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ARLINDO CIMA-20150243/JOÃO PIRES-20150259/JÚLIO PIRES-20140111
12 de janeiro de 2018
Extração Sólido-Líquido de Compostos Fenólicos em Casca de
Manga
Operações Unitárias
Docente: Inês Seabra
LICENCIATURA EM BIOTECNOLOGIA
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ÍNDICE
ÍNDICE .......................................................................................................................... 1
RESUMO ........................................................................................................................ 3
1-INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 4
1.1- MANGIFERA INDICA L. .............................................................................................. 4
1.2-COMPOSTOS FENÓLICOS ............................................................................................ 5
1.2.1-DESCRIÇÃO GERAL ............................................................................................. 5
1.2.2-PRESENTES NA MANGIFERA INDICA L. .......................................................................... 8
1.3-EXTRAÇÃO SÓLIDO-LÍQUIDO ....................................................................................... 9
1.3.1-DESCRIÇÃO GERAL ............................................................................................. 9
1.3.2- FATORES QUE PODEM INFLUENCIAR NA EFICIÊNCIA .................................................... 10
2-OBJETIVOS ................................................................................................................. 11
3-MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................................. 11
3.1- PREPARAÇÃO DA MATÉRIA-PRIMA E DETERMINAÇÃO DA HUMIDADE PELO MÉTODO GRAVIMÉTRICO. 11
3.1.1. MATERIAIS: ................................................................................................... 11
3.1.2-PROCEDIMENTO .............................................................................................. 11
3.2- EXTRAÇÃO SÓLIDO-LIQUIDO. ................................................................................... 12
3.2.1. MATERIAIS: ................................................................................................... 12
3.2.2-PROCEDIMENTO: ............................................................................................. 13
3.2.3- AFERIÇÃO DO RENDIMENTO DE EXTRAÇÃO: ............................................................ 13
3.3- TEOR DE COMPOSTOS FENÓLICOS NO EXTRACTO. ........................................................... 14
3.3.1-MATERIAIS: .................................................................................................... 14
SOLVENTES E PADRÃO UTILIZADOS:............................................................................... 14
3.3.2- PREPARAÇÃO DAS SOLUÇÕES: ............................................................................. 14
3.3.3- PREPARAÇÃO DOS EXTRATOS PARA ANÁLISE ESPECTROFOTOMÉTRICA: ............................. 14
3.3.4. CONSTRUÇÃO DA RETA DE CALIBRAÇÃO ................................................................. 15
3.3.5-ANÁLISE DAS AMOSTRAS DE EXTRATO: .................................................................... 15
3.4-ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (TESTE DE CAPTURA COM DPPH). .............................................. 15
3.4.1-MATERIAIS: .................................................................................................... 15
SOLVENTES E REAGENTES: .......................................................................................... 16
3.4.2-PROCEDIMENTO: ............................................................................................. 16
4-RESULTADOS E DISCUSSÃO: ............................................................................................. 17
4.1-GERAL: ............................................................................................................... 17
4.2-DESCRIÇÃO ESPECÍFICA: ........................................................................................... 17
5.-CONCLUSÃO ............................................................................................................. 20
6-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................................... 21
7-ANEXO 1 ................................................................................................................... 23
7.1-PROTOCOLO 1: ..................................................................................................... 23
.......................................................................................................................... 23
8-ANEXO 2 ................................................................................................................... 24
8.1-PROTOCOLO 2 ...................................................................................................... 24
9-ANEXO 3 ................................................................................................................... 26
9.1-PROTOCOLO 3 ...................................................................................................... 26
.......................................................................................................................... 26
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.......................................................................................................................... 27
.......................................................................................................................... 28
10-ANEXO 4 ................................................................................................................. 29
10.1-PROTOCOLO 4 .................................................................................................... 29
.......................................................................................................................... 29
.......................................................................................................................... 30
11-ANEXO 5 ................................................................................................................. 31
11.1-EQUAÇÕES: ........................................................................................................ 31
.......................................................................................................................... 31
12-ANEXO 6 ................................................................................................................. 32
12.1-TABELA 1 - DETERMINAÇÃO DA HUMIDADE DA MATÉRIA-PRIMA. ......................................... 32
.......................................................................................................................... 32
7.3.2-TABELA 2 - DETERMINAÇÃO DO RENDIMENTO DAS EXTRAÇÕES. ......................................... 32
.......................................................................................................................... 32
7.3.3-TABELA 3 - CURVA PADRÃO DE ÁCIDO GÁLICO.............................................................. 32
.......................................................................................................................... 32
7.3.4-FIGURA 1 - CURVA PADRÃO DE ÁCIDO GÁLICO. ............................................................. 33
.......................................................................................................................... 33
7.3.5-TABELA 4 - TEOR DE FENÓLICOS NOS EXTRATOS. ........................................................... 33
.......................................................................................................................... 33
7.3.6-TABELA 5-ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS (DPPH). .......................................... 34
.......................................................................................................................... 34
7.3.7-TABELA 6-CONTROLO DO ENSAIO DE DPPH. ............................................................... 34
.......................................................................................................................... 34
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RESUMO
A planta Mangifera indica L., mais conhecida como a manga, tem origem nas florestas do sul e
sudeste da Ásia, mais precisamente na Índia.
A produção de manga em Portugal é pouco significativa, devido as condições climatéricas.
A principal aplicação/utilização da manga é para a alimentação humana, mas este fruto possui
também qualidades terapêuticas, já que ajuda a tratar de anemias, bronquites, feridas e tosse. Possui
propriedades diuréticas e é rica em calorias.
Neste trabalho prático foi realizada uma atividade laboratorial repartida por quatro protocolos
laboratoriais fornecidos pela docente Inês Seabra de 2012, onde foi realizado o rendimento de
extração, o teor de compostos fenólicos e a atividade antioxidante relativos à casca manga, onde
variámos o tempo, a concentração do solvente e razão entre o sólido e o solvente.
