EVOLUÇÃO DAS IMUNOGLOBULINAS ENVOLVIDAS NA RESPOSTAIMUNE DE CAMUNDONGOS AO SCHISTOSOMA MANSONI*

Othon de Carvalho Bastos**Humberto de Araújo Rangel***Luiz Augusto Magalhães***Aquiles Eugênico Piedrabuena***

BASTOS, O. de C. et al. Evolução das imunoglobunilas envolvidas na resposta imune de ca-mundongos ao Schistosoma mansoni. Rev, Saúde públ., S, Paulo, 18: 138 - 54, 1984.

RESUMO: Foi estudada a evolução das imunoglobulinas envolvidas na resposta imunede camundongos ao Schistosoma mansoni durante oito semanas de infecção, utilizando sorospluri-específicos como reativos biológicos e a técnica da imunoeletroforese bidimensional.Os resultados expressaram modulação da resposta imune humoral, tanto em soros de animaisparasitados (I) como nos normais, tomados como controle (C). Aumentos relativos dos níveisde imunoglobulinas entre estes dois grupos foram constatados pela relação I/C. Foi possívelverificar o aparecimento de uma resposta primária, ocorrida entre o início da doença e a se-gunda semana de infecção, constituída de IgM e IgA, e uma secundária, iniciada na sexta se-mana de infecção, constituída pelas IgA; IgG1 e IgM, com aumentos relativos de 4.5; 3 e 2vezes normal.

UNITERMOS: Schistosoma mansoni. Imunoglobulinas. Esquistossomose mansônica.

INTRODUÇÃO

A identificação de classes de imunoglobu-linas envolvidas na resposta do hospedeirovertebrado ao Schistosoma mansoni tem sidofeita na esquistossomose humana (Hillyer20,1969; Antunes e col.2, 1971; Kanamura ecol.23, 1978) e experimental, utilizando-seprincipalmente camundongos (Hillyer eFrick21 1967; Sher e col.41,1977). Entretan-to, os dados existentes na literatura sobre ci-nética e classes de imunoglobulinas, envolvi-das na infecção esquistossomótica produzidaem Mus musculus, têm sido expressos em uni-

dades absolutas (mg/ml), não se levando emconsideração o fato de os animais em obser-vação estarem postos a inúmeros estímulosantigênicos aleatórios que podem influenciaros valores finais do teor das gamaglobulinas.Este aspecto pode ser crítico, uma vez quea quantificação de anticorpos específicos pa-ra S. mansoni é sempre feita em termos rela-tivos, não se sabendo, portanto a quantidadeabsoluta produzida durante a infecção.

Por outro lado, estudos da cinética eclasses de anticorpos envolvidos nas in-fecções parasitárias são realizados utilizan-do-se reativos biológicos monoespecíficos

* Parcialmente financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientíco eTecnológico (CNPq)

** Da Universidade Federal do Maranhão - Programa de Pesquisa e Pós-Graduaçao emImunologia - Campus Universitário - Bacanga - Bloco 3 - Sala 3A - 65000 - São Luís ,MA - Brasil.

*** Da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Caixa Postal 6109 - 13100 -Campinas, SP. -

de cadeias pesadas, cuja aquisição é dispen-diosa para os laboratórios de pesquisapertencentes aos países em desenvolvimento.

Com a finalidade de minimizar estasdificuldades, nesta pesquisa foram utili-zados soros pluriespecíficos para seremcomparados os níveis das diferentes imu-noglobulinas encontradas em camundongosesquistossomóticos com os detectados emgrupos de animais normais, tomados comocontrole.

MATERIAL E MÉTODOS

Hospedeiro Definitivo e Procedência doS. mansoni.

Foram tomados 160 Mus musculusalbinos (dos dois sexos) da raça Swiss,com 30 dias de vida, nascidos no Biotério doDepartamento de Parasitologia, da Universi-dade Estadual de Campinas (SP). Estesanimais foram pesados e dividos aleatoria-mente em dois grupos numericamente iguais.Um desses grupos foi submetido à infecçãopor cercárias de S. mansoni da linhagem BH.O outro grupo foi utilizado como controleda experiência.

Método de Infecção de Camundongos.

Decorridas quatro semanas, contadas apartir da data da exposição das Biomphala-ria glabrata aos miracídios da linhagem mi-neira, os moluscos foram expostos à luze a temperatura de 28°C, por duas horas,com a finalidade de se obter cercárias (Pe-llegrino e Macedo39, 1955). As larvas eramtransportadas para tubos de ensaio de 10ml,contendo água à temperatura de 28°C,aquecidos por lâmpadas elétricas. A caudade cada roedor foi imersa em suspensão con-tendo 100 cercárias, assim permanecendopor duas horas. Em seguida, os camundongoseram retirados e suas caudas lavadas, com afinalidade de serem separadas e contadas aspartes cefálicas das cercárias que não conse-guiram penetrar pelo tegumento. Foi deter-minada a diferença entre o número de cer-cárias contidas inicialmente na suspensão e oencontrado na recontagem. Obteve-se, assim,

o número de cercárias penentrantes (Maga-lhães27, 1969).

Coleta de Material para Análise Parasito-Imunológica.1. Obtenção de soros.A cada semana que se completava após a

data da exposição dos camundongos às lar-vas infectantes, 10 animais do grupo infec-tado e 10 do grupo controle eram pesados esangrados pelo plexo braquial (Lima e Sil-va2 6 , 1970).

O sangue, dos 10 indivíduos de cada gru-po, coletado no mesmo tubo, era deixadoà temperatura ambiente, para a obtençãodo soro. Logo a seguir, os soros eram cen-trifugados a 270g, à temperatura de 0°C.Em seguida, eram ministrados e distribuí-dos em alíquotas de 100 ul e rotulados deacordo com o grupo de origem e com asemana correspondente. O grupo dos infec-tados recebeu a sigla In e dos controles Cn;sendo n equivalente ao número de semanastranscorridas desde a data da exposição.

A conservação do material sérico foi fei-ta por congelação e permaneceu neste es-tado até a realização das análises.

2. Coleta de Vermes e Contagem de Gra-nulomas Hepáticos.

Após a sangria, os camundongos foramsacrificados e suas cavidades peritoneais ex-postas. Em seguida, o sistema porta de cadaanimal foi perfundido e exemplares deS. mansoni foram retirados dos vasos mesen-téricos e hepáticos (Brener6, 1962). Vermes,também, foram obtidos por esmagamentodo fígado entre lâminas de vidro (Hill19,1956). Os esquistossomos encontrados fo-ram contados, sendo que os adultos foramseparados por sexo.

