Estudos de oxidação da 2-hidroxi-nevirapina, metabolito do ... · 3 Resumo A nevirapina (NVP) é um inibidor da enzima transcriptase reversa do vírus da imunodeficiência humana

Estudos de oxidação da 2-hidroxi-nevirapina, metabolito do fármaco anti-HIV nevirapina

Muna Cabral Sidarus (Licenciada)

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Química

Júri

Presidente e Orientador: Prof.ª Doutora Maria Matilde Soares Duarte Marques, Departamento de Engenharia Química e Biológica, IST

Vogais: Doutora Alexandra Maria Moita Antunes, REQUIMTE, Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa

Prof.ª Doutora Dulce Elizabete Bornes Teixeira Pereira Simão, Departamento de Engenharia Química e Biológica, IST

Dezembro 2007

2

Agradecimentos

Antes de mais, gostaria de começar por agradecer à Prof. Doutora Matilde Marques pela

oportunidade de trabalho, que representou muito para mim, e pela infinita paciência que

demonstrou.

Agradeço à Doutora Mariana Duarte por tudo o que me ensinou sobre as técnicas

envolvidas neste trabalho, pelo apoio, boa disposição e amizade, embora tenhamos trabalhado

juntas pouco mais de um mês. Agradeço também à Doutora Alexandra Antunes pelos

esclarecimentos sobre o trabalho desenvolvido anteriormente e por alguns conselhos práticos.

Quero ainda agradecer aos colegas presentes no dia-a-dia pela companhia, simpatia e

ajuda, em especial ao Doutor André Ferreira e à Dr.ª Ana Sofia Ferreira, à Dr.ª Cristina Jacob e

ao Dr. Tiago Fernandes. Espero que o espírito de partilha entre os laboratórios 401 e 403

possa manter-se, apesar das dificuldades.

Agradeço à Prof. Doutora Mª Fernanda Carvalho pela disponibilização de algum

equipamento, como o aparelho de IV e ao Prof. Doutor José Ascenso e ao Doutor Konstantin

Luzyanin pela assistência no uso dos aparelhos de RMN. Agradeço ainda à Dr.ª Kamila Koci

pelos espectros de massa. Por fim, agradeço ao Prof. Doutor João Luís Ferreira da Silva pelos

resultados da difracção de raios-X que foram marcantes neste trabalho.

Por último, agradeço à FCT pela bolsa no âmbito do projecto POCI/QUI/56582/2004.

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Resumo

A nevirapina (NVP) é um inibidor da enzima transcriptase reversa do vírus da

imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV–1) cuja hepatotoxicidade está bem documentada.

Neste trabalho pretendeu-se avaliar a possível contribuição do metabolito 2-hidroxi-nevirapina

(2−OH−NVP) para a hepatotoxicidade da NVP. A abordagem utilizada envolveu o estudo da

oxidação da 2−OH−NVP com o intuito de prever o tipo de metabolitos secundários que se

poderão formar in vivo. Em especial, pretendeu-se avaliar a possibilidade daquela estrutura do

tipo fenólico originar catecóis e/ou quinonas, que se sabe terem potencial citotóxico e

genotóxico. A oxidação com sal de Fremy, nitrosodissulfonato de potássio [(KSO3)2NO],

originou a abertura do anel central da NVP e a contracção do anel hidroxilado a um anel de 5

membros, que resultou na formação de 2-ciclopropilamino-N-(4-metil-2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-

-pirrol-3-il)nicotinamida. Os outros produtos de oxidação identificados, as 3-carbamoil-

e 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridinas resultaram de oxidações ainda mais extensas,

envolvendo uma destruição completa da estrutura da NVP, tanto com sal de Fremy como com

óxido de prata, Ag2O. Nenhum dos produtos identificados tem interesse biológico plausível,

visto que não se prevê que este tipo de degradação ocorra in vivo. Estudos enzimáticos

preliminares, utilizando peroxidases, indicaram alguma inactividade do metabolito; contudo,

será ainda necessário confirmar os resultados obtidos. Foram também caracterizados um dos

produtos secundários da síntese da 2−OH−NVP, a 2,5-N-diacetoxi-NVP (di−OAc−NVP), e o

seu produto de hidrólise, a 2,5-N-di-hidroxi-NVP (Ndi−OH−NVP). Atribui-se um maior interesse

ao produto secundário, di−OAc−NVP; com efeito a sua hidrólise parece ter originado o produto

final, 2−OH−NVP, o que poderá levar a novas optimizações do processo de síntese.

Palavras Chave

Nevirapina, 2-hidroxi-nevirapina, fármacos anti-HIV, oxidação, metabolismo,

hepatotoxicidade.

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Abstract

Nevirapine (NVP), an inhibitor of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV–1)

reverse transcriptase enzyme, has been well described as hepatotoxic. The main goal of this

work was to assess the possible contribution of the NVP metabolite, 2-hydroxy-nevirapine

(2−OH−NVP), to NVP hepatoxicity. The study of the metabolite’s oxidation was used to

evaluate the possible formation of secondary metabolites in vivo. In particular, the ability to

obtain catechols and/or quinones from the phenolic-like structure would give good information

about its potential cytotoxic and genotoxic properties. Oxidation with Fremy’s salt,

potassium nitrosodisulfonate [(KSO3)2NO], caused opening of the central NVP ring and

contraction of the hydroxylated ring to a 5-membered ring, originating 2-cyclopropylamino-

-N-(4-methyl-2,5-dioxo-2,5-dihydro-1H-pyrrol-3-yl)nicotinamide. The other oxidation products

identified, 3-carbamoyl- and 3-carboxy-2-cyclopropylamino-pyridine, were a result of lengthier

oxidations, causing total destruction of the NVP backbone, with both Fremy’s salt and silver

oxide, Ag2O. None of the products identified are of plausible biological interest, since this kind of

degradation is not expected to happen in vivo. Preliminary enzymatic studies, using

peroxidases, suggest inactivity of the metabolite substrate, though further confirmation of these

results is required. 2,5-N-diacetoxy-NVP (di−OAc−NVP), one of the secondary products of the

2−OH−NVP synthesis, was also characterised, as well as its hydrolysis product,

2,5-N-dihydroxy-NVP (Ndi−OH−NVP). A greater interest was ascribed to this secondary

product, di−OAc−NVP; in fact, its total hydrolysis seems to have yielded the final product,

2−OH−NVP, which could lead to further optimization of the synthetic method.

Keywords

Nevirapine, 2-hydroxy-nevirapine, anti-HIV drugs, oxidation, metabolism, hepatotoxicity.

5

Índice

Agradecimentos ................................................................................................................ 2

Resumo .............................................................................................................................. 3

Palavras Chave.................................................................................................................. 3

Abstract.............................................................................................................................. 4

Keywords ........................................................................................................................... 4

Índice de Figuras............................................................................................................... 7

Índice de Tabelas ............................................................................................................ 11

Lista de Abreviaturas...................................................................................................... 12

1. Introdução................................................................................................................ 15

1.1. Enquadramento.................................................................................................. 15 1.1.1. O Síndrome da Imunodeficiência Adquirida................................................. 15

1.1.1.1. Os primórdios ......................................................................................................15 1.1.1.2. O que define a SIDA............................................................................................15 1.1.1.3. Os números da pandemia ...................................................................................18

1.1.2. O Vírus da Imunodeficiência Humana ......................................................... 19 1.1.2.1. Modo de acção....................................................................................................19 1.1.2.2. A transmissão......................................................................................................20 1.1.2.3. Objectivo terapêutico...........................................................................................21 1.1.2.4. Terapias ..............................................................................................................22

1.2. A Nevirapina....................................................................................................... 25 1.2.1. Revelância da Nevirapina nos Tramentos Anti-HIV..................................... 25

1.2.1.1. A descoberta .......................................................................................................25 1.2.1.2. Eficácia vs Toxicidade .........................................................................................26 1.2.1.3. A Prevenção da Transmissão Vertical Mãe-Filho................................................29 1.2.1.4. Resistências ........................................................................................................32

1.2.2. Metabolismo ................................................................................................. 34 1.2.3. Os Riscos de Hepato- e Genotoxicidade ..................................................... 37

1.3. Considerações finais.......................................................................................... 40

2. Parte Experimental.................................................................................................. 41

2.1. Métodos Gerais, Materiais e Equipamento........................................................ 41 2.1.1.1. Solventes.............................................................................................................41 2.1.1.2. Reagentes ...........................................................................................................41 2.1.1.3. Soluções tampão.................................................................................................41 2.1.1.4. Cromatografias de camada fina...........................................................................41 2.1.1.5. Cromatografias preparativas de camada fina......................................................42 2.1.1.6. Evaporação e secagem de amostras ..................................................................42 2.1.1.7. Espectros de infravermelhos ...............................................................................42 2.1.1.8. Espectros de massa ............................................................................................42 2.1.1.9. Espectros de ressonância magnética nuclear .....................................................43 2.1.1.10. Pontos de fusão...................................................................................................43

2.2. Síntese da 2−OH−NVP...................................................................................... 43 2.2.1.1. Acetilação............................................................................................................43 2.2.1.2. Cromatografia em coluna ....................................................................................44 2.2.1.3. Hidrólise ..............................................................................................................44

2.3. Oxidação química da 2−OH−NVP ..................................................................... 44 2.3.1.1. Isolamento e purificação dos produtos ................................................................44 2.3.1.2. Aquecimento, arrefecimento e agitação ..............................................................44

6

2.3.2. Óxido de prata, Ag2O ................................................................................... 45 2.3.2.1. Oxidações............................................................................................................45 2.3.2.2. Tratamento das misturas reaccionais..................................................................45

2.3.3. Sal de Fremy ................................................................................................ 46 2.3.3.1. Oxidações............................................................................................................46 2.3.3.2. Tratamento das misturas reaccionais..................................................................48

2.4. Oxidação enzimática da 2−OH−NVP................................................................. 48 2.4.1.1. Peroxidase de rábano .........................................................................................48 2.4.1.2. Lactoperoxidase ..................................................................................................48

3. Resultados e Discussão......................................................................................... 49

3.1. Síntese da 2−OH−NVP...................................................................................... 49 3.1.1. Procedimento ............................................................................................... 49 3.1.2. Mecanismo ................................................................................................... 52 3.1.3. Caracterização dos produtos isolados ......................................................... 54

3.1.3.1. NVP .....................................................................................................................59 3.1.3.2. di−OAc−NVP .......................................................................................................59 3.1.3.3. 2−OAc−NVP........................................................................................................60 3.1.3.4. 2−OH−NVP..........................................................................................................61 3.1.3.5. Ndi−OH−NVP ......................................................................................................62

3.2. Oxidação química da 2−OH−NVP ..................................................................... 63 3.2.1. Óxido de prata, Ag2O ................................................................................... 64 3.2.2. Sal de Fremy ................................................................................................ 66 3.2.3. Caracterização dos produtos de oxidação isolados..................................... 69

3.2.3.1. Nicotinamida XVII ................................................................................................72 3.2.3.2. mO e mU .............................................................................................................73 3.2.3.3. mV.......................................................................................................................74

3.2.4. Mecanismos de oxidação............................................................................. 75 3.3. Oxidação enzimática da 2−OH−NVP................................................................. 77 3.4. Conclusões ........................................................................................................ 79

Bibliografia....................................................................................................................... 80

Anexo I – Espectros de IV .............................................................................................. 85

Anexo II – Espectros de MS ........................................................................................... 89

Anexo III – Espectros de RMN ....................................................................................... 96

7

Índice de Figuras

Figura 1 – O Laço Vermelho é um símbolo de solidariedade para com as pessoas que vivem com VIH/SIDA. (fonte Wikipédia) ...................................................................................... 15

Figura 2 – Esquema da relação entre o número de cópias de HIV por mL de plasma (escala e curva a vermelho) e a contagem de células CD4 por µL de sangue (escala e curva a azul) durante a progressão natural da infecção sem tratamento; de notar que o perfil destas curvas pode apresentar grandes variações. (adaptado de Wikipédia) ............................ 17

Figura 3 – Os números da pandemia em 2006, adaptado do relatório anual da OMS/ONUSIDA. A rubrica mulheres não inclui os números da população infantil, onde se consideram crianças de idade inferior a 15 anos. Os intervalos apresentados definem limites baseados na melhor informação disponível. .................................................................... 18

Figura 4 – Microscopia de varrimento electrónico do HIV–1 durante o processo de gemulação da célula hospedeira numa cultura de linfócitos. (fonte Wikipédia).................................. 20

Figura 5 – Esquema do ciclo de vida do HIV, da entrada na célula à formação duma réplica pela célula infectada. (adaptado de Wikipédia) ................................................................ 23

Figura 6 – Os componentes dum cocktail triplo usual contra o HIV combinado das formulações comerciais Combivir® , que contém os NRTIs AZT (I) e 3TC (II), e Viramune®, que contém o NNRTI NVP (III)................................................................................................. 24

Figura 7 – A estrutura de mais um NRTI, a didanosina ou ddI cuja formulação comercial tem o nome de Videx®................................................................................................................. 26

Figura 8 – A estrutura dum PI, o nelfinavir, cuja formulação comercial tem o nome de Viracept®. .......................................................................................................................... 26

Figura 9 – As estruturas de mais um NRTI e um NNRTI, respectivamente a estavudina ou d4I (VI), cuja formulação comercial tem o nome de Zerit®, e o efavirenz ou EFV (VII), cuja formulação comercial pode ter nomes como Sustiva® ou Stocrin®. ................................. 27

Figura 10 – Frequência de sintomas hepáticos nas primeiras 6 semanas de tratamento com NVP. Nesta representação são postos em evidência os limites de contagens de CD4 avançados pela BI e a FDA para minimizar a ocorrência de efeitos adversos graves pelo uso de NVP. Imagem adaptada dum gráfico apresentado pela BI, coligido a partir de estudos com e sem grupo de controlo.............................................................................. 29

Figura 11 – Os metabolitos da NVP, 2−OH−NVP (VIII), 3−OH−NVP (IX), 4−CO2H−NVP (X), 12−OH−NVP (XI) e 8−OH−NVP (XII). .............................................................................. 35

Figura 12 – Esquema das reacções duma quinona no meio fisiológico. Por um lado, actuando como electrófilo (E+) pode reagir directamente com nucleófilos como as proteínas e o DNA. Por outro lado, devido à sua reactividade redox pode originar ROS por intermédio de ciclos entre as suas formas de hidroquinona e radical semiquinona. As ROS produzidas podem por sua vez levar à oxidação de lípidos, proteínas ou DNA. (adaptado da referência 50) ............................................................................................................... 38

Figura 13 – Esquema representativo das vias potenciais de genotoxicidade duma quinona, onde E+ e ROS correspondem, respectivamente, à acção electrófila da própria quinona ou à acção das espécies de oxigénio reactivas originadas por intermédio de ciclos redox nos quais a quinona está envolvida. GSH corresponde ao nucleófilo glutationa, presente no meio celular, e [NQO1] a enzima NAD(P)H:quinone oxidoreductase dependente dos co-factores NAD(P)H, nicotinamida adenina dinucleótido (fosfato). (adaptado da referência 50) .................................................................................................................... 39

Figura 14 – Esquema reaccional simplificado da síntese do metabolito 2−OH−NVP a partir da NVP. Para efeitos de clarificação, inclui-se a identificação dos anéis e a numeração dos átomos da NVP. ................................................................................................................ 49

8

Figura 15 – Esquema reaccional da síntese da 2−OH−NVP, com produtos intermediários. ..... 51

Figura 16 – Hipótese de mecanismo para a acetilação oxidativa nas condições deste trabalho........................................................................................................................................... 53

Figura 17 – Sobreposição, na zona dos protões aromáticos, dos espectros de 1H−RMN dos compostos isolados na síntese da 2−OH−NVP, incluindo o produto secundário, di−OAc−NVP, e o seu produto de hidrólise, Ndi−OH−NVP.............................................. 55

Figura 18 – Sobreposição, na zona de campo alto, dos espectros de 1H−RMN dos compostos isolados na síntese da 2−OH−NVP, incluindo o produto secundário, di−OAc−NVP, e o seu produto de hidrólise, Ndi−OH−NVP. .......................................................................... 55

Figura 19 – Sobreposição, na zona dos carbonos aromáticos, dos espectros de 13C−RMN dos compostos isolados na síntese da 2−OH−NVP, incluindo o produto secundário, di−OAc−NVP, e o seu produto de hidrólise, Ndi−OH−NVP.............................................. 57

Figura 20 – Isómeros cis e trans da di−OAc−NVP. .................................................................... 59

Figura 21 – Estrutura do novo produto isolado, Ndi−OH−NVP XV, proveniente da hidrólise da di−OAc−NVP; XVI representa um esquema do tipo de protonação que propomos que ocorra para XV. ................................................................................................................. 62

Figura 22 – CCF das m.r.s de MS12 a MS17, da esquerda para a direita, cada uma seguida da sua mistura com o padrão de MP, que se encontra mais à direita. MS12 e 13 foram realizadas em CHCl3, MS14 e 15 em CH2Cl2 e MS16 e 17 em THF. MS12, 14 e 16 foram realizadas unicamente com fase orgânica, enquanto MS13, 15 e 17 também têm tampão. Foram coloridas a vermelho as manchas resultantes do MP e noutras cores produtos que se pensam coincidentes entre as reacções................................................ 65

Figura 23 – CCF de vários produtos isolados. mP e mO, respectivamente nas 1ª e 5ª posições a contar da esquerda são de reacções com Fremy. mT, mU e mV, nas 3ª, 7ª e 8ª posições são produtos de oxidação com Ag2O. As 2ª, 4 e 6ª posições são misturas dos isolados do lado direito e esquerdo. A 9ª posição é a mistura de mV e o padrão de MP, que se encontra-se mais à direita. Foram coloridas as manchas que se pensam coincidentes; rfs idênticos foram comparados através dos espectros de 1H-RMN. ......... 68

Figura 24 – Sobreposição dos espectros de 1H−RMN na zona dos protões aromáticos para o MP, 2−OH−NVP, e os produtos de oxidação caracterizados........................................... 69

Figura 25 – Sobreposição dos espectros de 13C−RMN na zona dos carbonos aromáticos para o MP, 2−OH−NVP, e os produtos de oxidação caracterizados........................................... 71

Figura 26 – Estutura do produto mioritário de oxidação da 2−OH−NVP pelo sal de Fremy. ..... 72

Figura 27 – Estrutura do produto de oxidação extensa da 2−OH−NVP comum aos dois oxidantes, sal de Fremy e Ag2O, a 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina. ....................... 73

Figura 28 – Estrutura doutro produto de oxidação extensa da 2−OH−NVP isolado de reacções com Ag2O, a 3-carbamoil-2-ciclopropilamino-piridina...................................................... 74

Figura 29 – Hipótese de mecanismo de oxidação mediado pelo radical de Fremy, com catálise básica. ............................................................................................................................... 76

Figura 30 – Hipótese de mecanismo de oxidação que dá origem aos produtos de maior degradação oxidativa, para ambos os oxidantes testados............................................... 77

Figura 31 – Espectro de IV da NVP, MP da síntese da 2−OH−NVP.......................................... 85

Figura 32 – Espectro de IV da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP........................................................................................................................................... 85

Figura 33 – Espectro de IV da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP........................................................................................................................................... 86

Figura 34 – Espectro de IV da 2−OH−NVP. ............................................................................... 86

9

Figura 35 – Espectro de IV da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP................ 87

Figura 36 – Espectro de IV do produto de oxidação do sal de Fremy, mAC (=mE=mP), identificado como a nicotininamida XVII. .......................................................................... 87

Figura 37 – Espectro de IV do produto de oxidação de Ag2O, mU, identificado como 3-carboxi- -2-ciclopropilamino-piridina (igual a mO do sal de Fremy). .............................................. 88

Figura 38 – Espectro de IV do produto de oxidação de Ag2O, mV, identificado como 3-carbamoil-2-ciclopropilamino-piridina. ........................................................................... 88

Figura 39 – Espectro de MS-ESI positivo da NVP, MP da síntese da 2−OH−NVP. .................. 89

Figura 40 – Espectro de MS-ESI positivo da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP. ...................................................................................................................... 89

Figura 41 – Espectro de MS-ESI negativo da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP. ...................................................................................................................... 90

Figura 42 – Espectro de MS-ESI positivo da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP. ...................................................................................................................... 90

Figura 43 – Espectro de MS-ESI negativo da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP. ...................................................................................................................... 91

Figura 44 – Espectro de MS-ESI positivo da 2−OH−NVP. ......................................................... 91

Figura 45 – Espectro de MS-ESI negativo da 2−OH−NVP......................................................... 92

Figura 46 – Espectro de MS-ESI positivo da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP..................................................................................................................... 92

Figura 47 – Espectro de MS-ESI negativo da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP..................................................................................................................... 93

Figura 48 – Espectro de MS-ESI positivo do produto de oxidação do sal de Fremy, mE (=mP=mAC), identificado como a nicotininamida XVII. .................................................... 93

Figura 49 – Espectro de MS-ESI negativo do produto de oxidação do sal de Fremy, mE (=mP=mAC), identificado como a nicotininamida XVII. .................................................... 94

Figura 50 – Espectro de MS-ESI positivo do produto de do sal de Fremy, mO, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mU do Ag2O)............................................. 94

Figura 51 – Espectro de MS-ESI positivo do produto de oxidação de Ag2O, mU, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mO do sal de Fremy). .................... 95

Figura 52 – Espectro de MS-ESI positivo do produto de oxidação de Ag2O, mV, identificado como 3-carbamoil-2-ciclopropilamino-piridina. ................................................................ 95

Figura 53 – Espectro de 1H-RMN (em acetona) da NVP, MP da síntese da 2−OH−NVP. ........ 96

Figura 54 – Espectro de 13C-RMN (em acetona) da NVP, MP da síntese da 2−OH−NVP. ....... 96

Figura 55 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP...................................................................................................... 97

Figura 56 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP...................................................................................................... 97

Figura 57 – Espectro de 1H-RMN (em acetona) da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP...................................................................................................... 98

Figura 58 – Espectro de 13C-RMN (em acetona) da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP...................................................................................................... 98

Figura 59 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) da 2−OH−NVP. ................................................. 99

Figura 60 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) da 2−OH−NVP................................................. 99

10

Figura 61 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP................................................................................................................... 100

Figura 62 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP................................................................................................................... 100

Figura 63 – Espectro de 1H-RMN (em acetona) do produto de oxidação do sal de Fremy, mE (=mP=mAC), identificado como a nicotininamida XVII. .................................................. 101

Figura 64 – Espectro de 13C-RMN (em acetona) do produto de oxidação do sal de Fremy, mE (=mP=mAC), identificado como a nicotininamida XVII. .................................................. 101

Figura 65 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) do produto de do sal de Fremy, mO, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mU do Ag2O). ............................... 102

Figura 66 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) do produto de do sal de Fremy, mO, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mU do Ag2O). ............................... 102

Figura 67 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) do produto de oxidação de Ag2O, mU, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mO do sal de Fremy).103

Figura 68 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) do produto de oxidação de Ag2O, mU, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mO do sal de Fremy).103

Figura 69 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) do produto de oxidação de Ag2O, mV, identificado como 3-carbamoil-2-ciclopropilamino-piridina. ........................................... 104

Figura 70 – Espectro de 13C-RMN (em acetona) do produto de oxidação de Ag2O, mV, identificado como 3-carbamoil-2-ciclopropilamino-piridina. ........................................... 104

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Índice de Tabelas

Tabela 1 – Condições das reacções de oxidação da 2−OH−NVP com Ag2O............................ 46

Tabela 2 – Condições das reacções de oxidação com sal de Fremy......................................... 47

Tabela 3 – Atribuições dos sinais de 1H−RMN dos produtos isolados na síntese .................... 56

Tabela 4 – Atribuições dos sinais de 13C−RMN dos produtos isolados na síntese.................... 57

Tabela 5 – Resumo dos fragmentos positivos obtidos por MS-ESI dos produtos isolados na síntese............................................................................................................................... 58

Tabela 6 – Resumo dos fragmentos negativos obtidos por MS-ESI dos produtos isolados na síntese............................................................................................................................... 58

Tabela 7 – Resultados das reacções de oxidação da 2−OH−NVP com Ag2O........................... 64

Tabela 8 – Resultados das reacções de oxidação com sal de Fremy ....................................... 67

Tabela 9 – Atribuições dos sinais de 1H−RMN dos produtos de oxidação................................. 70

Tabela 10 – Atribuições dos sinais de 13C−RMN dos produtos de oxidação ............................. 71

Tabela 11 – Resumo dos fragmentos positivos e negativos obtidos por MS-ESI dos produtos de oxidação....................................................................................................................... 72

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Lista de Abreviaturas

Devido ao uso generalizado da língua inglesa no meio científico, mas também no

dia-a-dia, serão utilizadas ao longo deste trabalho várias abreviaturas na sua forma inglesa

mais usual. Aqui apresentam-se as siglas por ordem alfabética da abreviatura mais utilizada no

texto seguida do seu significado em português. Nos casos onde foram utilizadas as siglas

inglesas, a expressão correspondente encontra-se entre parêntesis. Em casos pontuais não se

apresentam os significados em português por serem siglas muito específicas.

