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ii
INSTITUTO AGRONÔMICO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA
TROPICAL E SUBTROPICAL
EXPRESSÃO DIFERENCIAL PARA A TOLERÂNCIA
A ESTRESSE INDUZIDO POR ALUMÍNIO EM Coffea
arabica.
BÁRBARA REGINA BAZZO
Orientador: Dr. Carlos Augusto Colombo
Dissertação submetida como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre em
Agricultura Tropical e Subtropical, Área de
Concentração em Genética, Melhoramento e
Biotecnologia Vegetal
Campinas, SP
2012
Ficha elaborada pela bibliotecária do Núcleo de Informação e Documentação do Instituto Agronômico B634e Bazzo, Bárbara Regina Expressão diferencial para a tolerância a estresse induzido por alumínio em coffea arabica./ Bárbara Regina Bazzo. Campinas, 2012. 64 fls Orientador: Carlos Augusto Colombo Dissertação (Mestrado) em Agricultura Tropical e Subtropical – Instituto Agronômico 1 Café – alumínio 2. Solos ácidos I. Colombo, Carlos Augusto II. Título CDD 633.73
iii
DEDICATÓRIA
A realização deste trabalho muito se deve a ajuda e ao apoio de muitas pessoas. Dedico essa
dissertação às pessoas que participaram da transformação desse projeto em realização. Em
especial à minha família. Ela fez a diferença, pois quando o tempo fechou e a tempestade
chegou, ela estava lá, pronta para me levantar. Ao meu orientador, amigo e segundo pai
Carlos, que esteve comigo, me guiou, me explicou, me ajudou, riu comigo. À minha amiga
Daiane, que além da amizade e dos conselhos, ajudou na elaboração e realização do projeto e
dispensou de suas horas para que o trabalho se realizasse; às minhas amigas de laboratório
Míriam, Paula, Manu, Aline, Luciana, Lúcia e Daiana que incentivaram minhas idéias e
acreditaram em mim.
Obrigada a todos.
iv
AGRADECIMENTO
Ao IAC e a Pós-Graduação, pela oportunidade.
Aos professores e funcionários pelo tempo e pela contribuição.
A CAPES, pela concessão da bolsa.
Ao Pólo APTA de Mococa, por fornecer o material de estudo.
v
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS .............................................................................................................. vi
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. vii
RESUMO ................................................................................................................................ viii
ABSTRACT .............................................................................................................................. ix
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 10
2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................................. 11
2.1 O Café no Brasil ................................................................................................................. 12
2.1 O gênero Coffea .................................................................................................................. 11
2.2 Solos Ácidos ....................................................................................................................... 14
2.3 O Alumínio Fitotóxico ....................................................................................................... 14
2.4 Estresse Oxidativo .............................................................................................................. 17
2.5 Mecanismos de Defesa ....................................................................................................... 18
2.5.1 Mecanismos simplásticos e apoplásticos ......................................................................... 19
2.6 Genética e Biologia Molecular da Defesa ao Alumínio ..................................................... 22
3 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 25
3.1 Material Vegetal ................................................................................................................. 25
3.2 Ensaio Biológico ................................................................................................................ 25
3.2.1 Germinação ...................................................................................................................... 25
3.2.2 Indução de estresse ao alumínio ...................................................................................... 26
3.3 Extração de RNA ................................................................................................................ 26
3.4 Purificação do RNA ........................................................................................................... 27
3.5 Síntese de cDNA ................................................................................................................ 27
3.6 Mineração de Dados e Desenho de Primers ....................................................................... 27
3.6.1 Busca de sequências ........................................................................................................ 27
3.6.2 Desenho de Primers ......................................................................................................... 28
3.7 Reações de qRT-PCR ......................................................................................................... 28
3.8 Análise dos Dados .............................................................................................................. 28
3.8.1 Estabilidade do Normalizador ......................................................................................... 29
3.8.2 Teste de Eficiência........................................................................................................... 29
3.8.3 Quantificação relativa ...................................................................................................... 29
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 30
4.1 Ensaio Biológico ................................................................................................................ 30
4.2 Extração de RNA ................................................................................................................ 31
4.3. PCR quantitativa ................................................................................................................ 33
4.3.1 Mineração de Dados e Desenho de Primers .................................................................... 33
4.3.1.1 Busca de sequências ..................................................................................................... 33
4.3.1.2 Desenho de primers ...................................................................................................... 35
4.4 Análise dos Dados .............................................................................................................. 37
4.4.1 Estabilidade do Normalizador ......................................................................................... 37
4.4.2 Teste de Eficiência........................................................................................................... 37
4.4.3 Quantificação relativa ...................................................................................................... 40
4.5 Contigs 5351, 1441 e 6750 relacionados a detoxificação interna de espécies reativas de
oxigênio. ................................................................................................................................... 46
4.6 Contigs 3026, 17520 relacionados a utilização de ácidos orgânicos. ................................. 50
5 CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 53
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 54
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Genes relacionados à defesa contra o estresse causado pelo íon alumínio Nome da
enzima, organismo de origem e referência no banco de dados
NCBI......................................................................................................................33
Tabela 2 - Contigs de Coffea arabica potencialmente relacionados com o estresse provocado
pelo íon alumínio. Enzima, contigs de C. arabica no PBGC, valor de e-value e
similaridade com sequências de outros
organismos.............................................................................................................34
Tabela 3 – Enzima e contigs similares do PBGC selecionados para a síntese dos primers;
comprimento (Pb), temperatura de anelamento (Tm) e porcentagem de
nucleotídeos guanina e citosina (% CG) das sequências de oligonucleotídeos
direto e reverso obtidas pelo programa PRIMER EXPRESS (Applied
Biosystems)............................................................................................................36
Tabela 4 - Eficiência dos genes alvo potencialmente relacionados com a resposta
antioxidativa induzida pela toxicidade ao alumínio em C. arabica e normalizador
calculado de acordo com o coeficiente angular da reta (slope) (RAMAKERS et
al., 2003)................................................................................................................38
Tabela 5 - Quantificação relativa (QR) ao calibrador (controle negativo) pelo método de
PFAFFL (2001) de moléculas alvo nas cultivares Catuaí e Icatu sob estresse por
alumínio nos tempos 1 hora, 12 horas e 48 horas (duas repetições por amostra –
C1, C1‟)..................................................................................................................42
Tabela 6 – Expressão diferencial de moléculas alvo induzidas por alumínio entre amostras de
Catuaí e Icatu sob três tratamentos: 1 hora, 12 horas e 48 horas. Moléculas alvo
induzidas pelo alumínio com expressão diferencial significativa (EDAl ≥ 2) em
negrito....................................................................................................................45
Tabela 7 – Expressão diferencial de moléculas alvo induzidas por alumínio entre amostras de
Icatu e Catuaí sob três tratamentos: 1 hora, 12 horas e 48 horas. Moléculas alvo
induzidas pelo alumínio com expressão diferencial significativa (EDAl ≥ 2) em
negrito....................................................................................................................45
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Possíveis mecanismos de toxicidez e detoxificação ao alumínio utilizado pelas
plantas (KOCHIAN et al., 2005)...........................................................................20
Figura 2 - Medição de raízes de plântulas de Coffea arabica Catuaí com 40 dias de
germinação.............................................................................................................31
Figura 3 - Plântulas de Coffea arabica Catuaí e Icatu submetidas a estresse por alumínio em
cultivo hidropônico................................................................................................31
Figura 4 - Eletroforese em gel de agarose 1% para verificação da integridade das amostras de
RNA total extraído de pontas de raízes de café mostrando as bandas 28S e
18S..........................................................................................................................32
Figura 5 - Curva padrão gerada para ilustrar o cálculo de eficiência de amplificação do gene
Glutationa Redutase a partir de RNA extraído de pontas de raízes de café. Em
destaque, o coeficiente angular da reta (slope) e o valor da eficiência
(E)...........................................................................................................................37
Figura 6 - Curvas de amplificação da diluição seriada com sete concentrações de cDNA
(concentrado e seis diluições) para análise de eficiência dos genes ACT (Actina -
A), APX (Ascorbato Peroxidase - B), CAT (Catalase - C), FER (Ferritina - D),
GLUTRed (Glutationa Redutase - E) e SOD (Superoxido Dismutase - F)
(Continua)..............................................................................................................39
Figura 7 - Curva de amplificação para o gene APX para o genótipo Icatu nos tempos 1 hora,
12 horas e 48 horas (duas repetições e controles para cada tempo) gerada pelo
software 7500 Fast System SDS (Sequence Detection System) v 1.3.1 (Applied
Biosystems)............................................................................................................40
Figura 8 - Curva de melting para o gene APX no genótipo Catuaí nos tempos 1 hora, 12
horas e 48 horas (duas repetições e controles para cada
tempo)................................................................................................................... 40
Figura 9 - Quantificação relativa (QR) ao calibrador (controle negativo) de moléculas alvo
nas cultivares Catuaí e Icatu sob estresse por alumínio nos tempos 1 hora, 12
horas e 48 horas (C1, C12, C48 – Catuaí; I1, I12, I48 – Icatu)
(Continua)..............................................................................................................43
‘Figura 9 - Quantificação relativa (QR) ao calibrador (controle negativo) de moléculas alvo
nas cultivares Catuaí e Icatu sob estresse por alumínio nos tempos 1 hora, 12
horas e 48 horas (C1, C12, C48 – Catuaí; I1, I12, I48 – Icatu)
(Continuação)‟......................................................................................................44
viii
Expressão Diferencial para a Tolerância a Estresse Induzido por Alumínio em Coffea
arabica.
RESUMO
As principais regiões agrícolas no Brasil estão localizadas em solos ácidos que possuem
teores de alumínio em quantidades suficientes para alterar o crescimento de muitas espécies
de plantas cultivadas. A ação do alumínio na planta é diretamente na raiz, inibindo o
crescimento do ápice radicular e a formação de raízes secundárias, resultando em um sistema
radicular pouco desenvolvido e com limitações para mais bem explorar água e nutrientes,
sobretudo de camadas profundas do solo. Embora haja um número grande de pesquisas a
respeito dos efeitos tóxicos do alumínio e dos mecanismos de defesa a este íon em várias
plantas de valor econômico, poucos trabalhos relatam os seus efeitos na cultura do café. A fim
de analisar a expressão diferencial de genes potencialmente relacionados com a tolerância
desta cultura ao alumínio, duas cultivares comerciais de Coffea arabica foram submetidas a
um ensaio hidropônico sob tratamento com e sem alumínio (controle negativo) nos tempos 1
hora, 12 horas e 48 horas. Os genes diferencialmente expressos foram quantificados por meio
da técnica de PCR Quantitativo em Tempo Real (q-PCR). Dos sete genes analisados
relacionados com o estresse oxidativo causado pelo estresse ao alumínio, três (Contigs 1441,
5351 e 6750) revelaram aumento de expressão relativa em raízes na cultivar Icatu em relação
a cultivar Catuaí e dois, Contigs 3026 e 17520 na cultivar Catuaí em relação à Icatu, todos
descritos na literatura como potencialmente induzidos. Os contigs são similares aos genes
ascorbato peroxidase, superoxido dismutase, catalase, malato dehidrogenase e citrato sintase,
conforme literatura. Nossos resultados corroboram que estudos posteriores de caracterização
funcional sejam realizados em que poderão ser utilizados em projetos de seleção assistida ou
ensaios de transgenia visando à produção de cultivares de café mais tolerantes a solos ácidos.
Palavras-chave: Estresse abiótico, expressão gênica, estresse oxidativo, PCR Quantitativo em
Tempo Real (q-PCR), Sustentabilidade.
ix
Differential Expression to Tolerance of Aluminum - Induced Stress in Coffea arabica.
ABSTRACT
The main Brazilian agricultural regions areas are located in acid soils, which have
exchangeable aluminum contents enough to damage the growth of many cultivated plants
species. The aluminum acts directly in plant roots systems, inhibiting the apex growth and the
formation of secondary roots, resulting in a poorly developed root system and limitations to
better exploit water and nutrients, especially of deep soil layers. Despite the researches in
several important cultivated plants about the aluminum toxic effects and it defense
mechanisms, few reports the effects of this ion in coffee. In order to analyze the differential
expression patterns of genes related to potentially aluminum tolerance that culture, two Coffea
arabica cultivars were tested under hydroponic treatment with and without aluminum
(negative control) in 1 hour, 12 hours and 48 hours. The differentially expressed genes were
quantified by Real-Time Quantitative PCR (q-PCR). Of the seven genes related to stress by
aluminum stress, three (Contig 1441, Contig 5351 and Contig 6750) revealed a relative
expression increased in roots growing in Icatu over Catuaí and two, Contig 3026 e Contig
17520 in Catuaí over Icatu, all described in the literature as potentially induced. The contigs
1441, 5351, 6750, 3026 and 17520 are similar to described genes ascorbate peroxidase,
superoxide dismutase, catalase, malate dehydrogenase and citrate synthase, according to the
literature. Our results suggest that later functional characterization studies should be
conducted and, if its functions are confirmed, may be used in assisted selection
or transgenic experiments projects aimed at coffee cultivars more tolerant to acid soils.