No final verificou-se que existe uma elevada concentração fenólica mesmo que tenha sido feita
uma diluição das soluções dos estratos. Foi constatado que os melhores solventes são os que são
constituídos por uma porção de H2O e EtOH.
Para a confirmação destes resultados será necessário proceder á realização de mais ensaios
estudando mais especificamente as condições a variar.
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1-INTRODUÇÃO
1.1- Mangifera indica L.
A planta Mangifera indica L., mais conhecida como a manga, tem origem nas florestas do
sul e sudeste da Ásia, mais precisamente na Índia. Este fruto foi introduzido em África e no
Brasil. O nome da fruta vem da palavra do idioma malaiala manga e foi popularizada na
Europa pelos portugueses.
A árvore deste fruto é de grande porte e pode chegar até 30 metros de altura, com uma
copa densa. Possui folhas de coloração avermelhada quando é jovem e posteriormente verde-
escura. As suas flores são pequenas, róseas ou esverdeadas. O fruto tem uma forma alongada
e ovoide, já a casca é esverdeada com algumas manchas pretas, amarelas ou róseas quando
está maduro. Possui uma polpa carnosa, suculenta, comestível e fibrosa, com cor amarela. A
semente é achatada de tamanho variável.
Geralmente aceitam qualquer tipo de solo, mas adaptam-se melhor em regiões de clima
quente e chuvoso. O período ideal para o plantio é nas estações mais chuvosas. A propagação
é feita por sementes ou enxertia.
A produção mundial deste fruto é feita essencialmente em regiões de clima tropical e
subtropical: sul da Ásia, América do Sul, América Central e nas porções sul e central de
África e Austrália. O grande comércio deste fruto é dominado atualmente pela Índia, devido
ao seu volume gigantesco de produção.
A produção de manga em Portugal é pouco significativa, devido as condições climatéricas
do país não serem as mais apropriadas para o crescimento e desenvolvimento da árvore do
fruto, mas estão a ser desenvolvidas técnicas para o desenvolvimento do fruto em países
mediterrânicos.
A principal aplicação/utilização da manga é para a alimentação humana, mas este fruto
possui também qualidades terapêuticas, já que ajuda a tratar de anemias, bronquites, feridas e
tosse. Possui propriedades diuréticas e é rica em calorias.
Falando agora da sua composição química (Tabela 2), este fruto é riquíssimo em vitamina
A (principalmente quando está maduro) e contém quantidades significativas de vitaminas do
complexo B e vitamina C, para além de alguns sais minerais, como o ferro e o potássio, por
exemplo. Este fruto é rico em compostos fenólicos (Adaptado de ROSSETTO, s.d.).
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1.2-Compostos fenólicos
1.2.1-Descrição Geral
Quanto aos compostos fenólicos podem ser definidos como substâncias possuidoras de
anel aromático com ou mais grupos de hidroxilos e têm sido submetidos a variados e
intensivos estudos devido a sua direta influencia na qualidade dos alimentos. Englobam uma
gama enorme de substâncias, entre elas os ácidos fenólicos, os quais, devido á suas
composições químicas possuem propriedades antioxidantes (SOARES, 2002).
Com a estrutura de um anel aromático ligado diretamente a apenas um grupo hidroxilo, é
constituído o composto fenólico mais comum, o fenol simples.
Relativamente á existência destes compostos na natureza, podem ser classificados como:
pouco e largamente distribuídos na natureza. No conjunto com pouca distribuição existe um
numero muito restrito. No grupo que abrange a grande maioria (larga distribuição),
encontram-se aqui os fenólicos geralmente de todo o reino vegetal (SOARES, 2002).
Os compostos fenólicos podem ser classificados em vários grupos consoante o número de
carbonos presentes na molécula (Tabela 3) (SHAHIDI, 2004).
Tabela 1-Classificação botânica da
Mangifera Indica L (WIKIPEDIA, 2017)
Tabela 2-Composição química da Mangifera
Indica L (SILVA; CALISTO, 2013)
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Atualmente existem vários estudos realizados com legumes, frutas, sementes, cascas e
madeira, que revelam a presença de compostos fenólicos com propriedades antioxidantes e
anticancerígenas (MOURE, 2000), e de acordo com King (1999) citado por Angelo (2006), de
todos os compostos fenólicos, destacam-se os flavonóides, os ácidos fenólicos e os taninos
como os mais comuns antioxidantes fenólicos de fonte natural.
Entre as componentes da planta na qual se insere as funções de crescimento e
desenvolvimento os flavonoides apresentam um especial destaque. Muitas destas
funcionalidades são essenciais para a sobrevivência, como a atração de animais polinizadores
e dispersores de sementes, estimulação da bactéria Rhizobium para a fixação de azoto e
assimilação de minerais provenientes das folhas. Os flavonoides também são conhecidos por
aumentarem a tolerância das plantas frente a fatores abióticos e são empregados como agentes
de defesa contra herbívoros e patógenos (ANDERSON, 2005).
Os flavonoides possuem uma estrutura básica formada por C6-C3-C6, o difenil propano
(Figura 1), sendo os compostos mais diversificados do reino vegetal. Consistem em dois
anéis aromáticos interligados por três carbonos que geralmente forma uma estrutura
heterocíclica oxigenada (BRAVO, 1998).
Figura 1 - Difenil propano- Estrutura geral de um flavonoide com os anéis A, B e C e sistema de numeração para
diferenciação dos carbonos (ZIELINSKI, 2005).
Os ácidos fenólicos podem ser então subdivididos em 3 grupos. O primeiro é composto
pelos ácidos benzoicos (Figura 2), sendo que a estrutura possui sete átomos de carbono (C6-
C1). O segundo é constituído pelos ácidos cinâmicos (Figura 3), com nove átomos de carbono
(C6-C3) (SOARES, 2002).
