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JosÉ B. O. AMORIM
FATORES REGULADORES DA SECREÇÃO DE ~ POTÁSSIO EM TÚBULO DISTAL CORTICAL DE
RIM DE RATO: (estudo de microperfusão tubular renal "in vivo").
~ Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências (Fisiologia).
Área de Concentração: Fisiologia
Orientador: Prof.Dr. Gerhard Malnic.
São Paulo 1999
Candidato: José Benedito Oliveira Amorim.
Título da Tese: FATORES REGULADORES DA SECREÇÃO DE
POTÁSSIO EM TÚBULO DISTAL CORTICAL DE RIM DE RATO:
(estudo de microperfusão tubular renal "in vivo").
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Tese de Doutorado,
em sessão pública realizada em .. .. ! ... J. J .. .. , considerou o
candidato:
( )Aprovado ( )Reprovado
1) Examinador(a)·-----------------
2) Examinador(a) ________________ _
3) Examinador(a), ________________ _
4) Examinador(a), ________________ _
5) Presidente. __________________ _
JOSÉ B. O. AMORIM
FATORES REGULADORES DA SECREÇÃO DE POTÁSSIO EM TÚBULO DISTAL CORTICAL DE RIM DE RATO: (estudo de microperfusão tubular renal "in vivo").
Tese apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências (Fisiologia).
Área de Concentração: Fisiologia
Orientador: Prof.Dr. Gerhard Maluic.
São Paulo 1999
Aos meus pais ("in memoriam")
Que me deram todo o apoio, incentivo e amor
Para o meu desenvolvimento;
A minha esposa, Rosana, e aos meus filhos
Guilherme e Rodrigo;
Pela compreensão, dedicação e carinho.
Ao Prof. Dr. Gerhard Malnic;
Dificilmente poderia resumir em poucas,
Palavras a importância de sua Presença,
De seu Exemplo e principalmente de sua
Amizade,
Por todos estes anos de intenso trabalho, mas
Repletos de Alegrias;
Meu eterno agradecimento pelo apoio, incentivo e orientação na
formação e continuidade da minha carreira.
AGRADECIMENTOS:
Á todos os Professores deste Instituto, com os quais tive a
oportunidade e a felicidade de enriquecer meus conhecimentos;
Á todos os funcionários pela ajuda a mim dispensada, especialmente
aos da Biblioteca deste Instituto, pelo apoio, e colaboração na
confecção final desta Tese;
Ao Prof.Dr. Horácio; Profa.Dra. Wilma e Prof.Dr. Divo, pelo
despertar e direcionamento da minha vida acadêmica-científica, e
principalmente pela amizade a que nos une.
Á todos os meus amigos, desta Universidade e de São José dos
Campos, Á CAPES, FUNDUNESP e FAPESP, pelo auxílio
financeiro,
E a todos que, direta ou indiretamente, colaboraram para a
realização deste trabalho.
ÍNDICE
I- INTRODUÇÃO ............................................................................................... O!
Angiotensina .................................................................................................... I 7 Bradicinina....................................................................................................... 19 Prostaglandina .................................................................................................. 22 Peptídeo atrial Natriurético .............................................................................. 25 Arginina Vasopressina ..................................................................................... 28
II- OBJETIVOS .... ............................................................................................... 31
III- MATERIAL E MÉTODOS........................................................................ 32
Fase cirúrgica................................................................................................. 32 Preparo das micropipetas duplas e microeletródios ....................................... 34 Metodologia da Microperfusão..... ................... ... .... ... .... ... .... ... .... ... ... ........... 36 Medidas de Potenciais elétricos e Análise das curvas de atividade de K+.... 38
IV- RESULTADOS ............................................................................................ 43
V- DISCUSSÃO ............................................................................................... 76
Efeito da Angiotensina II............................................................................ 77 Efeito da Bradicinina............. .... .... .. .. .. . .. .. .. . .. .. .... .. .. .. .. .. .... .. .. .. .... ... .. . .. . .. .. .. 81 Efeito da Prostaglandina E,....................................................................... 85 Efeito do ANP............................... .... .. .. .. .. .. . .. . .. .. .. . .. .. .. . .. . .. .. ... .. .. .. . .. .. .. .... . 87 Efeito da A VP........................................................................................... 90
VI- CONCLUSÕES .......................................................................................... 100
VII- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................... 103
ABSTRACT
It has been shown that luminal perfusion with collected proximal fluid
increases distal K+ secretion as compared to artificial solutions (Am. J.
Physiol. 258 (Fl523) 1990). This may be due to filtration or paracrine
secretion offactors stimulating K+ transport. Here we investigate severa! that
may act in this way. K+ secretion (h+) was measured by stationary
microperfusion in paired perfusions with contrai and A VP-containing 0.5
mM K+ solutions measuring the rate of increase of K+ activity and
transepithelial PD by double-barrelled microelectrodes. Luminal perfusion
with A VP and ANP stimulated K+ secretion, while ANGII, Bradykinin and
PGE2 inhibited h+. During luminal perfusion of A VP, h+ was 1.34 ± 0.35
(n~24 tubules) nmol.cm-2 s-1 during perfusion with 10"9 M A VP, against
0.90 ± 0.12 (n~21) in contrais (P< 0.02). Since luminal V1 receptors have
been described, a specific peptide V 1 antagonist (p-Mercapto-cyclopenta
methylenepropionyl-0-Me-Tyr-Arg-Vasopressin, MCM) was added to the
perfusate. With 10-9 M A VP + 10-6 M MCM, JK was 0.36 ± 0.067 against
0.77 ± 0.10 (contra!) (n~9) nmol.cm-2 s1 (P< 0.01). With 10"6 M MCM
alone, h+ was 0.37 ± 0.04 against a control of 0.62 ± 0.06 (n~ 19) nmol.cm· 2 s 1 (P<O.Ol). A peptide V2 antagonist had no such effect. ln Brattleboro
rats, which do not produce endogenous A VP, MCM had no effect when
given alone, although A VP still stimulated K+ secretion. ln conclusion,
luminal AVP stimulates distal K secretion significantly. The V1 antagonist
MCM inhibits the etfect of A VP, but also reduces h+ when given alone.
This suggests that A VP acts luminally via V 1 receptors, but also that there
appears to be a background effect of endogenous A VP blocked by the
antagonist.
Key-words: potassium, vasopressm, receptors, anti-V1, distal tubule,
microperfusion,
AA - Ácido Araquidônico
ADH- Hormônio antidiurético
4-AP- 4-Amino-piridina
ALDO - Aldosterona
GLOSSÁRIO
AMPc- 3'5'-Monofosfato cíclico de adenosina
ANGI - Angiotensina 1
ANGII - Angiotensina II
ANP- Peptídeo Atrial Natriurético
Anti-AT1- Antagonista de receptor AT1 de ANGII (Losartan)
A TP - Trifosfato de Adenosina
A V1 -Bloqueador de receptor V 1 de A VP
A V2 - Bloqueador de receptor V2 de A VP
A VP- Arginina Vasopressina
BK2- Receptor de Bradicinina
BK - Bradicinina
BK+- Canais de potássio de grande condutância
CaMKII- Cálcio calmodulina
DAG- Diacil-glicerol
DCC- Dueto Coletor Cortical
DCMI - Dueto Coletor Medular Interno
DNA- Ácido desoxiribonuclêico.
DPtrans - Diferença de potencial transepitelial
ECA - Enzima de Conversão da Angitensina
EP- Receptor de Prostanóide do tipo E (EP1,2,3,4)
FDC- "Food, Drug and Cosmetics Agency"
FSR - Fluxo sanguíneo renal
20-HETE- Ácido 20-Hidroxi-eicosatetranóico
GMPc - 3 '5 '-Monofosfato cíclico de Guanosina
HEPES- (Ácido N-[2-hidroxietil]piperazine-N' -[2-etanosulfônico])
IP3 -lnositol trifosfato
Maxi-K- Canais de potássio de grande condutância
MDCK- "Madin Darby Canine Kidney Cell"
NEP- Endopeptidase neutra
NO - Óxido Nítrico
NO-sintase - Enzima geradora de NO
PCR - "Polymerase Chain Reaction"
PG - Prostaglandina
PGE2 - Prostaglandina E2
PKA - Proteína Quinase A
PKC - Proteína Quinase C
PLA2 - Fosfolipase Az
PLC- Fosfolipase C
RFG -Ritmo de filtração glomerular
RNAm- Ácido ribonuclêico mensageiro
RNAr- Ácido ribonuclêico ribossômico
ROMK - "Rat Out Medullary Potassium Channel"
SCC- Sistema Calicreína-Cinina
SK - Canais de potássio de pequena condutância
SNC- Sistema Nervoso Central
"STOP FLOW"- Perfusão estacionária
TAL - Ramo ascendente espesso da alça de Henle
TEA- Tetraetilamônio
TCN - Túbulo Conector
Vm- Potencial de Membrana
V, -Potencial Transepitelial
I INTRODUÇÃO
O potássio (K+) é wn dos mais abundantes cátions do organismo. Este
íon participa de inúmeras funções celulares e sua concentração nos fluídos
intra e extracelular é mantida constante a despeito da grande variabilidade de
sua ingestão. Uma concentração adequada de K+ intracelular é requerida para
infuneros processos celulares vitais, tais como: tun ótimo crescimento celular,
divisão celular, síntese de DNA e proteínas, regulação de volume celular e
balanço ácido-base intracelular. Alterações da concentração intracelular do K+
levam a modificações do pH, o qual indiretamente influencia os processos
metabólicos por alteração da atividade de várias enzimas (ST ANTON &
GIEBISCH, 1992). Em adição, a excitabilidade do nervo e a contração
muscular dependem sobremaneira do potencial de membrana (V m), que por
sua vez , é dependente da diferença de concentração de K+ através das
membranas.
Dos 3,500mEq de potássio encontrados num homem de 70Kg, cerca de
98% estão confinados no líquido intracelular. Destes, cerca de 80% estão
contidos nas células musculares numa concentração de !50mEq/Litro. 2% do
potássio corpóreo (cerca de 70mEq) estão localizados no tluído
extracelular( cerca de 14 litros), onde a concentração fisiológica varia entre 3.5
a 5.5 mEq/litro (Figura 1 ). O mecanismo básico que mantém este gradiente de
cerca de 30 vezes entre os compartimentos intra e extracelular envolve a
atividade da bomba Na+,K+-ATPase, situada na membrana celular de todas as
células de manúferos (SELDIN & GIEBISCH,1989)(Figura 1).
A ingestão diária de potássio é de cerca de IOOmEq. Para ser mantido o
seu balanço, diariamente cerca de 90 mEq são excretados pelos rins e 1 O
mEq pelas fezes. Na situação normal, a excreção renal de potássio
corresponde a cerca de 18% de sua carga filtrada. Entretanto, dependendo da
2
condição metabólica do indivíduo, pode variar, desde 1% da sua carga filtrada
(na situação de carência de potássio) até cerca de 150% (durante sobracarga
deste cátion). Estes valores demonstram que, fisiologicamente, há extensa
reabsorção tubular e que, dependendo do caso considerado, esta pode
aumentar ou então pode ocorrer secreção tubular de potássio.
São descritos dois mecarusmos regulatórios que controlam a
concentração de potássio. O primeiro envolve a redistribuição de potássio
entre os compartimentos intra e extracelular. Vários hormônios, como por
exemplo a insulina e agonistas beta-adrenérgicos, aumentam o "uptake" de
K+ pela célula e desta forma retiram o K+ do espaço extracelular para o
intracelular (BIA & DeFRONZO, 1981). Já agonistas alfa-adrenérgicos
inibem a entrada de K+ na célula. Outros fatores não hormonais também
influenciam a captação celular deste cátion, como desequilíbrio ácido-básico,
tonicidade do plasma, citoesqueleto celular, entre outros.
3
Homeostase do potássio
INGEST ÃO(l OOmEq)
~ Fluido intracelular
3.500mEq(140-150mEq!L (>95%)
Gastro Trato Fluido Extracelular Músculo intestinal 70mEq(3.5-5.5mEq/L) Plasma 2.700mEq
17mEq -l~mEq 2% (3.5-5.5 -< mEq!L) -(0.5%)
~ Fígado
250mEa Osso
~ .... ~>- 300mEq Entrocttos
EXCREÇÃO RENAL 250mEq
90mEq
Figura 1- Panorama do balanço (homeostase) de K+ num indivíduo de 70Kg.
Observar a elevada concentração do K+ no líquido intracelular, comparado ao
fluido extracelular.
O segundo mecantsmo envolve o controle renal (STANTON &
GIEBISCH, 1992), pois o rim desempenha papel chave na regulação da
concentração extracelular de K+, desde que 90% da ingesta de K+ são
excretados pelos túbulos renais.
4
Mecanismos de transporte do potássio ao longo do néfro.
Todas as células v1vas possuem elevada concentração intracelular de
K•, e apresentam mecanismos de transporte que mantêm esta concentração.
Entre estes mecanismos destaca-se a Na-r/K-r-ATPase. Além disso, as
membranas de todas as células são permeáveis ao potássio, um processo que
atualmente é atribuído à presença de canais iônicos. Portanto, trata-se de uma
permeabilidade de alta especificidade, que varia conforme a natureza das
células, conforme sejam excitáveis ou não excitáveis, glandulares, ou
epiteliais. O rim tem um papel importante na regulação do potássio do meio
interno. Seu papel pode ser avaliado através do "clearance" de K+, que é
normalmente cerca de 20% do valor da inulina, indicando considerável
reabsorção tubular. Entretanto, em animais aos quais se administra uma
sobrecarga de K+, sulfato ou certos diuréticos como os inibidores da anidrase
carbônica, tal "clearance" se eleva, podendo exceder o da inulina. Por outro
lado, foi verificado que a excreção global de K+ é pouco afetada por variações
da carga filtrada. Berliner interpretou estes dados supondo que este íon seria
completamente reabsorvido no TP, sendo a quantidade que aparece na urina
proveniente de secreção em porções mais distais do néfro (BERLINER et
alii., 1950). Achados mais recentes, obtidos por métodos de micropunção em
ratos, confirmaram esta hipótese. Até o início do túbulo distal cortical (distal
convoluto) há reabsorção de cerca de 95% da carga filtrada. A partir deste
local se observa secreção de K+ sendo esta variável de acôrdo com o estado
metabólico do organismo. Em ratos carentes deste cátion, tal secreção distal
está ausente, mas está muito aumentada em ratos submetidos a uma dieta rica
de K+. No dueto coletor e possivelmente no túbulo distal pode ocorrer
reabsorção em vez de secreção de K+, em caso de hipocalemia. Desta forma,
---·-
5
as células tubulares renais apresentam mna série de mecanismos que modula
o transporte de potássio em sentido de sua reabsorção e/ou secreção.
Estudos de microperfusão e em ±luxo livre, demonstram que
aproximadamente 70% do K+ filtrado é reabsorvido, por difusão e por
"solvent drag", no túbulo proximal, em sua maior parte pela via paracelular,
movido pela DP lúmen-positiva dos segmentos S2 e S3. A existência de um
componente ativo na reabsorção de K+ pelo segmento S1 do túbulo proximal é
controvertida. O potássio sai da célula passivamente, por canais iônicos, pela
membrana basolateral, a favor do seu gradiente eletroquimico. Sob condições
fisiológicas, o ramo ascendente espesso (TAL) reabsorve, adicionalmente,
cerca de 25% da carga filtrada de K•, através do co-transportador 2CLNa+:K+
localizado na membrana lmninal das células situadas neste segmento. O K+
pode , em sua maior parte, voltar passivamente para a luz tubular, através de
canais específicos. Entretanto, quando o cotransporte Na+:K+:2Cr é
bloqueado por diuréticos de alça, pode ocorrer também secreção de K+ no
TAL (OBERLEITHNER et alii., 1983). Presumivelmente, ions de K+ são
secretados para dentro do lúmen, por canais de K+ sensíveis a ATP que são
responsáveis pela recirculação de K+ através da membrana apical (HEBER T
& ANDREOLI, 1984 ). Existem também evidências que a reabsorção de K+
no TAL é regulada por hormônios tais como a vasopressina (REEVES et alii.,
1989), que aumenta a condutância apical a K+ neste segmento e contribui
também para a estimulação da reabsorção de NaCI (REEVES et alii., 1989).
Entretanto, a reabsorção de K+ no túbulo proximal bem como no TAL,
não são mecanismos importantes na manutenção da horneostase de K+
extracelular (GIEBISCH, 1987). Estudos de micropunção e microperfusão
têm estabelecido firmemente que o dueto coletor inicial e cortical (DCC) é o
priucipal sitio de regulação fina da secreção de K+ (MALNIC et alii.,
1964/66/71; STANTON & GIEBISCH, 1982). No segmento final do túbulo
6
distal cortical (ou coletor inicial), existe uma diferença de potencial de cerca
de -40 m V lúmen-negativa, favorável a transferência deste cátion para a luz
tubular. A Na+1K+-ATPase, localizada na membrana basolateral mantém a
concentração celular de potássio elevada, fornecendo um potencial químico
considerável para secreção passiva de K+ que se observa nesse segmento
tubular. O potássio desta forma, pode ser transferido da célula para a luz a
favor deste gradiente eletroquimico através da membrana luminal.
Neste segmento existem dois tipos celulares: a célula principal,
responsável pela secreção de K+ e reabsorção de Na+ (KOEPPEN et alii.,
1983 ); e a célula intercalar; envolvida principahnente na reabsorção de K+ e
secreção de próton (H'), via trocador K+IH' (WINGO, 1990) e H'-ATPase do
tipo vacuolar (GLUCK et alii., 1996).
A técnica de microperfusão por bomba em túbulos renais "in vivo",
pennite a utilização de soluções artificiais com composição eletrolítica similar
àquela encontrada no fluido nativo tubular. Quando este método é aplicado
em túbulo proximal, a taxa de reabsorção de fluido e íons é sempre mais baixa
do que a observada durante a situação de fluxo liVTe (GERTZ, 1963;
MALN!C et alii., 1966/90; STANTON & GIEBISCH, 1982; STANTON &
KAJSSLING, 1988; OKUSA et alii., 1990; VELÁSQUEZ et alii., 1992). As
maiores diferenças relatadas entre a técnica de microperfusão por bomba e
fluxo liVTe são observadas no túbulo distal. Em rato, por exemplo, a taxa de
reabsorção de fluido na situação de fluxo liVTe é de 2.0-2.5nl.min-'.mm·'
contra 1.0-1.6 nl.min-1 tum·' na situação de perfusão por bomba na velocidade
de 5-7nl/min. A reabsorção de Na+ e a secreção de K+ também é afetada pela
perfusão com fluido nativo, particularmente em túbulo distal (KHURJ et alii.,
1975). Esta discrepância entre os resultados obtidos pelos métodos acima
descritos é bem evidente quando a concentração de potássio no fluido distal é
comparada sob variadas velocidades de fluxo. Enquanto que na situação de
7
fluxo livre, a razão de concentração de K+ transepitelial é mantida constante a
despeito de consideráveis oscilações de fluxo, uma queda significante é
observada durante perfusão por bomba, quando a velocidade de fluxo é
aumentada. De fato, a secreção de potássio é marcadamente prejudicada
durante perfusão luminal com solução artificial. Situação similar é observada
com respeito a reabsorção de Na+: o transporte aumenta com o aumento da
taxa de fluxo na situação de fluxo livre, enquanto que a dependência da
reabsorção de Na+ do fluxo de fluido tubular é ausente ou atenuada durante
perfusão com bomba. As razões para estes diferentes resultados ainda não são
claras. Uma possibilidade seria a ausência de uma substãncia que estimule o
transporte durante a perfusão por bomba (MALNIC et alii., 1990).
