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CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE UMA GTP-BINDINGPROTEIN ESPECÍFICA DA MEMBRANA PLASMÁTICA DESOJACONTIN. L. A. S., PIROVANI. C. P.; e FONTES. E. P. B.(Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular - BIOAGROIUFV-Viçosa-MG - 36.571.000)

Previamente, usando como sonda anticorpos contra proteínas demembrana parcialmente purificadas, isolou-se de uma biblioteca deexpressão um cDNA que codifica uma proteína, S-64, específica dasemente de soja. O clone foi totalmente sequenciado. A estruturaprimária da proteína codificada possui 489 aminoácidos e peso molecularcalculado em 64.000. A proteína possui um peptídeo sinal no terminalamino, uma sequência consenso de glicosilação e um sítio de ligação àATP/GTP. O cDNA marcado com F-12-dUTPfoi usado como sonda e ostranscritos foram detectados exclusivamente na semente, exibindo umacúmulo crescente durante a fase de estocagem e decrescendo com adesidratação das sementes. Um fragmento do cDNA foi clonado no sítioBam HI do vetor de expressão em bactéria pEt-16b, sob o controle dopromotor da t7 RNA Polimerase. Uma versão truncada da proteína foiexpressa em bactéria mediante indução com IPTG. A proteínarecombinante foi purificada de extrato bacteriano e utilizada naimunização de coelhos para a produção de anticorpos policlonaisespecíficos. Frações celulares de cotilédones foram analisadas por meiode "imunobloting" e a proteína S-64 foi identificada na fraçãomembranosa. Em ensaios de irnunoprecipitação utilizando-se extratosprotéicos de células cultivadas em meio líquido e resina de GTP-agarose,foi verificado que S-64 possui habilidade de ligar à GTP. Afuncionalidade da sequência de glicosilação está sendo analisada pormeio de irnunoprecipitaçãocom concanavalina-A, uma vez que proteínasglicosiladas possuem habilidade em ligar à esta resina.

CNPQ - CAPES - FAPEMIG

MOLECULAR CLONING OF A NOVEL BIP GENE FROMSOYBEAN (Glycine max.): POSSffiLE REGULA TORYPROMOTER ELEMENTS

PEDRA 1H F. DELÚ-FlLHO. N. FRANCO D.M.C.O. ANDFONTES. E.P.B. Depto de Bioquímica e Biologia Molecular,BlOAGRO, UFV, 36571-000 - Viçosa - MG

The HSP70-related proteins constitute a family of ubiquitousproteins which share a remarkable conservation of primary structure.Members of the HSP70 class of stress proteins have been describedas molecular chaperones which are involved in normal cellmaintenance functions such as protein folding, assembly, disassemblyand degradation. We have previously isolated a soybean cDNA from

'- a lambda gt Ii expression Iybrary which encodes a class of stressproteins implicated as a key mediator of protein folding and assemblyin the ER. Isolation of the corresponding genomic clone wasconducted by screening a soybean EMBL3 genomic lybrary using theBiP cDNA as a probe. Fulllength genomic sequences were isolatedand three putative positive clones were further selected by Southemblot analysis. From the three positive clones two has been classifiedas diferent members of BiP genes, on the basis of size, restrictionpatem and partial sequencing. Analysis comparison of these clonesshows a high homology with isoforms B and C of the BiP genefamily frorn soybean. We are currentiy analyzing the sequences ofclones to identify possible regulatory promoter elements.

Supported by PADCT/CNPq, FAPEMIG,FINEP and CNPq

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Supported by: PAOCT/CNPq, FAPEMIG, FlNEP and CNPq.

ANALYSIS OF BiP GENE EXPRESSION FROM SOYBEAN(Glycine max) UNDER SELECTIVE STRESS CONDlTIONSSHOWS POS-TRANSLATIONAL MODIFICA TION FORDlFFERENT ISOFORMS

BUZELI. R. A A, CASCARDO, J C. M, CAROLINO, S. M. 8., ARAUJO, A F. &FONTES, E. P. B.DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR/BIOAGRO, UFV,36571-000 VlÇOSA-MG

The ER-residenl molecular chaperone, known as binding protein (BiP), is a HSP70-related protein which has been implicated in sorting and control of protein exit from lheER. BiP functions primarily to promote folding and assembly of newly synthesizedproteins as thev enter into lhe ER lumen. This activity involves transient binding becauseBiP is released when proper folding or assembly into oligomers is achieved. Permanent-binding of BiP reflects failure of lhe proteins to achieve a proper conformation, Iherebypreventing their exit from lhe ER. By sucessive chromatografy on DEAE-sepharose andATP-agarose we have .9urified a 78 Ki!)a ATP-binding protein from water solubleproteins of soybean seéds, which cross-reacted wilh a maize BiP antibody. We baveprepared antibody against lhe purified protein and a truncated version of BiP. Thecarboxy-terminus of lhe cDNA was expressed in E. coíi and lhe truncated protein wasaffinity-purified and used to prepare antibodies.. We bave a1so analysed lhe BiPinduction under stress conditions in soybean cell suspension cultures and plants ingreenhouse. Treatrnents of lhe cells with tunicamycin, salycilic acid and PEG promote aremarkable induction of BiP syntesis. To investigate lhe biological significance for lhedifference in gene copy number in higher plants we bave used immunoblottings of twodimensional gel electrophoresis to identify lhe soybean BiP isofonns. Protein extractsfrom dilTerent organs of soybean dernonstrate lhe presence of BiP isoforms, The syntesisof BiP isoforms on leaf are induced in response to water stress, a property of soybeanBiP. Treatrnent of lhe protein extracts from soybean organs with phosphatase a1calineand anaJysis used immunoblottings of Iwo dimensional gel electroforesis shows pos-translational modification for different binding protein isofonns. We are currentlyanaJysing lhe individual contribution of each mernber of lhe BiP family to lhe pattern ofBiP gene expressioo in separated stresses.

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TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE MILHO (Zea mayS L.)MEDIADA POR Agrobacterium tumefaciens. Maria JoséV. Vasconcelos. Mauricio S. Antunes. Douglas Barduche.Luciano V. Paiva. Edilson Paiva, Fernando H. Valicente.José Edson F. Figueiredo. Carlos Henrigue S. Carvalho;Mauricio A. Lopes. Núcleo de Biologia Aplicada,CNPMS/EMBRAPA, Sete Lagoas, MG, 35701-970.

Até recentemente, não era possível transformar plantasde milho (Zea mays L.) por meio da técnica deAgrobacterium, pois nenhuma cepa conhecida destabactéria de solo infectava eficientemente esta gramínea.Trabalhos utilizando a cepa LBA 4404 (pT0K233) deAgrobacterium tumefaciens (Japan Tobacco Inc.)demonstraram seu grande potencial para utilização emexperimentos de transformação genética de milho. Visandoavaliar o potencial de transformação de genótipos tropicaisde milho por esta cepa, embriões imaturos (15-16 diasapós a pollnizaçâo) de cinco linhagens tropicais foramassepticamente excisados do grão e inoculados em meiode cultura. Os embriões se desenvolveram durante onzedias e foram co-cultivados em meio líquido. com a cepaLBA 4404 (pT0K233). Ensaios histoquímicos efluorimétricos confirmaram a transferência do T-DNA paraos embriões. Calos transformantes desenvolveram-se emmeio de seleção contendo o antibiótico higromicina B comoagente de seleção, demonstrando a integração do DNAplasmidial ao genoma dos embriões.

Apoio financeiro: EMBRAPA, CNPq/RHAE', FINEP/PADCT.

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