Estrutura Classe
C6 Fenólicos Simples
C6 – C1 Ácidos fenólicos e compostos relacionados
C15 Flavonas
C6, C10, C14 Quinonas
Taninos Oligómeros e Polímeros
Tabela 3 - Classificação de alguns compostos fenólicos (adaptado de Shahidi & Naczk, 2004).
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Figura 2-Ácidos benzoicos Figura 3-Ácidos cinâmicos
Por fim a cumarinas (Figura 4) formam o terceiro grupo e são derivadas do ácido cinâmico
por ciclização da cadeia lateral do ácido o-cumárico (SOARES, 2002).
Figura 4-Cumarinas
Os compostos fenólicos são constituintes muito importantes no mundo hortícola e
frutícola. Através da quantificação destes conseguimos obter informações a respeito da
atividade antioxidante, qualidade do alimento e dos potenciais benefícios á saúde
(TALCOTT, et al, 2003).
Segundo Da Mota (2011), os taninos integram, em conjunto com os flavonóides, os
compostos fenólicos responsáveis pela adstringência e gosto amargo das plantas. São dotados
de propriedades biológicas diversas, relacionadas com o seu potencial como quelantes iónicos
e agentes precipitantes de proteínas e antioxidantes. Compreendem ainda, compostos
polifenólicos solúveis em água, que podem ter uma massa molecular elevada e são divididos,
de acordo com a sua estrutura e origem biogenética, em dois grupos principais: taninos
hidrolisáveis (Figura 8-(e) e (f)) e condensados (Figura 8-(g)). Os taninos hidrolisáveis são
ésteres de ácidos fenólicos e açúcares, em geral, glucose e dividem-se em galotaninos
R1=R2=R3=R4=H Ácido cinâmico; R1=OH Ácido o-
cumárico; R2=OH Ácido m-cumárico; R3=OH Ácido p-
cumárico; R2=R3=OHÁcido cafeico; R2=OCH3; R3=OH
Ácido ferúlico; R2=R4=OCH3; R3=OH Ácido sinápico
R1=OH Ácido Salicilico; R1=R4=OH Ácido
Gentísico; R3=OH Ácido p-hidroxibenzóico;
R2=R3=OH Ácido Protocatequínico; R2=OCH3;
R3=OH Ácido Vanilico; R2=R3=R4=OH Ácido
Gálico; R2=R4 = OCH3; R3=OH Ácido Siríngico
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(açúcares esterificados com ácido gálico) e elagitaninos (açúcares esterificados com ácido
elágico). A hidrólise origina ácido gálico (Figura 8-(a)), ácido elágico (Figura 8-(b)) ou o
seu derivado, o ácido hexahidroxidifénico (Figura 8-(c)) e o respectivo resíduo de
monossacarídeo. Os taninos condensados (proantocianidinas) são polifenóis constituídos por
catequina e leucoantocianidina unidas entre si por ligações carbono-carbono que só em
condições especiais são clivadas.
1.2.2-Presentes na Mangifera indica L.
De acordo com (BERARDINI, et al, 2005) e (RIBEIRO, et al, 2008), a manga (Mangifera
indica L.) têm presente na constituição da sua casca cerca de seis compostos fenólicos, são
eles: mangiferina, isomangiferina, quercetina diglicosídeo, quercetina 3-O-glucosídeo e
canferol 3-O-glucosídeo.
A mangiferina (Figura 5) e derivados (isomangiferina) possuem várias atividades como
antioxidante, imunomodulatória e anti-inflamatória.
Figura 5-Mangiferina
Figura 8- Exemplo de alguns compostos fenólicos: (A) ácido gálico; (B) ácido elágico; (C)
ácido hexahidroxidifénico (HHDP); (D) catequina; (E) estrutura típica de um elagitanino;
(F) estrutura típica de um galotanino; (G) e estrutura típica de uma proantocianidinas
(Adaptado de Mota, 2011).
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Quercetina (Figura 6) é um flavonoide natural que possui propriedades farmacológicas, tais
como anti-inflamatória, anti carcinogénica (atua no sistema imunológico), antiviral, influencia
na inibição de cataratas em diabéticos, anti-histamínicas (antialérgicas), cardiovascular, entre
outras atividades. No caso da manga são encontrados o quercetina diglicosídeo, quercetina 3-
O-glucosídeo (Figura 7).
Figura 6-Quercetina Figura 7- Quercetina 3-O-glucosídeo
Canferol (Figura 8) é um flavonol natural, família dos flavonoides, que está presente em
diversos alimentos derivados de vegetais e frutos. No seu estado puro, o canferol é um sólido
cristalino de coloração amarelada, com um ponto de fusão alto comparativamente com a água
(276-278 ºC), ligeiramente solúvel em água e fortemente solúvel em etanol aquecido e éteres.
Do ponto de vista fisiológico, o canferol age como um antioxidante ao reduzir o stress
oxidativo e vários estudos sugerem que o consumo de canferol pode reduzir o risco de vários
cancros em humanos. Na manga esta presente um derivado da estrutura original, o canferol 3-
O-glucosídeo (Figura 9).
Figura 8- Canferol Figura 9- Canferol 3-O-glucosídeo
1.3-Extração sólido-líquido
1.3.1-Descrição Geral
A operação de extração é uma operação de separação/purificação muito comum a nível
industrial. Nesta operação, a separação do soluto da mistura de alimentação é promovida pela
adição de outro composto, designado por solvente.
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O conceito de extração aplica-se a alimentações sólidas ou líquidas, às quais se pretende
retirar o soluto, seja para o obter num estado mais puro por constituir o produto objeto do
processo, seja para remover impurezas (Química, 2016).
1.3.2- Fatores que podem influenciar na eficiência
Vinculados ao material: quantidade, natureza, teor de humidade, tamanho das partículas;
Vinculados ao líquido: escolha do solvente, seletividade e quantidade;
Vinculados ao sistema: temperatura, agitação, pH, tempo de extração.