AcOEt – acetato de etilo

AgOAc – acetato de prata

AZT – azidotimidina ou zidovudina ou ZDV

BI – Boehringer Ingelheim

CD4 – linfócitos T CD4+

CCF – cromatografia em camada fina

CYP – citocromo P450 13C-RMN – ressonância magnética nuclear de carbono-13

D – coeficiente de distribuição

ddI – didanosina

DMSO – dimetilsulfóxido

DNA – ácido desoxirribonucleico (deoxyribonucleic acid)

d4T – estavudina

E+ – espécie electrófila

EFV – efivarenz

EI – ionização por impacto electrónico

ESI – ionização por electrospray

eq – equivalente

Et2O – éter dietílico

EUA – Estados Unidos da América

FDA – Food and Drug Administration

GRID – gay-related immune deficiency

GSH – glutationa

HAART – terapias antiretrovirais de alta eficiência (highly active antiretroviral therapy)

HIV (VIH) – vírus da imunodeficiência humana (human immunodeficiency virus)

HIV+ – estatuto de seropositividade de um indivíduo que apresenta anti-corpos para o HIV

HMBC – correlação heteronuclear a mútliplas ligações (heteronuclear multiple bond correlation)

HRP – peroxidase de rábano (horseradish peroxidase)

13

HSQC – correlação heteronuclear de quantum simples (heteronuclear single quantum correlation)

1H-RMN – ressonância magnética nuclear de protão

IV – infravermelho

J – constante de acoplamento

LAV – lymphadenopathy associated virus

M – peso molecular

MeOH – metanol

MP – material de partida

m.r. – mistura reaccional

MS – espectro de massa (mass spectrum)

MTCT – transmissão vertical de mãe para filho (mother-to-child transmission)

m/z – razão massa/carga

NADH – nicotiniamida adenina dinucleótido (nicotinamide adenine dinucleotide)

NADPH – nicotiniamida adenina dinucleótido fosfato (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)

nH – área relativa, como número de protões

NNRTI – inibidores da transcriptase reversa não nucleósidos (non nucleoside reverse transcriptase inhibitors)

NOESY – espectroscopia de amplificação nuclear de Overhauser (nuclear Overhauser enhancement spectroscopy)

NQO1 – NAD(P)H:quinone oxidoreductase

NRTI – inibidores da transcriptase reversa análogos dos nucleósidos (nucleoside reverse transcriptase inhibitors)

NtRTI – inibidores da transcriptase reversa análogos dos nucleótidos (nucleotide reverse transcriptase inhibitors)

NVP – nevirapina

OMS – Organização Mundial de Saúde

ONUSIDA – Programa Conjunto das Nações Unidas sobre o VIH/SIDA

PA – ponto de aplicação

PAH – hidrocarboneto policíclico aromático (policyclic aromatic hydrocarbon)

PI – inibidores da protease (protease inhibitors)

pka – logaritmo de base 10 da constante de acidez

rf – factor de retenção (retention factor)

RMN – ressonância magnética nuclear

RNA – ácido ribonucleico (ribonucleic acid)

ROS – espécies de oxigénio reactivas (reactive oxygen species)

RTI – inibidores da transcriptase reversa (reverse transcriptase inhibitors)

SIDA (AIDS) – síndrome da imunodeficiência humana adquirida (acquired immune deficiency syndrome)

THF – tetra-hidrofurano

14

UV – ultravioleta

3TC – lamivudina

δ – desvio químico

λ – comprimento de onda

ν – número de onda

15

1. Introdução

1.1. Enquadramento

1.1.1. O Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

1.1.1.1. Os primórdios 1, 2, 3

O alerta foi dado em 1981 nos Estados Unidos da

América (EUA) quando grupos de homossexuais de Los

Angeles e Nova Iorque começaram a ser afectados por

doenças pouco comuns. Foram detectados casos de

pneunomia por pneumocystis jirovecii (antes conhecido

por carinii) e de sarcoma de Kaposi, que são muito raros

em indivíduos saudáveis. Nesta altura, chegou a

denominar-se aquele quadro clínico por GRID,

Gay-Related Immune Deficiency, uma expressão sem

tradução simples em português, mas que mostra

claramente a relação que se estabelecia entre aquela

imunodeficiência e o grupo alvo detectado até então, a

comunidade homossexual masculina. Contudo, em breve

seriam descritos casos semelhantes em utilizadores de

drogas injectáveis e em pouco tempo o estranho

fenómeno estendeu-se a doentes hemofílicos, ou outros

indivíduos que tivessem necessitado de transfusões sanguíneas ou recebido produtos

derivados do sangue. Já em meados de 1982 foi introduzida a designação Síndrome da

Imunodeficiência Humana Adquirida (SIDA), embora inicialmente tenham coexistido várias

denominações, e apareceram as primeiras definições.

Com relativa rapidez começou a haver relatos de casos semelhantes por todo o mundo,

fazendo com a SIDA deixasse de ser encarada como um problema de saúde isolado. Em 1985,

a Organização Mundial de Saúde (OMS) reuniu cientistas e profissionais de saúde para que se

definissem estratégias globais para a prevenção e controlo da SIDA. No entanto, a associação

inicial entre a doença e comportamentos condenáveis pelas morais vigentes na maior parte das

culturas, foi e é ainda hoje responsável por parte da estigmatização dos doentes com SIDA e

portadores do Vírus da Imunodeficiência Humana (VIH ou HIV) e também pela dificuldade em

criar uma consciência global da pandemia que se instalou.

1.1.1.2. O que define a SIDA 1, 2

A doença designada por SIDA e que está associada ao HIV, não é, por assim dizer uma

única doença, mas um quadro clínico no qual um conjunto de patologias, que são raras na

população em geral, podem afectar em simultâneo um único indivíduo. A destruição

Figura 1 – O Laço Vermelho é um símbolo de solidariedade para com as pessoas que vivem com VIH/SIDA. (fonte Wikipédia)

16

progressiva do sistema imunitário por parte do vírus cria uma grande vulnerabilidade a

qualquer tipo de infecção oportunista e a certos tumores e cancros.

Como veremos em maior detalhe, soube-se desde cedo que o HIV era um vírus muito

contagioso, embora com vias de contágio bastante específicas, como através do sangue,

fluidos corporais e do contacto com algumas mucosas. As características das vias de contágio

estabelecidas contribuíram para que a SIDA tenha sido considerada durante décadas, uma

doença exclusiva de certos grupos de risco, já de si marginalizados pela sociedade, como os

homossexuais e os toxicodependentes. Porém, hoje em dia, como consequência da

globalização do VIH/SIDA não podemos ver a epidemia na mesma óptica. Actualmente há, em

especial, zonas onde a taxa de incidência é enorme, como em geral por toda a África

sub-Sahariana. Subsistem grupos de risco, mas estes são fortemente dependentes da região e

respectivas práticas culturais, para além das campanhas de sensibilização e das medidas de

prevenção que as organizações mundiais e os governos locais vão fazendo. Presentemente,

os heterossexuais vieram mesmo a tornar-se no grupo com maior incidência numa larga

maioria de países devido a práticas como a prostituição e à negação e falta de

consciencialização relativamente à infecção pelo HIV.

Como veremos também, o vírus foi isolado pouco tempo depois dos primeiros relatos da

doença, o que permitiu começar a compreender a sua actuação e traçar guias sobre como

atacar a sua evolução. Contudo a relação entre o HIV e a SIDA foi admitida inicialmente sem

todas as verificações “clássicas” para agentes patogénicos, devido às características

específicas do próprio vírus e da respectiva doença. Por essa razão, persistem ainda hoje

vozes discordantes sobre a relação entre a doença e o vírus e sobre o grau de contágio do

HIV. Essa discussão fica fora do âmbito deste trabalho, ainda mais porque o conhecimento

existente hoje em dia deixa muito pouca margem para dúvidas4. A quem se interessar por esta

discussão recomenda-se a leitura dum pequeno capítulo dum livro de leitura fácil e repleto de

referências, Nine Crazy Ideas in Science, de Robert Ehrlich5. Uma das dificuldades na relação

entre o HIV e a SIDA é a possibilidade de um tempo de latência do vírus muito prolongado, que

pode ser superior a uma década. Outras dificuldades residem no facto de ser um retrovírus e

como tal não se comportar da mesma forma que as bactérias em cultura, para além de não

afectar todas as espécies animais da mesma forma. Por outro lado a complexidade da doença

torna difícil defini-la, o que se constata pela constante actualização e variadas definições.

Hoje em dia a maioria das definições da SIDA pressupõe geralmente que se verifiquem,

pelo menos, as seguintes condições:

� ser seropositivo, ou HIV+, o que significa que são detectáveis anticorpos do HIV no

sangue;

� ter uma contagem dos linfócitos CD4+ inferior a 200/µL de sangue.

17

Existe também uma listagem de doenças que pode definir o diagnóstico de SIDA,

contudo essa listagem tem maior utilidade na avaliação do estádio da doença do que para

definir um diagnóstico em si. Ainda que ela também pudesse ter interesse para os profissionais

de saúde a trabalhar em zonas sem condições de obter resultados laboratoriais, há que ter em

conta que as infecções oportunistas mais frequentes poderão variar de acordo com os locais,

pelo que uma listagem deste tipo não pode ser universal. Um diagnóstico de SIDA mantém-se

mesmo que a contagem de CD4 volte a subir e/ou que sejam curadas eventuais doenças

relacionadas com a SIDA.

Em especial nos países de fracos recursos económicos, nem sempre estão disponíveis

meios fiáveis de detecção da presença de anticorpos ou da carga viral, medida geralmente

pelo RNA viral. A medição directa do DNA viral ou a sua amplificação são métodos ainda mais

dispendiosos. Contudo a contagem de células do sistema imunitário pode ser mais acessível e

por isso se tornou importante compreender de que forma se relacionam estas variáveis, para

poder melhor definir diagnósticos e tratamentos em todo o mundo. A variação destes

indicadores encontra-se esquematizada na Figura 2.

A partir da Figura 2 figura podem identificar-se os vários estádios da infecção pelo HIV.

Inicialmente, existe uma fase de infecção relativamente rápida, muito virulenta, e que é também

a fase de maior probabilidade de contágio, embora o estado serológico do indivíduo seja ainda

negativo. Nesta fase podem ocorrer sintomas equivalentes a um estado gripal, mas a sua

frequência e variabilidade é de tal ordem que não podem servir como diagnóstico. De seguida,

Figura 2 – Esquema da relação entre o número de cópias de HIV por mL de plasma (escala e curva a vermelho) e a contagem de células CD4 por µL de sangue (escala e curva a azul) durante a progressão natural da infecção sem tratamento; de notar que o perfil destas curvas pode apresentar grandes variações. (adaptado de Wikipédia)

18

há um duma inflexão dos valores tanto de CD4 como da carga viral, que corresponde a uma

primeira resposta do sistema imunitário, na qual são criados anticorpos e a infecção é

parcialmente controlada. É somente após esta fase que o teste sanguíneo passa a dar HIV+;

o tempo entre o contágio e a seroconversão geralmente demora entre 3 a 6 meses. Após estas

primeiras fases, atinge-se um patamar de progressão lenta da carga viral, no início do qual os

valores de CD4 se situam ainda dentro do limiar do saudável. O tempo desta fase de latência é

o mais variável e pode chegar a décadas. Por fim, há uma fase de escalada da carga viral

quando se dá o colapso do sistema imunitário devido à diminuição excessiva dos linfócitos

CD4; a SIDA instala-se e a progressão é rápida, podendo levar à morte em menos de 1 ano.

1.1.1.3. Os números da pandemia

PPPeeessssssoooaaasss aaa vvviiivvveeerrr cccooommm HHHIIIVVV eeemmm 222000000666

dddaaasss qqquuuaaaiiisss mmmuuulllhhheeerrreeesss

dddaaasss qqquuuaaaiiisss cccrrr iiiaaannnçççaaasss

NNNooovvvaaasss iiinnnfffeeecccçççõõõeeesss pppooorrr HHHIIIVVV eeemmm 222000000666


MMMooorrrttteeesss dddeeevvviiidddaaasss aaa SSSIIIDDDAAA eeemmm 222000000666


...............................................................

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

...............................................................

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...............................................................

... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...

333999,,,555 mmmiiilllhhhõõõeeesss [34,1 – 47,1]

111777,,,777 mmmiii lllhhhõõõeeesss [15,1 – 20,9]

222,,,333 mmmiii lllhhhõõõeeesss [1,7 – 3,5]


555333000 mmmiii lll [410 – 660]


333888000 mmmiii lll [290 – 500]

Figura 3 – Os números da pandemia em 2006, adaptado do relatório anual da OMS/ONUSIDA6. A rubrica mulheres não inclui os números da população infantil, onde se consideram crianças de idade inferior a 15 anos. Os intervalos apresentados definem limites baseados na melhor informação disponível.

Segundo o relatório6 mais recente da OMS e da ONUSIDA – Programa Conjunto das

Nações Unidas sobre o VIH/SIDA, hoje em dia parece estar-se no bom caminho no sentido

dum esforço global para gerir esta epidemia, incluindo a melhor acessibilidade a tratamentos

eficazes e a programas de prevenção. Todavia, segundo o mesmo relatório e ao contrário do

que se poderia pensar, o número de pessoas a viver com o HIV não parou de aumentar, assim

como as mortes associadas à SIDA. O número de adultos e crianças infectadas aumentou em

cerca de 400 mil entre 2004 e 2006, situando-se nos 4,3 milhões. Este valor encontra-se

incluído no total de quase 40 milhões a viver com o HIV em 2006 e que corresponde a uma

prevalência de 1,0% na população adulta mundial (15-49 anos). As estatísticas apontam para

que 40 % da população infectada dita adulta, ou seja com mais de 15 anos, pertença à faixa

etária dos 15 aos 24 anos. Há que ter isto em conta quando se analisa a percentagem de

mulheres que corresponde a metade (48 %) da população adulta infectada e que por isso

19

estará na sua maioria em plena idade fértil, donde os grandes aumentos nas taxas de

infecções em crianças, em especial na África sub-Sahariana. São mesmo impressionantes os

dados para esta zona do planeta, pois quase dois terços (63 %) dos indivíduos infectados a

nível mundial se encontram nesta região e quase três quartos (72 %) das mortes causadas

pela SIDA no ano de 2006 se concentraram na África sub-Sahariana.

As difíceis condições politico-económicas encontradas na maioria dos países da África

sub-Sahariana têm tornado a sua população num alvo fragilizado para a infecção por HIV

originando consequentemente um novo foco de mortes por SIDA, o que nos países

desenvolvidos já está mais controlado. Naqueles países rege sobretudo a falta de informação e

de meios de prevenção do contágio e em certos locais, para piorar, uma miríade de

desinformação e mistificação extremamente perigosas, que têm levado a uma explosão dos

contágios sem precedentes. Para além do mais, a percentagem de população devidamente

testada é reduzidíssima e muito inferior é a percentagem de população tratada. Contudo várias

organizações mundiais têm vindo a realizar inúmeras iniciativas junto dos governantes e

sobretudo directamente junto da população, daí a introdução tendencialmente optimista do

relatório anteriormente referido, pois na verdade já se percorreu um longo caminho no sentido

de melhorar esta e outras situações de desigualdade.

Nos países ditos ricos, a SIDA tornou-se uma doença crónica, tendo vindo a ser

consideravelmente prolongada a esperança de vida dos doentes. Por outro lado, de maior

impacto e mais desejável é a possibilidade de prolongar a latência do vírus evitando mesmo

que a doença se instale, mantendo a carga viral em valores residuais através das actuais

terapias antiretrovirais de alta eficácia (HAART – highly active antiretroviral therapy). Contudo

estas terapias, em especial, são ainda muito dispendiosas e por isso não estão acessíveis a

todos. Como veremos com um pouco mais de detalhe na próxima secção, os tratamentos

antiretrovirais são usualmente “cocktails” de drogas que atacam o vírus impedindo a sua

replicação. Uma vacina para o HIV tem sido esperada, mas mostra-se difícil de atingir devido

às características específicas do retrovírus.

1.1.2. O Vírus da Imunodeficiência Humana

1.1.2.1. Modo de acção 1, 2

O vírus responsável pela nova doença detectada a partir de 1981, foi identificado em

1983 por uma equipa do Institut Pasteur liderada por Luc Montagnier, tendo sido inicialmente

designado por LAV - Lymphadenopathy Associated Virus7. Os avanços rápidos obtidos naquela

altura, só foram possíveis devido ao empenho e trabalho de conjunto de vários especialistas,

entre cientistas e clínicos e às colaborações com grupos doutros países8.

O isolamento do HIV permitiu uma rápida compreensão do seu mecanismo de acção,

desde a infecção até à fase da SIDA, e a definição dos alvos a atacar. Duma forma

simplificada, o HIV atinge algumas células do sistema imunitário, sobretudo os linfócitos CD4,

20

e ao usá-las para se replicar origina a sua destruição. Com o tempo, a diminuição da contagem

das células CD4 é acompanhada por um aumento das partículas de HIV no plasma, a carga

viral. Como anteriormente representado na Figura 2, a relação entre aqueles indicadores não é

tão simples e varia fortemente ao longo da infecção. Na Figura 4, pode ver-se uma imagem do

vírus durante o processo de gemulação, o que corresponde à fase na qual um novo vírus se

destaca do linfócito após replicação. Mais adiante na Figura 5 (pg. 23) pode encontrar-se uma

representação mais detalhada da actuação do vírus numa célula alvo.

Sem terapia antiretroviral, o tempo

médio de progressão da infecção pelo

HIV até à instalação da SIDA é de cerca

de uma década e o tempo médio de

sobrevivência depois de adquirir a

doença é de cerca de 9 meses. Contudo

há uma variabilidade enorme nestes

valores, pois para além de haver pessoas

que podem ter um sistema imunitário

mais frágil ou fragilizado, há no sentido

inverso factores genéticos que podem

contribuir para uma maior resistência ao

vírus. Por outro lado, tanto a

susceptibilidade à infecção como a sua progressão e posterior instalação da doença dependem

da espécie e da estirpe do HIV. Para além de haver duas espécies do vírus, o HIV–1 e o HIV–2

(pouco comum), existem ainda vários sub-tipos e estirpes; no caso do HIV–1 os sub-tipos mais

correntes são os A, B, C, D9,10. Convém ter em mente que a grande variabilidade genética do

HIV, embora só apresente 9 genes, advém sobretudo das suas naturalmente elevadas taxas

de replicação e de mutação9.

1.1.2.2. A transmissão 1, 2

Simplificando, pode dizer-se que a transmissão do HIV se dá pelo contacto com fluidos e

tecidos infectados. Contudo, para realçar os chamados “comportamentos de risco”, embora

duma forma muito generalista, estão definidas 3 vias de contágio:

�� o contacto sexual;

�� o contacto com fluidos e tecidos - seja devido à partilha de seringas infectadas ou

à transfusão de sangue infectado ou produtos derivados ou ainda à exposição dos

profissionais de saúde e outros profissionais que lidem com pessoas infectadas;

�� a transmissão vertical da mãe para o filho (MTCT) – que pode ser pré-natal,

perinatal ou pós-natal.

Figura 4 – Microscopia de varrimento electrónico do HIV–1 durante o processo de gemulação da célula hospedeira numa cultura de linfócitos. (fonte Wikipédia)

21

Detalhando a MTCT (sigla que corresponde à designação inglesa mother-to-child

transmission), que é a mais importante no âmbito deste trabalho, esta pode ser:

�� intra-uterina, pelo sangue da mãe que passa para o bebé através da placenta;

�� durante o parto, devido especialmente ao contacto com as mucosas vaginais;

�� através da amamentação, pois o vírus está presente no leite materno.

As estatísticas apresentadas num artigo de revisão de 200711 indicam que cerca de 1/3

da MTCT seja resultante da amamentação enquanto os restantes 2/3 se dão antes ou durante

o parto, sendo que estes se repartem em cerca de 1/3 antes do parto e 2/3 durante o parto.

Isto corresponde a uma percentagem de cerca de 45 % de MTCT no parto em si. No mesmo

artigo apresentam-se taxas de MTCT naturais, isto é sem qualquer intervenção, de 15-30 % na

Europa e EUA e 25-40 % na África sub-Sahariana. É muito corrente o uso dum valor

aproximado de 25 % para a MTCT natural, contudo há que ter em conta que embora por vezes

pareçam curiosamente baixas estas taxas são bastante variáveis.

Mesmo sem medicação, há alguns procedimentos relativamente simples que podem ser

seguidos como forma de reduzir significativamente o risco de MTCT, como é o caso da

cesariana e da alimentação através de aleitação artificial. Porém, e mais uma vez no caso dos

países de fracos recursos, estes procedimentos podem não se apresentar como alternativas

fiáveis, pois o risco duma intervenção como a cesariana pode representar um risco

grandemente acrescido para a mãe e o uso de aleitação artificial pode ser impossibilitado tanto

pelo sua inexistência no terreno como pela falta de água apropriada para a sua preparação.

Curiosamente, estudos realizados levaram a concluir que há um maior risco numa alimentação

mista que na amamentação exclusiva e por isso em certas circunstâncias a amamentação

pode representar um risco menor. As organizações mundiais envolvidas na luta contra o

VIH/SIDA têm-se mantido atentas e vários estudos tem sido desenvolvidos nesta área de forma

a avaliar melhor os prós e contras dos vários tipos de alimentação dos recém-nascidos, face às

situações dos vários países onde as alternativas são escassas.

1.1.2.3. Objectivo terapêutico 1, 2

Do isolamento do vírus à compreensão do mecanismo da doença o passo não foi longo

e cedo se definiram os alvos da terapia a desenvolver. Porém, desde a “declaração de ataque”

à replicação do vírus até se conseguir obter resultados verdadeiramente encorajadores e com

repercussão clara na qualidade de vida dos pacientes houve um longo caminho a percorrer.

Os primeiros resultados foram desoladores; terapias constituídas por uma única

substância com comprovada eficácia antiviral in vitro, como por exemplo o AZT (I, Figura 6,

pg. 24, azidotimidina, simplesmente zidovudina ou ZDV), embora pudessem diminuir a carga

viral não permitiam uma sustentabilidade de resultados que levasse a uma melhoria

significativa e continuada dos doentes de SIDA, pois para além dos efeitos secundários por

vezes insuportáveis, o desenvolvimento de resistências à droga reduzia a eficácia a médio

22

prazo. Mesmo assim, o AZT continua a ser hoje em dia uma das drogas mais utilizadas no

combate ao HIV/SIDA, seja nos chamados “cocktails” ou na prevenção da MTCT, como

veremos. Os “cocktails” triplos ou terapêuticas consideradas de “alta eficácia” só começaram a

ser utilizados a partir de 1996, 13 anos após o isolamento do vírus. As HAART são combinados

de, pelo menos, 3 drogas antiretrovirais, usualmente contendo 2 tipos de agentes que atacam a

replicação do vírus de forma diferente, como veremos em maior detalhe na próxima secção.

Só a partir da introdução das HAART se obteve um declínio muito marcado na morbidez e

mortalidade provocadas pelo HIV. Contudo e como já se referiu, a introdução de terapêuticas

eficazes não foi acompanhada pela redução na incidência da infecção, antes pelo contrário.

Além do mais, as zonas onde o HIV se tem mais disseminado, são também aquelas onde não

há acesso às terapias mais recentes e eficazes.

De referir que a progressão da fase de HIV+ para a fase de SIDA é ainda de difícil

controlo em alguns casos, mesmo usando HAART, particularmente devido a problemas de

adesão aos tratamentos. A falta de adesão tem variadas causas, das quais as principais são os

efeitos secundários e a dificuldade em seguir correctamente as, por vezes complicadas,

posologias. Este problema afecta não só a eficácia individual dos tratamentos como induz

resistências, como se verifica com os antibióticos para o caso das bactérias. Estas razões

fazem com que a indústria farmacêutica continue a manter-se empenhada em desenvolver

novas drogas de combate a esta grave infecção, tentando também melhorar as combinações e

posologias das terapêuticas, evitando efeitos secundários, facilitando a adesão e minimizando

o desenvolvimento de resistências.