Os fígados procedentes dos camundongosinfectados foram homogeneizados em águae a suspensão transportada para os copos desedimentação. A cada suspensão foramadicionadas aproximadamente 5 gotas deformol a 40%. O sedimento foi lavado comágua e transportado para placas de Petricom base milimetrada, com a finalidadede serem contados os granulomas hepáti-

cos em lupas estereoscópicas, de acordocom o método descrito por Brener e col.7

em 1956.

Obtenção de Reativos Biológicos.Na imunoeletroforese quantitativa foram

utilizados soros de coelhos anti-imunoglobu-linas (anti-Igs) de camundongos. Estas Igsforam isoladas a partir de soro normal dosroedores (SN), através da seguinte metodo-logia:

1. Fracionamento do soro normal de ca-mundongo.

Globulinas do soro normal de camundon-gos foram precipitadas com sulfato de amô-nio a 50% de saturação, em pH=8.0 e, emseguida, dialisada contra solução de NaCl,0.15 M, até reação de Nessler negativa(Lima e Silva26, 1970). Uma nova diálise foifeita com solução tampão de fosfato de po-tássio NaCl (0.1 M; pH = 8.0), antes de cadafiltração em gel.

2. Filtração em gel.Seis mililitros da fração globulínica foram

aplicados em colunas de 45 x 5 cm de Sepha-dex G200 (Pharmacia), segundo Fahey ecol. 12 (1964). O eluente utilizado foi solu-ção tampão de fosfato de potássio (0,05M,pH = 8) com fluxo médio de 70ml por hora.Frações de 4ml foram coletadas e suas ab-sorvâncias determinadas a 280 nm. Cada fil-tração produzia três picos individuais de pro-teínas e as que correspondiam às globulinascom pesos moleculares de 19S e 7S, eramconcentradas separadamente em ultrafiltros(Amicon) e submetidas à eletroforese prepa-rativa em bloco.

3. Eletroforese preparativa em bloco deamido.

Para preparo do bloco de amido foi em-pregado amido hidrolisado suspenso emsolução tampão veronal (0.05 M; pH =8.6).A eletroforese foi realizada com uma dife-rença de potencial de 250V, por 24 h (Kun-kel e Slater24, 1952). O mesmo tampãoveronal foi utilizado para a eluição do ma-terial resultante da separação. Os eluatos

foram analisados por absorvância em 280nm e os que apresentaram valores mais ele-vados, referentes a cada pico, foram subme-tidos a imunoeletroforese.

4. Imunoeletroforese.A imunoeletroforese unidimensional

(Grabar e Burtin17, 1964) foi utilizada paraverificação do comportamento dos eluatosobtidos da eletroforese em bloco, frente aoanti-soro normal de camundongo. A téc-nica da imunoeletroforese do tipo Rocketde Laurell foi realizada conforme descri-ção de Wekke (Axelsen e col.3, 1973), eserviu para identificar proteínas nos elua-tos. Os suportes utilizados foram ágar paraa imunoeletroforese de Grabar e Burtin 17 eagarose (BIO-RAD Lab.) para a imunoele-troforese Rocket, a 1% em solução tampãoveronal-HCl (0.05 M; PH=8.6 e u= 0.02).As condições de forese foram de 6 V/cm,por 1,10 h e 1,5 V/cm, por 15 h, respecti-vamente para a primeira e a segunda imuno-eletroforese. A solução tampão da cuba foia mesma utilizada para o preparo do gel.

Os eluatos que, na imunoeletroforeseunidimensional, apresentaram sistemas preci-pitantes, considerados apropriados paraa obtenção de reativos biológicos, foram se-parados para a imunização de coelhos. Osanti-soros obtidos foram utilizados para aquantificação das Igs dos camundongos es-quistossomóticos. Da eletroforese da 19Sresultou uma fração que foi utilizada para aobtenção de soros de coelho anti-IgM decamundongos, denominada fração FM. Dofracionamento da 7S resultou a fração G,utilizada para a obtenção de soros de coelhoanti-IgG.

5. Imunização de coelhos.Foram imunizados coelhos com soro nor-

mal (SN), frações FM e G de camundongos,obedecendo os seguintes esquemas:

a. Imunização com soro normal (SN).Em 1 ml de adjuvante completo de

Freund foi emulsionado 1 ml de uma dilui-ção do SN em solução salina fisiológica(0.15M), contendo 10mg de proteínas to-

tais. O volume final foi distribuído em 4 alí-quotas e inoculadas por via intramuscularnas patas do animal. Especialmente, as ino-culações das patas traseiras foram feitas emregiões próximas aos gânglios poplíteos (Oli-veira 3 6 , 1975). Decorridos 30 dias após adose sensibilizante, os coelhos foram nova-mente inoculados, em vários pontos distri-buídos no dorso do animal, com antígenotratado de maneira idêntica a anterior. Osanti-soros obtidos, 20 dias após a última do-se, foram analisados por imunodifusão(Ouchterlony37, 1958) e apresentaram o tí-tulo precipitante de 1/32, quando testadoscom o antígeno na concentração de 500 ugde proteína/ml.

6. Imunização com as frações FM e G.O esquema de inoculação das frações

FM e G em coelhos foi análogo ao utiliza-do para o soro normal de camundongos.Contudo, a concentração antigênica da dosedesencadeante da resposta imune foi a me-tade da utilizada na sensibilização. Os títu-los dos anti-soros, obtidos por imuno-difu-são, foram: 1/32, para o anti-FM, e 1/16,para o anti-G (Ouchterlony37, 1958).

Dosagem de Proteínas.1. Proteínas totais.O teor protéico dos diferentes soros foi

determinado pelo reativo do biurêto, segun-do Wiechselbaum46 (1946), e/ou a 280nm,em espectrofotômetro Zeiss, PMQ III, comcubas de quartzo e caminho óptico de 1 cm.

2. Das frações séricas.As seroproteinas de camundongos imunes

e normais (controles) foram quantificadaspor eletroforese em microzonas e por imu-noeletroforese bidimensional quantitativa.

a. Eletroforese em microzonas.Fitas de acetato de celulose, contendo os

soros em estudo, foram submetidas a 250V/cuba, contendo solução tampão veronal-ace-tato (0.05M; pH= 8.6), por 30 min. O con-junto utilizado para a forese foi o Microphor

(Zeiss). A densitometria foi determinada emRegistrador de Extinção n.°3 (Zeiss).

b. Imunoeletroforese bidimensionalquantitativa.