Estes fatores têm influência no rendimento da extração e consequentemente na leitura final
do teor de antioxidantes. De acordo com Siqueira et al. (1997) o antioxidante é “qualquer
substância que, quando presente em baixas concentrações, comparado ao substrato oxidante,
retarda ou inibe o processo de oxidação”.
Quanto à determinação do teor de compostos fenólicos totais é feita através do método
espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau onde se utiliza o ácido gálico como padrão de
referência.
A extração possui um vasto campo de aplicação
nas análises de fármacos, no tratamento de minérios,
mas também na indústria alimentar, de cosmética e
na produção de óleos essenciais, assim como na
purificação de correntes efluentes com vista a retirar
contaminantes indesejados e tóxicos.
Os principais mecanismos de separação baseiam-
se nos seguintes processos: adsorção, partição (fase
normal e reversa), troca iônica e exclusão. Esses
mecanismos estão associados a processos químicos,
físicos e mecânicos que atuam durante a separação.
Dentre as principais forças químicas e físicas
atuantes entre as moléculas do soluto e do solvente,
destacam-se as ligações de hidrogénio, interações
dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido e interações
iônicas (Jardim, 2010). É também de realçar que
existem diversos fatores que podem influenciar o
rendimento de uma extração nomeadamente: a
temperatura, a composição do solvente, o tamanho
das partículas, o tempo de retenção, o gradiente de
concentração, o pH e a agitação do meio (Seabra,
2015).
Figura 10- Processo de
filtração
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2-OBJETIVOS
Com a presente atividade experimental pretendeu-se averiguar se a casca de Mangifera
indica L. é ou não matéria-prima viável para a extração de compostos fenólicos, recorrendo à
operação unitária extração sólido-líquido convencional. Pretendeu-se também estudar o efeito
da composição do solvente (mistura EtOH e H2O) e tempo com a finalidade de determinar
quais as condições experimentais testadas eram mais favoráveis à obtenção de compostos
fenólicos como á atividade antioxidante (teste de captura com DPPH) desta matéria-prima.
3-MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados os protocolos (Nº1, Nº2, Nº3 e Nº4) e respetivamente escritos pela
docente da unidade curricular, Inês Seabra em 2012. No decorrer da atividade existiram
algumas alterações e ajustes. Serão então indicadas abaixo os ajustes/alterações feitas
relativamente ao protocolo inicial (Anexo 1, 2, 3, 4: Protocolos Originais).
3.1- Preparação da matéria-prima e determinação da humidade pelo método
gravimétrico.
Para a obtenção correta da nossa matéria-prima (casca de manga), foi necessário extraí-la
da polpa e caroço. De seguida foi triturado de modo a obter um granulado muito fino, pois
existiu por parte dos alunos uma previa secagem em casa.
3.1.1. Materiais:
❖ Matéria prima triturada;
❖ Placas de Petri sem tampa (3);
❖ Espátula;
❖ Exsicador;
❖ Estufa (aproximadamente 103 ºC);
❖ Balança analítica (4 casas decimais);
❖ Caneta de acetato.
3.1.2-Procedimento
1. Colocou-se as placas de Petri na estufa a cerca de 103 ºC durante meia hora (30
minutos), para que estas secassem devidamente;
2. De seguida as placas foram removidas da estufa, colocadas num exsicador,
deixando-as arrefecer até atingir a temperatura ambiente;
3. Identificou-se com caneta de acetato as placas (3) e anotou-se a sua respetiva
massa. A cada placa foi adicionada aproximadamente 0,5 gramas de amostra;
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4. Por último as placas foram colocadas novamente na estufa a 103 ºC. Após 2 horas
retiraram-se as placas da estufa, deixando-se arrefecer no exsicador antes de
proceder a nova pesagem (no nosso constatou-se que a massa inicial/“húmida” era
a mesma que a massa final/“seca”, devido a ter sido feita uma prévia secagem em
casa dos alunos, como já foi mencionado).
5. Com a junção de todos os dados obtidos como se pode observar no Anexo 3-
Tabela 1 procedeu-se então ao cálculo da humidade de cada uma das amostras
(Equação 1-Anexo 2), como também o desvio padrão e coeficiente de variação
dos valores de humidade obtidos (Equação 2-Anexo 2).
3.2- Extração sólido-liquido.
Relativamente extração sólido-liquido, o procedimento realizou-se de forma diferente ao
que está descrito no protocolo (Nº2-Extracão sólido-líquido).
3.2.1. Materiais:
❖ Frascos de plástico, previamente etiquetados, para armazenamento dos extratos (6);
❖ Copos (6);
❖ Matéria-prima;
❖ Micro-pipeta;
❖ Filtro;
❖ Funil de Vidro;
❖ Balança analítica;
❖ Tanque de Banho-Maria termoestatizado;
❖ Caneta de acetato;
❖ Provetas;
❖ Eppendorfs;
❖ Suporte para eppendorfs;
❖ Cronómetro;
❖ EtOH;
❖ H2O.
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3.2.2-Procedimento:
1. De modo a avaliar diferentes condições experimentais, elaborou-se o seguinte
plano de extração (Tabela 4), para o mesmo equipamento, copo em banho
termoestatizado.
2. Em primeiro lugar, foi montado o equipamento de extração, tanque para banho
termoestatizado para aquecer até a temperatura pretendida (40ºC).
3. Em seguida, identificaram-se os copos segundo o plano de extração (Tabela 4) e
colocou-se em cada um, 1 g de matéria-prima e cerca de 20 ml de solvente de
acordo com as razões sólido: solventes definidos no plano de extração (Tabela 4).
Iniciou-se as seis extrações, colocando o copo respetivo a cada extração no tanque
para banho termoestatizado a 40 ºC e iniciou-se a contagem do tempo. Ao fim de
30 minutos, retirou-se o copo 6 (EtOH: H2O 50/50), de modo a estudar a variável
tempo.