Quando se estuda o comportamento dos transportes iônicos em fluxo
livre, também a reabsorção de Na+ é maior que durante perfusão com soluções
artificiais; isto levou HAEBERLE et alii.(1983), a analisar o efeito de
microperfusão com fluido proximal coletado por micropunção tubular, sobre a
reabsorção proximal de Na+ (HAEBERLE et alii., 1983). Estes autores
verificaram que esta perfusão levava a um estímulo da reabsorção de fluido
em comparação com perfusões com soluções artificiais. Sugeriram a presença
de fatores endógenos, provavelmente adicionados ao fluido tubular durante
seu percurso ao longo dos túbulos renais, que poderiam exercer efeito
estimulante sobre o transporte iônico nos segmentos perfundidos.
Maís recentemente, foram realizados, em nosso laboratório,
experimentos em que túbulos distais corticais de rim de rato foram
perfundidos com fluido colhido por micropunção de túbulos proximais.
Verificou-se que nestas condições ocorria maior secreção de K+ que durante
perfusão com soluções artificiais (MALNIC et alii., 1990). Desta maneira,
comprovou-se que também a secreção de K+ podia ser estimulada por tàtores
presentes em fluido tubular nativo. Não ficou, no entanto, claro que tipo de
8
fator poderia ser este capaz de estimular o transporte tubular de K+ durante
microperfusões. Como o conhecimento da regulação do transporte de K+ por
fatores luminais de ação ainda desconhecida tem inegável interesse tanto do
ponto de vista do conhecimento da função tubular como de eventuais
aplicações farmacológicas, julgamos interessante perseguir esta questão.
Portanto, o objetivo deste trabalbo é investigar eventuais fatores que
possam estar presentes em fluído tubular, ou pela própria filtração do plasma
ao nível glomerular, ou através de secreção tubular em segmentos a montante
do túbulo distal cortical, particularmente ao longo do túbulo contorneado
proximal. Com esta finalidade, perfundimos o túbulo distal cortical com
soluções artificiais contendo substâncias que podem ser encontradas em
fluido tubular, incluindo diferentes agentes hormonais (Arginina
Vasopressiua, Angiotensina II, Bradicinina, Peptídeo Atrial Natriurético,
Prostaglandina E,) avaliando concomitantemente o fluxo secretório de
potássio (JK+).
O conhecimento dos mecantsmos de transporte de K+ renal foi
grandemente ampliado por dois métodos. Em primeiro lugar, a introdução
por ERWIN NEHER & BERT SAKMANN (1976) da técnica de "patch
clamp", através da qual foi possível estudar a localização e as propriedades
dos canais de K+ ao longo do néfro. Posteriormente, com as técnicas de
biologia molecular, foi possível clonar os canais de K+, fornecendo novas
idéias sobre a estrutura destes canais e sua provável regulação.
Os canais de K+ são constituídos por um diversificado grupo de
proteiuas de membrana, que facilitam o movimento de K+ através da
membrana celular. Geralmente, mais de um tipo de canal de K+ esta presente
em células de mamíferos. Vários trabalbos relatam as propriedades biofisicas
destes canais em tecido renal. Nos últimos anos, foram descritos alguns tipos
de canais de K+, com ampla caracterização molecular, e com seus prováveis
9
papéis fisiológicos. Alguns autores classificam os canais de K+ em dois
grandes grupos: um regulado por variações de voltagem, constituindo o grupo
de canais dependentes de voltagem (Kv), e o outro dependente de
nucleotídeos cíclicos (Knuo)(DESIR, 1995). Outro tipo de classificação, foi
recentemente apresentada por WEI et alii.(1996), baseada em sua constituição
molecular, contendo 2, 4 ou 6 segmentos transmembrânicos. Estes autores
chamaram a atenção para o fato de que o canal que possui 6 domínios
transmembrânicos, apresenta a estrutura molecular mais conservada entre as
espécies do reino animal.
Um tipo de canal de potássio descrito para tecido renal, contendo dois
segmentos transmembrânicos, ROMK, apresenta retificação para dentro, e é
similar aos canais IRK de retificação para dentro ("inward retifier")(BOIM et
alii., 1995). Estes canais são de grande interesse devido a várias
características ou propriedades comuns com canais de K+ nativos presentes na
membrana apical de células do ramo ascendente espesso e das células
principais do DCC
A despeito das similaridades de estrutura dos membros da superfamília
de IRK, os canais tipo ROMK mostram uma grande sensibilidade ao pH
intracelular maior do que a dos retificadores IRK. A redução do pH de 7 A
para 6.8, reduz a probabilidade de estado aberto destes canais. Esta marcada
sensibilidade da família ROMK para o pHi deve ser importante na
homeostase de K+ durante diferentes estados metabólicos (CHOE et alli.,
1997). Especificamente apóia a observação clínica que alcalose metabólica é
frequentemente acompanhada por aumento da secreção de K+ , e que a
hipocalemia desta alcalose poderia ser em parte explicada por tun aumento da
permeabilidade luminal ao K+ no DCC devido à elevação de pH (ST ANTON
& GIEBISCH, 1982, WRIGHT & GIEBISCH, 1992).
lO
Do ponto de vista molecular, esta proteína apresenta dois domínios
transmembrânicos (Ml e M2) e uma alça denominada região H5, similar aos
tetraméricos poros de canais de K+ dependentes de voltagem. As isoformas
destas proteínas estão distribuídas diferentemente ao longo do néfron. O canal
tipo ROMK2 é o mais largamente distribuído (ramo ascendente espesso,
dueto coletor cortical), ROMKl é especificamente expresso em dueto coletor
e a expressão do canal tipo ROMK3, é limitada à medula e ramo ascendente
espesso e túbulo distal convoluto (BOIM et alii., 1995; XU et ahi., 1997).
Segundo W ANG (1995), os canais de potássio desempenham pelo
menos quatro fimções em células epiteliais dos túbulos renais. Primeiro,
devido à sua alta especificidade ao potássio, estes canais participam na gênese
do potencial de membrana (Vm), ou seja, na diferença de potencial elétrico
(DDP) negativo celular, e deste modo suprem a célula de uma força movente
para difusão iônica através da membrana apical e basolateraL Segundo, a
ativação de canais de potássio por alteração de volume das células tubulares
contribue para o controle do volmne celular. Terceiro, a recirculação de íons
K+ por canais específicos para este cátion através da membrana apical e
basolateral é mn mecanismo essencial para manutenção de um fimcionamento
adequado de cotransportadores como o Na+:2Cr:K+, ou transportadores de
natureza ativa (permutadores) como a Na+.IK+-ATPase. Finalmente, uma
classe especial de canais de potássio de células principais localizada
principalmente em dueto coletor cortical, responde a uma grande variedade de
estímulos e desempenha o papel mais importante no processo da secreção de
potássio.
Descreveremos a seguir, a disposição destes canais ao longo do néfro,
bem como suas características funcionais, como conhecidas atualmente:
• Túbulo proximal - Neste segmento, os canais mais importantes são canais
de potássio sensíveis ao ATP, ao estíramento ("stretch") e também a
li
variações do pH, localizados na membrana BL. Concentração milimolar de
Mg-ATP e acidificação do citosol inibem a condutância de K+ por estes
canais, enquanto que o aumento de volume celular (Lw)("swelling") e a
aplicação de pressão negativa pela micropipeta de "patch clamp" ativam os
mesmos (BECKet alii., 1993; Ki\WARARA et alii., 1987; MEROT et
alii., 1989; SACKIN, 1995). Vários estudos sugerem que estes canais de
K" sensíveis ao ATP na membrana BL nas células do túbulo proximal
estão de certa forma associadas à ativação da Na",K"-ATPase (BECK et
alii., 1993). A redução do pH inibe os canais de K", um efeito consistente
com o decréscimo da condutância ao potássio na situação de acidose
(KUBOTA, et alii., 1983).
• Ramo ascendente espesso da alça de Hen1e - Dois tipos de canais com alta
probabilidade de estado aberto, com condutância de K", de cerca de 30 e
de 70 pS, estão localizados na membrana apical e sujeitos a regulação por
alterações do pH, concentração de ATP, proteína quinase A (PKA), e
proteína quinase C (PKC)(Figura 2)(W ANG, 1994). Ainda neste
segmento, apresenta-se um canal de potássio de alta condutância para o
K\ ativado por cálcio e por despolarização da membrana, porém com
probabilidade de abertura baixa, e ativação por aumento de volume celular
(tw) (GUGGINO et alii., 1987) (não mostrado na Figura 2). Estes canais
devem ser importantes para a regulação do volume celular e não para o
transporte de K", desempenhado provavehnente pelos canais de baixa
condutância (WANG et alii., 1990; PALMER & FRINDT et alii, 1994/
1997).
API CAL
Na+ __ _
Na +
2cr K+
12
TAL BASOLATERAL
Figura 2 - Regulação dos canais de K+ na membrana apical em células do
ramo ascendente espesso da alça de Henle (TAL).
Alterações na concentração de cálcio intracelular podem modular a
atividade de ambos os tipos de canais de K+ da membrana apical,
indiretamente, por ativação da PKC (W ANG et alii.,l996). Os canais de K+
luminais são também inibidos por pH ácido e por concentração milimolar de
ATP. AMPc e PKA, relativos aos eventos de sinalização celular de hormônios
como o ADH (ou Arginina Vasopressina), aumentam a atividade destes
canais. Tal aumento de condutância ao K+, leva também ao aumento da
reabsorção de cloreto de sódio devido ao incremento da recirculação de
potássio pela membrana apical (GIEBISCH,l998).
A Figura 2 mostra também que o ácido araquidôníco (AA), inibe os canais
lmnínais de K•, um efeito mediado pelo metabolito 20-HETE, do citocromo
P-450 (W ANG & LU, 1995). A inibição dos canais de K+ que segue a
ativação dos receptores de cálcio na membrana BL, provavelmente relaciona
se ao efeito do AA, e tem sido sugerido que metabolitos do citocromo P-450
podem mediar o efeito de alterações do cálcio extracelular na reabsorção de
cloreto de sódio por modulação da recirculação de potássio apicat
• Túbulo coletor cortical (DCC) - Dois tipos de canal de potássio apical
foram descritos neste segmento em rato e coelho (Figura 3). O primeiro
refere-se a um canal de alta condutância ao K+ , com baixa probabilidade
de abertura à DP fisiológica, dependente de voltagem e de concentração de
Ca++ intracelular. Este canal é inibido por TEA (tetraetilamônío) e
provavelmente está envolvido no controle de volume celular (GIEBISCH,
1998). O outro tipo de canal apresenta uma baixa condutância ao K•, com
retificação para dentro ("inwardly rectitying"), e com alta probabilidade de
estado aberto. Estes canais, provavelmente estão envolvidos com a
secreção distal de K•, localizando-se na membrana apical das células
principais de DCC (WANG et alii., 1995; GIEBISCH, 1998). Em resposta
a fatores como vasopressina, alcalinização celular ou "intake" alto de K•,
ocorre wn recrutamento de canais apicaís adicionais com conseqüente
aumento de secreção de potássio (CASSOLA et alii., 1993). O canal de
baixa condutância ao K+ apical é altamente sensível a acidificação do meio
intracelular, e a atividade do canal declina marcadamente quando o pH é
reduzido de 7.4 para 7.0 (CHOE et alii., 1997). Isto está coerente com os
efeitos da situação de acidose metabólica, na qual ocorre diminuição da
secreção de K+ no túbulo distal (G!EBISCH, 1998).
Uma importante propriedade da secreção de potássio apical, é sua
sensibilidade ao ATP. Estudos de "patch clamp" mostram que baixas
14
quantidades de ATP, por exemplo concentração submilimolar, são necessárias
para fosforilação e ativação dos canais, enquanto que concentrações da ordem
milimolar de ATP, inibem a atividade dos canais (WANG et alii., 1990;
GIEBISCH, 1998). Esta inibição pode ser revertida ou atenuada por ADP,
PKA dependente de AMPc, e por aumento do pH. Vasopressina estimula a
secreção de K+ por uma via dependente de PKA (CASSOLA et alii., 1993).
Estes resultados são consistentes com as observações de microperfusão
tubular "in vivo" e "in vitro" na qual ADH estimula a secreção de potássio
(SCHAFER et alii., 1990; FIELD et alii., 1984).
Existem vários estudos sugerindo que a proteina quinase C (PKC) e a
qninase dependente de C a++ -calmodulina (CaMKil), ativada por Ca ++, inibem
a atividade dos canais luminais de K+ (KUBOKAWA et alii., 1995). Outros
fatores que modulam a condutância apical de K+ incluem o efeito inibitório
direto do ácido araquidônico (AA) e a interação com o citoesqueleto celular
(WANG, CASSOLA & GIEBISCH; 199211994).
Foram identificados canais de K+ na membrana basolateral, mostrando
diferentes condutâncias unitárias (Figura 3)(HIRSCH & SCHLATTER,
1993). Um aspecto de interesse destes canais, refere-se a sua sensibilidade ao
pH, estimulação por NO e GMPcíclico, bem como inibição por aumento de
Ca++ e ATP celular (HIRSCH & SCHLATTER, 1993; WANG, 1995). Vários
estudos indicam que o óxido nítrico (NO) está envolvido na regulação de
transporte iônico nas células principais. Acredita-se que o NO estimula a
abertura dos canais de K+ basolaterais, uma vez que a inibição da NO-sintase
reduz a atividade destes canais, enquanto que agentes que promovem a
liberação de NO ou geração de GMPc (como o ANP), estimulam os mesmos
(W ANG, 1995). O NO e o GMPc hiperpolarizam o potencial de membrana e
desta forma favorecem a entrada de Na+ no lado luminal (LU & WANG,
1997).
15
API CAL CCD BASOLATERAL
Figura 3 - Acima: Regulação da secreção de K+ nas células principais do
túbulo coletor cortical (DCC). Abaixo, regulação dos canais de K+ na
membrana BL das células principais do mesmo segmento.
16
Agentes hormonais que influenciam a secreção tubular de potássio.
Vários são os fatores que afetam o transporte de K•, tais como:
elevação do ritruo (fluxo) de perfusão, presença de ânions impermeantes,
meio alcalino, entre outros, que estimulam a secreção deste cátion nos
segmentos finais do néfron. Além disso, existem inúmeros agentes hormonais
que participam da regulação da excreção de potássio nos segmentos finais do
néfro.
Entre os hormônios conhecidos que modulam a secreção de potássio,
destacam-se os mineralocorticóides. A regulação hormonal da excreção de K•
no rim depende em grande parte da ação da aldosterona. Entretanto, recentes
estudos não somente redefinem o papel da aldosterona, como sugerem a
participação de outros hormônios que participam da homeostase do K• no
rim, sob uma variedade de condições fisiológicas (FIELD & GIEBISCH,
1985).
Existem inúmeros trabalhos demonstrando o efeito dos
mineralocorticóides, especialmente da aldosterona, na reabsorção de Na•, e no
aumento da secreção de K+ e H+, em dueto coletor cortical (FIELD et alii.,
1984b ). Este hormônio penetra na membrana basolateral (MBL) por difusão,
devido a sua lipossolubilidade, aumentando de forma aguda a permeabilidade
da membrana luminal (ML) ao Na+ No citoplasma, a aldosterona combina-se
também com um receptor, tàrmando um complexo ativo, receptor-esteróide,
que por sua vez, penetra no núcleo e induz a transcrição de RNAmensageiro e
RNAribossômico, levando ao aumento da síntese de proteínas. Estas proteínas
podem estimular a secreção ativa de H+, bem como, o aumento da
permeabilidade ao Na+ na ML (estimulando a síntese e/ou incorporação de
canais). O aumento da concentração de Na+ intracelular estimula a atividade
17
da Na+1K+-ATPase da MBL, aumentando a reabsorção de Na+ e a
concentração de K+ intracelular. A estimulação do transporte de Na+ toma a
luz tubular mais negativa. Ambos os aumentos, da concentração intracelular
de K+ e da negatividade luminal, determinam uma elevação da secreção de
K+, amplificando o fluxo secretório inicial, induzido pelo eteito imediato da
aldosterona. A regulação da liberação da aldosterona pela supra-renal, decorre
principalmente de alterações da concentração plasmática de Na+ e de K+, e
dos hormônios adrenocorticotrófico (ACTH) e da Angiotensina II
(GIEBISCH,l992).
Estudos de efeitos agudos e crônicos de mineralocorticóides mostram
que existe um aumento na taxa de "turnover" da Na+1K+-ATPase, com
inserção de novas unidades desta ATPase na MBL, e aumento da
permeabilidade ao sódio e ao potássio da membrana apical. Em adição, o
simultâneo aumento na bomba eletrogênica associado ao aumento da
permeabilidade do K+ na membrana basolateral induz a uma marcada
hiperpolarização do potencial celular (cerca de -1 Oüm V). Estes efeitos
elétricos resultam numa difusão passiva de K+ através da membrana
basolateral. O aumento de K+ celular, por sua vez, aumenta a condutância
deste ion no lado lmninal (STANTON & GIEBISCH, 1992).
Angiotensina II ( AN G II).
O sistema renina-angiotensina é um elemento importante na regulação,
a curto e a longo prazo, da pressão sanguínea arterial. Fatores que reduzem a
pressão arterial, como as reduções no volume sangnineo eficaz (dieta
hipossódica, diuréticos, perda sanguínea, insuficiência cardíaca congestiva
18
(ICC), cmose hepática, síndrome nefrótica), ou as reduções na resistência
periférica total (vasodilatadores), ativam a liberação de renína pelos ríns.
A renína é uma enzima que atua sôbre o angiotensinogênio (substrato
da renina) para catalisar a formação do decapeptídeo angiotensina L Este
decapeptídeo é clivado pela enzima conversara de angiotensina (ECA)
produzindo o octapeptídeo angiotensina II.
A angiotensina II, por sua vez, atua através de diferentes mecanismos,
embora coordenados, para elevar a pressão arterial em direção aos seus
valores normais. Talvez o mais importante mecanismo seja a capacidade que
a angiotensina II tem em inibir a secreção de Na+ e H20 pelos rins.
A ANGII contribui para a regulação da excreção de Na+ através de seu
efeito estimulante na córtex da glãndula suprarenal, promovendo aumento da
secreção de aldosterona, e assim, aumentando a reabsorção de Na+
principalmente no nefro distaL No entanto, foi descrita também ação direta
deste peptídeo no nefro (BURNIER et alii., 1996). Em indivíduos normais, a
infusão de baixas doses de AN G II reduz a excreção urinária de Na+, enquanto
que a administração de um inibidor da Enzima de Conversão de Angiotensina
(ECA), aumenta a natriurese, ambos efeitos ligados à regulação da reabsorção
de Na+ nos segillentos proximal e distal do néfron (LIU & COGAN, 1987;
VOS et alii., 1993).
Estudos de microperfusão de lóbulos proximais no rato mostraram que
a administração de angiotensina em doses picomolares estímula a reabsorção
de Na+, particularmente pela ativação da pennuta Na+M (NASCIMENTO
GOMES & MELLO-AIRES, 1992).
O aumento de excreção nrinária de Na+ foi também descrito com a
utilização de bloqueadores de receptores da ANGI! em rato e cão (FENOY et
alii., 1991; BOVEE et alii., 1991). Durante microperfusão "in vivo" em ratos
Munich-Wistar, Losartan foi extremamente efetivo em inibir a reabsorção de
19
cr , bicarbonato e H,O no segmento SI do túbulo convoluto proximal (XIE et
alii., 1990). Losartan foi mais potente do que Captopril na inibição do
transporte de NaCL O bloqueio do sistema renina-angiotensina com inibidores
da ECA, geralmente causa um aumento do K+ plasmático, devido ao
decréscimo dos níveis plasmáticos de aldosterona. Já a ação do Losartan, em
alguns modelos experimentais, promove o aumento da excreção de K+
(BOVEE et alii., 1991; XIE et alii., 1991). Entretanto, em outros estudos,
demonstrou-se que este efeito foi transiente e não afetava os llive1s
plasmáticos de K+ (BURNIER et alii.,l993). Vários mecarnsmos foram
postulados para explicar a resposta caliurética do losartan. A excreção de K+
poderia resultar de um aumento da carga de Na+ no túbulo distal. Outra
explicação seria que o aumento da excreção de K+ estaria relacionado com
um aumento da concentração de ácido úrico presente no fluido luminal do
túbulo distaL Existem evidências mostrando que o túbulo proximal possui um
permutador urato/ânion, localizado em "brush border" de vesícula de
membrana, responsável pela reabsorção de ácido úrico (ROCH-RAMEL et
alii., 1994), sendo este pennutador sensível a presença de losartan. Em favor
desta hipótese, está o fato que a excreção de K+ e de ácido úrico apresentam
uma significante correlação positiva (BURNIER et alii., 1995).