Apesar dos cerca de 25 anos de pesquisas na área, a muito esperada vacina para o

HIV, com enorme potencial no controlo e erradicação desta pandemia, parece ter ainda um

longo caminho a percorrer, devido às características peculiares daquele retrovírus.

Actualmente o objecto de maior interesse nesta área é o sistema de fusão do vírus com a

membrana celular das suas células alvo. A fusão depende da interacção de estruturas

proteicas à superfície do vírus com receptores específicos existentes em algumas células do

sistema imunitário, contudo o HIV tem a capacidade de interagir com vários desses receptores,

o que dificulta a tarefa. Ao impedir aquelas interacções, evitar-se-ia a entrada do vírus nas

células hospedeiras, o que no fundo evitaria o processo de infecção em si (ver Figura 5).

1.1.2.4. Terapias 1, 2, 12

Como vimos, embora as terapêuticas disponíveis hoje em dia, permitam um combate

relativamente eficaz à replicação viral, estamos ainda longe de alcançar uma cura para esta

infecção. Para melhor compreender o modo de acção do HIV, na Figura 5 representa-se um

esquema do ciclo de vida do vírus, incluindo o processo de fusão, os processos de transcrição,

integração e reconstrução e terminando na gemulação do novo vírus. Os agentes terapêuticos

são classificados consoante os diferentes mecanismos nos quais actuam. Existem três classes

maioritárias, todas interferindo com a replicação viral:

23

¤¤ inibidores da transcriptase reversa

análogos dos nucleósidos (NRTI);

¤¤ inibidores da transcriptase reversa

não nucleósidos (NNRTI);

¤¤ inibidores da protease (PI).

São também utilisados inibidores

análogos dos nucleótidos (NtRTI), que

evitam a metabolização necessária aos

NRTIs, mas actuam da mesma forma,

e para além dos PIs peptídicos, mais

recentemente foram desenvolvido outros PIs

não peptídicos. Mantêm-se ainda linhas de

investigação que procuram novos alvos do

ciclo de vida do vírus onde se possa actuar,

como a linha de investigação que se referiu

anteriormente para o caso das vacinas,

tendo-se já desenvolvido inibidores da

fusão. Alguns antiretrovirais desta classe

emergente já se encontram aprovados pela

FDA (a Food and Drug Administration é a

entidade dos EUA que regula os mercados

da alimentação e medicamentos).

No caso das classes mais correntes,

que actuam sobre a replicação viral,

podemos ver que até agora se conseguiu

inibir com resultados positivos 2 enzimas

alvo no processo de replicação viral, a

transcriptase reversa e a protease. Como se

pode ver pelo esquema da Figura 5,

enquanto a primeira actua antes da replicação, quando o RNA viral é transcrito em DNA,

a segunda actua após a replicação, sendo responsável pelo processo de maturação do novo

vírus, independentemente do processo de gemulação. Para além disso, obtiveram-se

resultados com 2 tipos de inibidores: os que se assemelham aos substratos naturais

das enzimas e que competem com aqueles pela ligação ao centro activo, geralmente

bloqueando-o; ou outros que actuam num centro alostérico da enzima, induzindo alguma

alteração no centro activo ou impedindo o seu acesso; em ambos os casos, os substratos

naturais são impedidos de activarem os processos necessários à progressão da sequência da

replicação.

Figura 5 – Esquema do ciclo de vida do HIV, da entrada na célula à formação duma réplica pela célula infectada. (adaptado de Wikipédia)

24

Geralmente, os do primeiro tipo são designados por inibidores competitivos e os

segundos não-competitivos. Tomando como exemplo o caso dos RTIs – ou inibidores da

transcriptase reversa – inibem o mesmo alvo, a enzima transcriptase reversa, sejam eles

análogos ou não dos nucleósidos. Enquanto os NRTIs, ou seja os análogos dos nucleósidos,

se ligam ao centro activo da enzima, os NNRTIs, não nucleósidos, interagem com uma bolsa

alostérica específica originando uma deformação no centro activo. No caso específicos dos

NRTIs, ou pelos menos alguns deles, estes podem não bloquear a actividade da enzima, mas

antes actuar como se fossem substratos naturais, por terem estruturas semelhantes às dos

nucleósidos. Desta forma introduzem-se no DNA viral e impedem a continuação da cadeia por

terem a parte do açúcar adulterada (ver estruturas do AZT e 3TC na Figura 6, pg.24), o que por

conseguinte irá igualmente originar uma falha no processo de replicação. Os RTIs anti-HIV são

usualmente bastante específicos para a enzima viral não afectando as polimerases de DNA

doa mamíferos, o que permite que não interfiram com os processos normais de replicação

celular do hospedeiro. A especificidade é tal que o HIV–2 é intrinsecamente resistente aos

NNRTIs devido a diferenças estruturais do respectivo centro alostérico13, que não permitem o

mesmo tipo de interacção. Outra característica dos NNRTIs é que, por actuarem todos no

mesmo local, as estirpes que desenvolvem resistências são usualmente resistentes a todos os

NNRTIs. A selecção de estirpes com resistência a NNRTIs é bastante comum pois geralmente

são sensíveis à mutação de um único resíduo, entre vários, o que como veremos pode ser um

problema acrescido para certas terapias desenvolvidas com antiretrovirais desta classe.

Voltando às terapias HAART, podemos agora especificar que estas incluem,

vulgarmente, dois NRTIs e um NNRTI ou um PI. Um exemplo seria uma combinação dos

princípios activos representados na Figura 6. Os NRTIs AZT (I) e lamivudina (II, 3TC) estão

presentes na formulação comercial Combivir® e o NNRTI nevirapina (III, NVP) no Viramune®.

O

N3

OH

NH

NO

O

I

N

NH

NN

O

III

O

S

OH

N

NO

NH2

II

Figura 6 – Os componentes dum cocktail triplo usual contra o HIV combinado das formulações comerciais Combivir® , que contém os NRTIs AZT (I) e 3TC (II), e Viramune®, que contém o NNRTI NVP (III).

25

1.2. A Nevirapina

1.2.1. Revelância da Nevirapina nos Tramentos Anti-HIV

1.2.1.1. A descoberta 14

A NVP (11-ciclopropil-5,11-di-hidro-4-metil-6H-dipirido[3,2-b:2’,3’-e][1,4]diazepin-6-ona,

III, Figura 6) foi descoberta por Hargrave e seus colaboradores, um grupo que trabalhava na

Boehringer Ingelheim (BI) Pharmaceuticals. Num artigo de 199115, Hargrave descreve que para

tentar evitar os efeitos indesejáveis dos NRTIs procuravam um inibidor estruturalmente

diferente dos nucleósidos. Não tendo pistas que pudessem servir para a racionalização duma

estrutura-guia, seguiram a via do teste aleatório. Embora se tente apoiar cada vez mais o

desenvolvimento de novos fármacos em dados sobre relações estrutura−actividade ou no

conhecimento das estruturas das enzimas alvo, mesmo hoje em dia, isto nem sempre é

possível. Como no caso descrito, faz-se uso da via aleatória em especial nas situações de

pesquisa de novas estruturas eficazes. Depois de encontrarem um composto-guia com alguma

actividade, Hargrave e o seu grupo identificaram a NVP como sendo uma estrutura promissora

daquela família de compostos e em 1994 registaram a sua patente16. O trabalho posterior de

desenvolvimento realizado na BI fez com que a NVP fosse o primeiro NNRTI a ser aprovado

para o tratamento do HIV. Aprovado o uso exclusivo para adultos pela FDA em 1996, seguiu-se

a aprovação na Europa em 1997 e o alargamento da autorização da FDA ao uso em crianças,

no ano de 1998. Devido sobretudo à sua elevada toxicidade o Canadá mostrou-se renitente em

aprovar aquela droga. Em 200017, 200418 e 200519 foram emitidos avisos, pela BI e a FDA,

sobre os riscos de hepatotoxicidade do Viramune.

Convém referir que a NVP tem sido envolta em controvérsias sobre variados aspectos,

sejam a sua eficácia, a credibilidade de certos estudos, a hepatoxicidade, o uso como

profilático na MTCT ou o desenvolvimento de resistências. Assim, por vezes torna-se difícil

seguir os variados estudos, as suas conclusões, as discussões à volta dos resultados

apresentados, as controvérsias levantadas e as recomendações do fabricante e organizações

mundiais envolvidas. Sem querer fazer uma revisão aprofundada de toda a literatura existente,

pretende-se nos próximos sub-capítulos realçar alguns estudos e as conclusões principais dos

que consideramos serem os três principais dos pontos de vista a considerar: a eficácia vs

toxicidade, a MTCT e as resistências. Como veremos, a eficácia da NVP foi provada em vários

regimes, contudo a sua toxicidade é um problema incontornável e por isso foram definidas

algumas restrições ao seu uso. Paralelamente, foi descoberta uma alternativa terapêutica para

a profilaxia da MTCT que consiste no uso da NVP em dose única, o que permite diminuir

drasticamente a ocorrência de reacções adversas, especialmente as mais letais. Esta

posologia tem tido um impacto importante sobretudo na África sub-Sahariana, no entanto

realçou outro efeito negativo da NVP que é a geração de estirpes resistentes, típico dos

NNRTIs.

26

1.2.1.2. Eficácia vs Toxicidade

O estudo clínico publicado em 199820, denominado INCAS, comprovou a eficácia da

NVP numa terapia tripla com AZT e didanosina (IV, ddI), em comparação com 2 combinações

duplas, AZT + NVP e AZT + DDI. Para além de demonstrar a maior rapidez da combinação

tripla na redução da carga de RNA viral no plasma, mostrou que era possível atingir e manter

níveis abaixo dos limites de detecção disponíveis (20 cópias de RNA viral/mL de plasma).

Os resultados deste estudo também apontam para que o desenvolvimento de espécies

resistentes à NVP seja evitado pela combinação tripla, sendo sugerido como resultado directo

da supressão da replicação viral verificada pela diminuição da carga viral a valores abaixo dos

detectáveis. Neste estudo não foram relatadas reacções adversas graves.

Para além do uso profiláctico que a NVP tem na MTCT e que será discutido mais

adiante, o seu uso na profilaxia pós-exposição (PEP, postexposure prophylaxis) em

profissionais de saúde ou outros indivíduos que entram em contacto com o HIV no decurso da

sua actividade tomou alguma relevância, embora aparentemente não tenha havido

recomendações das entidades competentes nesse sentido21. No entanto, em 200022 e 200123,24

surgem relatos de hepatotoxicidade fulminante em pessoal de saúde sob PEP. Face a estes

casos o uso da NVP em PEP foi completamente desrecomendado. Estes casos são

perfeitamente concordantes com a hipótese de risco acrescido de hepatotoxicidade para

contagens de CD4 elevadas, apresentada posteriormente, pois aqueles indivíduos estariam

presumivelmente de boa saúde e por isso deveriam apresentar contagens bastante elevadas

daqueles linfócitos. Face a este relatos e provavelmente a resultados de estudos em curso,

a BI emite o primeiro aviso sobre a hepatotoxicidade do Viramune17.

IV

N

NH

N

N

O

OOH

HH

O

NH

OH

S

NH

O

OH

V

Figura 7 – A estrutura de mais um NRTI, a didanosina ou ddI cuja formulação comercial tem o nome de Videx®.

Figura 8 – A estrutura dum PI, o nelfinavir, cuja formulação comercial tem o nome de Viracept®.

27

Em 2004 é publicado um estudo sobre a toxicidade de regimes contendo NVP durante a

gravidez, resultante do PACTG 102225. Neste estudo pretendia-se inicialmente comparar a

eficácia da NVP vs um PI, o nelfinavir (V, NFV), numa combinação tripla com dois NRTIs,

o AZT e a 3TC. O estudo foi suspenso devido à incidência de efeitos adversos imputados à

NVP ser maior que o que se esperava. Em especial, uma morte devido a falha hepática,

foi objecto de muita polémica, como testemunha o artigo posteriormente editado pela Harper’s

Magazine26 onde se critica ferozmente os procedimentos dos estudos clínicos nos EUA e se

apontam as controvérsias em torno do HIVNET (estudo sobre o qual falaremos adiante,

abstendo-nos dessas controvérsias) e até se chega a apoiar as ideias do “dissidente”

Duesberg, uma voz quase solista contra os actuais pressupostos sobre o HIV e a SIDA.

Este artigo deve, no entanto, servir como alerta para a politização da questão da SIDA e para

as possíveis interferências que os poderes políticos e económicos podem ter e que a

comunidade científica, por vezes, não consegue evitar. Voltando aos resultados do PACTG, os

autores apontam para que todos os efeitos adversos encontrados no grupo da NVP se

verificaram em pacientes com contagens de CD4 acima de 250/µL. Do mesmo ano data o 2°

aviso18 da BI referindo um risco acrescido de efeitos adversos, sobretudo a nível hepático,

em pacientes com contagens de CD4 acima daquele limite e fazendo especial referência às

mulheres grávidas. Contudo no artigo do PACTG há já referência a um estudo retrospectivo de

2003 que realça os limites posteriormente definidos no aviso da FDA de 200519, 250/µL para as

mulheres e 400/µL para os homens.

Voltando a atenção para a eficácia da NVP há que realçar um estudo27, realizado por

uma equipa espanhola e publicado no mesmo ano e com os mesmo objectivos que o PACTG

1022, mas que não se centrava em mulheres

grávidas e que não faz referência alguma a

efeitos adversos. Os resultados obtidos por

esta equipa indicam não haver uma diferença

significativa no sucesso dos dois regimes

AZT+3TC+NVP vs AZT+3TC+NFV, sendo

ambos muito positivos pois ao fim de um ano

de terapia as percentagens de indivíduos com

cargas virais abaixo das 200 cópias/mL são

de 83% para o regime com NNRTI e 78%

para o regime com PI.

Em 2004 ainda é publicado outro

estudo28 sobre terapia tripla com base em 2

NRTIs, a estavudina (VI, d4T) e a 3TC, que

pretendeu comparar agora a eficácia da NVP

com outro dos NNRTIs correntemente

OOH

NH

NO

O

VI VII

O

NH

Cl

O

CF3

Figura 9 – As estruturas de mais um NRTI e um NNRTI, respectivamente a estavudina ou d4I (VI), cuja formulação comercial tem o nome de Zerit®, e o efavirenz ou EFV (VII), cuja formulação comercial pode ter nomes como Sustiva® ou Stocrin®.

28

utilizado, o efavirenz (VII, EFV). Neste estudo compararam-se não só a eficácia da combinação

com NVP vs EFV, como também o efeito dos 2 NNRTIs em conjunto e da toma diária da NVP

ser única ou repartida por duas doses. As taxas de insucesso (40-50 %) variam pouco entre as

diferentes terapias. A diferença não foi significativa entre a duas posologias de NVP, com uma

taxa intermédia. A combinação com EFV resultou na taxa mínima e a combinação com os 2

NNRTIs na máxima. O resultado menos positivo da junção dos 2 NNRTIs pode dever-se

simplesmente à maior ocorrência de efeitos adversos naquele sub-grupo, não se podendo

concluir sobre a eficácia daquela combinação em si. Também se verificou que a dose diária

única de NVP originou mais efeitos adversos que o EFV. Em termos de conclusões este estudo

não permitiu dar preferência a um dos NRTIs em estudo, mas levantou mais questões sobre a

segurança do uso da NVP, entre as quais porque 2 mortes lhe foram associadas. Interessante

que este estudo, ao contrário dos 2 anteriormente referidos, que se restringiam a grupos muito

pequenos e provavelmente pouco heterogéneos, aglutina resultados de vários locais e analisa

os resultados de várias perspectivas e com detalhes relevantes, como é o caso da variabilidade

de respostas consoante a proveniência dos pacientes. Há que sublinhar que se sabe que,

em especial, as isoenzimas que metabolizam a NVP sofrem de polimorfismos, como veremos

mais adiante, o que pode ter um impacto significativo nas probabilidade de reacções adversas

e sobretudo dos casos mais graves.

O mesmo grupo de investigadores, o grupo 2NN, publicou posteriormente um estudo

baseado nos resultados anteriores, mas onde explora as questões de segurança levantadas29.

Mais uma vez os resultados não permitem estabelecer uma diferença significativa na eficácia

dos 2 NNRTIs referidos, mesmo re-analisando os dados face a outras variáveis. Contudo,

conseguem estabelecer uma relação entre alguns dos efeitos secundários adversos

provocados pela NVP e a contagem das células CD4. No entanto os autores são muito

cuidadosos no que toca a tirar conclusões.

Dada a hepatotoxicidade da NVP se ter revelado por vezes fulminante e fatal, embora a

percentagem de casos indique que sejam relativamente raros, o fabricante preferiu tomar

medidas de precaução emitindo os avisos anteriormente referidos e sublinhando o

acompanhamento cuidado nas primeiras semanas de tratamento e os limites de contagens de

CD4 já referidos, que parecem apoiados por dados coligidos pela própria BI a partir de vários

estudos30.

Para além da hepatoxicidade que se tem vindo a sublinhar neste texto, a NVP origina

com mais frequência rash cutâneo (13 %) e podem ocorrer ocasionalmente (1,5 %) outras

reacções de hipersensibilidade, sobretudo expressas através da pele, sendo a mais rara e

mortal o síndrome de Stevens-Johnson14.

29

Figura 10 – Frequência de sintomas hepáticos nas primeiras 6 semanas de tratamento com NVP. Nesta representação são postos em evidência os limites de contagens de CD4 avançados pela BI e a FDA para minimizar a ocorrência de efeitos adversos graves pelo uso de NVP. Imagem adaptada dum gráfico apresentado pela BI30, coligido a partir de estudos com e sem grupo de controlo.

Apesar dos efeitos secundários, a NVP apresenta algumas aplicações específicas, uma

das quais iremos tratar de seguida. Outras aplicações são como último reduto, em casos onde

já se deu a chamada falha virológica, com combinações de um ou mais PIs ou NRTIs e em

especial nos casos em que não foram previamente usados NNRTIs14. Outra potencial

vantagem específica da NVP advém da sua capacidade de atravessar a barreira hemato-

-encefálica31, característica bastante particular entre os antiretrovirais e que poderá vir a abrir

novas aplicações terapêuticas. Por um lado, actualmente os casos de demência associada à

SIDA têm vindo a aumentar e, por outro lado, alguns estudos têm vindo a defender a hipótese

de que o vírus possa usar o sistema nervoso central e o cérebro como locais de acumulação

durante a fase de latência.

Depois de toda esta exposição não se espera que a NVP seja um dos antiretrovirais

mais utilizados a nível mundial32. Aparentemente, o desenvolvimento de genéricos baratos no

Brasil e na Índia, fazem com que não tenha deixado de fazer parte dos regimes terapêuticos

nas zonas de menores recursos, seja em HAART ou na profilaxia da MTCT, como veremos de

seguida.

1.2.1.3. A Prevenção da Transmissão Vertical Mãe-Filho

O primeiro fármaco a ser utilizado na prevenção da MTCT foi o AZT, administrado por

um curto período no final da gravidez. Os resultados não eram maus, contudo num estudo

preliminar sobre o uso duma dose única de NVP (HIVNET 006)33 obtiveram-se resultados

30

promissores. Observou-se que tanto com uma dose única de NVP só materna como na dose

única de NVP mãe+recém-nascido, era possível detectar o fármaco em níveis considerados

eficazes no recém-nascido até aos 7 dias. A persistência da NVP no organismo da mãe e do

bebé, para além de o proteger durante o parto permitiria prolongar o efeito protector, pelo

menos aos primeiros dias de amamentação. Verificou-se também que as mães não sofriam um

agravamento dos marcadores da infecção/doença após o parto. Este estudo não refere efeitos

adversos ou outras ocorrências relacionadas com o uso de NVP.

Desde então, a dose única de NVP tem sido objecto de muitos estudos, pois apresenta

fortes vantagens para os países de fracos recursos, quer a nível económico, quer na

simplificação da administração. No seguimento daquele estudo preliminar, pretendeu-se então

comparar a eficácia da posologia da dose única de NVP com a anteriormente utilizada de AZT

de curta duração. Os resultados do HIVNET 01234 mostraram haver uma diferença pouco

significativa na percentagem de crianças infectadas no momento do nascimento, 10,4 % e

8,2 %, para a terapia com AZT e NVP, respectivamente. Contudo às 6-8 semanas – 21,3 % e

11,9 % – e novamente às 14-16 semanas – 25,1 % e 13,1 % – as percentagens no grupo da

NVP foram cerca de metade das do grupo do AZT. De referir que os recém nascidos foram

amamentados quase na sua totalidade, o que justifica parte do aumento das percentagens de

crianças infectadas ao longo das primeiras semanas de vida. Neste estudo os efeitos adversos

foram considerados idênticos para ambos os grupos. As características da NVP que são

realçadas e que os autores pensam justificarem a diferença de resultados são a capacidade de

reduzir a concentração de RNA viral até 3 ordens de grandeza após uma dose única, de actuar

imediatamente sobre o vírus a nível intra- e extracelular e de não necessitar de metabolização

para ser activa. Os longos tempo de meia-vida são também referidos, permitindo com uma

única dose manter níveis terapêuticos no recém nascido ao longo da primeira semana.

Os curtos tempos de meia-vida do AZT implicam doses repetidas, que antes do mais podem

condicionar fortemente a eficácia do tratamento. Isto porque se não se conseguir manter um

bom estado estacionário há o risco de recorrentes concentrações plasmáticas

sub-terapêuticas, o que para além de diminuir directamente a eficácia da terapia aumenta a

probabilidade de emergirem resistências.

Os resultados deste último estudo parecem realçar mais vantagens da dose única de

NVP, pois para além de prevenir a MTCT durante o parto, os seus longos tempos de vida

permitem proteger também contra a MTCT através da amamentação, em especial tendo em

consideração que as primeiras semanas (aproximadamente o 1° mês) são as de maior risco

pois o colostro e o leite materno neste período apresentam uma maior carga viral que o leite

posterior11. Apesar de todas as controvérsias à volta do estudo HIVNET012, a simplicidade e

acessibilidade do tratamento originaram muitos apoios a que esta profilaxia de dose única de

NVP estivesse realmente acessível a uma maior percentagem de mulheres, sobretudo na

África sub-Sahariana. Ainda sobre o regime de dose única de NVP exclusivo, que continua a

31

ser até aos nossos dias o mais comum naquela zona do globo e ainda quase a única,

se alguma, alternativa de profilaxia disponível, há que referir alguns resultados obtidos no

HIVNET024. Num artigo já de 200535, apresentam-se resultados dum sub-estudo no qual se

pretendeu verificar a influência da variabilidade nos tempos de toma da dose única de NVP

materna ou infantil. Segundo os dados recolhidos, a eficácia da profilaxia não é grandemente

influenciada a não ser que a dose única de NVP materna seja ingerida a menos de 2 h do parto

e que a dose única de NVP infantil seja administrada logo nas primeiras 4 h de vida. De referir

que igualmente para os estudos anteriores a dose única de NVP materna foi administrada 24 h

ou mais antes do parto e que a dose única de NVP infantil foi administrada até às 72h.

A combinação dos dois procedimentos anteriormente descritos, AZT de curta duração

mais dose única de NVP, origina ainda melhores resultados na prevenção da MTCT e permite

diminuir parcialmente a principal preocupação relativa ao regime exclusivo que são as

resistências. Mais recentemente alguns estudos têm vindo a sustentar que nesta combinação,

a dose única de NVP materna pode ser evitada, sendo somente administrada a dose única de

NVP infantil e que tal permite reduzir a taxa de resistências nas mulheres. Um estudo realizado

no Botswana36 refere taxas de MTCT idênticas, de cerca de 4 %, para bebés com 1 mês cujas

mães tinham recebido ou não uma dose única de NVP, isto para além de todas as mães terem

recebido AZT nas últimas semanas de gravidez e durante o parto e todos os bebés terem

recebido uma dose única de NVP pós-parto e AZT durante o primeiro mês. Este estudo

verificou também que perto de 50 % da mulheres que receberam NVP apresentavam estirpes

resistentes 1 mês após o parto. Noutro estudo realizado no Malawi37, todos os recém-nascidos

receberam dose única de NVP imediatamente pós-parto e alguns também receberam AZT

durante 1 semana, enquanto às mães só foi administrada a dose única de NVP caso se

tivessem apresentado no hospital mais de 4 h antes do parto, caso contrário não receberam

dose única de NVP. Os resultados apontam para reduções bastante significativas nas

resistências à NVP entre os bebés que receberam dose única de NVP+AZT e cujas mães não

receberam NVP e os bebés que só receberam NVP e cujas mãe também receberam NVP,

respectivamente, 27 % vs 87 %. Para além de que ao eliminar a dose única de NVP materna,

evita-se o desenvolvimento de resistências nas mulheres. O risco de MTCT foi idêntico para

qualquer das opções de tratamento, 8-10 % à nascença e 6,5-12 % às 6-8 semanas.

