Expresión de las isoformas de la cadena pesada de la

Expresión de las isoformas de la cadena pesada de la miosina en los músculos elevadores de la

mandíbula en Pan troglodytes

Neus Ciurana Maynegre

TESIS DOCTORAL

FACULTAD DE MEDICINA Y CIENCIAS DE LA SALUD

PROGRAMA DE DOCTORADO

MEDICINA

Expresión de las isoformas de la cadena pesada de la miosina en los músculos elevadores de la mandíbula en Pan troglodytes

Directores de tesis

Dr. Josep Mª Potau Ginés

Dra. Rosa Artells Prats

Neus Ciurana Maynegre

Barcelona, 2018

A Montse,

Agradecimientos

Recuerdo perfectamente el primer día en la Facultad de Medicina. Todos los

alumnos estábamos en el aula magna y el Decano nos comentó que allí no sólo se

formaban médicos, sino que también existía la opción de realizar un doctorado y

dedicarse a la investigación. En aquel momento pensé que yo nunca haría un doctorado.

Con la licenciatura y el MIR era suficiente. Me equivoqué. Me equivoqué como otras

tantas veces, pero por suerte siempre he tenido personas a mi lado que me han ayudado,

empezando por mi familia. Quiero dar las gracias a mis padres, a mi abuela, a mi

hermano y a mi pareja por su apoyo incondicional y por su ayuda, tanto en los buenos

como en los malos momentos.

Quiero agradecer a todos los compañeros y compañeras de la Unidad de

Anatomía y Embriología Humanas, Anna, Carme, Joan, Marc, Sandra y Ruth, por

haberme dedicado horas de su tiempo a enseñarme todo lo necesario para trabajar en un

laboratorio. Sin vuestra colaboración hubiera sido mucho más complicado aprender a

realizar RT-qPCR, geles de agarosa, geles de poliacrilamida, extracción de proteínas y

un largo etcétera de técnicas y procedimientos.

También agradecer al Dr. Navarro sus consejos y su ayuda, siempre que me he

encontrado en un callejón sin salida. Sin su orientación la realización de la tesis hubiera

sido más difícil.

Por último, un agradecimiento muy especial a mis directores de tesis, la Dra.

Artells y el Dr. Potau. En primer lugar, a la Dra. Artells por su apoyo y todos sus

comentarios que han ayudado a mejorar el trabajo realizado. En segundo lugar, al Dr.

Potau por su dedicación, paciencia y sinceridad entre muchas otras cosas. Han sido

muchos años con momentos compartidos, disecciones, charlas, comidas..., incluso

salidas en bicicleta. Gracias por tratarme como una más de tu familia. Sabes que sin ti

nunca hubiera hecho un doctorado.

Abreviaturas

AA Aminoácido

Ac Anticuerpo

ADP Adenosín difosfato

ADN Ácido desoxirribonucleico

ADNc Ácido desoxirribonucleico complementario

ARN Ácido ribonucleico

ARNm Ácido ribonucleico mensajero

ARNnp Ácido ribonucleico nuclear pequeño

ARNr Ácido ribonucleico ribosómico

ARNt Ácido ribonucleico de transferencia

ASTF Área de sección transversal fisiológica

ATP Adenosín trifosfato

BSA Bovine serum albumine

DTT Dithiothreitol

dNTP Deoxyribose nucleoside triphosphate

DE Desviación estándar

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

kDa Kilodalton

MHC Myosin heavy chain

MLC Myosin light chain

RNasa Ribonucleasa

RT-qPCR Real time quantitative polymerase chain reaction

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TEMED Tetrametiletilendiamina

9

Índice

1. Introducción ............................................................................................................ 13

1.1. Filogenia de los primates ................................................................................. 13

1.2. Evolución del aparato masticador .................................................................... 18

1.3. Anatomía de los músculos masticadores ......................................................... 20

1.3.1. Morfología externa ................................................................................... 20

1.3.2. Morfología interna .................................................................................... 23

1.4. Características electromiográficas de los músculos masticadores ................... 28

1.5. Características moleculares de los músculos masticadores ............................. 31

1.5.1. Isoformas de la MHC ............................................................................... 31

1.5.2. Métodos de análisis .................................................................................. 36

1.5.3. Composición y distribución de los diferentes tipos de fibras ................... 40

1.6. Expresión genética ........................................................................................... 45

1.6.1. RT-qPCR .................................................................................................. 47

2. Hipótesis y objetivos ................................................................................................ 51

2.1. Hipótesis .......................................................................................................... 51

2.2. Objetivos .......................................................................................................... 52

3. Artículos ................................................................................................................... 57

3.1. Artículo primero: “Expression of MyHC isoforms mRNA transcripts in

different regions of the masseter and medial pterygoid muscles in chimpanzees” .... 57

3.2. Artículo segundo: “Expression of myosin heavy chain isoforms mRNA

transcripts in the temporalis muscle of common chimpanzees (Pan troglodytes) ...... 67

4. Discusión .................................................................................................................. 79

5. Conclusiones ............................................................................................................. 87

6. Anexos ...................................................................................................................... 91

6.1. Anexo 1: peso muscular y porcentajes de expresión del ARNm en Pan

troglodytes .................................................................................................................. 91

10

6.2. Anexo 2: protocolo de la RT-qPCR ................................................................. 92

6.2.1. Extracción del ARN mediante el protocolo TriPure de Roche ................ 92

6.2.2. Síntesis del ADNc .................................................................................... 93

6.2.3. RT-qPCR .................................................................................................. 94

6.3. Anexo 3: resultados no publicados .................................................................. 95

6.4. Anexo 4: objetivos de futuro ......................................................................... 100

6.4.1. Extracción y cuantificación de proteínas ................................................ 101

6.4.2. Electroforesis en gel de poliacrilamida .................................................. 102

7. Bibliografía............................................................................................................ 111

Introducción

13

1. Introducción

1.1. Filogenia de los primates

Los primates han evolucionado de un ancestro común que los estudios

moleculares sitúan en el período Cretácico, hace 85 millones de años (Perelman et al.,

2011). Posteriormente, durante el Eoceno temprano aparecieron los euprimates1, hace

unos 55 millones de años, y tuvo lugar su gran expansión por el mundo que dio lugar a

una gran variedad de especies (Martin, 1990; Ni et al., 2004; Stringer & Andrews,

2005). Actualmente hay unas 400 especies que conforman el orden de los primates

(Groves, 2005; Fleagle, 2013), que se divide en dos subórdenes (Strepsirrhini y

Haplorrhini) (Figura 1).

Figura 1. Árbol filogenético del orden de los primates.

Los Strepsirrhini incluyen a todos los prosimios, excepto a los társidos, y se

dividen en dos superfamilias, la Lemuroidea (lémures) y la Lorisoidea (loris y gálagos)

1 Primates con aspecto moderno

14

(Goodman et al., 1990) (Figura 2). Estos primates presentan un tamaño cerebral

pequeño en relación al tamaño corporal, un hocico puntiagudo y rinario, una

almohadilla de piel húmeda y desprovista de pelo situada alrededor de la nariz con una

función olfativa (Ankel-Simons, 2010). Hoy en día, los lémures se localizan en

Madagascar y constan de varios géneros, entre ellos el género Microcebus que es el

primate vivo más pequeño, con un peso de 30 a 60 gr (Campbell et al., 2007; Ankel-

Simons, 2010). Los loris viven en África y en el sudeste asiático, mientras que los

gálagos viven en África (Campbell et al., 2007; Swindler, 1998). En general, los

Strepsirrhini se alimentan de insectos, caracoles, frutas y, en algunos casos, de lagartos

y resina de los árboles (Campbell et al., 2007; Swindler, 1998).

Figura 2. a) Fotografía de un lémur de la especie Propithecus verreauxi. b) Fotografía de un loris del género Nycticebus (Imágenes realizadas por Michael Melford y Frans Lanting

publicadas en The Guardian).

Los Haplorrhini se subdividen en el infraorden Tarsiiformes (társidos) y el

infraorden Simiiformes (o Anthropoidea). En general, los társidos presentan las mismas

características que los otros prosimios (Martin, 1990), pero carecen de rinario (Figura

3). Estos primates se localizan en el sudeste asiático y son básicamente insectívoros

(Ankel-Simons, 2010; Swindler, 1998). El infraorden Anthropoidea se diferencia de los

prosimios por presentar un tamaño cerebral mayor, por tener un menor número de

a) b)

15

dientes y por la presencia de un tabique postorbital (Campbell et al., 2007). Los

primates Anthropoidea se clasifican en el parvorden Platyrrhini (New World monkeys)

y el parvorden Catarrhini, que se divide a su vez en dos superfamilias, la

Cercopithecoidea (Old World monkeys) y la Hominoidea (Perelman et al., 2011)

(Figura 1).

Figura 3. Fotografía de Tarsius tumpara (Imagen realizada por Geoff Deehan, publicada en The Guardian).

Los Platyrrhini se diferencian de los Catarrhini por presentar algunas

características primitivas, como tener tres premolares superiores e inferiores, pero sobre

todo por la forma de la nariz que es más ancha y plana (Ankel-Simons, 2010; Swindler,

1998) (Figura 4). Estos primates son relativamente pequeños, con un peso corporal de

100 gr (Cebuella) a 7-10 kg (Atelines), y viven en bosques de centroamérica,

sudamérica y México (Campbell et al., 2007; Swindler, 1998). En general, habitan en

los árboles y su dieta consta principalmente de frutas, insectos y raíces (Campbell et al.,

2007). La superfamilia Cercopithecoidea es la más abundante y diversa, incluyendo a

más de 100 especies de primates que viven en bosques tropicales y en las sabanas

africana y asiática, tanto en el hábitat terrestre como en el arbóreo (Lewin, 2000;

Campbell et al., 2007). Presentan una dieta rica en fruta, hojas y raíces y,

16

ocasionalmente, algunas especies también se alimentan de resina de los árboles e

insectos (Cachel, 1979).

Figura 4. Diferencias anatómicas de la región nasal entre un primate platirrino (a) y un primate catarrino (b) (Imagen adaptada de Primates, John P. Rafferty, 2011).

La superfamilia Hominoidea se diferencia de los otros primates, entre otras

cosas, por presentar un gran desarrollo encefálico, una región nasal ancha y una cola

muy reducida o ausente (Fleagle, 2013). Se divide en dos familias, la Hylobatidae y la

Hominidae (Stringer & Andrews, 2005). La familia Hylobatidae está formada por los

gibones que habitan únicamente en el medio arbóreo y presentan algunas características

ancestrales que comparten con los cercopitécidos, como por ejemplo, los caninos en

forma de daga (Stringer & Andrews, 2005; Campbell et al., 2007). Los gibones son los

Hominoidea más pequeños, tienen un peso corporal de 5 a 15 kg y viven en los bosques

tropicales del sudeste asiático (Fleagle, 2013). Estos simios son frugívoros, pero algunas

especies también se alimentan de raíces y de invertebrados como las termitas (Swindler,

1998; Fleagle, 2013) (Figura 5). La familia Hominidae comprende a los grandes simios

(“great apes”) que son principalmente arbóreos, pero que habitan en el hábito terrestre

en diferentes grados. Incluyen los orangutanes (género Pongo), los gorilas (género

Gorilla), los chimpancés (género Pan) y los humanos (género Homo) (Figura 6).

a) b)

17

Figura 5. Imagen de un gibón de la especie Hoolock tianxing (Imagen realizada por Fan Pengfei y publicada en The Guardian).

Figura 6. Imágenes de un orangután (a), de un gorila (b) y de un chimpancé común (c) (Imágenes realizadas por Ian Sample y Alexandra Rosati y publicadas en The Guardian).

Los orangutanes están representados actualmente por dos especies que viven en

las islas Borneo (Pongo pygmaeus) y Sumatra (Pongo abelii) y su peso varía entre 39

kg en las hembras y hasta 80 kg en los machos (Campbell et al., 2007; Swindler, 1998).

El principal componente de la dieta de los orangutanes es la fruta madura, pero también

pueden comer raíces y, en algunos casos, termitas (Taylor, 2006). Los gorilas también

están representados por dos especies (Gorilla gorilla y Gorilla beringei) y se localizan

en África central, presentando como los orangutanes, un marcado dimorfismo sexual. El

peso corporal máximo de las hembras es de 90 kg y el de los machos de hasta 200 kg

a) b) c)

18

(Fleagle, 2013). Los gorilas son principalmente vegetarianos y su dieta consta de una

elevada proporción de hojas, pudiendo añadir también hormigas y termitas (Campbell et

al., 2007). Los últimos grandes simios no humanos son los chimpancés que viven en

África occidental y se alimentan de grandes cantidades de fruta, pequeños invertebrados

y, ocasionalmente, raíces y semillas (Martin, 1990; Campbell et al., 2007; Swindler,

1998). Están representados por dos especies, los chimpancés comunes (Pan troglodytes)

y los bonobos (Pan paniscus) y se consideran los parientes más próximos a los

humanos, en la escala filética. Se calcula que esta divergencia tuvo lugar hace entre 5 y

7 millones de años (Schrago & Russo, 2003; Patterson et al., 2006).

1.2. Evolución del aparato masticador

A lo largo de la evolución de los primates se han sucedido modificaciones

morfológicas en el aparato masticador que se relacionan con el tipo de dieta, estilo de

vida y hábitos alimentarios (Cachel, 1979; Hoh, 2002; Taylor & Vinyard, 2004; Stringer

& Andrews, 2005; Lieberman, 2011). Así, los Strepsirrhini y los társidos presentan una

mandíbula primitiva, con forma de V y con falta de fusión de sus dos mitades a nivel de

la línea media, lo que permite un cierto grado de movilidad durante la masticación

(Lieberman, 2011). Estos prosimios se caracterizan por presentar unos dientes

puntiagudos, con un incisivo medial inclinado hacia delante (excepto en los társidos),

que realizan una función prensil. Estas adaptaciones son idóneas para capturar y matar

insectos, pero también para excavar agujeros en la corteza de los árboles con el objetivo

de obtener resina (Martin, 1990; Stringer & Andrews, 2005; Rosenberger, 2010) (Figura

7).

19

Figura 7. Mandíbula de Galago senegalensis (prosimio).

