20-23; Atlanta, USA. Atlanta: CDC,1993:137-38.

6. Artigo de revista eletrônica Morse SS. Factors in the emergence of infectious diseases. Emerg Infect Dis [periódico eletrônico] 1995 Jan-Mar [citado1996 Jun 5];1(1). Disponível: www.cdc.gov/ncidod/EID/eid.htm. Acessado: 14 de dezembro de 2001. 7. Materiais da Internet Food and Agriculture Organization of the United Nations. Preparation and use of food based dietary guidelines [site na Internet]. Disponível: www.fao.org/docrep/x0243e/x0243e09.htm#P1489_136013. Acessado: 14 de dezembro de 2001. Obs.: uma lista completa de exemplos de citações bibliográficas pode ser encontrada na Internet, em http://www.icmje.org/ ou http://www.jped.com.br/port/normas/normas_07.asp. Artigos aceitos para publicação, mas ainda não publicados, podem ser citados desde que indicando a revista e que estão "no prelo".

Observações não publicadas e comunicações pessoais não podem ser citadas como referências; se for imprescindível a inclusão de informações dessa natureza no artigo, elas devem ser seguidas pela observação "observação não publicada" ou "comunicação pessoal" entre parênteses no corpo do artigo.

Os títulos dos periódicos devem ser abreviados conforme as abreviaturas do Index Medicus; uma lista extensa de periódicos, com suas respectivas abreviaturas, pode ser obtida através da publicação da NLM "List of Serials Indexed for Online Users", disponível no endereço http://www.nlm.nih.gov/tsd/serials/lsiou.html

Para informações mais detalhadas, consulte os "Requisitos Uniformes para Originais Submetidos a Revistas Biomédicas". Este documento está disponível em http://www.icmje.org/ ou http://www.jped.com.br/port/normas/normas_07.asp Tabelas


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Cada tabela deve ser apresentada em folha separada, numerada na ordem de aparecimento no texto, e com um título sucinto, porém explicativo. Todas as explicações devem ser apresentadas em notas de rodapé e não no título, identificadas pelos seguintes símbolos, nesta seqüência: *, †, ‡, §, ||, . A formatação das tabelas deve utilizar apenas comandos de tabulação ("tab") e nova linha ("enter"). Não usar funções de criação de tabelas, não sublinhar ou desenhar linhas dentro das tabelas, não usar espaços para separar colunas (usar comando de tabulação/"tab"), não usar comandos de justificação, não usar tabulações decimais ou centralizadas. Não usar espaço em qualquer lado do símbolo±.

Figuras (fotografias, desenhos, gráficos) Todas as figuras devem ser numeradas na ordem de aparecimento no texto. Todas as explicações devem ser apresentadas nas legendas. Figuras reproduzidas de outras fontes já publicadas devem indicar esta condição na legenda, assim como devem ser acompanhadas por uma carta de permissão do detentor dos direitos. Fotos não devem permitir a identificação do paciente; tarjas cobrindo os olhos podem não constituir proteção adequada. Caso exista a possibilidade de identificação, é obrigatória a inclusão de documento escrito fornecendo consentimento livre e esclarecido para a publicação. Microfotografias devem apresentar escalas internas e setas que contrastem com o fundo.

As ilustrações são aceitas pelo Jornal de Pediatria em cores para publicação no site. Contudo, todas as figuras serão vertidas para o preto-e-branco na versão impressa. Caso os autores julguem essencial que uma determinada imagem seja colorida mesmo na versão impressa, solicita-se um contato especial com os editores. Imagens geradas em computador, como gráficos, devem ser anexadas sob a forma de arquivos nos formatos .jpg, .gif ou .tif, com resolução mínima de 300 dpi, para possibilitar uma impressão nítida; na versão eletrônica, a resolução será ajustada para 72 dpi. Gráficos devem ser apresentados somente em duas dimensões, em qualquer circunstância. Desenhos, fotografias ou quaisquer ilustrações que tenham sido digitalizadas por escaneamento não costumam apresentar grau de resolução adequado para a versão impressa da revista; assim, devem ser enviadas em versão impressa original (qualidade profissional, a nanquim ou impressora com resolução gráfica superior a 300 dpi), com duas cópias. Nesses casos, no verso de cada figura deve ser colada uma etiqueta com o seu número, o nome do primeiro autor e uma seta indicando o lado para cima.