É de considerar, que a utilização da dose única de NVP nunca chegou a ser aprovada

pela FDA. De qualquer forma, nos EUA, esta profilaxia só faria sentido em casos em que a

mãe desconhecesse o seu estado serológico até à altura do parto. Nos EUA e na Europa o uso

de HAART durante a gravidez é o procedimento mais recomendado, podendo reduzir a MTCT

até menos de 1 %. No entanto, riscos e benefícios a longo prazo dos tratamentos com

múltiplas drogas, tanto para as mães como para as crianças, estão ainda pouco esclarecidos.

32

1.2.1.4. Resistências 38, 39

Como já vimos, parte dos efeitos adversos podem ser evitados pela posologia de dose

única de NVP, contudo outro problema foi realçado por este uso como é o caso das

resistências. Esta é uma característica menos desejável, que afecta sobretudo os NNRTIs,

e que advém da facilidade com que aparecem estirpes resistentes e que em geral conferem

resistência a todos ou quase todos os fármacos desta classe. Os NNRTIs são particularmente

sensíveis, como já se referiu, porque basta uma única de várias mutações possíveis que

afectam a bolsa alostérica alvo para que o vírus crie resistência. Há que ter em mente que no

ciclo de vida do vírus ocorrem muitas mutações naturalmente, algumas das quais podem

originar resistência a antiretrovirais, e basta uma pequena pressão selectiva daqueles agentes

para que a variante mutante tome relevância. O facto da NVP apresentar longos tempos de

meia-vida e poder ser detectada no plasma até 3 semanas após uma dose única torna esta

droga especialmente susceptível ao desenvolvimento de resistências. Esta susceptibilidade é

ainda potenciada pela posologia de dose única, uma vez que não é garantida uma boa

supressão da carga viral.

Como já se relatou, este tem sido mais um tema de controvérsia em torno da NVP.

Alguns estudos indicam que a presença das estirpes resistentes não duraria mais de cerca de

1 ano. Todavia, outros estudos começaram a detectar as estirpes resistentes durante tempos

mais longos, devido essencialmente à sensibilidade das tecnologias disponíveis. Enquanto um

método padrão, por sequenciação, apenas consegue detectar sub-populações que

representem mais de 20 % da população total de vírus, outros métodos utilizados mais

recentemente permitem baixar essa sensibilidade até 0,1 %. No entanto, entre os vários

estudos nesta área também não parecem compatibilizar-se as percentagens de mães e filhos

afectados. Embora a sensibilidade das tecnologias utilizadas também possa ter efeito naqueles

resultados, estudos posteriores ajudam a compreender esta variabilidade doutro ponto de vista.

Estudos do grupo de Eshleman10 verificaram diferentes susceptibilidades dos sub-tipos de

HIV–1 à génese de resistências. Enquanto o sub-tipo C pode chegar a originar 70 % ou mais

casos de resistência, os sub-tipos A e D apresentam percentagens inferiores, 20-50 %.

Esta observação pode justificar, em grande parte, a variabilidade de resultados nestes e

noutros estudos, pois a distribuição de sub-tipos é variável entre regiões. Assim, estudos

realizados com populações de zonas diferentes podem naturalmente originar resultados

díspares; como se refere no estudo mencionado, enquanto no Uganda os sub-tipos

predominantes são os A e D e o C é quase inexistente, no Malawi este último sub-tipo é

praticamente o único presente.

Por outro lado, tem-se vindo a levantar a questão da relevância clínica destes resultados

e por isso outros estudos tentam verificar paralelamente se a exposição à dose única de NVP

das mães e dos filhos pode realmente comprometer tratamentos posteriores. Esta questão é

tanto mais importante tendo em conta que nos meios onde aquela profilaxia é largamente

33

utilizada, o mais provável é que um tratamento posterior, mesmo que já de terapias

combinadas, contenha também NVP. Não ficando também excluída a questão da eficácia da

mesma profilaxia utilizada numa gravidez posterior. Neste assunto também nem todos os

estudos são concordantes, mas alguns sugerem que mesmo para sub-populações de estirpes

resistentes só detectadas com os métodos mais sensíveis há um risco acrescido de falha

virológica.

Num estudo realizado na Tailândia (PHPT-2)41, foi administrada a dose única de NVP a

várias grávidas que tinham recebido AZT no último semestre da gravidez. De referir que, assim

como noutros estudos, o grupo de placebo-placebo, para a mãe e o bebé, foi descontinuado a

meio do tempo de observação devido às diferenças nos resultados da MTCT, que atingiram os

80 % neste caso. Os resultados obtidos são concordantes com os do estudo HIVNET006,

apontando para reduções muito similares nos grupos NVP-NVP, que corresponde a doses

únicas administradas à mãe e ao filho, e no grupo NVP-placebo, no qual só a mãe recebe dose

única de NVP. Voltando à discussão das resistências, posteriormente àquele estudo foi

avaliada a resposta das mães que tinham recebido dose única de NVP e um tratamento

pós-parto com HAART – contendo NVP42. Embora os resultados da eficácia dos tratamentos

pós-parto não sejam completamente conclusivos e levantem outras dúvidas, ao fim de 6 meses

as discrepâncias na percentagem de mulheres que atingiram cargas virais inferiores ao limite

de detecção de 50 cópias de RNA/mL de plasma começam a delinear-se. A diferença

encontrada entre o grupo não exposto e aquele que foi exposto e não apresentava mutações

(68 % vs 52 %) não foi estatisticamente significativa, mas indicia que possíveis sub-populações

não detectáveis pelos métodos padrão possam influenciar a resposta a futuros tratamentos.

Porém, o grupo com resistências detectadas não deixou responder à terapia, embora com

resultados menos positivos (38 % de taxa de supressão viral). É ainda de referir que, apesar de

aquele estudo ter sido feito com uma terapia de combinação com AZT, 66 % das mulheres que

receberam a dose única de NVP apresentavam resistências menos de 2 semanas após o

parto. A principal dúvida que ficou por esclarecer neste estudo prende-se com o tempo

pós-exposição à NVP do início da HAART, uma vez que outros estudos observaram uma

diminuição forte das sub-populações resistentes ao longo do primeiro ano pós-parto.

Já no ano corrente foi publicado um artigo43 cujos resultados parecem mais

esclarecedores. Neste estudo, realizado no Botswana entre 2001 e 2003, as grávidas

receberam AZT nas últimas semanas de gravidez e o par mãe-filho recebeu dose única de

NVP ou placebo. Os recém-nascidos foram ainda tratados com AZT durante 6 meses no caso

de serem amamentados ou durante um mês se receberam aleitação artificial. Devido a

resultados já aqui apresentados36, a meio do estudo todos os recém-nascidos passaram a

receber dose única de NVP. Para as mulheres que começaram tratamentos HAART com NVP

(Combivir® +Viramune®) menos de 6 meses após o parto, no qual tinham recebido NVP,

a percentagem de falha virológica foi superior a 40 % a 6 meses de tratamento, comparada

34

com nenhum caso no grupo de placebo durante o parto. Nas mulheres que iniciaram HAART 6

meses após o parto a diferença daquelas percentagens não é significativa, sendo 7,8 % e

12 %, respectivamente para o grupo placebo e o grupo dose única de NVP. Para os bebés que

começam HAART com menos de 12 meses, também se verificou que a percentagem de falha

virológica foi significativamente maior naqueles que receberam dose única de NVP, 77 % em

comparação com o placebo, 9 %. É ainda referido que as respostas não variam

significativamente 12 ou 24 meses após o início da HAART. Assim, os autores recomendam

que mulheres a necessitar de HAART menos de 6 meses após terem recebido dose única de

NVP devem começar o tratamento, mas sem NVP. Uma opção adequada seria uma

combinação de NRTIs com um PI44. Contudo, e mesmo considerando os maus resultados

obtidos para as crianças, os autores referem que a dose única de NVP não pode ainda deixar

de ser utilizada e que pelo menos a menor incidência de falha no tratamento para as mulheres

que necessitaram de tratamento mais tarde não deixa de ser um resultado bastante positivo.

Para além da grande discrepância entre as profilaxias e tratamentos disponíveis nos

países de maiores e menores recursos, estes resultados indicam a cada vez maior urgência

em tornar as HAART universalmente acessíveis, para que seja possível tanto diminuir as

transmissões horizontais e verticais como melhorar a qualidade e prolongar a vida daqueles

que vivem com o VIH/SIDA. Estatísticas de 2002 indicavam que para cada bebé nascido com

HIV nos EUA e na Europa quase 2 mil nasceriam infectados em África; no entanto há que ter

em conta que grandes esforços foram tidos desde essa altura, com resultados positivos no

terreno; por isso hoje espera-se que esta proporção esteja menos desequilibrada. Contudo,

ainda em 2004 o relatório da OMS/ONUSIDA referia que apenas um percentagem inferior a

10 % de mulheres grávidas podia aceder à profilaxia de dose única de NVP em África e por

isso ainda há um longo caminho a percorrer até ao acesso universal das HAART, tanto em

questões económicas como de logística e outras.

1.2.2. Metabolismo A NVP é uma droga de baixo peso molecular, M = 266,3 g/mol, e lipofilia moderada, com um

coeficiente de partição da ordem de log D = 1,831. É uma base fraca, de pka = 2,8, encontrando-

-se, por isso, não ionizada ao pH fisiológico. Os resultados farmacocinéticos observados estão

em boa concordância com estas características físico-químicas, uma vez que a NVP apresenta

uma elevada biodisponibilidade, longos tempos de meia-vida e uma distribuição corporal

alargada, incluindo ao nível do cérebro45. A eliminação da NVP dá-se principalmente através de

metabolização pelo fígado e excreção dos metabolitos na urina. A quantidade de composto-

-mãe excretado na urina é cerca de 3 % nos humanos46, sendo também baixa para os outros

animais estudados, salvo excepções provavelmente pontuais observadas num macaco

cynomolgus macho47. A excreção do composto-mãe através das fezes é próxima da excreção

urinária nos humanos e nos outros animais, excepto no cão que elimina perto de 50 % do

composto mãe por esta via46, 47. Embora sejam observadas diferenças no perfil de metabolitos

35

e velocidade de metabolização intra- e inter-espécies, pode considerar-se que qualitativamente

o metabolismo da NVP é semelhante. A NVP é extensamente oxidada por enzimas

dependentes do citocromo P450 (CYP), sendo os principais metabolitos identificados os

2-, 3-, 8- e 12-hidroxi-NVP (12−OH−NVP), respectivamente VIII, IX, XII e XI (na Figura 11),

o 4-carboxi-NVP (4−CO2H−NVP, X), originado por oxidação secundária do 12−OH−NVP, e os

conjugados glucorónidos dos metabolitos hidroxilados. Nos humanos a espécie 4−CO2H−NVP

parece ter pouca relevância, ao contrário das espécies animais onde é usualmente o

metabolito maioritário. Nos humanos os metabolitos de fase II, isto é, os conjugados

glucorónidos dos metabolitos hidroxilados, compõem a grande maioria das formas excretadas

através da urina. Num estudo46 realizado em condições de indução, isto é com tomas prévias

regulares durante algumas semanas, uma dose única de NVP radiomarcada com 14C foi

recuperada a 76 % na urina, dos quais 68 % correspondiam aos glucorónidos das 2-, 3- e

12−OH−NVP. Estes metabolitos correspondem individualmente a percentagens da ordem dos

20 % enquanto os outros metabolitos e o composto-mãe correspondem apenas a percentagens

na ordem dos 1-3 %. Nos estudos realizados não foram identificados outros metabolitos de

fase II, como os provenientes de acetilação ou sulfatação dos grupos hidroxilo.

N

NH

NN

O

OHN

NH

NN

O

OH

N

NH

NN

O

OH

N

NH

NN

OOH

VIII IX

XIIXI

N

NH

NN

OOOH

X

Figura 11 – Os metabolitos da NVP, 2−OH−NVP (VIII), 3−OH−NVP (IX), 4−CO2H−NVP (X), 12−OH−NVP (XI) e 8−OH−NVP (XII).

36

Tanto nos humanos como noutras espécies há fortes indícios de que o metabolismo da

NVP é autoinduzido. Comparando os resultados de estudos com dose única vs doses

repetidas, a velocidade de eliminação pode tornar-se 2 vezes mais rápida e os tempo de

meia-vida proporcionalmente mais curtos46. Os estudos indicam que a NVP é metabolizada

sobretudo pelas isoenzimas CYP3A4 e CYP2B6 e são estas que são especificamente

induzidas46, 48, 49. A dependência do CYP2B6 na formação do metabolito 3−OH−NVP,

em conjunto com o facto daquele ser um dos metabolito maioritários nos humanos, pode ser

um dos indicadores do processo de autoindução, uma vez que aquela isoforma é usualmente

pouco relevante nos humanos. Outros resultados corroboram estas observações, uma vez que

em culturas de células este metabolito nem sempre é tão relevante. Alguns resultados apontam

para a possibilidade da NVP também inibir o CYP3A4, mas a concentração necessária para tal

é muito superior, mais de 100 vezes, à concentração plasmática terapêutica pelo que não terá

relevância clínica49. A indução originada pela NVP actua não só no seu próprio metabolismo,

mas pode também interferir com outros fármacos aumentando as suas taxas de eliminação e

reduzindo a sua eficácia, inclusivamente outros antiretrovirais. No entanto, dado o metabolismo

da NVP fazer uso quase exclusivo daquelas duas isoformas de CYP e correspondentemente

apenas influenciar as mesmas, as interacções parecem ser na prática limitadas. Por outro lado,

o metabolismo da NVP também pode ser susceptível de alterações por interferência com

outros medicamentos, como é o caso do cetoconazol, um antifúngico conhecido pela sua

capacidade de inibir especificamente ambas aquelas isoformas49.

As isoenzimas referidas, para além de estarem envolvidas na metabolização de variados

xenobióticos – compostos estranhos que entram num organismo – são também especialmente

atreitas a polimorfismos. O que, como já se referiu no texto, quer dizer quer há variações

genéticas da sua expressão e em populações diferentes há probabilidades diferentes de se

expressarem cada uma das variantes. Há mutações que não são muito relevantes, mas há

outras que podem implicar uma metabolização muito mais lenta, potenciando o risco de efeitos

secundários, ou muito mais rápida, reduzindo a eficácia do tratamento devido a uma maior taxa

de eliminação. Porém a questão não é tão simples, pois também há a possibilidade das

variações nas isoenzimas originarem diferentes perfis de metabolitos. Isto pode originar que

em certas populações haja uma maior probabilidade de metabolizar um dado fármaco a um

metabolito que possa ser particularmente prejudicial, ou exactamente o oposto. Por isso são

importantes os estudos farmacológicos e farmacocinéticos antes dos primeiros estudos clínicos

e o posterior alagamento dos estudos clínicos a um número crescente de indivíduos. Contudo,

é sempre possível que não se detectem potenciais problemas graves, como no caso da NVP

com os casos de hepatotoxicidade fulminante.

37

1.2.3. Os Riscos de Hepato- e Genotoxicidade 50, 51, 52 A hepatotoxicidade da NVP pode ser devida aos mecanismos de indução enzimática ou

a uma potencial genotoxicidade. Este último mecanismo seria mediado pelo metabolismo e o

fígado tornar-se-ia um órgão alvo devido à concentração de enzimas que comporta. Estudos

em animais apontam para que a hepatotoxicidade da NVP possa ser devida à indução

enzimática e não a mecanismos de genotoxicidade53. Continua, porém, a ser necessário

esclarecer bem aqueles mecanismos e verificar aprofundadamente a sua existência ou não nos

humanos.

Nas últimas décadas houve uma evolução muito significativa na compreensão de vários

mecanismos de toxicidade e de mutagénese. Para além dum conhecimento mais detalhado do

metabolismo, uma das áreas que se desenvolveu bastante e apresenta resultados importantes

foi a da detecção e identificação de aductos de DNA. Ainda há trabalho a fazer para relacionar

os níveis e tipos de aductos encontrados com a oncogénese, mas em termos analíticos houve

uma evolução que permite a quantificação de doses muito reduzidas, aos níveis usualmente

presentes nos humanos. Em geral, qualquer xenobiótico com características electrófilas (E+),

ou que possa ser metabolizado a uma espécie E+, tem potencial genotóxico pois pode formar

aductos com o DNA, através do ataque às suas bases que têm carácter nucleófilo, em especial

as purinas. Existem vários tipos de aductos de DNA, que podem originar diferentes erros na

transcrição daquela molécula fundamental ao funcionamento de qualquer célula. Devido à

grande necessidade de correcção na transcrição do DNA, existem também vários mecanismos

naturais para a correcção daqueles erros, que contudo podem ser falíveis e induzir mutações.

Um dos tipos de compostos endógenos ou exógenos que têm vindo a ser estudados

devido ao seu potencial de formação de aductos são os compostos com anéis aromáticos

susceptíveis de formar espécies hidroxiladas que podem originar quinonas. As quinonas são

aceitadores do tipo Michael e por isso têm um carácter E+ acentuado. A nível endógeno temos

os estrogénios, que se sabe terem um papel relevante no desenvolvimento de cancros,

especialmente a nível da mama, devido a mecanismos de estimulação de receptores.

Para além desse mecanismo, os estrogénios parecem também estar envolvidos na iniciação

das mutações que levam à carcinogénese. Estudos recentes, têm vindo a apoiar esta hipótese

e a esclarecer os mecanismos pelos quais actuam, sendo apontado um dos tipos de

orto-quinonas usualmente existentes em quantidades desprezáveis, mas que devido a

diferenças ou desequilíbrios metabólicos podem ser detectadas em quantidades significativas

nos tecidos alvo, assim como os seus aductos. Outro exemplo, desta feita de proveniência

exógena, são os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs), os quais formam também

orto-quinonas que interactuam com o DNA.

38

Contudo o potencial genotóxico das quinonas não se restringe à formação de aductos

com o DNA; devido à sua reactividade redox, podem estar envolvidas em ciclos redox que

originam espécies de oxigénio reactivas (ROS), que por sua vez também podem iniciar vários

processos mutagénicos. Nas Figura 12 e Figura 13 são apresentados esquemas que

evidenciam a reactividade das quinonas e os mecanismos através dos quais podem levar à

mutagénese e à oncogénese.

OH

OHR

O

OR

O-

OR

1 e−2 e−, 2 H+

(E+)

Alquilação de Proteinas

DNA

(ROS)

Oxidação de Proteinas

DNA

Lípidos

2 O2 O2O2O22

hidr

oqui

nona

radical semiquinona

Figura 12 – Esquema das reacções duma quinona no meio fisiológico. Por um lado, actuando como electrófilo (E+) pode reagir directamente com nucleófilos como as proteínas e o DNA. Por outro lado, devido à sua reactividade redox pode originar ROS por intermédio de ciclos entre as suas formas de hidroquinona e radical semiquinona. As ROS produzidas podem por sua vez levar à oxidação de lípidos, proteínas ou DNA. (adaptado da referência 50)

39

O

O

peroxidaçãolipídica

proteínas com pontes disulfureto

mistas

alquilaçãoproteínas

Lípidos Proteínas

DNA

ROS

E+

ROSE+

oxidaçãoDNA

aductosDNA

aductosvolumosos

estáveis

locaisabásicos

(despurinação)

oxidaçãode

bases

quebras na cadeia

DNA

GSHNAD(P)H

[P450 reductase][NQO1]

consumo deespéciesredutoras

formaçãode

ROS

formação GSSG

GSH−E+

ROSE+

formaçãoROS

destoxificação

diminuição dos níveis

de GSH

activação decascatas desinalização

Figura 13 – Esquema representativo das vias potenciais de genotoxicidade duma quinona, onde E+ e ROS correspondem, respectivamente, à acção electrófila da própria quinona ou à acção das espécies de oxigénio reactivas originadas por intermédio de ciclos redox nos quais a quinona está envolvida. GSH corresponde ao nucleófilo glutationa, presente no meio celular, e [NQO1] a enzima NAD(P)H:quinone oxidoreductase dependente dos co-factores NAD(P)H, nicotinamida adenina dinucleótido (fosfato). (adaptado da referência 50)

40

1.3. Considerações finais

No grupo de trabalho em que este projecto se insere já foram feitos alguns estudos

sobre a potencial genotoxicidade da NVP, em especial, sobre o seu metabolito 12−OH−NVP,

o qual se verificou poder originar in vitro uma grande variedade estrutural de aductos de DNA.

Na sequência destes resultados, interessa aferir o significado dos outros metabolitos

hidroxilados, tendo sido escolhida, neste caso, a 2−OH−NVP. Resultados preliminares,

também obtidos no seio do grupo de investigação, indicam não haver reacção directa do

derivado mesilado do metabolito 2−OH−NVP com as bases do DNA, em contraste com o que

acontece de facto para a 12−OH−NVP (Doutora Alexandra Antunes, comunicação pessoal).

Outros estudos realizados também no grupo com metabolitos fenólicos do tamoxifeno55

serviram como ponto de partida para delinear as estratégias do presente trabalho.

Não se prevendo uma interacção directa do metabolito em estudo com o DNA, interessa

verificar se aquele metabolito de tipo fenólico poderá originar metabolitos secundários do tipo

catecóis e/ou quinonas. Como se referiu anteriormente, o potencial genotóxico das quinonas é

elevado, o que dá relevo ao estudo da oxidação in vivo dos metabolitos fenólicos a quinonas.

Foram assim, definidos os objectivos deste trabalho, como sendo primeiro o estudo da

oxidação química da 2−OH−NVP, incluindo a identificação dos produtos obtidos, e posteriores

estudos comparativos de oxidação enzimática e outros considerados relevantes. Os avanços

não permitiram ir mais além até este momento, sendo de seguida apresentados os resultados

obtidos.

41

2. Parte Experimental

Serão inicialmente descritos sucintamente alguns métodos utilizados durante este

trabalho. De seguida, para cada secção serão também descritas algumas metodologias gerais

e posteriormente serão apresentados os métodos específicos e eventuais

adaptações/alterações aos métodos gerais.

2.1. Métodos Gerais, Materiais e Equipamento

2.1.1.1. Solventes

Os solventes utilizados foram adquiridos comercialmente (Lab-Scan, Fisher Scientific,

Riedel-de Haën), eram de grau analítico ou superior e foram utilizados, em geral, sem qualquer

purificação.

2.1.1.2. Reagentes

Os reagentes necessários foram adquiridos comercialmente (Aldrich, Sigma, Riedel-de

Haën, Merck), apresentavam o grau de pureza necessário e não necessitaram de qualquer

purificação. A NVP foi adquirida à Cipla e também utilizada sem mais purificação.

2.1.1.3. Soluções tampão

A maioria das soluções tampão foram preparadas especificamente para este trabalho a

partir de reagentes disponíveis no laboratório e de água destilada. Alguns tampões foram

preparados, para uma dada concentração e pH, a partir das quantidades de reagentes

tabeladas56. No caso do tampão fosfato, utilizado a vários pHs, foi utilizada frequentemente

uma solução mãe a 100 mM preparada a partir de hidrogenofosfato de sódio dodecahidratado.

A partir da solução mãe foram preparadas, consoante a necessidade, porções de solução

tampão a um pH específico por adição de soluções de HCl ou NaOH 1 M, preparadas para o

efeito.

2.1.1.4. Cromatografias de camada fina

A evolução das reacções foi seguida por cromatografia em camada fina (CCF) em placas

cromatográficas de alumínio com sílica gel 60 F254 da Merck. Sempre que necessário, esta

metodologia foi também utilizada para comparar misturas e identificar componentes fazendo

uso de padrões. Não sendo a identificação por este método inequívoca, quando necessário

foram realizadas análises posteriores mais detalhadas por outros métodos. Foram utilizadas

várias misturas eluentes, baseadas sobretudo nos solventes: diclorometano, acetato de etilo e

éter dietílico (CH2Cl2, AcOEt e Et2O). Detalhes das proporções e outras misturas serão

identificados caso necessário. As placas de CCF foram “reveladas” por observação sob luz

ultravioleta (UV), lâmpada Camag, ao comprimento de onda (λ) de 254 nm.