Bradicinina (BK)
O Sistema Calicreina-Cinina (SCC) Renal, é composto por um
complexo conjunto multienzimático, do qual os principais elementos são: a
enzima calicreína, o substrato cininogênio, hormônios efetores ou cininas ,
dentre os quais se encontra a bradicinina (BK e lisii-BK), enzimas
metabólicas [entre as mais relevantes encontram-se a cininase I, cininase II
(ECA) e a endopeptidase neutra- NEP], e um número ainda desconbecido de
20
ativadores e inibidores de calicreína e outras cininases, Este sistema parece
participar de inúmeros processos complexos, tais como: eventos
inflamatórios, resposta à lesão tecidual, controle do volume extracelular,
regulação da pressão sanguínea, controle da excreção de sódio e água,
resistência vascular renal e liberação de renina (VIO, 1992).
A bradicinina é um nonapeptídeo, enquanto que a calidina, também
denominada lisil-bradicinina, apresenta tun resíduo lisina adicionado na
porção aminoternrinal. Os dois peptídeos são clivados a partir de a 2-
globulinas que são sintetizadas pelo figado e circulam no plasma, Esses
precursores são denominados de cininogênios, Existem dois cininogênios, o
cininogênio de alto peso molecular e o de baixo peso molecular, Numerosas
serinoproteases geram cininas, mas as proteases altamente específicas que
liberam bradicinina e calidina dos cininogênios são denominadas de
calicreinas,
Existem dois tipos de calicreínas: a calicreína plasmática de 88kDa, e a
calicreina tissular, proteína comparativamente menor, com massa molecnlar
de 29kDa, Esta última é sintetizada em numerosos tecidos, inclusive em
glândula salivar, SNC, sistema cardiovascular e rim, A síntese da pro
calicreina tissular é regulada por mnnerosos fatores, inclusive pela
aldosterona no run e nas glândulas salivares (GOODMAN & GILMAN,
1996),
O conhecimento atual da localização da calicreina no tecido renal,
através de várias metodologias aplicadas como: microdissecção de segmentos
de néfron de coelhos, imunoreação à calicreina em segmentos de néfrons
rnicrodissecados, estudos de rnicropunção em ratos, e estudos de
imunocitoquímica, indicam a presença desta enzima nas células do túbulo
conector (BEASLEY et alii,,1987). Estas células possivehnente podem estar
relacionadas também com a secreção de K+ distal, o que deixa em aberto
21
como estes fenômenos possam estar relacionados. Com respeito à presença de
calicreína na membrana plasmática, a enzima foi observada ao longo de
extensas àreas basais e luminais, como reportado recentemente em fiações de
membrana purificadas. A calicreína pode atuar na membrana como
ectoenzima, como sugerido por dados obtidos em suspensão de células
corticais; e pode ser liberada para dentro da urina e do compartimento
vascular, já que é encontrada em ambos os efluentes de ríns isolados
perfundidos. No rim humano, com os mesmos métodos, a calicreína também
foi localizada no segmento correspondente ao túbulo conector. A estreita
associação anatômica desta região com o aparelho justaglomerular sugere
uma função desempenhada pelas células do túbulo conector, como regnlação
do FSR, RFG e liberação de renína, o que é consistente com um efeito
parácrino. Isto é apoiado considerando a inexistência de calicreína no túbulo
proximal ( sugeríndo que a calicreína não é filtrada em quantidades
significantes no glomérulo )(VIO et alii., 1983). Porém em condições
patológicas como insuficiência renal crônica, pode ser detectada a presença
desta enzima no filtrado glomerular.
A fonte primária mas não exclusiva de biossíntese de cininogênios, é o
figado, porém pelo método de imunofiuorescência e imunocitoquimica, foi
demonstrada a presença deste substrato em células de dueto coletor de ríns de
rato, Fato curioso, nestes estudos, é a presença de cininogênio próximo à
calicreína em segmentos de transição entre túbulo conector e coletor de rim
humano.
A ação da calicreína sobre seu substrato leva à geração de cininas das
quars a bradicínína é a mais notada. A capacidade vasodilatadora desta
substãncia, que modula a fimção renal através de ação vascular e tubular, vem
sendo extensivamente ínvestigada, através de várias metodologias, como:
infusão e perfusão de bradicinina, administração de antagonistas, uso de
22
anticorpos, inibidores de cininases (Captopril, Enalapril), inibidores de NEP
(Phosphoramidon) e inibidores de cininogênio (aprotinina). As cininas
causam aumento do FSR, liberação de renina em glomérulo isolado, medeiam
a indução de hiperfiltração por dieta rica em proteínas, inibem a resposta
hidrosmótica da vasopressina em dueto coletor cortical isolado, bem como a
reabsorção de sódio no dueto coletor medular interno.
Os receptores de cininas têm sido caracterizados através de técnicas
farmacológicas, bioquímicas e de clonagem molecular (CHAJ et alii., 1996; -
SONG et alii., 1996) sendo localizados em células justaglomerulares, células
mesangiais, segmento fino e espesso da alça de Henle, túbulo proximal e
distal. Bradiciuina também causa um relaxamento dose-dependente de
arteríolas aferentes isoladas de ratos (EDW ARDS, 1985). Ainda, um sítio
ligante semelhante ao receptor de BK foi descrito em membrana glomerular
de ratos. O sítio específico e sua afinidade, parecem ser semelbantes ao
receptor de ciniua BK2. O receptor mais importante da bradicinina no rim,
BK2, tem sido localizado por técnicas de PCR reversa e hibridização "iu
situ" de RNAm, em quase todos os segmentos do néfron. Sua maior densidade
está em dueto coletor, conector e pars recta do túbulo proximal (SONG et
alii., 1996; MAR!N-CASTRANO et alii, 1996).
Prostaglandina E2 (PGE,)
As Prostaglandiuas (PG) compreendem uma diversificada familia de
lípides biologicamente ativos, derivados do metabolismo do ácido
araqnidônico, pela ação da ciclooxigenase. O rim é particularmente uma fonte
rica destes prostanóides, sendo a PGE2 seu maior metabólito renal, atingindo
concentração urinária da ordem de nanomolar, enquanto na circulação sua
concentração é bem menor, na faixa de picomolar (DUNN & HOOD, 1977;
21
BONV ALET et alii., 1987). A produção local pode ser estimulada por vários
hormônios nicluíndo angiotensina, vasopressina e bradicinina, e por outro
lado os prostanóides modulam também a ação destes hormônios (BREYER et
alii., 1996). A PG regula a hemodinâmica renal e existem evidências de sua
açào no transporte de soluto e água, apresentando efeitos distintos sobre
células alvo do tecido renal, dependendo do tipo de prostaglandina (PGE2 ,
PGh,PGFz,Ir.) ou do tipo de receptor presente.
Recentemente foram descritos múltiplos receptores de prostaglandinas,
através de estudos farmacológicos, utilizando-se análogos estruturais de PG.
A nomenclatura para tais receptores foi padronizada, e assiin todos receptores
para prostaglandina E2 são referidos como receptores EP(E-Prostanóide ), e
seus subtipos foram descritos como EP~, EP2, EP3 e EP4 (COLEMAN et alii.,
1994; TOH et alii., 1995; REGAN et alii., 1993/1994).
A sequência amino-acídica destes receptores foi reportada, constituindo
sete domínios transmembrânicos característicos de receptores acoplados a
proteína-G (HENDERSON et alii., 1990; NAMBA et alii., 1993). A ativação
de cada receptor, por sua vez, está ligada a uma determinada via de
transdução de sinal. O receptor EP1 está acoplado à via Inositol Trifosfato
(IP3) e Diacil-glicerol (DAG); o receptor EP3, acoplado à proteína Gi; e os
receptores EP2, EP4, acoplados à proteína G, (COLEMAN et alii., 1994;
BREYER et alli., 1996).
O receptor EP 1 foi originalmente identificado pela sua capacidade de
causar contração muscular lisa em vários tecidos. O papel intrarenal deste
receptor foi somente parcialmente caracterizado. Por hibridização "in situ"
mostrou ser expresso em DCC de camundongo e homem. Em DCC de coelho,
a PGE2 inibiu o transporte de Na• por um mecanismo acoplado a liberação de
Ca++ de estoques intracelulares (HEBERT et alii., 1993). Este aumento de
Ca ++ é mimetizado por sulprostone, ativador do receptor EP1, mas não é
24
reproduzido por ativadores de receptor EP3 (MB28767) ou de receptores
EP,!EP3(11-deoxi-PGE2), e pode ser bloqueado por aotagonistas de receptor
EP1 (FOWLER et alii., 1995).
O receptor EP, foi clonado em homem, coelho, rato, camundongo e
vaca (BREYER et alii., 1996). Esta classe de receptor parece ser a única que
permite vários tipos de "splicing" alternativos. Pelo menos 9 tipos de
isoformas são expressas no homem, 4 em coelhos, e 3 em rato e camundongo.
Foram expressadas 4 isoformas de receptor EP3 de glândula adrenal bovina
(NAMBA et alli., 1993) e designadas EP,A.B.C.D·
Dos quatro subtipos, o EP3 parece ser o mats ubíquo. O RNA
mensageiro do receptor EP3 é muito expresso em riin e útero, e é expresso
também em estômago, tiino, baço, pulmão, e cérebro (SUGIMOTO et alli.,
1992). TAKEUCill et alli. (1993), clonaram receptor EP3 em rato e
exatninaram a distribuição de seu mRNA em rim através de transcrição
reversa e PCR, em segmentos de néfrons dissecados. Seus resultados indicam
que estes receptores são expressos em segmento espesso da alça de Henle e
dueto coletor no córtex e na medula renal.
Ftmcionalmente, os receptores do grupo EP3 parecem estar envolvidos
em pelo menos dois processos intracelulares, run dos quais resulta na inibição
da liberação de neurotraosmissores, da secreção ácida gástrica, e da lipólise; e
o outro envolve a contração da musculatura lisa. No primeiro processo, as
respostas são todas classicamente mediadas por inibição da adenilciclase e no
último, por arunento de cálcio livre intracelular, quer de origem extra ou
intracelular. Em epitélio de túbulo coletor cortical, a ocupação destes
receptores causa inibição da geração de AMPc induzida pelo tratamento com
A VP (SONNENBURG & SMITH, 1988). Este receptor está aparentemente
envolvido "in vivo" na inibição da reabsorção de ágna estimulada pela A VP
(SMITH, 1989). A atividade do receptor renal EP3 é bloqueada pela toxina
Z5
pertussis, indicando que o receptor é acoplado à proteína G,
(SONNENBURG et alli., 1990); além disto, o mesmo receptor tem sido
parcialmente purificado em associação com a proteína G sensível a toxina
pertussis (WATANABE et alli., 1986, 199la). Assim, o receptor EP3 renal
parece estar acoplado a proteína Gi e está envolvido na inibição da formação
de AMPc. Este mecainsmo também é descrito em estômago, onde o EP3 está
envolvido na inibição da secreção ácida induzida pela histamina (REEVES et
alli., 1988), e em tecido adiposo, onde inibe a lipólise induzida pela epinefrina
(BUTCHER & BA!RD, 1968; STRONG et alli., 1992) [Estes últimos eventos
mediados por EP3 são inibidos pela toxina pertussis ].
PGE2 e agonistas EP3 (M&B 28767) diminuem o túvel de AMPc
estimulado por forskolin em células que expressam receptor EP3
(camundongo). lnteressantemente, embora PGE, e M&B28767 possuem
afinidade siuúlar por receptor EP3 recombinante, a potência do análogo sobre
preparações contendo receptor EP3 nativo é duas ordens de grandeza maior do
que a de PGE2. Esta diferença parece refletir a grande eficácia deste agente
M&B, resultando numa eficiência maior na estimulação do complexo
receptor-M&B do que do receptor-PGE2 (SUGIMOTO et alli., 1993).
Peptídeo Atrial Natriurético(ANP).
A forrna ativa do ANP é um polipeptídeo contendo 28 aminoácidos
(ANP28). Desde a descoberta e a caracterização deste peptídeo, que estimula
a natriurese e a diurese, vários outros agentes tem sido identificados. Os
miócitos atriais secretam o pro-hormônio que apresenta 126 resíduos
aminoacídicos, que após clivado fornece o ANP, contendo 28 aminoácidos
(99-126). Nas diferentes espécies de mamíferos o ANP difere apenas num
aminoácido na posição 12, tal como isoleucina em rato, e metionina em
26
humanos. O ANP, também denominado Fator Atrial Natriurético, pertence a
uma família denominada de peptídeos natriuréticos, nos quais se incluí o
"braín natriuretic peptide" ou BNP, que apesar do nome também é encontrado
em músculo atrial e ventricular, além do peptídeo natriurético do tipo C
(CNP), presente em células nervosas e endoteliais, e curiosamente com pouca
atividade natriurética em mamíferos (MAACK, 1996). Um outro componente,
ANF32, também denominado urodilatina, foi detectado na urina e em células
do túbulo distal.
O estímulo para secreção de ANP é o estiramento do tecido atrial
cardíaco. Assim, o aumento do volume plasmático, ou o aumento da pressão
venosa, são potentes estímulos fisiológicos para sua secreção. As principais
ações do ANP incluem: um efeito direto sobre o rim, influindo na
hemodinâmica renal, com aumento da excreção de água e eletrólitos; um
antagonismo funcional do sistema renina-angiotensina-aldosterona, por
inibição da síntese de renina e aldosterona, e também por antagonizar todos os
efeitos conhecidos da ANGII; também desempenha um antagonismo da
atividade autonômica, que causa vasoconstricção, e finalmente por promover
um aumento da permeabilidade hidráulica capilar, estimulando movimento de
fluído do compartimento intra vascular para o intersticial.
O ANP aumenta significativamente a carga de Na+ nos segmentos
finais do néfro, fato essencial para seu efeito natriurético. As razões para este
aumento são múltiplas e incluem: arunento do ritmo de filtração glomerular
(RFG), diminuição da hipertonicidade da medula interna que diminui o efluxo
passivo de fluído no ramo descendente da alça de Henle, e um efeito tubular
direto que reduz a reabsorção de Na+ no dueto coletor medular interno
(DCMI) (ATLAS & MAACK, 1992).
Um aspecto fisiológico importante do ANP está relacionado ao seu
efeito inibitório sôbre o sistema renina-angiotensina-aldosterona. A infusão
27
aguda de ANP inibe a secreção de aldosterona pela adrenal, resultando num
decréscimo dos níveis plasmáticos dos hormônios antinatriuréticos (BURNET
et alii., 1984; MAACK et alii., 1984). A diminuição da aldosterona plasmática
em parte é devida à diminuição da atividade da renina no plasma, e em outra
parte ao efeito direto inibitório (do ANP) na zona glomerulosa da adrenal, na
síntese de aldosterona. A mais provável explicação para o decréscimo da
secreção de renina é o aumento da carga de Na+ na mácula densa (ATLAS et
alii., 1992). O ANP também antagoniza todos os efeitos conhecidos da
ANGII, como vasoconstricção periférica, atividade promotora de crescimento
de célula muscular lisa vascular , reabsorção de Na+ proximal, bem como o
efeito dipsogênico central. Estes efeitos antagônicos provavelmente estejam
relacionados com o decréscimo de Ca ++ intracelular, uma vez que em célula
muscular lisa vascular foi descrita uma estimulação da Ca ++ -ATPase do
sarcolema devido à ativaçào de uma via intracelular dependente de GMPc, ao
qual o ANP está relacionado.
Existem bioquimicamente e funcionalmente duas classes distintas de
receptores para o ANP. Uma compreende os receptores envolvidos na
ativação do GMPc. Estes receptores, dependendo da afinidade com que se
ligam ao ANP ou aos seus derivados, podem ser divididos em Tipo A (alta
afmidade) e B (baixa afinidade) (CHANG et alii., 1989, SUDOH et alii.,
1990). A segunda classe corresponde aos receptores do Tipo C, também
denominados receptores de "clearance". Estes não estão acoplados à atividade
do GMPc, podem ligar-se ao ANP ou a qualquer derivado com afrnidade
similar, e não levam a efeito natriurético. Acredita-se que os receptores do
tipo C tenham importàucia para a remoção do ANP da circulação, pois após a
ligação hormônio-receptor, decorre intemalização ( endocitose) deste
complexo e posterior desintegração do hormônio por hidrólise lisossomal,
enquanto os receptores são reciclados. Assim os receptores C atuam como um
28
sistema tampão hOtmonal, impedindo grandes e inadequadas flutuações de
ANP no plasma (NUSSENZVEIG et alii , J 990; BROWN & ZUO, 1992;
ANAND-SR!V ASTA V A & TRACHTE, 1993; MAACK, I 996)
Vários trabalhos mostraram que o tecido renal apresenta wna ampla
distribuição destes receptores, particulannente em córtex renal (NAPIER et
a]ii,, !984; YlP et alii, 1985) e no glomérulo (BALLERMANN et aliL, 1985;
BUTLEN et a]ii,, 1987} TERADA et alii, (1991), detectaram altos níveis de
RNA mensageiro para o receptor de ANP em tubulos renais isolados, no
glomérulo e dueto coletor medular intcnw, enquanto outros segmentos rena]s
como CCD, túbulo convoluto proximal c distal apresentaram níveis muito
baixos de expressão,
Arginina-Vasopressina (AVI')
O honnônio neurohipofisário argum1a~vasopressma, sintetizado nos
núcleos supra-optico e paraventricular do hipotálamo, apresenta múltiplas
ações, incluindo a inibição da diurese~ contraçâo da célula muscular lisa,
agregação plaquetária, estimulação da glicogenólise no figado, modulação da
liberação do horrnônio adrenocortícotrófico (ACTH), e ainda pmticipa da
regulação central de alí,,'llmas funçôes somátícas, como termoregulação e
regulação da pressão sanl,'llínea (JARD et alíí,, 1988), Estas mítltiplas ações
poderiam ser explicadas pela ínteração do A VP com pelo menos três tipos de
receptores acoplados a proteína G: o receptor V 1a{ vascular, hepático) c
V1b(hipófise anteríor) relacionados com a via dos fosfoinositideos, com
ativação da fosfolipase C e liberação do CaH intracelular (NATHANSON et
alíí,, !992); e os receptores V2 (rim), acoplados a via adenil-ciclaseiAMPc,
A clonagem e a expressão dos receptores de A VP, contimram que são
pmtencentes a uma familia aeoplada a proteína G, caracterizados por sete (7)
29
domínios transmembrânicos. A expressão do RNA mensageiro que codifica o
receptor V ta, é abundante em fígado e rim de rato e está presente também no
tecido nervoso (MOREL et alii., 1992; OSTROWSKI et alii., 1993). A
transcrição do receptor V 2 é alta no tecido renal, especialmente no dueto
coletor e ramo ascendente espesso da alça de Henle (OSTROWSKI et alii.,
1994). O A VP circulante, uma vez ligado ao receptor V2, promove aumento
da permeabilidade dos segmentos fmais do néfron à água, levando à
concentração urinária e a conservação de água pelo organismo.
NITSCHKE et alii.(l99\ ), descreveram também a presença de
receptores do tipo V1 nos segmentos distais, como dueto coletor cortical e
medular. O mesmo resultado foi mostrado por HIRASAWA et alii.(l994),
através de experimentos de PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain
Reaction), bem como por TERADA et alii.(l993), detectando a expressão de
RNA mensageiro de receptores do tipo V1, em glomérulo, DCC, dueto coletor
medular interno e externo. Por outro lado, existem também evidências de que
a A VP, aluando em receptores V 1, modula o transporte iônico (BARRE TO
CHAVES & De MELLO-AIRES, 1997).