4. Os extratos obtidos foram, então, filtrados e armazenados em frascos devidamente
rotulados.
3.2.3- Aferição do rendimento de extração:
5. Determinou-se, em primeiro lugar, o volume de extrato obtido na extração com o
auxílio de uma proveta.
6. Em seguida, pesaram-se 18 eppendorfs na balança analítica e pipetaram-se para os
mesmos, amostras de 1,5 ml de cada extrato, em triplicado.
7. As amostras nos eppendorfs foram colocadas na estufa com a tampa aberta, a 40ºC,
durante sensivelmente uma semana, até que o solvente evaporasse por completo.
Manga(Mangifera Indica )
Matéria-prima Solvente Tempo (min.) Razão sólido:solvente (m/v)
45
45
45
45
45
30
1:20
EtOH:H2O (50:50)
EtOH:H2O (100)
EtOH:H2O (50:50)
1:20
1:20
H2O
EtOH:H2O (25:75)
1:20
1:20
1:20
EtOH:H2O (75:25)
Tabela 4-Plano de extração
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8. Por fim, foram pesados os eppendorfs com o extrato, em princípio, já sem nenhum
vestígio de solvente.
9. Calcularam-se então as massas de extrato correspondentes ao volume de extrato do
eppendorfs e ao volume total de extrato obtido, utilizando as Equações (3) e (4),
respetivamente do Anexo 5. Com estes valores, foi possível, através da Equação
(5) do Anexo 5, calcular o rendimento das extrações em base seca.
Todos os valores aferidos anteriormente podem ser consultados no Anexo 6-Tabela 2.
3.3- Teor de compostos fenólicos no extracto.
3.3.1-Materiais:
❖ Espátula;
❖ Copo de precipitação de 500 mL;
❖ Tubos de ensaio;
❖ Pipetas automáticas (20 µL; 100 µL; 1mL; 5mL);
❖ Espectrofotómetro e cuvetes de plástico;
❖ Vórtex;
❖ Cronómetro.
Solventes e Padrão utilizados:
❖ Água destilada;
❖ Reagente de Folin;
❖ Na2CO3;
❖ Etanol;
❖ Padrão de composto fenólico (ácido gálico).
3.3.2- Preparação das soluções:
Foram preparadas previamente, uma solução de carbonato de sódio a 17% (m/v) e uma
solução padrão de ácido gálico (3,2 mg de ácido gálico/2 ml de etanol), sendo esta a solução-
mãe de ácido gálico.
3.3.3- Preparação dos extratos para análise espectrofotométrica:
Das 18 amostras secas preparadas em 3.2.2., selecionaram-se 6, garantindo que
correspondiam às 6 diferentes extrações efetuadas, sendo as restantes armazenadas para uma
eventual necessidade de repetir o ensaio. As amostras selecionadas foram diluídas
primariamente com etanol (600 µL) ou água (600 µL) dependendo da sua razão extrato:
solvente, recorrendo ao vórtex e ultrassons para garantir a solubilização total dos extratos.
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Por fim ainda procedemos a mais uma diluição devido á concentração do estrato ainda ser
muito elevada, ou seja, retiramos para um novo eppendorfs cerca de 200 µL da solução obtida
nos eppendorfs anteriores e acrescentamos 600 µL de H2O (diluição 1: 4).
3.3.4. Construção da reta de calibração
Foram utilizados 6 tubos de ensaio, sendo um deles o "branco", e os restantes referentes à
curva de calibração. De seguida foram colocadas, nos tubos de ensaio, entre 0 a 20 μL (0, 4,
8, 12, 16, 20) alíquotas de solução mãe e adicionou-se etanol até perfazer um volume de 20
μL. O tubo de ensaio sem solução-mãe representou o "branco". De seguida, adicionaram-se
1580 μL de água destilada a todos os tubos de ensaio e mais 20 μL de água no "branco" para o
volume final ser igual aos restantes tubos de ensaio.
Iniciou-se a contagem do tempo (auxílio do cronómetro do telemóvel), no momento que se
adicionou 100 μL de reagente de Folin-Ciocalteu ao primeiro tubo, o "branco". Passado 30
segundos, adicionaram-se 300 μL da solução de carbonato de sódio e, após agitação, colocou-
se o tubo em banho termoestatizado a 40ºC, onde permaneceu durante 30 minutos. Este
procedimento foi repetido, sequencialmente para os restantes tubos.
Foram, então, medidos os valores de absorvância de cada amostra no espectrofotómetro a
765 nm em cuvetes de plástico. Para tal, calibrou-se o espectrofotómetro com a leitura do
"branco", fazendo-se em seguida a leitura das restantes amostras. Os valores obtidos podem
ser consultados no Anexo 6-Tabela 3. Com estes resultados, procedeu-se à construção da
curva de calibração (Anexo 6-Figura 1).
3.3.5-Análise das amostras de extrato:
A análise das amostras foi feita em triplicado, pelo que foram transferidas três alíquotas
(20 μL) de cada amostra previamente diluídas (assim como as amostras em 3.3.4) para tubos
de ensaio, perfazendo um total de 18 tubos. De seguida, adicionaram-se 1580 μL de água
destilada a todos os tubos de ensaio. Procedeu-se então da maneira referida em 3.3.4.
Por fim, foi determinado o teor de compostos fenólicos de cada amostra. Para tal recorreu-
se à equação da reta de calibração e à Equação (7) do Anexo 5, o que permitiu obter o teor de
fenólicos expresso em mg EAG/mL de solução. Pelas Equações (8) e (9) do Anexo 5 foi
possível calcular o teor de fenólicos expresso em % EAG (m/m) onde se pode observar no
Anexo 6-Tabela 4.
3.4-Atividade antioxidante (teste de captura com DPPH).