Keywords: Abiotic stress, gene expression, oxidative stress, Real-Time Quantitative PCR (q-
PCR), Sustainability.
10
1 INTRODUÇÃO
Os solos brasileiros se caracterizam por serem ácidos, com pH por volta de 5,1, não
recomendado para o desenvolvimento do cafeeiro, cuja faixa aceitável está entre 6 e 6,5
(COOXUPE, 2008). O alumínio é o terceiro elemento químico mais abundante na crosta
terrestre, depois do oxigênio e do silício, com 7,1%, e um dos principais fatores abióticos
limitantes da agricultura praticada em solos acidificados.
Segundo estimativas do CONAB (2011), Minas Gerais é o maior estado produtor de
café, com 68% do produto beneficiado, sendo as regiões Sul de Minas e Cerrado as mais
importantes e o solo dessas duas regiões é predominantemente ácido.
A ação do alumínio na planta é diretamente na raiz, inibindo o crescimento do ápice
radicular e a formação de raízes secundárias (KOCHIAN et al., 2004), o que resulta em um
sistema radicular pouco desenvolvido e incapaz de explorar camadas profundas do solo,
diminuindo a capacidade da planta em absorver água e nutrientes.
Pela presença dos mecanismos de tolerância e resistência, o alumínio é uma força
seletiva importante na natureza, tornando diversas espécies adaptadas ao estresse abiótico
(KOCHIAN et al., 2004).
As plantas desenvolveram mecanismos de proteção contra os efeitos tóxicos ao
alumínio, os quais podem ser divididos em duas classes: i) os mecanismos simplásticos ou de
tolerância, que permitem a imobilização do metal ou neutralização do mesmo dentro da
célula; ii) mecanismos apoplásticos ou de resistência, que impedem a entrada em função da
sua imobilização na rizosfera. (KOCHIAN, 1995).
Nos processos apoplásticos, a defesa contra o alumínio, mediada pela exsudação de
ácidos orgânicos e outros compostos, parece ser o mais comum. Esses quelantes incluem os
malatos, citratos e oxalatos, quem podem se ligar ao alumínio dentro ou fora da célula
(mecanismos simplásticos ou apoplásticos). Quando ligados dentro da célula, o alumínio
permanece inativo dentro de vacúolos ou no citoplasma, prevenindo seus efeitos negativos
nos processos celulares (KOCHIAN et al., 2002).
O estresse oxidativo, no entanto, é um evento biológico originado por inúmeros
estresses, sendo um mecanismo secundário. Muitos dos estresses abióticos conhecidos, como
seca, salinidade, temperatura e alumínio quebram o balanço metabólico das células,
resultando no aumento de produção das espécies reativas de oxigênio (EROs) (MITTLER,
11
2002). Estas, quando se acumulam nos tecidos, podem levar a alteração da atividade das
enzimas do complexo antioxidativo, que desempenham papel importante no combate a esses
radicais e são requeridas quando o equilíbrio entre produção e remoção das EROs é afetado
por fatores ambientais adversos (como o estresse por alumínio) (APEL & HIRT, 2004).
Dentro desta classe de enzimas, as mais importantes são a Superoxido Dismutase
(SOD) (EC number 1.15.1.1), Catalase (CAT) (EC number 1.11.1.6) e enzimas do complexo
Ascorbato-Glutationa (APX, GPX) (EC number 1.11.1.11, 1.11.1.9).
Respostas adequadas às mudanças ambientais são cruciais para o crescimento e
sobrevivência da planta. No entanto, os mecanismos de toxicidade/defesa ao íon Al+3
e as
respostas moleculares e bioquímicas que permeiam estas respostas em relação ao estresse não
são bem esclarecidas para o café. O grande número de genes descritos na literatura envolvidos
nos mecanismos de resistência e/ou tolerância das plantas mostra a gama de vias metabólicas
que o alumínio afeta, sugerindo a presença de tantos outros genes presentes nesses processos
bioquímicos. Assim, o presente estudo pretende utilizar ferramentas da biologia molecular
para: (I) quantificar o produto da expressão dos genes potencialmente relacionados aos
mecanismos de defesa aos efeitos tóxicos do alumínio; (II) analisar os genes encontrados
quanto ao padrão de transcrição gênica temporal das raízes do material de estudo; (III) e
relacionar os genes estudados com as diferentes respostas entre as cultivares Catuaí e Icatu. A
descoberta de tais genes amplia o conhecimento em relação aos mecanismos de defesa do
cafeeiro e abre perspectivas para novas estratégias de melhoramento genético visando ao
desenvolvimento de cultivares tolerantes a solos ácidos.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 O gênero Coffea
O cafeeiro pertence à família Rubiaceae, do gênero Coffea. A família Rubiaceae
abrange mais de 10 mil espécies agrupadas em 630 gêneros. O gênero Coffea se divide em
quatro seções: Eucoffea que apresenta 24 espécies, Marcarocoffea com 18 espécies,
Argocoffea com 11 espécies e Paracoffea com 13 espécies (BRIDSON, D. M. &
VERDCOURT, B., 1988). A sessão de maior importância econômica é a Eucoffea, pois as
espécies Coffea arabica L. e Coffea canephora Pierre estão dentro. São as espécies mais
cultivadas para o consumo do café, respondendo, respectivamente, por 70% e 30% do café
12
comercializado no mundo sendo, portanto as de maior importância econômica dentro das
inúmeras espécies existentes (MELO, B. & SOUZA, L. B., 2010).
C. arabica é uma espécie tetraplóide (2n = 4x = 44 cromossomos) e autógama, com
apenas 10% de polinização cruzada. Sua origem é de terras altas, a mais de 1000 m de altitude
da Etiópia e do Sudão, onde cresce em estado semi-silvestre nos estratos inferiores da floresta,
enquanto que C. canephora é diplóide (2n = 2x = 22 cromossomos) e alógama, sendo a
fecundação controlada por um sistema de incompatibilidade do tipo gametofítico (CONAGIN
& MENDES, 1961).
Segundo DAVIS et al. (2006) existem no total 103 espécies do gênero Coffea
distribuídas em 41 espécies na África, 59 na ilha de Madagascar e três nas Ilhas Mascarenhas.
2.2 O Café no Brasil
A produção cafeeira é uma atividade de grande impacto econômico, tanto pela
formação de capital no setor agrícola como pela geração de emprego nos diferentes setores da
economia, ou seja, a indústria, agricultura e o comércio. A empregabilidade nesses setores
chega ao número de três milhões e meio de empregos diretos, sendo um dos setores com
maior capacidade de geração de empregos no país. O café caracteriza-se por ser o segundo
maior produto do mundo em volume de negócios, perdendo apenas para o petróleo (CONAB,
2012; SAES & NAKAZONE, 2002).
O café foi trazido da Guiana Francesa em 1727, e quatro anos depois, já aconteciam as
primeiras exportações. Em 1849, a produção brasileira já atingia 40% da produção mundial e
chegou à casa dos 70% no período de 1925/1929; em 2007 foram 33,4 milhões de sacas
produzidas, em uma área de 2,7 milhões de hectares (CARVALHO, 2007).
O café é um dos produtos agrícolas brasileiros de maior importância econômica. O
Brasil é o maior produtor e exportador de café, com participação média de 24% nas
exportações mundiais. Em 2002, as exportações brasileiras bateram o recorde de 27,9 milhões
de sacas, o que representou uma porção de mercado de 32%, o maior dos últimos 12 anos
(SAES & NAKAZONE, 2004). Em 2011, o consumo deste produto aumentou 3,11%,
passando de 19,13 milhões de sacas para cerca de 20 milhões de sacas. Para 2012, a ABIC
(Associação Brasileira da Indústria de Café) espera um crescimento de 3,5% do volume
(ABIC, 2011). A estimativa de produção de café para 2012 é de que o país colherá entre 48,97
e 52,27 milhões de sacas do produto. Esse valor é um aumento de 12,6% a 20,2%, quando
comparada com a produção obtida na temporada anterior que foi de 43,48 milhões de saca.
(CONAB, 2012).
13
Segundo estimativas do CONAB (2011), o estado de Minas Gerais é o maior produtor,
com 68% do café beneficiado do país, sendo as regiões Sul de Minas e Cerrado as mais
importantes. Neste bioma o solo predominante (com abrangência de 46%) é o latossolo, cujas
características são a baixa fertilidade e a acidez (pH abaixo de 5,5). Além disso, nesses solos
normalmente são encontradas altas concentrações de Al+3
e baixos teores de Ca2+
e Mg2+
abrangendo as camadas superficiais e subsuperficiais (OLIVEIRA et al., 2005; EMBRAPA,
2007).
Em 1932, o Instituto Agronômico (IAC) deu início a um amplo estudo biológico e
agronômico do cafeeiro (C. arabica) e, particularmente, de seu melhoramento. Os estudos
envolviam sistemática, citologia, biologia da reprodução, genética e técnicas agronômicas,
tendo como objetivo, reunir informações básicas para o melhoramento da cultura
(CARVALHO, 2007). O melhoramento genético convencional tem obtido sucesso atendendo
o setor produtivo, realizando estudos pelos métodos tradicionais de cruzamentos e seleção de
progênies. Entretanto, hoje em dia, há a necessidade de ampliar o conhecimento e aplicar
novas abordagens tecnológicas para o melhoramento do cafeeiro.
A biotecnologia aplicada, através de técnicas de cultura de tecidos, marcadores
moleculares e transformação genética, tem-se revelado uma ferramenta importante de apoio
aos programas de melhoramento, auxiliando na identificação e avaliação de novos genótipos e
obtendo novos materiais genéticos em tempo reduzido.
O recente desenvolvimento de técnicas biomoleculares produziu enorme quantidade
de informações na área da genômica de plantas com importante potencial de aplicação no
melhoramento genético das espécies. O sequenciamento de ESTs (Expressed Sequences Tags)
em larga escala, por exemplo, nos permite dispor de um banco de genes cujas funções podem
atribuídas a determinadas características agronômicas de interesse agrícola.
No caso do café, como resultado do Projeto Brasileiro do Genoma Café, uma
iniciativa da FAPESP, Cenargen e do Consórcio Brasileiro de Pesquisas Cafeeiras, foram
produzidas cerca de 215 mil sequências ESTs de C. arabica, C. canephora e C. racemosa, a
partir do RNA extraído de diferentes tecidos e ou órgãos das plantas. Após tratamento por
ferramentas de bioinformática, esse banco ficou representado por cerca de 30 mil sequências
de genes putativos, que se encontram depositados em uma base de dados on – line. A partir do
conhecimento destas seqüências, pesquisas importantes e inéditas visando ao melhoramento
do café poderão ser realizadas (VIEIRA et al., 2006).
14
2.3 Solos Ácidos
Em torno de 30% da área da crosta terrestre é
que corresponde a mais de 50% dos solos potencialmente agricultáveis no mundo, sendo que
as regiões tropicais e subtropicais contam com a maior porção (60%) (VON UEXKÜLL &
MUTERT, 1995).
Os solos ácidos em regiões tropicais são úmidos, devido aos altos índices de
precipitação pluviométrica, fazendo com que os nutrientes solúveis do solo, como cálcio,
magnésio e potássio, sejam lixiviados e, consequentemente, quando não repostos, o pH do
solo diminuídos. Em pH baixo, os íons hidrogênios (H+) atuam sobre os minerais liberando
Al+3
que estava retido por cargas negativas de argila do solo. Assim, a quantidade de Al+3
em
solução aumenta com a acidez do solo (NOLLA & ANGHINONI, 2004). O alumínio é o
terceiro elemento químico mais abundante na crosta terrestre com 7,1%, e apresenta-se como
um dos principais fatores abióticos limitantes para a agricultura, chegando a restringir a
produção em mais da metade das terras agricultáveis na África, Ásia e América do Sul
(SILVA & SOUZA, 1998).
Os solos brasileiros se caracterizam por serem solos ácidos, com pH por volta de 5,1,
não recomendado para o desenvolvimento do cafeeiro, cuja faixa aceitável está entre 6 e 6,5
(COOXUPE, 2008).
O processo de acidificação é muitas vezes intensificado por práticas agrícolas, pela
mineração ou pelo descarte de resíduos (RAO et al., 1993), podendo ser corrigidos por
calagem, um processo de neutralização dos íons H+ e Al
3+. Entretanto, a aplicação de calcário
na superfície do solo não soluciona os problemas de acidez nas camadas inferiores e a
calagem a grandes profundidades geralmente não é possível por apresentar dificuldades
técnicas e econômicas (MARIA et al., 1993).
Por esta razão, o uso de cultivares tolerantes ao Al+3
torna-se a estratégia mais efetiva
para a produção cafeeira.
2.4 O Alumínio Fitotóxico
É importante compreender como o Al+3
apresenta o efeito tóxico na planta, quais os
mecanismos de defesas para o estresse e quais os efeitos fisiológicos, bioquímicos e genéticos
envolvidos na tolerância.