Placas de vidro de 9 x 12cm, cobertascom 16ml de agarose (BIO-RAD Lab.) a1% em tampão veronal-HCl (0.05M; pH= 8.6e u =0.02) de Svendsen (Axelsen e col.3,1973), foram utilizadas para a imunoeletro-forese bidimensional quantitativa de Laurell,de acordo com as orientaçãoes de Weeke,descritas em Axelsen e col.3 (1973). Aeletroforese no primeiro sentido foi reali-zada com 6V/cm, por 1,10h, e na segundadimensão, 1,5 V/cm, por 15h. A quantifica-ção das imunoglobulinas foi feita pela medidada área envolvida pelo precipitado, com au-xílio de papel milimetrado. Multiplicamos osvalores correspondentes às alturas de cada pi-co em milímetros por uma base determinadano quadrante superior esquerdo da precipita-ção, estabelecida por uma linha que bisecta-va a da altura.

Identificação das Imunoglobulinas.Para a identificação das imunoglobulinas

de camundongos foram utilizados soros pa-drões anti-globulinas do roedor, procedentesdos laboratórios Bionetics (IgA, IgM e IgG2a)e da Miles (IgG1 e IgG2b). Estes soros,na segunda forese, foram colocados em cana-letas abertas no gel, localizadas na faixa demigração das globulinas. A migração da glo-bulina, especificamente reconhecida pelo so-ro padrão, sofre atraso e permite sua identi-ficação (absorção "in situ").

Determinação da Atividade do Anticorpo.Vermes adultos depositados em solução

salina fisiológica (0.15M) foram lavados trêsvezes nesta mesma solução, com intervalosde 60 min entre cada lavagem, à temperaturade 37°C. Em seguida, os esquistossomos fo-ram liofilizados e adicionados, em excesso,ao soro imune de camundongos da 8a sema-na de infecção (10 mg do material liofiliza-do em 200 ul de soro). Permaneceram 3 ho-ras neste estado, à temperatura ambiente, e12 horas a 4.° C. O sobrenadante retirado foi

centrifugado a 3.000g, por 20 min, a 0.°C eanalisado por imunoeletroforese bidimensio-nal, frente ao soro anti-FM. Em seguida, oliofilizado foi lavado três vezes em soluçãosalina tamponada com fosfatos (PBS; 0.01 M;pH= 7.2) e submetido à reação de imuno-fluorescência indireta, para comprovação daabsorvação.

Reações de ImunofluorescênciaForam realizadas reações de imunofluo-

rescência indireta entre os soros imunes decamundongos esquistossomóticos e os espo-rocistos, cercárias, vermes e miracídios da li-nhagem mineira de S. mansoni. As reaçõesse processaram em tudos de ensaio (cercá-rias e miracídios) e em cortes histológicos(esporocitos, vermes e miracídios). A leitu-ra dos resultados foi realizada em microscó-pio Zeiss, contendo lâmpada HBO 200,filtros barreira 0/47/44 e excitador I.

A obtenção do material para as reaçõesprocessou-se da seguinte maneira:1. Cercárias —Foram utilizadas larvas, com

duas horas de vida. As cercárias forammortas pela adição de 5 gotas de formal-deido a 40%, em 100ml de suspensão cer-cariana.

2. Vermes — Esquistossomos recém-cole-tados, foram lavados três vezes em solu-ção salina fisiológica (0.15M), duranteuma hora. Em seguida, foram mergulha-dos em fixador de Rossman (90 ml deetanol 100% saturado com ácido pícrico e10ml de formaldeido a 37%), por 15 h(NASH, 1974). Para a inclusão, a peça foicortada em tiras de 5mu de espessura epreparada para microscopia óptica.

3. Miracídios — Foram utilizados mirací-dios obtidos de cortes histológicos defígados parasitados e, também, recém--eclodidos de ovos isolados do mesmo ór-gão. As preparações para cortes histoló-gicos foram confeccionadas de maneiraidêntica a descrita para os vermes. O pro-cedimento para o isolamento dos ovosfoi iniciado pela homogeinização dos fí-gados em liquidificador. Posteriormente,

os ovos foram lavados com solução deNaCl a 1.7%, em peneiras metálicas"granutest", com malhas de 0.149;0.074 e 0.037mm. Em seguida, foramdepositados sobre a superfície de uma so-lução de Hypaque (Winthrop) a 10% con-tida em funil cuja abertura estava cerrada;três horas após, a torneira do funil foiaberta e os ovos foram recuperados,isentos de tecidos.

4. Esporocistos - caramujos parasitadoscom S. mansoni foram fixados, incluí-dos em parafina e montados em lâminasde microscopia, pelo método semelhanteao descrito para os vermes.

As reações de imunofluorescência indi-reta foram as mesmas, tanto para o materialmanuseado em tubos, como para o preparoem lâminas. Os esporocistos foram lavadostrês vezes com solução salina tamponada(PBS; 0.01M; pH= 7.2). As lâminas foramsecas parcialmente e os imune-soros, diluí-dos a 1/8, adicionados sobre as preparações,deixando-se reagir em câmara úmida, na tem-peratura ambiente, por 30 min. Após esteperíodo, o material foi novamente lavadoem PBS, 3 vezes por 5 min. O excesso dePBS foi retirado adicionando-se o conjugadoantiglobulinas 7S de camundongo produzi-do em cabra, marcado com isotiocianato defluoresceina (Hayland Lab.) e diluído a1/50 (Lemos Neto25 , 1975). O conjugadofoi diluído em PBS, contendo azul de Evans,na diluição de 1:10.000 (Nash32, 1974).Esta reação processou-se em câmara úmida,por 45 min. Depois, as preparações foramlavadas em PBS e montadas em glicerinaalcalinizada com tampão carbonato (pH =9.0).

RESULTADOS

Evolução da Infecção.A percentagem de cercárias que conseguiu

penetrar variou de 83% a 96%, nos diferen-tes lotes, resultando que, em média, pene-tram 50 cercárias por animal.