Los primates antropoideos presentan una mandíbula con forma de U, excepto

algunos Platyrrhini, con sus dos mitades fusionadas a nivel de la línea media

(Lieberman, 2011). La fusión de la mandíbula se relaciona con la capacidad de resistir

una mayor fuerza transversal, generada durante la masticación debido a la acción del

músculo masetero profundo y permite una coordinación más efectiva de los músculos

masticadores (Hylander, 1979; Hylander et al., 2000; Vinyard et al., 2006). Otras

diferencias existentes entre antropoides y prosimios son los incisivos con forma de

espátula, adaptados para cortar el alimento, y la mayor área de superficie de los molares

para aumentar la eficacia del molido (Martin, 1990; Stringer & Andrews, 2005). En los

primates hominoideos, la principal diferencia respecto al aparato masticador se

encuentra entre los humanos y el resto de los grandes simios. Los grandes simios no

humanos ingieren alimentos mecánicamente resistentes que requieren una mayor fuerza

oclusiva y un mayor número de ciclos masticatorios. Por ejemplo, los chimpancés

comunes dedican aproximadamente la mitad del día a la masticación (Lieberman,

2011). En cambio, los humanos presentan un aparato masticador más grácil que genera

una menor fuerza oclusiva en comparación con la de los grandes simios. Estas

diferencias funcionales están relacionadas con las características anatómicas del aparato

20

masticador y con los tipos de fibras que presentan los músculos masticadores

(Lieberman, 2011) (Figura 8).

Figura 8. Mandíbula de un chimpanzé común (a) y de un humano (b).

1.3. Anatomía de los músculos masticadores

Los músculos que actúan sobre la mandíbula se subdividen en dos grupos, los

músculos cuya contracción provoca el descenso de la mandíbula (“jaw-open muscles”)

y los músculos cuya contracción eleva la mandíbula (“jaw-close musles”) (Van Eijden

et al., 1997). Los músculos elevadores de la mandíbula son el masetero, el pterigoideo

medial y el temporal. Estos músculos son los responsables de generar la fuerza oclusiva

y los movimientos de la mandíbula asociados a la masticación y a la mordedura (Taylor

& Vinyard, 2013).

1.3.1. Morfología externa

El masetero es un músculo multipeniforme que está constituido por dos

porciones, la superficial y la profunda (Williams & Warwick, 1980; Lieberman, 2011).

La porción superficial se origina en el arco zigomático y sus fibras se dirigen en sentido

posteroinferior para insertarse en el ángulo de la mandíbula. La porción profunda se

origina en el tercio posterior del arco zigomático y se inserta en la rama de la

a) b)

21

mandíbula, presentado sus fibras una orientación prácticamente vertical (Figura 9). En

los primates no humanos estas dos porciones se pueden separar fácilmente gracias a la

presencia de una lámina aponeurótica entre ellas (Aiello & Dean, 1990).

Figura 9. Imágenes de la porción superficial (a) y profunda (b) del músculo masetero en Pan troglodytes y Homo sapiens (Imágenes cedidas por JM Potau).

El músculo pterigoideo medial se origina en la fosa pterigoidea del esfenoides y

se inserta en la cara interna de la rama y del ángulo de la mandíbula (Williams &

Warwick, 1980) (Figura 10). La orientación de sus fibras es oblicua, similar a la

orientación de las fibras de la porción superficial del masetero y, al igual que éste, se

trata de un músculo multipeniforme (Aiello & Dean, 1990).

a)

b)

22

Figura 10. Imágenes del músculo pterigoideo medial en Pan troglodytes (a) y Homo sapiens (b)

(Imágenes cedidas por JM Potau).

Finalmente, el temporal es un músculo bipeniforme que se origina en la fosa

temporal del cráneo y en la fascia temporal, insertándose en la apófisis coronoides de la

mandíbula y en el borde anterior de la rama mandibular (Aiello & Dean, 1990) (Figura

11). En Pan troglodytes y en los primates no humanos, el músculo temporal está

dividido por un tendón intramuscular en una porción superficial y una porción profunda

(Ross, 1995; Oxnard & Franklin, 2008). En los humanos, la porción superficial es

prácticamente inexistente o está representada por una fina capa muscular con un

impacto funcional mínimo, mientras que la porción profunda constituye la porción

principal del músculo temporal (Oxnard & Franklin, 2008; Lee et al., 2012). La porción

más profunda del temporal ha sido diferenciada por Dunn et al. (1996) con el nombre de

músculo esfenomandibular, que se extiende desde la superficie infratemporal del ala

mayor del esfenoides a la cresta temporal de la mandíbula. Sin embargo, estudios

posteriores consideran el músculo esfenomandibular como una parte del músculo

temporal y no como un músculo independiente, debido a la falta de una inervación

propia y a la ausencia de tejido fascial que delimite los dos vientres musculares (Türp et

al., 1997; Akita et al., 2000; Schön-Ybarra & Bauer, 2001; Skinner & Aziz, 2003; Geers

et al., 2005).

a) b)

23

Figura 11. Imágenes de la porción superficial, profunda y esfenomandibular del músculo temporal en Pan troglodytes (a) y del músculo temporal y su porción esfenomandibular en Homo sapiens (b)

(Imágenes cedidas por JM Potau).

1.3.2. Morfología interna

Las características funcionales de un músculo se relacionan con su morfología

interna, esto es, con el modo en que están organizadas las fibras musculares dentro del

mismo músculo (Vinyard & Taylor, 2010). Las fibras musculares son células

multinucleadas, que presentan una membrana celular o sarcolema y un citoplasma o

sarcoplasma. La mayor parte del sarcoplasma está ocupado por miofibrillas dispuestas

de forma paralela a la longitud de la fibra muscular. Las miofibrillas están constituidas

por una sucesión de sarcómeros, que corresponden a las unidades funcionales de los

músculos (Alberts et al., 2013). Los sarcómeros están formados por dos proteínas

contráctiles denominadas actina y miosina, que constituyen los filamentos delgados y

a)

b)

24

gruesos del sarcómero, respectivamente (Schiaffino & Reggiani, 2011). La miosina, a

su vez, está compuesta por cuatro cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, presentando

estas últimas una cabeza que contiene la enzima ATPasa, encargada de proporcionar la

energía para la contracción muscular (Korfage et al., 2005a) (Figura 12).

Figura 12. Esquema que muestra el nivel de organización dentro de la fibra muscular, desde la miofibrilla hasta la miosina, que está compuesta por dos cadenas pesadas (MHC) y cuatro ligeras (MLC)

(Imagen adaptada de Korfage et al., 2005a).

La contracción muscular se debe al deslizamiento de los filamentos de actina

respecto a los filamentos de miosina y el grado de interacción entre estos dos filamentos

determina la tensión que un músculo puede generar. Según la teoría de los filamentos

deslizantes, a medida que el sarcómero disminuye su longitud aumenta el grado de

25

solapamiento entre la actina y la miosina hasta llegar al punto óptimo de interacción,

donde la fuerza muscular generada es máxima. A partir de este punto, si el sarcómero

continúa disminuyendo su longitud, también disminuye la tensión muscular generada

(Sciote & Morris, 2000) (Figura 13).

Figura 13. Relación entre la tensión y la longitud del sarcómero (Imagen adaptada de Sciote & Morris, 2000).

La suma de las tensiones generadas por todos los sarcómeros resulta en la fuerza

generada por todo el músculo. Dependiendo de la organización de las fibras musculares

dentro del músculo, éste es propicio para la generación de una elevada fuerza muscular

o para la generación de una rápida velocidad de contracción (Van Eijden et al., 1997).

Así, los músculos con fibras oblicuas (unipeniformes, bipeniformes y multipeniformes)

son óptimos para la generación de una fuerza muscular elevada. En estos músculos, las

fibras se sitúan formando un ángulo en relación al eje de acción del músculo (ángulo de

penación). Esta disposición permite agrupar a un mayor número de fibras por unidad de

área de sección y, por lo tanto, agrupa a un mayor número de sarcómeros en paralelo,

que ejercen una fuerza muscular mayor (Van Eijden et al., 1997). El área de sección

transerval fisiológica (ASTF) es un parámetro que se relaciona con el número de

Longitud sarcómero (µm)

Ten

sión

rel

ativ

a

26

sarcómeros en paralelo que presenta un músculo y, por lo tanto, se relaciona

directamente con la fuerza muscular que puede desarrollar dicho músculo (Van Eijden

et al., 1997). El ASTF se calcula mediante la seguiente fórmula:

Masa muscular (gr) x cos Ø

ASTF (cm2) =

Longitud fibra muscular x 1.0564 (gr/cm3)

Donde Ø es el ángulo de penación de las fibras musculares y 1.0564 (gm/cm3)

es la densidad del músculo esquelético (Méndez, 1960; Taylor & Vinyard, 2013). Con

esta fórmula se deduce que el ASTF está directamente relacionada con la masa

muscular e inversamente relacionada con la longitud de las fibras musculares (Powell et

al., 1984; Taylor & Vinyard, 2004). Por otro lado, los músculos con fibras largas y

paralelas a su eje longitudinal son óptimos para generar una elevada velocidad de

contracción. Estas fibras presentan un mayor número de sarcómeros en serie cuyo

acortamiento es sumatorio, es decir, la contracción total de la fibra muscular equivale a

la suma de acortamientos de sus sarcómeros (Van Eijden et al., 1997). Por lo tanto, la

longitud de la fibra muscular es proporcional a la velocidad de contracción ya que las

fibras más largas presentan un mayor número de sarcómeros en serie y pueden producir

contracciones más rápidas (Sciote & Morris, 2000; Grünheid et al., 2009). En resumen,

un músculo adaptado a una elevada velocidad de contracción presenta una menor

capacidad de generar tensión muscular y viceversa (Lieber & Friden, 2000).

En Homo sapiens se han descrito diferencias intra e intermusculares en los

elevadores de la mandíbula en relación a la longitud de sus fibras, área de sección

transerval fisiológica y ángulo de penación (Van Eijden et al., 1997). En primer lugar,

se han observado diferencias entre las dos porciones del músculo masetero. La porción

27

superficial presenta una mayor ASTF (6.82 cm2), longitud de fibras (24.6 mm) y ángulo

de penación (16.5º) respecto a la porción profunda, que presenta una ASTF de 3.49 cm2,

una longitud de fibras de 18.0 mm y un ángulo de pennación de 6.7º (Van Eijden et al.,

1997). En segundo lugar, la región anterior del músculo temporal tiene una ASTF de 7.7

cm2 y una longitud de fibras de 27.1 mm, mientras que la región posterior presenta una

ASTF de 5.55 cm2 y una longitud de fibras de fibras de 25.7 mm (Van Eijden et al.,

1997). Finalmente, a nivel intermuscular, el temporal es el que presenta una mayor

ASTF y longitud de fibras entre los músculos elevadores de la mandíbula, mientras que

el pterigoideo medial es el músculo con una menor ASTF (6.0 cm2) y longitud de fibras

(12.9 mm) (Van Eijden et al., 1997).

También se han observado diferencias morfológicas internas en los músculos

masetero y temporal entre Homo sapiens y Pan troglodytes que se relacionan con sus

diferentes requerimientos funcionales (Taylor & Vinyard, 2013). El masetero

superficial y el temporal de Homo sapiens presentan, respectivamente, una ASTF de

4.96 cm2 y 10.39 cm2 (Taylor & Vinyard, 2013), valores muy parecidos a los

observados por otros autores (Van Eijden et al., 1997). En cambio, en Pan troglodytes

el ASTF del masetero superficial es de 16.78 cm2 y en el temporal de 19.95 cm2. Es

decir, Homo sapiens presenta una menor ASTF de los músculos elevadores de la

mandíbula en comparación con Pan troglodytes, pero la longitud de las fibras

musculares en relación a la longitud de la mandíbula es muy similar o superior en los

humanos. Así, en Homo sapiens la relación de la longitud de las fibras musculares con

la longitud de la mandíbula es de 0.248 para el músculo masetero superficial y de 0.282

para el temporal, mientras que en Pan troglodytes esta relación es de 0.168 para el

masetero superficial y de 0.334 para el temporal (Taylor & Vinyard, 2013). Estos

28

resultados sugieren una disminución de la fuerza máxima a expensas de una mayor

velocidad de contracción en Homo sapiens en comparación con Pan troglodytes.

1.4. Características electromiográficas de los músculos masticadores

Una forma de valorar si las diferencias estructurales de los músculos se traducen en

diferencias funcionales es mediante la electromiografía. Esta técnica permite registrar la

señal bioeléctrica generada durante la contracción muscular, cuantificarla y compararla

entre diferentes músculos, individuos o especies mediante el uso de electrodos

intramusculares o de superficie (Grünheid et al., 2009). Esto nos permite determinar

cuánto tiempo ha estado activo un músculo, cuando ha llegado al pico máximo de

actividad y el orden en el que se han activado los diferentes músculos involucrados en

una misma acción o conducta, como la masticación (Vinyard & Taylor, 2010). La

masticación presenta dos fases, la apertura y la clausura (Lieberman, 2011). A su vez, la

fase de clausura se divide en dos partes: una primera parte rápida que finaliza cuando

los dientes contactan con la comida y una segunda parte lenta en la que tiene lugar la

oclusión dentaria (“power stroke”), momento en el que se produce la rotura de los

alimentos (Wall et al., 2006; Ross & Iriarte-Diaz, 2014).

Los estudios electromiográficos realizados en humanos y otras especies de primates

antropoideos muestran una gran variabilidad en el reclutamiento de las fibras de los

músculos elevadores de la mandíbula y de sus partes. Esta variabilidad depende del

movimiento realizado, del punto de oclusión dentaria (o "power stroke") y de la dieta

(Cachel, 1979; Hylander et al., 1987; Wood, 1987; Schindler et al., 2007; Vinyard et al.,

2008). En primer lugar, según el movimiento realizado se han descrito diferencias

funcionales entre las dos porciones del músculo masetero y entre la región anterior,

29

posterior y esfenomandibular del músculo temporal (Zenker, 1955; Wood, 1986;

Hylander et al., 1987; Wood, 1987; Hylander & Johnson, 1994; Blanksma et al., 1997;

Hylander et al., 2005; Fuentes et al., 2012). En relación al músculo masetero, la porción

superficial actúa principalmente en los desplazamientos verticales de la mandíbula y

presenta una actividad sinérgica con el pterigoideo medial, mientras que la porción

profunda actúa en los movimientos laterales y de retrusión de la mandíbula (Wood,

1987; Hylander & Johnson, 1994; Blanksma et al., 1997). En primates antropoideos

como Papio anubis, Macaca fuscata y Aotus trivirgatus se ha observado que la porción

profunda del masetero llega al pico máximo de actividad antes que la porción

superficial (Hylander et al., 1987; Hylander & Johnson, 1994; Hylander et al., 2005).