Vários estudos mostram os resultados do Al+3
em diversas plantas de interesse
comercial. A maior parte deles comprova que a ação do Al+3
na planta é diretamente na raiz,
inibindo o crescimento do ápice radicular e a formação de raízes secundárias, como
15
apresentado nos trabalhos de PANDA et al. (2003) com Vigna radiata, YANG et al. (2008)
com arroz e CAMBRAIA et al. (1991) com sorgo; o Al+3
ainda pode afetar a disponibilidade
de fósforo para a planta, importante nutriente para os processos de fotossíntese e respiração.
O café caracteriza-se por ser uma espécie moderadamente tolerante ao Al+3
, pois altas
saturações deste metal podem comprometer o desenvolvimento de raízes nas camadas
subsuperficiais do solo (RODRIGUES et al., 2001). Como conseqüência, pode ocorrer
retardamento do crescimento e desenvolvimento radicular, aumento do diâmetro das raízes e
diminuição do número de raízes secundárias (PAVAN & BINGHAN, 1982).
BRACCINI et al. (2000), utilizando o método do papel-solução, concluíram que a
cultivar Icatu Vermelho IAC 4045 foi a mais tolerante ao Al+3
. Entretanto MAURI et al.
(2004) mostraram que o clone originado de Catuaí Amarelo, em comparação com clones de
Coffea canephora, apresentou os maiores valores de massa seca, área e comprimento
radicular.
Em café, são encontradas diferenças entre as cultivares para a tolerância à toxicidade
ao Al+3
e entre linhagens dentro de uma mesma cultivar. Em um estudo com duas cultivares
de café, Catuaí e Icatu, RODRIGUES et al. (2006) notaram que a primeira cultivar mantinha
inalterada as concentrações de Al+3
nas folhas, mas as concentrações radiculares aumentavam
com a crescente saturação do metal. Já Icatu, mantinha as concentrações radiculares fixas,
transportando o Al+3
para as partes aéreas. Segundo os autores, os dados sugerem mecanismos
de resposta diferentes, em que Catuaí responderia com a compartimentalização e exclusão do
metal na raiz, enquanto que Icatu agiria com mecanismos de defesa interna, como a ação de
enzimas. Entretanto, pouco se sabe a respeito de compostos orgânicos ou genes envolvidos no
processo de combate ao estresse nesta cultura.
Em estudos realizados por BRACCINI et al. (1998a) com cultivares café, plantas
cultivadas em solução nutritiva com Al+3
apresentaram inibição de crescimento e
desenvolvimento das partes aéreas e da raiz, além de redução do comprimento da raiz
principal, altura das plantas e área foliar. Entretanto, os autores observaram aumento da
proliferação de raízes secundárias, o que foi interpretado como sendo uma resposta à restrição
da absorção por nutrientes. Num segundo estudo, os mesmos autores observaram ainda uma
redução de concentração de fósforo e cálcio nas folhas superiores e inferiores devido à
retenção desses minerais nas raízes (BRACCINI et al., 1998b).
Os efeitos do Al+3
na nutrição mineral de plantas dependem, além das condições
experimentais, da cultura e do nutriente envolvido no estudo. O Al+3
pode afetar diretamente a
16
absorção de fósforo pela precipitação de fosfato de alumínio na raiz, impedindo-o de
participar de processos de transferência de energia (CLARKSON, 1966).
Devido à competição catiônica, o Al+3
pode também inibir a absorção de cálcio. Seu
transporte dentro das células é energicamente passivo (DELHAIZE & RYAN, 1995) e pode
ser deslocado pela competição por ligantes ou pela redução da diferença do potencial elétrico
da membrana (RENGEL, 1992) que é fundamental para a estabilidade celular. O Al+3
se liga a
moléculas de pectina na parede celular, por fazer uma ligação mais forte e rápida do que o
Ca2+
. O deslocamento leva a uma situação de rigidez, o que ocasiona uma menor capacidade
de extensibilidade, característica essa necessária para expansão celular (KOCHIAN et al.,
2004).
Dentro da célula, os íons Al+3
interagem com vias de transdução de sinais relacionadas
com o cálcio. A exposição do metal pode levar a alterações nos níveis citosólicos de Ca2+
, que
por sua vez afetam a atividade de enzimas como a fosfolipase C da via do fosfoinositídeos
(KOCHIAN et al., 2004).
A rápida resposta da raiz indica que num primeiro momento o Al+3
inibe a expansão e
elongação das células das raízes, e depois a divisão celular também passa a ser inibida
(KOCHIAN, 1995). O sítio da toxicidade do Al+3
está localizado no ápice da raiz e desta
forma, as pesquisas envolvendo Al+3
são focadas nestas regiões (RYAN et al., 1993;
SIVAGURU et al., 1999).
A intoxicação por esse elemento resulta, então, em um sistema radicular pouco
desenvolvido e incapaz de explorar camadas profundas do solo, diminuindo a capacidade da
planta em absorver água e nutrientes. Como resultado, as plantas sensíveis ao Al+3
apresentam
maior suscetibilidade à deficiência hídrica e nutricional, ocasionando perdas na produtividade
e instabilidade de produção das culturas.
Os efeitos causados pelo Al+3
nas raízes são visíveis com pouco tempo de indução do
estresse, que são seguidos por efeitos secundários em longo prazo, não causados diretamente
pelo Al+3
, mas como conseqüência a esse estresse (KOCHIAN et al., 2002).
O estresse oxidativo pode ser considerado um efeito secundário importante. É uma
condição biológica causada pelo desequilíbrio entre a produção de EROs (Espécies Reativas
de Oxigênio) e a desintoxicação do organismo. Em plantas tolerantes submetidas a essas
condições, a enzima superóxido dismutase tem papel importante na decomposição de
superóxidos e sua atividade aumentada em trigo (BABOURINA et al., 2006), soja
(CAKMAK & HORST, 1991), triticale (cultivar sensível) (LIU et al., 2008), Arabidopsis
thaliana (RICHARDS et al., 1998), milho (ROCHA, 2006) e arroz (SHARMA e DUBEY,
17
2007). O estresse oxidativo também causa a peroxidação de lipídeos em soja (CAKMAK &
HORST, 1991), arroz (MERIGA et al., 2004), tabaco (ONO et al., 1995; YIN et al., 2010).
Em estudos com milho (WANG et al., 2011) foi detectada a oxidação de proteínas após a
inibição do crescimento radicular pelo Al+3
, algo até então desconhecido em plantas,
indicando que existem outros alvos da toxidez deste íon (BOSCOLO et al., 2003).
2.5 Estresse Oxidativo
Em muitas situações de estresse abiótico, como seca, salinidade, temperatura e Al+3
,
ocorre quebra do balanço metabólico das células, resultando no aumento de produção das
espécies reativas de oxigênio (MITTLER, 2002).
A evolução do processo metabólico aeróbio, como a respiração e a fotossíntese, leva à
produção de EROs nas mitocôndrias, cloroplastos e peroxissomos. Originadas a partir da
transformação de O2 em H2O, essas espécies intermediárias do oxigênio incluem os radicais
superóxidos (O2-•), peróxido de hidrogênio (H2O2), radical hidroxila (OH
•) e o oxigênio
singlet. O oxigênio que origina esses radicais é participante da cadeia respiratória, mas uma
parte escapa, resultando na redução parcial do oxigênio molecular (MITTLER, 2002). Esses
radicais são formados durante funções metabólicas normais ou induzidos por estímulos
ambientais. Quando se acumulam nos tecidos, podem levar a alteração da atividade das
enzimas do complexo antioxidativo, que desempenham papel importante no combate a esses
radicais e são requeridas quando o equilíbrio entre produção e remoção das EROs é afetado
por fatores ambientais adversos (APEL & HIRT, 2004).
Dentro desta classe de enzimas, as mais importantes são a Superoxido Dismutase
(SOD) (EC number 1.15.1.1), Catalase (CAT) (EC number 1.11.1.6) e enzimas do complexo
Ascorbato-Glutationa (APX, GPX) (EC number 1.11.1.11, 1.11.1.9). Elas formam uma
maquinaria eficiente e a SOD age na primeira linha de frente contra as EROs, dismutando os
superóxidos em H2O2. Os superóxidos são produzidos em vários compartimentos celulares,
como peroxissomos, mitocôndrias, cloroplastos e glioxissomos. Assim, a SOD também é
encontrada em todos esses lugares e baseado no co-fator metal usado pela enzima, ela é
classificada em: SOD-ferro (FeSOD) (cloroplasto), SOD-manganês (MnSOD) (mitocôndria e
peroxissomo) e SOD-cobre e zinco (Cu-ZnSOD) (cloroplasto e citosol) (ALSCHER et al.,
2002).
Nas plantas, o substrato mais importante para detoxificação do H2O2 é o
ascorbato. Após a dismutação do superóxido para H2O2, este oxidante não pode ser
18
acumulado, por exemplo, em cloroplastos, onde pode oxidar grupos tiol, importantes para
enzimas envolvidas na fotossíntese. A CAT catalisa a reação de quebra do H2O2 em água e
oxigênio, junto com as enzimas APX e GPX e Glutationa S-Transferase (EC number
2.5.1.18) (NOCTOR & FOYER, 1998).
Nesse ciclo, são empregadas quatro enzimas: ascorbato peroxidase (APX), dehidroascorbato
redutase (EC number 1.8.5.1) (DHA), monodehidroascorbato redutase (MDA) e Glutationa
Redutase (GR) (EC number 1.6.4.2). O H2O2 é removido pela APX através do ascorbato
como redutor, formando o radical monodehidroascorbato (MDA) (APEL & HIRT, 2004;
MITTLER, 2004).
Respostas adequadas às mudanças ambientais são cruciais para o crescimento e
sobrevivência da planta, contudo, os mecanismos moleculares e bioquímicos que permeiam
estas respostas em relação ao estresse com Al+3
, ainda são pouco compreendidos.
Pesquisas envolvendo a análise da atividade destas enzimas têm sido feitas em várias
culturas, como Allium cepa L. (ACHARY et al., 2008), milho (BOSCOLO et al., 2003),
triticale (LIU et al, 2008), Arabidopsis thaliana (RICHARDS et al., 1998), batata (TABALDI
et al., 2007), arroz (SHARMA & DUBEY, 2007), cevada (ŠIMONOVIČOVÁ et al., 2004) e
tabaco (YIN et al., 2010).
2.6 Mecanismos de Defesa ao Al+3
As plantas desenvolveram diversos mecanismos de proteção contra os efeitos tóxicos
ao Al+3
, os quais podem ser divididos em duas classes: 1) os mecanismos simplásticos ou de
tolerância, que permitem a imobilização do metal ou neutralização do mesmo dentro da
célula; 2) mecanismos apoplásticos ou de resistência, que impedem a entrada em função da
sua imobilização na rizosfera (KOCHIAN, 1995).
Os mecanismos simplásticos permitem acumular o Al+3
em locais específicos da
planta, que por sua vez entraria no simplasto e a tolerância seria alcançada através de sua
imobilização, compartimentalização ou detoxificação. Tal via incluiria quelação do Al+3
no
citosol, compartimentalização no vacúolo e expressão de proteínas ligantes de Al+3
(KOCHIAN, 1995; DELHAIZE & RYAN, 1995; TAYLOR, 1988).
Os mecanismos apoplásticos ou de resistência, no entanto, impedem a entrada do
metal pela raiz, protegendo os sítios intracelulares sensíveis ao ataque do íon. Estes
mecanismos incluem: imobilização do Al+3
na parede celular, permeabilidade seletiva da
membrana plasmática, formação de uma barreira de pH na rizosfera, exsudação de quelantes e
efluxo de Al+3
(TAYLOR, 1988; KOCHIAN et al., 2004).
19
2.6.1 Mecanismos simplásticos e apoplásticos
Pela presença dos mecanismos de tolerância e resistência, o Al+3
é uma força seletiva
importante na natureza, tornando diversas espécies adaptadas ao estresse abiótico (KOCHIAN
et al., 2004).
Os mecanismos de resistência ao Al+3
baseiam-se na formação de complexos com
carboxilatos. Os mecanismos de exclusão envolvem a liberação destes ânions através de
canais aniônicos ligados ao Al+3
na membrana plasmática, enquanto que os mecanismos de
desintoxicação interna envolvem a quelação do Al+3
citosólico por ânions carboxilato com o
subseqüente seqüestro no vacúolo através de transportadores (Figura 1) (KOCHIAN et al.,
2005).
Nos processos apoplásticos, a defesa contra o Al+3
, mediada pela exsudação de ácidos
orgânicos e outros compostos, parece ser o mais comum.
Esses quelantes incluem os malatos, citratos e oxalatos, que podem se ligar ao Al+3
dentro ou fora da célula (mecanismos simplásticos ou apoplásticos). Quando ligados dentro
da célula, o Al+3
permanece inativo dentro de vacúolos ou no citoplasma, prevenindo seus
efeitos negativos nos processos celulares.
A primeira evidencia na literatura de resistência ao Al+3
mediada por ácido orgânico
foi descrita por MIYASAKA et al. (1991), que demonstraram que cultivares de feijão
(Phaseolus vulgaris) tolerantes ao Al+3
excretavam oito vezes mais citrato que os genótipos
sensíveis. O citrato é um importante quelador do Al+3
e o complexo Al+3
-carboxilato não é
absorvido pelas raízes.