As médias dos valores referentes ao nú-mero de vermes e de granulomas hepáticos,encontrados no decorrer da infecção, foram20 e 2.000 respectivamente. Verificou-se,também, que os vermes adultos começarama aparecer em épocas em que ainda se regis-travam o encontro de esquistossomulos.

A distribuição dos pesos corporais dosanimais destinados a experiência não diferiusignificativamente da distribuição normal.Contudo, as medias dos diferentes lotes dis-tribuíram-se assimetricamente e por grupos.A heterogeneidade desta variância, verifica-da pelo teste de Bartlett, foi altamente sig-nificativa para 15 graus de liberdade (X2 =52.3843). Por este motivo, o estudo do com-prometimento do fígado e do baço foi in-vestigado, comparando-se a média dos pesosdesses órgãos do grupo infectado com asdo grupo controle. Os resultados obtidosforam analisados pelo teste U e indicaram a

ocorrência de diferenças significativas nopeso destes órgãos, a partir da 4a semana deinfecção.

Os resultados da eletroforese em micro-zonas dos soros oriundos dos animais perten-centes aos diversos lotes de infectados e decontroles foram analisados estatisticamente emostraram diferenças significativas entre os

grupos no que se refere aos níveis de albumina e das globulinas a e B . Estes níveis

modificaram-se a proporção que a infecçãoevoluiu (Tabela 1). Ocorreu elevação no ní-vel das globulinas dos animais do grupo in-fectado, principalmente na região da B e 7 -globulina, nas 7a e 8a semanas após a exposi-ção. A albumina apresentou queda do nívelsérico nesta época.

Evolução das Imunoglobulinas.1. Padronização do método.Foram utilizados, no presente trabalho,

três imune-soros de coelhos anti-imunoglo-bulinas de camundongos, para a quantifi-cação das imunoglobulinas (Igs) dos sorosdos animais dos grupos infectados (I) e con-trole (C): anti-FM 1; anti-FM e anti-G.Os soros de camundongos, analisados porImunoeletroforese Bidimensional, frente a es-tes reativos biológicos, apresentaram três sis-temas precipitantes bem definidos (Fig. 1).Foi observado, com qualquer um dos imune-soros utilizados, relação linear entre as áreasdelimitadas por estas precipitações e as quan-tidades de soros de camundongos aplicadas.Os valores obtidos com replicadas, apre-sentaram variações em volta de 10%, consi-deradas dentro dos limites de erro estabele-cidos para o método.

A identificação dos três sistemas preci-pitantes foi realizada através da técnica deabsorção "in situ", utilizando padrões anti-Igs de camundongos, tal como pode serobservado na Fig. 1, que mostra um sistemaprecipitante correspondente a Ig da classeM (IgM). Utilizando idêntica metodologia,foi possível constatar que o Pico 1 corres-pondia a IgGl e o pico 3, a IgA. Com oimune-soro anti-G foram obtidos, também,sistemas precipitantes e identificados comosendo IgG1, IgG2b e IgG2a, respectivamen-te.

O soro padrão anti-IgG1 reagiu com IgAde camundongos como reflexo da dificulda-de da obtenção de reativos mono-específi-cos de cadeias pesadas.

A localização destas proteínas foi corres-pondente às suas mobilidades eletroforéticas.

2. Quantificação das imunoglobulinas.A comparação dos padrões das reações

de imunoeletroforese bidimensional quanti-tativa, obtidas com soros dos camundongosdos diferentes lotes, mostrou que o teordas imunoglobulinas variou durante o perío-do de observação, tanto no grupo controlecomo no grupo infectado (Fig. 2). Estaobservação pode ser feita com qualquer dosimune-soros disponíveis, principalmente como soro anti-G, utilizado para quantificar asimunoglobulinas G2a e G2b. Como se podeobservar na Fig. 2, não houve paralelismoentre as variações ocorridas dentro dos lo-tes controle (C) e às apresentadas nos lotesinfectados (I).

Os dados referentes a quantificação dasdiversas classes de Igs estão dispostos nasFigs. 3 a 7, onde se verifica, a grosso modo,que ocorreram alterações quantitativas du-rante o período de observação, tanto nogrupo I como no grupo C. Pode-se observar,também, que as variações que ocorreram nogrupo C apresentaram um aspecto cíclicosinosoidal. A comparação das curvas de evo-lução das imunoglobulinas do grupo C como I mostraram, no que se refere a IgM,IgA e IgG1, que as duas curvas são aparente-mente paralelas da primeira até a quintasemana de observação, após o que aparece-ram nítidas diferenças quantitativas nos ní-veis dessas imunoglobulinas, nos dois grupos.Houve, durante o período de observação,aparente paralelismo entre os dois grupos,no que diz respeito aos níveis das imunoglo-bulinas IgG2a e IgG2b.

A análise estatística dos dados quantitati-vos (teste de Wilcoxon) evidenciou que osdois grupos diferiram significativamente, noque se refere ao teor da IgG1. A análisede variância mostrou que os dois grupos,também, diferiram significativamente, quan-

do comparados a partir da 6a semana após aexposição, no tocante ao teor de IgA. Emconcordância com o aparente paralelismoobservado nas Figs. 6 e 7, não foram eviden-ciadas diferenças significativas entre os gru-pos C e I, no que se refere ao teor das imu-noglobulinas IgG2a e IgG2b.

Considerando que ao longo do períodode observação houve variação ampla do teorda Igs no grupo C, não se pode atribuir umalto significado aos valores de concentraçãoabsoluta de imunoglobulinas do grupo I.Em decorrência deste fato, o teor das Igsdo grupo I será melhor representado, indi-cando-se quantas vezes seu nível é maior oumenor do que o grupo C. Isto pode ser fei-to através da relação dos resultados obtidosno grupo I e C correspondente (I/C), levan-do-se em consideração que os valores I/C,

situados entre 0.8 e 1.2, devem ser incluí-dos na faixa considerada de variação normal,uma vez que as variações das replicatas foiigual ou inferior a 20%. A representaçãoda relação I/C, ao longo do período de ob-servação, mostra que, nas primeiras semanas,houve elevação do teor da IgM, seguido porum aumento da IgA (Fig. 8). Após esta ele-vação, os níveis destas Igs voltaram pratica-mente à normalidade, entre a 3a e 5a sema-na e, em seguida, os níveis da IgA, IgG1 eIgM começaram a aumentar consideravelmen-te, chegando a atingir, na 8a semana, a valo-res correspondentes a 4.5, 3 e 2, respecti-vamente.