42

2.1.1.5. Cromatografias preparativas de camada fina

A CCF preparativa foi utilizada com frequência para isolar ou purificar os componentes

de misturas obtidas durante o trabalho, em geral, em quantidades bastante reduzidas. Para tal

foram utilizadas as placas de sílica/alumínio anteriormente referidas, quando a quantidade de

amostra era da ordem dos poucos mg, ou placas de sílica/vidro, estas até um máximo de 100

mg de amostra cada (placa preparativas de sílica gel 60 F254 de 0,5 mm da Merck). Em casos

pontuais foram também utilizadas placas de alumina/vidro, óxido de alumínio 60 F254 da Merck.

Os eluentes variaram entre misturas de CH2Cl2, AcOEt e Et2O; as proporções utilizadas ou

outras misturas, serão indicadas quando houver relevância, assim como o número de eluições

se superior a uma. A aplicação das amostras foi realizada através de uma esponja aplicadora

preparada para o efeito a partir de algodão e uma pipeta de Pasteur. A placa foi sempre bem

seca entre cada aplicação de amostra. Posteriormente à eluição, as placas foram raspadas nas

zonas contendo os compostos de interesse e as respectivas sílicas extraídas, por contacto com

CH2Cl2 ou AcOEt durante um mínimo de 15 min e sob agitação forte. Outras misturas de

solventes podem ter sido utilizadas e o tempo de extracção variar. As sílicas foram de seguida

filtradas e lavadas, geralmente com AcOEt ou o solvente utilizado na extracção, e o extracto

evaporado num evaporador rotativo e seco na linha de vácuo, quando necessário para

caracterização. A “revelação” das CCF preparativas foi realizada pelo método anteriormente

descrito.

2.1.1.6. Evaporação e secagem de amostras

Sempre que necessário as amostras foram evaporadas no Rotavapor R-200 Büchi,

equipado com um banho de aquecimento B-490 da mesma marca. Quando necessário, as

amostras foram posteriormente secas na linha de vácuo, individualmente e directamente por

intermédio de um take-off ou dentro de um excicador, por vezes com várias amostras.

2.1.1.7. Espectros de infravermelhos

Foram realizados espectros de infravermelho, IV, para a caracterização de produtos de

interesse em pastilhas de brometo de potássio, KBr, num aparelho Jasco FI/IR 4100. Os

espectros dos compostos caracterizados neste trabalho são apresentados no Anexo I (pg. 85).

2.1.1.8. Espectros de massa

Para a caracterização adequada de todos os produtos de interesse, foram traçados

espectros de massa, MS, por injecção directa num espectrómetro de massa Varian 500 – MS

Ion Trap. A fonte de ionização utilizada foi o electrospray (ESI), com azoto (N2) como gás de

nebulização a uma pressão de 30 psi, uma voltagem de 5000 V e tempo máximo de ionização

250 ms. Foram obtidos MSs a polaridade positiva e para alguns casos também negativa.

O solvente utilizado foi metanol (MeOH) para todas as amostras. Os espectros obtidos estão

representados no Anexo II (pg. 89) e um resumo das razões m/z mais relevantes é

apresentado nas Tabelas 5, 6 e 11 do capítulo 3 – Resultados e Discussão.

43

2.1.1.9. Espectros de ressonância magnética nuclear

Os espectros de ressonância magnética nuclear de protão (1H-RMN) foram traçados nos

aparelhos Varian Unity–300 e Bruker Avance II 300 (a operarem a 300 MHz para o 1H) e

maioritariamente no Bruker Avance II 400 (a operar a 400 MHz para o 1H). Os espectros de

carbono (13C-RMN) foram traçados no Bruker 400 (a operar a 100,6 MHz para o 13C) assim

como as experiência bidimensionais: correlações heteronucleares de quantum simples e a

múltiplas ligações (HSQC e HMBC) e espectroscopia de amplificação nuclear de Overhauser

(NOESY). Os solventes utilizados foram acetona-d6 [(CD3)2CO] e dimetilsulfóxido-d6

[(CD3)2SO]. As experiências foram realizadas à temperatura ambiente, a cerca de 22 °C.

No caso do di−OAc−NVP, foram traçados espectros a várias temperaturas, desde a

temperatura ambiente até um máximo de 45 °C em acetona e 70 °C em DMSO. Os espectros

dos compostos aqui caracterizados estão representados no Anexo III (pg. 96). No capítulo 3

– Resultados e Discussão são apresentados alguns pormenores dos espectros em

sobreposição para comparação (Figuras 17-19 e 22-23) e os dados relevantes, como as

atribuições dos sinais dos espectros de 1H-RMN e 13C-RMN e as constantes de acoplamento

(J), encontram-se resumidos nas Tabelas 3, 4, 9 e 10. Todas as escalas foram calibradas

usando o sinal proveniente das quantidades residuais de solvente não deuterado: δ para 1H

– 2,50 [(CD3)2SO] e 2,05 [(CD3)2CO]; δ para 13C – 39,50 [(CD3)2SO] e 29,82 [(CD3)2CO]. Para a

atribuição de alguns sinais de 13C recorreu-se às correlações identificadas através das

experiências de bidimensionais – HSQC, HMBC e NOESY.

2.1.1.10. Pontos de fusão

Os pontos de fusão foram medidos para todos os produtos de interesse em lamela no

aparelho Leica Galen II, equipado com um módulo de aquecimento Leica AG, e não foram

corrigidos.

2.2. Síntese da 2−OH−NVP

2.2.1.1. Acetilação

Num balão de fundo redondo foram adicionados 100 mL de CH2Cl2 a cerca de 500 mg

(1,8 mmol) de NVP e a mistura levada a um refluxo forte (banho de água a cerca de 75 °C ou

banho de óleo a 105 °C). Ao atingir uma temperatura estável no banho, o balão foi retirado do

banho e foram adicionados sequencialmente os reagentes, AgOAc (1,32 g; 7,9 mmol; 4,5 eq)

e I2 (1,15 g, 4,5 mmol, 2,6 eq), sendo retomado o banho o mais rapidamente possível.

A reacção deu-se em cerca de 10 min, após os quais se deixou arrefecer a mistura reaccional

à temperatura ambiente antes de filtrar o sólido amarelo que se formou, o qual foi lavado com

CH2Cl2. A mistura obtida foi cromatografada em coluna.

44

2.2.1.2. Cromatografia em coluna

A solução resultante foi, geralmente, dispersa em celite (545 coarse da Fluka), sendo

seca no evaporador rotativo seguido da linha de vácuo. A mistura dispersa em celite foi

aplicada num funil com sílica gel (60 H da Merck) já acondicionada. Para aplicar a amostra na

sílica foi adicionado n-hexano, utilizado também no acondicionamento da sílica. Os gradientes

de eluentes utilizados foram misturas de CH2Cl2 e AcOEt evoluindo para % crescentes de

AcOEt e subsequentemente misturas de AcOEt e MeOH, até atingir os 100 % de MeOH.

Alternativamente, foi utilizado Et2O no lugar de CH2Cl2. Deste modo foram isolados os produtos

acetoxilados da NVP: 2-acetoxi-NVP (2−OAc−NVP) e 2,5-N-diacetoxi-NVP (di−OAc−NVP) cuja

caracterização será apresentada no capítulo 3 – Resultados e Discussão.

2.2.1.3. Hidrólise

Posteriormente, os produtos anteriormente isolados foram hidrolisados a 2-hidroxi-NVP

(2−OH−NVP) utilizando cerca de 100 mL de MeOH para dissolver cerca de 350 mg de produto

isolado e deixando reagir com mais 10 mL de KOH 1 M em MeOH, durante cerca de 2h.

A mistura reaccional foi parcialmente concentrada por evaporação e de seguida neutralizada

com HCl 1M. À solução neutralizada foi adicionada H2O e feitas pelo menos 2 extracções com

AcOEt. A caracterização do produto final será também apresentada no capítulo 3 – Resultados

e Discussão.

2.3. Oxidação química da 2−OH−NVP

2.3.1.1. Isolamento e purificação dos produtos

Nos casos de interesse foram realizadas CCFs preparativas utilizando como eluente

CH2Cl2/AcOEt 1:1 e extraindo com CH2Cl2 ou AcOEt.

2.3.1.2. Aquecimento, arrefecimento e agitação

Todas as reacções de oxidação foram realizadas com agitação, embora esta possa ter

sido interrompida, em situações a referir. Para garantir uma agitação eficiente, o método mais

utilizado foi a agitação através de barra magnética. No entanto, em algumas circunstâncias

foram também utilizados outros métodos, como um vórtex (MS1 Minishaker da IKA) com

adaptador para 6 amostras a cerca de 1000 rpm, a agitação suave de baloiço dum incubadora

(Incubator Shaker II da Boekel) ou a agitação dum Thermomixer (da Eppendorf com

capacidade para 24 tubos de 1,5 mL) também a cerca de 1000 rpm. Algumas reacções foram

também aquecidas, por intermédio de banhos de água ou óleo ou através do aquecimento

próprio dos aparelhos referidos, a incubadora ou o Thermomixer. Noutros casos ainda,

pretendeu-se manter a temperatura das reacções abaixo da temperatura ambiente, tendo para

tal sido usado um banho de água/gelo, com eventual adição de cloreto de sódio.

45

2.3.2. Óxido de prata, Ag2O

2.3.2.1. Oxidações

Foram realizadas reacções numa gama de 5 a 50 mg de MP, 2−OH−NVP. A quantidade

de oxidante, óxido de prata (Ag2O), usada foi geralmente um pouco inferior a 10 vezes o peso

do material de partida – m(Ag2O) = 10 m(NVP) ⇔ ~12 eq molares de Ag2O. Houve reacções

realizadas unicamente em fase orgânica, tendo os solventes utilizados sido clorofórmio

(CHCl3), CH2Cl2, ou tetra-hidrofurano (THF), em geral, 1 mL para cada 10 mg de MP. Para

várias das condições testadas foram realizadas reacções de fase única e reacções em duas

fases (embora geralmente THF/H2O não faça 2 fases, nas condições usadas tal aconteceu na

maioria dos casos). A fase aquosa foi um tampão a pH7 de 100 mM, citrato ou fosfato,

adicionado no mesmo volume da fase orgânica. Em casos pontuais as proporções utilizadas

podem ter sido diferentes (ver Tabela 1). Por vezes a temperatura das reacções foi mantida

acima da temperatura ambiente, através dum meio apropriado (ver 2.3.1.2), tendo sido a

temperatura máxima testada cerca de 60 °C. Na Tabela 1 apresenta-se um resumo das

condições específicas utilizadas em cada uma das reacções. Os tempos máximos de reacção

variaram entre 5 a 168 h e encontram-se detalhados na Tabela 7 (capítulo 3 – Resultados e

Discussão), assim como um resumo dos principais resultados.

2.3.2.2. Tratamento das misturas reaccionais

O tratamento das m.r.s passou primeiro por uma filtração, que inicialmente foi realizada

através duma pipeta com algodão, mas desta forma podiam ser encontrados resíduos de prata

(Ag) nas amostras tratadas. Posteriormente passou a usar-se um filtro de porcelana com uma

boa camada de celite para melhorar a retenção das pequenas partículas de Ag. Mesmo assim

não se conseguiu garantir a eliminação total dos resíduos. O sólido foi sempre lavado com o

solvente em uso e geralmente com mais um pouco de MeOH. No caso das reacções realizadas

com 2 fases, posteriormente à filtração foram extraídos eventuais produtos presentes na fase

aquosa e combinados com a fase orgânica pré-existente. Quando foi utilizado THF, a m.r. foi

evaporada antes do tratamento da fase aquosa. As fase aquosas foram extraídas, pelo menos

3 vezes, com AcOEt. A caracterização de alguns dos produtos isolados será apresentada no

capítulo 3 – Resultados e Discussão.

46

2.3.3. Sal de Fremy

2.3.3.1. Oxidações

Foram realizadas reacções numa gama de 3,5 a cerca de 140 mg de MP, 2−OH−NVP.

A quantidade de oxidante, sal de Fremy [(KSO3)2NO], usada foi cerca de 10 vezes o peso do

material de partida – m(Fremy) = 10 m(NVP) ⇔ 12 eq molares de Fremy. Nestas reacções

geralmente utilizou-se 1mL de fase orgânica e 1 mL de fase aquosa para cada 10 mg de MP:

como fase orgânica usou-se MeOH, THF e AcOEt; como fase aquosa foram utilizadas soluções

tampão, sobretudo fosfato 100 mM, a pH 5, 7 e 10, ou por vezes simplesmente H2O destilada

(como anteriormente referido, embora geralmente THF/H2O não faça 2 fases, nas condições

usadas tal aconteceu na maioria dos casos). Houve também reacções realizadas unicamente

em fase aquosa. A temperatura das reacções foi frequentemente mantida acima ou abaixo da

temperatura ambiente, usando um dos meios referidos (ver 2.3.1.2) e tendo a gama de

temperaturas testada variado entre cerca de 5 e 60 °C. Na Tabela 2 são apresentadas as

condições específicas para as reacções realizadas. Os tempos máximos de reacção variaram

Tabela 1 – Condições das reacções de oxidação da 2−OH−NVP com Ag2O

Nota: a eq ox = n(Ag2O)/n(2−OH−NVP). b Tp ct e tp ff correspondem a tampão citrato e fosfato, respectivamente.

Fase Orgânica Reacção m(MP)/mg eq oxa

Solvente1 Solvente2 Fase Aquosab Temperatura Agitação

MS1 9 11,0 — — Ambiente Magnética

MS3 11 10,9

CHCl3 1 mL

— — 40 °C Incubadora Incubadora

MS8 19 ~ 6,9 AcOEt 3 mL — 60 °C

Banho Água Magnética

MS10 19 13,3

CH2Cl2 2 mL

— — 60 °C Banho Óleo Magnética

MS12 5 12,9 — —

MS13 5 11,7

CHCl3 0,5 mL

— Tp ct pH7 100 mM 0,5 mL

MS14 5 11,7 — —

MS15 5 13,4

CH2Cl2 0,5 mL


MS16 5 12,7 — —

MS17 5 11,7

THF 0,5 mL


Ambiente Vórtex

MS27 21 12,0 THF 20 mL — —

MS28 21 12,6 THF 10 mL — Tp ff pH7

100 mM 10 mL

Ambiente Magnética

MS29 53 10,8 THF 25 mL — Tp ff pH7

100 mM 25 mL Ambiente Magnética

47

entre 1 a 208 h e encontram-se detalhados na Tabela 8 (capítulo 3 – Resultados e Discussão),

assim como um resumo dos principais resultados.

Tabela 2 – Condições das reacções de oxidação com sal de Fremy

Reacção m(MP)/mg eq oxa Fase Orgânica Fase Aquosab Temperatura Agitação

MS2 10 13,3 Ambiente Magnética

MS4 10 12,0

MeOH 1 mL

H2O 1 mL 40 °C

Incubadora Incubadora

MS5 12 9,9 H2O 1 mL

MS6 12 9,9 Tp ct pH6 10 mM 1 mL

Ambiente Magnética

MS7 9 ~ 13,1c

THF 1 mL

Tp ct pH7 100 mM 1 mL

50-60 °C Incubadora

Incubadora

MS9 20 ~ 12,0 c 60 °C Banho Água

Magnética

MS11 19 12,4

AcOEt 2 mL

Tp ct pH7 100 mM2 mL 60 °C

Banho Óleo Magnética

MS24 22 11,5 — Tp ff pH10 100 mM 4 mL

MS25 24 10,7 THF 2 mL

MS26 23 10,9 AcOEt 2 mL

Tp ff pH10 100 mM 2 mL

10 °C a Ambiente Banho Água/Gelo Magnética

MS31 137 10,2 THF 50 mLd


5 °C a 30 °C Banho Água/Gelo

Magnética

MS34 3,6 12,3 H2O 0,5 mL

MS35 3,8 11,6 Tp ff pH5 100 mM 0,5 mL

MS36 3,5 11,6 Tp ff pH7 100 mM 0,5 mL

MS37 3,0 14,7

—

Tp ff pH10 100 mM 0,5 mL

MS38 3,5 12,3 H2O 0,5 mL

MS39 3,2 12,7 Tp ff pH5 100 mL 0,5 mL

MS40 3,6 12,0 Tp ff pH7 100 mM 0,5 mL

MS41 3,7 11,3

THF 0,5 mL


MS42 3,5 11,3 H2O 0,5 mL

MS43 3,7 12,3 Tp ff pH5 100 mM 0,5 mL

MS44 3,7 12,3 Tp ff pH7 100 mM 0,5 mL

MS45 4,2 10,5

AcOEt 0,5 mL


30 °C Thermomixer Thermomixer

MS46 6 12,8 THF 6 mL


30 °C Banho Água Magnética

Notas: a eq ox = n(sal de Fremy)/n(2−OH−NVP). b Tp ct e tp ff correcpondem a tampão citrato e fosfato, respectivamente. c N° de equivalentes aproximado, porque foi preparada uma solução do oxidante, mas não se obteve a dissolução total. d Este solvente não foi adicionado logo de início, mas sim às 44h30m de reacção.

48

2.3.3.2. Tratamento das misturas reaccionais

O tratamento das m.r.s passou sempre pela recolha da fase orgânica sobrenadante no

caso do AcOEt, ou a sua evaporação no caso do THF, seguindo-se extracção da fase aquosa

com AcOEt. A caracterização dos produtos isolados considerados mais relevantes será

apresentada no capítulo 3 – Resultados e Discussão.

2.4. Oxidação enzimática da 2−OH−NVP

As reacções enzimáticas foram realizadas no aparelho Thermomixer, anteriormente

referido, a temperatura constante e com agitação adequada.

2.4.1.1. Peroxidase de rábano

Foi utilizada peroxidase de rábano (HRP) da Sigma, em solução a 1250 unidade/mL de

tampão fosfato 10 mM a pH7, e as reacções foram realizadas a 30 ou 37 °C. A par das

reacções com 2−OH−NVP foi realizado um branco e utilizada uma amostra de fenol para

controlo positivo, isto é, para testar quantitativamente a actividade da enzima. As quantidade

utilizadas foram 5 mg de produto, 500 µL de tampão fosfato 100 mM a pH7, 50 µL de enzima e

50 µL de H2O2 a 30 %. O tempo máximo de reacção foi de cerca de 3h.

2.4.1.2. Lactoperoxidase

Foi utilizada lactoperoxidase da Sigma, em solução a 135 unidades/mL de tampão

fosfato 33 mM a pH7. As reacções foram realizadas a 37 °C e as restantes condições foram

idênticas às usadas para a HRP.

49

3. Resultados e Discussão

3.1. Síntese da 2−OH−NVP

3.1.1. Procedimento

Resumida na Figura 14 está a síntese do metabolito hidroxilado na posição 2 – referente

ao anel A – da NVP, que foi optimizada no grupo pela Doutora Alexandra Antunes. Iremos

contudo descrevê-la sucintamente e debruçar-nos sobre alguns pontos relevantes do trabalho

desenvolvido previamente ao aqui apresentado. Já se encontravam descritos métodos de

síntese deste e outros metabolitos da NVP57; contudo havia interesse em encontrar sínteses

mais simples. O procedimento aqui apresentado é realizado em menos passos, parte

directamente da NVP e resulta em melhores rendimentos globais. A nova síntese, consiste

essencialmente em 2 passos, sendo o primeiro a acetoxilação do material de partida (MP) e o

segundo uma hidrólise do material acetoxilado ao respectivo derivado hidroxilado. Como se

pode prever pelo tipo de reacções envolvidas, a maior parte do trabalho de optimização

centrou-se no primeiro passo. Verificou-se que algumas condições, como o solvente e a

temperatura da reacção, influenciavam fortemente o rendimento obtido e como tal foram

testadas várias opções. As melhores condições encontradas foram CH2Cl2 a refluxo num

banho de óleo a 104 °C. Durante o desenvolvimento do método também se notou que era

crucial a ordem de adição dos reagentes, pois se o iodo (I2) fosse adicionado antes do acetato

de prata (AgOAc) não havia conversão significativa e era recuperado o MP; mais adiante na

discussão faremos alguns comentários ao mecanismo da reacção baseados sobretudo nesta

observação. Outra das observações feitas na altura, foi que o aumento do tempo de reacção

e/ou do número de equivalentes dos reagentes fazia aumentar a percentagem do produto

secundário di-acetoxilado (di−OAc−NVP, XIV, Figura 15, pg. 51). O método inclui também uma

cromatografia entre os dois passos de reacção pois verificou-se ser necessária a purificação do

produto maioritário, a 2-acetoxi-NVP (2−OAc−NVP, XIII, Figura 15, pg. 51), antes de proceder à

4a

11a

4

N1

3

2

NH

5

8

9

7

N10

6a

10a

6

N11

13

15 14

12O

N

NH

NN

O

OH

1) AgOAc

2) I2

CH2Cl2, ∆

10 min

KOH, MeOHA C

Figura 14 – Esquema reaccional simplificado da síntese do metabolito 2−OH−NVP a partir da NVP. Para efeitos de clarificação, inclui-se a identificação dos anéis e a numeração dos átomos da NVP.

50

sua hidrólise. Não foi possível encontrar condições que permitam a realização dos dois passos

em sequência pois a purificação do produto final, 2−OH−NVP, torna-se demasiado difícil.

Durante o presente trabalho foi necessário realizar esta síntese algumas vezes, tendo

sido feitas algumas observações de interesse para a discussão deste procedimento e

introduzidas algumas alterações pequenas ao método. Uma das dúvida que se punha era a

necessidade de fazer a reacção num banho de temperatura tão elevada quando o solvente era

CH2Cl2, que tem um ponto de ebulição muito mais baixo, da ordem dos 40 °C. O procedimento

adaptado envolveu a utilização dum banho de água e verificação da altura do refluxo; para se

obter um refluxo aproximadamente equivalente, a cerca de meia altura do condensador, o

banho de água apenas precisa de estar a cerca de 75 °C. Nestas condições a reacção parece

realizar-se com conversões adequadas e tem algumas vantagens, como a maior rapidez na

subida e homogeneização da temperatura do banho e maior estabilidade da temperatura do

banho quando se retira o balão para adição dos reagente e se volta a colocá-lo. Desta forma

há um menor gasto energético global devido à temperatura inferior do banho e à redução do

tempo de aquecimento do banho, sendo esta última também útil na redução do tempo de

preparação prévio, que era algo longo para uma reacção que em si é muito rápida. Uma

desvantagem do uso de banho de água poderia ser a perda por evaporação, pois a

temperatura é mesmo assim suficiente para induzir evaporação considerável; contudo o tempo

da reacção é curto e o tempo de regularização da temperatura não é suficiente para que isso

seja efectivamente um problema.

De maior influência no processo de síntese, foi a caracterização e confirmação da

relevância do produto secundário anteriormente identificado, di−OAc−NVP, que aparecia com

bastante frequência. Este produto secundário pode estar presente em quantidade considerável

na mistura final, o que se pensa levar a que a reacção não origine um rendimento tão alto

como o espectável, embora a conversão da NVP possa parecer completa. Outra razão possível

para esta limitação serão perdas na cromatografia, devido à hidrólise espontânea durante este

processo catalisada pela acidez da sílica. Como já se referiu, o produto de hidrólise do

intermediário maioritário é o produto final pretendido; no entanto, não foram encontradas

condições para o recuperar integralmente da sílica. Assim, a hidrólise espontânea antes ou

durante a cromatografia originará perdas inevitáveis. A observação efectuada de maior

interesse potencial foi que a hidrólise do produto secundário parece originar o produto final

pretendido, a 2−OH−NVP, nas mesmas condições utilizadas para o componente intermediário

maioritário. Contudo, não se conseguindo desenvolver uma metodologia que permita a

purificação do produto final, a hidrólise directa da mistura reaccional – que permitiria a

diminuição de perdas por conversão dos dois intermediários em simultâneo – continua

dificultada. Chegou a testar-se o uso de AcOEt como único eluente, para a purificação

cromatográfica da 2−OH−NVP, mas a separação não foi tão eficaz como esperaríamos pelas

CCFs. No entanto, a observação anterior abre a possibilidade de testar outras condições

51

reaccionais que venham a facilitar a purificação e a recuperação. Um método que poderia

permitir até a purificação amostras de 2−OH−NVP com impurezas, seria a acetoxilação total da

amostra obtendo-se maioritariamente o produto di−OAc−NVP. O isolamento apenas deste

último até seria útil porque usando a mesma técnica de cromatografia, mas introduzindo o Et2O

na mistura de eluentes, aquele produto é muito mais separado do MP e das outras impurezas

da reacção que têm um rf próximo da 2−OAc−NVP. Contudo tentativas preliminares que se

fizeram com anidrido acético em piridina não mostraram resultados promissores,

provavelmente porque a adição ao N é oxidativa assim como a adição ao anel, pelo que

condições de acetilação simples não são suficientes. Uma possibilidade de alteração directa no

procedimento de síntese, a partir das observações tidas durante a optimização, seria o

prolongamento do tempo de reacção. Em princípio, originar-se-ia um aumento do rendimento

do produto secundário, di−OAc−NVP, contudo em simultâneo poderá haver um aumento

doutros produtos secundários. Novas tentativas e uma optimização das condições naquele

sentido poderiam ser uma via interessante de melhoramento desta síntese, que não se fizeram

por não ser este o objectivo do presente trabalho.

