GenÃ©tica FCM-UNL [Sebenta] Ana Carlota Dias

7/28/2019 Gentica FCM-UNL [Sebenta] Ana Carlota Dias

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SebentaGentica

-Actualizada-

2009-2010

Faculdade de Cincias Mdicas, Universidade Nova de Lisboa


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PrefcioEsta sebenta foi elaborada por Ana Carlota Dias, no 1

semestre do segundo ano do curso de Medicina da FCML noano lectivo 2009/2010 e surgiu da minha necessidade eminente

de ver a luz ao fundo do tnel nesta rea da gentica.

Assim, organizei-a de modo a cobrir todos os temas do

programa de gentica elaborado pelo professor Rueff para o

ano lectivo 2009/2010. Os poucos temas que no desenvolvi

foram os que achei totalmente chineses ou repetidos num ou

noutro ponto do programa.

Todo o texto desta sebenta foi literalmente copiado, quer da

sebenta de gentica nova que est neste momento em

circulao, quer dos slides das aulas tericas do professor e

ainda de livros e artigos, os quais esto presentes no ndice

bibliogrfico. Quero portanto salientar que nada do que aqui

est escrito da minha autoria.

Espero que vos seja til.


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Gentica-Programa FCM / UNL Pgina 2 de 12

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G1/G0 quiescncia.

Controlo da proliferao celular e cascatas de transduo de sinal.

Fase S e replicao semi-conservativa e semi-descontnua do DNA.

RNA iniciador e fragmentos de Okasaky.

Protenas estabilizadoras da cadeia simples, helicases e topoisomerases 1 e 2.

O problema do fim da replicao: telomerase.

Fase M.

Condensao de cromatina.

Fuso acromtico e protenas contrcteis do citoplasma.

Mitose.

Recombinao mittica e troca de cromtides irms (SCEs).

O ciclo biolgico e a reduo meitica da ploidia.

Meiose.

Quiasmatae crossing-over.

Converso e complementao gnica.

3. Genes e expresso do material gentico

Transcrio.

RNA polimerases I, II e III.

Locais de iniciao.

Elementos cise elementos trans.

Locais de ligao TATA, GC, CAAT e factores de transcrio.

Formao do cape poli-adenilao.

Intres e exes.

snRNAs, spliceossoma e splicingdos RNAs. Splicingalternativo.

Edio do RNA.

RNAs no codificantes (ncRNA):

microRNAs e o mecanismo de interferncia de RNA. Ligao aos 3UTR

Rede de regulao mediada pelos ncRNAs.


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Cdigo gentico.

Degenerescncia do cdigo gentico.

A quase universalidade do cdigo gentico.

Cdigo gentico mitocondrial.

Traduo.

Estrutura dos ribossomas, RNAs e protenas ribossomais

Activao dos aminocidos.

Amino-acil-tRNA sintetases.

Iniciao.

Elongao.

Peptidil-transferase e translocao.

Terminao.

Pptido sinal e topognese.

Regies no traduzidas 5UTR e 3UTR.

4. Regulao da expresso gentica.

Nveis de regulao da expresso gentica:

Regulao transcripcional

Regulao no processamento de mRNA e modificaes ps-transcripcionais.

Factores de transcrio, promotores, enhancerse silencers.

Regulao ps-transcrio.

Regulao e organizao da cromatina.

5. Gentica de Populaes

A uniformidade e a disjuno mendelianas dos caracteres.

Dominncia e recessividade.

Conceito de locuse de alelo.

Heterogeneidade gentica e allica.


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A segregao mendeliana dos caracteres

Recombinao por crossing-overe o fenmeno de linkage.

Transmisso matrilinear do DNA mitocondrial.

Gentica formal.

Frequncia gnica, frequncia genotpica.

Equilbrio de Hardy-Weinberg.

Bialelia e poli-alelia.

Polimorfismos.

Isolados genticos.

Panmixia e endogamia.

Efeito fundador.

Conceito de bottleneck. Expanso e migrao.

Migraes populacionais de alelos.

Desequilbrio de linkagee sua variao a nvel populacional.

HapMap e blocos haplotpicos

Deriva gentica.

Fitnesse distribuio geogrfica.

Incidncia e prevalncia de doenas genticas e fitness.

3. DIVERSIDADE E PATOLOGIA (6 horas).

1. Mecanismos e consequncias de mutao

Mecanismos de mutao e classificao de mutaes.

Classificao das mutaes:

Mutaes pontuais, deleces, inseres, duplicaes, expanso de

tripletos. Conceito de pr-mutao (expanses instveis de tripletos).

Mecanismos de mutao.

Tautomeria de bases.

Erros de proof readinge emparelhamentos errados.