3. Especificidade das Imunoglobulinas.Foi verificada a capacidade dos soros de

camundongos reagirem com os antígenos de

S. mansoni, usando a imunoeletroforesebidimensional e a reação de imunofluores-cência indireta.

Os soros obtidos dos animais pertencentesaos lotes C apresentaram reações negativascom quaisquer das técnicas empregadas.

A imunoeletroforese bidimensional, dossoros previamente absorvidos com vermesliofilizados, indicou uma acentuada reduçãodas áreas correspondentes às imunoglobuli-nas IgM; IgA; IgG1 e IgG2 (Fig. 9). Em con-cordância com este fato, os vermes liofiliza-dos, utilizados na absorção, quando subme-tidos ao teste de imunofluorescência, mos-traram-se fortemente positivos.

As reações de imunofluorescência indire-ta foram feitas, seja utilizando-se cortes

histológicos de esquistossomos, esporocistose miracídios, seja utilizando miracídios ecercárias íntegras. Os resultados obtidos, su-mariados na Tabela 2, indicam que reaçõespositivas podem ser observadas a partir da3a semana de infecção, quando se utilizamcortes histológicos de esquistossomos. Ini-cialmente, a positividade destas reações podeser observada no tubo digestivo do esquistos-somo. Isto ocorreu quando foram utilizadossoros de animais com 4 semanas de infecção.Com os soros das semanas subseqüentes, apositividade se estendeu para além do tubodigestivo, sendo que, nas últimas semanas,todo corpo do verme apresentou-se fluores-cente, acentuando-se o tegumento e o tubodigestivo.

Utilizando cercárias íntegras, foi possí-vel determinar reações positivas frente a so-ros de animais com 4 semanas de infecção.Com estes soros, foram observadas reaçõespositivas nas extremidades da parte cefáli-ca das cercarías. Com os soros dos animaiscom 6 a 8 semanas de infecção, observou-se positividade crescente do tegumento dalarva.

Com os miracídios, a positividade podeser verificada a partir da 4.° semana de infec-ção, nos cílios e tegumento. A princípio, es-tas reações foram discretas, intensificando-sequando foram utilizados os soros das sema-nas subseqüentes. As reações realizadascom os soros controles foram todas negati-vas. Idênticas observações foram verificadasem miracídios contidos em cortes histoló-gicos de fígado de camundongos infectados.

Nos esporocistos, as reações positivas emcercárias começaram a aparecer na 6a

semana após infecção, e em cercárias e nasparedes dos esporocistos, da 7a semana emdiante.

DISCUSSÃO E CONCLUSÕES

A infecção experimental de camundongoscom Schistosoma mansoni é fácil de serestabelecida, desde que se observe dois fa-tores considerados importantes por Ghan-

dour e Webbe16 (1973), para maior aprovei-tamento do potencial energético das cercá-rias na invasão do tegumento dó hospedeiro:a utilização de larvas recém-emergidas e decamundongos jovens. Na realização do pre-sente trabalho foram observados os fatoresidade das cercárias (2 horas) e do hospedei-ro vertebrado (30 dias). Os resultados obti-dos na evolução da parasitose mostraram quetodos os animas expostos ao verme estavamparasitados. Vários resultados obtidos duran-te a infecção não diferiram dos dados mos-trados por outros autores. O número de cer-cárias, viáveis para a infecção de camundon-gos, foi semelhante ao encontrado por Oli-ver e Stirewalt35 (1952), precursores do mé-todo de infecção através da cauda do animal,e por Magalhães e Carvalho28 (1968), quan-do compararam o poder infectante da li-nhagem mineira com a linhagem paulista doverme. Exemplares de S. mansoni tornaram-se adultos em épocas em que ainda se regis-trava a presença de vermes jovens, comparan-do-se ao "amadurecimento assincrônico dosvermes", analisado por Brener5 (1956), aocomparar seus dados com os que foram pu-blicados por Faust e col. 13, em 1934, erecentemente por Barbosa e col.4 (1978).As datas em que foram registrados o apare-cimento de granulomas hepáticos (6a sema-na) e o pico destas reações textrinas (8a se-mana), assim como a média de parasitas re-cuperados por animal, foram, também,resultados coincidentes com os da literaturaespecializada (Brener5 1956; Brener e col.7,1956 e Warren45, 1967).

A eletroforese foi aplicada nos soros dosanimais pertencentes aos diferentes lotesinfectados e controles. A análise dos perfisdas proteínas séricas mostrou que houve va-riações quantitativas, tanto nos lotes infec-tados como nos controles correspondentes.Estas variações não foram estatisticamentesignificativas quando comparadas isolada-mente entre os lotes de cada grupo. Contu-do, se levarmos em consideração que o erroda dosagem das proteínas e das frações ele-troforéticas não é maior do que 10%, há quese admitir que as flutuações dos níveis dasproteínas totais não estão incluídas no li-

mite do erro de dosagem e, conseqüentemen-te devem ser atribuídas a alterações reaisnos níveis destas proteínas.

A comparação feita entre os dados dosgrupos controle e infectado mostrou a ocor-rência de alterações estatísticas muito signi-ficantes das frações B e 7 - globulinas, alémde hipoalbuminemia. Estes resultados sãoconcordantes com as observações feitas des-de a década de 50, tanto na esquistossomosehumana (Fiorillo14, 1954) como na expe-rimental (Evans e Stirewalt10, 11, 1957,1958; Sadun e Walton40, 1958). Alguns au-tores, como de Witt e Warren9 (1959),não encontraram hipoalbuminemia em ca-mundongos esquistossomóticos e concluíramser possível a síntese de albumina pelo pa-rênquima hepático não totalmente destruí-do pelo parasita. Porém, outros trabalhos

realizados em seguida confirmaram as obser-vações que vinham sendo encontradas nohomem (Fiorillo15, 1966) e em modelosexperimentais (Smithers e Walker43 , 1961).Estes dois últimos autores acrescentaram queo decréscimo no nível da albumina ocorriaao mesmo tempo em que um marcante au-mento intravascular de seus "catabólitos"era registrado por isótopos, sugerindo seresta a causa principal da hipoalbuminemia.Esta ocorrência seria devido ao insuficienteanabolismo desta proteína pelo fígado pa-rasitado. As causas imunológicas destesfenômenos são bastante discutidas e conside-radas como resultantes de estímulos antigê-nicos específicos e inespecíficos. Os espe-cíficos correriam por conta das secreções eexcreções procedentes de vermes e do está-gio larvário contido nos ovos, e os ines-

pecíficos, decorrentes de lesões tissularesprovocadas pelo S. mansoni no fígado(Smithers e Terry42, 1969).