Este modelo de actividad electromiográfico se relaciona con un desplazamiento lateral

de la mandíbula que ayuda a posicionar los molares justo antes de la oclusión dentaria

(Hylander et al., 1987; Hylander & Johnson, 1994; Vinyard et al., 2008; Ross & Iriarte-

Diaz, 2014). En los humanos se han descrito diferencias funcionales entre las regiones

anterior y posterior del masetero superficial y profundo (Blanksma et al., 1992;

Guzmán-Venegas et al., 2015). Estos estudios muestran que la región anterior del

masetero superficial tiene un mayor reclutamiento que la región posterior en acciones

submaximales, pero no en acciones de fuerza máxima donde presentan el mismo nivel

de actividad (Guzmán-Venegas et al., 2015). Por otro lado, la región anterior del

masetero profundo presenta una mayor actividad en las mordidas en dirección

anteromedial, mientras que la región posterior del masetero profundo actúa en las

mordidas en dirección posterolateral (Blanksma et al., 1992). En relación al músculo

temporal, la región anterior presenta un mayor reclutamiento de sus fibras en los

movimientos verticales de la mandíbula, mientras que la región posterior actúa

principalmente en los movimientos de retrusión (Cachel, 1979; Wood, 1987; Blankma

30

et al., 1997). De la porción esfenomandibular sólo se han realizados estudios

electromiográficos en humanos, en los que se ha observado que participa en los

movimientos laterales de la mandíbula, presentando una actividad sinérgica con el

músculo pterigoideo lateral, y en el mantenimiento de la postura y estabilización de la

mandíbula (Zenker, 1955; Wood, 1986; Fuentes et al., 2012).

En segundo lugar, la variación en el punto de oclusión dentaria provoca un cambio

en el sistema de palancas del aparato masticador que se traduce en variaciones en el

patrón de reclutamiento de los músculos masticadores (Vinyard et al., 2008). Así, en

Homo sapiens se ha observado una menor actividad electromiográfica de los músculos

masetero y temporal cuando el punto de mordida es anterior a la posición de

intercuspidación máxima2, siendo la porción anterior del temporal la que presenta un

mayor reclutamiento de sus fibras en comparación a la región posterior. En cambio, si el

punto de mordida es posterior a la posición de intercuspidación máxima el

reclutamiento de fibras es mayor en la región posterior del temporal en relación a la

región anterior (Ahlgren, 1986; Blanksma & Van Eijden, 1995; Schindler et al., 2007).

Finalmente, en tercer lugar, según el tipo de dieta, los estudios electromiográficos

realizados en el músculo masetero de Papio anubis, Macaca fuscata, Aotus trivirgatus y

Lemur catta muestran una gran variabilidad en el reclutamiento de las fibras de la

porción superficial en comparación con la porción profunda (Hylander et al., 2000;

Vinyard et al., 2006). De hecho, la porción profunda presenta prácticamente la misma

actividad electromiográfica en alimentos duros y blandos, mientras que la porción

superficial disminuye la actividad electromiográfica en alimentos blandos y la aumenta

2 Posición oclusal de la mandíbula en la que las cúspides de los dientes de ambos arcos se interponen

completamente.

31

en alimentos duros (Hylander et al., 2000; Vinyard et al., 2006). En relación al músculo

temporal, Wall et al. (2008) describen en Papio anubis un mayor reclutamiento de las

fibras del temporal superficial anterior en comparación con las fibras del temporal

profundo anterior en alimentos mecánicamente resistentes. Este modelo de

reclutamiento apoya la hipótesis de una fuerza oclusiva elevada (“high occlusal force

hypothesis”), según la cual las partes superficiales de los músculos masticadores son las

encargadas de generar la elevada fuerza muscular necesaria para procesar los alimentos

más resistentes.

1.5. Características moleculares de los músculos masticadores

1.5.1. Isoformas de la MHC

Otra forma de valorar la función de un músculo es analizando la expresión de las

isoformas de la cadena pesada de la miosina (MHC). La MHC es una proteína con

actividad ATPasa que determina la velocidad y la fuerza de contracción de la fibra

muscular (Bottinelli et al., 2006). En los mamíferos, las diferentes isoformas de la MHC

están codificadas por un grupo de genes localizados en los cromosomas 14, 17 y 7

(Tabla 1) (Schiaffino & Reggiani, 1996; Weiss & Leinwand, 1996; Weiss et al., 1999).

En el cromosoma 14 se localizan los genes MYH6 y MYH7 que codifican para las

isoformas cardíacas, la MHC-α cardíaca y la MHC-ß, respectivamente. La isoforma

MHC-α cardíaca se expresa en los atrios del corazón, mientras que la isoforma MHC-ß

se expresa en los ventrículos. Esta última isoforma también se expresa en el músculo

esquelético, donde se denomina MHC-I (Weiss & Leinwand, 1996).

32

Tabla 1. Cromosomas y genes de la MHC y la isoforma para la que codifican.

CROMOSOMA GEN MHC

17 MYH1 IIX

17 MYH2 IIA

17 MYH3 Embriónica

17 MYH4 IIB

14 MYH6 α-cardíaca

14 MYH7 Beta/I

17 MYH8 Neonatal

17 MYH13 Extraocular

7 MYH16 Masticadora

En el cromosoma 17 se localizan seis genes que codifican las isoformas MHC-

neonatal o MHC-fetal, MHC-embriónica, MHC-IIA, MHC-IIX, MHC-IIB y MHC-

extraocular (Weiss & Leinwand, 1996). Las isoformas MHC-neonatal y MHC-

embriónica están codificadas por los genes MYH8 y MYH3, respectivamente, y se

expresan durante el desarrollo fetal. Después del nacimiento, son reemplazadas de

forma progresiva por las isoformas MHC-I, MHC-IIA, MHC-IIX y MHC-IIB

(Schiaffino et al., 2015). Las isoformas MHC-I, MHC-IIA, MHC-IIX y MHC-IIB son

las más abundantes en el músculo esquelético de los mamíferos adultos (Pette & Staron,

2000). Estas isoformas difieren en la actividad ATPasa y en la velocidad de liberación

del ADP durante el ciclo de contracción, características que determinan la fuerza y la

velocidad de contracción de la fibra muscular (Bottinelli et al., 1996; Schiaffino &

Reggiani, 2011). El ciclo de contracción, o de puentes cruzados, se inicia con la unión

33

del ATP a la cabeza de la miosina, que se separa de la actina. La cabeza de la miosina

tiene actividad ATPasa e hidroliza el ATP en ADP y Pi, provocando la formación de un

puente cruzado entre la actina y la miosina. A continuación, se libera el Pi y se

desencadena el golpe de potencia que produce el desplazamiento de la actina en relación

a la miosina y genera la fuerza de contracción. Finalmente, se libera el ADP y la

miosina puede volver a unirse al ATP y a separarse de la actina (Schiaffino & Reggiani,

2011; Walklate et al., 2016) (Figura 14).

Figura 14. Representación del ciclo de contracción muscular.

Las isoformas de la MHC con mayor actividad ATPasa hidrolizan el ATP más

rápidamente y, por lo tanto, presentan una mayor potencia muscular3 (Walklate et al.,

2016). Por otro lado, las isoformas de la MHC con mayor velocidad de liberación del

ADP pueden iniciar el ciclo de interacción de la actina con la miosina con mayor

3 La potencia muscular es la energía liberada por unidad de tiempo.

34

rapidez, hecho que confiere a estas isoformas una mayor velocidad de acortamiento de

la fibra muscular y, por lo tanto, una mayor velocidad de contracción.

La isoforma MHC-I presenta una baja velocidad de liberación del ADP y una baja

actividad ATPasa, pero tiene un coste tensional bajo4 (Schiaffino & Reggiani, 2011).

Estas características hacen que la isoforma MHC-I sea apropiada para acciones

musculares prolongadas y de baja intensidad, como el mantenimiento de la postura. De

hecho, esta isoforma se expresa en fibras de oxidación lenta (o "slow-oxidative") que

obtienen el ATP necesario para la contracción por medio de la vía oxidativa (glucólisis

aeróbica) (Korfage et al., 2005a). Estas fibras presentan una elevada resistencia a la

fatiga y son las predominantes en los músculos tónicos y posturales (Schiaffino &

Reggiani, 2011).

Las isoformas MHC-II son más rápidas y potentes que la MHC-I, presentando una

velocidad de liberación del ADP y una actividad ATPasa que aumenta en el orden

MHC-IIA<MHC-IIX<MHC-IIB. La isoforma MHC-IIB, que es la isoforma con mayor

velocidad de contracción y potencia muscular de las tres, no se ha detectado en los

mamíferos de gran tamaño, incluido Homo sapiens (Pette & Staron, 2000). Esto se debe

a una disminución de la actividad transcripcional en la región promotora del gen MYH4

que permite la transcripción de parte del gen, pero no la traducción a proteína (Snow et

al., 1982; Horton et al., 2001; Harrison et al., 2011). La isoforma MHC-IIX presenta un

coste tensional elevado y se expresa en fibras con metabolismo glucolítico de

contracción rápida (o "fast-twitch glycolitic"). Estas fibras obtienen el ATP por medio

de la vía glucolítica (glucólisis anaeróbica) y presentan una baja resistencia a la fatiga

(Korfage et al., 2005a). Finalmente, la isoforma MHC-IIA presenta una actividad

ATPasa y una velocidad de liberación del ADP que se sitúa entre las isoformas MHC-I

4 El coste tensional equivale al consumo de ATP por unidad de tiempo.

35

y MHC-IIX. La isoforma MHC-IIA se expresa en fibras con metabolismo oxidativo

glucolítico de contracción rápida (o "fast-twitch oxidative glycolitic"), es decir, fibras

que obtienen el ATP necesario para la contracción de la vía oxidativa y también de la

vía glucolítica (glucólisis aeróbica y anaeróbica) y que presentan una resistencia a la

fatiga y un coste tensional moderados (Korfage et al., 2005a). Las fibras "fast-twitch

oxidative glycolitic" junto a las fibras "fast-twitch glycolitic" son el tipo de fibras más

abundantes en los músculos fásicos (Schiaffino & Reggiani, 2011).

La isoforma MHC-extraocular está codificada por el gen MYH13 y es específica de

los músculos extraoculares (Weiss et al., 1999). Esta isoforma presenta una elevada

velocidad de contracción y un bajo coste tensional que la hacen apropiada para los

requerimientos funcionales de los músculos extraoculares, los cuales presentan

movimientos sacádicos rápidos pero también movimientos lentos para poder centrar la

mirada en la retina y así enfocar los objetos (Briggs & Schachat, 2000; Sciote & Morris,

2000).

Finalmente, en el cromosoma 7 se localiza el gen MYH16 que codifica la isoforma

MHC-IIM (Desjardins et al., 2002). Esta isoforma se caracteriza por una elevada

actividad ATPasa, capaz de generar una elevada tensión muscular, y por una velocidad

de contracción que se sitúa entre las isoformas MHC-I y MHC-IIA (Hoh, 2002; Toniolo

et al., 2008). La isoforma MHC-IIM solamente se ha descrito en músculos derivados del

primer arco branquial de diferentes especies de mamíferos, incluidos los primates

(Rowlerson et al., 1983; Hoh, 2002). El gen de la isoforma MHC-IIM es el primero en

divergir durante el proceso evolutivo (Qin et al., 2002), hace aproximadamente 400

millones de años, dando a los animales unos músculos masticadores potentes, útiles

para la captura de presas y/o para procesar alimentos mecánicamente resistentes (Figura

15). En los humanos, el gen MYH16 se transcribe solamente a una porción inestable de

36

la cabeza de la miosina, de 76 kDa, debido a una mutación que provoca la aparición de

un codón de stop en la secuencia del ARNm (Stedman et al., 2004). Por lo tanto, en los

humanos el gen MYH16 se transforma en un pseudogen, capaz de transcribir una parte

de la secuencia del gen a ARNm pero sin capacidad para la expresión de la proteína,

hecho que se relaciona con la disminución del tamaño de las fibras de tipo II en los

músculos elevadores de la mandíbula en Homo sapiens (Stedman et al., 2004). Según

Perry et al. (2005), la inactivación del gen MYH16 tuvo lugar hace 5.7 millones de

años, coincidiendo con la divergencia de los géneros Homo y Pan.

GEN PROTEÍNA

MYH8 MHC-neonatal

MYH4 MHC-IIB

MYH1 MHC-IIX

MYH2 MHC-IIA

MYH3 MHC-embriónica

MYH13 MHC-extraocular

MYH6 MHC-α cardíaca

MYH7 MHC-β/I

MYH16 MHC-masticadora

Figura 15. Reconstrucción filogenética de la MHC.

1.5.2. Métodos de análisis

La variedad de isoformas de la MHC da un marco funcional muy amplio al músculo

esquelético. Para valorar estas características funcionales desde un punto de vista

molecular existen diferentes métodos histoquímicos, inmunohistoquímicos o por medio

de electroforesis en gel (SDS-PAGE).

37

Tinción ATPasa

Mediante este método las fibras musculares se clasifican en I, IIA, IIX y IIM

dependiendo de su actividad ATPasa en diferentes medios de pH (Brooke & Kaiser,

1970; Rowlerson et al., 1981). Las fibras de tipo I tienen una elevada actividad ATPasa

en pH ácido, mientras que las fibras de tipo II presentan una elevada actividad ATPasa

en pH básico. Para diferenciar los subtipos de fibras II, la muestra muscular se incuba

previamente en un tampón ácido (fibras IIX) o en un tampón básico (fibras IIA)

(Brooke & Kaiser, 1974; Sciote & Morris, 2000). Las fibras de tipo IIM presentan una

elevada actividad ATPasa en todos los rangos de pH (Rowlerson et al., 1981).

El inconveniente de la tinción ATPasa es que no puede diferenciar fibras puras, que

expresan una sola isoforma de la MHC, de las fibras híbridas, que expresan más de una

isoforma de la MHC (Pette & Staron, 2000). Tampoco puede diferenciar las isoformas

MHC-neonatal y MHC-α cardíaca (Korfage et al., 2005b).