Apresenta-se na Figura 15, como resumo, o esquema reaccional evidenciando os

intermediários obtidos e a possibilidade de hidrólise de ambos ao produto final. Relativamente

aos rendimentos, os resultados anteriores indicavam valores da ordem dos

43 % para a conversão da NVP em 2−OAc−NVP, com isolamento, e 79% para a hidrólise.

Não foi possível calcular rendimentos com as alterações introduzidas às condições da reacção,

em especial incluindo a hidrólise de ambos os produtos intermediários, 2−OAc−NVP e

di−OAc−NVP.

N

NH

NN

O

N

NH

NN

O

OO

N

NH

NN

O

OH

+

1) AgOAc

2) I2

CH2Cl2, ∆

10 min

KOH, MeOH

N

N

NN

O

O

O

O

O

XIII XIV

Figura 15 – Esquema reaccional da síntese da 2−OH−NVP, com produtos intermediários.

52

3.1.2. Mecanismo Como já se referiu, pretende-se também fazer uma pequena discussão do mecanismo

de reacção envolvido na acetoxilação, para tentar compreender melhor as condições e os

resultados obtidos em termos de produtos secundários. Para aquela reacção, uma hipótese

forte seria a mediação do ataque pelo I2, por um mecanismo radicalar ou outro. Na literatura, as

condições utilizadas correspondem à reacção de Prévost, que mecanisticamente se pensa ser

iniciada pelo ataque electrófilo de I+ a um alceno58, formando um ião iodónio cíclico. Contudo

um ataque deste tipo a uma piridina é muito pouco provável devido à sua aromaticidade e à

electrodeficiência característica destes heterociclos. Outra possibilidade seria o ataque do I+ ao

N da piridina, favorecendo um ataque nucleófilo na posição orto o que seria mais concordante

com os resultados obtidos já que não se obteve um produto di-substituído, característico da

reacção de Prévost, embora também não se esteja em condições exactamente idênticas.

Contudo, a hipótese dum papel iniciador do I2 não é concordante com a observação inicial de

que a adição daquele reagente em primeiro lugar implica não se dar reacção. No entanto,

pensando na afinidade entre a Ag e o I que leva à rápida formação dum precipitado quando se

adicionam os reagentes, presumivelmente AgI, é mais natural assumir que seja esta a força

motriz iniciadora da reacção e que transientemente poderá ser formada uma espécie do tipo

hipoiodito de acetilo, CH3COOI. Na literatura encontram-se referências a esta espécie e até

especificamente ao combinar AgOAc e I2 em ácido acético glacial59. Embora esta referência

trate de quebras oxidativas de álcoois e outras referências mencionem iodações em condições

similares60, pensamos que aquela espécie é a mais plausível nas condições usadas e para os

resultados obtidos. Pondo a hipótese da formação transiente da espécie CH3COOI temos

novamente vários mecanismos a considerar. Uma possibilidade seria a quebra homolítica da

ligação O−I, possivelmente catalisada pela luz, hν, iniciando um mecanismo radicalar59. Apesar

da evidência contra a iniciação através do I2, no grupo já haviam sido realizados alguns testes

com armadilhadores de radicais para a verificação daquela hipótese, os quais não apoiaram

um mecanismo daquele tipo (Doutoras Alexandra Antunes e Mariana Duarte, comunicações

pessoais). Assim, pondo a hipótese de um mecanismo não radicalar poderemos ter um ataque

do Iδ+ ao par de electrões livre do N da piridina e um posterior ataque do −OAc à posição

adjacente do anel. O esquema apresentado na Figura 16 é baseado nesta hipótese.

53

A partir da discussão do mecanismo da reacção, podemos prever outros produtos

secundários possíveis. Existem pelo menos mais 2 produtos visíveis nas CCFs da m.r., embora

estejam presentes em quantidade reduzidas. Um desses produtos tem rf inferior a 2−OH−NVP

e o outro, que foi detectado nas últimas repetições da síntese, tem rf entre a 2−OAc−NVP e a

NVP. Eventualmente estes produtos podem estar relacionados um com o outro, pois seria

plausível pela proximidade de rfs que fossem outro acetoxilado e o respectivo produto de

hidrólise. Dado que estes produtos não foram isolados, não temos, porém, nenhuma evidência

estrutural concreta. Como vimos, a NVP parece não reagir directamente com I2 provavelmente

devido à desactivação dos seus anéis para adições electrófilas. Por isso seria mais provável

que outros produtos secundários fossem também acetoxilados e não iodados. Por outro lado,

a substituição largamente maioritária na posição 2 poderá ser devida a um carácter doador

inferior do N para a este carbono, devido à presença do grupo carbonilo, em comparação com

N

NH

NN

OO

-

O

Ag+

O

O

I+ I2 AgI + δ+

δ−

N

NH

NN

O

I

O

O

H

O-

O

Ag+

N

NH

NN

O

OO

N+

NH

NN

O

IH

O-

O

+ AgI + CH3COOH

Figura 16 – Hipótese de mecanismo para a acetilação oxidativa nas condições deste trabalho.

54

o N para ao carbono 3. Em oposição, a presença do grupo carbonilo poderá ser responsável

por não ser observada substituição no anel C, devido a uma menor probabilidade de ataque

inicial do N daquele anel ao Iδ+. De qualquer forma, a haver outro produto de acetoxilação,

a 9-acetoxi-NVP poderá mesmo assim ser mais provável que a 3-acetoxi-NVP. Deve ainda ser

mencionado que foi aparente a presença de outros produtos secundários de polaridade

elevada que dificultam a purificação do produto final, 2−OH−NVP.

3.1.3. Caracterização dos produtos isolados Relativamente à estabilidade, a 2−OH−NVP e os outros compostos envolvidos na

síntese são bastante estáveis quando armazenados em pó ou em soluções de solventes

orgânicos, mesmo a temperaturas ambiente elevadas, cerca de 30 °C, com a excepção da

di−OAc−NVP e da 2−OAc−NVP, que em solução têm alguma tendência a hidrolisar

espontaneamente.

Dois novos produtos foram isolados a partir duma mistura de várias fracções contendo

2−OH−NVP que se tentou purificar por intermédio duma cromatografia realizada com AcOEt

como único eluente. Os produtos que não tinham sido observados anteriormente,

apresentavam igual rf em AcOEt, mas diferentes afinidades para com o Et2O. Em misturas de

AcOEt e Et2O é possível obter rfs diferentes e adicionando Et2O à mistura de produtos é

possível obter um pp branco e manter o produto corado em solução; tendo o produto branco

sido purificado desta forma. O outro produto que origina soluções muito escuras, mas é roxo

quando seco, ficou sempre contaminado com o primeiro, mesmo quando se realizou uma CCF

preparativa em condições nas quais eram aparentemente separados. Inicialmente não se

compreendeu a origem dos novos produtos, mas ao identificar o composto branco como sendo

a 2,5-N-di-hidroxi-NVP (Ndi−OH−NVP, XV, Figura 21, pg. 62) deduziu-se que fosse

proveniente de hidrólise da di−OAc−NVP. É provável que o produto roxo tenha uma

semelhança estrutural grande com a Ndi−OH−NVP, dados os rfs próximos e os resultados

obtidos por 1H−RMN. Partindo do princípio que seriam ambos produtos de hidrólise da

di−OAc−NVP, poderíamos pensar que fosse, por exemplo, o 2-acetoxi-5-N-hidroxi-NVP.

No entanto não podendo realizar uma caracterização mais detalhada por falta de pureza, não

se podem avançar mais considerações.

Apresenta-se um resumo do resultados da caracterização dos compostos envolvidos na

síntese da 2−OH−NVP nas figuras e tabelas que se seguem. Sucedem-se algumas

considerações sobre a caracterização de cada um dos compostos. O material de partida

– a NVP – que foi obtido comercialmente, é incluído para sobretudo para comparação.

Os espectros de IV, MS, 1H-RMN e 13C-RMN são apresentados por completo nos Anexos

I a III.

55

6789101112 ppm

2,5-N-di-OH-NVP(em DMSO): X = OH, Y = OH

2-OH-NVP (em DMSO): X = OH, Y = H

2-OAc-NVP (em acetona): X = OAc, Y = H

di-OAc-NVP (em DMSO): X = OAc, Y = OAc

NVP (em acetona): X = Y = H

Figura 17 – Sobreposição, na zona dos protões aromáticos, dos espectros de 1H−RMN dos compostos isolados na síntese da 2−OH−NVP, incluindo o produto secundário, di−OAc−NVP, e o seu produto de hidrólise, Ndi−OH−NVP.

0,00,20,40,60,81,01,2 ppm

2,5-N-di-OH-NVP(em DMSO)

2-OH-NVP (em DMSO)

2-OAc-NVP (em acetona)

di-OAc-NVP (em DMSO)

NVP (em acetona)

Figura 18 – Sobreposição, na zona de campo alto, dos espectros de 1H−RMN dos compostos isolados na síntese da 2−OH−NVP, incluindo o produto secundário, di−OAc−NVP, e o seu produto de hidrólise, Ndi−OH−NVP.

N

N

NN

O

X

Y

56

Tabela 3 – Atribuições dos sinais de 1H−RMN dos produtos isolados na síntese

δδδδ/ppm (integraçãoa, multiplicidadeb); J/Hzc atribuições

NVP di−OAc−NVP 2−OAc−NVP 2−OH−NVP Ndi−OH−NVP

Hs14

Hs15

0,38 (2H, m)

0,87 (2H, m)

0,29 (1H, m); 0,59 (1H, m)

0,88 (1H, m); 1,02 (1H, m)

0,40 (2H, m)

0,87 (2H, m)

0,35 (2H, m)

0,85 (2H, m)

0,38 (2H, m)

0,69 (2H, m) ciclopropilo

H13 3,74 (1H, m) 2,80 (1H, m) 3,63 (1H, m) 3,60 (1H, m) 2,74 (1H, m)

Me Hs12 2,43 (3H, s) 2,07 (3H, sd) 2,46 (3H, sd) 2,23 (3H, s) 1,87 (3H, sd)

Me (OAc) — 2,48 (3H, s); 1,79 (3H, s) 2,26 (3H, s) — —

H2 8,08 (1H, d) Jo (H2, H3) = 4,9

— — — — anel A

H3 7,05 (1H, d) 7,01 (1H, sd) 6,84 (1H, sd) 6,30 (1H, s) 6,26 (1H, s)

H7 8,06 (1H, dd) Jo (H7, H8) = 7,7

8,18 (1H, dd) Jo (H7, H8) = 7,7

8,07 (1H, dd) Jo (H7, H8) = 7,6

7,97 (1H, dd) Jo (H7, H8) = 7,6

8,16 (1H, dd) Jo (H7, H8) = 7,7

H8 7,15 (1H, dd) Jo (H8, H9) = 4,7

7,26 (1H, ddd) Jo (H8, H9) = 4,6

7,18 (1H, dd) Jo (H8, H9) = 4,8

7,17 (1H, dd) Jo (H8, H9) = 4,8

6,64 (1H, dd) Jo (H8, H9) = 4,8

anel C

H9 8,49 (1H, dd) Jm (H7, H9) = 2,0

8,69 (1H, dd) Jm (H7, H9) = 2,0

8,49 (1H, dd) Jm (H7, H9) = 2,0

8,47 (1H, dd) Jm (H7, H9) = 2,0

8,24 (1H, dd) Jm (H7, H9) = 1,7

NH (5) 8,79 (1H, sl) — 8,80 (1H, sl) 9,60 (1H, s) —

2−OH — — — 10,56 (1H, sl) 11,40 (1H, s)f

5−OH — — — — 9,49 (1H, s)f

Hs lábeise

N+H (11) — — — — 7,97g (1H, sd)f

Notas: a integração representada como número de protões, nH. b multiplicidade apresentada como s – singuleto, sl – siguleto largo, d – dupleto, dd – dupleto de dupletos, m –

mutipleto. c constantes de acoplamento: Jo – acoplamento orto, Jm – acoplamento meta. d singuletos desdobrados. e os H lábeis geralmente são singuletos largos que abatem por adição de D2O; no caso dos compostos em estudo os

grupos OH parecem tornar-se singuletos bem definidos quando se muda de solvente de acetona para DMSO. f os sinais dos Hs lábeis não foram atribuídos inequivocamente. g supõe-se que pode haver um protão associado aos Ns 1, 10 e/ou 11 (ver Figura 21, pg. 62).

57

80100120140160180 ppm

2,5-N-di-OH-NVP (em DMSO) 2-OH-NVP (em DMSO) 2-OAc-NVP (em acetona)

di-OAC-NVP (em DMSO) NVP (em acetona)

Figura 19 – Sobreposição, na zona dos carbonos aromáticos, dos espectros de 13C−RMN dos compostos isolados na síntese da 2−OH−NVP, incluindo o produto secundário, di−OAc−NVP, e o seu produto de hidrólise, Ndi−OH−NVP.

Tabela 4 – Atribuições dos sinais de 13C−RMN dos produtos isolados na síntese

δδδδ/ppm atribuições NVP di−OAc−NVP 2−OAc−NVP 2−OH−NVP Ndi−OH−NVP

C14

C15

9,1 9,4

10,0 10,4

9,1 9,3

8,5 8,6

6,8 6,9 ciclopropilo

C13 ~30a 29,3 ~30a 28,9 23,8

Me C12 17,7 16,0 18,1 17,8 16,0

Me (OAc) — 20,2; 28,0 21,0 — —

C2 144,7 162,3 c 160,4b 163,9b

C3 123,0 132,1 114,6 ~108 d 122,9

C4 153,1 ~118d

C4a 144,0 144,7

152,6 167,5b

anel A

C11a 93,0 106,4b

C6a

121,8b 155,3b

115,0

c 121,2b 124,9b 107,6

C7 140,8 138,8 141,0 139,9 137,7

C8 119,9 117,9 120,2 119,3 111,3

C9 152,3 153,6 152,3 150,9 152,2

anel C

C10a 151,1 159,4

carbonilo C6

161,3b 167,8b 177,9

c

167,1

158,4 168,8b

carbonilo (OAc) — 168,8; 171,9 169,1 — —

Notas: (ver página seguinte)

58

Notas (Tabela 4): a fica obscurecido pelo sinal do solvente, evidenciado pelo espectro HSQC. b sem atribuição definitiva, devido à falta de correlações bidimensionais. c no espectro traçado em acetona não se detectaram os carbonos quaternários, devido à baixa concentração.

Foi também traçado um espectro em DMSO, mas a amostrava estava pouco pura, não se conseguindo fazer as atribuições correctas devido a interferências.

d sinais pouco definidos, mas com correlação nos espectros bidimensionais.

Tabela 5 – Resumo dos fragmentos positivos obtidos por MS-ESI dos produtos isolados na síntese

m/z iões +

NVP di−OAc−NVP 2−OAc−NVP 2−OH−NVP Ndi−OH−NVP

M+Na++MeOH 321 379 353

MH++MeOH 357 331

M+Na+ 347 321

MH+ 267 325 283 299

[MH−CH3CO2H+MeOH+Na]+ 377

[MH−CH3CO2H+MeOH]+ 355

[MH−CH2=C=O]+ 283

[MH−CH3CO2H−CH2=C=O+MeOH+Na]+ 336

[MH−CH3CO2H−CH2=C=O+MeOH]+ 313

[MH −CH2=C=O−ciclopropilo]+ a 243

[3-acil-2-ciclopropilamino-piridina]+ b 161

[2-ciclopropilamino-piridina]+ c 133 Notas: a b c

NH

NH

NN

O

OH

+ H+

N

C+

O

N

NN

+

Tabela 6 – Resumo dos fragmentos negativos obtidos por MS-ESI dos produtos isolados na síntese

m/z iões −−−−

di−OAc−NVP 2−OAc−NVP 2−OH−NVP Ndi−OH−NVP

[M−H+MeOH]− 329

[M−H]− 323 281 297

[M−H−CH3CO+MeOH]− a 369

[M−H −CH3CO]− a 280

[M−CH3CO2H−CH3CO+MeOH]− 311 Notas: a Estas propostas de fragmentação apresentam diferença de uma unidade para as razões m/z detectados.

59

3.1.3.1. NVP

Não há muitas considerações a fazer sobre a caracterização

da NVP, que como já se referiu é comercial e se apresenta aqui

para comparação com os demais compostos estruturalmente

relacionados. Contudo, houve uma observação sobre o seu ponto

de fusão que gostaríamos de relatar. O ponto de fusão da NVP foi

medido com o intuito de comprovar a calibração do aparelho

utilizado e verificar a conveniente utilização do mesmo. O ponto de

fusão da NVP está referido como sendo 196 °C61. No entanto, por mais que uma ocasião,

aquilo que se observou para a NVP adquirida foi uma transição de estado pouco definida que

se dá a pouco e pouco e que culmina, a cerca de 200 °C, numa reorganização dos cristais da

amostra, que contudo só fundem a uma temperatura bastante superior, 245-250 °C. Sendo

confirmada a pureza da amostra através da caracterização espectroscópica realizada, resta

admitir que poderá haver uma transformação entre formas polimorfas, eventualmente com

diferentes graus de hidratação.

3.1.3.2. di−OAc−NVP

N

N

NN

O

O

O

O

O

N

N

NN

O

O

O

O

O

Figura 20 – Isómeros cis e trans da di−OAc−NVP.

O espectro de 1H-RMN da di−OAc−NVP apresentou algumas características curiosas,

como um desdobramento acentuado dos sinais dos Hs do grupo ciclopropilo, realçado na

Figura 18 pela presença de 4 multipletos bem distintos na zona de campo alto.

Esta observação levou a que se traçassem novos espectros com variação de temperatura

– em acetona até aos 45 °C e em DMSO até aos 70 °C – não tendo sido observadas variações

nos multipletos. A diminuição de temperatura não foi realizada, mas pensa-se que se possa

tratar de verdadeiros isómeros e não só de confórmeros. A construção de uma estrutura

modelo e simulações simples da estrutura em 3D com o programa ChemSktech permitiram

realçar a possibilidade de dois isómeros, cis e trans, relativamente às posições do grupo

N

NH

NN

O

60

N−OAc e ciclopropilo (Figura 20), com possível interacção dos grupos no isómero cis.

No entanto, observando a sobreposição de espectros de 1H-RMNs em pormenor na zona dos

protões do grupo ciclopropilo (Figura 18), vê-se que a NVP e a 2−OAc−NVP também

apresentam um muito ligeiro desdobramento daqueles sinais. No caso da di−OAc−NVP,

verifica-se ainda um desdobramento do sinal de H8, embora muito pequeno, e não observável

nos outros Hs aromáticos do anel C. O desdobramento doutros sinais como os H3 e Hs12 não

foi exclusivo do di−OAc−NVP (ver Tabela 3). A di−OAc−NVP foi o composto melhor

caracterizado, tendo sido realizados para além dos espectros HSQC e HMBC, um espectro

NOESY. Com as correlações dos espectros bidimensionais foi possível atribuir todos os

carbonos observados no espectro de 13C-RMN, à excepção dos carbonos dos 2 grupos acetilo,

os quais não foi possível distinguir um do outro. Estas correlações permitiram também distinguir

os Hs dos 3 grupos metilo presentes na molécula.

Os MS obtidos para a amostra de di−OAc−NVP não apresentam o ião molecular e todos

os fragmentos parecem estar associados pelo menos a uma molécula de solvente, MeOH, para

além da possibilidade de se associarem ainda a um ião sódio. Assim, identificaram-se os

fragmentos como sendo provenientes da perda de ácido acético e posterior perda de ceteno;

no modo positivo (ver Tabela 5) foram ambos encontrados em associação a MeOH e a

MeOH+Na+ e no modo negativo (ver Tabela 6) foram encontrados os fragmentos

correspondentes associados a MeOH.

O espectro de IV da di−OAc−NVP apresenta os esperados 3 picos de carbonilo, a 1769,

1692 e 1645 cm−1, que se atribuem respectivamente, ao 2-acetoxi, ao 5-acetoxi e ao NHCOAr.

Estas atribuições foram feitas por comparação com os carbonilos da NVP e 2−OAc−NVP.

A amostra de di−OAc−NVP apresentou cristais com comportamentos díspares: enquanto

os cristais de maiores dimensões parecem fundir com decomposição a temperaturas mais

baixas e pouco definidas (abaixo dos 200 °C) alguns cristais mais pequenos parecem persistir

acima de 300 °C. Poderá haver sistemas de cristalizações diferentes ou apenas a incorporação

de solvente nos cristais maiores. Não se descarta a possibilidade dos cristais mais resistentes

serem alguma impureza.

3.1.3.3. 2−OAc−NVP

O espectro de 1H-RMN da 2−OAc−NVP é muito próximo

do da NVP, à excepção da ausência de sinal para o H2,

da presença dum sinal de Me extra e de alguma

blindagem do H3. Esta blindagem do H3 é natural pela

presença do grupo OAc no carbono adjacente e foi

também observada na mesma ordem de grandeza para a di−OAc−NVP quando o espectro foi

traçado no mesmo solvente. Como para a NVP, não foi possível identificar todos os carbonos

porque no espectro de 13C-RMN não se distinguem bem os carbonos quaternários, não se

N

NH

NN

O

OO

61

observando também as respectivas correlações nos espectros bidimensionais. Em DMSO foi

possível atingir uma concentração superior, mas a amostra utilizada não estava tão pura,

havendo demasiadas interferências para poder atribuir os carbonos observados

inequivocamente.

Os MS obtidos para a amostra de 2−OAc−NVP apresentam muitos fragmentos

associados ao solvente ou a iões sódio (ver Tabela 5), como para a di−OAc−NVP.

São detectados o MH+ e o respectivo [M−H] −, assim como, em ambos os modos, a perda dos

grupos ceteno ou acetilo. No modo positivo são detectadas as associações do ião molecular

com Na+, MeOH e ambos. Neste modo há ainda um fragmento para o qual propomos a perda

de ceteno e ciclopropilo (ver Tabela 5). Embora, este tipo de fragmentação não seja comum

por ESI, que é uma técnica de fragmentação suave, ela pode ser observada com ionização por

impacto electrónico (EI)46. A escolha de uma voltagem elevada em ESI, poderá ser a razão da

observação deste tipo de fragmento e das fragmentações ainda mais extensas observadas

noutros casos, como veremos.

Como já se referiu, o espectro de IV da 2−OAc−NVP apresenta 2 picos de carbonilo,

a 1778 e 1645 cm−1, que se atribuem respectivamente, ao CH3COO e ao NHCOAr,

por comparação com os carbonilos da NVP e da di−OAc−NVP.

A fusão da 2−OAc−NVP deu-se a 255-260 °C, nos 2 ensaios realizados.

3.1.3.4. 2−OH−NVP

Para a 2−OH−NVP verificou-se uma blindagem ainda

maior do H3, que a observada para as di−OAc−NVP e

2−OAc−NVP; por outro lado parece haver desblindagem do H

lábil do N5 e, como seria de esperar, pode identificar-se mais

um H lábil relativo ao grupo hidroxilo. Os Hs do anel C são

pouco afectados, tal como observado para a 2−OAc−NVP.

Grande parte dos carbonos visíveis no espectro de 13C-RMN foram atribuídos, não sendo

contudo possível fazê-lo inequivocamente para todos. Os carbonos sem correlação nos

espectros bidimensionais foram incluídos na Tabela 4, tendo sido as atribuições realizadas por

comparação com as da di−OAc−NVP.

A 2−OH−NVP foi o composto para o qual se obtiveram MSs mais simples, tendo sido o

MH+ e o correspondente [M−H] − os picos base nos modos positivo como negativo,

respectivamente. No modo positivo, MH+ corresponde mesmo ao único fragmento significativo.

No modo negativo, foram observados outros fragmentos que não foi possível racionalizar e que

se pensa serem devidos a interferências.

O espectro de IV da 2−OH−NVP apresenta, como seria de esperar, apenas um

carbonilo, a 1658 cm−1, que coincide com o da 2−OAc−NVP.

N

NH

NN

O

OH

62

O ponto de fusão da 2−OH−NVP é superior a 300 °C, não se tendo observado qualquer

alteração na amostra até àquela temperatura.