Como apresentado em soja (SHEN et al., 2005), Lupinus albus (GERKE et al., 2007;
WANG et al., 2007) e feijão (Phaseolus vulgaris L.) (RANGEL et al., 2007), a exsudação de
citrato ou ácido cítrico pelas raízes das plantas é um mecanismo primordial para caracterizar
tolerância ao Al+3
e permitir o crescimento da planta sob a condição de estresse.
Além do citrato, outros ácidos orgânicos são de grande importância para a
imobilização e liberação do Al+3
. Plantas de espinafre (Spinacia oleracea L. cv. Quanneng)
mantidas em cultivo protegido, sob condições de estresse em Al+3
, mostraram efluxo de
oxalato como forma de resistência, com inicio em um período de 30 minutos sob o estresse
abiótico e duração de até 6 horas (YANG et al., 2005). Este mesmo composto, em trigo
mourisco fornece tolerância à planta por meio da complexação do metal nas folhas, formando
um composto insolúvel com o metal que impede sua ligação com os compostos celulares (MA
et al., 1998).
20
Assim como a planta pode produzir substâncias que complexam e exsudam o Al+3
, os
compostos fenólicos (classe de antioxidantes importantes para o combate ao envelhecimento
das células) colaboram para os mecanismos de tolerância. TOLRÀ et al.(2009) sugerem que
esses compostos têm função no processo de desintoxicação da planta, fornecendo proteção
contra frações do Al+3
que escapam dos mecanismos de resistência ao metal. Eles observaram
em milho Cateto, que apresenta tolerância significativa ao Al+3
, que o nível de catecol, ácido
cafeico e catequinas (compostos antioxidantes) foi maior nesta raça do que nas plantas
sensíveis. Em Sorghum bicolor, os níveis de compostos fenólicos foi maior nas plantas
sensíveis, salientando a função destes na proteção da planta (PEIXOTO et al., 2007).
Figura 1 - Possíveis mecanismos de toxicidez e detoxificação ao Al+3
utilizado pelas plantas
(KOCHIAN et al., 2005).
21
Diversos estudos fisiológicos e moleculares têm investigado os mecanismos de defesa
através dos canais iônicos na membrana plasmática que transportam estes compostos, e nos
últimos anos eles parecem ser a chave para atingir a resistência ao Al+3
. O primeiro gene
relacionado ao transporte de compostos foi identificado em trigo (Triticum aestivum), o
TaALMT1, um transportador de malato ativado por Al+3
. Ele está expresso especificamente e
constitutivamente em ápice de raízes de linhas de trigo tolerantes ao Al+3
(SASAKI et al.,
2004).
ZHANG et al. (2001) mostraram que ânions ativados por Al+3
ocorrem em
protoplastos de ápices de raízes tanto de genótipos tolerantes quanto genótipos sensíveis de
trigo. Entretanto, em isolinhas resistentes, o fluxo de íons foi melhor e permaneceu mais ativo
do que nas isolinhas sensíveis. Essas descobertas mostraram que os mecanismos internos de
detoxificação são os mesmos, independentemente do genótipo, porém aparecem mais
abundantes e mais ativos naqueles resistentes ou tolerantes.
Há três possíveis cenários para regulação do Al+3
mediada por canais de ânions que
regulam o efluxo de ácidos orgânicos: (I) o Al+3
se liga diretamente ao canal e ele se abre; (II)
o Al+3
se liga a um receptor desconhecido que medeia a abertura de canais por meio de uma
via de sinalização; (III) o Al+3
entra na célula e inicia uma cascata de eventos que envolve
componentes citoplasmáticos e da membrana plasmática (KOCHIAN et al., 2002).
Os três ácidos orgânicos descritos (oxalato, citrato e malato) possuem perfis de
quelação próprios, com diferentes habilidades para isso. A partir disso, dois tipos de padrões
para a secreção de ácidos orgânicos têm sido identificados, de acordo com o tempo entre
exposição-secreção: o padrão I, em que não há diferença de tempo entre a adição de Al+3
e o
começo da secreção do ácido (resposta rápida); e o padrão II, em que existem algumas horas
de diferença entre os dois eventos (MA et al., 2001). O primeiro perfil indica que o Al+3
ativa
canais iônicos pré-existentes e a indução dos genes não é requerida, enquanto que o padrão II
mostra que a indução é requerida, e esses genes estariam relacionados ao metabolismo e ao
transporte dos ácidos orgânicos. (MA & FURUKAWA, 2003)
Embora vários trabalhos mostrem a eficiência dos ácidos orgânicos no combate ao
Al+3
, este não é o único mecanismo de defesa conhecido. Em 2005, PIÑEROS et al.
mostraram que tanto genótipos resistentes quanto tolerantes de milho possuíam uma
significante exudação de citrato. Eles ainda investigaram outros mecanismos potenciais, como
liberação de quelantes, alcalinização da rizosfera ou mesmo translocação do Al+3
para a parte
área, não obtendo resultados conclusivos.
22
2.7 Genética e Biologia Molecular da Defesa ao Alumínio
As espécies vegetais respondem de maneira diferente quando cultivadas em solos com
alta saturação de Al+3
. A seleção de plantas tolerantes é considerada a alternativa mais
adequada para aumentar a produção em solos ácidos com altas concentrações de Al+3
. Assim
o primeiro passo nesta abordagem é estabelecer um sistema rápido e preciso para
identificação e seleção de grande número de plantas tolerantes.
O controle genético dessa característica é conhecido para algumas espécies.
Entretanto, na maioria dos casos o assunto não é bem esclarecido. Entre os cereais, a espécie
mais tolerante é o centeio, seguida por aveia, trigo e cevada (GALLEGO & BENITO, 1997).
Em trigo, a tolerância parece ser controlada por um ou dois genes maiores
(CAMARGO, 1981). LAGOS et al. (1991) referem-se a dois genes controlando essa
característica, baseados na análise de cruzamentos da variedade brasileira BH 1146 com
CI14124 e Atlas 66, com o principal deles localizado no cromossomo 4D (ANIOL &
GUSTAFSON, 1984).
A herança simples também foi observada em cevada (MINELLA & SORRELLS,
1992). Esses autores identificaram um gene de efeito maior (Alp) e concluíram que os
diferentes graus de tolerância ao Al+3
, observados entre as cultivares, foram devidos a
ocorrência de alelos distintos nesse loco e à presença de outros genes de efeito menor. Eles
também observaram que as taxas de segregação, enquanto monogênicas, deslocavam de
dominantes para recessivas, com o aumento das concentrações, sugerindo que a tolerância era
uma característica genética dependente de dosagem. Mais tarde TANG et al. (2000)
mapearam o gene Alp no braço longo do cromossomo 4H. Eles também sugerem que os genes
ligados à tolerância em cevada e trigo seriam ortólogos, já que as duas espécies possuem a
mesma marca próxima aos genes de tolerância.
Para o milho, a resistência ao Al+3
apresenta-se como uma característica complexa. As
descobertas indicam que o controle se dá por múltiplos genes (MAGNAVACA et al., 1987),
mas MOON et al. (1997), em cruzamentos de linhas somaclonais S1587 com linhagens Cat-
100-6, mostraram que provavelmente um único gene, parcialmente dominante, controlaria a
tolerância, cuja denominação foi dada como ALM1.
Em arroz, NGUYEN et al. (2001) mostram que o controle também é influenciado por
muitos genes. Em análise de RFLP, estes autores encontraram nove regiões diferentes em oito
cromossomos que provavelmente conferiam resistência ao Al+3
. Esses resultados concordam
com os encontrados por KHATIWADA et al. (1996), que demonstraram o envolvimento de
23
vários genes na tolerância com efeito aditivo e que a herança é quantitativa com interação
alélica de dominância nos diversos locos.
Estudos similares, em soja, indicaram um efeito aditivo na absorção de elementos
minerais e crescimento da raiz na presença de Al+3
(SPEHER & GALWEY, 1996).
BIANCHI-HALL et al. (2000) encontraram cinco QTLs com efeitos reduzidos, indicando que
o controle da tolerância ao Al+3
nessa espécie é quantitativo.
Em centeio, GALLEGO & BENITO (1997) propuseram a existência de três genes Alt
controlando a tolerância ao Al+3
nesta espécie, o que concorda com análises prévias feitas por
ANIOL & GUSTAFSON (1984), que usando linhas de adição e substituição trigo-centeio
(linhagens com cromossomos extras ou cromossomos substituídos), localizaram três genes de
tolerância ao Al+3
nos cromossomos 3, 4 e 6 do genoma R dessa espécie.
Mudanças na expressão dos genes e no controle normal dos processos fisiológicos
parecem ser os maiores efetores das respostas celulares aos estresses abióticos e bióticos
(MILLA et al, 2002). Por esse motivo, nos últimos anos o alvo dos estudos tem sido os genes
induzidos pelo estresse e relacionados ao transporte de ácidos orgânicos, a síntese de
proteínas ligantes ou da via de combate do estresse oxidativo (YAMAJI et al., 2009; HUANG
et al., 2009; XIA et al., 2010).
A primeira família de genes relacionados com a tolerância ao Al+3
foi identificada,
clonada e seqüenciada por SASAKI et al. (2004), que mostraram a expressão maior do gene
transportador de malato ALMT (Aluminum Activated Malate Transporter) em plantas de trigo
resistentes ao Al+3
. A alta expressão deste gene em muitos genótipos resistentes ao Al+3
está
associada com elementos repetidos em “tandem” no promotor (SASAKI et al., 2006). Em
cevada, o gene HvAACT1 foi identificado pela primeira vez por FURUKAWA et al. (2007),
responsável pela secreção de citrato dependente de Al+3
, pertencente à família MATE
(Multidrug and Toxic Compound Extrusion).
Essa família é formada por um grupo de transportadores de proteínas em um largo e
diverso grupo de células procarióticas e eucarióticas (RYAN et al., 2010). Muitos parecem
funcionar como carreadores secundários, para remover compostos orgânicos do citosol. Ela é
composta por três grandes famílias e 14 subfamílias. A classe I é composta por MATEs
bacteriais, a classe II por MATEs de eucariotos (que por sua vez é dividido em subclasse: (1)
fungos e bactérias, (2) plantas, (3) protozoários e (4) animais) e a classe III que incluem
MATEs bactérias e archaeas (MAGALHÃES et al., 2010).
A família MATE de Arabidopsis contém pelo menos 56 membros (LI et al., 2002,
ROGERS & GUERINOT, 2002) além de apresentar uma região QTL próxima ao gene
24
AtALMT1 no cromossomo 1 que representa uma maior tolerância ao Al+3
do que o gene em
questão (HOEKENGA et al., 2006).
Outras espécies de plantas também já tiveram genes dessas famílias identificados,
como em Arabidopsis (AtALMT1) (HOEKENGA, 2006; LIU et al., 2009), sorgo (ALTSB)
(MAGALHÃES et al., 2007), milho (ZmASL) (MARON et al., 2010), arroz (OsFRDL1)
(YOKOSHO et al., 2009).
Mais recentemente, novas classes de genes têm sido identificadas como responsáveis
pela tolerância ao Al+3
.
HUANG et al. (2009) mostraram que em arroz, os genes que medeiam essa
característica não são genes da família MATE e sim os genes STAR1 e STAR2 (nomeados
como OsSTAR1 e OsSTAR2). O primeiro codifica um domínio de ligação de nucleotídeos e o
segundo codifica um domínio transmembrana de transportadores ABC (ATP binding cassette
transporter). Eles mostraram que OsSTAR1 interage com OsSTAR2 formando um complexo
localizado na membrana de vesículas das células da raiz, que tem atividade específica de
efluxo de UDP-glucose para o apoplasma, podendo alterar a membrana celular e
provavelmente assim conferindo a tolerância. YAMAJI et al. (2009) identificaram um fator
de transcrição ART1 (Al resistance transcription factor 1) que regula a expressão dos genes
relatados em arroz e de outros 30 genes, cujos alguns também participam da detoxificação
interna e externa. Em Arabidopsis thaliana também foi identificados gene dessa família, o
AtSTAR1, cujo transportador está em células de raiz e parte superior da planta (HUANG et al.,
2010).
Esse mesmo fator de transcrição regula um gene identificado por XIA et al.(2010), o
Nrat1, pertencente à família de transportadores de Al+3
tipo Nramp (natural resistance-
associated macrophage protein) específico para o Al+3
trivalente (não carreia outros cátion
como manganês, cádmio ou ferro). Quando nocauteado, o resultado foi a diminuição da
captação de Al+3
, aumento da ligação do mesmo na parede celular e da sensibilidade ao metal.
Esse transportador, como relatado pelos autores, parece ser a primeira etapa para
detoxificação por seqüestro de Al+3
pelos vacúolos.
Outras culturas também tiveram perfis de expressão traçados recentemente. Em milho,
NINAMANGO-CÁRDENAS et al. (2003) mapearam cinco QTLs em três cromossomos, que
juntos explicavam 60% da variação fenotípica. Em 2010, MARON et al. clonaram e
caracterizaram dois genes relacionados com a tolerância ao Al+3
nesta planta, ZmMATE1 e
ZmMATE2, que estão subjacentes à dois QTLs descritos. No mesmo ano, KRILL et al. (2010)
confirmaram quatro genes como contribuidores para a tolerância ao Al+3
: Zea mays AltSB like
25
(ZmASL), Zea mays aluminum-activated malate transporter 2 (ALMT2), S-adenosyl-L-
homocysteinase (SAHH), and Malic Enzyme (ME).