Como sabemos, o método da eletroforeseem microzonas permite quantificar as alte-rações que ocorrem nas cinco principaisfrações séricas, caracterizadas pelas suas mo-bilidades eletroforéticas. Contudo, o sorocontém maior número de componentes iden-tificados (53 proteínas séricas humanas)e as alterações quantitativas dos mesmos,durante a infecção, poderão ser feitas indi-vidualmente, utilizando métodos imunoquí-micos.

Habitualmente, no estudo da evoluçãodas diferentes classes de Imunoglobulinas,tem sido utilizado o método de Mancinie col.29 (1965), comparando-se uma mistu-ra (pool) de soros dos animais infectados.Este método tem alta sensibilidade e é ex-celente para a determinação de quantidadesabsolutas de imunoglobulinas, porém, tem oinconveniente de exigir soros mono-espe-cíficos. A preparação deste tipo de soroapresenta numerosos problemas, tendo emvista que a quantidade média de soro obtidapor camundongo é de 0,5ml/animal, o querequer grande número de camundongos paraesta finalidade. Por outro lado, a quantidadedas diferentes imunoglobulinas nestes sorosé baixa, sendo que a obtenção destas proteí-nas em estado de pureza, exige uma grandequantidade de material inicial. Têm sido inú-meras as tentativas de obtenção das cincomaiores classes de Igs de camundongos. Osmétodos utilizados foram os mais variadospossíveis. A maioria deles empregou a sepa-ração em DEAE-celulose como passo prin-cipal (Kalpaktsoglou e col. 2 2 , 1973), ou-tros usaram a eletroforese em zona combi-nada com cromatografia de troca-iônica(Fahey e col. 12, 1964), com ou sem préviaprecipitação das globulinas pelo sulfato deamônio; outros ainda incluíram a filtraçãoem gel ou eletroforese preparativa, seguidapor várias formas de cromatografia em colu-na e, por fim, combinações entre eletrofore-se em zona de purificação do material ele-tro-separado, com a técnica de eletro-focali-zação (Murgita e Vas31, 1970). Em nosso

trabalho, por exemplo, frações que foramconsideradas puras por imunoeletroforeseunidimensional, quando utilizadas para aimunização de coelhos, induziram a forma-ção de soros pluri-específicos (cadeias levese pesadas). Para contornar estas dificuldades,têm sido utilizados camundongos isogênicosportadores de mielomas (Fahey e col.12,1964). A manutenção de camundongos iso-gênicos requer laboratórios especiais e téc-nicos capacitados para selecionar geneti-camente estes animais, e a obtenção de cé-lulas de mieloma para o implante requer aimportação de material produzido no ex-terior.

O método da imunoeletroforese quanti-tativa bidimensional tem a vantagem de nãoexigir a utilização destes soros, conseqüente-mente qualquer laboratório, medianamenteequipado, poderá obter soros pluri-específi-cos que permitam quantificar as Igs em estu-do. Utilizando este método, foi-nos possíveldosar as Igs de camundongos envolvidas naresposta imune ao S. mansoni.

A análise estatística dos dados dos gru-pos controle e infectado indicou a existênciade alterações significativas a partir da 6a se-mana de infecção, em concordância com osdados da eletroforese em microzonas e comos dados de outros autores que observaramelevação nos níveis das B e y - globulinas,a partir da época da oviposição (Smithers eTerry42, 1969). As três imunoblobulinasque se destacaram como principais partici-pantes da resposta imune do camundongo aoS. mansoni: IgG1, IgA e IgM, também foramencontradas participando da imunidade naesquistossomose humana (Hillyer20, 1969;Antunes e col.2, 1971 e Kanamura e col.33,1978); murina (Hillyer e Frick21, 1967;Deeldler8, 1973 e Sher e col41, 1977) e emoutras infecções parasitárias produzidas porprotozoários, como malária e tripanossomose(PAHO38, 1967).

O valor dos dados quantitativos absolu-to das Igs tem pouco significado, conside-rando-se que o nível dessas proteínas sofreflutuações amplas durante o desenvolvimen-to dos animais (Ohwaki e col.33, 1977;Haaijman e col.18, 1977), chegando muitas

vezes a duplicar a concentração inicial,como foi observado no presente trabalho.Essas flutuações se devem principalmente avários estímulos antigênicos, decorrentes damanutenção dos animais em biotério eda própria variação ambiente. Tendo emvista as alterações que ocorrem normalmen-te nos animais de observação, o estudo dodesenvolvimento das imunoglobulinas deveser feito, comparando-se animais da mesmaraça e idade, submetidos às mesmas condi-ções ambientes durante o período do expe-rimento. Nestas condições, foi possível es-timar quantas vezes o nível das Igs dos ani-mais infectados aumentou em relação aosdo grupo controle.

O perfil sorológico resultante da relaçãoI/C (Fig. 8), evidenciou aspectos clássicosda resposta imune encontrada em animaisque tenham recebido dois estímulos antigê-nicos consecutivos. Estes aspectos têmsido observados em camundongos conven-cionais a axênicos, utilizando-se antígenostimo dependentes ou não (Ohwaki e col.33,1977). A resposta primária, caracterizadapela IgM e IgA, ocorrida entre a primeira ea segunda semanas após a infecção, deve-seprovavelmente a estímulos antigênicos decercárias e esquistossomulos. A resposta se-cundária, caracterizada pela IgG1, IgA e IgM,ocorreu a partir da 6a semana após a infec-ção, possivelmente devido a antígenos pro-venientes de vermes adultos, aos ovos dosparasitas e aos tecidos desnaturados por se-creções destas formas evolutivas do verme.Nesta data, foi também observado aumentosignificativo dos pesos do baço e do fígado.

O aparecimento de anticorpos da classeIgM como primeira Ig efetora da respostaimune, tem sido encontrada na esquistosso-mose (Kanamura e col.23, 1978) e em váriasoutras infecções, como toxoplasmose (Ama-to Neto e col.1, 1972) e doença de Chagas(Vattuone e col.44, 1973). A presença daIgA nas duas respostas, com destaque nasecundária, pode ser explicada como resul-

tante de reações celulares ocorridas a ní-vel de plasmócitos localizados em mucosasdo trato respiratório e gastroentérico, espe-cíficas a antígenos do primeiro e segundo es-tágio, respectivamente.

