Fundamentos da Cromatografia

8/19/2019 Fundamentos da Cromatografia

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SENAI - Curso de Tecnologia emProcessos Quimicos

Analise Instrumental -Prof Eduardo Louzada 1

11

EDUARDO SANTOSEDUARDO SANTOS

LOUZADA LOUZADA

FUNDAMENTOSFUNDAMENTOSDEDE

CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA

Faculdade de Tecnologia SENAI Roberto Mange Curso de Tecnologia em Processos Quimicos

22

CROMATOGRAFIAMichael Tswett - 1906

Separação da clorofila de umamistura de pigmentos de planta.

33

Carbonato de cálcio em pó

Pequena quantidade de amostra

Éter de petróleo

Bandas separadas e de cores distintas.

CROMATOGRAFIA

44

CROMATOGRAFIAéter depetróleo

CaCO3

mistura dePigmentos(clorofila)

pigmentosseparados

55

CROMATOGRAFIA

Kroma = cor Graph = escrever

Escrevendo em cores

66

CROMATOGRAFIAUma amostra a ser analisada é

freqüentemente uma mistura de vários

componentes numa matriz complexa.

Para amostras que contenham

componentes desconhecidos, eles precisam ser

separados dos demais, de modo que cada

componente individual possa ser identificado .

PROBLEMA:


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77

CROMATOGRAFIA

Separação de misturas por interaçãodiferencial dos seus componentes entre

uma FASE ESTACIONÁRIA e umaFASE MÓVEL .

Princípio Básico

88

Nos processoscromatográficos , estãoenvolvidos duas fases,

sendo que uma selocomove através de uma

outra. Assim, a fase que semove denomina-se

fase móvel, e a que não selocomove denomina-sefase estacionária ou

suporte.

FASE ESTACIONÁRIA

99 1010

CROMATOGRAFIA

1111TEMPO 1212

CROMATOGRAFIAUSOS E APLICAÇÕES

Ferramenta analítica para separação demisturas.

Combinada com química convencional ouinstrumental – identificar espécies químicas.

Qualitativamente e Quantitativamente


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1313

Métodos CromatográficosCromatografiaCromatografia

PlanarPlanar ColunaColuna

F.M. LíquidaF.M. Líquida

C.CamadaC.Camada

DelgadaDelgadaC.PapelC.Papel

F.M. GasosaF.M. Gasosa F.M. LíquidaF.M. Líquida

C. GasosaC. Gasosa CLAECLAECCCCCC

CCCCCC-Cromatografia em Coluna Clássica.CLAECLAE-Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.

1414

CROMATOGRAFIA PLANARCROMATOGRAFIA PLANAR

A FaseA FaseEstacionária éEstacionária é

colocada em umacolocada em umasuperfície planasuperfície plana

(Placa de Vidro(Placa de Vidroou Papel)ou Papel)

1515

CROMATOGRAFIA EM COLUNACROMATOGRAFIA EM COLUNA

A Fase Estacionária é colocada em umtubo cilíndrico (Coluna Cromatográfica)

1616

1) Quanto ao método de aplicação daamostra e seu subseqüente

desenvolvimento:

Eluição

Deslocamento

Análise Frontal

Critérios de Classificação

1717

Eluição:A Introdução da amostra é feita

em uma única aplicação, com uma fasemóvel pura, que arrasta a amostra

ao longo da placa ou coluna.Este é o método mais utilizado

na cromatografia analítica.

1818

Deslocamento:Os componentes da amostra são

retirados da fase estacionária usandouma fase móvel que tem mais

afinidade poreles. Este método é mais utilizadoem cromatografia preparativa, em

nível industrial.


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1919

Análise Frontal:Análise Frontal:

A amostra éA amostra écontinuamentecontinuamenteaplicada à umaaplicada à uma

coluna, contendo acoluna, contendo afase estacionária,fase estacionária,

sendo osendo ocomponentecomponente

menos retido, omenos retido, oúnico que sai naúnico que sai naforma pura.forma pura.