A via adenil-ciclase/ AMPc envolve a participação da proteína quinase
A (PKA). Está bem caracterizado que o AMP c estimula a permeabilidade à
agua e a condutância de Na+ apical no DCC. Foi demonstrado também, que o
AMPc aumenta a secreção de K+ neste segmento (SCHLATTER &
SHAFER, 1987; ABRAMOW et alii., 1987). Foi sugerido que o efeito do
AMPc sobre a secreção de K+ resulta no aumento da força movente para o
K+, através da membrana apical (SCHAFER et alii.,l990). Em estudos de
"patch-clamp", em DCC de ratos, foi demonstrado que o AMPc causa
abertura de maior número de canais de baixa condutância a K+ por intermédio
da proteína quinase A (PKA)(CASSOLA et alii., 1993).
30
Recentemente, um canal para K+ (ROMKl) regulado por ATP e
apresentando retificação para dentro, possuindo muitas propriedades
semelhantes aos canais de pequena condutância de K+, foi clonado de medula
externa de ratos (HO et alii., 1993 ). A sequência de arninoácídos do ROMKl,
revela vários sítios putativos para fosforilação por PKA, fornecendo assim
novas evidências do envolvimento da PKA neste processo. Outro aspecto, é
que em células A6, que apresentam propriedades funcionais similares às
células principais de DCC, o AMPcíctico aumenta significativamente a
densidade dos canais de K+ de baixa condutância (HAMILTON & EATON,
1991).
A importância do papel da PKA na modulação da atividade do canal de
K+ vem sendo explorada pelo estudo dos efeitos do ADH sobre a condutância
apical deste cátion. Desde que a razão de permeabilidade entre a membrana
basolateral e luminal não foi alterada por A VP, foi sugerido que o aumento da
força movente para K' seria responsável pelo efeito estimulatório do A VP
sobre a secreção de K', ao invés do aumento da condutância luminal ao K'.
Entretanto, se a condutância em ambos os lados da membrana foi estimulada,
nenhuma alteração de razões de permeabilidade seria observada. Esta hipótese
foi investigada em experimentos de "patch-clarnp". A aplicação de ADH (10-
200 pM), significantemente estimulou a atividade do canal em patches "cell
attached". Este efeito pode ser mímetizado pela adição de AMPc,
particularmente de formas permeantes em membrana, como o db-AMPc
(dibutyril-AMPc), ou pela adição de um inibidor da fosfodiesterase (W ANG,
1995).
31
II - OBJETIVOS
Como revisto na introdução a este trabalho, a secreção de potássio no
néfro distal depende da natureza do fluido que o perfunde. Quando esta
perfusão é realizada com fluido tubular nativo, é observado maior ritmo de
secreção que durante a perfusão com soluções exclusivamente salinas,
artificiais. O presente trabalho foi realizado para investigar eventuais fatores
estimuladores da secreção tubular de potássio que possam estar presentes em
fluído tubular, ou pela própria filtração do plasma ao nível glomerular, ou
através de secreção tubular em segmentos a montante do túbulo distal corticaL
Com esta fmalidade, perfundimos o túbulo distal cortical com soluções
artificiais contendo substãncias que podem ser encontradas em fluido tubular
nativo, como diferentes agentes hormonais (Arginina-Vasopressina,
Angiotensina li, Bradicinina, Peptídeo Atrial Natriurético, Prostaglandina E2)
em concentrações norma e suprafisiológica, avaliando-se concornítantemente
o fluxo secretório de potássio (Jk+).
32
III- MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados ratos albinos Wistar machos, pesando entre 180 a
340g, fornecidos pelo biotérío central do Instituto de Ciências Biomédicas,
USP, além de ratos Brattleboro, que são geneticamente desprovidos de
hormônio antidiurético (A VP), fornecidos pela Escola Paulista de
Medicina(UNIFESP).
Os animais receberam dieta sólida padrão (NUVlLABcrl, PR) e água
"ad libitum" até o momento do experimento. Durante a fase experimental, os
animais foram anestesiados com Inactin (Byk-Gulden, Konstanz, FRG), na
concentração de JOOmg!Kg de peso corpóreo. Este anestésico apresenta as
seguintes vantagens: rápida indução anestésica, permite uma respiração
regular e ausência de alteração da pressão sanguinea. Caracteriza-se ainda por
manter um longo período anestésico, dispensando doses complementares. Sua
utilização tem sido constante em nosso laboratório e seus beneficias têm
suplantado seguramente suas restrições apontadas na literatura) como as
evidências da depressão na reabsorção tubular proximal em ratos anestesiados
pelo Inactin, comparando-os com ratos anestesiados por barbiturato
(VESTRJ, 1992).
Os animais controles, a segu1r, receberam infusão salina e annna1s
foram preparados para microperfusão "in vivo" como descrito previamente
por GIL & MALNIC (1989). Resmnidamente os experimentos consistiam das
segumtes etapas:
Fase cirúrgica.
1 - Os animais foram levados a uma mesa cirúrgica com temperatura
mantida a 3 7"C, por meio de uma placa aquecida. Posteriormente, foi feita a
33
traqueostomia e canulação da veia jugular para infusão com solução de NaCl
0.9% acrescido de 3% de manitol, mediante uma bomba de infusão contínua
(Havard Apparatus, MA, USA), nmna velocidade variando de 0.05 a 0.1
mllmin, os Brattleboros, por outro lado, devido à perda continua de água,
receberam infusão contendo solução de NaCI(55nnnol!l), NaHCo,
(20mmol/l), KC1(3mmol/l), acrescido de I% de manitol, na velocidade de O. I
a 02ml/min.
Em alguns grupos experimentais, foi feita a canulação da artéria
carótida, a fim de coletar amostras de sangue para a medida de pH, Pco,,
através de mu pHmetro (Radiometer BMS3/MK2), bem como determinar as
concentrações de Na+ e K+ por fotometria de chama (B262, Micronal, Brasil).
2 - Os animais foram colocados em decúbito lateral direito, sendo o rim
esquerdo exposto por incisão lateraL Este foi liberado da gordura perirrenal,
através da divulsão deste tecido por utilização de pequena tesoura reta
cirúrgica com ponta arredondada. O rim foi fixado em mu suporte acrílico e
imobilizado com agar 5% em solução fisiológica. Uma pequena área na
superficie renal, centro-lateralmente, foi mantida livre de ágar, a fim de
permitir o acesso dos microeletródios e micropipetas instalados nos
micromanipuladores.
3 - A visualização tubular foi realizada através de microscópio
estereoscópio (Leitz, Alemanha), com amuento de 40 à IOOx, sendo o rim
transilurniuado por mu bastão de quartzo, acoplado a mua lâmpada de
tungstênio. O rim foi banhado durante todo o experimento com solução
Ringer a 3 7°C A cauda do rato foi seccionada em sua extremidade e
mergulhada em "beaker" contendo solução salina e fazia contato elétrico por
ponte de Agar/KCl com uma hemicélula de Agi AgCL Desta forma, o
34
compartimento extracelular do animal foi utilizado como nível de referência
das medidas elétricas realizadas.
Preparo das micropipetas duplas e microeletródios
Foram confeccionadas micropipetas duplas, utilizando-se capilares
duplos do tipo Tlieta (R & D. optical systems, lnc., Spencerville, MD, USA).
Cada capilar foi estirado verticalmente (Narishige, modelo P2, Japão) e
bizelado por um microesmeril (Fabricado na oficina do Departamento de
Fisiologia e Biofisica do ICB, USP) para obtenção de nm bizel com diâmetro
de ponta entre 12 e 15 J.!m. A micropipeta dupla continha em nm dos ramos
solução perfusora controle contendo I 00 mM de NaCI, 1 O mM Hepes, 1mM
CaCJ,, 1 mMgS04, 1 mM NH.Cl, 0.5mM KCI, pH 6.5, e acrescentava-se
rafinose para manter a osmolalidade em 300müsm. Adicionava-se também
nm corante verde FDC 0.05% para facilitar a identificação do segmento renal
perfundido O outro ramo foi preenchido com óleo de rícino corado com
negro sudan (Sudan-black) com a finalidade de se bloquear a coluna de fluido
perfusor dentro do lnmen ("stopped flow microperfusion").
Para os microeletródios duplos, utilizamos capilares duplos do tipo
Hi1genberg (Malsfeld, Alemanha), assimétricos (ramo maior com 1.6mm de
diâmetro externo, ramo menor com 0.8mm). Inicialmente os capilares foram
estirados verticalmente (Narishige, modelo P2, Japão), de forma a obter-se
diâmetro de ponta de I J.!m. Devido à natureza apoiar da resina de troca iôníca,
o ramo maior, onde é adicionada esta resina, sofria nm processo de
silanízação (hidrofobização ).
Este processo consiste na reação dos gmpos hidroxila do vidro com o
átomo de silício do composto orgânico Hexamethyldisilazano (Fluka
Chemika, Buchs, SW), através da exposição do capilar ao vapor deste
35
composto, por um periodo médio de 30 min. A silanização foi realizada
através da adição de 0.2ml de disilazano em uma cãmara de vidro, com 15cm
de altura por 5cm de diãmetro, com tampa de rosca, e com uma vedação de
borracha adaptada para permitir a fixação dos microeletródios e impedir o
vazan1ento do composto. Esta câmara foi também mantida em capela com
exaustão, durante este procedimento.
O microeletródio, assim preparado, foi posteriormente colocado num
dessecador, evitando contato com a umidade do ar. A adição da resina de
troca iônica, específica para o K+ (Fluka Chemika, SW) na ponta do
microeletródio foi feita através de um capilar de vidro, estirado manualmente
em maçarico e introduzido no maior ramo, previamente silanizado, 24 horas
antes do início da fase cirúrgica. Pelo mesmo processo, solução eletrolítica de
fosfato ácido de potássio ( 40mM) e NaCl (15mM), com pH 7, foi colocada no
mesmo ramo, acima da resina. No ramo menor (referência), solução composta
de 0.26M NaCI e 0.76M acetato de sódio, corada com 0.1% de corante FDC,
foi introduzida.
Para calibração dos microeletródios, realizada antes e depois de cada
punção, foram utilizadas 3 soluções de composições similares à solução
utilizada para microperfusão tubular controle (NaCI 100mM, CaCh l.2mM,
MgS04 1mM, 1'-.'H,Cl !mM, HEPES I OmM), porém contendo diferentes
concentrações de K\ a saber: 3, 10 e 30mM. O microeletródio era então
calibrado, observando-se a variação de voltagem em relação ·a variação de
concentração de K•. O valor médio da DP por década de variação de [K+] foi
de 43±2.5mV, semelhante aos valores referidos por WRIGHT &
McDOUGAL (1972).
Foram confeccionadas micropipetas simples com capilares do tipo
Kimax (A. H. Thomas, Philadelphia, USA), de paredes finas, e diãmetro
externo de 0.8nun. Os capilares foram estirados horizontalmente (estirador de
36
Livingstone). A seguir, sua ponta foi quebrada manualmente, através de pinça
de relojoeiro, sob microscopia óptica (Zeiss, Alemanha), de maneira a obter
se um diâmetro fmal de 5 a l4J.!m. A pipeta foi então afilada com
microesmeril, para pennitir a formação de bizel. Esta micropipeta simples foi
preenchida com uma solução, contendo a mesma composição eletrolítica da
solução perfusora controle, além da substância a ser estudada (Bário,
Benzamil, A VP, ANP, PGE2, BK, ANGII).
As conexões entre os ramos das micropipetas dupla e simples, e as
seringas injetoras foram feitas com tubos de polietileno. A união entre os
ramos da tnicropipeta e os tubos de polietileno foi mantida através de agulhas
hipodénnicas, vedadas com lacre. A seguir, as micropipetas duplas e o
microeletródio foram colocados em micromanipuladores mecânicos (Leitz,
Wetzlar, Alemanha), enquanto a pipeta simples foi adaptada num
micromanipulador (Fischer, Gottinagen, Alemanha) através de um porta
micropipetas feito na oficina do Departamento, ligado a outra seringa.
Metodologia da microperfusão.
A determinação da secreção tubular de potássio foi feita através da
técnica de microperfusão estacionária, como previamente descrito por
MALNIC & MELLO-AIRES (1971). A utilização de microperfusão
estacionária para o estudo da secreção distal de K+, é uma inovação
metodológica, uma vez que este método, inicialmente, foi utilizado para
avaliação da secreção de H+ e reabsorção de bicarbonato em túbulos renais, e
para determinação de transporte de K+ em túbulo proximal. Isto pennite
avaliações sequenciais da atividade de K+ luminal durante perfusões controle
e experimental no mesmo segmento tubular renal (VESTRI et alii., 1992).
:n
Os túbulos distais foram localizados, iniciabuente, por perfusão com
soluções perfusoras coradas a partir de uma alça proximal média ou final com
a micropipeta dupla. Posteriormente, impalava-se o segmento distal fmal com
microeletrodo duplo, contendo nmn dos ramos resina de troca iônica sensível
ao potássio (Fluka Chemika, SW), e no outro, menor, solução eletrolítica
referência corada com verde FDC 0.1% (eletrodo de referência).
A identificação e confirmação das alças distais finais foi feita por
critérios anatômicos e elétricos. A partir de alça distal inicial ocorre um tempo
de trânsito abaixo de 2 segundos de uma solução corada, de uma alça até a
seguinte, e em geral o segmento distal não consta de mais de duas alças
(VELÁSQUEZ et alii., 1987). Ainda, a diferença de potencial transepitelial
encontra-se acima de -20m V (lúmen negativo) (GIL & MALNTC, 1989;
LOPES & MALNTC, 1989). A solução perfusora era isolada do fluido tubular
com óleo injetado pelo outro ramo da micropipeta. Em alguns
experimentos a perfusão dos túbulos renais foi feita do segmento distal inicial
para o segmento distal final (perfusão distal-distal).
Finalmente, a micropipeta simples contendo o agente hormonal a ser
estudado era inserida no mesmo néfro (proximal ou distal inicial). Cada
túbulo foi perfundido primeiramente com solução controle, e a seguir, com
solução experimental, permitindo, desta forma, comparação pareada entre a
microperfusão controle e experimentaL
Por esta técnica cerca de quatro a oito curvas, controle e experimental,
foram obtidas, constituindo sua média, um par de valores para cada túbulo. A
Figura 4 ilustra a metodologia de microperfusão estacionária utilizada. O
valor de "N" de nossas tabelas, corresponde ao número de túbulos
perfundidos, sendo aproximadamente de I a 3 túbulos para cada rato
estudado.
38
Medidas de Potenciais elétricos e Análise das curvas de atividade de K'.
No trabalho de VESTRI & MALNIC (1990) discute-se alguns aspectos
relevantes quanto ao funcionamento do microeletrodo íon-seletivo.
Para estudar e caracterizar microeletrodos íon-seletivos assumiu-se tun
modelo com fonnalismo adequado para a análise do equilíbrio do sistema
microeletrodo-solução desconhecida (fluido tubular). O mesmo formalismo
pode ser usado para soluções de calibração. Para isto, utiliza-se os
coeficientes de atividade de Debye-Hueckel, a resposta básica do eletrodo
dada por Nicolsky e o potencial de jtmção líquida dado por Henderson.
Cada íon interlerente j contribui para a soma dentro do fator
logarítmico na equação de Nicolsky (Nicolsky, 1937; Ede1man et alii., 1978),
que pode ser reduzida para:
E = Eo + RT/zF ln( ai+ aj)
e, no nosso caso:
E= Eo + Sp. Log (aK' + k.aNa +)
Onde:
E- Eo ~diferença de potencial elétrico medido pelo microeletrodo.
Eo ~ potencial de referência.
k ~ fator de seletividade.
Sp ~ variação de voltagem por década de concentração de potássio
(slope)em solução pura.
aK+ - atividade de potássio,
aNa+ - atividade de sódio.
39
A seletividade do microeletrodo para sódio é cerca de I Ox menor que
para o potássio, mas a concentração de sódio é em média I Ox maior( IOOmM)
que a de potássio. Por isto, os " slopes" obtidos na calibração são menores que
o valor teórico de 61,5mV a 37"C.
As voltagens referidas acima e a diferença de potencial transepitelial
foram lidas em um eletrômetro, de dois canais, diferencial, de alta impedância
de entrada, modelo FD223 (WPI, New Haven, CT), cuja saída foi
continuamente registrada por um polígrafo de quatro canais (Beckman,
modelo RS! lA) e simultaneamente digitalizada em intervalos de 1 segnndo
por microcomputador AT 386 (Deli mod. 333D) acoplado a um conversor
analógico digital (Lynx, São Paulo), através do qual os dados são adquiridos e
processados. As atividades de potássio correspondem à diferença de potencial
elétrico entre os canais de potássio e de referência.
Os dados foram analisados por um programa "Visual Basic" no
"software" Excel (Microsoft). Foram obtidos a meia-vida (tV,) para retomo
da atividade de K+ ao nível estácionário, a atividade de potássio estacionária
[K+], e a Diferença de potencial (DP) transepitelial. O fluxo de potássio CJk +)
foi então calculado, em analogia a fluxos de ~ medidos anteriormente por
meio deste método, seguindo a seguinte equação (GIL & MALNIC, 1989):
ln 2 . r J = -(K - K )*-
K' f h s 0 2
Onde tV, corresponde ao tempo decorrido para atingir a metade da diferença
máxima de concentração de K+;
K, é a atividade de K+ estacionário;
R. é a atividade de K+ inicial (0.5mM)
r corresponde ao raio do túbulo
40
Após a aquisição e processamento dos dados, e a determinação dos
fluxos secretórios de potássio, estes eram tabelados e a significância das
diferenças estatísticas foi determinada através da aplicação do "teste t"
pareado de Student.
Drogas e Soluções utilizadas:
- Solução perfusora luminal Controle (em mM)- I 00 NaCl, I CaC12, 1.2
MgS04, 1NR.Cl, 10 HEPES, 0.5 KCI. A osmolalidade desta solução foi
ajustada com rafinose (PM 395), para 300 mOsmol/Kg de H20.
41
Soluções padrões (em mM)- 100 NaCI, 1 CaC]z, 1.2 MgS04, 1NR.Cl, 10
HEPES, KCI 3 , 10, 30.
Angiotensina II (Escola Paulista de Medicina- UNIFESP, Brasil)
Peptideo Atrial Natriurético (Bachen Fine Chemicals, New Haven, CT)
Arginina Vasopressina (Sigma Chemical Company, St Louis, USA)
Anti-V 1 (Jl-mercapto- Jl-Jl-cyclopentamethylenepropionyl 1, O-Me-Tyr'
Arg8 vasopressina, MCMV- Sigma Chemical CO, St Louis, USA).
Anti-V2 (adamantaneacetyl, 0-Et-D-Tyr2, Val4 aruinobutyril6
, Arg8•9
vasopressina, AA V- Sigma Chemical, CO, St Louis, USA).
Benzamil (Hidrocloreto de Benzilamiloride - Research Biochemicals Int,
Natick, MA).
Bradicinina- (Sigma Chemical, CO, St Louis, USA)
Prostaglandina E2 - (Sigma Chemical, CO, St Louis, USA)
Losartan (DUP 753; Du Pont Merck, Wilmington, DE)- inibidor AT1
42
s
Figura 4: Desenho esquemático do sistema experimental. A esquerda,
micropipeta dupla com solução perfusora controle (P) e óleo mineral corado
(C). A direita, micropipeta dupla com resina de troca iônica (IE) e solução de
referência(Ref). Uma terceira micropipeta simples (S) também foi utilizada no
tubulo proximal ou distal final durante a microperfusão com solução
experimental.
43
lV - RESULTADOS.