Legendas das figuras Devem ser apresentadas em página própria, devidamente identificadas com os respectivos números (nas versões impressas, em espaço duplo).

Referências:

1. International Committee of Medical Journal Editors. Uniform requirements for manuscripts submitted to biomedical journals. JAMA 1997;277:927-34. 2. International Committee of Medical Journal Editors. Uniform requirements for manuscripts submitted to biomedical journals. Updated October 2001. Available from: http://www.icmje.org. Acessado 28 de janeiro de 2003. 3. Comitê Internacional de Editores de Revistas Médicas. Requisitos uniformes para originais submetidos a revistas biomédicas. J Pediatr (Rio J) 1997;73:213-24. 4. Comitê Internacional de Editores de Revistas Médicas. Requisitos uniformes para originais submetidos a revistas biomédicas. Atualização de outubro de 2001. Disponível em: http://www.jped.com.br. Acessado 28 de janeiro de 2003. 5. Haynes RB, Mulrow CD, Huth EJ, Altman DJ, Gardner MJ. More informative abstracts revisited. Ann Intern Med 1990;113:69-76. 6. BIREME - Centro Latino-Americano e do Caribe de Informação em Ciências da Saúde. DeCS - Descritores em ciências da saúde: lista alfabética 2ª ed. rev. amp. São Paulo: BIREME, 1992.


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111p. 7. BIREME - Centro Latino-Americano e do Caribe de Informação em Ciências da Saúde. DeCS - Descritores em ciências da saúde. Disponível em: http://decs.bvs.br 8. Ministério da Saúde. Conselho Nacional de Saúde. Resolução no. 196 de 10/10/96 sobre pesquisa envolvendo seres humanos. DOU 1996 Out 16; no. 201, seção 1:21082-21085.

Lista de Checagem

Recomenda-se que os autores utilizem a lista de checagem abaixo para certificarem-se de que todo o material requerido está sendo enviado. Não é necessário anexar a lista.

- Carta de submissão assinada por todos os autores (ou declaração no corpo da mensagem do e-mail) - Original em 3 cópias impressas (dispensado, em caso de envio por e-mail) - Cópia do original em disquete (dispensada, em caso de envio por e-mail) - Página de rosto com todas as informações solicitadas (no corpo da mensagem, em caso de e-mail) - Resumo em português e inglês, com descritores (integrante do primeiro arquivo anexado, em caso de e-mail) - Texto contendo introdução, métodos, resultados e discussão (integrante do primeiro arquivo anexado, em caso de e-mail) - Referências bibliográficas no estilo Vancouver, numeradas por ordem de aparecimento (integrante do primeiro arquivo anexado, em caso de e-mail) - Tabelas numeradas por ordem de aparecimento (integrante do segundo arquivo anexado, em caso de e-mail) - Gráficos numerados por ordem de aparecimento (integrante do segundo arquivo anexado, em caso de e-mail) - Figuras (original e 2 cópias) identificadas (no caso de envio por correio) - Legendas das figuras (integrante do primeiro arquivo anexado, em caso de e-mail) - Inclusão da informação sobre aprovação do trabalho por comitê de ética (no corpo do texto, na seção de Métodos)

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Estudos clínico-moleculares de três famílias Pernambucanas ... · Prof. Dr. Marcos Antônio de Moraes Júnior, Dpto. de Genética, CCB, UFPE Leal GF. Estudos clínico-moleculares