Inmunohistoquímica

Esta técnica consiste en utilizar anticuerpos (Ac) específicos para cada isoforma

de la MHC. Los Ac más utilizados en humanos y primates no humanos se resumen en la

Tabla 2 y en la Tabla 3, respectivamente (Rowlerson et al., 1983; Rowlerson et al.,

1988; Sciote et al., 1994; Korfage & Van Eijden, 1999; Korfage et al., 2000; Wall et al.,

2013).

Uno de los inconvenientes de la inmunohistoquímica es la posibilidad de que un

Ac específico para una isoforma de la MHC reaccione con otra isoforma. Esto es debido

a que las isoformas de la MHC presentan una cadena de aminoácidos muy similar. Por

ejemplo, la isoforma MHC-IIA y la MHC-IIX tienen un 94.8% de aminoácidos

idénticos (Österlund et al., 2012). Otro inconveniente de este método es la dificultad

38

para diferenciar fibras híbridas. Las fibras híbridas pueden variar el contenido de las

diferentes isoformas de la MHC a lo largo de la fibra muscular (Korfage et al., 2016;

Zhang & Gould, 2017). Esto favorece que solamente se observe el Ac de la isoforma de

la MHC con mayor proporción y se subestimen las otras isoformas que componen la

fibra muscular. Por ejemplo, el Ac 332-3D4, utilizado en humanos, no puede diferenciar

fibras de tipo IIA de fibras híbridas que co-expresan las isoformas MHC-IIA y MHC-

IIX (Korfage & Van Eijden, 1999; Korfage & Van Eijden, 2003).

Tabla 2. Anticuerpos más utilizados en los músculos masticadores de Homo sapiens (Sciote et al., 1994; Korfage & Van Eijden, 1999; Korfage et al., 2000).

Anticuerpo MHC

I IIA IIB IIX α neo IIM

219-1D1 + - - - - - -

249-5A4 - - - - + - -

333-7H1 - + - - - - -

340-3B5 - + + + - - -

332-3D4 - + - + - - -

Antifetal - - - - - + -

Anti-IIM - - - - - - +

MY-32 - + - + - + -

39

Tabla 3. Anticuerpos más utilizados en los músculos masticadores de primates no humanos (Rowlerson et al., 1983; Rowlerson et al., 1988; Wall et al., 2013).

Anticuerpo MHC

I IIA IIB IIX α Emb IIM

Anti-I + - - - - - -

Anti-IIA - + - - - - -

Anti-IIM - - - - - - +

Anti-emb - - - - - + -

Anti-IIB - + + - - - -

NOQ7.5.4D + - - - - - -

MY32 - + - + - - +*

* no reacciona a la MHC-IIM en algunos primates del Nuevo Mundo.

SDS-PAGE

Se llama SDS-PAGE a la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil

sulfato sódico. La electroforesis en gel permite separar las proteínas aplicando un

campo eléctrico. Las proteínas se cargan en una membrana, en este caso de

poliacrilamida, por la que se desplazan en dirección al electrodo con carga opuesta a

una velocidad que depende del tamaño y de la forma de la proteína (Alberts et al.,

2013). Es decir, este método nos permite separar las proteínas de diferente tamaño

molecular y diferente forma. En el caso de las isoformas de la MHC, donde tenemos un

tamaño y una forma prácticamente idénticos, se requiere un gel especial, diseñado por

Talmadge & Roy (1993), que permite separar proteínas con un peso molecular de 1-2

kDa de diferencia. Posteriormente, este protocolo ha sido modificado para mejorar la

40

resolución de las bandas y disminuir el tiempo requerido para realizar la técnica

(Bamman et al., 1999; Roberts et al., 2012).

Uno de los inconvenientes del SDS-PAGE es la imposibilidad de detectar

isoformas de la MHC con una baja proporción o que co-emigran con otra banda de la

MHC (Korfage & Van Eijden, 2003).

1.5.3. Composición y distribución de los diferentes tipos de fibras

Los músculos elevadores de la mandíbula presentan una composición y

distribución muy heterogenia de los diferentes tipos de fibras, tanto en los humanos

como en el resto de primates (Ringqvist, 1974; Maxwell et al., 1979; Vignon et al.,

1980; Eriksson & Thornell, 1983; Rowlerson et al., 1983; Miller & Farias, 1988;

Shaughnessy et al., 1989; Sciote et al., 1994; Korfage & Van Eijden, 1999; Korfage et

al., 2000; Andreo et al., 2002; Wall et al., 2013).

Primates no humanos

En uno de los primeros estudios realizados en primates no humanos, concretamente

en Macaca mulatta, se observaron diferencias en la distribución de las fibras I y II entre

las regiones anterior y posterior de los músculos masetero superficial y temporal

mediante la tinción por ATPasa (Maxwell et al., 1979). Según este estudio, la región

anterior de los dos músculos presenta una mayor proporción de fibras I y una menor

proporción de fibras II que la región posterior. Concretamente, la región anterior del

masetero superficial presenta un 78.93-92.14% de fibras I y un 7.29-21.08% de fibras

II, mientras que la porción posterior del masetero superficial presenta un 27.50-40.14%

de fibras I y un 60-74.25% de fibras II. En relación al músculo temporal, las fibras de

tipo I representan entre el 20.65-49.95% en la región anterior y entre el 9.43-9.92% en

la región posterior, siendo el resto fibras de tipo II. El inconveniente de este estudio es

41

que clasifica a las fibras con una intensidad de tinción intermedia como fibras de tipo I,

hecho que puede sobreestimar la proporción de estas fibras. Posteriormente, Rowlerson

et al. (1983) realizaron un estudio donde se analizaba la composición de los músculos

elevadores de la mandíbula en diferentes especies de primates mediante tinción ATPasa

y tinción indirecta de inmunoperoxidasa (Tabla 4).

Tabla 4. Primates estudiados por Rowlerson et al. (1983).

Parvorden Especie Músculo analizado

Platyrrhini Callithrix penicillata Masetero y temporal

Saimiri sciureus Masetero, temporal y pterigoideo medial

Catarrhini Cercopithecus sp. Masetero y temporal

Macaca fascicularis Masetero, temporal y pterigoideo medial

Macaca irus Masetero y temporal

Pan troglodytes Masetero

En todos los primates estudiados se observaron dos características comunes. La

primera es que las fibras de tipo IIM son las más abundantes en los músculos elevadores

de la mandíbula siendo el resto fibras de tipo I y, en algunos casos, de tipo IIC

(equivalentes a fibras que expresan las isoformas MHC-I y MHC-IIA). Así, en el

masetero de Pan troglodytes las fibras de tipo IIM representan entre un 43-69% y las

fibras de tipo I entre un 31-57% (Rowlerson et al., 1983). La segunda característica es el

aumento gradual de fibras de tipo I a medida que profundizamos en el músculo, en

decremento de las fibras IIM (Rowlerson et al., 1983; Rowlerson et al., 1988).

42

Otros estudios han valorado si existen o no diferencias intramusculares en la

composición y distribución de los diferentes tipos de fibras en los músculos masetero y

temporal (Miller & Farias, 1988; Andreo et al., 2002; Wall et al., 2013). En un estudio

realizado en Cebus apella por medio de la tinción ATPasa no se describen diferencias

entre la región anterior y la posterior de los músculos temporal superficial y masetero

superficial (Andreo et al., 2002). En cambio, en otro estudio realizado en Macaca

mulatta (“rhesus monkey”), con el mismo método, se observó que la región anterior del

temporal superficial presentaba una mayor proporción de fibras de tipo I (13.1%) que la

región posterior del temporal, tanto en el temporal superficial (6.6%) como en el

temporal profundo (9.5%) (Miller & Farias, 1988). En este mismo estudio, la región

posterior del temporal profundo presentaba un mayor porcentaje de fibras I (9.5%) y IIA

(42.6%) que la región posterior del temporal superficial (6.6% de fibras tipo I y 34.9%

de fibras tipo IIA), pero no se observaron diferencias entre la región anterior del

temporal superficial y la región anterior del temporal profundo (Miller & Farias, 1988).

Estas diferencias sí que fueron descritas por Wall et al. (2013) en Papio anubis por

medio de inmunohistoquímica y SDS-PAGE. Según Wall et al. (2013) el temporal

superficial presenta una mayor proporción de fibras IIM (87.0-88.7%) que la región

anterior del temporal profundo (14.4-60.7%), donde hay una mayor presencia de fibras I

(38.1-83.3%) y algunas fibras de tipo IIA (<5%). El amplio rango del porcentaje de las

fibras IIM y I en la región anterior del temporal profundo se debe al dimorfismo sexual,

presentando las hembras una mayor proporción de fibras I (83.3%) y los machos una

mayor proporción de fibras IIM (60.7%) (Wall et al., 2013).

Homo sapiens

Los músculos elevadores de la mandíbula en Homo sapiens se han analizado por

medio de métodos histoquímicos, inmunohistoquímicos y mediante SDS-PAGE

43

(Ringqvist, 1974; Vignon et al., 1980; Eriksson & Thornell, 1983; Sciote et al., 1994;

Korfage & Van Eijden, 1999; Korfage et al., 2000). Estos músculos muestran

proporciones variables de fibras I, IIA, IIX y fibras híbridas, pero en ningún caso se

describe la presencia de fibras de tipo IIM (Sciote et al., 1994; Korfage & Van Eijden,

1999; Korfage et al., 2000). A diferencia de los músculos de las extremidades, las fibras

híbridas de los músculos elevadores de la mandíbula pueden presentar las isoformas

MHC-α cardíaca y MHC-fetal (Butler-Browne et al., 1988; Bredman et al., 1991; Sciote

et al., 1994; Korfage & Van Eijden, 1999; Weiss et al., 1999). Se cree que la presencia

de las isoformas MHC-α cardíaca y MHC-fetal proporciona un mayor rango funcional a

los músculos elevadores de la mandíbula para así poder optimizar al máximo la fuerza y

la velocidad de contracción en cada acción realizada, ya que las características

contráctiles de las fibras híbridas se sitúan entre las isoformas que co-expresan (Korfage

et al., 2005b). Otra diferencia en relación a los músculos de las extremidades es que las

fibras de tipo I de los músculos elevadores de la mandíbula presentan un diámetro

mayor que las fibras de tipo II (Sciote et al., 2003).

Existe una gran variabilidad en las proporciones de las fibras I, IIA, IIX e

híbridas en los músculos elevadores de la mandíbula en los humanos (Ringqvist, 1974;

Vignon et al., 1980; Eriksson & Thornell, 1983; Shaughnessy et al., 1989; Korfage &

Van Eijden, 1999; Korfage et al., 2000). En general, las fibras puras más frecuentes son

las de tipo I seguidas por proporciones variables de fibras de tipo IIA y IIX. Por otro

lado, las fibras híbridas representan aproximadamente el 40% del total de las fibras,

siendo el tipo de fibra híbrida más habitual la que contiene las isoformas MHC-α

cardíaca + MHC-I + MHC-IIA (Korfage et al., 2000; Korfage et al., 2005b).

Los diferentes estudios realizados por tinción ATPasa muestran unos rangos

muy amplios en las proporciones de las diferentes fibras en los músculos masetero,

44

pterigoideo medial y temporal (Ringqvist, 1974; Vignon et al., 1980; Eriksson &

Thornell, 1983; Shaughnessy et al., 1989). Así, en el músculo masetero la proporción de

fibras de tipo I se sitúa entre el 28.6% y el 62.5%, en el pterigoideo medial entre el 37%

y el 54% y en el temporal entre el 30.9% y el 53.4% (Ringqvist, 1974; Vignon et al.,

1980; Eriksson & Thornell, 1983; Shaughnessy et al., 1989). Estos rangos tan amplios

pueden ser debidos al diferente criterio a la hora de clasificar las fibras híbridas en

fibras de tipo I o fibras de tipo II (apartado 1.5.2.). Otro dato a tener en cuenta es la edad

de los sujetos estudiados. Se ha observado que con el envejecimiento hay una

disminución de fibras de tipo I y un aumento de fibras de tipo II e híbridas en los

músculos elevadores de la mandíbula (Monemi et al., 1999). De hecho, coincide que los

estudios por tinción ATPasa, con menor proporción de fibras tipo I, utilizan muestras

musculares de sujetos con una edad más avanzada que los estudios con mayor

proporción de fibras tipo I, que utilizan sujetos más jóvenes (Ringqvist, 1974; Vignon et

al., 1980; Eriksson & Thornell, 1983; Shaughnessy et al., 1989).

Los estudios inmunohistoquímicos, a diferencia de la tinción por ATPasa,

permiten identificar las diferentes isoformas de la MHC mediante el uso de anticuerpos

específicos. Estos estudios muestran que la isoforma más frecuente en los músculos

elevadores de la mandíbula es la MHC-I, que se expresa en el 70% de las fibras, seguida

de la isoforma MHC-IIA, que se expresa en el 30% de las fibras (Korfage et al., 2000;

Korfage et al., 2005b). Estas dos isoformas de la MHC, junto a la isoforma MHC-IIX,

se pueden expresar en fibras puras o híbridas. En el músculo masetero, las fibras puras

que expresan la isoforma MHC-I representan un 35% de todas las fibras, las fibras puras

que expresan la isoforma MHC-IIA un 8.3% y las fibras puras para la isoforma MHC-

IIX un 14.4%, siendo el 42.4% restante fibras híbridas (Korfage et al., 2000). Entre las

dos porciones del masetero, la superficial presenta una menor proporción de fibras puras

45

que expresan la isoforma MHC-I que la porción profunda (26.8% vs. 47.8%) (Korfage

et al., 2000). En el músculo pterigoideo medial se han descrito unos porcentajes muy

similares a los observados en el masetero para las fibras puras, concretamente un 32.3%

de fibras expresan solamente la isoforma MHC-I, un 5.4% la isoforma MHC-IIA y un

10.6% la isoforma MHC-IIX, mientras que el 51.5% de las fibras restantes son híbridas

(Korfage & Van Eijden, 2000). En el músculo temporal, las isoformas MHC-I y MHC-

IIA que se expresan en fibras puras son más abundantes en comparación con los

músculos masetero y pterigoideo medial, pero presentan una menor proporción de fibras

híbridas (Korfage et al., 2000). Concretamente, un 45.5% de las fibras expresan

únicamente la isoforma MHC-I y un 13.7% la isoforma MHC-IIA, mientras que las

fibras híbridas representan un 30% (Korfage et al., 2000). Entre la región anterior y

posterior del músculo temporal se observan diferencias en la proporción de la isoforma

MHC-I que se expresa en fibras puras, un 51.2% en la región anterior y un 37.9% en la

región posterior (Korfage & Van Eijden, 1999; Korfage et al., 2000).