Tem sido demostrado que, os anticorposda classe IgG1, estão presentes nos soros decamundongos parasitados com S. mansoni(Sher e col.41,1977).

Não foi observada a formação de anticor-pos entre a 3a e 5a semanas após a infecção.Este período de latência da resposta imuneé coincidente com o registrado por Mota-Santos e col.30, em 1976, que observaramestado de depressão imunológica em ca-mundongos esquistossomóticos, avaliadopela capacidade dos linfócitos esplênicosformarem "rosetas" e de produzirem anti-corpos "in vitro" frente a antígenos timodependentes (hemácias de carneiro).

O aumento das Igs verificado durante ainfecção se deve a uma produção de anti-corpos específicos para antígenos provenien-tes do parasita, demonstrado pela imunoele-troforese bidimensional com soros previa-mente absorvidos e pelas reações de imuno-fluorescência indireta, utilizando diferentesestágios evolutivos do parasita. Estes dadoscoincidem com os Okot-Kotber34 (1978)e indicaram que os primeiros anticorposformados são específicos para o tubo diges-tivo do parasita, sugerindo serem estes an-tígenos altamente imunogênicos.

O conjunto de dados mostrou que utili-zando-se soros pluri-específicos de fácilobtenção e expressando-se as alteraçõesquantitativas pela reação I/C, foi possívelestudar a evolução da resposta imune humo-ral na esquistossomose, obtendo-se dadoscomparáveis com os encontrados na litera-tura. Isto permite admitir que esta metodo-logia pode ser utilizada no estudo da respos-ta imune de outras patologias.

BASTOS, O. de C, et al, [The evolution of immunoglobulins involved in the immune responseto mice infected with Schistosoma mansoni.] Rev. Saúde públ., S, Paulo, 18: 138 - 54,1984.

ABSTRACT: The evolution of immunoglobulins involved in the immune response ofmice infected with Schistosoma mansoni was studied by using plurispecific sera and the bi--dimensional immunoelectrophoresis technique. Determinations of the level of differentimmunoglobulins in infected animals and control groups which were mantained under similarconditions detected significant variations in both groups over the 8 weeks of observation.The study of the relationship (I/C) between the level of immunoglobulins of the infectedanimals (I) and that of corresponding control (C) showed that the infected animals presen-ted a primary response (1-2 weeks after infection date) and a secondary response that wasinitiated in the 6th week of infection, with levels of IgA, IgG and IgM that were respectively4.5, 3 and 2 times higher than those of corresponding control.

UNITERMS: Schistosoma mansoni. Immunoglobulins. Schistosomiasis.

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICAS

1. AMATO NETO, V.; CAMARGO, M.E.; MEN-DONÇA, J.S.; LEVI, G. C. & OSEKA, G.W. Observações sobre a pesquisa de anti-corpo IgM anti-toxoplasma por imunofluo-rescência no soro de pacientes com toxo-plasma adquirida, forma linfoglandular.Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, 14: 264-72,1972.

2. ANTUNES, L. J.; REIS, A. P.; PELLEGRINO,J.; TAVARES, C. A. & KATZ, N. Immuno-globulins in human schistosomiasis man-soni.J. Parasit., 57: 539-42, 1971.

3. AXELSEN, N. H.; KROL, J. & WEEKE, B. Amanual of quantitative immunoelectrofo-resis: methods and applications. Oslo, Uni-versitestsforlaget, 1973.

4. BARBOSA, M.A.; PELLEGRINO, J.; COE-LHO, P. M. Z. & SAMPAIO, I. B. M.Quantitative aspects of the migration andevolutive asynchronism of Schistosomamansoni in mice. Rev. Inst. Med. trop. S.Paulo, 20:121-32, 1978.

5. BRENER, Z. Observações sobre a infecçãodo camundongo pelo S. mansoni. Rev.bras. Malar., 8: 565-75, 1956.

6. BRENER, Z. Contribuição ao estudo da tera-pêutica experimental da esquistossomosemansônica, Belo Horizonte, 1962. [Tesede Cátedra - Faculdade de Odontologia eFarmácia da Universidade de Minas Gerais]

7. BRENER, Z.; PELLEGRINO, J. & OLIVEIRA,F. C. Terapêutica experimental da esquis-tossomose mansoni. Aplicação do mé-todo de isolamento de granulomas dofígado de camundongos. Rev. bras. Malar.,8:583-7, 1956.

8. DEELDER, A. M. Immunology of experimen-tal infections with Schistosoma mansoni inthe swiss mouse and Fasciola hepatica inrabbit. Acta leidensia, 39: 1-107, 1973.

9. DeWITT, W. B. & WARREN, K. S. Hepato-splenic shistosomiasis in mice. Amer. J.trop. Med. Hyg., 8: 440-6, 1959.

10.EVANS, A. S. &.STIREWALT, M. A. Sorolo-gic reactions in Schistosoma mansoni in-fection. III. Ionographic fracionation ofsera of mice with progressive disease. Exp.Parasit., 6:8-17, 1957.

11. EVANS, A. S. & STIREWALT, M. A. Sorolo-gic reactions in Schistosoma mansoni in-fection. IV — Comparative ionographicstudy of sera of hamster, mice, and albinorats. Exp. Parasit. 7: 165-77, 1958.

12.FAHEY, J. L.; WUNDERLICH, J. & MISHEL,R. The immunoglobulins of mice. I —Four major classes of immunoglobulins;7S Y2, 7S Y1 ,Y1 A(B2 A), and Y1M-glo-bulins. J. exp. Med., 120: 223-41, 1964.

13.FAUST, E. C; JONES, C. A. & HOFFMAN,W. A. Studies on schistosomiasis manso-ni in Puerto Rico. III — Biological studies.2 — The mammalian phase of the life cicle,Puerto Rico. J. Publ. Hlth trop. Med.,10:133-96, 1934.

14.FIORILLO, A. M. Estudo eletroforético dosoro de pacientes portadores de esquistos-somose mansoni hepatoesplênica, Hospi-tal, Rio de Janeiro, 45: 647-51, 1954.

15.FIORILLO, A. M. Electroforese das proteínasdo sangue na esquistossomose mansôni-ca forma hepatoesplênica. Rev. Inst. Med.trop. S.Paulo, 8: 1-8, 1966.