2020

2) Mecanismos de separação:

Físico

Químico

Mecânico

Critérios de Classificação

2121

Físico:

Quando se trata dafase estacionáriasólida , a adsorçãodo soluto ocorre nainterface entre o

sólido e a fasemóvel, devido apresença de grupos

ativos na suassuperfícies.

..2222

Químico:É usado em

cromatografia portroca iônica. A

fase estacionáriaé constituída de

uma matriz ondesão adicionadosgrupos funcionais

ionizáveis

2323

Mecânico:É usado emcromatografia por

exclusão. Asmoléculas menores

da amostra sãoseparadas dasmaiores porquesão capazes de

penetrarfacilmente em

todos os poros dafase estacionária. 2424

Centrifugação Cristalização

Destilação Extração

Filtração

PROCEDIMENTO SIMPLES DE SEPARAÇÃO

••CromatografiaCromatografia

MÉTODOS INSTRUMENTAIS DE SEPARAÇÃO


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2525

CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA

PLANAR PLANAR

Faculdade de Tecnologia SENAI Roberto Mange Curso de Tecnologia em Química Fármaco-Industrial

EDUARDO SANTOSEDUARDO SANTOS

LOUZADA LOUZADA

2626




C.CamadaC.Camada





2727

CROMATOGRAFIA EM PAPEL

Técnica simples e econômica de separação doscomponentes de uma mistura.

Cromatografia

líquida-líquida e aseparação ocorrepor absorção

(solubilidade) dosoluto entre os dois

líquidos. 2828

Diferentes solubilidades relativas doscomponentes da amostra na fase móvel (líquida -solventes) e na fase estacionária (líquida – Água

retida na celulose).

Componentes menos solúveis na faseestacionária têm uma movimentação mais rápida,enquanto os mais solúveis serão seletivamente

retidos com uma movimentação mais lenta.

CROMATOGRAFIA EM PAPEL

2929

FASE MÓVEL E

FASE ESTACIONÁRIA

A celulose do papel é constituída por 2.000ou mais unidades de glicose anidra ligadas

por átomos de oxigênio.

Um líquido polar como a água terá grandeafinidade pelas hidroxilas de cada glicose,

formando pontes de hidrogênio: fica retido efunciona como fase estacionária.

3030

Líquidos menos polares (solventesorgânicos): são repelidos por essa estrutura

e funcionam como fase móvel.

n -pentano, ciloexano, tetracloreto de carbono,benzeno, tricloroetileno, clorofórmio, éteretílico, acetato de etila, amônia, acetona,

etanol, metanol, acetonitrila e água

FASE MÓVEL E

FASE ESTACIONÁRIA


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3131

Aplica-se através deum tubo capilar ou

micropipeta.

É recomendávelque a amostra seja

dissolvida numsolvente bastante

volátil

APLICAÇÃO DA AMOSTRA

3232

Ascendente.

TIPOS

Descendente.

Horizontal (circular).

Bidimensional.

3333

Ascendente. Descendente.

3434

Horizontal (circular). Bidimensional.

3535

Cromatografia em papelDetecção

Análise qualitativa: Rf (fator de retenção) Cor da Mancha

Análise quantitativa: Diretamente no papel

– Comparação da intensidade das cores das manchas– Área da mancha– Densitômetria ( Intensidade da cor)

3636




C.CamadaC.Camada






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3737

A Cromatografia em Camada Delgada(CCD) ou Thin Layer Chromatography(TLC) é uma técnica simples, sendo

desenvolvida sobre uma placa devidro, que contém uma fina camada de

adsorvente.

É um tipo de cromatografia líquido-sólido

INTRODUÇÃO

3838

Consiste num método cromatográficoplanar, com Fase Móvel líquida e Fase

Estacionária sólida.

Seu desenvolvimento é por Eluição e omecanismo de separação, por Adsorção.

INTRODUÇÃO

3939

DesenvolvimentoEluição:

A Introdução da amostra é feitaem uma única aplicação, com uma fase

móvel pura, que arrasta a amostra

ao longo da placa ou coluna.Este é o método mais utilizadona cromatografia analítica.