Deslizamento da DNA polimerase em regies repetitivas.


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Desaminao espontnea da 5-metil citosina e hipermutabilidade das regies

CpG.

Mutaes induzidas por mutagneos fsicos e qumicos.

Radiao ionizante e UV.

Agentes qumicos intercalantes e anlogos de bases.

Agentes qumicos alquilantes e arilantes. Aductos de DNA.

Metabolizao de pr-mutagneos (Metabolismo de fase 1 e de fase 2).

A super famlia gnica dos citocromos P450 (genes CYP).

Inducibilidade e susceptibilidade a cancro.

Significado e consequncias de mutaes.

Em regies extra-gnicas: annimas (SNPs, VNTR e STR).

Em regies codificantes.

Silenciosas, missense, nonsense, frameshift, de splicing.

Em regies reguladoras.

Consequncias patolgicas em cada tipo de mutao.

Tipos de mutao mais frequentes em patologia humana.

Impacto em patologia gentica da taxa de neo-mutao humana.

2. Mecanismos protectores da fidelidade informativa.

Sistemas enzimticos de reparao do DNA.

Reparao pr-replicativa pelas DNA-polimerases.

Reparao ps-replicativa por recombinao.

Reparao por exciso

Glicosilases e endonucleases de locais apurnicos.

NER, BER, MMR. NHEJ

Sndromes de dfice de reparao e fragilidade cromossmica.

Anemia de Fanconi.

Ataxia-telangiectasia.

Sndrome de Lynch e dfice de reparao de emparelhamentos errneos MMR


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Xeroderma pigmentosum.

Sndrome de Cockayne.

Trico-tiodistrofia.

Sndrome de Bloom e o dfice de DNA-ligase.

4. DA DIVERSIDADE PATOLOGIA - EXPRESSO CLNICA E MECANISMOS DE

DOENA GENTICA (8 horas).

1. Patologia gentica monognica.

Fibrose qustica.

O gene CFTR, transporte trans-membranar de cloreto e a clnica da fibrose

qustica.

A mutao F508 e as outras mutaes do gene CFTR. Heterozigotos

compostos.

A migrao e expanso europeia de alelos mutantes de CFTR.

Classificao das mutaes no gene CFTR. Do laboratrio clnica.

Glucosuria renal. Mutao no gene SLC5A2. Mutaes privativas

Sndrome de Antley-Bixler. Mutao no gene POR.

Hemoglobinopatias.

Hemoglobina Lepore e crossing-overdesigual.

Talassmias-deleco, represso da transcrio ou traduo e anomalias de

splicing.

Drepanocitose e haplotipos de restrio.

Origem e distribuio das mutaes nas hemoglobinopatias e gentica de

populaes.

Quadro clnico das hemoglobinopatias.

2. Patologia gentica monognica autossmica dominante.

Anlise de mecanismos de expresso clnica autossmica dominante.

Alteraes nos colagneos.

Osteognese imperfeita e sndrome de Elhers-Danlos dominante.


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A mutao da transtirretina e polineuropatia amiloidtica familiar (PAF).

O sndrome de Marfan e a fibrilhina.

Coreia de Huntington.

Neurofibromatose de von Recklinghausen.

A cardio-miopatia hipertrfica familiar e heterogeneidade de locuse allica.

Doena poliqustica renal.

3. Genopatias metablicas.

Doenas lisossomais - mucopolissacaridoses e esfingolipidoses.

A doena de Tay-Sachs e a endogamia.

Sndromes de Hurler, Hunter e I cell disease - anlise dos mecanismos

etiopatognicos.

Terapia gnica nas doenas de Fabry, de Gaucher e no sndrome de Hurler.

As vias metablicas da fenilalanina e tirosina - fenilcetonria, alcaptonria e

albinismo.

Deficincia de alfa-1-antitripsina.

As hiper-lipoproteinmias familiares - anlise dos dfices de receptores de LDL.

Doenas peroxissomais:

Sndrome de Zellweger.

Adrenoleucodistrofia.

Doena de Refsum - da mutao pontual ao dfice de sinais de topognese.

4. Mosaicismo da expresso ligada ao cromossoma X.

Mecanismos de inactivao do cromossoma X.

Hemoflia e sndrome de Lesh-Nyan.

A distrofina e a distrofia muscular de Duchenne.

Deficincia em glucose-6-fosfato desidrogenase.

5. Hereditariedade no convencional.

Dissomias uniparentais.


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Imprintinggenmico: sndromes de Prader-Willi e de Angelman.

Expanso de tripletos como mecanismo de doena e sndromes de expanso de

tripletos.

X-frgil.

Coreia de Huntington e outras doenas de poliglutamina.