3.4.1-Materiais:
❖ Balança analítica (4 casas decimais);
❖ Espátula;
❖ Cronómetro (telemóvel);
❖ Tubos de ensaio;
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❖ Espectrofotómetro e cuvetes de plástico;
❖ Suporte para tubos de ensaio;
❖ Pipetas automáticas;
❖ Vórtex.
Solventes e Reagentes:
❖ Água destilada;
❖ Etanol;
❖ Radical DPPH.
3.4.2-Procedimento:
1. Inicialmente foi preparada, com uma concentração molar de 0,3 mM, uma solução de
DPPH com etanol. Esta solução foi preparada para todos pois seria necessária colocar
1 mL por cada amostra de todos os grupos;
2. De seguida, diluiu-se os extratos em etanol e água destilada (750 µL de etanol a 99.5%
e 250 µL H2O);
3. Preparou-se uma solução para cada estrato (com a mesma concentração 21.4 mg/mL)
previamente calculada, utilizando um tubo de ensaio com 10 mL com etanol a 75%;
4. No seguimento foram adicionados 2,5 mL da solução de cada extrato em 3 tubos de
ensaio de modo a o processo se feito em triplicado;
5. 3 tubos de ensaio foram utilizados como controlo onde foram adicionados 2,5mL de
etanol 75%;
6. Também foram feitos “brancos”, respetivos a cada estrato onde consistia em adicionar
2,5 mL de extrato juntamente com 1 mL de etanol em um novo tubo de ensaio;
7. Foi então ligado o cronómetro do telemóvel e adicionado 1 mL da solução DPPH de
15 em 15 segundos;
8. No final do processo, antes da leitura, foram colocados num local privados de luz.
9. Por fim foram lidas as absorvâncias no espectrofotómetro (Anexo 6-Tabela 5). Com
as absorvâncias obtidas foi possível calcular a percentagem de atividade antioxidante
(%AA) através da Equação 10 do Anexo 5.
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4-RESULTADOS E DISCUSSÃO:
4.1-Geral:
Para avaliar e quantificar os compostos fenólicos presentes na casca de manga, foram
considerados o rendimento da extração e o teor de compostos fenólicos dos extratos como
também a atividade antioxidante. Em seguida são apresentados os resultados obtidos, sendo
que as tabelas auxiliares para a obtenção dos resultados, incluindo a percentagem de
humidade das matérias-primas, encontram-se no Anexo 6.
4.2-Descrição específica:
Após a realização da primeira parte da atividade experimental, foi determinada a humidade
das amostras de matéria-prima (casca de manga), como a sua média, desvio padrão e
consequentemente coeficiente de variação (Tabela 5).
Assim podemos verificar que a matéria-prima apresentava baixa humidade pois, como já
referido anterior, existiu uma previa secagem em casa dos alunos, onde o seu valor foi 10,9±
1,3 %, obtendo assim um coeficiente de variação (CV) de 11,5 %.
Foi então avaliado o fator tempo e concentração de etanol, nos três processos (rendimento
de extração, teor de fenólicos e atividade antioxidante), como podemos observar no Figura 11
que teve como base as Tabelas (2), (4) e (5) presentes no Anexo 6 como já foi referido.
Figura 11-Efeito do tempo de extração (minutos) no rendimento de extração, teor fenólico e atividade antioxidante em %.
Ensaio Média DP CV
11,6
11,6
9,4
Humidade (%)
10,9 1,3 11,5
Tabela 5 – Humidade em percentagem da matéria-prima.
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Como se pode verificar pelos resultados obtidos na Figura 11 foi obtido um maior
rendimento da extração ao fim de 45 minutos (23,8), o que significa que o aumento do tempo
de extração compensou relativamente á quantidade de compostos fenólicos extraídos. O
menor rendimento aos 30 minutos pode dever-se ao decorrer ainda do processo de extração,
ou seja, ainda estão a ser obtidos compostos fenólicos ao fim de 30 minutos. Os valores dos
desvios-padrão são 8,1 no tempo de extração de 45 minutos e 9 no tempo de extração 30
minutos. É importante mencionar que o rendimento é razoável, mas baixo, pois na extração
inicial, as soluções apresentaram-se muito concentradas o que levou a uma diluição de 1: 4.
Relativamente ao teor fenólico, podemos observar que a extração feita a 45 minutos
apresenta, ligeiramente, uma concentração superior (13,2 > 12,9). Assim podemos extrapolar
que existe um aumento, ainda que seja pequeno, na extração de compostos fenólicos. Este
aumento reduzido pode significar que o tempo ótimos de extração foi atingido muito
provavelmente no intervalo de tempo 30-45 minutos. Os valores dos desvios-padrão são 2 e
1,8, respetivos ao aumento do tempo.
Por fim a atividade antioxidante, ao longo tempo, apresenta comportamento idêntico á
evolução do teor fenólico, sendo que aqui o aumento é muito mais vincado e notório, sendo
que, aos 45 minutos de extração apresentava uma percentagem de 61,2 crescendo de 48,1 ao
passar de 15 minutos. Os desvios-padrão obtidos são de 7,2 e de 2,8, sendo o primeiro de 30
minutos e o segundo de 45 minutos.
Em última análise encontra-se um gráfico (Figura 12), que pretende correlatar o resultado
obtidos dos três processos (rendimento de extração, teor de fenólicos e atividade antioxidante)
em função da concentração do solvente testado, durante o mesmo tempo (45 minutos).
Figura 12-Efeito da composição do solvente no rendimento de extração, teor fenólico e atividade antioxidante em %.
No que diz respeito ao rendimento da extração, para todas as razões diferentes de solvente
a que obteve melhor resultado foi 25: 75 e 75/25. Para além disso também se pode constatar
que quando o solvente é constituído por mistura de H2O com EtOH a rentabilidade é maior
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(excetuando o caso 50:50 devido a erros). Comparativamente aos ensaios puros tanto de água
destilada como de etanol é possível verificar uma afinidade similar, ou seja, existem
compostos fenólicos muito compatíveis com a água e com o etanol).