1.6. Expresión genética

La expresión genética es el proceso en el que los genes se transforman en

proteínas y consta, básicamente, de dos fases: la transcripción y la traducción (Lodish et

al., 2000). La transcripción se realiza dentro del núcleo de la célula y consiste en

sintetizar una cadena de ARN utilizando como molde una de las dos cadenas de ADN

que contienen el gen (Borukhov & Nudler, 2008). Las enzimas encargadas de realizar

esta acción son las ARN polimerasas que desenrollan la doble hélice de ADN y van

agregando uno a uno los nucleótidos de ARN complementarios a los nucleótidos de la

46

cadena de ADN (Kerppola & Kane, 1991)5 (Tabla 5). La cadena de ARN que se obtiene

se denomina ARN mensajero (ARNm) y presenta regiones codificadoras, denominadas

exones, y regiones no codificadoras, denominadas intrones (Alberts et al., 2013).

Durante la transcripción, los intrones son eliminados por medio de los ARN nucleares

pequeños (ARNnp) y los exones se unen entre sí para formar el ARNm maduro, proceso

denominado maduración del ARN por corte y empalme o “RNA splicing” (Crick,

1979).

Tabla 5. Nucleótidos complementarios entre el ADN y el ARN.

ADN ARN

Adenina Uracilo

Timina Adenina

Guanina Citosina

Citosina Guanina

El ARNm maduro es transportado hacia el citoplasma donde tiene lugar la segunda

fase de la expresión genética, la traducción. La traducción es la síntesis de la proteína a

partir del ARNm maduro y se lleva a cabo en los ribosomas (Lodish et al., 2000). Los

ribosomas están constituidos por proteínas ribosomales y por ARN ribosómico (ARNr),

que acomoda el ARNm dentro del ribosoma para que interactúe con el ARN de

transferencia (ARNt) (Lodish et al., 2000). El ARNt es un tipo de ARN con forma de

cruz que en un extremo transporta uno de los veinte aminoácidos necesarios para formar

la proteína y en el otro extremo presenta una secuencia de tres nucleótidos, denominada

anticodón, que es complementaria a una secuencia de tres nucleótidos del ARNm,

5 El ADN presenta los nucleótidos adenina, guanina, citosina y timina, mientras que el ARN presenta los

nucleótidos adenina, guanina, citosina y uracilo.

47

denominada codón. Así, el ARNt convierte la secuencia de nucleótidos del ARNm

maduro en una secuencia de aminoácidos que constituirán la proteína (Alberts et al.,

2013) (Figura 16).

Figura 16. Representación de la síntesis proteica.

1.6.1. RT-qPCR

La RT-qPCR (real time quantitative polymerase chain reaction) sirve para

identificar y cuantificar la expresión de diferentes genes a nivel de su ARNm o

“transcript”. Esta técnica permite amplificar una secuencia definida de ARNm y

discriminarla de otra estrechamente relacionada, con lo que presenta una elevada

especificidad (Bustin, 2000). También nos permite trabajar con material genético de

muestras de tejido muscular muy pequeñas debido a que tiene una elevada sensibilidad

y puede amplificar niveles muy bajos de ARNm (Bustin, 2000). Además, nos permite

trabajar con músculos criopreservados durante largos períodos de tiempo, puesto que

cualquier degradación post-mortem potencial del ARNm puede compensarse

48

normalizando los valores de expresión del gen estudiado con los de un gen endógeno

resistente (Bahar et al., 2007).

Estudios realizados en tejido muscular muestran una correlación entre el ARNm

específico de una isoforma de la MHC y su proteína sugiriendo una regulación

transcripcional de la expresión de los genes de la MHC (Cox & Buckingham, 1992;

Wright et al., 1997; Eizema et al., 2005; Hemmings et al., 2009; Zurmanova & Soukup,

2013; Men et al., 2016). Estos resultados indican que el estudio de la expresión genética

de las isoformas de la MHC puede ser válido para analizar las características

funcionales de un músculo o de sus partes.

Hipótesis y objetivos

51

2. Hipótesis y objetivos

2.1. Hipótesis

La hipótesis que se plantea en el presente proyecto de Tesis Doctoral es que las

diferencias funcionales y ultraestructurales que se han descrito entre los diferentes

músculos elevadores de la mandíbula o entre sus diferentes porciones en los humanos

modernos y en otras especies de primates no hominoideos, mediante el uso de diferentes

técnicas como la electromiografía, la tinción ATPasa o mediante técnicas hitoquímicas

o inmunohistoquímicas, se verán también reflejadas en los patrones de expresión de las

diferentes isoformas de la MHC de estos músculos en Pan troglodytes.

A pesar de que los chimpancés comunes y los bonobos son las especies de

primates más emparentadas con los humanos modernos desde el punto de vista

filogenético, las características funcionales y moleculares de sus músculos masticadores

han sido poco estudiadas hasta la actualidad, posiblemente debido en parte a la

dificultad de acceder al estudio de estos primates afectados por un elevado riesgo de

extinción. En este sentido, el uso de la RT-qPCR para determinar los patrones de

expresión de las isoformas de la MHC puede ser de gran utilidad al permitir analizar

músculos pertenecientes a primates criopreservados durante largos períodos de tiempo

que dificultan el estudio mediante técnicas histoquímicas o inmunohistoquímicas.

De esta forma, pensamos que se podrán detectar diferencias significativas en los

patrones de expresión de las isoformas de la MHC entre los diferentes músculos

elevadores de la mandíbula (masetero, pterigoideo medial y temporal) y entre sus

diferentes porciones en Pan troglodytes que se podrán relacionar con sus respectivos

52

patrones funcionales que han sido estudiados en los humanos modernos y en otras

especies de primates no hominoideos mediante técnicas electromiográficas.

2.2. Objetivos

El objetivo principal de nuestro proyecto de Tesis Doctoral es analizar mediante

RT-qPCR el patrón de expresión de las diferentes isoformas de la MHC en los músculos

elevadores de la mandíbula en Pan troglodytes para valorar si existen diferencias

significativas que puedan relacionarse con las características funcionales de estos

músculos observadas mediante electromiografía en los humanos modernos y otras

especies de primates no hominoideos. Con ello, se pretende mejorar el conocimiento

que se tiene sobre la anatomía, función y composición de los músculos masticadores de

los chimpancés comunes, una especie relativamente poco estudiada a pesar del elevado

grado de parentesco que presenta con los humanos modernos. Pensamos que nuestros

resultados podrán ser aplicados a diferentes campos de estudio como la anatomía

comparada, la anatomía evolutiva o la antropología.

La consecución de este objetivo principal se ha basado en el desarrollo de los

siguientes objetivos específicos:

1- Diseccionar los músculos elevadores de la mandíbula (masetero, pterigoideo

medial y temporal) en diferentes individuos de las especies Homo sapiens y Pan

troglodytes para obtener información sobre su anatomía y su masa muscular

relativa.

2- Recoger muestras de los diferentes músculos diseccionados y de sus porciones

(regiones anterior y posterior del masetero superficial, regiones anterior y

posterior del masetero profundo, regiones anterior y posterior del temporal

53

superficial, regiones anterior y posterior del temporal profundo y región

esfenomandibular del temporal) para el estudio de los patrones de expresión de

las isoformas de la MHC mediante RT-qPCR.

3- Obtener y comparar los patrones de expresión de las isoformas de la MHC entre

las regiones anterior y posterior del masetero superficial.


las regiones anterior y posterior del masetero profundo.


las porciones superficial y profunda del masetero.


la porción superficial del masetero y el pterigoideo medial.


la porción profunda del masetero y el pterigoideo medial.


las regiones anterior y posterior del temporal superficial.


las regiones anterior y posterior del temporal profundo.


las regiones anteriores de los temporales superficial y profundo.


las regiones posteriores de los temporales superficial y profundo.


la porción esfenomandibular del temporal y las otras regiones de este músculo.

13- Comparar los resultados obtenidos con otros estudios que se han realizado en

los músculos masticadores de los humanos y otras especies de primates

54

mediante técnicas electromiográficas, tinciones ATPasa y técnicas histoquímicas

e inmunohistoquímicas.

Artículos

57

3. Artículos

3.1. Artículo primero: “Expression of MyHC isoforms mRNA transcripts in different regions of the masseter and medial pterygoid muscles in chimpanzees”

Resumen

Los músculos masetero y pterigoideo medial de Pan troglodytes actúan

conjuntamente elevando la mandíbula, pero los estudios electromiográficos realizados

en otras especies de primates, incluidos los humanos, muestran diferencias funcionales

entre los dos músculos y entre las dos porciones del masetero (Basmajian & De Luca,

1985; Hylander et al., 1987; Blanksma et al., 1997; Hylander et al., 2000; Wall et al.,

2006; Schindler et al., 2007; Vinyard et al., 2008; Williams et al., 2011; Guzmán-

Venegas et al., 2015). Una forma alternativa a la electromiografía para valorar las

características funcionales de un músculo es el análisis de la expresión de las diferentes

isoformas de la MHC (Bottinelli & Reggiani, 2000).

En este artículo se obtuvieron la masa muscular del masetero y del pterigoideo

medial en cinco Pan troglodytes y se analizaron la expresión del ARNm de las

isoformas MHC-I, MHC-IIA, MHC-IIX y MHC-IIM en diferentes porciones de estos

dos músculos mediante RT-qPCR.

Los resultados obtenidos indican que el masetero presenta una mayor masa

muscular en comparación con el pterigoideo medial (peso medio del masetero de 62 gr

y peso medio del pterigoideo medial de 24 gr) y que la masa de la porción superficial

del masetero es superior a la de la porción profunda (peso medio de la porción

superficial de 45.5 gr y peso medio de la porción profunda de 16.5 gr). El patrón de

58

expresión de las isoformas de la MHC obtenido es similar en todas las regiones

analizadas, siguiendo el patrón MHC-IIM>MHC-IIA>MHC-I>MHC-IIX. No se

identificaron diferencias significativas de los patrones de expresión de las isoformas de

la MHC entre las regiones anterior y posterior del masetero superficial, entre las

regiones anterior y posterior del masetero profundo, entre la porción superficial del

masetero y el pterigoideo medial ni entre la porción profunda del masetero y el

pterigoideo medial. Sin embargo, sí que se observaron diferencias significativas entre

las porciones superficial y profunda del masetero, presentando la porción superficial un

mayor porcentaje de expresión de la isoforma MHC-IIM (40.2% vs. 34.2%).

El patrón de expresión de las isoformas de la MHC obtenido en el masetero y el

pterigoideo medial es típico de músculos fásicos, por presentar un porcentaje de

expresión de la isoforma MHC-I inferior al 50% (21.5% en el masetero y 22.2% en el

pterigoideo medial), y de gran potencia, por presentar un porcentaje de expresión

elevado de la isoforma MHC-IIM (37.2% en el masetero y 37.7% en el pterigoideo

medial). Estos resultados concuerdan bien con el gran desarrollo que presenta la

musculatura masticadora en Pan troglodytes. Por otro lado, las diferencias observadas

entre las porciones superficial y profunda del músculo masetero están en la línea de las

observaciones realizadas por otros autores con el uso de la electromiografía. Estas

observaciones indican un patrón de reclutamiento diferente para las dos porciones del

masetero, presentando la porción superficial una mayor actividad en movimientos

verticales, cuando se requiere una mayor fuerza muscular, y presentando la porción

profunda una mayor actividad en los movimientos laterales de la mandíbula, que sirven

para colocar los molares antes de la oclusión dentaria (Hylander et al., 1987; Hylander

& Johnson, 1994).

59

Como conclusión, el análisis de los patrones de expresión de las diferentes

isoformas de la MHC puede aportar información novedosa relacionada con las

características anatómicas y funcionales de los músculos masticadores de Pan

troglodytes, que se puede complementar con la obtenida por otros autores con el uso de

otras metodologías en otras especies de primates.

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67

3.2. Artículo segundo: “Expression of myosin heavy chain isoforms mRNA transcripts in the temporalis muscle of common chimpanzees (Pan troglodytes)

Resumen

El temporal es uno de los músculos elevadores de la mandíbula junto con el

masetero y el pterigoideo medial. En Pan troglodytes, el músculo temporal está

formado por una porción superficial y una porción profunda (Aiello & Dean, 1990).

Además, algunos estudios realizados en humanos y en Macaca mulatta (Türp et al.,

1997; Schön-Ybarra & Bauer, 2001; Skinner & Aziz, 2003) han descrito una porción

profunda del temporal, denominada porción esfenomandibular, que algunos autores

identifican como un músculo independiente (Dunn et al., 1996). Funcionalmente, el

músculo temporal se puede dividir en una región anterior y una región posterior. Los

estudios electromiográficos realizados en humanos y en otras especies de primates no

hominoideos muestran que la región anterior actúa principalmente en la elevación de la

mandíbula, mientras que la región posterior participa sobretodo en su desplazamiento

posterior y lateral (Blanksma et al., 1997; Hylander et al., 2005; Vinyard et al., 2008).

Por su parte, la porción esfenomandibular actúa principalmente en el mantenimiento de

la postura de la mandíbula (Wood, 1986; Fuentes et al., 2012). En el presente estudio se

analizaron los patrones de expresión de las isoformas de la MHC en las diferentes

porciones del músculo temporal en cinco Pan troglodytes, con la finalidad de observar

diferencias significativas que puedan relacionarse con las diferencias funcionales

observadas por otros autores en los humanos y otras especies de primates no

hominoideos con el uso de la electromiografía.

68

En los cinco chimpancés comunes diseccionados se pudo identificar una porción

esfenomandibular claramente separada del resto del músculo temporal. Sin embargo, su

inervación no estaba diferenciada de la inervación de las regiones anteriores del resto

del temporal (nervio temporal profundo anterior), con lo que no consideramos

pertinente la identificación de la porción esfenomandibular como un músculo

independiente del temporal (Türp et al., 1997; Schön-Ybarra & Bauer, 2001).