Em café, estudos de suspensão celular tratada com Al+3
resultaram no aumento da
atividade de uma fosfolipase C (PLC), na produção de IP3 em ate duas vezes mais que o
normal (MARTINEZ-ESTEVEZ et al., 2003), como também na indução de uma proteína
MBP (Myelin Basic Protein), membro da família gênica MAPK (ARROYO-SERRALTA et
al., 2005).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material Vegetal
O ensaio biológico foi conduzido com duas cultivares comerciais de Coffea arabica,
Icatu vermelho IAC 4045 e Catuaí Amarelo IAC 62, para análise de expressão de genes
responsivos ao Al+3
. Os genótipos foram com base em um screening prévio de cinco
cultivares comerciais (Obatã 1669-20, Tupi IAC 4993, Mundo Novo MP 38817-1, Catuai
Amarelo IAC 62, Icatu Vermelho IAC 4045) para a identificação de cultivar tolerante e
sensível (Catuai e Icatu).
A cultivar Catuaí Amarelo IAC 62 apresenta porte baixo, frutos amarelos e foi obtida
pelo Instituto Agronômico de Campinas (IAC), através do método de hibridização entre
cafeeiros da variedade „Caturra Amarelo‟ selecionados pelo vigor e produtividade (FILHO et
al., 2006)
Icatu possui porte alto, frutos vermelhos, excelente bebida para café expresso, obtida
pelo Instituto Agronômico de Campinas (IAC), tendo como característica resistência à
maioria das raças do patógeno causador da ferrugem alaranjada do cafeeiro (FILHO et al.,
2006).
3.2 Ensaio Biológico
3.2.1 Germinação
Para obtenção das plântulas, 3.500 sementes (número estimado a partir da taxa de
germinação) das duas cultivares, oriundas do Pólo Regional Nordeste Paulista (Mococa) da
APTA, foram embebidas em hipoclorito de sódio 2,5% por um período de seis horas para a
retirada do pergaminho (MEIRELES et al., 2007), descascadas e tratadas com fungicida
Tyran 70% PS (0,2% do peso das sementes) para evitar contaminação. Depois disso, as
26
sementes foram colocadas em câmara de germinação B.O.D., a uma temperatura de 26 ºC no
escuro, e retiradas após atingirem o tamanho de raiz de aproximadamente três centímetros.
Após a etapa de germinação, as plântulas foram transferidas para solução nutritiva de
HOAGLANG & ARNON (1950), adaptado conforme BRACCINI et al. (1998a),
permanecendo 24 horas para aclimatação a 25 ºC e fotoperíodo de 12 horas.
3.2.2 Indução de estresse ao alumínio
Para determinar a quantidade de material necessária, ensaios preliminares foram feitos,
e a quantidade de material macerado necessária para a extração de RNA foi determinada em
no mínimo 100 plântulas (coleta em “bulk”) (rendem 100 mg de material).
Cerca de 1200 plântulas de cada variedade foram utilizadas para o ensaio biológico,
divididas em 4 caixas plásticas com aproximadamente 300 plântulas cada, dispostas em
bandejas de isopor e mantidas com aeração por bombas.
A partir de então, uma soluções de Al+3
à concentração de 0,370 µM na forma de
AlCl3+
foi adicionada à solução nutritiva, descrita por MISTRO et al. (2007). A partir de
então, 100 plântulas (coleta em “bulk”) de cada genótipo foram coletadas nos tempos 1 hora,
12 horas e 48 horas. Para certificar as análises de expressão, foram coletadas amostras
controles (sem adição de Al+3
) nos mesmos tempos descritos, totalizando ao final 12
tratamentos por genótipo (6 tratamentos em duplicatas).
A região meristemática das 100 raízes de cada tratamento foi excisada (3 a 5
milímetros de comprimento) e congelada para extração de RNA, síntese de cDNA e q-PCR.
Neste período, as plântulas foram mantidas a 25 ºC sob fotoperíodo de 12 horas e o pH
das soluções nutritivas foi adequado diariamente para 4,2 com HCl 0,1 mol.L-1
ou NaOH 0,1
mol.L-1
.
3.3 Extração de RNA
Para a extração de RNA dos ápices congelados foi utilizado o reagente TRIZOL®
(Invitrogen), de acordo com protocolo adaptado para plantas (MONTE & SOMERVILLE,
2001). A qualidade de todos os RNAs foi verificada em corrida eletroforética em gel de
agarose 1% com coloração por fluorescência Gel Red (Biotium) e a quantidade determinada
por espectrofotometria em comprimento de 260-280 ηm ressuspendido em Tris-HCl 10 mM;
pH 7.5.
27
3.4 Purificação do RNA
Para a purificação do RNA extraído, foi utilizado o kit RNeasy Mini Kit® (Qyagen)
com protocolo específico do fabricante para plantas e adaptado pelo nosso laboratório de
acordo com testes realizados. O RNA limpo foi ressuspendido em 30 µL de água DEPC
(dietilpirocarbonato) 0,2% tratada.
3.5 Síntese de cDNA
A quantidade de 3 µg de RNA total de cada amostra foi tratada com
Deoxyribonuclease I, Amplification Grade (DNAse) (Invitrogen) para a degradação do DNA
genômico contaminante (volume final de cada amostra= 22 µL).
Os cDNAs foram sintetizados a partir de 1 µg do RNA tratado utilizando a enzima
transcriptase reversa do kit SuperScript® III First-Strand Synthesis SuperMix for q-PCR
(volume total da amostra= 21µL). Todos os métodos descritos neste item foram realizados de
acordo com a recomendação do fabricante.
Os cDNAs não foram quantificados, mas suas concentrações foram baseadas na
quantidade inicial de RNA utilizada nas sínteses. Os cDNAs foram diluídos em solução
estoque de 4,7 ηg/µL.
3.6 Mineração de Dados e Desenho de Primers
3.6.1 Busca de sequências
Sequências de genes descritas na literatura como expressas em condição de estresse
causado por Al+3
foram buscadas na base de dados do NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) por palavras-chave em Arabidopsis thaliana. Possíveis
isoformas de proteínas destes genes também foram selecionados para posterior blast no
Projeto Brasileiro Genoma Café (PBGC).
Tanto genes envolvidos nos mecanismos simplásticos como apoplásticos foram
considerados nas atividades de busca in silico. Ou seja, genes relacionados com o estresse
oxidativo e com a utilização de ácidos orgânicos foram selecionados por blastn e por
palavras-chave dos genes de interesse na base de dados do PBGC (Coffea Genome Projects).
Desta forma foi possível a identificação de contigs de café similares às sequências de
nucleotídeos de Arabidopsis thaliana, que por sua vez, possuíam funções idênticas aos genes
descritos na literatura. A procura por blastn foi escolhida, pois possibilita a obtenção de
28
sequências de nucleotídeos a partir de sequências de nucleotídeos; dessa maneira, possibilita
uma comparação e identificação de sequências similares.
A seleção das sequências de café foi baseada em seus valores de e-value, sua
identidade (mínimo de 70%), suas análises estruturais (qualidade do seqüenciamento) e suas
anotações no banco de dados PBGC. A validação das sequências de café selecionadas foi
realizada por buscas blast contra a base de dados UniProt (Swiss-Prot
http://www.uniprot.org). As sequências que retornaram seqüências similares que não seguiam
a restrição foram eliminadas da pesquisa.
3.6.2 Desenho de Primers
As sequências dos contigs validados e selecionados pela mineração de dados foram
utilizadas para o desenho de oligonucleotídeos específicos por meio do software PRIMER
EXPRESS v 3.0 (Applied Biosystems), de acordo com o tutorial do fabricante.
Os primers sintetizados foram selecionados e analisados pela ausência de formação de
dímeros, cross-dímeros, harpins e penalidades descritas pelo programa, temperatura de
anelamento (60º C), tamanho de amplicon (entre 50 e 150) e região de anelamento do primer.
3.7 Reações de q-PCR
O volume total das reações de q-PCR foi de 10 µL, sendo 5 µL de reagente Platinum®
SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG, 1,0 µL de oligonucleotídeo específico direto (200
ηM), 1 µL de oligonucleotídeo especifico inverso (200 ηM), 1 µL de água DEPC tratada e 1
µL de cDNA. As reações foram preparadas em triplicata, adicionadas em placas ópticas
MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) (Applied
Biosystems) e realizadas em amplificador modelo 7500 Fast Systems (Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA).
3.8 Análise dos Dados
Para a análise dos dados o software usado foi 7500 Fast Systems SDS (Sequence
Detection Systems) v. 1.3.1 (Applied Biosystems). A especificidade dos produtos
amplificados foi avaliada pela análise das curvas de dissociação, geradas pelo software, de
cada gene alvo e do normalizador estudado.
29
3.8.1 Estabilidade do Normalizador
Os normalizadores Actina (ACT) e Proteína Ribossomal S19, indicados para café por
GOULÃO et al. (2011) e BOTTCHER et al. (2011) foram testados pelo método da
quantificação absoluta com o intuito de selecionar o normalizador com CT (Cycle Threshold)
mais estável em todas as amostras estudadas. Para padronização da quantidade das amostras
de cDNA, a amplificação do gene normalizador escolhido foi realizada em triplicata em todas
as placas de reação de q-PCR.
3.8.2 Teste de Eficiência
Sete diluições em série (concentrado, 0,5 – 0,015) foram feitas de um pool de cDNAs
escolhidos aleatoriamente para a realização das reações de eficiência da PCR (E), cujas
quantificações foram realizadas em triplicata, para gerar curvas padrão para cada par de
primers. A eficiência da PCR (E) para cada gene alvo foi estimada pela equação E= 10(-1/slope)
(RAMAKERS et al., 2003), em que o slope é o valor da inclinação da curva em regressão
linear; os valores de E foram levados em consideração em todos os cálculos subseqüentes.
3.8.3 Quantificação relativa
A quantificação dos genes potencialmente relacionados à tolerância do cafeeiro aos
efeitos tóxicos do íon Al+3
nas duas cultivares (Catuaí e Icatu) e nos seis tratamentos (1 hora,
12 horas e 48 horas e controles negativos) foi realizada pelo método de quantificação relativa
utilizando o gene ACT como normalizador, previamente selecionado (item 3.8.1), e os cDNAs
dos controles negativos como calibradores.
A quantidade relativa (QR) das moléculas alvo foi calculada a partir dos métodos de
PFAFFL (2001), que considera a eficiência (E) de cada gene alvo no calculo da quantificação
relativa em relação ao gene calibrador e dispensa a utilização de curva padrão e a necessidade
das eficiências dos genes alvo e normalizador serem iguais a dois (Ealvo = Enormalizador = 2)
como ocorre no método do CT comparativo (ΔΔCT) (LIVAK & SCHIMITTGEN, 2001).
As QRs das moléculas alvo foram obtidas pela seguinte fórmula:
QR = (Ealvo)ΔCt alvo (Ct controle – Ct amostra)
/ (Enormalizador) ΔC
T normalizador (C
T controle – C
T amostra)
, sendo Ealvo
a eficiência da reação de PCR com o gene alvo, CT o número de ciclos no qual a taxa de
amplificação é mais exponencial para todas as amostras avaliadas e Enormalizador a eficiência da
reação de PCR com o gene normalizador ACT.
30
A análise de expressão diferencial (ED) das moléculas alvo foi realizada levando-se
em conta seus valores de CT do normalizador presente nas placas da reação. As Eds foram
obtidas pela seguinte fórmula:
ED = (Ealvo) ΔC
T alvo (C
T Icatu – C
T Catuaí)
/ (Enormalizador) ΔC
Tnormalizador (C
T Icatu – C
T Catuaí)
, sendo CT Icatu
a média dos valores de CT das duas repetições biológicas realizadas.
Para identificar a expressão diferencial unicamente causada pela toxicidade ao Al+3
(EDAl), os valores de expressão diferencial (ED) de cada tratamento foram comparados com
os valores de ED de seus calibradores (controles negativos) por meio do seguinte cálculo
(EIRAS, 2010):
EDAl = ED tratamento / ED controles negativos
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Ensaio Biológico
As plântulas crescidas em câmara de germinação B.O.D. foram transferidas para a sala
de hidroponia (com controle de temperatura a 25 oC constantes), após 40 dias de incubação,
onde permaneceram por dois dias para a realização do ensaio biológico. Raízes de mesmo
comprimento foram selecionadas (Figura 2) e em seguida dispostas em bandejas postas em
caixas contendo 4,5 litros de solução nutritiva (Figura 3).
As plântulas permaneceram um dia em aclimatação na solução nutritiva e após esse
período foram submetidas ao tratamento de estresse induzido por Al+3
.
Nos tempos de coleta determinados, as pontas de raízes foram excisadas com bisturi
estéril e imediatamente colocadas em nitrogênio líquido e acondicionadas em biofreezer.