Na leitura dos teores fenólicos como na atividade antioxidante podemos constatar, apesar
de o gráfico não replicar muito bem os acontecimentos que deveriam ter ocorrido, que com o
aumento da concentração de EtOH na composição do solvente também deveria existir um
aumento progressivo nos valores obtidos, o que não se constatou totalmente e devidamente,
pois o que obteve maior percentagem foi 50: 50 decrescendo a partir daí.
Estes resultados poderiam ter sido influenciados pelo plano de extração, pois foi decidido
que seria 45 minutos nos três processos (rendimento de extração, teor fenólico e atividade
antioxidante), enquanto que o tempo ótimo para o processo seria entre 30-45 minutos, como
foi anteriormente mencionado.
Apesar de tudo, pode mesmo assim observar-se alguma tendência do aumento dos valores,
o que indica que os solventes mais seletivos e adaptados para a extração dos compostos
fenólicos da matéria-prima eleita (casca de manga) são os que possuem maior teor etílico.
De modo a obter resultados mais conclusivos e concretos seria necessário proceder á
realização de mais ensaios.
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5-CONCLUSÃO
Com a execução desta atividade experimental composta em quatro parte, foi possível
retirar várias conclusões.
Desde logo, em primeiro lugar, das condições laboratoriais descritas, as que se aproximam
das condições ótimas para a extração variam consoante a matriz vegetal utilizada.
Relativamente a casca da manga, o maior teor de compostos fenólicos, 13,2 ± 19, foi
obtido utilizando um solvente com razão de EtOH: H2O 50: 50 (v/v) e um tempo de extração
de 45 minutos.
Assim sendo, a matéria-prima é passível de ser utilizada, uma vez que apresenta bons
teores de compostos fenólicos, pelo menos nas condições experimentais analisadas
(importante de referir novamente que, após a obtenção do extrato foi necessário fazer uma
diluição 1: 4 pois era muito concentrado). A matéria-prima apresenta-se com grande potencial
para a aplicação como antioxidante nos alimentos (enriquecimento nutricional), nos
cosméticos (retardamento do envelhecimento), como entre outras áreas. Logo, sendo a casca,
um resíduo muito abundante e uma fonte de produtos de elevado valor acrescentado, deve ser
considerado no desenvolvimento do conceito de biorefinaria aplicada as indústrias.
Para que num futuro próximo, a casca de manga, possa ser utlizada como fonte, seria
necessário efetuar estudos mais pormenorizados para determinar a natureza dos compostos
fenólicos e poder-se-ia testar outras condições laboratoriais, como por exemplo o efeito
equipamento de extração e a temperatura de extração, e assim encontrar formas de aumentar
o teor de compostos fenólicos nos extratos.
Concluímos assim que, é possível afirmar que os objetivos delineados inicialmente foram
cumpridos parcialmente com êxito, pois foi possível extrair e quantificar os compostos
fenólicos através das diferentes condições experimentais descritas, com rendimentos e teores
de compostos fenólicos bastante satisfatórios. Pode-se afirmar ainda que alguns resultados
não são fiáveis, visto que os valores de coeficientes de variação referentes aos respetivos
ensaios são superiores em alguns casos a 15, sendo que seria necessário repetir, novamente, os
respetivos protocolos experimentais.
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7-ANEXO 1
7.1-Protocolo 1:
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8-ANEXO 2
8.1-Protocolo 2
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9-ANEXO 3
9.1-Protocolo 3
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10-ANEXO 4
10.1-Protocolo 4
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11-ANEXO 5
11.1-Equações:
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12-ANEXO 6
12.1-Tabela 1 - Determinação da humidade da matéria-prima.
12.2-Tabela 2 - Determinação do rendimento das extrações.
12.3-Tabela 3 - Curva padrão de ácido gálico.
Ensaio Média DP CV
1 45,9 46,3 46,3 0,4 0,4 11,6
2 48,1 48,6 48,5 0,5 0,5 11,6
3 46,4 47,0 47,0 0,6 0,6 9,4
Humidade (%)Matéria-prima Ensaio Caixa (g) Caixa + Amostra húmida (g) Caixa + Amostra seca (g) Amostra húmida (g) Amostra seca (g)
10,9Manga(Mangifera Indica ) 1,3 11,5
Ensaio Média DP CV
1,0 12 1,5 1 0,9139 0,9526 0,0387 0,3096 0,9 34,7297
1,0 12 1,5 2 1,0611 1,0914 0,0303 0,2424 0,9 27,1915
1,0 12 1,5 3 1,0627 1,0912 0,0285 0,2280 0,9 25,5761
1,0 13,5 1,5 1 0,9127 0,9455 0,0328 0,2952 0,9 33,1144
1,0 13,5 1,5 2 1,0565 1,0872 0,0307 0,2763 0,9 30,9943
1,0 13,5 1,5 3 1,0444 1,0742 0,0298 0,2682 0,9 30,0856
1,0 13,5 1,5 1 0,8885 0,9173 0,0288 0,2592 0,9 29,0760
1,0 13,5 1,5 2 1,0583 1,0726 0,0143 0,1287 0,9 14,4371
1,0 13,5 1,5 3 1,06 1,0876 0,0276 0,2484 0,9 27,8645
1,0 16 1,5 1 0,8981 0,933 0,0349 0,3723 0,9 41,7594
1,0 16 1,5 2 1,0469 1,0712 0,0243 0,2592 0,9 29,0760
1,0 16 1,5 3 1,059 1,082 0,023 0,2453 0,9 27,5205
1,0 17 1,5 1 0,9475 0,9754 0,0279 0,3162 0,9 35,4701
1,0 17 1,5 2 1,0494 1,064 0,0146 0,1655 0,9 18,5614
1,0 17 1,5 3 1,0396 1,056 0,0164 0,1859 0,9 20,8498
1,0 14 1,5 1 0,9161 0,9417 0,0256 0,2389 0,9 26,8026
1,0 14 1,5 2 1,0409 1,0623 0,0214 0,1997 0,9 22,4053
1,0 14 1,5 3 1,0491 1,0683 0,0192 0,1792 0,9 20,1020
Manga(Mangifera Indica )
Rendimento de extracção (%)Extracto seco total (g)MP base seca (g)MP base húmida extracção (g)Matéria-prima Volume alíquota (mL) EnsaioSolvente Epp. + extracto seco (g)Eppendorf (g)Tempo (min.) Razão sólido:solvente (m/v) Volume de extracto (mL) Extracto seco alíquota (g)
45
45
45
45
45
30
25,0
1:20
EtOH:H2O (50:50)
EtOH:H2O (100)
EtOH:H2O (50:50)
1:20
1:20
H2O
EtOH:H2O (25:75)
1:20
1:20
1:20
4,9 16,8
9,2 36,8
23,1 3,4 14,7
31,4 1,6 5,0
23,8 8,1 34,1
7,8 23,8
29,2
32,8EtOH:H2O (75:25)
Volume sol. ác. gálico Massa ác. gálico Conc. ácido gálico
(uL) nos 20 uL (ug) nos 20 uL (mg/mL)
1 4 4,09333 0,2047 0,093
2 8 8,18667 0,4093 0,401
3 12 12,28000 0,6140 0,564
4 16 16,37333 0,8187 0,726
5 20 20,46667 1,0233 0,807
Ponto Abs 765 nm Ord. Origem Declive
3,87784E-02 1,11004
33
Ext
raçã
o S
ólid
o-L
íqu
ido
de
Co
mp
osto
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ólico
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12.4-Figura 1 - Curva padrão de ácido gálico.