Los principales resultados obtenidos indican que la expresión de las isoformas

de la MHC sigue un patrón similar en todas las regiones del músculo temporal de Pan

troglodytes (MHC-IIM>MHC-IIA>MHC-I>MHC-IIX), excepto en la región posterior

del temporal superficial donde la isoforma MHC-I presenta un mayor porcentaje de

expresión que la isoforma MHC-IIA. No se observaron diferencias significativas de los

patrones de expresión cuando se compararon las regiones anterior y posterior del

temporal superficial, las regiones anterior y posterior del temporal profundo, las

regiones anteriores de los temporales superficial y profundo y las regiones posteriores

de los temporales superficial y profundo. Cabe destacar, pero, que se observó una

diferencia no significativa en el porcentaje de expresión de la isoforma MHC-IIM entre

las regiones anterior (47%) y posterior (40.5%) del temporal superficial que podría

relacionarse con las diferencias funcionales observadas entre las dos regiones mediante

el uso de la electromiografía (Blanksma et al., 1997; Hylander et al., 2005; Vinyard et

al., 2008).

Los patrones de expresión de las isoformas de la MHC sí que presentaron

diferencias significativas cuando se compararon las regiones anteriores de los

temporales superficial y profundo con la porción esfenomandibular. En este caso, la

porción esfenomandibular presentó un menor porcentaje de expresión de la isoforma

MHC-IIM en la porción esfenomandibular (33.6%) respecto a la región anterior del

69

temporal superficial (47%) y a la región anterior del temporal profundo (43%). Esta

observación implica una menor capacidad de la porción esfenomandibular de desarrollar

potencia muscular, lo que se relaciona con su función lateralizadora y estabilizadora de

la mandíbula que se ha descrito en diferentes estudios electromiográficos realizados en

Homo sapiens (Wood, 1986; Fuentes et al., 2012).

Como conclusión, las diferencias observadas en los patrones de expresión de las

isoformas de la MHC en las diferentes porciones del músculo temporal de Pan

troglodytes, pueden relacionarse con algunas de las diferencias funcionales que se han

identificado electromiograficamente en otras especies de primates.

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Discusión

79

4. Discusión

Los músculos elevadores de la mandíbula de Pan troglodytes presentan un patrón de

expresión característico de los músculos fásicos, con un elevado porcentaje de ARNm

de las isoformas MHC-II (>73%). Este patrón de expresión es el esperado para unos

músculos que actúan durante la fase de clausura del ciclo de la masticación, al final de

la cual tiene lugar la rotura de los alimentos (Lieberman, 2011). La gran potencia de los

músculos elevadores de la mandíbula en Pan troglodytes queda reflejada en la mayor

expresión de ARNm de la isoforma MHC-IIM. Esta isoforma es la más potente debido a

su elevada actividad ATPasa y presenta una velocidad de contracción moderada, que se

sitúa entre las isoformas MHC-I y MHC-IIA (Hoh, 2002; Toniolo et al., 2008). Este

modelo de expresión de los músculos elevadores de la mandíbula se corresponde con

sus características morfológicas, propicias para la generación de una elevada fuerza

muscular (Taylor & Vinyard, 2013). Los tres músculos son peniformes y, por lo tanto,

pueden agrupar un mayor número de sarcómeros en paralelo que les permiten generar

contracciones musculares más potentes (Aiello & Dean, 1990; Van Eijden et al., 1997).

Un parámetro que refleja el número de sarcómeros en paralelo es el ASTF que está

directamente relacionada con el peso muscular (Powell et al., 1984). Nuestros resultados

muestran que los músculos con mayor masa muscular presentan una mayor expresión

de la isoforma MHC-IIM. Así, el músculo temporal tiene un peso de 120.5 gr y una

expresión de ARNm de la isoforma MHC-IIM que representa el 41.5%, el músculo

masetero superficial tiene un peso de 45.5 gr y una expresión de la isoforma MHC-IIM

del 40.2%, el músculo masetero profundo tiene un peso de 16.5 gr y una expresión de la

isoforma MHC-IIM del 34.2% y el músculo pterigoideo medial tiene un peso de 24 gr y

una expresión de la isoforma MHC-IIM del 37.7%. Esta relación, pero, no se cumple en

80

el caso de las dos porciones del músculo temporal, donde la porción superficial presenta

un peso muscular de 39.9 gr y una expresión de ARNm de la isoforma MHC-IIM del

43.8%, mientras que la porción profunda presenta un peso muscular de 68.7 gr y una

expresión de ARNm de la isoforma MHC-IIM del 43.2%.

En general, los músculos elevadores de la mandíbula muestran el mismo patrón de

expresión: MHC-IIM>MHC-IIA>MHC-I>MHC-IIX (Anexo 1). Concretamente, el

músculo masetero muestra unos porcentajes para la isoforma MHC-IIM del 37.2%, para

la isoforma MHC-IIA del 28.6%, para la isoforma MHC-I del 21.5% y para la isoforma

MHC-IIX del 12.8%. Estos porcentajes son muy parecidos a los obtenidos en el

músculo pterigoideo medial, que presenta un porcentaje de ARNm de la isoforma

MHC-IIM del 37.7%, de la isoforma MHC-IIA del 28.3%, de la isoforma MHC-I del

22.2% y de la isoforma MHC-IIX del 11.8%. En cambio, el temporal presenta una

mayor proporción de ARNm de la isoforma MHC-IIM (41.5%) y una menor proporción

de la isoforma MHC-IIA (23.5%). Estos resultados sugieren que el masetero y el

pterigoideo medial presentan unas características funcionales parecidas y están en la

línea de las observaciones electromiográficas. Según los estudios electromiográficos

realizados en diferentes especies de primates antropoideos, incluidos los humanos, el

masetero y el pterigoideo medial actúan de forma sinérgica durante los movimientos de

elevación de la mandíbula, llegando al pico máximo de actividad durante la oclusión

dentaria (Basmajian & De Luca, 1985; Hylander et al., 1987; Aiello & Dean, 1990; Van

Eijden et al., 1997; Schindler et al., 2007; Williams et al., 2011).

A nivel intramuscular, existen diferencias significativas en la expresión de la

isoforma MHC-IIM entre las dos porciones del músculo masetero. El masetero

superficial presenta una expresión de ARNm de la MHC-IIM del 40.2%, mientras que

la porción profunda presenta una expresión del 34.2% (p=0.032). Además, el masetero

81

superficial presenta una menor proporción de ARNm de las isoformas MHC-I y MHC-

IIA. Estas dos isoformas son las menos potentes, pero son las más resistentes a la fatiga

(Schiaffino & Reggiani, 2011). Estas diferencias en el patrón de expresión de las

isoformas de la MHC entre el masetero superficial y el masetero profundo se

correlacionan con los estudios electromiográficos realizados en Papio anubis, Macaca

fuscata, Aotus trivirgatus y Homo sapiens (Hylander et al., 1987; Wood, 1987;

Hylander & Johnson, 1994; Blanksma et al., 1997; Hylander et al., 2005). Estos

estudios muestran que el masetero superficial actúa en los movimientos verticales de la

mandíbula y aumenta el reclutamiento de sus fibras durante la masticación de alimentos

mecánicamente resistentes (Hylander & Johnson, 1994; Blanksma et al., 1997). En

cambio, el masetero profundo desplaza la mandíbula lateralmente y ayuda a colocar los

molares justo antes de la oclusión dentaria, por lo que requiere de movimientos más

precisos y menos potentes (Hylander et al., 1987; Hylander & Johnson, 1994; Vinyard

et al., 2008; Ross & Iriarte-Diaz, 2014). Algunos estudios electromiográficos realizados

en humanos también describen diferencias en el modelo de reclutamiento de las fibras

musculares entre las regiones anterior y posterior del músculo masetero, tanto en su

porción superficial como en la profunda (Blanksma et al., 1992; Guzmán-Venegas et al.,

2015). Estas diferencias no se han visto reflejadas en nuestro estudio en el patrón de

expresión de las isoformas de la MHC, con lo que posiblemente se deban a diferencias

en las características morfológicas de las dos regiones como, por ejemplo, la orientación

de sus fibras musculares.

El músculo temporal se divide funcionalmente en una región anterior y una región

posterior. La región anterior actúa durante la fase de clausura de la mandíbula y

aumenta su actividad durante el procesamiento de alimentos resistentes, en cambio la

región posterior actúa en los movimientos de retrusión de la mandíbula (Cachel, 1979;

82

Wood, 1987; Blanksma et al., 1997; Hylander et al., 2005). Estas dos regiones del

temporal también presentan diferencias en su morfología interna. Así, en Homo sapiens

la porción anterior presenta una ASTF de 7.7 cm2 y la porción posterior de 5.55 cm2

(Van Eijden et al., 1997). Todas estas diferencias, funcionales y estructurales, entre las

regiones anterior y posterior del músculo temporal no se traducen en diferencias

significativas en la expresión de las isoformas de la MHC en Pan troglodytes, pero

hemos observado una tendencia a una mayor expresión de la isoforma MHC-IIM y a

una menor expresión de la isoforma MHC-I en la región anterior del temporal

superficial respecto a su región posterior. Concretamente, la región anterior del

temporal superficial presenta un porcentaje de expresión de la isoforma MHC-IIM del

47% y un porcentaje de expresión de la isoforma MHC-I del 19.9, mientras que la

región posterior del temporal superficial presenta un porcentaje de expresión de la

isoforma MHC-IIM del 40.5 y un porcentaje de expresión de la isoforma MHC-I del

26.9%. La isoforma MHC-I presenta una baja actividad ATPasa y es la isoforma de la

MHC menos potente (Schiaffino & Reggiani, 2011). Esta isoforma se expresa en fibras

de contracción lenta, que son idóneas para las actividades posturales y los movimientos

de precisión (Korfage et al., 2005a). Esto sugiere que la región anterior del temporal

superficial es más potente, mientras que su región posterior tiene una mayor

participación en los movimientos de precisión y posturales de la mandíbula, tal y como

indican los estudios morfológicos y electromiográficos. Posiblemente, una ampliación

de la muestra muscular se traduzca en diferencias significativas en el modelo de

expresión de las isoformas de la MHC entre las regiones anterior y posterior del

músculo temporal.

Donde sí hemos obtenido diferencias significativas es en la expresión de ARNm de

la isoforma MHC-IIM entre las regiones anteriores del temporal superficial y del

83

temporal profundo y la porción esfenomandibular. Algunos autores consideran la

porción esfenomandibular como un músculo independiente debido a que se puede

diferenciar anatómicamente de la porción profunda del temporal (Dunn et al., 1996). En

las disecciones que hemos realizado en cinco Pan troglodytes hemos podido identificar

la porción esfenomandibular como una porción separada del temporal profundo pero su

inervación depende del nervio temporal profundo anterior, igual que el resto de la

región más anterior del temporal, con lo que descartamos que se trate de un músculo

independiente. La porción esfenomandibular presenta una menor proporción de ARNm

de la isoforma MHC-IIM (33.6%) y una mayor proporción de la isoforma MHC-IIA

(31.5%) en comparación con la región anterior del temporal superficial (MHC-IIM 47%

y MHC-IIA 22.5%) y profundo (MHC-IIM 43% y MHC-IIA 22.3%), siendo estas

diferencias significativas en el caso de la isoforma MHC-IIM (temporal superficial vs.

esfenomandibular p=0.032 y temporal profundo vs. esfenomandibular p=0.016) pero

no en el caso de la isoforma MHC-IIA. La isoforma MHC-IIA es la más lenta y menos

potente de las isoformas MHC-II (Schiaffino & Reggiani, 2011). Esta isoforma se

expresa en fibras con metabolismo oxidativo glucolítico de contracción rápida con una

resistencia a la fatiga moderada (Korfage et al., 2005a). Este modelo de expresión se

corresponde con las observaciones realizadas mediante electromiografía en los

humanos, que demuestran una mayor participación de la porción esfenomandibular en el

control postural y en la estabilización de la mandíbula (Zenker, 1955; Wood, 1986;

Fuentes et al., 2012). Además, nuestros resultados apoyan la hipótesis de una fuerza

oclusiva elevada (“high occlusal force hypothesis”), según la cual las partes

superficiales de los músculos de la masticación son las encargadas de generar la fuerza

muscular necesaria para procesar los alimentos más resistentes.

84

Los porcentajes de expresión del ARNm de las isoformas de la MHC que hemos

obtenidos mediante RT-qPCR son diferentes a los porcentajes de tipos de fibras

observados por otros autores mediante otras técnicas en los músculos elevadores de la

mandíbula de diferentes especies de primates no humanos, como Pan troglodytes

(Rowlerson et al., 1983), Macaca mulatta (Maxwell et al., 1979; Miller & Farias, 1988),

Cebus apella (Andreo et al., 2002) y Papio anubis (Wall et al., 2013). Estas diferencias

son debidas, posiblemente, a la presencia de fibras híbridas, que en los músculos

elevadores de la mandíbula de Homo sapiens representan entre el 30% y el 51.5% de las

fibras, y a la capacidad de cada técnica para detectarlas y cuantificarlas (Korfage & Van

Eijden, 1999; Korfage & Van Eijden, 2000; Korfage et al., 2000; Korfage & Van

Eijden, 2003; Österlund et al., 2012; Wall et al., 2013). Las fibras híbridas expresan más

de una isoforma de la MHC y pueden variar su contenido a lo largo de la fibra muscular

(Pette & Staron, 2000; Korfage et al., 2016; Zhang & Gould, 2017). Además, los

estudios realizados por tinción ATPasa en Macaca mulatta (Maxwell et al., 1979;

Miller & Farias, 1988) y Cebus apella (Andreo et al., 2002) no describen la presencia

de fibras IIM, que es el tipo de fibra más habitual en los músculos masticadores de los

primates (Rowlerson et al., 1983).

En resumen, el patrón de expresión de las isoformas de la MHC en los músculos

elevadores de mandíbula en Pan troglodytes nos aporta nueva información a nivel

molecular que se puede relacionar con las características morfológicas y funcionales de

estos músculos observadas mediante otras técnicas.

Conclusiones

87

5. Conclusiones

1- La masa media del masetero en Pan troglodytes es 2.6 veces mayor que la del

pterigoideo medial y la masa media del masetero superficial es 2.8 veces mayor

que la del masetero profundo.

2- El patrón de expresión de las isoformas de la MHC es similar en el masetero

superficial, en el masetero profundo y en el pterigoideo medial, presentando la

secuencia MHC-IIM>MHC-IIA>MHC-I>MHC-IIX.

3- No hemos identificado diferencias significativas en los patrones de expresión de

las isoformas de la MHC entre las porciones anterior y posterior del masetero

superficial y del masetero profundo.

4- No hemos identificado diferencias significativas en los patrones de expresión de

las isoformas de la MHC entre el pterigoideo medial y las porciones superficial

y profunda del masetero.