O protocolo experimental padrão envolve a microperfusão com uma
solução contendo uma concentração baixa de potássio (O .5mM), seguido pela
observação da variação da atividade deste cátion até um valor estacionário
durante o bloqueio do fluxo de fluido na alça distal final. A Figura 5 ilustra
um regisu·o obtido num dos experimentos mostrando acima, a variação da
atividade de potássio, e abaixo, a variação da diferença de potencial durante a
perfusão com Ringer controle.
Como descrito anteriormente, os dados obtidos por digitalização foram
processados em uma planilha do Excel através de um macro dentro deste
"software". Este procedimento permite a construção de gráficos como
ilustrado na Figura 6, mostrando o decaimento exponencial da diferença entre
a concentração de potássio estacionário e a concentração no tempo t. Esta
figura corresponde à perfusão com uma solução Ringer controle, enquanto
que na Figura 7, mostra-se o mesmo procedimento, porém com solucão
contendo agente honnonal (A VP w·''M).
As Tabelas e Figuras do presente trabalho são mostradas no final deste
tópico. A Tabela I mostra os parâmetros ácido-base do sangue de alguns
grupos de animais usados neste estudo, indicando que durante as condições
experimentais não foram encontradas diferenças significativas em relação aos
valores considerados fisiologicamente normais. Resultados semelhantes já
foram mostrados em trabalhos anteriores deste laboratório. Mostra-se também
os valores médios de concentrações plasmáticas de potássio e sódio, que se
encontram na faixa fisiológica.
No intuito de estudar o efeito de uma condição que é conhecida por
modificar o transporte de K+ no túbulo distal, foram feitas perfusões luminais
contendo Benzamil, um análogo do amiloride com predominante atividade
44
bloqueadora sobre canais de Na+ e praticamente nenburn efeito sobre o
pennutador Na+M (KLEYMAN & CRAGOE, 1988). A Tabela II fornece os
valores médios da concentração de K+ estacionária [K+],, medidos após
perfusão tubular, quando o nível de K+ luminal retoma ao nível estacionário, e
a meia-vida da atividade de K+ lmnínal, na condição controle e após perfusão
com Benzamil. N corresponde ao número de túbulos. A concentração
estacionária de K+ foi marcadamente reduzida nesta condição experimental, e
o tY, foi significativamente maior do que na situação controle, indicando que
o influxo de K+ foi inibido por este agente, sendo muito mais lento do que o
controle.
A tabela II mostra também os valores dos tluxos de K+(h +), e a
DPtrans, calculados a partir dos dados descritos anteriormente, obtidos
através da condição referida. Como pode ser observado, o Benzarníl diminuiu
o tluxo secretório de K+ (11.6%) comparado à situação controle. Isto indica
que a maior parte do transporte transepitelial deste cátion é transcelular, via
canais de K+ presentes na membrana lurninal. Como esperado, a diferença de
potencial transepitelial (DPtrans) diminuiu acentuadamente nesta condição
experimental, como mostra a Tabela II.
Efeito da Angiotensina II
As Tabelas III, IV e V mostram os dados referentes à microperfusão
distal com o peptideo ativo, angiotensina II. Podemos observar que durante a
perfusão de ANGII na luz tubular, ocorreu uma redução no tluxo secretório
de potássio, nas duas concentrações estudadas, ou seja, 10-9 e w-"M (Figura!O). Este efeito direto do agente hormonal na inibição da secreção
distal de potássio, ocorreu apesar de que não houve diferenças significativas
45
de tY, e de Ks, origurando-se de tendências destes valores que se combinaram
no cálculo de h+.
Tendo em vista que grande parte dos efeitos fisiológicos da
angiotensina II no rim adulto são mediados principalmente pela ativação dos
receptores AT1 (SMITH et alii., 1992), realizamos uma série de experimentos
com um antagonista de receptores AT1, Losartan (10-6M), no intuito de se
estudar a natureza do receptor responsável pelo efeito inibitório deste agente
honnonal no transporte distal de potássio.
Como pode ser notado na Tabela V e Figura 11, o emprego do losartan
durante as perfusões luminais de túbulos distais, reduziu o efeito inibitório da
angrotensinall sobre o fluxo resultante de potássio (Jk+)- Durante perfusão
isolada com losartan não se observou efeito significante sobre o Jk+. Durante
perfusão combinada de losartan e angiotensinaii (10-"M) (Tabela V; Figura
11 ), não houve a inibição anteriormente observada ..
Como a concentração de angiotensina na urina atinge valores até I O
vezes maiores do que o plasmático (THEKKUMKARA et alii., 1998,
NA V AR et alii., 1999), estes resultados sugerem que a secreção distal de
potássio pode depender de angiotensina II luminal.
Efeito da Bradicinina (BK)
Os resultados referentes à perfusão lurninal com Bradicinina (BK) em
túbulos distais iniciais e finais, são mostrados nas tabelas VI, VII e VIII.
Podemos observar pela análise dos resultados que as duas concentrações
estudadas deste agente, 10-9 e I o·"M, inibiram o fluxo secretório de potássio
h+ significativamente (Figura 13 ).
Durante perfusão 1uminal com bradicinina (10-"M), a diferença de
potencial transepitelial (DP) sofreu alteração sigificativa, caindo da situação
46
controle, com 48.5±3.7mV, para 43.2±3.4mV na experimental,. Este queda,
pode ter contribllido para a acentuada redução do fluxo secretório de potássio,
com redução proporcional a 50% do valor controle. A Tabela VII mostra os
valores referentes à concentração estacionária de potássio [K+], e à meia vida
(tY,) de aproximação das atividades de potássio ao seu valor estacionário,
durante perfusão distal com bradicinina, nas duas concentrações estudadas,
que apresentaram valores significativamente diferentes dos valores controle.
Efeito da Prostaglandina
Os resultados obtidos com a perfusão luminal com PGEz podem ser
observados nas Tabelas VI, VII, VIII e Fignra 14. Como pode ser observado
na tabela VIII e Fignra 14, a PGE2 10'6M e 10'9M, reduziu
significativamente o fluxo secretório de potássio, durante a perfusão lurninal
de túbulos distais. Esta inibição da prostaglandina no transporte de potássio
pode ter sido influenciada pela redução da DP transepitelial nas duas
concentrações estudadas. Por outro lado, não observamos alterações
significativas do potássio estacionário [K+], . Já com relação ao tY,, quando
perfimdimos PGE2 com 10'9M (Tabela VII), notamos um aumento
significativo comparado aos valores controle.
Efeito do ANP
Com relação ao ANP, observamos que durante a perfusão lurninal com
este agente nas concentrações de 10'9 e 10'11M, comparada à situação
controle, houve um efeito estimulatório sobre o fluxo secretório de potássio
(Jk+)(Figura 12). Como pode ser observado nas Tabelas VI, VII e VIII,
47
durante este estímulo, não ocorreram diferenças significativas nos valores da
DP transepitelial e do [K•],, e houve queda significante do 6~.
O aumento proporcional a 30% do valor controle, indica que este
hormônio também pode contribuir para a regulação do transporte distal de
potássio.
Efeito da Vasopressina
A Figura 8 mostra uma sequência de medidas de Jk+ em um túbulo
perfimdido com solução controle e com A VP I o·' 1M. Nota-se, em sucessivas
perfi1sões, que o A VP eleva a secreção de K+ , o que é reversível retomando à
solução controle.
A Tabela X, mostra resumidamente o valor de [K+h e tY, durante a ação
do A VP sobre a secreção de K•. Estes valores correspondem à média dos
dados controle comparados com a média na situação experimental; N
representa o número de túbulos perfimdidos. O uivei do potássio estacionário
[K•],, na grande mawna dos experimentos, não foi alterado
significativamente, enquanto tYz, foi reduzido quando A VP era perfimdido, e
aumentado quando na presença de anti-V 1•
A Tabela XI e Figuras 15, 16 e 17, fornecem o fluxo resultante de K+,
durante perfusão luminal com A VP a diferentes concentrações, com A V 1, e
com AV2 . Nota-se claramente que AVP em ambas concentrações (10-11 e 10-
9M), estímulou o Jk+ significativamente. Este dado representa um importante
achado, do ponto de vista fisiológico,uma vez que os uiveis plasmáticos deste
hormônio estão na margem de 10-12 a 10'11M, e sua concentração na urina
final atinge valores bem superiores, cerca de 1000 vezes acima dos
plasmáticos (MOSES & STECIAK, 1986).
48
Já o A VP na concentração de 1 0'6M, embora tenba apresentado uma
certa estimulação do Jk+, não levou a um efeito estatisticamente significante
(Tabela XI, Fignra 15). Nota-se, nestes experimentos, que as modificações de
JK+ se devem a redução de !\I,( maior velocidade de secreção de potássio) e
não a alterações de K, (Tabela X).
A adição de A V 1 com A VP 10'11M reverteu a ação deste peptídeo
hormonal, porém, quando A V 1 foi perfundido isoladamente, resultou
aproximadamente o mesmo efeito. Por outro lado, o antagonista A V2, não
mostrou nenbum efeito significante, perfundido sozinbo ou adicionado
conjuntamente ao A VP, ou seja, não reverteu a ação estimulante do A VP 10· 11M (Fignra 17).
Estes resultados indicam que o efeito do A VP sobre o transporte de K",
durante perfusão luminal, é mediado por receptores do tipo V 1, e ainda, como
mesmo na ausência de A VP o antagonista específico de receptor V~,
significativamente reduziu a secreção de potássio distal, isto parece indicar
uma atividade tônica (mantida mesmo sem administrar o hormônio) no túbulo
distal.
A Tabela IX relaciona as médias da Diferença de Potencial na situação
controle e experimental. Embora existisse uma tendência de queda da DP
durante o período experimental em alguns grupos, diferenças entre grupos
controles e experimentais não foram estatisticamente significantes, o que é
compatível com a ausência das diferenças do [K+],, na maioria dos grupos
estudados.
A atividade do antagonista, A V~, poderia decorrer de uma ação
inespecífica deste agente. Desta forma, nós utilizamos ratos homozigotos
Brattleboro, que não produzem endogenamente A VP, mas apresentam
receptores para este hormônio (SABOLIC, KATSURA, et alii., 1995). Os
resultados obtidos nestes ratos são fornecidos nas Tabelas XII, XIII, XIV e
49
Figura 18. Pode-se notar que AVP l0-11 M estimulou significativamente a
secreção de K+, mas que a administração conjunta de A VP e anti-V 1 não
modificou o JK+ de forma significante. Ainda, A V 1 administrado
isoladamente, não inibiu a secreção de K•, como tinha sido observado nos
ratos normais, apoiando a hipótese que este efeito provavelmente esteja
relacionado com um nível basal deste hormônio, agindo sobre a membrana
huninal, na modulação da excreção distal de K+.
Para confirmar que o estímulo na secreção de potássio pela A VP se
passa por canais de K+, perfundimos luminalmente o túbulo distal com um
bloqueador específico para estes canais, o Ba ++. Como pode ser observado na
Tabela XV, Figura 19, o Ba++ a 3mM, isoladamente ou associado a AVP (l0-
11M), promoveu redução significativa do h+, ao redor de 80%, comparado à
situação controle. Esta Tabela mostra ainda que durante à ação deste agente
ocorreu wna elevação da DPtrans causada, provavelmente, por urna
despolarização da membrana lwninal, o que está de acôrdo com os dados da
literatura (ANDO et alii., 1991; BAJLEY et alii., 1999).
0.3
"' 3.0 -+ ~ 30.0
;;; -20
é -40 ..... ;,
-60
I
i
Time (min)
2
i
PERFUSION WITH 0.5mM K'
50
3
Figura 5 - Registro sequencial de mna série de microperfusões realizados em
túbulo distal, utilizando solução controle ( C) contendo 0.5mM de potássio.
51
30
25
E 20
~ 15 11: ~
<I 10
5
o -h~~~~~~~~~~~~~n TOTl r r rl·r-1 rrTTTr-ITTn-r•rrTll r r r1 rj
o 5 10 15 ~o 25 30 35 I
Figura 6 - Gráfico mostrando a variação da concentração de K+ (I'.[K]), em
função do tempo (t), durante perfusão controle na alça distal final cortical.
-~~~
18 16 14
:i! 12 E 10 -~ 8 -<1
6 4 2 o
o 5 10 15 20
s Figura 7 - Gráfico mostrando a variação da concentração de K+ (I'.[K]), em
função do tempo (t), durante perfusão experimental na alça distal fmal
cortical.
52
I AVP1a11M I 1.5 l
' ' ' ~ ' ~ ' ' ' 11! ' '
"' 1 ~ E ' ' ' u ' ' .
' - ' o ' ' E ' c 0.51 - ' ""' I -, I ' ' ' o '
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
llNE(nin)
Figura 8 - Gráfico mostrando a variação do fluxo secretório de K+ (h+), em
função do tempo (t), durante perfusão experimental na alça distal final
cortical.
53
TABELA I- Parâmetros ácido-base sanguíneos, e concentrações de Na+ e K+
plasmáticos, obtidos durante os experimentos.
' ' [Na']mM/1 [K']mM/1 pH (unidades ) ' Pco2(mmHg) I '
Ratos Wistar (N~45) 7.35±.10 39.3±0.63 137±2.8 3.56±0.54
'
Ratos Brattleboro (5) 7.41±.03 40.1±0.57 149±.98 4.6±.43
I ' ' -Os valores correspondem as medias ± erro-padrao, N corresponde ao nwnero de ratos avahados,
TABELA II - Concentrações estacionárias de potássio [K+],, mela vida de
aproximação das atividades de K+ ao seu valor estacionário (tYz), Diferença de
potencial transepitelial e valores de fluxo secretório de K+ (Jk+ ), nos grupos
controle e experimental (Benzamil 10·' M), obtida durante a microperfusão de
túbulos distais.
Control Benzamil 1 o-4 M N
' ' ' ' ' ' ' ' Ks,mM 30.6 ± 2.9 8.5 ± 1.9"' ' 11 ' ' '
Tv., s 8.5 ± 1.6 18.6 ± 3.6 * 11
I 31.7 ± 2.4 4.9 ± 1.9 ** 11 ' ' PD,mV ' ' ' ' ' ' ' ' ' '
J I -2 -t K, nmo .cm .s 0.69 ± 0.14 0.14±0.03' 11
Médias± erro padrão, *p<O. 05, **p<O.OO 1 , diferenças em relação aos controles. (N, números de túbulos).
-~ ' 1/) .
"i E (.) .
54
1.0 =CONTROL
0. BENZAMIL 1 O"'M
Õ O. E c: -~
"") *
Figura 9 -Efeito do Benzamil (O.lmM), sobre o fluxo secretório de K+
(Jk+). *(p<O.Ol) em relação ao controle.
55
TABELA III - Diferença de potencial transepitelial nos grupos controle e
experimental (Angiotensina e antagonista de receptor de angiotensina-AT1),
obtida durante a nticroperfusão de túbulos distais.
DIFERENÇA DE CONTROLE EXPERIMENTAL POTENCIAL (mV) (mV)
1 1
ANGIOTENSINA l0-11 M 34.7±3.6(10) 30.6±3.4
ANGIOTENSINA w·"M 47.2±3.0(9) I 48.4±3.1 1 1
LOSARTAN -AT1 10-6M 41.0±3.8(16) 41.7±3.7
ANG. l0-11M + AT1 10"6M 40.3±2.6(11) 1
38.6±2.2 1 1 1 1
-medtas±crro padrao.
TABELA IV - Concentrações estacionárias de potássio [K•],, e meia vida de
aproximação das atividades de K+ ao seu valor estacionário (t'h) em
experimentos de perfusão com Angiotensina e antagonista de receptor de
angiotensina-AT 1•
[K•], t '.!,
CONTROLE EXPERIMENTAL CONTROLE EXPERIMENTAL
ANGIOTENSINA l0- 11M 27.4±2.9(13) 23.3±2.3 17.4±2.0(13) 19.9±2.2*
ANGIOTENSINA I o·"M 31.3±3.8(10) I 29.2±4.4 11.5±1.0(10) 18.0±2.5* 1 1
1
LOSARTA.N -AT1 10"6M 1
10.9±1.5(11) 14.2±1.9 22.1±1.3(11) 1 24.4±1.0 1 1
1
ANG. w-11M + AT; w·"M I 1
I 20.0±1.9(14) 1 18.9±1.5 13.9±1.4(14) 16.0±1.7 1 1
-*(p<0.05), medms±erro padrao.
56
TABELA V- Valores de fluxo secretório de K+ (Jk+), nos grupos controle e
experimental (Angiotensina e antagonista de receptare de angiotensina-AT1),
obtidos durante a microperfusão de túbulos distais.
Jk+( nmol.cm -l .s -t) CONTROLE EXPERIMENTAL
' ANGIOTENSINA 10-1 1M I '
1.0±0.17(27) 0.63±0.08***
' ANGIOTENSINA 10-9M 0.90±0.19(27) 0.70±0.22**
LOSARTAN -AT1 10-6M 0.80±0.08(11) 0.67±0.09
ANG. l0-11 M + AT1 10-6M 0.57±0.04(15) 0.47±0.06
.. -***(p<O.Oül),**(p<0.002) vs controle, med~as±erro padrao.
., "' "'e o ~
2
E .S1 "' ...,
c::::J CONTROL
rnmD ANG 1110-11 M
c::::::J CONTROL
lll'iJIJlll Ar-13 I 1 o·'M
57
Figura 10 - Efeito da Angiotensina (ANGII 10-11, I o·'M), sobre o fluxo
secretório de K+ (Jk+)*(p<0.05) em relação ao controle_
2
1.5
;;U)
"'e 1.o ()
~ r:
>E ....,
58
c::::::J CONTROL
1+'4 LOSARTAN(AT1A) 10•M
c::::J CONTROL
lli['illJ ANG 11 10-11 M+AT1 10-6M
Figura 11 - Efeito do antagonista AT1 (Losartan 10-6M), e efeito combinado
do Losartan (1 o·6M) com ANGII (1 o·" M), sobre o fluxo secretório de K+
(Jk+).,
59
TABELA VI Diferença de potencial transepitelial nos grupos controle e
experimental (Bradicinina, Peptídeo Atrial N atrinrético-ANP,
Prostaglandina), obtida dnrante a microperfusão de túbulos distais,
DIFERENÇA DE CONTROLE EXPERIMENTAL POTENCIAL lmVl fmVl
ANP l0' 11 M ' 45.0±4.5(13) 46.7±4.9
ANP l0"9M 40.5±2.5(13) 41.8±2.9
BRAOICININA l0-11 M 48.5±3.7(10) 43.2±3.4**
I BRADICININA 10-9M I 40.3±2.9(10) 35.6±3.1*
PROSTAGLANDINA PGE2 lO""M 51.3±2.6(12) 47.6±2.7*
' ' PROSTAGLANDINA PGE2 10·~ 4L9H9(12) ' 33.5±4.3** ' ' ' ' - -*(p<0.05) **(p< 0.001) em relaçao ao controle, medtas ±erro padrao.
60
TABELA VII - Concentrações estacionárias de potássio [K+]s , e meia vida
de aproximação das atividades de K+ ao seu valor estacionário (tY,) em
experimentos de perfusão com Bradiciuiua, Peptideo Atrial Natriurético
ANP, Prostaglandina E,.
[K+], t y,
' ' CONTROLE I EXPERIMENTAL CONTROLE EXPERIMENTAL ' ' '
ANP l0-11M 28.5±1.5(16) 27.0±1.1 17.9±1.8(12) 12.8±1.23*
1\NP ro-~ 27.3±0.8(15) 28.4±0.8 I 15.5±1.3(16) 13.0±1.3*
' BRADlCTNJNA l0-11M 34.9±3.3(13) 33.6±3.7 26.1±1.7(13) 34.0±2.2**
' BRADICININA I o·~ ' 31.6±2.3(14) 30.3±2.2 16.8±2.7(11) 24.8±3.9** ' ' '
PROSTAGLANDINA 30.1±0.8(11) 28.5:!:l.S I 18.4±1.8(13) 25.5±2.7** PGE2 I0"9M ' I ' ' '
PROSTAGLANDINA 32.6±1.7(l0) 29.6±0.95 14.0±12(13) 20.1±2.3** PGE2!0-~
*(p<0.05)**(0.0005<P<O.Ol) vs controle, médtas±erro padrão.