4040

SeparaçãoFísica:

Quando se trata dafase estacionáriasólida , a adsorçãodo soluto ocorre nainterface entre o

sólido e a fasemóvel, devido a

presença de gruposativos na suassuperfícies.

..

4141

- NoNo estudoestudo preliminarpreliminar dede umum sistemasistema ouou dede umaumasituaçãosituação..

Os farmacêuticos aprendem muito sobre acomplexidade dos componentes do extrato deuma planta, qualitativamente, por exemplo,aminoácidos em vegetais, fermentação, sorosangüíneo, urina etc.

APLICAÇÕES

4242

-- NoNo estudoestudo preliminarpreliminar dede umum sistemasistema ouou dede umaumasituaçãosituação..

A medicina legal investiga casos deenvenenamento; emprega a técnica naidentificação de estimulantes ingeridos poratletas. A técnica pode ainda ser aplicada a reaçõesde síntese e também para reações dedegradação de um produto natural extraído deuma planta ou de uma substânciadesconhecida.

APLICAÇÕES


8/17



4343

-- NoNo isolamentoisolamento dede produtosprodutos dede reaçãoreação

Esta técnica pode ser aplicada noisolamento de produtos de reação dediversas formas, analisando a eficiência ea precisão de uma destilação ou de umacristalização, podendo até mesmoverificar a pureza das frações obtidas.

APLICAÇÕES

4444

- Especialmente na Química Orgânica temos estasEspecialmente na Química Orgânica temos estasutilidadesutilidades

estabelecer a identidade de dois ou maiscompostos;

determinar o número de componentes de umamistura;

determinar o solvente apropriado para umaseparação por cromatografia em coluna;

APLICAÇÕES

4545

Em todas estasEm todas estasaplicações, a CCD tem aaplicações, a CCD tem a

vantagem de utilizarvantagem de utilizarpequenas quantidades depequenas quantidades deamostrasamostras..

APLICAÇÕES

4646

Na CCD, a fase líquida se move através dafase estacionária.

Como há uma interação preferencial do

composto a ser identificado com uma dasfases, o percurso total percorrido pelo compostoserá diferente do percurso percorrido pela fase

móvel.

PRINCÍPIO DA TÉCNICA

4747

Se o percursopercorrido pelocomposto for

menor do que opercorrido pela

fase móvel, diz-seque há uma maior

adsorsão docomposto na fase

estacionária.

PRINCÍPIO DA TÉCNICA

4848

Preparação das Placas:

Espalhamento

Pré-Fabricadas

Manual

Espalhadores


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4949

Manual:

Solução do adsorvente é aplicadamanualmente sobre a placa de vidro,

com o auxílio de uma bagueta.Pode-se também fazer uma solução

do adsorvente em solvente volátil emergulhar a placa.

Este tipo de espalhamento gerasuperfícies não uniformes. 5050

Preparação das placasPreparação das placas

utilizandoutilizandoEspalhadorEspalhadorUtiliza-se quandohá necessidadede camadas bem

uniformes eespessuras

definidas doadsorvente

5151

PreparaçãoPreparaçãodas placasdas placasutilizandoutilizando

EspalhadorEspalhador

5252

Placas Pré-Fabricadas:

Existem no mercado PlacasPré-Fabricadas, dos

adsorventes mais comuns.

Apesar do custo maiselevado, elas dispensam apreparação e são bem maisuniformes e homogêneas, oque melhora a separação e

torna o Rf mais reprodutível.

5353

•Aplicação: Utilizada para separação de compostoshidrofílicos (açúcares, aminoácidos, íonsinorgânicos, ácidos nucléicos).

PREPARAÇÃO DA SUSPENSÃO DO ADSORVENTE

CeluloseCelulose

•Aplicação: Geralmente empregadas na separação decompostos lipofílicos. (Hidrocarbonetos, vitaminaslipossoluveis, corantes sintéticos)

Alumina ( AlAlumina ( Al22OO33))

Sílica ( SiOSílica ( SiO22))•Aplicação: Utilizada para separação de compostoslipofílicos (fenóis, aminoácidos, esteróides ). 5454

ATIVAÇÃO DAS PLACAS

A ativação consiste em aquecer as placasem temperaturas relativamente elevadas, portempo prolongado. Isto aumenta o seu poderde adsorsão.