Ataxia de Friedreich

Distrofia miotnica.

Doena de Machado-Joseph.

6. Patologia citogentica.

Citogentica clnica.

Polimorfismos e abortamentos de repetio.

Metodologias de bandeamento.

Aneuploidias de expresso fenotpica patolgica - as trissomias 13, 18 e 21.

Deleces e microdeleces.

Sndrome do grito do gato e variabilidade das extenses de deleco de 5p.

Sndrome de DiGeorge.

Microdeleco do cromossoma Y e infertilidade.

Deleces em 1p e 19q em oligodendrogliomas, significado prognstico e

teraputico.

Sndromes de genes contguos (DiGeorge, Smith-Magenis, Williams).

Translocaes equilibradas, transmisso e clculo de risco.

Inverses pericntricas e paracntricas.

Cromossomas em anel e isocromossomas.

Outras anomalias estruturais (dicntricos, fragmentos acntricos, entre outros).

Mosaicismo citogentico.

Fragilidade cromossmica e mapa de locais frgeis.

Da clnica citogentica e anlise molecular do sndrome do X frgil.


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7. Patologia multifactorial.

Situaes multifactoriais.

Identificao de genes de susceptibilidade em doenas multifactoriais.

Estudos de associao de caso-controlo e estudos familiares.

Marcadores annimos e desequilbrio de linkage.

5. A GENTICA DO CANCRO (3 horas).

1. Mutao somtica e cancro.

Oncogenes e genes supressores de tumores.

O carcter multifsico e multifactorial da cancerignese. Hipteses gentica e

epigentica.

Oncogene addiction. Passenger and Driver mutations.

Leucemia mielide crnica e tirosina-quinases. Receptores de transporte e

resistncia teraputica.

2. Sndromes de cancro familiar.

Mutaes nos genes BRCA1 e BRCA2no cancro da mama familiar.

Mutao no gene RBe retinoblastoma hereditrio por perda de heterozigotia (LOH).

A polipose adenomatosa familiar (FAP) e o sndrome de Lynch (HNPCC).

P53 e sndrome de Li-Fraumeni.

Haploinsuficincia e dominncia negativa (p53).

MEN1 e MEN2(multiple endocrine neoplasia type 1 and type 2).

Alteraes cromossmicas e cancro

Deleco no cromossoma 11 e tumor de Wilms.

Deleco no cromossoma 13 e retinoblastoma.

Citogentica de clulas neoplsicas.

A actividade enzimtica da telomerase e o estudo de neoplasias.


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6. A GENTICA MOLECULAR HUMANA - REAS DE INTERVENO (6 horas).

1. Testes genticos predictivos.

Diagnstico pr-implantatrio.

Diagnstico pr-natal.

Diagnstico pr-sintomtico.

Aconselhamento gentico, avaliao de risco e preveno da recorrncia.

2. Rastreios e diagnstico precoce (fenilcetonuria e hipotiridismo).

3. A Medicina Molecular.

A farmacogenmica e a oncogenmica.

A identificao de novos alvos teraputicos.

A engenharia de tecidos e a regenerao celular.

Lisboa, 28 de Setembro de 2009

O regente,

Jos Rueff(Prof. Catedrtico)


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GENTICA

Ano lectivo 2009 - 2010

Livros sugeridos

Principais livros de estudo:

Vogel and Motulsky's Human Genetics. Problems and Approaches

Speicher, Michael; Antonarakis, Stylianos E.; Motulsky, Arno G. (Eds.)

Springer Verlag, 4th ed., 2010.

Strachan T. and Read A.P. Human Molecular Genetics,

3rd edition. Garland Science, Taylor & Francis Group, 2004.

Livros de estudo adicionais:

Gardner, R.J.M. e Sutherland, G.R. Chromosome Abnormalities and Genetic

Counselling, 3rd edition. Oxford University Press, 2003.

Nussbaum R.L., McInnes R.R. e Willard H.F. Thompson & Thompson Genetics in

Medicine, 7th edition.Saunders, 2007.

Korf, B.R. Human Genetics and Genomics, 3rd edition. Blackwell, 2007.

Jorde L.B., Carey J.C., Bamshad M.J. e White R.L. Medical Genetics 3rd

edition.Mosby, 2005.

Lewis R. Human Genetics: Concepts and Applications. 8th edition. McGraw-Hill

Higher Education. 2008.

Turnpenny, P. e Ellard S. Emery's Elements of Medical Genetics. 13th edition.

Churchill Livingstone, 2007.

Passarge E. Color Atlas of Genetics. 3rd edition. Thieme Medical Publishers, 2007.


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Regateiro F.J. Manual de Gentica Mdica. Imprensa da Universidade, Coimbra, 2003.