3.1.3.5. Ndi−OH−NVP

N

N

NN

O

OH

OH

N

N

NN

O

OH

OH

R

H+

XV XVI

Figura 21 – Estrutura do novo produto isolado, Ndi−OH−NVP XV, proveniente da hidrólise da di−OAc−NVP; XVI representa um esquema do tipo de protonação que propomos que ocorra para XV.

Os espectros de RMN indicavam uma molécula próxima da 2−OH−NVP, mas não

coincidente, como se pode ver pela sobreposição dos 1H−RMNs apresentada na Figura 17.

Após cuidada ponderação de todos os resultados, pensa-se tratar-se duma forma protonada do

2,5−N−di−OH−NVP (XV e XVI, Figura 21) e as razões para tal são detalhadas de seguida.

A massa molecular encontrada a partir dos MS positivo e negativo indica a presença de um

grupo OH extra em relação à 2−OH−NVP. Contudo, o 1H−RMN indicava não ter havido uma

2ª substituição no anel A, nem no anel C, o que nos levou a supor uma oxidação num dos

azotos da molécula. Voltando de novo aos resultados do MS identificaram-se fragmentos

coincidentes ou concordantes com alguns resultados das oxidações químicas, os quais

discutiremos adiante, e que indicam uma dupla quebra da estrutura da NVP no anel central.

O facto de se observarem fragmentos nos quais a estrutura do anel C e o grupo N-ciclopropilo

se apresentam intactos (ver Tabela 5), leva-nos a restringir as opções de oxidação aos Ns do

anel A (posição 1) ou da amida (posição 5). O facto da se obterem fragmentos de baixo peso

molecular por ESI, que se sabe ser uma técnica de ionização suave, levou-nos a ponderar

opções que explicassem a tendência da molécula a fragmentar daquela forma. Assim,

parece-nos mais plausível que a oxidação se tenha dado no N5, pois pode facilitar a quebra da

ligação ao anel A (como se verifica para os produtos de oxidação) e permite que o N1 se

mantenha livre para a partilha do protão. Considera-se aqui um tipo de protonação, talvez

pouco comum, possivelmente distribuída entre 3 Ns, os N1, N10 e N11, como se esquematiza

em XVI (Figura 21). Uma partilha da protonação poderá ser facilitada pela proximidade

daqueles Ns, permitindo que o composto não apresente uma carga localizada, de que

decorrerá a mobilidade razoável observada nas CCFs. Esta hipótese é também consistente

com a presença de 3 Hs lábeis no espectro de 1H−RMN.

63

Considerando agora que este é um produto de hidrólise da di−OAc−NVP, verifica-se que

a blindagem do sinal dos Hs12 observada é concordante com uma substituição na posição 5 e

com a atribuição feita para a di−OAc−NVP, como se pode ver no resumo apresentado na

Tabela 3. O desdobramento dos sinais dos ciclopropilos, observado para a di−OAc−NVP, não é

identificado na Ndi−OH−NVP provavelmente devido à menor dimensão do grupo substituinte na

posição 5, OH em vez de OAc. Embora estes compostos sejam oxidados nas mesmas

posições, os respectivos efeitos nos Hs aromáticos são bastante diferentes: enquanto na

di−OAc−NVP todos os Hs do anel C foram ligeiramente desblindados, no Ndi−OH−NVP cada

um sofre um efeito diferente. Como para a 2−OH−NVP nem todos os carbonos puderam ser

atribuídos inequivocamente e aqueles para os quais não se dispôs de correlações através dos

espectros bidimensionais, foram incluídos na Tabela 4 por comparação com as atribuições da

di−OAc−NVP.

O espectro de IV traçado para o Ndi−OH−NVP apresenta um pico de carbonilo forte,

a 1635 cm−1, valor um pouco inferior à NVP e à di−OAc−NVP, embora também apresente outro

pico forte de maior energia, a 1705 cm−1, o qual não foi atribuído.

Para este composto, o ponto de fusão apresenta disparidades como se observou para o

di−OAc−NVP. Parece dar-se uma fusão de certas partes da amostra a uma temperatura

inferior a 200 °C com decompõe. Contudo, a restante amostra só parece fundir totalmente a

270 °C. Verificou-se alguma coloração do pó branco em certas zonas da amostra que poderá

ser proveniente de algumas impurezas que poderão ter ponto de fusão inferior.

3.2. Oxidação química da 2−OH−NVP

Foram escolhidos 2 reagentes amplamente documentados como promovendo a

oxidação de fenóis a quinonas, com o objectivo de aferir a tendência à oxidação do metabolito

2−OH−NVP e o tipo de produtos de oxidação que se originam. Para tal foram escolhidos o

óxido de prata (Ag2O) e o sal de Fremy [(KSO3)2NO], e foram realizadas reacções em variadas

condições. A tendência para a oxidação verifica-se realmente, tendo sido com o último oxidante

que se obtiveram os resultados mais consistentes e interessantes. Para as reacções com sal

de Fremy obteve-se um produto comum a todas as condições e, em geral, largamente

maioritário e identificado como a 2-ciclopropilamino-N-(4-metil-2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-

-3-il)nicotinamida (XVII, Figura 26, pg. 72). Com Ag2O, os resultados foram menos inequívocos

e a oxidação produzida parece ser, em geral, mais extensa, chegando a produtos sem

interesse para este estudo. Contudo, o sal de Fremy também leva parcialmente a oxidações

mais extensas que as previstas, como é comprovado pelo produto que se verificou coincidir

para ambos os oxidantes, identificado como a 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (XVIII,

Figura 27, pg. 73). Nas próximas secções os resultados serão descritos e discutidos em maior

detalhe. Por fim serão discutidos, em conjunto, as caracterizações dos produtos isolados de

maior interesse e os mecanismos das oxidações.

64

3.2.1. Óxido de prata, Ag2O As várias condições experimentadas, como quantidades utilizadas, solventes,

temperatura e agitação, encontram-se resumidas na Tabela 1 (Parte Experimental, pg. 46).

Os tempos máximos de reacção e alguns dos resultados, como a taxa de conversão, o número

de produtos obtidos e a codificação dos produtos isolados, são apresentados na Tabela 7.

Tabela 7 – Resultados das reacções de oxidação da 2−OH−NVP com Ag2O

Reacção Taxa Conversão/% t100%/ha tmáx/h

b N° de

Produtos Obtidos

Produtos Isolados

MS1 100 > 47 ~ 72 2 mC, mD

MS3 100 < 45 ~ 72 3 (+1)c

mA, mB

MS8 100 < 2 ~ 48 1 (= mB) d

MS10 100 < 2,5 ~ 72 1 (+2)e FMS10

MS12 100 <1,5f 4

MS13 100 <3,5f 2

MS14 100 < 0,5f 2

MS15 100 <3,5f 3

MS16 100 > 72 2

MS17 100h ~ 96h

~ 96 (~ 5)g

4

FFA MS13+15

MS27 ~ 100i >168 ~ 168 (~ 29)g 4

MS28 100 < 3 ~ 5 9 (3)j

MS29 ~ 100i >72 ~ 72 (~ 7)k

6 (3)j

mT, mU, mV, mX, mZ, mAA

Duma forma geral, observou-se uma dependência forte dos resultados com os solventes

orgânicos e a presença de fase aquosa. O tipo de diferenças observadas é bem representado

pelos resultados apresentados na Figura 22, na qual se pode ver a CCF das m.r.s de MS12 a

MS17, onde cada par de reacções foi feito com um solvente orgânico, CHCl3, CH2Cl2 e THF,

num caso sem fase aquosa, noutro caso com tampão a pH7 (ver Tabela 1). Não é contudo

possível apontar qual o tipo de efeito observado, até porque não foi possível isolar e

caracterizar todos os produtos obtidos. Uma diferença, por exemplo, entre os solventes

clorados, poderá ser a presença de HCl no CHCl3 que poderá catalisar certas degradações.

A influência da presença de fase aquosa, poderá também prender-se com a catálise de certas

reacções, como veremos na discussão do mecanismo.

Notas: a Tempo aproximado para atingir

100 % de conversão. b Tempo máximo de reacção. c Mais 1 produto foi detectado,

ténue, depois de parte do tratamento das m.r.s.

d Não foi realizado tratamento das m.r.s.

e Mais 2 produtos eram visíveis nas CCFs, mas muito ténues.

f Alguma dificuldade em determinar com segurança.

g Tempo de agitação no início da reacção, restante tempo sem agitação.

h Últimas CCF parecem ainda indicar presença de MP, contudo a resultante das reacções não apresenta MP.

i Não ficou clara a total conversão nestas reacções, mas no tratamento das m.r.s da mistura de MS27 a MS29 aparece MP.

j Nos extractos detectam-se muito mais produtos que ao aplicar as m.r.s directamente.

k Tempo inicial de agitação. Nesta reacção confirmou-se a tendência para reagir melhor sem agitação, pois teve momentos com e sem agitação.

65

Figura 22 – CCF das m.r.s de MS12 a MS17, da esquerda para a direita, cada uma seguida da sua mistura com o padrão de MP, que se encontra mais à direita. MS12 e 13 foram realizadas em CHCl3, MS14 e 15 em CH2Cl2 e MS16 e 17 em THF. MS12, 14 e 16 foram realizadas unicamente com fase orgânica, enquanto MS13, 15 e 17 também têm tampão. Foram coloridas a vermelho as manchas resultantes do MP e noutras cores produtos que se pensam coincidentes entre as reacções.

O aumento da temperatura de reacção pareceu resultar numa maior rapidez de

conversão, em comparação com outra reacção no mesmo solvente. No entanto, as velocidades

de reacção não foram muito reprodutíveis. Também se observou o caso de reacções que

pareceram evoluir mais sem agitação que quando agitadas, não tendo sido possível

racionalizar este fenómeno. Outro efeito da temperatura poderá ser a obtenção de um maior

número de produtos, que poderá ser devido a uma degradação dos produtos iniciais de

oxidação directa do MP. Um efeito do mesmo tipo poderá dar-se quando o tempo de reacção é

muito prolongado, mesmo sem se atingir a conversão total.

A conversão total poderá dar-se em poucas horas, mas devido a arraste observado nas

CCFs e à proximidade de rf de alguns produtos com o MP a maioria das reacções foi

prolongada durante bastante mais tempo. Contudo, houve dificuldades na reprodutibilidade da

rapidez de conversão como se mostra com os casos de MS28 e MS29 que em princípio

estariam nas mesmas condições. Em MS29 verificou-se uma influência negativa da agitação

na evolução da reacção, que já havia sido observada para outras reacções. Em contraste,

a reacção MS28 deu-se tão rapidamente que não pareceu existir o mesmo efeito negativo da

agitação.

Em relação às reacções com Ag2O deve-se ainda referir que é difícil eliminar totalmente

os resíduos de Ag das m.r.s e que a presença daqueles mesmo em quantidades pequenas

parece continuar a degradar a mistura de produtos filtrada. A concentração de oxidante na m.r.

também parece poder influenciar a reacção, mas mais uma vez os efeitos observados não

foram consistentes.

66

Através dos espectros de 1H-RMN os últimos produtos isolados, verificou-se que mT não

estava suficientemente puro para uma caracterização mais detalhada e mX, mZ e mAA não

pareceram ter interesse, pois não se reconhecem características da estrutura da NVP.

Foi possível caracterizar em maior detalhe o produto maioritário das respectivas reacções, mV,

assim como mU, como veremos mais adiante. A comparação de alguns destes produtos com

produtos das reacções com sal de Fremy será apresentada mais à frente após a discussão

daqueles resultados.

3.2.2. Sal de Fremy Como anteriormente no caso das oxidações com Ag2O, apresentam-se a condições

experimentais resumidas na Tabela 2 (Parte Experimental, pg. 47) e os tempos de reacção e

alguns dos resultados na Tabela 8.

Como já se referiu, os resultados das oxidações com o sal de Fremy parecem mais

consistentes, em especial porque se identificou um produto comum a todas as condições,

o qual se conseguiu isolar várias vezes. Inicialmente, com base na evidência de 1H-RMN e 13C-RMN, pensou-se que este produto fosse o catecol, 2,3-di-hidroxi-NVP, o que seria bastante

interessante do ponto de vista deste trabalho. Contudo, a possibilidade de resolução da

estrutura por difracção de raios-X levou à indentificação inequívoca deste produto como a

2-ciclopropilamino-N-(4-metil-2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-3-il) nicotinamida (XVII, Figura 26,

pg. 72). Esta estrutura apresenta menor interesse no âmbito do objectivo deste trabalho, mas

tem uma grande relevância estrutural e reaccional. Mais adiante será proposto um mecanismo

que tenta racionalizar a sua formação (Figura 29, pg. 76).

Uma das características que diferencia estas reacções das oxidações com Ag2O foi que

geralmente as conversões foram muito inferiores e mesmo quando foi possível obter

conversões totais, foi preciso um tempo superior. Esta observação é concordante com o facto

do sal de Fremy ser um oxidante mais suave que o Ag2O, sendo que nas condições testadas o

último parece levar a reacções mais rápidas, mais completas e originando maior degradação.

Antes de mais deve ser mencionado que se observaram instabilidades dos próprios

solventes ou da espécie reactiva do sal de Fremy em presença daqueles. Segundo a

literatura62, a coloração roxa observada ao disolver o sal de Fremy em solução aquosa é

originada pelo radical que se pensa ser activo na reacção - (KSO3)2NO•. Mais se verificou,

através daquela referência62, que as condições óptimas seriam pH 10 e temperatura

ligeiramente baixa. O MeOH, solvente utilizado inicialmente, parece reagir imediatamente com

o sal de Fremy. Nas condições testadas, o AcOEt é o solvente que parece ser menos sensível

ao sal de Fremy, como comprovaram o resultados das reacções MS42 a 45 realizadas com

este solvente e diferentes fases aquosas. O outro solvente utilizado foi o THF que também

reage com o sal de Fremy, mas essa reactividade diminui fortemente com o pH da fase

aquosa, sendo desprezável a pH10. Esta observação também é concordante com as

67

diferenças observadas nos resultados das reacções MS38 a 41. Sem solvente orgânico, a

reacção torna-se muito lenta, a todos os pHs testados, provavelmente devido à baixa

solubilidade do MP.

Tabela 8 – Resultados das reacções de oxidação com sal de Fremy

Reacção Taxa Conversão/% t100%/ha tmáx/h

a N° de

Produtos Obtidos

Produtos Isolados

MS2 — ~ 24 2

MS4 Baixa

— ~ 24 —b —

MS5 — — ~ 1 — —

MS6 Média — ~ 72 2 —

MS7 Média — ~ 48 2 —

MS9 Média — ~ 48 6 (4)c EMS9

MS11 Alta — ~ 24 4 mE, mF, mG

MS24 Alta — ~ 48 7 (2)d mP, mQ

MS25 Alta — ~ 48 2 mR, mS

MS26 100 < 19 ~ 24 4 (2)d

mM, mN, mO

MS31 ~ 100 ~ 2 e ~ 48 12 (3)c

mAB, mAC, mAD

MS34 —g

MS35 —g

MS36 —g

MS37 —g

MS38 —g

MS39 —g

MS40 —g

MS41 2

MS42 —g

MS43 2

MS44 3

MS45

Baixa — ~ 208 (~ 48)f

3

—h

MS46 Média — ~ 24 —

Notas: a Definidos como na Tabela 7. b Esta reacção não foi

suficientemente seguida para saber quantos produtos foram originados.

c Nestes casos parece haver um efeito claro de concentração, sendo observáveis mais produtos ao concentrar o sobrenadante da reacção.

d Os extractos finais apresentam mais produtos que aqueles que se detectam a partir das m.r.s apesar de se aplicar tanto a fase aquosa como a fase orgânica nas placas. Provavelmente será também um efeito de concentração.

e Depois de 2 dias de reacção com produtos muito ténues, ao adicionar THF a reacção parece ficar completa em apenas 2 h.

f As reacções foram agitadas e aquecidas durante os 2 primeiros dias, depois foram deixadas tapadas à temperatura ambiente e sem agitação.

g Não foi possível determinar com segurança, mas parece não ter ocorrido reacção ou foi muito pouco extensa.

h O tratamentos destas m.r.s não foi concluído.

68

Realmente, a reacção parece ser favorecida a pH elevado, provavelmente em especial

pela maior estabilidade da espécie radicalar reactiva, comprovada por uma persistência da

coloração roxa durante tempos muito superiores aos outros pHs testados. Contrariamente às

recomendações da literatura, a baixa temperatura não pareceu apresentar vantagens.

Neste caso, o aumento da temperatura parece ter um efeito positivo, mas provavelmente não é

necessário mais que cerca de 30 °C, pouco acima da temperatura ambiente.

O uso de duas fases imiscíveis também pareceu ter um efeito positivo nas reacções.

O tempo de reacção prolongado, a temperatura e o uso de AcOEt podem estar associados a

uma maior quantidade produtos, talvez alguns provenientes da degradação de produtos

primários, isto é directamente da oxidação do MP. O uso de THF associado a uma fase aquosa

de pH elevado parece adequado e gerou bons resultados.

Como já foi referido houve um produto, em geral, largamente maioritário presente em

todas as reacções. Foi possível caracteriza-lo com grande detalhe e foi identificado como

sendo a 2-ciclopropilamino-N-(4-metil-2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-3-il)nicotinamida (XVII,

Figura 26, pg. 72). Houve outro produto relevante obtido em algumas das reacções, mas que

contudo não se pode isolar com pureza suficiente para a sua identificação. Outro produto não

maioritário isolado da reacção MS26, mO, verificou-se ser coincidente com um dos produtos da

oxidação pelo Ag2O. Na Figura 23 apresenta-se uma CCF onde é possível ver a comparação

de rfs de alguns dos produtos isolados de ambos os oxidantes e destes com o MP.

A caracterização mais detalhada de mU e mO confirmou serem realmente o mesmo produto,

como discutiremos adiante.

Figura 23 – CCF de vários produtos isolados. mP e mO, respectivamente nas 1ª e 5ª posições a contar da esquerda são de reacções com Fremy. mT, mU e mV, nas 3ª, 7ª e 8ª posições são produtos de oxidação com Ag2O. As 2ª, 4 e 6ª posições são misturas dos isolados do lado direito e esquerdo. A 9ª posição é a mistura de mV e o padrão de MP, que se encontra-se mais à direita. Foram coloridas as manchas que se pensam coincidentes; rfs idênticos foram comparados através dos espectros de 1H-RMN.

69

3.2.3. Caracterização dos produtos de oxidação isolados Como foi anteriormente feito para os produtos isolados na síntese da 2−OH−NVP,

apresenta-se aqui um resumo dos resultados de RMN e MS, seguidos uma pequena discussão

da caracterização de alguns dos produtos de oxidação isolados. Nas figuras e tabelas, incluem-

se os resultados já discutidos do MP, 2−OH−NVP, para comparação. Os produtos para os

quais foi possível fazer uma caracterização mais completa foram: o produto maioritário da

reacção com sal de Fremy, para o qual se apresentam resultados dos isolados mE e mAC,

e que foi identificado como a nicotinamida XVII (Figura 26, pg. 72); o produto mO obtido da

oxidação pelo sal de Fremy e o produto mU obtido da oxidação pelo Ag2O, que se apresentam

em separado, mas se discutem em conjunto por se considerarem idênticos; e o produto mV,

maioritário das reacções MS27 a 29 realizadas com Ag2O.

6789101112 ppm

mV (em DMSO): X = NH2

mU (em DMSO): X = OH

mO (em acetona):X = OH

nicotinamida XVII(em acetona)

2-OH-NVP (em DMSO)

Figura 24 – Sobreposição dos espectros de 1H−RMN na zona dos protões aromáticos para o MP, 2−OH−NVP, e os produtos de oxidação caracterizados.

NH

NH

NNH

O

O

O

X

NNH

O

70

Tabela 9 – Atribuições dos sinais de 1H−RMN dos produtos de oxidação

δδδδ/ppm (integraçãos, multiplicidadeb); J/Hzc atribuições

2−OH−NVP nicotinamida XVIId mOd mUd mVd

Hs14

Hs15

0,35 (2H, m)

0,85 (2H, m)

0,50 (2H, m)

0,77 (2H, m)

0,76 (2H, m)

1,08 (2H, m)

0,78 (2H, m)

1,11 (2H, m)

0,39 (2H, m)

0,71 (2H, m) ciclopropilo

H13 3,60 (1H, m) 2,93 (1H, m) 2,76 (1H, m) 2,80 (1H, m) 2,78 (1H, m)

Me Hs12 2,23 (3H, s) 2,00 (3H, s) — — —

H2 — — — — — anel A

H3 6,30 (1H, s) — — — —

H7 7,97 (1H, dd) Jo (7, 8) = 7,6

8,17 (1H, dd) Jo (7, 8) = 7,8

8,22 (1H, dd) Jo (7, 8) = 7,6

8,29 (1H, dd) Jo (7, 8) = 7,7

7,93 (1H, dd) Jo (7, 8) = 7,6

H8 7,17 (1H, dd) Jo (8, 9) = 4,8

6,68 (1H, dd) Jo (8, 9) = 4,7

7,22 (1H, dd) Jo (8, 9) = 4,7

7,31 (1H, dd) Jo (8, 9) = 4,8

6,60 (1H, dd) Jo (8, 9) = 4,8

anel C

H9 8,47 (1H, dd) Jm = 2,0

8,33 (1H, dd) Jm = 1,8

8,64 (1H, dd) Jm = 1,8

8,73 (1H, dd) Jm = 2,0

8,20 (1H, dd) Jm = 1,7

NH/NH2 (5) 9,60 (1H, s) 9,69 (1H, sl)e — — 7,37 (<1H, s); 7,99 (<1H, s)

2−OH 10,56 (1H, sl) — — — —

NH (1) — 9,09 (1H, sl)e — — —

NH (11) — 8,13 (1H, sl)e f f 8,56 (1H, sg)

Hs lábeis

OH (ácido) — — h 11,58 (1H, s) —

Notas: a integração representada como número de protões, nH. b multiplicidade apresentada como s – singuleto, sl – siguleto largo, d – dupleto, dd – dupleto de dupletos,

m – mutlipleto. c constantes de acoplamento: Jo – acoplamento orto, Jm – acoplamento meta. d para facilitar a atribuição manteve a numeração original da NVP para todos os produtos de oxidação. e os sinais dos Hs lábeis não foram atribuídos inequivocamente

f em mO observa-se uma banda muito larga e grande a 3,5 que se define num pico de H2O por adição de D2O, não se identificando igual comportamento em mU. Contudo, também não se observa outro sinal que possa corresponder ao H lábil previsto.

g singuleto desdobrado.

h é possível que não se veja o singuleto por ser demasiado largo em acetona, enquanto que no caso de mU se vê bem porque o espectro foi traçado em DMSO.

71

80100120140160180 ppm

mV (em acetona) mU (em DMSO) mO (em DMSO)

nicotinamida XVII (em acetona) 2-OH-NVP (em DMSO)

Figura 25 – Sobreposição dos espectros de 13C−RMN na zona dos carbonos aromáticos para o MP, 2−OH−NVP, e os produtos de oxidação caracterizados.

Tabela 10 – Atribuições dos sinais de 13C−RMN dos produtos de oxidação

δδδδ/ppm atribuições 2−OH−NVP nicotinamida XVIIa mOa mUa mVa

C14

C15

8,5 8,6 7,4 9,8 10,0 7,4

ciclopropilo

C13 28,9 24,4 25,3 25,7 24,4

Me C12 17,8 10,2 — — —

C2 160,4 — — — —

C3 ~108b — — —

C4 ~118 b — — —

C4a 144,7

124,3 135,0 173,2 — — —

anel A

C11a 169,6 — — —

C6a

121,2 124,9 109,6 111,9 112,1 c

C7 139,9 138,8 129,0 137,2 137,2

C8 119,3 112,3 119,1 119,8 111,7

C9 150,9 153,7 153,7 154,5 152,7

anel C

C10a 151,1 148,0 151,6

carbonilo C6 177,9

159,8 167,3 167,1 162,4

c

Notas: a para facilitar a atribuição manteve a numeração original da NVP para todos os produtos de oxidação. b sinais pouco definidos, mas com correlação nos espectros bidimensionais. d os carbonos quaternários não foram visíveis.