61
TABELA VIII- Valores de fluxo secretório de K+ (h+), nos grupos controle
e experimental (Bradicinina, Peptídeo Atrial Natriurético-ANP,
Prostaglandina), obtidos durante a nticroperfusão renaL
Jk+( nmol.cm -z .s-1) CONTROLE EXPERIMENTAL
ANP l0-11 M ' 0.70±0.07(16) ' 0.91±0.06*** ' ' ' ' '
' ' ANP l0"9M 0.60±0.03(13) ' 0.80±0.09*** ' ' '
' BRADICININA l0"11 M 0.71±0.10(27) ' 0.37±0.05** ' '
BRADICININA !O'M ' ' 093±0.17(27) 0.52±0.05**
1---PROSTAGLANDINA PGE:-z 10-6M 0.80±0.08(12) 0.47±0.04***
PROSTAGLANDINA PGEz l0"9M 0.93±0.08(12) 0.55±0.05***
*(p<0.05), **(p<0.02), ***(p< 0.001) em relação ao controle, médias± erro padrão.
., .. "'E " ci E r: -"' ...,
•
c::::::::J CONTROL
!®/A ANP 10"11M
=CONTROL
IElliD AI'P 1 O_gM
62
Figura 12 -Efeito do peptídeo atrial uatriurético (ANP 10-11, 10-9M), sobre o
fluxo secretório de K+ (Jk+)*(p<O.OOI) em relação ao controle.
c:::::J CONTROL
Emii BK 10-9M
63
Figura 13 - Efeito da Bradicinina (BK 10-11, 10-9M), sobre o tluxo secretório
de K' (Jk+)*(p<O.OOI) em relação ao controle.
c::::::J CO NT ROL
fimi'illl PG E2 1 0"9M
~CONTROL
!iiiiD PG E2 1 0-9M
64
Figura 14 - Efeito da Prostaglandina E, (PGE, 10-', 10-6M), sobre o fluxo
secretório de K+ (Jk+).*(p<O.OOl) em relação ao controle.
65
TABELA IX - Diferença de potencial transepitelial nos grupos controle e
experimental (Arginina Vasopressina-AVP, AV 1 e AV2, antagonistas de
receptores V1 e Vz), obtida durante a microperfusão de túbulos distais.
DIFERENÇA DE CONTROLE I EXPERIMENTAL ' (mVl (mV) POTENCIAL ' '
AVP l0-11M 32. 7±2.5(N= 17) 32.8±1.3
' ' ' ' AVP to·'1vf ' 43.7±3.9(7) 45.5±5.2
AVP l0"6M ' 45.4±1.8(16) ' 39.0±2.9 ' ' ' ' ' '
AVI 10-6M 40.6±2.9(18) I 35.8±2.6
' ' ' '
AVP l0"11M+AV110-~ ' ' 43.0±5.1(15) 34.5±4.8
AV2 !O"M ' 39.8±2.3(10) ' 35.0±2.4 ' ' ' ' ' '
AVP l0-11 M + AV2 10"5M 43.1±2.9(10) 36.6±3.0
-m&has±erro padrao
66
TABELA X - Concentrações estacionárias de potássio [K+], , e meia vida de
aproximação das atividades de K+ ao seu valor estacionário (tY,) em
experimentos com perfusão com Arginina Vasopressina-A VP, e antagonistas
de receptores V 1 e V z.
[K+], t y,
CONTROLE EXPERIMENTAL CONTROLE EXPERIMENTAL
AVP !0"11M 32.7±2.5(17) 32.8±1.3 25.5±1.8(24) 19.0±1.5**
-AVP 10·~ 30.5±0.9(7) 28.1±3.1 12.0±1.2(10) 8.9±l.l **
AVP !0"6M 27.2±1.9(16) 26.0±1.7 15.1±1.9(6) l0.8±2.4
AV1!0"6M 25.7±1.3(19) 24.9±1.5 16.6±1.5(23) 24.3±2.3**
' AVP !0" 11M+AVll0"6M ' 28.0±1.8(15) 23.2±2.0* 16.0±1.9(9) 26.0±3.9* ' ' ' ' ' AV2 IO"'M ' ' ' 25.5±1.8(10) 24.2±1.2 ' 17.3±2.7(8) 17.6±2.4 ' ' '
A VP w-11M +A vz w·"M / ' 12.7±1.1 23.2±1.2(17) 24.8±2.1 14.4±1.7(14) ' i *(P<0.05), **(P<O.O I) em relação ao controle, medtas±erro padrão.
67
TABELA XI- Valores de fluxo secretório de K+ (h+), nos grupos controle e
experimental (Argímna Vasopressina-A VP, antagonistas de receptores V 1 e
V 2), obtidos durante a microperfusão tubular distal.
Jk+( nmol.cm -l .s -l) CONTROLE I EXPERIMENTAL ' ' '
AVP l0"11 M O.S8±0.06(N==l7) 0.83±0.09***
' ' AVP w-~M ' 0.73±0_10(7) ' 0.96±0.11** ' ' ' ' ' '
AVP 10-6M 0.73±0.06(16) 0.89±0.09
' AVI 10-6M ' 0.37±0.041** ' 0.62±0.06(18) ' ' ' ' ' ' ' ' ' AVP10"11M+AVI10~ 0.77±0.101(15) ' 0.36±0.067**
'
AV2 l0"6M 0.61±0.097(10) 0.52±0.088
' ' ' '
AVP l0"11 M + AV2 10"6M ' ' ' 0.61±0.05(10) ' 0.73±0.057*
i ' '
***(p<O.OO l), **(p<O.Ol }, *(p<0.05) em relação ao controle. medias ±erro padrão.
*
* 1
1
~CONTROL
l!llmJ AVP 1 0-11M
c::::::J CONTROL
~AVP 10-BM
c::=::J CONTROL
if'-Y'"'' AVP 10~M
68
Figura 15 -Efeito da A VP, nas concentrações de 10-11, 10-9
, e I o·'M, sobre o
fluxo secretório de K+ (Jk+)*(p<O.O I) em relação ao controle.
"' "' "'e o ~ E c -"' .....
-"' "' "'e " ~ E c -"' .....
7
"' " E o o E c -"' .....
1 •
o
1.
1.
O. •
O.
•
c:::::::J CONfROL
~AVP1Q-11M
=CONTROL
~AV110-õM
c:::::::J CO NT ROL
69
@à\'j AVP 1 o-11M+ AV1 1 0-sM
Figura 16 - Efeito da A VP (1 o-11M), do antagonista de receptor V 1 (A V 1 10-
6M) e efeito combinado da AVP (l0-11M) com AV1 (10-6M), sobre o tluxo
secretório de K+ (Jk+)*(p<O.Ol) em relação ao controle.
"'E
" o E 1: -;;: ...,
o.o_L----'----'--
1.5
1
0.5
•
•
c:::::J CONfROL
!f"'"'i AVP 1 0-11M
c:::::J CONTROL
c:mmt A V2. 1 Q-6M
c:::::J CONTROL
70
~ AVP + A\/2. 10-6M
Figura 17- Efeito da AVP (l0-11M), do antagonista de receptor Vz (AV2
10'6M) e efeito combinado da AVP (!0-11M) com AV2 (10-6M), sobre o fluxo
secretório de K+ (Jk+)*(p<O.Ol) em relação ao controle.
-------
71
TABELA XII - Diferença de potencial transepitelial nos grupos controle e
experimental (Arginína Vasopressina-A VP, antagonista de receptor V1),
obtida durante a microperfusão de túbulos distais de rato Brattleboro.
DIFERENÇA DE CONTROLE EXPERIMENTAL POTENCIAL (mV) (mV)
' AVP l0'11 M ' 42.3±3.1(18) ' 39.3±4.0
' ' ' --+--' ' AVI 10-~ 45.2±3.6(12) ' 40.3±5.2 ' ' ' '
AVP l0-11 M +AVI 10'6M
I 44.5±4.2(14) 42.6±4.9
, médms±crro padrao.
TABELA XIII - Concentrações estacionárias de potássio [K+], , e meia vida
de aproximação das atividades de K+ ao seu valor estacionário (tY,) em
experimentos com perfusão com Arginina Vasopressina-AVP, e antagoinsta
de receptores V 1 em ratos Brattleboro.
[K+], t y,
' ' CONTROLE EXPERIMENTAL CONTROLE I EXPERIMENTAL
AVP l0'11M 28.7±1.4(13) 27.1±1.4 19.5±1.54(13) 16.0±1.6*
AVI w·6M 25.2±0.8(12) 24.8±1.0 15.5±2.2(12) 17.8±3.6
' A VP to-11M+ A VI w-ÓM 17.3±1.2(18) l7.3±U ' 9.75±0.8(18) 10.2±1.2 ' ' ' ' ' '
' -* (O.OOJ<p < 0.005) em relaçao ao controle méchas±crro padrao.
72
TABELA XIV- Valores de Fluxo secretório de K+ (Jk+), nos grupos controle
e experimental (Arginina Vasopressina e Anti-VI), obtidos durante a
microperfusão de túbulos distais, em rato Brattleboro.
Jk+( nmol.cm _z .s-I) CONTROLE EXPERIMENTAL
AVP lO"nM I 0.58±0.065(12) 0.68±0.08* I '
AVI w·6M 0.64±0.064(11) 0.71±0.08
' ' ' AVP 10"11 M + AVl w-6M 0.66±0.114(18) ' 0.77±0.100 ' ' '
-* (0.05<p < 0.01) em rclaçao ao controle, valores correspondem a médta e erro padrão.
~li)
"'E o o E " -"' ..,
.,I/) ., E o ~ E " -"' ..,
•
1
1
c::::::J CONfROL BRAT.
~ AVP 1 0-11M BRAT.
c::::::J CONTROL BRAT.
m:m AV1 10-•M BRAT.
= CONTROL BRAT.
73
aill AVP10-11M+AV1 BRAT .
Figura 18 -Efeito da A VP (1 o-uM), do antagonista de receptor V1 (AV1 10· 6M), e efeito combinado da AVP (l0- 11M) com AV1 (10-6M) sobre o fluxo
secretório de K+ (Jk+ ), em animais Brattleboro, desprovidos geneticamente de
vasopressina. * (p<0.05) em relação ao controle.
74
TABELA XV - Concentrações estacionárias de potássio [K+],, meia vida de
aproximação das atividades de K+ ao seu valor estacionário (tY,), Diferença de
potencial transepitelial e valores de fluxo secretório de K* (Jk+), nos grupos
controle (Ba ++) e experimental (Ba ++ + A VP 10-"M), obtida durante a
microperfusão de túbulos distais ..
' ' ' ' ' Ba++, 3 mM Ba++ + 10-11 M AVP ' N
' ' ' ' ' ' ' I
K+s, Mm 12.7±1.04* 11.9±0.94' 16 ' ' ' ' ' '
TY2, s 18.4±1.67' 19.7±1.65' 16
' ' ' '
' ' ' ' ' ' ' ' ' PD, mV 43.8 ±3.15' 44.9 ± 3.20* 21
'
J -r I -2 -t K !nmo.cm s 0.19±0.021* 0.201 ± 0.023' 12
' ' ' - -*(p<O.O I) em relaçao ao controle, médms ±erro padrao.
75
1.5 =coNTROL
-"' mmmm Ba++
"' "' E 1.0 IZ'lZl Ba++ + AVP 10'11 M
<> õ E 1: 0.5 -" ..,
* *
0.0
Figura 19- Efeito doBa++ (3mM) e da associação da AVP (!0-11M)
com Ba++, sobre o fluxo secretório de K+ (Jk+)- *(p<O.OOI) em relação
ao controle.
76
V- DISCUSSÃO
A utilização da técnica de microperfusão estacionária constitni uma
inovação metodológica em relação ao transporte de potássio no túbulo distal
cortical, particularmente do dueto coletor inicial (ver material e métodos),
permitindo detenninações pareadas (controle e experimental) do transporte de
K+ em túbulos renais individuais. Por este método, estudamos o efeito de
alguns fatores conhecidos que afetam a secreção de K+, como Ba ++ e
Benzamil. A perfusão luminal com 3mM de Ba ++ reduziu o Jk+ para 22% do
valor controle. Isto indica que o bloqueio de canais luminais de K+
provavelmente abole a secreção celular de K+, o qual é responsável por 78%
do fluxo secretório total, enquanto que o remanescente representa a via
paracelular do transporte deste cátion, propiciada pelo favorável gradiente
eletroquímico. Observações similares foram feitas em DCC de coelhos
(MUTO, GIEBISCH, et alii., 1988; ANDO et alii., 1991). Estudos de
microperfusão "in vivo" mostraram tan1bém mn significante aumento da
DPtrans em túbulo distal final de ratos, durante à aplicação lmninal de BaCI,
(5nunol/l) (BAILEY et alii., 1999). Resultados similares foram obtidos no
presente trabalho.
A redução da DP transepitelial por Benzarnil I 0-4M, um bloqueador
específico de canais apicais de Na+, também causa uma marcada redução na
secreção distal de K+ (proporcional a 21% do valor controle), como esperado
devido a dependência deste transporte de potencial elétrico através das
membranas celulares do túbulo distal cortical (GARCIA-FILHO, MALNIC,
et alii., 1980; KLEYMAN & CRAGOE, 1988).
Em seguida, considerando a presença de inúmeros agentes hormonais
que podem ser encontrados em tluido tubular nativo, foi realizado mn
"screening" de possíveis agentes que poderiam estar envolvidos no transporte
77
distal de potássio. A seguir, discutiremos tais agentes e seus possíveis efeitos
sobre este trausporte:
EFEITO DA ANGIOTENSINA II
Os pnme1ros trabalhos que relatam a presença de receptores para
ANG!l em membraua luminal de célula tubular proximal datam da década de
80 (HARRIS & NAVAR,l985; DOUGLAS, 1987; NA VAR et alii., 1999).
Desde então vários pesquisadores vêm caracterizaudo e estudando a possível
ação luminal deste hormônio. Dentre estes, podemos citar o trabalho de
PAXTON et alii.(1993 ), que identificaram receptores de ANGII do tipo
l(AT1), através da técnica de imunohistoquímica, pelo uso de anticorpos
policlonais em epitélio de alça ascendente espessa, e em " brush border" de
túbulo proximal, em rim de rato. Já HARRISON-BERNARD et alii.(l997),
obtiveram novas evidências através do uso de anticorpos monoclonais,
mostrando uma graude distribuição renal destes receptores, incluindo
membraua basolateral e apical de células do túbulo proximal, dueto coletor
cortical e túbulo distal convoluto. A presença deste receptor AT1 em
glomérulo e arteríolas aferente e eferente também foi confirmada. MEISTER
et alii.(I 993 ), em estudo de hibridização " in situ", também caracterizaram o
mRNA do receptor AT 1 em células da medula externa, túbulo proximal, TAL,
glomérulo renal, vasculatura arterial e vasa recta.
Por outro lado, tem sido mostrada a presença de augiotensinogênio na
luz tubular de tubulo proximal. Aliás, foi identificada a presença de mRNA de
augiotensinogênio neste mesmo segmento tubular (NA V AR et alii., 1999).
Outro aspecto relevante, reside no fato que em estudos de micropunção renal,
a concentração de ANGI e ANGII na luz tubular é muito maior do que a
plasmática. SEIKAL Y et alii.(1990) relataram que a [ANGII] no fluido
78
tubular atinge valores da ordem de 10-9M (30-40pmol/ml), aproximadamente
1000 vezes acima da plasmática, fato comprovado por outros autores
(BRAAM et alii., 1993; THEKKUMKARA et alii, 1998).
Estes dados sustentam a idéia de que o angiotensinogênio é secretado
no túbulo proximal (uma vez que devido ao alto peso molecular do
angiotensinogênio dificilmente seria filtrado pela membrana filtrante do
glomérulo) e que a ANGI poderia ser formada dentro do túbulo se ocorrer a
presença de renina ou enzimas semelhantes 'a renina no fluido tubular, bem
como de stutese de ANGII caso exista enzima conversara de angiotensina.
MOE et alii.(l993) e HEINRICH et alii.(l996) mostraram que a renina pode
ser secretada no túbulo proximal Em adição, LEYSSAC ( 1986) reportou
baixa, porém mensurável, concentração de renina no túbulo proxiinal,
indicando que a renina pode ser responsável pela geração de ANGI na luz
tubular. Foi descrito também que a enzima conversara é encontrada em
abundância em "hrush border" de célula epitelial proximal (SCHULZ et alii.,
1988; IKEMOTO et alii, 1987).
Desta forma, na luz tubular proximal encontram-se todos os elementos
(substrato, enzimas) necessários para formação da ANGII, e ainda, pela
presença de receptores AT 1, iinplicariam num possível efeito luminal. Sendo
assiin, perfundimos o tubulo distal fiual com ANGII, mostrando que este
hormônio interfere significativamente no fluxo secretório de potássio, em
ambas concentrações estudadas (lo·' e 10-"M). Para comprovar que o efeito
deste peptídeo não foi inespecífico, também realizamos uma série de
experiinentos utilizando a ANGII, adicionada ao losartan (10-6M), mostrando
que o efeito é revertido quando bloqueamos os receptores AT1.
A possível iinportância fisiológica da influência intralunrinal deste
peptideo sobre o transporte de íons, residiria no fato que este hormônio
poderia estar aluando no túhulo proximal promovendo uma maior reabsorção
79
tubular em condições de retração do VEC. Em favor desta hipótese, QUAN &
BAUM (1998) observaram uma diminuição no transporte tubular proximal,
durante microperfusão luminal com losartan (58%) na situação de contração
de volume.
Um aspecto interessante da ação da ANGII em túbulos renais é sua
ação bifásica, isto é, estimuladora do transporte iônico a concentrações baixas
(10.12 a 10'9M) e inibidora a níveis mais altos (I0-6-I0-5M)(COPOLLA &
FRÜMTER, 1994; BARRETO-CHAVES & MELLO-AIRES, 1996). Em
nossos experimentos, restringimo-nos às doses baixas (I o-n-1 o·'M),
considerando que já a essas doses encontramos um efeito inibidor da secreção
de potássio.
Outro dado importante é o trabalho de LI et alii.(l994), mostrando a
ação deste agente hormonal em ambos os lados da célula proximal, usando
microperfusão isolada de tubulo proximal de coelho. ANGII adicionada em
membrana basolateral e luminal separadamente apresentou efeito
estimulatório do transporte iônico em tàrma dose-dependente. Em adição,
mostraram que a ANGII com 10'11M luruinalmente apresentou um pico
estimulatório maior do que 10'10M deste hormônio adicionado no lado
basolateral.Quando a concentração peritubular era mantida a l0' 10M, a adição
de ANGII luminahnente não inibiu a taxa de reabsorção, mesmo quando a
concentração luminal atringiu valores de \0'8M, mostrando que na situação
em que ANGII está presente no lado basolateral, altas concentrações luminais
deste peptídeo não necessariamente inibem a taxa de reabsorção; pelo
contrário~ podem exercer um efeito estimulatório.
Os nossos resultados indicam que este agente peptídico possivelmente
apresenta LUn efeito luminal nos segmentos finais do néfro. Estudos de
microperfusão de túbulos proximais no rato mostraram que a administração
de angiotensina em doses picomolares estimula a reabsorção de Na+,
80
particularmente pela ativação da pemmta Na+/H+ (NASCIMENTO-GOMES
& MELLO-AIRES, 1992). WANG & GIEBISCH (1996) estudaram o papel
da ANGII na regulação da taxa de reabsorção de bicarbonato em tubulo distal
inicial e final, mostrando que ANGII em fluido tubular distal causou um
efeito estimulatório na reabsorção de volume e de bicarbonato, sendo este
efeito bloqueado por saralasin ( amiloride também bloqueou a estimulação
promovida pela ANGII). O aumento da reabsorção de volume observado
nestes trabalhos, implicaria no aumento da taxa de reabsorção eletrogênica de
Na+, aumento da atividade da bomba Na+/K+, despolarização da membrana
lmninal, levando a um aumento da diferença de potencial transepitelial, e
todos estes fatores resultariam nmn possível aumento na excreção distal de
K+. Nossos resultados mostram o contrário, ou seja, diminuição do tluxo
secretório de K+ e sem nenhum efeito sobre o transporte eletrogênico de Na+,
pois quando na presença de angiotensina, a DP transepitelial e a concentração
estacionária de potássio não se alteraram siguificativamente, em comparação
à situação controle .