5- Existen diferencias significativas en el patrón de expresión de la isoforma MHC-

IIM entre la porción superficial y profunda del masetero, presentando la porción

superficial un porcentaje de expresión mayor que la porción profunda.

6- No hemos identificado diferencias significativas en los porcentajes de expresión

de las isoformas MHC-I, MHC-IIA y MHC-IIX entre las porciones superficial y

profunda del masetero.

7- La porción superficial del temporal en Pan troglodytes representa el 33.1% de la

masa total del músculo temporal, la porción profunda representa el 57% y la

porción esfenomandibular el 9.9%.

88

8- En todos los chimpancés comunes diseccionados hemos identificado una porción

esfenomandibular del músculo temporal claramente separada del temporal

profundo. Sin embargo, la inervación de esta porción esfenomandibular se

verifica por el nervio temporal profundo anterior, igual que la porción anterior

del resto del temporal.

9- El patrón de expresión de las isoformas de la MHC en las diferentes porciones

del músculo temporal es similar al observado en los músculos masetero y

pterigoideo medial, siguiendo la secuencia MHC-IIM>MHC-IIA>MHC-

I>MHC-IIX. La única excepción es la región posterior del temporal superficial,

donde se sigue la secuencia MHC-IIM>MHC-I>MHC-IIA>MHC-IIX.

10- No hemos observado diferencias significativas en los patrones de expresión de

las isoformas de la MHC entre las regiones anterior y posterior del temporal

superficial ni entre las regiones anterior y posterior del temporal profundo.

11- El patrón de expresión de las isoformas de la MHC presenta diferencias

significativas entre la porción esfenomandibular y las regiones anteriores del

temporal superficial y del temporal profundo. Concretamente la porción

esfenomandibular presenta una menor expresión de la isoforma MHC-IIM.

12- El patrón de expresión de las isoformas de la MHC en los músculos elevadores

de la mandíbula de Pan troglodytes, obtenido mediante RT-qPCR, se relaciona

con las diferencias funcionales observadas en estos músculos mediante el uso de

la electromiografía en otras especies de primates.

Anexos

91

6. Anexos

6.1. Anexo 1: peso muscular y porcentajes de expresión del ARNm en

Pan troglodytes

La siguiente tabla muestra el peso medio y los porcentajes de expresión del

ARNm en los músculos masetero (porciones superficial y profunda), pterigoideo medial

y temporal (regiones anterior, posterior y esfenomandibular) en Pan troglodytes.

Músculo

Peso medio %MHC-I %MHC-IIA %MHC-IIX %MHC-IIM

(DE) (DE) (DE) (DE) (DE)

Masetero 62 (27.2) 21.5 (4.9) 28.6 (2.2) 12.8 (5.1) 37.2 (3.7)

Porción superficial 45.5 (19.9) 20.3 (5.1) 26.7 (2.5) 12.8 (6.5) 40.2 (5.1)

Región anterior 20.3 (5.6) 27.4 (2.0) 13.1 (6.7) 39.2 (6.0)

Región posterior 20.3 (4.6) 26.0 (2.9) 12.6 (6.7) 41.1 (4.9)

Porción profunda 16.5 (7.5) 22.7 (5.1) 30.4 (2.2) 12.7 (4.0) 34.2 (2.7)

Región anterior 22.6 (5.5) 30.9 (2.3) 12.7 (5.8) 33.8 (1.6)


Pterigoideo medial 24 (8.6) 22.2 (3.0) 28.3 (1.4) 11.8 (7.4) 37.7 (8.1)

Temporal 120.5 (45.9) 22.0 (2.8) 23.5 (4.8) 13.0 (1.4) 41.5 (5.0)

Superficial 39.9 (11.1)

Región anterior 19.9 (10.1) 22.5 (5.6) 10.6 (6.8) 47 (10.4)


Profundo 68.7 (7.4)

Región anterior 20.5 (4.6) 22.3 (5.0) 14.2 (7.6) 43.0 (4.9)


Esfenomandibular 11.9 (4.2) 21.8 (7.2) 31.5 (8.0) 13.1 (7.0) 33.6 (3.2)

92

6.2. Anexo 2: protocolo de la RT-qPCR

La realización de la RT-qPCR se basa en tres procesos diferentes: la extracción

del ARN de las muestras musculares que se van a analizar, la síntesis de ADN

complementario (ADNc) y la RT-qPCR propiamente dicha.

6.2.1. Extracción del ARN mediante el protocolo TriPure de Roche

En primer lugar, se cogen 100 mg de tejido muscular y se colocan en una placa

de Petri. Seguidamente, se añade 1 ml de TriPure y se homogeneiza el tejido trabajando

siempre en frío. Una vez se tiene homogeneizado el tejido, se pipetea en un tubo

Eppendorf de 1.5 ml y se deja incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente (15-25

ºC). Pasados los 5 minutos, se añaden 0.2 ml de cloroformo y se agita fuertemente el

tubo Eppendorf durante 15 segundos para que se mezcle bien el contenido. Se vuelve a

incubar el tubo Eppendorf a temperatura ambiente durante 15 minutos. Posteriormente,

se centrifuga la muestra durante 15 minutos a 12000 g y a 2-8 ºC de temperatura.

Después de la centrífuga, el contenido del tubo Eppendorf se separa en una capa

superior que contiene el ARN y una capa inferior que contiene el ADN y las proteínas.

Se aísla el ARN de la fase acuosa incolora de la capa superior en un nuevo tubo

Eppendorf de 1.5 ml y se añaden 0.5 ml de isopropanol. Se invierte manualmente el

tubo varias veces para que se mezclen los distintos componentes y se deja en el

congelador a -20 ºC durante 24 horas.

Una vez pasadas 24 horas, se retira el tubo Eppendorf del congelador y se incuba

a temperatura ambiente durante 20-30 minutos. Pasado este tiempo, se centrifuga la

muestra durante 10 minutos a 12000 g y a 2-8 ºC de temperatura. Se retira el tubo

Eppendorf de la centrifugadora y se descarta el sobrenadante, siendo cuidadosos para no

93

descartar también el pellet6. Se añade 1 ml de etanol al 75% y se realiza un vórtice.

Posteriormente, se centrifuga de nuevo la muestra durante 5 minutos a 7500 g y a 2-8 ºC

de temperatura. Se descarta el sobrenadante y se deja que el exceso de etanol se seque al

aire. Una vez se ha secado el etanol, se vuelve a suspender el pellet de ARN en 50 µl de

agua libre de RNasa, pipeteando repetidas veces para disolver el pellet de ARN y se

incuba durante 15 minutos a 55-60 ºC de temperatura. Pasado este tiempo, se procede a

cuantificar el ARN utilizando el espectrofotómetro NanoDrop 1000 (ThermoFisher) y

se almacena hasta su utilización a -80 ºC.

6.2.2. Síntesis del ADNc

Para realizar la síntesis del ADNc se descongela en primer lugar el ARN

obtenido en el proceso anterior y se realiza un vórtice. Seguidamente, se calcula el

volumen de ARN y de agua libre de RNasa para un volumen final de ADNc de 20 µl.

Es fundamental obtener la misma concentración de ADNc en todas las muestras ya que

posteriormente vamos a cuantificarlas y a analizar sus niveles de expresión. Se pipetean

los volúmenes calculados para cada muestra en su pozo correspondiente de la placa

MicroAmpTM optical 96 (ThermoFisher). Después, se añaden en cada pozo 2 µl de

tampón o buffer, 1.4 µl de MgCl2, 4 µl de dNTP (deoxyribose nucleoside triphosphate),

1 µl de random hexamer, 1 µl de RNA inhibitor y 1 µl de multiscribe. Para mezclar los

diferentes componentes, se tapan los pozos con tiras y se centrifuga la placa durante 1

minuto. Finalmente, se coloca la placa en el termociclador con las condiciones

siguientes: 10 minutos a 25 ºC, 48 minutos a 30 ºC y 5 minutos a 95 ºC para obtener el

ADNc.

6 El pellet es el precipitado de ARN, generalmente invisible, situado en la base del tubo Eppendorf.

94

6.2.3. RT-qPCR

Se realiza la RT-qPCR en un volumen total de 20 µl en ABI Prism 7700

Sequence Detection System (Applied Biosystems). En primer lugar, se pipetean 3 µl de

ADNc de cada muestra en su pozo correspondiente y 3 µl de agua libre de RNasa en un

pozo como control de contaminación. En segundo lugar, se añaden 10 µl de TaqMan, 6

µl de agua libre de RNasa y 1 µl del primer correspondiente (gen objetivo) en cada

pozo. Para finalizar, se centrifuga la placa durante 1 minuto y se realiza la RT-qPCR

con las siguientes condiciones: 2 minutos a 50 ºC, 40 ciclos de 10 minutos a 95 ºC y 15

segundos a 95 ºC y, al final, 1 minuto a 60 ºC.

Al finalizar la RT-qPCR se cuantifica el nivel de expresión de los genes de cada

isoforma de la MHC analizados mediante el método 2-∆∆Ct (Figura 17).

Figura 17. Expresión de las isoformas de la MHC-I, MHC-IIA, MHC-IIX y MHC-IIM en el músculo temporal de Pan troglodytes.

95

6.3. Anexo 3: resultados no publicados

Además de los resultados obtenidos en Pan troglodytes, se ha obtenido una serie

de resultados que aún no se han publicado en relación con la masa muscular y el patrón

de expresión de las isoformas de la MHC en los músculos elevadores de la mandíbula

de Homo sapiens (Tabla 6).

Tabla 6. Porcentajes de expresión del ARNm de las isoformas MHC-I, MHC-IIA, MHC-IIX y MHC-IIM en los músculos elevadores de la mandíbula de Homo sapiens y sus diferentes partes.

Músculo

Peso medio %MHC-I %MHC-IIA %MHC-IIX %MHC-IIM

(DE) (DE) (DE) (DE) (DE)

Masetero 17.8 (5.0) 28,6 (3.8) 34.0 (7.7) 26.4 (5.5) 11.0 (9.5)

Porción superficial 13.2 (3.4) 28.3 (4.4) 31.9 (9.0) 27.8 (7.0) 12.1 (9.4)

Región anterior 29.7 (7.1) 32.7 (9.8) 26.8 (8.8) 10.9 (11.8)


Porción profunda 4.6 (2.1) 28.9 (4.3) 36.2 (7.9) 25.0 (6.4) 9.9 (9.9)

Región anterior 28.3 (5.0) 37.9 (11.6) 22.9 (9.4) 10.9 (10.5)


Pterigoideo medial 7.6 (2.7) 29.6 (2.6) 30.4 (5.9) 28.6 (7.3) 11.3 (9.7)

Temporal 24.3 (9.44)

Región anterior 26.3 (11.7) 35.3 (6.0) 25.1 (6.1) 13.3 (12.4)


Esfenomandibular 37.6 (10.6) 38.5 (7.6) 18.2 (6.1) 5.6 (8.7)

Una de las adaptaciones más características que diferencian a Homo sapiens del

resto de primates hominoideos es la reducción del tamaño de los músculos elevadores

de la mandíbula (Aiello & Dean, 1990). El análisis del peso muscular nos indica que

96

esta reducción de tamaño ha afectado de forma similar a los músculos masetero, a sus

dos porciones, y al pterigoideo medial, y en un orden de magnitud superior al músculo

temporal. Así, si se considera la masa muscular, la relación Pan troglodytes/Homo

sapiens para el músculo masetero es de 3.5, siendo de 3.4 para la porción superficial y

de 3.6 para la porción profunda, y para el músculo pterigoideo medial es de 3.4. En

cambio, la relación existente entre el peso muscular del temporal de Pan troglodytes y

de Homo sapiens es de 5. Esto se debe a la ausencia de la porción superficial del

músculo temporal en Homo sapiens, ya que si eliminamos esta porción en Pan

troglodytes, la relación Pan troglodytes/Homo sapiens en el músculo temporal es de 3.3

(Oxnard & Franklin, 2008).

Los resultados de la RT-qPCR realizada en los músculos masetero, pterigoideo

medial y temporal de Homo sapiens muestran que se expresan todas las isoformas de la

MHC estudiadas, incluida la isoforma MHC-IIM. Posiblemente el ARNm de la

isoforma MHC-IIM detectado se corresponde con la parte del gen que se transcribe en

la porción inestable de la cabeza de la miosina, pero en ningún caso este ARNm llega a

traducirse en una proteína funcional (Stedman et al., 2004). Por este motivo, el ARNm

de la isoforma MHC-IIM no se ha tenido en cuenta para el análisis estadístico y

solamente podemos valorar las diferencias entre Homo sapiens y Pan troglodytes en la

expresión de la isoforma MHC-I y de las isoformas MHC-II en conjunto, es decir, la

expresión de las isoformas MHC-IIA y MHC-IIX en Homo sapiens y la suma de la

expresión de las isoformas MHC-IIA, MHC-IIX y MHC-IIM en Pan troglodytes (Tabla

7).

97

Tabla 7. Porcentajes de expresión del ARNm de las isoformas MHC-I y MHC-II en los músculos elevadores de la mandíbula en Homo sapiens y Pan troglodytes.

Músculo %MHC-I (DE)

Homo sapiens

%MHC-I (DE)

Pan troglodytes

%MHC-II (DE)

Homo sapiens

%MHC-II (DE)

Pan troglodytes

Masetero 32.3 (4.1) 21.5 (4.9) 67.7 (4.1) 78.5 (4.9)

Superficial 32.4 (5.9) 20.3 (5.1) 67.6 (5.9) 79.7 (5.0)

Profundo 32.1 (3.4) 22.7 (5.1) 67.9 (3.4) 77.3 (5.2)

Pterigoideo medial 33.6 (3.1) 22.2 (3.0) 66.4 (3.1) 77.8 (3.0)

Temporal

Región anterior 29.7 (10.7) 20.2 (4.6) 70.3 (10.7) 79.8 (4.6)



Los humanos presentan una mayor proporción de ARNm de la isoforma MHC-I.