72

Tabela 11 – Resumo dos fragmentos positivos e negativos obtidos por MS-ESI dos produtos de oxidação

nicotinamida XVII iões +

+ − mU mO mV iões −−−−

[dímero+MeOH]+ 386a

dímero+Na+ 379 379b

MH++MeOH 210 a 210 a

MH+ 178 a 178

[M-11]+ c 287 285 [M−13]− c

[3-acil-2-ciclopropilamino-piridina]+ d 161 161 161

[2-ciclopropilamino-piridina]+ e 133 133

imina f 121 Notas: a Nestes casos propõe-se que a fragmentação tenha originado M+ e não MH+ dadas as diferenças de uma unidade nas

razões m/z. b Neste caso há uma diferença de 2 unidades. c Não foi possível atribuir estes fragmentos. d e f

N

C+

O

N

NN

+

NN

+

3.2.3.1. Nicotinamida XVII

As características fundamentais do 1H-RMN

traçado para o produto maioritário das oxidações com

sal de Fremy são a ausência de H3, que indicava a

substituição naquela posição, e a existência de 3 Hs

lábeis. Isto levou-nos a pensar inicialmente tratar-se do

catecol 2,3 hidroxilado. Embora não tivesse sido

possível fazer todas as atribuições inequivocamente o 13C-RMN parecia apresentar os 15 carbonos da

estrutura da NVP. Contudo o MS apontava para a perda

de um carbono. Com a obtenção dum cristal deste

produto tornou-se possível a resolução da sua estrutura

por difracção de raios-X, identificando-se a 2-ciclopropil-

amino-N-(4-metil-2,5-dioxo-2,5-di-hidro-1H-pirrol-3-il)nico-

tinamida (XVII).

Ao indentificar correctamente a estrutura do produto, foi então possível atribuir os 3 Hs

lábeis aos três grupos NH, embora não especificamente de forma inequívoca, e confirmar quais

os sinais de 13C correctos. Os resultados de 13C-RMN ficaram também mais concordantes com

a estrutura pois havendo 3 carbonilos podem atribuir-se os 3 valores mais elevados de δ. De

NH

NH

NNH

O

O

O

XVII

Figura 26 – Estutura do produto mioritário de oxidação da 2−OH−NVP pelo sal de Fremy.

73

igual forma compreendem-se melhor os 3 picos fortes de carbonilo presentes no espectro de IV

da nicotinamida XVII, a 1662, 1685 e 1723 cm−1. O espectro de IV tinha nos feito pensar

inicialmente que haveria um equilíbrio entre uma forma catecólica e a respectiva quinona; no

entanto, as integrações unitárias dos Hs lábeis do espectro de 1H-RMN não eram compatíveis

com um equilíbrio daquele tipo.

Os MS obtidos levantaram bastantes dúvidas antes de identificação correcta da

estrutura. No entanto, entre o modo positivo e negativo, os resultados eram concordantes e a

sua repetição originou espectros idênticos. Após identificação do produto podem agora atribuir-

-se os picos base a m/z 287 e 285, respectivamente, ao MH+ e ao [M−H] −. Os restantes

fragmentos do modo positivo, têm m/z relativamente pequenos, mas são coincidentes com

outros encontrados e já apresentados, com excepção do m/z 121. Para este fragmento propõe-

-se que seja uma imina (ver Tabela 11) proveniente da perda de um carbono por parte da

2-ciclopropilamino-piridina, fragmento também observado a m/z 133.

Não foi possível obter uma amostra da nicotinamida XVII seca, apesar de evaporação

em linha de vácuo. Como já foi descrito para outros produtos caracterizados desta forma,

a amostra de cristais não parece homogénea, tendo comportamentos diferentes, consoante os

cristais se apresentam em aglomerados ou individualizados. Como também se verificou nos

outros casos, os aglomerados parecem sofrer transformações graduais, levando a uma fusão

com degradação, enquanto os cristais individualizados fundem a uma temperatura bastante

superior, que aqui se identificou como cerca de 230 °C.

3.2.3.2. mO e mU

Os resultados dos espectros de RMN para mO e mU –

produtos de oxidação pelo sal de Fremy e pelo Ag2O,

respectivamente – são muito próximos, as pequenas

diferenças observadas pensa-se serem devidas à

comparação de resultados obtidos em solventes diferentes,

mO em acetona e mU em DMSO. A ausência do H3 é uma

característica destes espectros; contudo à partida não se

esperava que todo o anel A estivesse em falta. O posterior

esclarecimento da estrutura como sendo a 3-carboxi-

-2-ciclopropilamino-piridina, através dos resultados de MS,

permite-nos agora compreender melhor os resultados de

RMN, em especial o 13C-RMN, no qual eram visíveis menos

carbonos que o esperado. Assim é também possível,

compreender melhor a presença dos protões lábeis, os quais,

no entanto, não foram completamente identificados. O H lábil identificado em DMSO a 11,58

ppm é provavelmente o do ácido carboxílico, que se esperaria bastante desblindado, mas não

é detectável em mO, provavelmente devido ao solvente. O H lábil do N do grupo ciclopropil,

OH

NNH

O

XVIII

Figura 27 – Estrutura do produto de oxidação extensa da 2−OH−NVP comum aos dois oxidantes, sal de Fremy e Ag2O, a 3-carboxi-2-ciclopropilamino- -piridina.

74

não se pôde atribuir inequivocamente, embora haja um sinal muito largo a cerca de 3,5 ppm no 1H-RMN do mO que poderá contê-lo (ver Tabela 9). Foi possível atribuir todos os carbonos

presentes no 13C-RMN e os valores encontrados são concordantes com os dos demais

produtos isolados.

Como já se referiu os resultados de MS foram muito importantes na caracterização

destes compostos e embora as fragmentações não sejam exactamente coincidentes,

mantém-se a identificação de ambos como idênticos. Em ambos os casos houve resultados

que apontam para uma presumível dimerização no espectrómetro de massa, como veremos

também para mV. Em mO, há mais dificuldade em atribuir o dímero com certeza, pois há

algumas interferências para m/z elevados. Contudo um dímero de [2M+MeOH] + parece

plausível uma vez que para o ião molecular também parece ser detectado M+ e não MH+.

Para mU o dímero associa-se a Na+ em vez de MeOH e não é visível o ião molecular.

Para ambos é importante o fragmento do ião molecular associado ao solvente e que também

difere de 1 unidade, sendo como tal [M+MeOH]+. Para mU foi também detectado o fragmento a

m/z 161 identificado anteriormente.

Devido à reduzida quantidade de amostras, só foi possível traçar o espectro de IV para

mU e o resultado não foi muito bom. Contudo, é aparente a presença de um grupo carbonilo,

a cerca de 1653 cm−1.

Não foi possível medir o ponto de fusão de nenhuma das amostras por falta de

quantidade.

3.2.3.3. mV

Como já se referiu para os produtos anteriores, após a

identificação do composto como a 3-carbamoil-2-

-ciclopropilamino-piridina, com base nos resultados dos MSs,

ficou mais fácil interpretar os resultados obtidos nos espectros

de RMN. No 1H-RMN, tal como para mO e mU é clara a

ausência do H3, mas as interferências na zona do Me não

permitiam admitir com segurança a sua inexistência. Admitindo

aquela estrutura fica até mais fácil atribuir os 3 Hs lábeis

encontrados, sendo o mais definido e mais desblindado

atribuído ao NH do ciclopropil e os outros dois ao NH2 da

amida, não equivalentes. Nos espectros de 13C-RMN não foi

possível observar os carbonos quaternários devido à diluição

da amostra.

Como já se referiu os resultados de MS foram cruciais na caracterização deste

composto. Como vimos também, estas estruturas parecem ter tendência a dimerizar, pelo que

se atribuiu o m/z 379 ao dímero associado a um Na+, embora haja uma diferença de 2

NH2

NNH

O

XIX

Figura 28 – Estrutura doutro produto de oxidação extensa da 2−OH−NVP isolado de reacções com Ag2O, a 3-carbamoil-2-ciclopropilamino--piridina.

75

unidades de massa. Para mV detecta-se também o MH+ e os fragmentos já identificados,

m/z 161 e 133.

Como para mU, a reduzida quantidade de composto disponível para traçar o espectro de

IV originou um espectro pouco definido, sendo, no entanto, possível atribuir um carbonilo,

a 1673 cm−1.

Não foi possível medir o ponto de fusão por falta de quantidade de amostra.

3.2.4. Mecanismos de oxidação

Ambos os oxidantes utilizados são referidos na literatura como doadores de 1e−, contudo

o sal de Fremy é mais usualmente referido como percursor de mecanismos radicalares62, 63, 64.

São aqui propostos dois mecanismos que tentam racionalizar as reacções que originam os

produtos de oxidação identificados. Ambos os mecanismos são apresentados com catálise

básica, contudo os resultados obtidos indicam que poderão ser independentes do pH. Para

ambos também seriam necessárias estudos mecanísticos aprofundados para os poder

confirmar.

O mecanismo apresentado na Figura 29, que ilustra a formação do produto XVII,

é específico para o sal de Fremy e é provável que seja iniciado por processos radicalares.

É ainda apresentada uma proposta distinta, na Figura 30, para o mecanismo conducente aos

outros produtos identificados, aplicável a ambos os oxidantes testados. A iniciação poderá ser

feita por mecanismos radicalares ou transferências sucessivas de 1 electrão, pelo sal de Fremy

ou Ag2O, dando origem à quinonimina XX. Através de catálise básica, a formação das

2-ciclopropilamino-piridinas XVIII e XIX poderá seguir os passos aqui apresentados.

Como se viu anteriormente, as 2-ciclopropilamino-piridinas XVIII e XIX foram ambas

isoladas e caracterizadas a partir dos produtos de oxidação com Ag2O, enquanto que a forma

de ácido carboxílico (XVIII) foi igualmente isolada como produto da oxidação com o sal de

Fremy. É possível que a polaridade elevada ou a tendência a polimerizar da quinona do anel A

(XXI) tenham levado a que esta espécie não tenha sido identificada e isolada. Nas reacções

com sal de Fremy era visível material fluorescente no PA das CCFs. Com Ag2O isso não

acontecia, mas houve suspeitas de que ficasse material adsorvido no óxido, pelo que aquela

espécie poderia não ser perceptível. Pelos resultados das reacções de oxidação com Ag2O

prevê-se que estes mecanismos se dêem mesmo em solventes orgânicos apróticos através

das doações sucessivas de 1 e−. Provavelmente a maior sensibilidade das oxidações com

Ag2O às escolha de solvente e à presença de água podem estar associadas à possibilidade de

catálise em meio aquoso e presença de ácidos ou bases. Por exemplo, a presença de vestígios

de HCl no CHCl3 poderia justificar a diferença de resultados entre o CHCl3 e o CH2Cl2. Porém

os efeitos observados não foram claros, não sendo possível compreender melhor aquelas

influências.

76

N

N

NN

O

OH

H

HN

N

NN

O

OHN

N

NN

O

OH

N

N

NN

O

O

N

OH

N O

NH

N

NN

O

O

N

O

NH

N

R

O

N

OO

OH

HNH

NH

OO

N

O

ROH

NH

NO

O O

ROHNH

NO

O

RO

OHO

H

H

NH

NO

O

RO

O

O

HNH

NHO

O

O

NH N

N O

HO− H2O

− (KSO3)2NH

N ONO

HO−

H2O

H2O

HO−

H2O

HO−

− CO2

HO−

XVII

Figura 29 – Hipótese de mecanismo de oxidação mediado pelo radical de Fremy, com catálise básica.

77

3.3. Oxidação enzimática da 2−OH−NVP

Foram realizados alguns testes preliminares com peroxidases, in vitro, para avaliar

melhor a probabilidade do metabolito em estudo, a 2−OH−NVP, gerar produtos oxidados do

tipo quinona que tenham potencial para interagir com as bases do DNA. Foram utilizadas as

enzimas peroxidase de rábano, HRP, e lactoperoxidase.

Detalhando um pouco mais os resultados, na primeira reacção com HRP, verificou-se a

formação aparente de um produto de rf relativamente elevado a cerca de 1 h de reacção a

30 °C. Contudo, posterior CCF realizada a 1h30m de reacção, revelou que embora a mancha

N

N

NN

O

O

H2O

N

NH

NN

O

O

O

H

NNN

O

O CONH2

HO-

H2O

H2O

HO-NNN

OH

O CONH2

OH

H2O

NH N

O

NH2

NOH

O

O

+

XX

XXI XIX

NH N

O

OH

XVIII

HO-

H2O

Figura 30 – Hipótese de mecanismo de oxidação que dá origem aos produtos de maior degradação oxidativa, para ambos os oxidantes testados.

78

até tivesse rf idêntico à nicotinamida obtida como produto da oxidação pelo sal de Fremy,

aquela estava também presente no branco, realizado na ausência de 2−OH−NVP. A 1h30m

parece haver outra mancha ténue de rf ainda superior à referida, no entanto às 3h de reacção a

mesma já não foi detectada. Realizando a reacção com fenol a 37 °C para controlo verifica-se

a HRP oxida o fenol, embora ao fim de 1h30 ainda existisse MP. Isto indica que a enzima

apesar de armazenada manteve a actividade. A repetição da reacção da 2−OH−NVP com HRP

a 37 °C não levou a nenhuma observação adicional relevante.

Por seu lado, a lactoperoxidase, não pareceu sequer reagir com o fenol, pelo que se

pensa que estivesse degradada ou desactivada.

Como conclusão seria útil realizar mais algumas experiências de oxidações enzimáticas

com enzimas adquiridas recentemente, para garantir que estão activas. Contudo, tal não foi

possível antes da escrita desta tese.

79

3.4. Conclusões

Ao longo deste trabalho, fizeram-se algumas observações sobre o método de síntese da

2−OH−NVP que poderão vir a permitir algumas melhorias no processo. Espera-se poder vir a

melhorar a conversão, se for possível converter todo o MP no produto di-acetoxilado. Contudo,

não se prevê a possibilidade de purificação do produto final através da técnica cromatográfica

utilizada. Mesmo que se obtenha maioritariamente a di−OAc−NVP, continuarão a ser possíveis

perdas por hidrólise durante a cromatografia.

A componente essencial do trabalho aqui apresentado, consistiu na oxidação química da

2−OH−NVP. Como já se referiu, resultados preliminares obtidos no grupo indicaram não haver

reacção directa deste metabolito com as bases do DNA. O objectivo de realizar as oxidações

químicas aqui descritas consistia em avaliar se metabolitos secundários como catecóis ou

quinonas são plausíveis in vivo, pois prevê-se que este tipo de metabolitos sejam por sua vez

muito mais reactivos para com o DNA.

Pensa-se que as oxidações químicas realizadas se dão de forma muito próxima com os

dois oxidantes escolhidos – sal de Fremy e Ag2O – por transferências sucessivas de electrões

ou no caso do sal de Fremy, mais provavelmente por um mecanismo radicalar. Os produtos

identificados indicam que a oxidação da 2−OH−NVP origina produtos muito mais degradados

que o esperado e sem interesse para o objectivo deste trabalho. A obtenção de estruturas

abertas do tipo nicotinamida são prova disso. Não é plausível que estas estruturas sejam

originadas in vivo. Porém, mesmo que através de oxidações enzimáticas e posterior

degradação estas se formem, não se prevê que tenham actividade biológica.

A forma de ácido carboxílico da 2-ciclopropilamino-piridina (ou ácido 2-ciclopropilamino-

-nicotínico) foi isolada tanto a partir das misturas resultantes de reacções tanto com o Ag2O

como com o sal de Fremy. Contudo, o sal de Fremy revelou ser um oxidante mais específico,

pois para todas as condições testadas foi obtido um produto maioritário, que se identificou

preliminarmente como o catecol, 2,3−di−OH−NVP, mas posteriormente se confirmou por

difracção de raios-X ser a nicotininamida XVII. A sua formação é mecanisticamente

interessante por envolver a quebra duma das ligações ao anel central da NVP e a contracção

do anel A a um anel de 5 membros. Apesar de não terem sido identificadas espécies quinóides

mantendo a estrutura da NVP, não está posta de parte a sua ocorrência in vivo. No seguimento

deste trabalho, teria interesse realizar estudos de voltametria cíclica para avaliar a reactividade

redox da 2−OH−NVP e testar a sua reactividade com as bases do DNA em condições de

oxidação electroquímica.

Estudos preliminares com peroxidases não foram conclusivos e carecem de avaliação

posterior. Em conclusão, serão necessário estudos adicionais in vitro e in vivo para esclarecer

a possível genotoxicidade da 2−OH−NVP.

80

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84

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85

Anexo I – Espectros de IV

16520

20

40

60

80

100

5001000150020002500300035004000

νννν /cm−−−−1

Inte

nsi

dad

e/%

Figura 31 – Espectro de IV da NVP, MP da síntese da 2−OH−NVP.

1769

16921645

40

55

70

85

100

5001000150020002500300035004000νννν /cm−−−−1

Inte

nsi

dad

e/%

Figura 32 – Espectro de IV da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.

86

1777

1658

40

55

70

85

100

5001000150020002500300035004000νννν /cm−−−−1

Inte

nsi

dad

e/%

Figura 33 – Espectro de IV da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.

16590

20

40

60

80

100

5001000150020002500300035004000


Inte

nsi

dad

e/%

Figura 34 – Espectro de IV da 2−OH−NVP.

87

1635

1706

10

25

40

55

70

85

100

5001000150020002500300035004000


Inte

nsi

dad

e/%

Figura 35 – Espectro de IV da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP.

1662

1685

1722

0

20

40

60

80

100

5001000150020002500300035004000


Inte

nsi

dad

e/%

Figura 36 – Espectro de IV do produto de oxidação do sal de Fremy, mAC (=mE=mP), identificado como a nicotininamida XVII.

88

1654

40

60

80

100

5001000150020002500300035004000


Inte

nsi

dad

e/%

Figura 37 – Espectro de IV do produto de oxidação de Ag2O, mU, identificado como 3-carboxi- -2-ciclopropilamino-piridina (igual a mO do sal de Fremy).

1672

70

80

90

100

5001000150020002500300035004000νννν /cm−−−−1

Inte

nsi

dad

e/%

Figura 38 – Espectro de IV do produto de oxidação de Ag2O, mV, identificado como 3-carbamoil- -2-ciclopropilamino-piridina.

89

Anexo II – Espectros de MS

321

267

100 150 200 250 300 350 400m/z

Figura 39 – Espectro de MS-ESI positivo da NVP, MP da síntese da 2−OH−NVP.

313

336

355

377

100 150 200 250 300 350 400m/z

Figura 40 – Espectro de MS-ESI positivo da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.

90

369

311

100 150 200 250 300 350 400m/z

Figura 41 – Espectro de MS-ESI negativo da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.

243

283

325

347

357

379

100 150 200 250 300 350 400m/z

Figura 42 – Espectro de MS-ESI positivo da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.

91

280

323

100 150 200 250 300 350 400m/z

Figura 43 – Espectro de MS-ESI negativo da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.

283

100 150 200 250 300 350 400m/z

Figura 44 – Espectro de MS-ESI positivo da 2−OH−NVP.

92

281

100 150 200 250 300 350 400m/z

Figura 45 – Espectro de MS-ESI negativo da 2−OH−NVP.

353

133161

299

321 331

100 150 200 250 300 350 400m/z

Figura 46 – Espectro de MS-ESI positivo da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP.

93

329

297

100 150 200 250 300 350 400m/z

Figura 47 – Espectro de MS-ESI negativo da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP.

121

133

161

287

100 150 200 250 300 350 400m/z

Figura 48 – Espectro de MS-ESI positivo do produto de oxidação do sal de Fremy, mE (=mP=mAC), identificado como a nicotininamida XVII.

94

285

100 150 200 250 300 350 400m/z

Figura 49 – Espectro de MS-ESI negativo do produto de oxidação do sal de Fremy, mE (=mP=mAC), identificado como a nicotininamida XVII.

386

178

210

100 150 200 250 300 350 400m/z

Figura 50 – Espectro de MS-ESI positivo do produto de do sal de Fremy, mO, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mU do Ag2O).

95

379

161

210

100 150 200 250 300 350 400m/z

Figura 51 – Espectro de MS-ESI positivo do produto de oxidação de Ag2O, mU, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mO do sal de Fremy).

133

161

379

178

100 150 200 250 300 350 400m/z

Figura 52 – Espectro de MS-ESI positivo do produto de oxidação de Ag2O, mV, identificado como 3-carbamoil-2-ciclopropilamino-piridina.

96

Anexo III – Espectros de RMN

8,

79

7,05

8,49 8,

08

8,06

7,15

3,74

2,43

2,05

0,87

0,38

0246810 ppm

Figura 53 – Espectro de 1H-RMN (em acetona) da NVP, MP da síntese da 2−OH−NVP.

167,

8

161,

3

155,

315

2,3

144,

714

0,8

121,9

123,

0

119,9

9,4

9,1

17,7

020406080100120140160180 ppm

Figura 54 – Espectro de 13C-RMN (em acetona) da NVP, MP da síntese da 2−OH−NVP.

97

8,69

8,18

7,26 7,

01

1,79

2,48

2,81

2,07

2,50

0,30

0,58

0,88

1,02

0246810 ppm

Figura 55 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.

177,

9

171,

916

8,8

162,

315

3,6

151,

715

3,1

144,

0 138,

8

132,

1

117,

9

115,0

93,0

29,3

28,0

20,2 16

,0

10,4

10,0

020406080100120140160180 ppm

Figura 56 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) da di−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.

98

8,80

8,49

8,07 7,18

6,84

3,63

2,46

2,26

2,05

0,87

0,40

0246810 ppm

Figura 57 – Espectro de 1H-RMN (em acetona) da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.

18,1

21,0

9,3

9,1

114,

6

120,

2

141,

0

152,

3

169,

4

020406080100120140160180 ppm

Figura 58 – Espectro de 13C-RMN (em acetona) da 2−OAc−NVP, produto intermediário da síntese da 2−OH−NVP.

99

10,5

6

9,60

8,47

7,97

7,17 6,

30

3,60

2,23

2,50

0,35

0,85

024681012 ppm

Figura 59 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) da 2−OH−NVP.

~115 ~1

07

167,

0

160,

415

9,4

150,

9

144,

613

9,9

124,

912

1,2

119,

3

8,6

8,5

17,8

28,9

020406080100120140160180 ppm

Figura 60 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) da 2−OH−NVP.

100

9,49

7,97

8,25

8,16

6,64 6,

26

2,74

2,50

1,87

0,380,69

0246810 ppm

Figura 61 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP.

152,

6

152,2106,4

158,

4

163,

916

7,5

168,8

137,

7

122,

9

111,

310

7,6

23,8 16

,0

6,9

6,8

020406080100120140160180 ppm

Figura 62 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) da Ndi−OH−NVP, produto de hidrólise da di−OAc−NVP.

101

9,11

9,69

8,33

8,13

8,17

6,68

2,93

2,00

0,500,

772,05

0246810 ppm

Figura 63 – Espectro de 1H-RMN (em acetona) do produto de oxidação do sal de Fremy, mE (=mP=mAC), identificado como a nicotininamida XVII.

159,

816

7,3

169,

617

3,2

153,

7

138,

813

5,0

124,

412

6,0

112,

310

9,6

24,4

10,2

7,5

020406080100120140160180 ppm

Figura 64 – Espectro de 13C-RMN (em acetona) do produto de oxidação do sal de Fremy, mE (=mP=mAC), identificado como a nicotininamida XVII.

102

3,58,64

8,22

7,22

2,76

2,50

0,74

1,07

0246810 ppm

Figura 65 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) do produto de do sal de Fremy, mO, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mU do Ag2O).

167,

1 153,

8

136,

7

119,

1

112,

0

25,3

9,8

020406080100120140160180 ppm

Figura 66 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) do produto de do sal de Fremy, mO, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mU do Ag2O).

103

11

,58

8,73

8,29

7,31

2,08

2,50

1,10

0,78

024681012 ppm

Figura 67 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) do produto de oxidação de Ag2O, mU, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mO do sal de Fremy).

151,

6

162,

4 154,

5

137,

2

119,

8

112,

1 25,8

10,0

020406080100120140160180 ppm

Figura 68 – Espectro de 13C-RMN (em DMSO) do produto de oxidação de Ag2O, mU, identificado como 3-carboxi-2-ciclopropilamino-piridina (igual a mO do sal de Fremy).

104

0,71

0,39

2,50

2,78

6,60

7,37

7,93

8,20

8,60

7,99

0246810 ppm

Figura 69 – Espectro de 1H-RMN (em DMSO) do produto de oxidação de Ag2O, mV, identificado como 3-carbamoil-2-ciclopropilamino-piridina.

152,

7

137,

2

111,

7

24,4

7,4

020406080100120140160180 ppm

Figura 70 – Espectro de 13C-RMN (em acetona) do produto de oxidação de Ag2O, mV, identificado como 3-carbamoil-2-ciclopropilamino-piridina.

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