Este processo promove a remoção de vapord’água e outros resíduos possivelmenteadsorvidos na placa.


10/17



5555

Adsorventes como sílica, alumina são ativadasa 105-110ºC por 30 a 60 minutos.

A celulose não deve ser aquecida por mais de10 minutos a 105ºC.


As placas podem ser conservadas, prontas parauso, em ambientes secos como dessecadores ou

caixas tipo estantes fechadas.

5656


5757

Após estarem asplacas todas

ativadas, costuma-seriscar as placas deformas a fazer com

que uma amostra, na

sua ascensão, nãointerfira na da outra

amostra.


5858

5959

ESCOLHA DA FASE MÓVEL

Um ensaio cromatográfico eficientesignifica uma separação total dos

componentes de uma amostra, numtempo relativamente curto.

Para isto acontecer, é necessárioempregar um solvente adequado acada sistema cromatográfico, isto é,amostra e adsorvente empregado 6060


Aplica-se a solução da amostra em pontosdiferentes separados por alguns centímetros.

Depois das manchas secas, aplica-se umsolvente diferente sobre o centro da mancha.

O líquido deverá migrar radialmente se oeluente for apropriado a separação será

eficiente.


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6161


6262


6363 6464


As amostras são aplicadasnas cromatoplacas na formade soluções, em solventes

bem voláteis.

Grandes quantidades deamostras geram manchas

muito grandes, o que não édesejado.

6565

Técnica de aplicação

••PontoPonto -análise qualitativa e quantitativa.

••FaixaFaixa - Análise quantitativa e preparativa.


• A distância entre as gotas não deve sermenor a 1,0 cm

6666

Forma incorretade aplicação

Forma correta deaplicação

A amostra deve ser aplicada com micropipeta,quando a quantidade da amostra é importante, oucom tubo capilar, quando não, de 1,5 cm a 2,0 cm,

da base da placa.



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6767


6868

DESENVOLVIMENTO DA CROMATOGRAFIA

Cromatografia ascendente é o métodomais utilizado e pode ser considerado a

técnica mais básica.

As cubas cromatográficas, em geral de vidrocom fundo plano, devem ter junto às paredesum pedaço de papel de filtro que permita a

subida da fase móvel, saturando rapidamenteo interior das mesmas.

6969


7070

As placas são colocadas numa cubacromatográfica quase na posição vertical,

apoiadas no fundo da cuba e inclinadas paraas paredes laterais.


Quando a fase móvel atinge umadeterminada posição nas placas (2/3), estasdevem ser retiradas e é importante marcar a

distância percorrida pela fase móvel,possibilitando o cálculo dos valores de Rf.

7171


7272

DESENVOLVIMENTO DA CROMATOGRAFIACuba saturada Cuba não saturadaCuba não saturada


13/17



7373

D E S E N V O L V I M E N T O D

A C R O M A T O

G R A F I A

7474


7575

D E S E N V

O L V I M E N T O D

A C R O M A T O G R A F I A

7676


7777

DESENVOLVIMENTODA CROMATOGRAFIA

7878



14/17



7979

Após a eluição, as cromatoplacas sãosecas e reveladas, tornando visível assubstâncias incolores existentes na

amostra. Os métodos podem ser:

FísicosQuímicosBiológicos

REVELAÇÃO DOS CROMATOGRAMAS

8080

FísicosMuitos compostos se tornam fluorescentes quando

excitados por luz UV, ou utiliza-se o adsorventecontendo uma substância fluorescente


8181

FísicosREVELAÇÃO DOS CROMATOGRAMAS

8282

Físicos

8383 8484

Químicos

Utiliza-se agentes cromogênicos(vanilina, tricloreto de Antimômio) que,

em contato com as substâncias daamostra, tornam-nas coloridas e,

portanto, visíveis.

O mais utilizado é o iodo, que torna asmanchas marrons.