Como se ha comentado anteriormente, esta isoforma presenta una baja velocidad de

contracción y una baja potencia muscular debido a su baja velocidad de liberación del

ADP y a su baja actividad ATPasa, respectivamente, pero tiene un coste tensional bajo

(Schiaffino & Reggiani, 2011). Esto hace que la isoforma MHC-I sea idónea para

contracciones prolongadas y de baja intensidad. En cambio, Pan troglodytes presenta

una mayor proporción de ARNm de las isoformas MHC-II. Estas isoformas pueden

generar una elevada potencia muscular, en especial la isoforma MHC-IIM, pero se

expresan en fibras con una baja resistencia a la fatiga (Korfage et al., 2005a; Schiaffino

& Reggiani, 2011). Estos resultados sugieren que Homo sapiens ha perdido potencia

muscular a cambio de una mayor resistencia a la fatiga y están en la línea de las

observaciones realizadas por Taylor & Vinyard (2013). Según estos autores, los

músculos elevadores de la mandíbula en Homo sapiens presentan una menor ASTF y,

98

por lo tanto, una menor potencia muscular en comparación con los mismos músculos en

Pan troglodytes. Como se ha comentado anteriormente, el ASTF está directamente

relacionada con la masa muscular y, de hecho, la relación entre el ASTF del masetero

superficial de Pan troglodytes y Homo sapiens es de 3.4 (16.78 cm2 / 4.96 cm2), similar

a la pérdida de masa muscular que hemos observado en nuestra muestra (Powell et al.,

1984; Taylor & Vinyard, 2013).

El patrón de expresión de las isoformas de la MHC obtenido en Homo sapiens es

el mismo para todos los músculos: MHC-IIA>MHC-I>MHC-IIX (Tabla 8). Estos

resultados sugieren que los músculos masetero, pterigoideo medial y temporal presentan

unas características funcionales similares tal y como indican los estudios

electromiográficos, que muestran una activación generalizada de estos músculos durante

la elevación de la mandíbula (Blanksma et al., 1997).

Tabla 8. Porcentajes de expresión del ARNm de las isoformas MHC-I, MHC-IIA y MHC-IIX en los músculos elevadores de la mandíbula de Homo sapiens y sus diferentes partes.

Músculo %MHC-I (DE) %MHC-IIA (DE) %MHC-IIX (DE) %MHC-II (DE)

Masetero 32.3 (4.1) 37.8 (6.4) 30.0 (6.6) 67.7 (4.1)

Superficial 32.4 (5.9) 35.7 (8.6) 31.9 (7.8) 67.6 (5.9)

Profundo 32.1 (3.4) 39.9 (6.2) 28.0 (7.8) 67.9 (3.4)

Pterigoideo medial 32.1 (3.1) 34.3 (5.9) 32.1 (6.0) 67.9 (3.1)

Temporal

Región anterior 29.7 (10.7) 41.2 (7.6) 29.1 (6.2) 70.3 (10.7)



99

A nivel intramuscular, no hemos obtenido diferencias significativas entre las dos

porciones del músculo masetero, pero existe una tendencia a la mayor expresión de

ARNm de la isoforma MHC-IIX en el masetero superficial y a la mayor expresión de

ARNm de la isoforma MHC-IIA en el masetero profundo. La isoforma MHC-I presenta

un patrón de expresión prácticamente idéntico en las dos porciones del masetero. Este

modelo de expresión se corresponde con los estudios electromiográficos que muestran

una mayor actividad del masetero superficial durante la fase de clausura de la

mandíbula, cuando se requiere de una elevada fuerza muscular, mientras que la porción

profunda actúa en movimientos laterales y de retrusión de la mandíbula, posiblemente

relacionados con la colocación de los molares (Wood, 1987; Blanksma et al., 1997).

Tampoco existen diferencias significativas a nivel de expresión del ARNm entre las

regiones anterior y posterior del masetero superficial y profundo, aunque el porcentaje

de expresión de la isoforma MHC-IIX es ligeramente menor en la región anterior

(30.2% en el masetero superficial y 26.3% en el masetero profundo) que en la región

posterior (33.5% en el masetero superficial y 29.8% en el masetero profundo). Este

modelo de expresión está en la línea de las observaciones realizadas por Guzmán-

Venegas et al. (2015) que muestran una mayor actividad electromiográfica de la región

anterior del masetero en acciones submaximales, en las cuales se reclutan en primer

lugar las fibras más resistentes a la fatiga.

Por otro lado, el modelo de expresión del ARNm de las isoformas MHC-I,

MHC-IIA y MHC-IIX en el músculo temporal refleja la división funcional descrita en

los estudios morfológicos y electromiográficos (Blanksma & Van Eijden, 1995;

Blanksma et al., 1997; Van Eijden et al., 1997). La región anterior del temporal actúa

durante la elevación de la mandíbula y presenta una mayor proporción de la isoforma

MHC-IIX, mientras que la región posterior participa en el mantenimiento de la postura

100

de la mandíbula y en su movimiento de retrusión, presentando una mayor proporción de

las isoformas más tónicas, la MHC-I y la MHC-IIA. Sin embargo, todas estas

diferencias observadas no son significativas. Las únicas diferencias significativas que

hemos observado respecto a la expresión de las isoformas de la MHC se han

identificado entre la región anterior del músculo temporal y su porción

esfenomandibular. La porción esfenomandibular presenta una mayor expresión de la

isoforma MHC-I y una menor expresión de la isoforma MHC-IIX en comparación con

la región anterior del temporal. Estos resultados se corresponden con las observaciones

realizadas en Pan troglodytes y coinciden con los estudios electromiográficos que

muestran una mayor participación de la porción esfenomandibular del temporal en el

mantenimiento de la postura y la estabilización de la mandíbula (Zenker, 1955; Wood,

1987; Fuentes et al., 2012).

Los porcentajes de expresión de las isoformas de la MHC que hemos obtenido

en nuestro estudio difieren notablemente de los porcentajes de tipos de fibras

musculares obtenidos en estudios histoquímicos e inmunohistoquímicos en los mismos

músculos. Este hecho se debe probablemente al papel que juegan las fibras híbridas en

este tipo de estudios (Ringqvist, 1974; Vignon et al., 1980; Eriksson & Thornell, 1983;

Shaughnessy et al., 1989; Korfage et al., 2000; Korfage et al., 2005b).

6.4. Anexo 4: objetivos de futuro

Actualmente, estamos trabajando en la cuantificación de las isoformas MHC-I y

MHC-II en los músculos elevadores de la mandíbula mediante SDS-PAGE. Este

método nos puede ser de utilidad para valorar si los niveles de ARNm de las isoformas

MHC-I y MHC-II obtenidos por RT-qPCR se correlacionan con los niveles de proteína.

101

El protocolo utilizado es el descrito por Talmadge & Roy (1993) junto con las

modificaciones propuestas por Bamman et al. (1999), Khon & Myburgh (2006) y

Mizunoya et al. (2008). Estos autores proponen aumentar la relación de acrilamida-bis

acrilamida (99:1) y la concentración del tampón superior para mejorar la resolución y la

separación de las bandas de las diferentes proteínas.

6.4.1. Extracción y cuantificación de proteínas

Para la extracción de las proteínas de una muestra muscular de 0.3 cm3 se utiliza un

tampón o buffer de lisis compuesto por: Tris-HCl, NaCl y tritón. Se tritura la muestra

muscular en 100 µl de tampón de lisis con 2 µl de cóctel inhibidor de proteasas y 1 µl

de ortoganato sódico 100X. Una vez triturada la muestra muscular, se pipetea en un

tubo Eppendorf de 1.5 ml y se deja en hielo durante una hora, realizándose vórtices cada

5-10 minutos. Posteriormente, se centrifuga la muestra a 14000 rpm durante 15 minutos

a 4 ºC. Seguidamente, se separa el sobrenadante (proteína) y se coloca en otro tubo

Eppendorf de 1.5 ml.

Una vez extraída la proteína, se cuantifica utilizando el método Bradford. En

primer lugar, se realiza una recta estándar con BSA (albúmina de suero bovino) para

poder conocer la concentración de proteína de nuestras muestras musculares (Tabla 9).

102

Tabla 9. Valores de BSA y de H2O miliQ utilizados para realizar la recta estándar.

Concentración (µg/µl) BSA (µl) H2O miliQ (µl)

0 0 200

1 0.25 199.75

2.5 0.625 199.375

5 1.250 198.75

7.5 1.875 198.125

10 2.5 197.5

15 3.75 196.25

20 5 195

En segundo lugar, se pipetean en un pozo 0.5 µl de muestra muscular con 199.5 µl

de H2O miliQ. Cada muestra muscular se pipetea en dos pozos diferentes de la placa

para cuantificar todas las muestras musculares por duplicado. Finalmente, se pipetean

en un pozo 0.5 µl del tampón de lisis y 199.5 µl de H2O miliQ para utilizarlo como

“blanco” (nos va a servir para quitar el ruido de fondo).

Una vez pipeteada la recta estándar, las muestras musculares y el “blanco” se

añaden 50 µl de Bradford en todos los pozos y se mezcla. Se protege de la luz con papel

de aluminio y se deja reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Finalmente,

se cuantifican las muestras en el espectrofotómetro con una absorbancia de 595 nm.

6.4.2. Electroforesis en gel de poliacrilamida

Para realizar la electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) se utiliza el

sistema de mini-geles de Bio-rad (Mini-Protean Tetra Cell®) (Figura 18).

103

Figura 18. Material utilizado para la preparación del gel de poliacrilamida.

Para preparar un gel de 0.75 mm de grosor, se necesitan los componentes

indicados en la Tabla 10.

Tabla 10. Componentes para la realización de un gel de poliacrilamida de 0.75 mm de grosor.

Componentes

Glicerol 100%

Acrilamida-bis 30% (99:1)

Tris 1.5 M (pH 8.8)

Tris 0.5 (pH 6.7)

Glicina 1M

EDTA 100 mM (pH 7.0)

SDS 10%

H2O destilada

TEMED

Amonio persulfato 10%

Previamente a la preparación del gel separador y del gel compactador se prepara el

marco de fundición (Figura 19).

Soporte de fundición

Placa de vidrio con espaciadores de 0.75mm

Placa de vidrio

Marco de fundición

Junta

Peine de 10 pozos

104

Figura 19. Colocación de los dos vidrios en el marco de fundición (izquierda) y el soporte de fundición preparado para añadir la solución del gel separador y del gel compactador (derecha).

Una vez tenemos el marco de fundición colocado en el soporte de fundición, se

prepara el gel separador (separating gel) con una composición de glicerol del 35% y del

8% acrilamida-bis acrilamida (99:1) (Tabla 11). Los últimos elementos que se añaden a

la solución del gel son el amonio persulfato al 10% y el TEMED

(tetrametiletilendiamina) para que inicien la polimerización. Inmediatamente después,

se mezcla la solución y se vierte en el soporte de fundición, dejando espacio suficiente

en la parte superior para el gel compactador.

Tabla 11. Componentes y volúmenes para la realización del gel separador.

Gel separador Volumen (µl)

Glicerol 100% 1.500

Acrilamida-bis 30% (99:1) 1.334

Tris 1.5 M (pH 8.8) 0.660

Glicina 1M 0.500

SDS 10% 0.200

H2O destilada 0.747

TEMED 0.003

Amonio persulfato 10% 0.050

105

Una vez el gel separador ha polimerizado, se prepara el gel compactador

(stacking gel) con una composición de glicerol del 35% y de 4% acrilamida-bis

acrilamida (99:1) (Tabla 12). Igual que antes, el amonio persulfato al 10% y el TEMED

son los últimos componentes que se añaden a la solución. Inmediatamente después, se

mezcla la solución, se vierte en el soporte de fundición y se coloca el peine para

muestras vigilando que no queden burbujas.

Tabla 12. Componentes y volúmenes para la realización del gel compactador.

Gel compactador Volumen (µl)

Glicerol 100% 1.500

Acrilamida-bis 30% (99:1) 1.334

Tris 0.5 M (pH 6.7) 0.700

EDTA 100 mM (pH 7.0) 0.200

SDS 10% 0.200

H2O destilada 1.680

TEMED 0.003

Amonio persulfato 10% 0.050

Mientras polimeriza el gel compactador se preparan los tampones, el superior y

el inferior. El tampón inferior (lower buffer) consiste en 50 mM de Tris (base), 75 mM

de glicina y 0.05% w/v de SDS, mientras que el tampón superior (upper buffer)

equivale a seis veces la concentración del tampón inferior.

Una vez tenemos el gel polimerizado, se coloca en la cubeta o tanque, se añade el

tampón superior y se preparan las proteínas (Figura 20). En primer lugar, se calcula la

cantidad de proteína para un volumen final de 20 µl. En general, se utiliza una

concentración de proteína de 5 a 15 µg en cada muestra y se utiliza el tampón de lisis

para ajustar el volumen. Se pipetea el volumen de proteína y de tampón de lisis en un

106

tubo Eppendorf de 0.2 ml y se añade 2 µl de DTT (1,4-Dithiothreitol) y 4 µl de laemmli

buffer 5X. Se mezclan bien los componentes y se desnaturalizan las proteínas a una

temperatura de 95 ºC durante 3 minutos.

Figura 20. Tanque con el gel de poliacrilamida.

Antes de colocar las proteínas en los pozos, se quita el peine y se lava el pozo con

un poco de tampón superior para eliminar los residuos no polimerizados. Seguidamente,

se cargan las proteínas en el pozo correspondiente dejando un pozo libre para cargar 10

µl de marcador de peso molecular o ladder. Finalmente, se añade el tampón inferior y

dejamos correr el gel durante 20 horas a 70 voltios a una temperatura aproximada de 4

ºC (Figura 21).

Figura 21. Tanque con el gel de poliacrilamida sin el peine y con los dos tampones, el superior y el inferior (izquierda). Tanque con el gel de poliacrilamida conectado a la fuente de energía (derecha).

107

Pasadas las 20 horas, se saca el gel con cuidado, se lava con agua destilada un par

de veces y se tiñe con azul Coomassie R-250 durante 1 hora. Después, se elimina el

exceso de tinción con uno o dos lavados de agua destilada. Finalmente, se realiza la

cuantificación de las proteínas de las isoformas MHC-I y MHC-II por densitometría

mediante el programa ImageJ (Figura 22).

Figura 22. SDS-PAGE donde vemos las bandas correspondientes a la MHC-I, MHC-II y MHC-IIM.

En el futuro queremos ampliar la muestra de primates y comparar la expresión de

los ARNm de las isoformas MHC-I y MHC-II con la cuantificación de su proteína

mediante SDS-PAGE. Esto puede aportar nueva información en relación con las

características funcionales de los músculos elevadores de la mandíbula que puede

complementar a la obtenida por otros métodos.

MHC-IIM

MHC-II MHC-I

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Expresión de las isoformas de la cadena pesada de la