16.GHANDOUR, A. M. & WEBBE, G. A studyof the death of Schistosoma mansoni cer-cariae during penetration of mammalianhost skin: the influence of the ages of thecercariae and of the host. Int. J. Parasit.,3: 789-94, 1973.

17.GRABAR, P. & BURTIN, P. Immuno-elec-trophoretic analysis. Amsterdam, ElsevierPubl., 1964.

18.HAAIJMAN, J. J.; VAN DEN BERG, P. &BRINKHOF, J. Immunoglobulin class andsubclass levels in the serum of CBA micethroughout life. Immunology. 32: 923-927,1977.

19. HILL, J. Chemoterapeutic studies with labora-tory infections of S. mansoni. Ann trop.Med. Parasit., 50: 39-48, 1956.

20.HILLYER, G. V. Immunoprecipitins in Schis-tosoma mansoni infections. IV — Humaninfections. Exp. Parasit., 25: 376-81,1969.

21.HILLYER, G. V. & FRICK, L. P. Immunopre-cipitins in Schistosoma mansoni infectionsI — Mouse infections. Exp. Parasit., 20:321-5, 1967.

23.KANAMURA, H. Y.; HOSHINO-SHIMIZU, S.& SILVA, L. C. Pattern of class-specificfluorescent antibodies according to thestagen of the infection in human schisto-somiasis mansoni. Rev. Inst. Med. trop. S.Paulo, 20:76-81, 1978.

24.KUNKEL, H. G. & SLATER, R. J. Electro-phoresis in a starch supporting medium.Proc. Soc. exp. Biol. Med., 80: 42-4, 1952.

25.LEMOS NETO, R. C. Estudo comparativo docomportamento parasitológico e imunoló-gico das linhagens mineira e paulista doSchistosoma mansoni Sambon, 1907.Campinas, 1975 [Dissertação de Mestrado- Instituto de Biologia da UNICAMP].

26. LIMA, A. O. & SILVA, W. D. Imunologia, imu-nopatologia e alergia. Rio de Janeiro. Gua-nabara Koogan, 1970.

27.MAGALHÃES, L. A. & CARVALHO, J. F.Determinação do número de cercárias pro-venientes de cepas diferentes de Schisto-soma mansoni que conseguem penetrar,sob determinadas condições de laborató-rio, em Mus musculus. Rev. Soc. bras.Med. trop., 3:249-50, 1969.

28.MAGALHÃES, L. A. Técnica para avaliaçãoda viabilidade de penetração de cercáriasde Schistosoma mansoni em Mus muscu-lus. Hospital, Rio de Janeiro, 75: 1663-6,1969.

29.MANCINI, G.; CARBONARA, C. O. & HERE-MANS, J. F. Immunochemical quantifi-cation of antigens by single radial immuno-diffusion. Immunochemistry. 2: 238-54,1965.

30.MOTA-SANTOS, T. A.; GAZZINELLI, G.;RAMALHO PINTO, F. J.; PELLEGRINO,J. & SILVA, W. D. da Immunodepres-sion in mice following Schistosoma man-soni infection. Rev. Inst. Med. trop. S.Paulo, 18:246-50, 1976.

31.MURGITA, R. A. & VAS, S. I. Isoelectric se-paration of mouse immunoglobulins. J.Immunol., 104: 514-7, 1970.

33.OHWAKI, M.; YASUTAKE, N.; YASUI, H. &OGURA, R. A comparative study onthe humoral immune response in germ--free and conventional mice. Immunology,32:43-8,1977.

34.OKOT-KOTBER, B. M. The development ofstage-characteristic immunofluorescencepattern in experimental schistosomiasisin mice. Ann. trop. Med. Parasit., 72: 255-62, 1978,

35.OLIVER, L. & STIREWALT, M, A. An effi-cient method for exposure of mice to cer-cariae of Schistosoma mansoni. J. Parasit.,38:19-23,1952.

36. OLIVEIRA, A. R. Considerações sobre anti-soros obtidos pela técnica de injeção deantígeno no linfonódulo. Summa Phytopa-thologica, 1:61-4,1975,

37.OUCHTERLONY, O. Diffusion-in-gel methodsfor immunological analysis. Progr. Allergy,5:1-78, 1958,

38.PAN AMERICAN HEALTH ORGANIZATION.Immunologic aspects of parasitic infec-tions. Washington, D. C., 1967. (Scient.publ., 50).

39.PELLEGRINO, J. & MACEDO, D. G. A sim-plified method for the concentration ofcercariae. J. Parasit., 41: 329-30, 1955.

40.SADUN, E. H. & WALTON, B. C. Studies onthe host parasite relationships to Schisto-soma mansoni. II — Quantitative changes inthe concentration of serum proteins inhumans and rabbits. Amer. J. trop. Med.Hyg., 7:550-4,1958.

41.SHER, A.; McINTYRE, S. & von LICHTEN-BERG, F. Schistosoma mansoni: kineticsand class specificity of hypergamaglobuli-

nemia induced during murine infection.Exp. Parasit., 41: 415-22, 1977,

42.SMITHERS, S. R. & TERRY, R. The immuno-logy of schistosomiasis. Advanc. Parasit.,7:41-93,1969.

43.SMITHERS, S. R. & WALKER, P. J. Serumprotein changes in monkey infected withSchistosoma mansoni, with special referen-ce to the metabolism of albumin. Exp.Parasit., 11:39-49,1961.

44.VATTUONE, N. H.; SZARFMAN, A. & GON-ZALES-CAPPA, S. M. Antibody respon-se and immunoglobulin levels in humanswith acute or chronic Trypanosoma cruziinfections (Chagas'Disease). J. trop. Med.Hyg., 76: 45-7,1973.

45.WARREN, K. S. A comparison of Puerto Ri-can, Brazilian, Egyptian and Tanzanianstrains of Schistosoma mansoni in mice;penetration of cercariae, maturation ofschistosomes and production of liver disea-se. Trans. roy. trop. Med. Hyg., 61: 795-802, 1967.

46.WEICHSELBAUM, T. E. An accurate and ra-pid method for the determination of pro-tein in small amount of blood serum andplasma. Amer. J. clin. Path. Techn., 10:40-9,1946.

Recebido para publicação em 05/04/1983Reapresentado em 24/11 /1983Aprovado para publicação em 26/11/1983