31
Figura 2 - Medição de raízes de plântulas de Coffea arabica Catuaí com 40 dias de
germinação.
Figura 3 - Plântulas de Coffea arabica Catuaí e Icatu submetidas a estresse por Al+3
em
cultivo hidropônico.
4.2 Extração de RNA
O RNA total extraído da ponta de raiz das amostras foi submetido à eletroforese em
gel de agarose 1% para verificação da integridade e rendimento. A figura 4 ilustra as bandas
correspondentes às subunidades 28S e 18S do RNA ribossômico das amostras, evidenciando
integridade ou baixo nível de degradação do RNA extraído.
32
Figura 4 - Eletroforese em gel de agarose 1% para verificação da integridade das amostras de
RNA total extraído de pontas de raízes de café mostrando as bandas 28S e 18S.
Em seguida, o RNA total extraído de cada amostra foi purificado em coluna de
afinidade RNeasy Plant Mini Kit® (QIAGEN) e posteriormente quantificado por
espectrofotometria em leitura de absorbância a 260 ηm e 280 ηm (estimativa da concentração
de proteínas nas amostras) e 320 ηm (outros contaminantes). Calculou-se então a razão entre
as leituras a 260 ηm e 280 ηm, visando estimar a pureza. O valor das razões das amostras
analisadas estavam entre 1,6 e 2,0, como desejado.
33
4. 3 PCR quantitativa
4.3.1 Mineração de Dados e Desenho de Primers
4.3.1.1 Busca de sequências
A partir de revisão bibliográfica, genes para sete enzimas do sistema de defesa
relacionadas com detoxificação interna das espécies reativas de oxigênio e com a síntese de
ácidos orgânicos foram identificados e selecionados em Arabidopsis thaliana, Glycine max e
Vitis vinifera (Tabela 1), descritos em trabalhos com estresse induzido por estresses abióticos,
inclusive por Al+3
. Isoformas de proteínas destes genes também foram selecionados para
posterior blast no PBGC.
Tabela 1 - Genes relacionados à defesa contra o estresse causado pelo íon Al+3
. Nome da
enzima, organismo de origem e referência no banco de dados NCBI.
Gene Organismo de Origem Referência
Glutationa Redutase citosólica (GR1) Arabidopsis thaliana Salanoubat et al., 2000.
Glutationa Redutase GR2 Arabidopsis thaliana Kubo et al., 1998.
Glutationa Redutase (GR) Glycine max Tang & Webb, 1994.
Ascorbato Peroxidase (APX1) Arabidopsis thaliana Theologis et al., 2000.
Ascorbato Peroxidase (APX2) Arabidopsis thaliana Salanoubat et al., 2000.
Ascorbato Peroxidase (APX3) Arabidopsis thaliana Mayer et al., 1999.
Ascorbato Peroxidase (APX4) Arabidopsis thaliana Mayer et al., 1999.
Ascorbato Peroxidase (APX5) Arabidopsis thaliana Mayer et al., 1999.
Ascorbato Peroxidase (APX6) Arabidopsis thaliana Mayer et al., 1999.
Ferritina (FER) 1 Arabidopsis thaliana Petit et al.,2001.
Ferritina (FER) 2 Arabidopsis thaliana Salanoubat et al., 2000.
Ferritina (FER) 3 Arabidopsis thaliana Salanoubat et al., 2000.
Ferritina (FER) 4 Arabidopsis thaliana Lin et al., 1999.
Catalase 1 Vitis vinifera Jaillon et al.,2007.
CAT 1 Arabidopsis thaliana Theologis et al., 2000.
CAT 2 Arabidopsis thaliana Mayer et al., 1999.
CAT 3 Arabidopsis thaliana Theologis et al., 2000.
MnSOD Arabidopsis thaliana Salanoubat et al., 2000.
Malate Dehidrogenase Arabidopsis thaliana Salanoubat et al., 2000.
Citrato Sintase Arabidopsis thaliana Salanoubat et al., 2000.
As sequências dos genes pesquisados, assim como as isoformas, foram usadas para
blastn contra a base de dados do PBGC (Coffea Genome Projects), bem como sequências
encontradas por palavra-chave. Assim, uma lista de contigs para cada gene relacionado com
34
tolerância ao Al+3
foi identificada (Tabela 2). Os contigs que apresentaram identidade menor
que 70% ou e-value maior que -15 foram descartados.
Tabela 2 - Contigs de Coffea arabica potencialmente relacionados com o estresse provocado
pelo íon Al+3
. Enzima, contigs de C. arabica no PBGC, valor de e-value e similaridade com
sequências de outros organismos.
Enzima (Gene)
Sequências
ortólogas de
Coffea arabica
(PBGC)
e-value Similaridade Organismos Similares
aos contigs
ASCORBATE
PEROXIDASE
Contig1441 1e -135 83% Capsicum annuum
Contig15271 1e -130 80% Gossypium hirsutum
Contig2000 1e -114 82% Nicotiana tabacum
Contig7863 1e -114 82% Nicotiana tabacum
Contig6830 0.0 82% Nicotiana tabacum
Contig14517 0.0 74% Vitis vinifera
Contig10989 1e -131 66% Vitis vinifera
SUPERÓXIDO
DISMUTASE [Mn] Contig5351 1e -118 86% Nicotiana plumbaginifolia
FERRITINA Contig6305 1e -102 73% Avicennia marina
Contig671 2e -76 67% Pyrus pyrifolia
CATALASE
Contig3524 0.0 86% Nicotiana plumbaginifolia
Contig13838 0.0 93% Vitis vinifera
Contig6750 0.0 93% Soldanella alpina
Contig10180 0.0 88% Nicotiana plumbaginifolia
Contig13901 1e -118 88% Glycine max
GLUTATIONA
REDUCTASE
Contig 4215 1e -130 85% Vitis vinifera
Contig14336 5e -95 82% Populus trichocarpa
Contig 11032 1e -121 71% Vitis vinifera
Contig15453 1e -118 85% Nicotiana tabacum
CITRATE SINTHASE Contig 17520 0.0 89% Cucurbita cv. Kurokawa
Amakuri
MALATO
DEHIDROGENASE Contig 3026 1e -154 86% Solanum tuberosum
35
4.3.1.2 Desenho de primers
Dentre os contigs pesquisados e relacionados com a tolerância ao Al+3
, foram
selecionados para as reações de q-PCR 11 contigs, e destes, 7 foram usados para o desenho de
primers, mostrando boas características, como temperatura de anelamento, região de
anelamento, sequência de oligonucleotídeos direto e reverso, obtidas pelo programa PRIMER
EXPRESS (Applied Biosystems) (Tabela 3).
36
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39
37
4.4 Análise dos Dados
4.4.1 Estabilidade do Normalizador
Dentre os normalizadores testados, o mais estável nas amostras estudadas foi ACT,
com bom perfil de amplificação e eficiência próxima de 100% (E=2).
4.4.2 Teste de Eficiência
O valor de CT (threshold cycle) refere-se ao ciclo de PCR em que há o aumento na
fluorescência acima do sinal basal. Em se tratando de uma reação de PCR em que o número
de cópias do gene sintetizado in vitro aumenta em progressão geométrica, a diferença do valor
de CT entre as amostras é indicativo do número inicial de cópias do gene alvo de cada
tratamento (GIULIETTI et al., 2001).
A eficiência de amplificação (E) para cada primer foi calculada utilizando-se o valor
referente ao coeficiente angular da reta (Slope) (Figura 5). Para sua estimativa, foram
utilizadas curvas padrão de diluição de cDNA. Assim, foi tomado um pool de cDNAs
contendo amostras escolhidas aleatoriamente de Catuaí e Icatu. A partir deste, foram feitas as
seguintes diluições seriadas (incluindo o concentrado): 5x10-1
, 2,5x10-1
, 1,25x10-1
, 6,25x10-2
,
3,12x10-2
e 1,5x10-2
. Em função desses resultados, foi realizada uma reação de q-PCR onde se
obteve o valor de CT, relativo à concentração de cDNA de cada uma das amostras (Figura 6).
Figura 5 - Curva padrão gerada para ilustrar o cálculo de eficiência de amplificação do gene
Glutationa Redutase a partir de RNA extraído de pontas de raízes de café. Em destaque, o
coeficiente angular da reta (slope) e o valor da eficiência (E).
y = -3,6841x + 21,939E = 1,86826
0
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15
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Log da Concentração
Glutationa Redutase
Y
Y previsto
Linear (Y
previsto)
38
O cálculo da eficiência de amplificação dos genes alvo e normalizador (ACT) resultou
em valores que variaram de 1,46 (Contig 6750 – CAT) a 2,09 (Actina – ACT) (Tabela 4).
Esses valores podem variar de 1 (valor mínimo) ate 2 (valor máximo e considerado ótimo)
(PFAFFL et al., 2002).
Tabela 4 - Eficiência dos genes alvo potencialmente relacionados com a resposta induzida
pela toxicidade ao Al+3
em C. arabica e normalizador calculado de acordo com o coeficiente
angular da reta (slope) (RAMAKERS et al., 2003).
Eficiência dos genes
Actina 2,0923
Catalase 1,4653
Glutationa Redutase 1,8683
Ascorbato Peroxidase 1,7857
Superoxido Dismutase 1,61
Ferritina 1,6979
Malato Dehidrogenase 1,4968
Citrato Sintase 1,7765
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C
D
40
4.4.3 Quantificação relativa
Para o cálculo de quantificação relativa (QR) foi considerado que todas as moléculas
alvo com valores maiores ou iguais a dois (QR ≥ 2) foram induzidas pelo estresse abiótico
causado pelo íon Al+3
, uma vez que tais dados demonstram um aumento igual ou maior que
100% de tais moléculas nas amostras estudadas. Nas figuras 7 e 8 estão ilustradas as curvas de
amplificação e melting geradas para o gene APX, respectivamente.
Figura 7 - Curva de amplificação para o gene APX para o genótipo Icatu nos tempos 1 hora,
12 horas e 48 horas (duas repetições e controles para cada tempo) gerada pelo software 7500
Fast System SDS (Sequence Detection System) v 1.3.1 (Applied Biosystems).
Figura 8 - Curva de melting para o gene APX no genótipo Catuaí nos tempos 1 hora, 12
horas e 48 horas (duas repetições e controles para cada tempo).
41
O cálculo de QR para os controles negativos (sem Al+3
) das moléculas alvo nas
amostras das cultivares Catuaí e Icatu sob tratamento com Al+3
nos tempos 1 hora, 12 horas e
48 horas revelou aumento de expressão dos contigs 6750 (Catalase), 11032 (Glutationa
Redutase), 1441 (Ascorbato Peroxidase), 5351 (Superoxido Dismutase - SOD), 3026 (Malato
Dehidrogenase - MDH) e 17520 (Citrato Sintase - CS) (Tabela 5) (Figura 9).
Para a cultivar Catuaí, as enzimas SOD e MDH tiveram expressão aumentadas no
tempo 1 hora. Para as enzimas catalase e glutationa redutase os maiores valores de expressão
foram nos tempos 48 e 12 horas.
Em Icatu, o aumento da expressão do contig para a enzima SOD foi maior no tempo 1
hora, catalase e glutationa no tempo 12 horas e ascorbato, catalase e citrato sintase no tempo
48 horas.
O contig 6305 para o gene de Ferritina não apresentou QRs maiores que dois para
nenhuma das cultivares em nenhum dos tempos.
Estes resultados demonstram uma possível indução na expressão dos contigs 6750,
11032, 1441, 5351, 3026 e 17520 estudados em Coffea arabica resultante do estresse abiótico
causado pelo Al+3
.
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05652377
0,2
72972615
3,0
72294569
0,3
21005023
C12
0,3
73357569
1,1
66400338
0,1
00940395
0,0
96816729
0,1
4023775
0,0
45276406
0,5
3273945
C12'
0,7
24455288
2,2
6605685
1,2
7103876
0,2
92461131
0,1
57813282
0,0
27923088
0,5
24900864
C48
7,3
65151104
0,2
75251524
0,4
10174791
0,0
42659253
0,0
06032021
0,0
47403727
0,9
15261063
C48'
3,0
84485523
0,7
18870553
0,3
24938012
0,3
0365924
0,0
00446969
0,0
13145811
1,8
76793202
I1
0,2
37940961
0,5
99047579
0,1
86531736
2,1
68619052
0,0
51013472
0,9
90982936
0,0
82387431
I1'
0,1
47414254
1,8
9884487
0,4
62166406
1,6
9551863
0,0
61476642
0,8
25021928
0,6
16403148
I12
9,6
38629857
2,0
21074821
0,8
11865414
0,0
60850744
0,1
23466793
0,0
13025079
0,3
50198439
I12
' 4,3
10258127
1,5
37201888
0,9
92968624
0,1
09169433
0,1
9670395
0,0
65859888
0,4
4637836
I48
6,3
26188758
0,3
73984136
3,2
80942022
0,8
78363885
0,1
96925057
1,3
7580918
2,5
69084707
I48
' 2,5
1989214
1,0
43865985
3,1
06134183
0,6
65559484
0,2
62130664
2,5
23712354
2,1
82825498
43
Figura 9 - Quantificação relativa (QR) ao calibrador (controle negativo) de moléculas alvo
nas cultivares Catuaí e Icatu sob estresse por Al+3
nos tempos 1 hora, 12 horas e 48 horas (C1,
C12, C48 – Catuaí; I1, I12, I48 – Icatu) (Continua).