Solução de ácido gálico - x mg / mL EtOH
12.5-Tabela 4 - Teor de fenólicos nos extratos.
y = 1,11004E+00x + 3,87784E-02R² = 9,50764E-01
0,0000
0,2000
0,4000
0,6000
0,8000
1,0000
1,2000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
Conc. Solução Teor de fenólicos
no epp. (mg/mL)-1/4 (mg EAG/mL sol.) Ensaio Média DP CV
38,7 1,2 8,06250 1 0,415 0,499 6,195
38,7 1,2 8,06250 2 0,421 0,506 6,277
38,7 1,2 8,06250 3 0,434 0,521 6,456
32,8 1,2 6,83333 1 0,336 0,412 6,026
32,8 1,2 6,83333 2 0,307 0,380 5,555
32,8 1,2 6,83333 3 0,325 0,400 5,847
28,8 1,2 6,00000 1 0,782 0,907 15,114
28,8 1,2 6,00000 2 0,67 0,783 13,042
28,8 1,2 6,00000 3 0,585 0,688 11,469
34,9 1,2 7,27083 1 0,481 0,573 7,877
34,9 1,2 7,27083 2 0,528 0,625 8,594
34,9 1,2 7,27083 3 0,591 0,695 9,556
27,9 1,2 5,81250 1 0,437 0,524 9,013
27,9 1,2 5,81250 2 0,314 0,387 6,664
27,9 1,2 5,81250 3 0,338 0,414 7,122
25,6 1,2 5,33333 1 0,015 0,055 1,039
25,6 1,2 5,33333 2 0,514 0,609 11,425
25,6 1,2 5,33333 3 0,651 0,761 14,277
45
H2O 45
ETOH:H2O(50/50) 45
ETOH:H2O(50/50) 30
ETOH:H2O(75/25)
ETOH:H2O(100/0) 45
2,0
Massa extracto epp. (mg)*1000 Vol. Solv. epp. (mL)Matéria-prima
ETOH:H2O(25/75) 45
Solvente Tempo
15,7
Manga(Mangifera Indica )
1,8 13,8
0,8 9,7
1,2 16,4
Abs 765 nmTeor de fenólicos (%) (mg EAG/mg extracto * 100)
6,3 0,1 2,1
0,2 4,1
7,6
5,8
Amostra
13,2
12,9
8,7
34
Ext
raçã
o S
ólid
o-L
íqu
ido
de
Co
mp
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12.6-Tabela 5-Atividade antioxidante dos extratos (DPPH).
12.7-Tabela 6-Controlo do ensaio de DPPH.
Matéria-Prima Solvente Tempo Amostra Absorvância Ensaio Média D.P C.V
1 0,868 15,837
2 0,793 23,109
3 0,836 18,940
B 0 X
1 0,626 48,028
2 0,58 52,489
3 0,599 50,646
B 0,09 X
1 0,44 58,112
2 0,399 62,088
3 0,385 63,445
B 0,008 X
1 0,564 45,314
2 0,447 56,658
3 0,701 32,030
B 0 X
1 0,612 41,047
2 0,573 44,829
3 0,612 41,047
B 0,004 X
1 0,471 54,331
2 0,517 49,871
3 0,617 40,175
B 0 X
Manga(Mangifera Indica)
H2O
ETOH:H2O(25/75)
ETOH:H2O(50/50)
ETOH:H20(75/25)
ETOH:H20(100/0)
ETOH:H2O(50/50)
18,912
4,448
4,527
27,597
5,160
15,039
3,649
2,241
2,771
12,327
2,183
7,238
45
45
45
45
45
30
50,388
61,215
44,667
42,308
48,125
19,295
% Atividade Antioxidante
Controlo Ensaio Média D.P C.V
1 1,091
2 1,039
3 0,964
0,063846169 6,190643435
Abs
1,031333333
![Histolocalização de compostos fenólicos em folhas de ......A casca é usada para tratamento de queimaduras e como antidisentérico[10]. Seu uso industrial também é bastante demandado](https://img.document.onl/doc/110x75/60a78f4c74aea95eb20c6820/histolocalizao-de-compostos-fenlicos-em-folhas-de-a-casca-usada.jpg)