Por outro lado, tem sido comprovado que alguns receptores acoplados
a proteína G poderiam ativar múltiplos sistemas de segundos mensageiros.
Tem sido evidenciado que alguns agentes hormonais, como bradicinina,
vasopressina, e angiotensina, poderiam afetar o transporte de eletrólitos
através do estímulo da síntese de prostaglandinas, e no caso do território
renal, o principal prostanóide envolvido nestas ações seria a PGE2
(ZUSMAN et alii., 1980; HOLT & LECHENE, 1981 I e II). Desta forma, a
PGE2 düninuiria a secreção de potássio distal, reduzindo o transporte
transcelular de Na+ através da inibição da bomba Na+/K+, ou pela düninuição
dos níveis de AMPc, pela ativação de receptores de prostanóides acoplados a
proteina G,, como o receptor EP3 (vide discussão das prostaglandinas).
81
Assim, não está esclarecido ainda porque doses de angiotensina que
estimulam a reabsorção de fluído e de bicarbonato, bem como de hidrogênio
(BARRETO-CHAVES & MELLO-AIRES, 1997, WANG & GIEBISCH,
1996), inibem a secreção de potássio, Foi sugerido que os efeitos de
angiotensina II em túbulo renal poderiam ser mediados pela concentração
citosólica de Ca* (NASCIMENTO GOMES & MELLO-AIRES, 1992;
OLIVEIRA SOUZA & MELLO-AIRES, comunicação pessoal), Por outro
lado, alguns canais de K+ (como os de condutãncia intermediária da MBL ),
são inibidos por Ca++ elevado (HIRSCH & SCHLATTER,l995), indicando
um efeito diferente sôbre H+ e K+ por parte de variações de Ca * citosólico,
EFEITO DA BRADICININA
A bradicinina e a lisil-bradicinina são autacóides que agem localmente,
induzindo dor, vasodilatação, permeabilidade vascular aumentada e síntese de
prostaglandinas (GOODMAN & GILMAN, 1996), As cininas no rim,
possivelmente formadas através da ação da calicreína sobre o substrato
cininogênio de baixo peso molecular, regulam o volume e a composição
urinários, Elas aumentam o fluxo sanguíneo renal e intensificam o transporte
elerrogênico de cloreto no túbulo coletor (CUTHBERT & MAGOLIUS,
1982), estimulando receptores do tipo B2 nas células tubulares, Que as cininas
apresentam uma ação importante no transporte iônico é sugerido pela grande
quantidade de cininases presentes em túbulos renais (BALLERMANN et alii,,
1991), e pelo efeito destas no transporte de Na+ (SCICLI & CARRETERO,
1986), A infusão de cininas estimulando a excreção de Na+ sem alterar o
RFG, fez com que WILLIS et alii,(l969) postulassem um efeito tubular
direto, particularmente em túbulo distal, Além disto, a inibição da sintese ou
da ação endógena destas cininas por aprotinina (inibidor de calicreina) e o uso
82
de anticorpo anti-cinina, reduziram o efeito natriurético e diurético estimulado
por infusões salinas (MARIN-GREZ, 1974), Em DCC de ratos, tratados com
mineralocorticóides, estes agentes reduziram a reabsorção de Na• estimulado
por ADH (SCICLI & CARRETERO, 1 986), TOMITA et alii.(1985) relataram
que a inibição deste transporte seria etetuada por uma via eletroneutra, uma
vez que as cininas não alteraram o V1.
Outro aspecto interessante das cininas é seu efeito inibitório sôbre o
fluxo de água estimulado por ADH (SCHUSTER et alii., 1984). Em células
de DCMI isoladas, BK inibiu canais apicais de Na•. Já em DCC de coelho as
cininas não tiveram o mesmo efeito inibitório sobre o transporte de Na-r
(ZEIDEL et alii., 1 990). Embora os trabalhos citados anteriormente mostrem
uma diversificação na resposta celular, dependendo da espécie estudada,
pode-se constatar de que as cininas efetivamente atuam em células epiteliais
renms.
V árias observações foram relatadas evidenciando a localização
específica da calicreína renal. Esta enzima foi encontrada nos segmentos
distais do nefro. Alguns trabalhos mostram por imunohistoquímica que a
calicreína é sintetizada no túbulo conector cortical (TCN)(BERG
ORSTA VIK et alii., 1976); Estes trabalhos foram apoiados pela detecção de
atividade amidolítica em túbulos convolutos distais, e por estudos de
imunoreatividade de células do TCN por microscopia eletrônica (FIGUEROA
et alii., 1984). Esta localização, e ainda o fato que a calicreína é encontrada
em vesículas secretórias muito próximas ao lúmen tubular, sugerem que o
sitio de ação desta enzima é a membrana lurninal em células localizadas a
juzante ("downstream") do túbulo conector (V ALLÉS et alii., 1997).
Evidências clínicas e experimentais a respeito de alterações da
atividade da calicreina urinária em condições de distúrbio ácido-base foram
reportadas por MARIN-GREZ & V ALLÉS (1994), mostrando que a
83
calicreína está envolvida na regulação do balanço ácido-base, provavelmente
por inibir o transporte renal de bicarbonato em segmentos distais do nefro
Embora as cíninas foram detectadas tanto em células tubulares, como na urína
(ALHENC-GELAS et alii., 1981), a origem das cinínas renais é controvertida.
Al,bTLrmas evidências pennitem postular que a calicreína renal não pode
ínteragir efetiva.mente com o cminogênio no túbulo distal, devido a
concentração baixa, e pH luminal desfavorável. MARIN-GREZ (1995)
demonstrou que injeção retrógrada de bradicinina no DCC não dínrinuiu a
concentração de bicarbonato, indicando que o efeito fisiológico da calicreina
sobre o transporte de bicarbonato não está relacionado com a liberação de
cininas. VALLÉS et alii. (1997), com metodologia similar, após ínjeção de
calicreína retrógrada, não observaram diferença de concentração de cínínas no
DCC, porém o fluxo de bicarbonato foi diminuído, sustentando a hipótese de
que a calicreína, e não as cininas, seria parte integrante de mn "feed-back"
negativo de regulação do equilíbrio ácido-base, atuando diretarnente através
modulação da secreção de bicarbonato.
Por outro lado, observou-se um aumento na atividade da calicreína em
animais submetidos, a longo prazo, a uma dieta rica em potássio (GUDER et
alii., 1987). Sabe-se que anormalidades no balanço de potássio levam a
distúrbios do equilíbrio ácido-base (MALNIC et alii., 1971} Assim, se a
calicreína está envolvida no balanço ácido-base e modificações da iogesta de
potássio modificam a atividade desta enzima pertencente ao SCC, é plausível
sugerir que este sistema relaciona-se com o metabolismo de potássio.
Receptores para ação da bradicinina podem ser encontrados em células
dos segmentos finais do néfro (TOMITA & PISANO, 1984), sugeríndo a
possibilidade de uma ação local importante na regulação do transporte iônico.
Entretanto, ainda não existem evidências de que a membrana luminal de
células do dueto coletor contenham receptores para as cínínas (V ALLÉS et
84
alii., 1997). A inibição da reabsorção de Na" pela bradicinina (WILLIS et
alii., 1969; VIO et alii., 1983; SCICLI & CARRETERO, 1986;
BALLERMANN et alii., 1991), poderia levar a uma diniinuição da DP
transepitelial, diniinuindo o gradiente eletroquímico favorável à secreção de
potássio e consequentemente reduziria a secreção distal deste cátion. Como
foi observado no presente estudo, bradicinina a I o·' e I o·' 1M, reduziu
sigriificativamente a DPtrans durante a tàse experimental, e reduziu em cerca
de 50% o fluxo secretório de potássio.
Uma alternativa a este mecanismo implicaria possíveis interações
hormonais em túbulo coletor cortical. Foi mostrado que as crumas não
aumentam GMPc, indicando que diferentemente do ANP, a inibição do
transporte de Na" não é mediado por GMPc (ZEIDEL, 1993). Entretanto,
HOLT & LECHENE (1981 I e II), mostraram que agentes peptídicos, como a
bradicinina e a vasopressina, podem estimular a síntese de prostaglandínas em
DCC de coelho, o que inibiria a reabsorção tubular de Na+ e de cloreto,
evento revertido pela adição de meclofenamato (um inibidor da síntese de
prostaglandinas ), e sugeriram uma modulação hormonal no transporte iônico
no néfro distal. Por outro lado, em cultura primária de célula de DCMI de
coelho, as ciriinas aumentaram a [Ca++] intracelular (SHAYMAN &
MORRISON, 1985) e foi mostrado em estudos de "patch clamp" que a
aplicação de ionomicina reduziu significativamente a abertura dos canais de
Na+ (PALMER & FRINDT, 1987), sugerindo que as cininas poderiam inibir
a condutãncia de Na+ através do aumento de cálcio intracelular. No entanto,
esta possibilidade contrasta com a sugestão discutida abaixo, envolvendo o
C a++ com o efeito estimulador da secreção de K+ pela A VP.
85
EFEITO DA PROSTAGLANDINA E2
A prostaglandina ~ é um potente mediador de muitas funções
biologicamente importantes, como as do sistema cardiovascular, pulmonar,
endócrina, renal, reprodutor e sistema imune (COLEMAN et alli., 1990). O
túbulo coletor, por sua vez, exibe a maior atividade da ciclooxigenase, ao
longo do néfro, sendo a PG~ o metabólito ativo do ácido araquidônico
encontrado em mmor quantidade. A concentração urinária de PG~,
geralmente utilizada como índice da produção renal deste prostanóide, está na
faixa de nanomolar, e é significativan1ente aumentada por dieta hipossódica
(SAKAIRI et alii., 1995).
Os diversos efeitos da PGE2 são dependentes do tecido e das vias de
transdução de sinal celular. A complexidade das respostas a este prostanóide é
atribuída ao reconhecimento de pelo menos quatro subtipos de receptores
(EP1, EP2,EP3, e EP4) que diferem na especificidade do sítio ligante,
distribuição no tecido, e acoplamento a diferentes sistemas de sinalização
celular.
Algumas isofonnas de receptor EP3 de camundongo e vaca, quando
expressas em oócito de hamster chinês, apresentaram mnltiplas vias de
transdução de sinal, acopladas a diferentes proteínas G (NAMBA et alli.,
1993 ). Entretanto muitos detalhes a respeito das vias de sinalização celular
destas diferentes isofonuas de receptor EP3, não foram ainda totalmente
esclarecidos.
AN et alii.(1994), clonaram um receptor EP3 de rim hmnano, expresso
em células CHO, que urna vez ativado, produziu um decréscimo na
concentração intracelular de AMPciclico e amuento na concentração de cálcio
intracelular. Outros estudos mostraram que o receptor EP3 relaciona-se com a
inibição da adenilciclase via proteína G,. Foi demonstrado também que o
86
receptor EP3 pode acoplar-se a outras vias intracelulares além da proteína G,,
levando, por exemplo, ao estímulo do metabolismo dos fosfoinositídeos via
proteína G insensível a toxina pertussis (NEGISHI et alli., 1989). Por outro
lado, Breyer et alii.(l998), em recente revisão, relataram que o receptor EP3 é
bastante expresso em DCC, e que provavelmente a célula mbular também
expresse o receptor EP 4, tanto em ML como MBL em dueto coletor.
Os distintos padrões de distribuição tecidual e as respostas bioquímicas
transduzidas por diferentes tipos de receptores EP, podem fornecer parte das
bases moleculares para o conhecimento dos papéis funcionais da PGE, "in
vivo". Nossos resultados mostraram que a prostaglandina PGE2 reduziu
significativamente o fluxo secretório de potássio. O efeito deste prostanóide
sobre o transporte iônico poderia estar relacionado a sua ação inibitória sobre
a bomba Na+1K+-ATPase (ZEIDEL, 1993). Desta forma, a PGE2 reduziria a
força movente para o transporte iônico, pois a reabsorção de Na+ neste
segmento ocorre predominantemente via canais apicais de Na+ sensíveis a
amiloride, e pela ativação da Bomba Na+IK+. Consequentemente, a PGE2
reduziria a DPtransepitelial, fato observado no nosso trabalho, bem como
reduziria a secreção de potássio distal. Observamos uma redução de cerca de
50% do fluxo secretório de potássio. Interessantemente, a redução do fluxo
secretório foi muito semelhante à redução proporcionada pela bradicinina,
consubstanciando o fato de que a bradicinina poderia estar estimulando a
síntese de prostaglandina (HOLT & LECHENE, 1981; ZUSMAN &
KEISER, 1980)
A prostaglandina, ainda, poderia estar aluando na redução do fluxo
secretório de potássio, através da ativação de receptores EP3 acoplados a
proteína Gi, diminuindo os níveis de AMPcíclico. Este segundo mensageiro
relaciona-se fortemente com o aumento da condutância iônica pelos canaJs
luminais de pequena condutância para o potássio (CASSOLA et alii., 1993).
87
Por outro lado, sabe-se que a PGE2 pode acoplar-se a outros tipos de proteína
G, como a proteína Gq, aumentando os níveis de fosfolipase C, com aumento
de proteína quinase C (inibidora dos mesmos canais de baixa condutância), e
subsequente aumento de Ca ++ intracelular.
Por outro lado, SAKAIRI et alii.(l995), em estudos de microperfusâo
isolada de DCC, demonstraram pela primeira vez que a PGE2 aplicada
luminalmente modula o transporte iônico em dueto coletor de coelho,
causando uma hiperpolarização provavelmente associada à via do receptor
EP4, insensível a Butaproste (agonista EP2). Além disto, o efeito luminal da
PGE2 na Vt, não foi afetado pela toxina pertussis, arguindo contra a possível
ação deste prostanóide em receptores EP3, localizados na membrana luminal.
O receptor EP4 , por sua vez, está envolvido no estimulo de AMPc, o que
promovena o amnento da permeabilidade osmótica observado no trabalho
destes autores.
Interessantemente, estes autores mostraram que o efeito
hiperpolarizante sobre a V, foi bloqueado pelo amiloride, sugerindo que esta
hiperpolarização é dependente da absorção de Na• no DCC. BOLGER et alii.
(1978) relataram que a infusão de PGE2 estimulou a natrimese e a dimese.
Em estudos de microperfusão de DCC, a PGE, inibiu a reabsorção de Na+
(LINO & IMAE, 1978). Entretanto, efeitos similares poderiam também
resultar da inibição da secreção de potássio, hidrogênío ou da absorção de
cloreto.
EFEITO DO ANP
As principais ações deste agente sobre o tecido renal incluem: efeito na
hemodinâmica renal (com aumento do RFG), efeito sobre transporte iônico
(com aumento da excreção de água e eletrólitos ); efeito inibitório do sistema
88
renina-angiotensina-aldosterona (por inibição da síntese de renina e
aldosterona) e fmalmente por promover um aumento da permeabilidade
hidráulica capilar, estimula movimento de tluido do compartimento
intravascular para o intersticial (MAACK, 1996).
Inúmeros trabalhos mostram o efeito destes peptídeos no aumento da
excreção de Na•, agindo no glomérulo e em vários segmentos tubulares,
incluíndo túbulo proximal, DCC, e DCMI (ZEIDEL, 1993). SONNENBERG
et alii.(1990) mostraram que a perfusão lmninal com ANP reduz a reabsorção
de Na+ em DCMI em rato. Nossos resultados mostraru que o ANP estimulou
significativamente a secreção de potássio distal, sugeríndo um efeito
modulatório no transporte deste cátion. É possível que as células do segmento
distal do néfro expressem receptores lumínais. Alguns aspectos importantes
sustentam esta possibilidade: o maior sítio de degradação de ANP são as
endopeptidases presentes em " brush border" de células renats
(BALLERMANN & ZEIDEL, 1992). Inibidores desta enzima estimulatn
natriurese, mesmo sem aumento dos níveis plasmáticos deste peptídeo
(GOETZ, 1991). Peptídeos semelhantes ao ANP, como a Urodilatína, são
síntetizados em segmento conector do córtex renal (GOETZ, 1991) causando
ínibição do transporte de Na+ em DCMI, de maneira similar ao ANP
(ZEIDEL, 1993). Em adição, trabalhos do nosso laboratório
(NASCIMENTO-GOMES et alii., 1992; OLIVEIRA SOUZA & MELLO
AIRES, comunicação pessoal), mostraratn que o ANP inibe o efeito tanto
estimulatório quanto inibitório da ANGII na extrusão celular de hidrogênio,
em túbnlo proximal "ín vivo"e em cultura de células MDCK. Já em estudos
de microperfusão em túbulo distal, o ANP não mostrou efeito significativo na
velocidade de reabsorção de bicarbonato e na modulação do efeito da
angiotensina (BARRETO-CHAVES & MELLO-AIRES,1996 e 1997).
89
V árias trabalhos mostraram que o rim expressa, especialmente no
córtex, receptores para estes agentes hormonais (NAPIER et alii., 1984; Y1P
et alii., 1985), particularmente em glomémlo (BALLERMANN et alii., 1985;
BUTLEN et alii., 1987). TERADA et alii.(1991), detectaram altos níveis de
RNA mensageiro para o receptor de ANP no glomémlo e dueto coletor
medular interno, enquanto outros segmentos renais como DCC, túbulo
convoluto proximal e distal apresentaram níveis muito baixos de expressão.
RITTER et alii.(l995) relataram que o ANP pode estar relacionado com a
regulação do transporte de HC03- no dueto coletor cortical, via guanylato
ciclase acoplado aos receptores do tipo B.
Existem várias evidências de que o GMPc é o mediador da ação do
ANP no transporte de Na+ em DCMI. O ANP aumenta os níveis celulares de
GMPc, e o GMPc reproduz os efeitos do ANP (ZEIDEL, 1993). Em células de
cultura primária de DCMI, em estudos de " patch clamp", o GMPc aplicado
na face citoplasmática reduziu o tempo de estado aberto dos canais sensíveis a
amiloride, (LIGHT et alii., 1989). Por outro lado, mostrou-se que o GMPc
pode atuar diretamente no canal do cátion ou pode estimular uma proteína
quinase dependente de GMPc (LIGHT et alii., 1990; HIRSCH &
SCHLATTER, 1995).
Outro aspecto interessante relativo às vias de transdução celular destes
agentes refere-se ao possível efeito inibitório da bomba de Na+/K+ deflagrado
pelo ANP. GUNNING et alii.(l992) mostraram, em suspensão de células de
DCMI, que o ANP a concentrações acima de 10'12M, causou inibição da
Bomba de Na+/K+, sendo esta inibição provavelmente mediada pela PGE2.
HOLT & LECHENE ( 1981 I e II) observaram mna diminuição na DP e na
reabsorção de Na+ na presença de ADH, devido provavelmente à síntese de
PGE2 pelo dueto coletor cortical, e sugeriram que peptídeos como o ANP
90
poderiam estar estimulando a produção local de prostanóides como a PGE2 ,
neste segmento.