0
2
4
6
8
10
12
C1 I1 C12 I12 C48 I48
Contig 6750 (Catalase)
0
1
2
3
4
5
C1 I1 C12 I12 C48 I48
Contig 11032 (Glutationa
Redutase)
0
1
2
3
4
5
C1 I1 C12 I12 C48 I48
Contig 1441 (Ascorbato
Peroxidase)
0
1
2
3
4
5
C1 I1 C12 I12 C48 I48
Contig 1609 (Superoxido
Dismutase)
0
1
2
3
4
5
C1 I1 C12 I12 C48 I48
Contig 3026 (Malato
Dehidrogenase)
44
‘Figura 9 - Quantificação relativa (QR) ao calibrador (controle negativo) de moléculas alvo
nas cultivares Catuaí e Icatu sob estresse por Al+3
nos tempos 1 hora, 12 horas e 48 horas (C1,
C12, C48 – Catuaí; I1, I12, I48 – Icatu) (Continuação)‟.
O cálculo de expressão diferencial entre as cultivares foi realizado e as moléculas alvo
com valores maiores ou iguais a dois nos diferentes tratamentos analisados foram
consideradas mais induzidas pelo Al+3
em uma cultivar e, portanto, consideradas envolvidas
na defesa contra o estresse oxidativo causado por este íon.
Como pode ser observado (tabelas 6 e 7), cinco dos seis contigs mostraram uma
expressão diferencial significativa. O contig para Catalase teve aumento acentuado para os
dois genótipos, em diferentes tempos. Já os contigs para ascorbato peroxidase e superoxido
dismutase demonstraram um aumento significativo na expressão na cultivar Icatu.
Os contigs 3026 e 17520 relacionados à síntese de ácidos orgânicos tiveram uma
expressão diferencial significativa para a cultivar Catuaí. O contigs 17520 teve expressão
tardia (12 e 48 horas) para a cultivar Icatu.
0
0,5
1
1,5
2
C1 I1 C12 I12 C48 I48
Contig 6305 (Ferritina)
0
1
2
3
4
5
C1 I1 C12 I12 C48 I48
Contig 17520 (Citrato
Sintase)
45
Tabela 6 – Expressão diferencial de moléculas alvo induzidas por Al+3
entre amostras de
Catuaí e Icatu sob três tratamentos: 1 hora, 12 horas e 48 horas. Moléculas alvo induzidas
pelo Al+3
com expressão diferencial significativa (EDAl ≥ 2) em negrito.
Tratamentos
Similaridade 1 hora 12 horas 48 horas
Contig 6750 Catalase 4,12872517 0,030457 1,193768596
Contig 11032 Glutationa Redutase 0,556897459 0,922364 0,711936484
Contig 1441 Ascorbato Peroxidase 1,603582982 0,279921 0,669753416
Contig 1609 Superoxido Dismutase 1,633772363 0,107602 0,148856979
Contig3026 Malato dehydrogenase 3,867410193 0,210983 0,067575025
Contig 17520 Citrato Sintase 11,68592273 1,613136 0,553454577
Tabela 7 – Expressão diferencial de moléculas alvo induzidas por Al+3
entre amostras de
Icatu e Catuaí sob três tratamentos: 1 hora, 12 horas e 48 horas. Moléculas alvo induzidas
pelo Al+3
com expressão diferencial significativa (EDAl ≥ 2) em negrito.
Tratamentos
Similaridade 1 hora 12 horas 48 horas
Contig 6750 Catalase 0,242205514 32,83282 0,837683286
Contig 11032 Glutationa Redutase 1,795662709 1,08417 1,404619685
Contig 1441 Ascorbato Peroxidase 0,623603525 3,572435 1,493086823
Contig 1609 Superoxido Dismutase 0,612080375 9,293493 6,717857666
Contig 3026 Malato dehydrogenase 0,713062649 4,739724 14,79836672
Contig 17520 Citrato Sintase 0,085573046 0,619911 1,806833011
Os resultados de expressão diferencial com valores maiores que dois indicam que os
genes estão sendo expressos sob a condição de estresse por Al+3
mostrando a possível relação
das enzimas APX, CAT, SOD MDH e CS no combate ao estresse causado pelo Al+3
nestas
cultivares, um balanço enzimático interno para a detoxificação interna das EROs e utilização
de ácidos orgânicos para complexação do Al+3
, mostrando diferenças de perfis enzimáticos
entre as cultivares.
46
4.5 Contigs 5351, 1441 e 6750 relacionados a detoxificação interna de espécies reativas de
oxigênio.
A rede antioxidante das plantas consiste em componentes enzimáticos, como a SOD
(que detoxifica os superoxidos), a ascorbato peroxidase e catalase (que quebram os peróxidos
em água e oxigênio). Elas são enzimas associadas com a manutenção do estado redox
constante das células (SHARMA & DIETZ, 2008).
Os dados obtidos neste trabalho confirmam os estudos da literatura, que sugerem ou
comprovam o envolvimento de enzimas do complexo anti-oxidativo de várias plantas aos
efeitos tóxicos pelo Al+3
. As enzimas APX, CAT e SOD estão potencialmente envolvidas com
vias metabólicas do estresse oxidativo, apontado como efeito secundário e resultado da
toxicidade causada por Al+3
. Cada uma delas é capaz de detoxificar o organismo de diferentes
maneiras.
Neste contexto, o estresse oxidativo pode ser considerado um efeito secundário
importante causado pelo Al+3
. É uma condição biológica gerada pelo desequilíbrio entre a
produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e a desintoxicação do organismo. Para
minimizar os efeitos, as plantas possuem um sistema antioxidante, composto por moléculas
como a Superoxido Dismutase (SOD) e a Ascorbato Peroxidase (APX), que participam
ativamente da eliminação e quebra das moléculas de H2O2 e O2-•
(FOYER & NOCTOR,
2003).
Estudos genéticos para estresse oxidativo causado por Al+3
envolvendo plântulas já
foram feitos com Arabidopsis thaliana, trigo (Triticum aestivum) e em culturas de células de
tabaco. Estes estudos sugerem uma ligação entre o estresse por Al+3
e o estresse oxidativo,
uma vez que este íon induz a expressão de diversos genes codificantes de enzimas
antioxidantes (PANDA & MATSUMOTO, 2010).
O aumento de expressão ou atividade de enzimas antioxidantes tem sido descrito em
diversas culturas, como Allium cepa L. (ACHARY et al., 2008), milho (BOSCOLO et al.,
2003), triticale (LIU et al, 2008), Arabidopsis thaliana (RICHARDS et al., 1998), batata
(TABALDI et al., 2007), arroz (SHARMA & DUBEY, 2007), cevada (ŠIMONOVIČOVÁ et
al., 2004) e tabaco (YIN et al., 2010).
As plantas possuem sistemas enzimáticos de defesa para vários tipos de espécies
reativas de oxigênio, que envolvem as superoxido dismutases, catalases, ascorbato
peroxidases, glutationas redutase, etc. É bem documentado que os genes codificantes destas
enzimas são ativados em resposta ao estresse oxidativo (MILLA, et al., 2002; RICHARDS et
al., 1998; WATT et al., 2003).
47
Uma superexpressão de determinados genes induzidos pelo Al+3
podem providenciar
proteção contra o estresse ao Al+3
e em alguns casos contra o estresse oxidativo (EZAKI et
al., 2000).
O contig 5351 é similar ao gene WMnSOD (Mitochondrial Manganese Superoxide
Dismutase) de Triticum aestivum, que conferiu maior resistência aos efeitos tóxicos do Al+3
quando superexpresso em canola (B. napus) (BASU et al., 2001). Neste trabalho, a
superexpressão do gene para superoxido dismutase, levou as canolas transgênicas
apresentarem menor extravazamento de eletrólitos, menor acúmulo de MDA
(malondialdeído) e menor inibição do crescimento radicular, sugerindo um menor estresse
oxidativo nestas plantas.
Estudos com superexpressão deste gene também foram feitos em plantas de tabaco,
feito por BOWLER et al. (2001) mostram que o a quantidade de danos celulares foi menor
quando comparado e o nível de proteção contra o estresse oxidativo aumentou.
A metaloenzima superoxido dismutase (SOD) catalisa a dismutação dos radicais
superoxidos em oxigênio e peróxido de hidrogênio, agindo na linha de frente contra as EROs.
Estes radicais são produzidos em qualquer compartimento onde tenha uma cadeia de
transporte de elétrons e por esse motivo, as SODs são encontradas em vários compartimentos
celulares (mitocôndria, peroxissomos ou citosol) (ALSCHER, 2002).
Os resultados encontrados no nosso trabalho sugerem uma elevada quantidade de
radical superoxido, uma vez que a expressão da enzima SOD foi elevada para a cultivar Icatu.
A grande quantidade destes radicais se dá principalmente quando as concentrações de Al+3
interferem fortemente no crescimento radicular das plantas (ŠIMONOVIČOVÁ et al., 2004).
Um aumento na atividade da SOD também foi encontrada nos trabalhos de CAKMAK &
HORST (1991) com soja, Arabidopsis thaliana (RICHARDS et al., 1998) e raízes de sorgo
(PEIXOTO et al., 1999).
Uma maior quantidade de SOD leva a uma superprodução e ao acúmulo de radicais
peróxidos de hidrogênio, que são citotóxicos e em excesso podem causar danos celulares.
Assim, um aumento na expressão das enzimas APX e CAT (que possuem grande afinidade
com estes radicais) ajuda no processo de detoxificação interna.
O balanço enzimático entre a SOD e diferentes enzimas de detoxificação interna é
considerado crucial na determinação de um nível basal de O2-
e H2O2. Então a expressão
maior dos contigs 1441 e 6750 (APX e CAT) indicam este balanço interno de proteção contra
as EROs e a quebra dos radicais peróxidos acumulados. Em um estudo com genótipos
tolerante e sensível de trigo, DARKÓ et al. (2004) mostraram que as três enzimas
48
apresentavam uma maior atividade em resposta ao estresse por Al+3
, mostrando a estreita
ligação dentro da rede antioxidativa celular.
Dentre as vias metabólicas importantes para a detoxificação interna de espécies
reativas de oxigênio, o ciclo da Ascorbato-Glutationa é o principal deles (APEL & HIRT,
2004). A APX tem um papel essencial na proteção das células em plantas superiores, algas e
outros organismos (GILL & TUTEJA, 2010).
Ela usa duas moléculas de ascorbato (utilizado como doador de elétrons) para reduzir
uma molécula de peróxido, com a concomitante formação de duas moléculas de
monodehidroascorbato (APEL & HIRT, 2004). Estudos feitos por PASTORI et al. (2003)
mostraram que o ascorbato regula a expressão de genes de defesa das plantas e modula o
crescimento de desenvolvimento via sinalização por fitormonios.
Neste trabalho, foi possível notar uma expressão aumentada no tempo de 12 horas na
cultivar Icatu, sugerindo um papel importante na detoxificação de peróxidos sob as condições
de estresse propostas neste genótipo, como suposto em CONKLIN et al. (2000), onde
mutantes deficientes em ácido ascórbico de Arabidopsis thaliana apresentaram-se
hipersensíveis a estresse ambiental. Em estudos com plântulas em fase de germinação de
abóbora (Cucurbita pepo L.) (DIPIERRO et al., 2004) e trigo (DE GARA et al., 1997) a
atividade da ascorbato peroxidase foi medida sob estresse com Al+3
, em que, nestes estudos,
foi maior.
O aumento na atividade da APX indica uma elevada produção de H2O2 aumentada
pelo Al+3
em tecido de raiz. Esta suposição parte do princípio de que a atividade desta enzima
e da catalase sejam elevadas. Esta sugestão já foi feita por MIZUNO et al. (1988), onde essas
enzimas agiriam protegendo a célula e suas organelas.
A APX possui uma alta afinidade para o peróxido (taxas de µM), mais do que as
catalases (intervalo de mM) e outras peroxidases, e é capaz de detoxificar baixas
concentrações de H2O2 (WANG et al., 1999).
A Catalase é uma enzima importante para a tolerância ao estresse oxidativo, uma vez
que em plantas de tabaco transgênicas com CAT suprimida tem níveis aumentados de EROs
em resposta a estresses bióticos e abióticos (CHAMNONGPOL et al., 1998).
O contig 6750 é similar ao gene codificante de catalase, enzima antioxidante que tem
o potencial de dismutar diretamente o H2O2 em O2 e H2O e é indispensável para a
detoxificação interna das espécies reativas de oxigênio (GILL & TUTEJA, 2010), radicais
esses gerados nos peroxissomos pelas oxidases envolvidas na β-oxidação de ácidos graxos e
fotorespiração.