15/17



8585

BiológicosUtiliza-se reações enzimáticas

ou bacterianas para tornara mancha visível.

Placa de sílica, eluída comPlaca de sílica, eluída comdiclorometano:metanol (97:3). Adiclorometano:metanol (97:3). Aplaca foi borrifada com soluçãoplaca foi borrifada com solução

esporos de fungosesporos de fungos e, ondee, ondeapareceram manchas brancasapareceram manchas brancas

porque houve inibição dos fungosporque houve inibição dos fungospelas substâncias contidas nospelas substâncias contidas nos

extratos de uma planta.extratos de uma planta.


8686

• Aplicadores de vidro

REVELAÇÃO PELO MÉTODO QUÍMICOREVELAÇÃO DOS CROMATOGRAMAS

8787


8888

REVELAÇÃO COM APLICADOR COMERCIAL

Revelando o cromatograma Modo de dirigir o jatoao longo da placa

cromatográfica

8989

O objetivo do desenvolvimento ésempre a melhor separação das

substâncias da amostra.A técnica básica mais utilizada é o

desenvolvimento ascendente(unidimensional).

Existem também desenvolvimentobidimensional.

FORMAS DE DESENVOLVIMENTO

9090

Os resultados obtidos após a revelação dascromatoplacas, podem ser documentados:

DOCUMENTAÇÃO DOS CROMATOGRAMAS

Desenhando as cromatoplacasDelineando as cromatoplacas sobre papel de seda

Fotografando as cromatoplacasXerocando as cromatoplacas


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9191

Comparações feitas do Rf obtidocom a amostra e o Rf de padrões é

considerado como o método qualitativo.

O método quantitativo serácitado posteriormente.

FatorFator de Retenção (R.f.)de Retenção (R.f.)

9292

d r 1

d m

d r 2

Linha de chegada da FM

Profundidade da FM

Ponto de partida da amostra

Ws1

Ws2

ANÁLISE QUALITATIVA

Leva em consideração a Cor e o Fator de Retenção :

onde dr é aonde dr é adistânciadistância

percorrida pelapercorrida pelaamostra e dmamostra e dmé a distânciaé a distânciapercorridapercorridapela fasepela fase

móvelmóvel

R.f.=dr/dmR.f.=dr/dm

9393

ResoluçãoResolução

Uma outra medida de separação de doisUma outra medida de separação de doiscomponentes consecutivos é a resolução;componentes consecutivos é a resolução;

Usada em cromatografia é calculada a partir daUsada em cromatografia é calculada a partir dadistância que separa as manchas dividido peladistância que separa as manchas dividido pelamédia das larguras de suas respectivas bases:média das larguras de suas respectivas bases:

RRss = 2(d= 2(dr1r1 –– ddr2r2) / (W) / (Ws1s1 + W+ Ws2s2))

9494

CÁLCULO DA RESOLUÇÃOCÁLCULO DA RESOLUÇÃO

RRss == 2(d2(dr1r1 –– ddr2r2))(W(Ws1s1 + W+ Ws2s2))

9595

•• Fator de Retenção (RFator de Retenção (Rff):):• Rf = dr / dm

•• Resolução (RResolução (Rss):):• Rs = 2(dr1 – dr2) / (Ws1 + Ws2)

PARÂMETROS UTILIZADOS NA CCD

9696

A CCD pode ser utilizada para quantificação.

Retira-se da cromatoplaca a área quecontenha a substância desejada que é extraída

e quantificada posteriormente.

Frequentemente, utiliza-se a densitometria, emedidas de fluorescência.

ANÁLISE QUANTITATIVA


17/17


Analise Instrumental -

9797

Densitometria ANÁLISE QUANTITATIVA

9898


9999


100100

8cm

10cm


Profundidade da FM


1cm

0,5cm

Exercícios

Calcule o Rf de cada substância e a Resolução

101101

12cm

15cm


Profundidade da FM


0,6cm

0,3cm

Exercícios

Calcule o Rf de cada substância e a Resolução

0,7cm

9cm

0,5cm

Documents

Fundamentos da Cromatografia