Em nossos experimentos, o efeito inibitório da PGE2 se opôs ao efeito
estimulatório do ANP sôbre o fluxo secretório de K+ durante a perfusão
luminal. Tem sido mostrado, contudo, que em cultura de células de DCMI, o
ANP ativa a fosfolipase C, via proteína G sensível a toxina pertussis (BEARL
et alii., 1991 ). Esta ativação conduz a um aumento de IP3, com aumento de
Ca++ intracelular, bem como de proteína quinase C, pela ativação do DAG. O
aumento de cálcio intracelular, poderia inibir os canais de potássio
basolaterais, favorecendo a secreção distal de potássio (HIRSCH &
SCHLATTER, 1995). Além disso, existem evidências de que os canais de
grande condutância para o potássio (BK) podem ser ativados pelo GJ\1Pc, ou
por agentes que ativam o GJ\1Pc, como o ANP e o Nitroprussiato (doador de
NO). Esta ação possui grande importância fisiológica pois agentes
vasodilatadores se contrapõem ao efeito de vasoconstrictores como a
angiotensina, e na mesma proporção possivelmente, agentes natriuréticos,
como o ANP se contrapõem ao efeito de antinatriuréticos (STOCKAND &
SANSOM, 1996).
EFEITO DA ARGININA V ASOPRESSINA
A estimulação do transporte de eletrolítos, incluindo K+, por agentes
como A VP, foi observada em vários epitélios renais. O aumento de 150% do
J/ foi detectado durante administração parenteral de A VP em perfusões de
túbulos distais (FIELD, STANTON, et alii., 1984). Um canal catiônico
inespecífico foi ativado pela aplicação de A VP na superficie Basolateral de
células A6 (MARUNAKA, TORDA, et alii., 1994). Foi descrito também que
a aplicação luminal deste hormônio no DCC, aumentou a condutância de
-------
9l
Cloreto luminal (ANDO, TABEI et alii., 1991; BREYER & ANDO 1994;
NARUSE, YOSHITOMI, et alii., 1995).
Mostramos no presente trabalho, que no túbulo distal final,
correspondente ao dueto coletor inicial, a A VP é ativa sobre o transporte de
potássio quando aplicada na superficie celular luminal. Para confirmar que o
estímulo na secreção de potássio pela A VP depende de canais de K•,
perfundimos luminalmente o túbulo distal com Ba ++ (3mM), conhecido
bloqueador específico para canais de potássio, associado à A VP (!0-11M)_
mostrando uma reversão do estímulo secretório. Nesta situação, a secreção de
potássio foi semelhante aquela obtida durante perfusão com o mesmo agente
isoladamente (Tabela XV).
Foram descritos até o presente momento dois tipos de receptores de
vasopressina, V 1 e V 2 , ambos localizados em vários tecidos, mas também em
células renais. Os receptores V2, são os responsáveis pela ação do AVP sobre
a permeabilidade à água de túbulos distais e coletores, localizados
primordiabnente na MBL (BICHET, 1996). Entretanto NONOGUCHI et alii.
(1995) através de imunohistoquímica, mostraram a presença de receptores V2
luminais em néfro distal, particularmente em DCMI. Os receptores V 1 foram
subdivididos em: V 1,, presentes em hepatócitos e medula renal,
particularmente em célula muscular lisa vascular, e também em células de
túbulo renal, especialmente de DCC (AMMAR, ROSEAU, et alii., 1992;
MAEDA, HAN, et alii., 1993; TERADA, TOMITA, et alii., 1993). E V1b,
descritos em células da medula adrenal (GRAZZINI, LODBOERER etalii.,
1996). Os receptores V1 foram localizados por imunocitoquímica em
segmentos conectores de túbulos distais e dueto coletor cortical, em ambos
lados da célula (MBL e ML) (GONZALEZ, FIGUEROA, et alii., 1997). O
RNA mensageiro do receptor V 1, foi também detectado por Polymerase Chain
Reaction (PCR) em DCC inicial de rato (TERADA, TOMITA, et alii., 1993).
92
Foi relatado também o efeito da vasopressma em receptores de
ocitocina, acoplados a tun tipo de receptor V1, não V1, e não V1b, que é
ativado por PLC, levando a um aumento do Ca ++ intracelular . Foi sugerido
um possível efeito modulatório da ativação destes receptores pela ação do
A VP em células do dueto coletor medular interno (MAEDA, HAN, et alii.,
1993).
O antagonista A V 1 utilizado neste trabalho, atua inespecificamente
sobre os diferentes subtipos de receptores V~, não permitindo a distinção entre
V 1, ou V Ib- Entretanto, o receptor descrito pela maioria dos pesquisadores
para o DCC é o subtipo Vt, (AMMAR, ROSEAU, et alii., 1992; MAEDA,
HAN, et alii., 1993; TERADA, TOMITA et alii., 1993).
Trabalhos recentes do nosso laboratório mostraram que o A VP a tua
sobre a secreção de próton em túbulo distal inicial e final, estimulando este
processo numa concentração de 10-9M (BARRETO-CHAVES & De
MELLO-AIRES, 1997). Os autores mostraram que o A VP estimula o
trocador Na+ !H' na membrana apical deste segmento. Em adição, eles
encontraram que o antagonista A V 1 (o mesmo utilizado nos presentes
experimentos) aboliu o efeito do A VP, enquanto o antagonista AV2 não
mostrou nenhum efeito significativo. Comparando seus dados com os
presentes resultados, podemos sugerir que a regulação da secreção de H+ via
trocador Na+/W divide um mecanismo comum com a secreção de K+ neste
segmento.
Vários peptideos hormonais possuem diferentes atividades quando
apresentam niveis plasmáticos baixos (fisiológicos) ou altos. Isto foi
evidenciado pela angiotensina, também um estimulador de transporte de W
em túbulo distal (BARRETO-CHi\ VES & MELLO-AIRES, 1996) e proximal
(NASCIMENTO-GOMES & MELLO-AIRES, 1992). Este peptídeo estimula
o transporte de bicarbonato proximal em baixas concentrações (!0-12M),
93
amnentando a condutância de K+ basolateral, enquanto efeitos diametrabnente
opostos foram observados quando a concentração de ANGII atinge valores da
ordem de micromolar (COPPOLA & FRÔMTER, l994a e b). O efeito do
AVP sobre o trocador Na+/H+ mostrou mn padrão similar ao da ANGII. A
extrusão de H+ por células MDCK em cultura, foi estimulada por A VP a l o-12
e 10-9M, mas foi reduzida na concentração de 10-7 e 10-6M (MALNIC,
FERNANDEZ, et alii., 1997). Entretanto, A VP com 10-6M não inibiu a
secreção de K+ distal, como observado no presente trabalho, mas o aumento
do fluxo secretório não atingiu um nível de signíficância. É passive! que a
ausência de mn efeito bifásico do A VP no CCD seja devido a propriedades
locais inerentes às vias de segundos mensageiros. Por outro lado, o papel da
elevada concentração da ANGII e do A VP sobre o transporte de W não havia
sido estudado em DCC anteriormente (BARRETO-CHA VES-MELLO
AIRES, 1997).
O desenvolvimento dos antagonistas de A VP permitiu que informações
importantes sobre as vias de sinalização celular fossem obtidas. É bem
conhecido que os receptores V 2 estão presentes predominantemente na
membrana basolateral de células do dueto coletor, onde modulam o efeito
hidrosmótico do A VP em concentrações basais fisiológicas ( !0-12M). Sabe-se
que este mecamsmo está envolvido com a vta
adenilciclase/AMPcíclico/proteína qumase A (PKA) (BORENSZTEIN,
WVIN, et alii., 1993; CASSOLA, GIEBISCH, et alii., 1993; SNYDER,
NOLAND, et alii., 1992). Por outro lado, os receptores V~, que modulam a
ação do A VP, predominantemente acoplam-se à via fosfolipase C
(PLC)/lP]iproteína quinase C(PKC) e Cálcio. Evidências a favor desta via
foram descritas em: túbulo proximal de coelho (Y AMADA, SEKJ, et alii.,
1996), ramo ascendente espesso de rato (STAR, NONOGUCHJ, et alii., 1988;
BURGESS, BALMENT, et alii., 1994; NJTSCHKE, FRÔBE, et alii., 1991),
94
célula principal de CCD de coelho (BURNATOWSKA-HLEDIN &
SPIELMAN, 1989; IKEDA, YOSHITOMI, et alii., 1994), e células em
cultura da linha LLC-PK1(DIBAS, REZAZADEH, et alii., 1997).
A inibição da ação do AVP pelo A V1 e a ausência de similar efeito do
A V 2, sugere que a via de sinalização celular envolvida neste processo
relaciona-se com a gênese de PKC e/ou aumento de Ca ++ intracelular. Dados
obtidos da técnica de "patch-clamp" têm mostrado importantes informações
sobre o mecanismo pelo qual A VP poderia influenciar o transporte de K+. Foi
descrito que a adição de A VP ao banbo de túbulos "split-open" de CCD
induziu a atividade de canais apicais silentes na configuração "cell-attached",
isto é, o A VP induziu ao amnento de canais de K+ de baixa condutància
funcionantes, amnentando a condutância apical de células principais ao K+
(CASSOLA, GIEBISCH, et alii., 1993). Estes autores também obtiveram
evidências de que este mecanismo foi mediado por AMPc/PKA.
Por outro lado, em células de cultura primâria renal, foram encontrados
maxi-canais de potássio, canais de K+ ativado porCa++ na membrana apical,
e foi mostrado também que estes canais amnentam sua probabilidade de
abertura quando A VP era adicionado ao meio. Estes canais apresentam mna
condutància de I 07pS, e é possível que possam mediar o efeito Ca ++
dependente na condutància apical de K+ (GUGGINO, SUAREZ-ISLA, et alii.,
1985). Foi também proposto que estes canais podem ser responsáveis pela
regulação do volmne celular, como ocorreria após a inchação da célula pós
inibição da bomba de Na+/K+-ATPase (STRANGE, 1990), mas possivelmente
também por estimulação da entrada de Na+ na célula principal de DCC pela
vasopressina (ANDO, TABEI, et alii., 1991; REIF, TROUTMAN, et alii.,
1986).
Um interessante achado foi a observação da inibição da secreção de K+
com antagonista anti-V" isoladamente. Isto poderia refletir mn efeito
95
inibitório inespecífico deste agente, mas poderia também indicar que em
condições controle existe um nível basal de A VP aluando sobre receptores V 1
luininais que poderia assim causar uma ativação tônica da secreção de K•,
Ações inibitórias desta natureza não foram ainda reportadas, Entretanto,
MAEDA et alii,(l993), perfundindo dueto coletor medular interno de rato
com A V 1, mostrou uma moderada redução dos túveis de cálcio celular, o qual
pode inibir o mecanismo dependente de Ca ++,
Com o objetivo de se eliminar um possível efeito inespecífico do anti
V 1 utilizado em nossos experimentos, fizemos uma série de experimentos
similares em ratos Brattleboro, os quais são desprovidos de produção
endógena de AVP por um defeito genético (VALTIN, 1982), Nestes ratos,
quando perfundimos túbulos distais com A VP exógeno, foi observado um
estímulo da secreção distal de K+, demostrando a presença de receptores
luininais, Embora a taxa de secreção de K+ distal foi semelhante áquela
observada em ratos Wistar, o A V 1 não apresentou efeito estatisticamente
significante, mostrando que este peptideo não teve uma ação independente de
seu efeito sôbre o receptor de A VP, Estes dados apoiam a hipótese de que em
ratos controles Wistar a secreção normal de potássio distal pode ser
dependente de túveis endógenos de A VP,
Finahnente, gostaríamos de discutir alguns aspectos relacionados com o
possível papel do cálcio na modulação da secreção distal de potássio, bem
como os prováveis canais de K+ envolvidos neste processo, É geralmente
aceito que o canal de pequena condutáncia seJa responsável pela secreção de
potássio neste segmento devido sua alta probabilidade de abertura em
condições fisiológicas, Como descrito anteriormente, este canal é
independente das alterações de voltagens da membrana celular e também da
concentração intracelular de Ca ++, sendo, entretanto, dependente do pH e do
ATP citosólico, Além disto, estes canais são ativados por PKA e inibidos por
PKC ou ácido araquidônico (W ANG et alii., 1992). Já na membrana
basolateral, foram descritos dois tipos de canais de potássio, de pequena e de
intermediária condutância ao potássio (HJRSCH & SCHLATTER, 1995). A
regulação dos canais de potássio basolaterais difere consideravelmente em
comparação aos da membrana luminal. São independentes da alteração de
voltagem, e são inibidos por aumento da atividade de Ca ++ acima de lmmol/1
(HJRSCH & SCHLATTER, I 993). Em adição, eles são ativados por uma
proteína kinase dependente de GMPc (HJRSCH & SCHLATTER, 1995), mas
não por PKA. O único parâmetro regulatório que todos os canais de potássio,
de células principais de DCC, possuem em comum é a dependência do pH
intracelular, diminuindo sua atividade quando se eleva o H' citosólico
(HIRSCH & SCHLATTER, 1993).
Desta forma, a variação da concentração de Ca++ intracelular pode
produzir efeitos variados sobre os canais de potássio localizados no lado
apical e/ou no lado basolateral. Um aumento na atividade de Ca ++ celular
poderia ativar os canais de grande condutância na membrana luminal, e
simultaneamente (ao aumento de Ca ++), poderia ocorrer uma inativação dos
canais de K+ na membrana basolateral, levando a célula principal a um
aumento da secreção de potássio, como observado no presente trabalho.
Evidências favoráveis a esta hipótese são descritas nos trabalhos de HlRSCH
& SCHLATTER (1993; 1995), que descrevem que um aumento da atividade
de Ca ++ celular, induzido por agonista, poderia aumentar a secreção de K+ por
dois fatores: inibição de canais de K+ ua membrana basolateral e ativação de
canais luminais de grande condutância que podem se somar aos canais de
pequena condutância de K+ apicais no aumento do fluxo secretório de K+
(Figura 20).
A influência de Ca ++ também poderia explicar a relação dos canais de
K+ basolaterais com a inibição da atividade da bomba Na+/K+-ATPase, uma
97
vez que o A TP não atua, nos mesmos, como um agente regulador, como
observado em outros tipos de canais de K', presentes no lado lumínaL A
inibição da bomba por ouabaína leva a um aumento da atividade de Na'
intracelular, o que resultaria num decréscimo da força movente para o
permutador Na•/ca", aumentando o Ca" intracelular. O aumento de Ca"
citossólico inibiria os canais de K+ basolaterais e explicaria a observação do
decréscimo da condutãncia basolateral deste cátion durante inibição da
bomba. Já a inibição da condutância lumínal ao sódio, por arniloride, levaria a
uma inibição secundária da bomba, porém não tendo efeito inibitório na
condutãncia ao potássio no lado basolateral. Nestas condições a força
movente para o permutador Na'/Ca" aumentaria, e a atividade de Ca++
intracelular diminuiria. Assim, a dependênciado transporte de K' do Ca ",
com inibição da atividade dos canais de K' pelo aumento do Ca" citosólico
celular poderia explicar as diferentes reações da condutãncia de K' frente aos
fatores que inibem a bomba eletrogênica.
Por outro lado, os canais de grande condutância não estão ativos
durante condições fisiológicas, mas poderiam ser ativados por despolarização
ou aumento intracelular de Ca" induzido pelo aumento de volume celular
("'v). De fato, o papel fisiológico destes canais em células epiteliais não foi
totalmente esclarecido, e algrms fatores como a necessidade de um limiar de
ativação mais positivo que -50mV, tomariam tais canais tonicamente
fechados quando o potencial de repouso destas células permanecesse entre -
60 e -90mV, como ocorre em condições normais. Entretanto, DESIR (1995)
relatou que é possível que células epiteliais de DCC e de medula renal
possuam uma variação suficiente do potencial de membrana para ativar tais
canats, uma vez que nestes segmentos ocorre um significativo aumento da
condutância ao Na' pela membrana lumínal, e assim decorreria uma
98
despolarização celular, e consequentemente aumento do fluxo secretório de
K+.
Uma outra possibilidade que poderia explicar os nossos resultados
refere-se à identificação de canais de potássio de pequena condutância,
dependentes de Ca •+ Recentemente, canais de pequena condutãncia para o K+
ativados por Ca ++ (SK), foram clonados de cérebro de ratos e humanos
(KOHLER et alii., 1996). Os canais SK diferem dos canais de grande
condutância (BK+), por serem mais sensíveis ao cálcio intracelular,
apresentam ativação não dependente de voltagem e possuem menor corrente
unitária (LANCASTER et alii., 1991; SAH, 1995).
99
LUMEN CÉLULA PRINCIPAL INTERSTÍCIO
FIGURA 20 - Ilustração dos possíveis mecanismos envolvidos na modulação
da secreção distal de potássio<
100
VI- CONCLUSÕES
V árias fatores afetam o transporte de potássio em túbulos renais,
tais como: concentração de sódio, ritmo de perfusão, presença de ions
impermeantes, pH, e outros. Entretanto, existem também evidências de que
diferentes substâncias biologicamente ativas interferem no transporte de
potássio, particulannente em dueto coletor corticaL A fim de verificar quais
destes hormônios poderiam ser responsáveis pela estimulação da secreção
distal de potássio, perfundimos o túbulo distal cortical (Dueto Coletor inicial)
com soluções artificiais contendo algumas substâncias que podem ser
encontradas em fluído tubular nativo, no caso Arginina-Vasopressina,
Bradicinina, Prostaglandina E2, e Fator Atrial Natriurético, avaliando-se
concomitantemente o ritmo de secreção de potássio (JK+). Para isto, foram
utilizados ratos albinos Wistar machos, preparados para microperfusão "in
vivo". Impalava-se o segmento distal final com microeletrodo duplo
assünétrico, contendo num dos ramos resina de troca iônica sensível ao
potássio, e no outro, menor, solução eletrolítica corada com verde FDC
( eletrodo de referência), determinando assim, simultaneamente, atividade de
potássio e a variação da diferença de potencial transepitelial (DP).
Pelos resultados obtidos no presente trabalho, durante a perfusão
luminal de túbulos distais corticais com agentes hormonais encontrados no
liquido tubular nativo, chegamos as seguintes conclusões:
1- A redução de 80-90% do fluxo secretório de K+ decorrente da ação
luminal de Ba ++ e Benzamil nas concentrações estudadas, indica que o
transporte transcelular é a principal via de excreção deste cátion, sendo os
10-20% remanescentes provavelmente devidos a difusão paracelular de
lO!
K+. Os experimentos mostram ainda que a secreção de K+ depende da
absorção de Na+ e da DP transepitelial, através da membrana apical.
2 - Foi inicialmente realizado um " screening" de possíveis agentes que
poderiam afetar o transporte distal de potássio. A ANGII, PGE, e a
Bradicinina diminuíram enquanto que o ANP e a A VP aumentaram
significativamente este processo.
3 - A microperfusão luminal com A VP (1 o·' e 10-llM) aumentou a secreção
de potássio distal. Isto sugere que existem receptores luminais para A VP, que
podem mediar o efeito do hormônio sôbre a membrana apical de células
tubulares distais.
4- O antagonista de receptor anti-V1 (10 6M) inibe o efeito do AVP sôbre a
secreção de potássio, mas também reduz o h+, quando admiuistrado sózinho.
Isto leva-nos a sugerir que a A VP atua via receptor V 1, e, além disto, deve
haver um efeito endógeno tônico, sendo este bloqueado pelo antagonista.
5 -O antagonista V2 não apresenta efeito sôbre secreção de K+, nem sózinho
nem conJuntamente com A VP. Isto sugere que os receptores V2 não são
importantes para o efeito luminal de A VP.
6 - Em ratos Brattleboro que geneticamente não produzem A VP, perfusão
luminal com A VP estimula a secreção de K+, indicando haver em túbulos
distais destes ratos, receptores para A VP. Por outro lado, anti-V 1 sózinho não
teve efeito, apoiando a estimulação tônica de h+ por A VP em ratos Wistar, já
que estes ratos não tem A VP endógeno.
!02
7- É possível que a A VP aplicada luminalmente, aluando em receptores V ~o,
alue através do sistema de sinalização PLC/IP3/PKC envolvendo elevação do
cálcio citosólico, o que poderia inibir os canais de potássio de pequena e
intermediária condutância basolaterais e simultaneamente estimular os canais
apicais de grande (Maxi-K) e/ou de pequena condutãncia (SK) dependentes
de cálcio, promovendo um efeito aditivo no aumento da secreção distal de
potássio.
103
VII- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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