49
O aumento de expressão da Catalase nos primeiros tempos para as duas cultivares
pode ser explicado pela grande disponibilidade de peróxidos difusos nos compartimentos
celulares, levando a sua indução. Esse aumento de atividade contribui para uma efetiva
redução dos danos oxidativos nas raízes durante a fase de germinação, uma vez que os
radicais peróxidos estão sendo quebrados ativamente pela CAT (LI et al., 2010).
Seu posterior decréscimo no tempo de 48 horas pode estar envolvido a alta
concentração de Al+3
, que pode levar a uma inibição da síntese da enzima ou a uma mudança
conformacional das subunidades enzimáticas, como descrito por USHIMARU et al. (1999).
Resultados assim foram descritos por SHARMA & DUBEY (2007), em que plântulas de
arroz cultivadas a 80 µM tiveram um aumento da atividade enzimática, diferente daquelas
cultivadas a 160 µM, cujos valores de atividades foram menores. Em pimenta (Capsicum
annuum L.), o gene CaCat1 isolado foi induzido pelo estresse Al+3
em raiz, sugerindo que a
toxicidez induz ao estresse oxidativo.
A regulação do metabolismo enzimático antioxidante em plantas é altamente
complexa, envolve uma série de enzimas com várias isoformas que atuam em diferentes
compartimentos celulares. O funcionamento desse sistema ainda não está bem esclarecido,
mas existem evidencias de sistemas compensatórios entre os diferentes sistemas antioxidantes
(BLOKHINA et al., 2003).
As diferenças quanto a tolerância entre os genótipos pode ter explicação para as
diferentes vias de defesa ao estresse. RODRIGUES et al. (2006) mostraram que os genótipos
Catuaí e Icatu apresentam diferentes mecanismos para adaptação ao Al+3
. O primeiro manteve
inalteradas as concentrações de Al+3
nas folhas, mas as concentrações radiculares aumentaram
com a crescente saturação de Al+3
, enquanto que o segundo manteve as concentrações
radiculares de Al+3
fixas. Isso mostra que, em Catuaí, mecanismos de compartimentalização e
exclusão estão atuando na raiz, ao passo que, em Icatu, mecanismos de tolerância, como a
ação de enzimas antioxidantes, estão agindo no mesmo órgão.
Os contigs relacionados ao estresse oxidativo relacionados à tolerância de Coffea
arabica sofrem maior indução após 12 horas de tratamento, com exceção para a superoxido
dismutase que mantém o perfil no tempo 48 horas. Esses resultados reforçam a relação do
estresse causado pelo Al+3
com o estresse oxidativo e sugerem que as respostas celulares
relacionadas a oxidação estão mais presentes em Icatu. Esta cultivar em presença do Al+3
apresentou maior eficiência do sistema antioxidativo, exibindo maior atividade das enzimas e
evidenciando uma forma de proteger as células contra a formação de espécies reativas de
oxigênio.
50
As enzimas APX, SOD e CAT possuem um papel importante de combate as espécies
reativas de oxigênio e o aumento de expressão delas mostra que os mecanismos de tolerância
estão agindo em ação ao estresse causado por Al+3
.
4.6 Contigs 3026, 17520 relacionados a utilização de ácidos orgânicos.
Os mecanismos de defesa ao Al+3
baseiam-se na formação de complexos com
carboxilatos (KOCHIAN et al., 2005). Nos processos apoplásticos, a defesa contra o Al+3
,
mediada pela exsudação de ácidos orgânicos e outros compostos, parece ser o mais comum
como descrito por diversos autores, como TAYLOR (1988), MIYASAKA et al. (1991),
DELHAYZE & RYAN (1995), KOCHIAN et al. (2005), entre outros. Esse mecanismo é
baseado na liberação de ácidos orgânicos através de canais ligados ao Al+3
na membrana
plasmática, que possuem a capacidade em complexar os íons Al+3
(KOCHIAN et al., 2005).
A primeira evidencia na literatura de resistência ao Al+3
mediada por ácido orgânico
foi descrita por MIYASAKA et al. (1991), que demonstraram que cultivares de feijão
(Phaseolus vulgaris) tolerantes ao Al+3
excretavam oito vezes mais citrato que os genótipos
sensíveis. O citrato é um importante quelador do Al+3
e o complexo Al-carboxilato não é
absorvido pelas raízes. A partir disso, estudos de caracterização funcional tem sido realizados
em diferentes culturas a fim de relacionar a superexpressão de genes relacionados com a
síntese, transporte e exsudação de ácidos orgânicos (OAs) com o aumento da tolerância de
plantas à toxicidade do íon Al+3
.
O contig 3026 é similar ao gene NeMDH (Nodule Enhanced Malate Dehydrogenase)
de Medicago sativa (TESFAYE et al., 2001) que codifica a enzima metabólica malato
dehidrogenase (EC number 1.1.1.37), envolvida na síntese de malato. Esse processo químico
consiste na carboxilação do fosfoenolpiruvato (via fosfoenolpiruvato carboxilase - PEPC) a
oxaloacetato, com adicional formação de ATP. O oxaloacetato então é reduzido a malato pela
enzima malato dehidrogenase, que é armazenado como ácido málico nos vacúolos (KENYON
et al., 1985).
Plantas transformadas de alfafa (M. sativa) para o gene codificante da enzima malato
dehidrogenase submetidas a estresse por Al+3
mostraram um aumento na atividade da enzima,
na concentração e no número de transcritos (TESFAYE et al., 2001). Em plantas transgênicas
de tabaco superexpressando MDH, houve um aumento significante na exsudação de malato
em comparação com as plantas não transformadas; as plantas transformadas também
mostraram uma forte tolerância ao Al+3
em comparação com as outras (WANG et al., 2010) e,
em um estudo feito por LÜ et al. (2012), esta mesma espécie superexpressando MDH
51
mitocondrial mostrou um aumento na absorção de fósforo, em comparação com as plantas
selvagens. A eficiência da utilização do fósforo geralmente é baixa em solos ácidos, uma vez
que este ânion se liga a moléculas de Al+3
, precipitando-as. A melhor absorção de P está
associada a superexpressão de malato, uma vez que este OA a uma eficiente quelação dos
íons Al+3
.
Embora uma rápida liberação de malato seja observada em diferentes plantas, estudos
mostram que uma diferença de fase pode existir entre a exposição de raízes ao Al+3
e a
exsudação de ácidos orgânicos (DENG et al., 2009). LI et al. (2000), em raízes de centeio,
observaram uma diferença de 10 horas entre a exposição e liberação de citrato.
Além do malato, o citrato está envolvido na amenização da toxicidade do Al+3
. O
efluxo ou acumulação de citrato pode ser reforçado pelo aumento de enzimas envolvidas na
síntese deste AO, como a citrato sintase (CS) (EC number 2.3.3.1).
O contig 17520 é semelhante ao gene citrate synthase, enzima chave envolvida na
condensação de oxaloacetato (OAA) e acetil CoA para produzir citrato:
acetil-CoA + H2O + oxaloacetato Citrato + CoA
(EXPASY, Bioinformatic Resource Portal, 2012)
A exsudação de citrato (ânion citrato tricarboxílico) é vista num grande número de
espécies, como em soja (SHEN et al., 2005), Lupinus albus (GERKE et al., 2007; WANG et
al., 2007) e feijão (Phaseolus vulgaris L.) (RANGEL et al., 2007) e a capacidade de quelar o
Al+3
é muito maior que o malato (malato dicarboxílico): valores de 9.6 e 5.7 para formação de
Al:citrato e Al:malato; desta maneira, o citrato é mais efetivo na detoxificação do Al+3
comparado ao malato (KOCHIAN et al., 2004).
Estudos de transformação genética mostram com o gene codificante de CS tem papel
importante na tolerância ao Al+3
. ANOOP et al. (2003) mostraram que canola (Brassica napus
cv. Westar) superexpressando gene de CS de Arabidopsis apresentavam aumento no efluxo de
citrato e conseqüente aumento na resistência ao Al+3
, assim como em plantas de tabaco,
mamão (de la FUENTE et al., 1997) e em Nicotiana benthamiana (DENG et al., 2009).
BARONE et al. (2008) introduzindo em alfafa o gene de CS de Pseudomonas aeruginosa
observaram que plantas transgênicas apresentavam uma tolerância maior que as não
modificadas. A maior tolerância encontrada nestas culturas a partir da superexpressão deste
gene leva a uma promissora utilização da técnica em plantas agronomicamente úteis.
Os três ácidos orgânicos descritos (oxalato, citrato e malato) possuem perfis de
quelação próprios, com diferentes habilidades para isso. A partir disso, dois tipos de padrões
para a secreção de ácidos orgânicos têm sido identificados, de acordo com o tempo entre
52
exposição – secreção: o padrão I, em que não há diferença de tempo entre a adição de Al+3
e o
começo da secreção do ácido (resposta rápida); e o padrão II, em que existem algumas horas
de diferença entre os dois eventos (MA et al., 2001). Para este estudo é possível notar que o
padrão I age em C. arabica, indicando que o Al+3
ativa canais iônicos pré-existentes e que a
indução dos genes não é requerida.
A exsudação de citrato e malato esta ligada tanto a produção pelas enzimas MDH e CS
como pelo transporte, por meio dos transportadores de malato e citrato (ALMT e ALCT), que
desempenham o papel de liberação dos ácidos orgânicos, pertencentes a família MATE
(Multidrug and Toxic Compound Extrusion). Essa família é formada por um grupo de
transportadores de proteínas em um largo e diverso grupo de células procarióticas e
eucarióticas (RYAN et al., 2010). Muitos parecem funcionar como carreadores secundários,
para remover compostos orgânicos do citosol.
De acordo com os mecanismos de defesa propostos, a expressão diferencial dos
contigs 3026 e 17520 na cv. Catuaí no tempo de 1 hora sugere sua possível relação com a
tolerância desta cultivar (nas condições propostas) aos efeitos tóxicos do Al+3
por meio da
complexação do metal no citosol e, que nesta cultivar, mecanismos de compartimentalização
do Al+3
podem estar agindo.
A partir dos resultados obtidos, ficam claros os efeitos do Al+3
nas duas cultivares,
induzindo estresse e danos celulares, que são amenizados por moléculas, como enzimas e
ácidos orgânicos, evitando danos maiores à planta.
Após a caracterização funcional, estes genes poderão ser utilizados em ensaio em
plantas transgênicas ou projetos de seleção assistida. Estudos de controle genético da
tolerância, número de genes que influenciam a característica e a herdabilidade já foram feitos
em outras culturas. Trabalhos nesse sentido são necessários para o melhoramento do cafeeiro
a tolerância ao Al+3
, em que os diferentes mecanismos de respostas envolvidos na tolerância
ao Al+3
podem ser a chave, em função de cada gene diferencialmente expresso nas cultivares.
53
5 CONCLUSÕES
1. A expressão dos genes de catalase, ascorbato peroxidase, glutationa redutase,
superoxido dismutase, malato dehidrogenase e citrato sintase de Coffea arabica é
induzida pelos efeitos tóxicos do íon Al+3
principalmente no período de 12 horas.
2. Os genes de catalase, ascorbato peroxidase e superoxido dismutase de C. arabica
pertencentes ao banco de dados do PBGC possuem maior expressão relativa no tempo
de 12 horas na cultivar Icatu quando comparada com a cultivar Catuaí, demonstrando
as relações dos mecanismos de exsudação de ácidos orgânicos e estresse oxidativo de
C. arabica aos efeitos tóxicos causados pelo íon Al+3
.
3. A maior expressão relativa dos genes de catalase, ascorbato peroxidase e superoxido
dismutase indica a maior atividade de vias antioxidantes na cv. Icatu em resposta aos
efeitos tóxicos do Al+3
presente no sistema radicular. A expressão diferencial destes
genes constitui uma evidência genética que relaciona o estresse oxidativo com o
causado pelo íon Al+3
.
4. Os genes codificantes das enzimas malato dehidrogenase e citrato sintase de C.
arabica pertencentes ao banco de dados do PBGC possuem maior expressão relativa
no tempo 1 hora na cultivar Catuaí quando comparada a Icatu, demonstrando os
diferentes mecanismos de defesa aos efeitos tóxicos do Al+3
em C. arabica.
5. A expressão relativa dos genes de malato dehidrogenase e citrato sintase na cultivar
Catuaí indica que um mecanismo de síntese e exsudação de ácidos orgânicos constitui
em um mecanismo de tolerância induzido em Coffea arabica sob estresse induzido por
Al+3
.
6. A maior expressão relativa dos genes de catalase, ascorbato peroxidase e superoxido
dismutase na cultivar Icatu em relação a cultivar Catuaí sugere que no primeiro
genótipo mecanismos de tolerância estão agindo nas raízes, enquanto que a maior
expressão relativa de malato dehidrogenase e citrato sintase na cultivar Catuaí em
relação a Icatu indica mecanismos de resistência.
7. Diante dos resultados, estudos de caracterização funcional dos genes identificados no
presente estudo e descritos acima são necessários em plantas adultas em condições
reais de cultivo para esclarecimentos sobre seus papéis nos mecanismos antioxidativos
de combate as espécies reativas de oxigênio de C. arabica ao estresse abiótico causado
pelo íon Al+3
.
54
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