Livros para consulta:

Emery, A. and Rimoin, D. Principles and Practice of Medical Genetics" - 3 vols. 5th

edition. Churchill Livingstone, 2007. (principalmente o 1 volume)Trent R. Molecular Medicine" 3rd edition. Academic Press, 2005.

Encyclopedia of the Human Genome 5 vols. John Wiley & Sons, Ltd. 2003.

The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. 3 vols. Edited by Scriver,

C. R., Beaudet, A. L., Sly, W. S., Valle, D., Childs, B., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B.,

eds., 8th ed., McGraw-Hill, New-York, 2001

Watson, J.D. A Passion for DNA; Genes, Genomes, and Society. Cold Spring Harbor

Laboratory Press, 2000.


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INTRODUO1. A Gentica como rea multidisciplinar e em rpida evoluo_____ Anlise histrica da evoluo da Gentica. De Miesher a Watson e Crick; deMendel a MorganSc. XIX- Leis de Mendel

- Descoberta do DNA: Friedrich Miescher

Sc. XX Sculo do gene- Re-descoberta das leis de Mendel

- Baptismo da Gentica (Bateson, 1906)- Erros inatos de metabolismo (Garrod, 1909)*

- DNA transformante (Avery, McLeod, 1994)

- Complementaridade de bases (Erwin Chargaff)

- Estrutura do DNA (Watson e Crick)

- Citogentica e citogentica mdica (tjio e Levan; Lejeune)

- Lysenko (1887-1943) contraria as leis de Mendel.

- Thomas Hunt Morgan (1933)- prmio nobel por provar que os cromossomas so portadores

de genes

- Avery e MacLeod (1944) descobriram que o DNA determina as caractersticas genticas.

- Chargaff e Francis Crick complementaridade de bases de DNA.

- Wayson e Crick (e tambm, Rosalind Franklin) estrutura do DNA em dupla hlice.

Sc. XXI- Sculo do genoma- Mapeamento gnico

- Sequenciao de DNA

- Programa do Genoma Humano- Genmica, trascriptmicas, protemica, metabolmica, interactmica.

Prmio Nobel 2009 Telmeros (ver pg. #)

2. Gentica descritivia e mecanicista____________________________A gentica descritiva a gentica da observao dos fenmenos. Regista e descreve ascaractersticas fenotpicas de indivduos e populaes. morfolgica e responde questo

como determinado indivduo em relao a uma dada caracterstica. Utiliza a elaboraode rvores genealgicas. A gentica mecanicista com base no genoma, explica as alteraes


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genotpicas. fisiolgica e responde questo como funciona. Tem primeiro conhecimento

do gene e s depois da sua expresso e efeito. A gentica mecanicista corresponde

gentica experimental, que recorre criao de modelos e ao uso de animais transgnicos,

nos quais, atravs da fertilizao in vitro, se introduz DNA alterado (humano ou de outra

espcie), obtendo-se, desta forma, um exemplar vivo de determinada alterao, que pode ser

manipulado.

Incidncia, prevalncia e impacto em sade pblica da patologia gentica

Taxonomia das doenas genticas e mecanismos de transmisso:- Monognicas- doenas que resultam de mutaes em apenas um gene- Polignicas- doenas que resultam da aco combinada de alelos de mais de um gene.- Multifactoriais- doenas em que uma parte pertence aos genes que conferem determinadasusceptibilidade (predisposio) gentica mas apresentam, igualmente, uma parte ambiental,

sem a qual a doena no se expressa.

- Cromossmicas- doenas causadas pela alterao da estrutura/nmero dos cromossomas.3. Algumas definies_____________________________________________Penetrncia- trata-se de um fenmeno de tudo-ou-nada e aplica-se probabiliade de umgene se expressar ou no, isto , de ter ou no expresso fenotpica. Quando a frequncia

de um fentipo inferior a 100%, ou seja, quando alguns indivduos que tm o gentipo no

o expressam, diz-se que o gene exibe uma penetrncia incompleta. Em termos estatsticos,

a percentagem dos indivduos com um determinado gentipo que so, de facto, afectados.


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Expressividade de um gene- corresponde ao modo de expresso do alelo, que pode seruniforme (ocorre quando um alelo expressa sempre um nico tipo de fentipo, de fcil

reconhecimento) ou varivel (quando a expresso do alelo resulta no aparecimento de vrios

padres de fentipos ou vrios graus de expresso).

Dominncia completa- neste caso um alelo capaz de suprimir a manifestao do outroquando em heterozigotia prevalecendo no fentipo.Dominncia incompleta situaes em que o fentipo dos indivduos heterozigsticos intermedirio, em termos quantitativos, entre os fentipos dos dois homozigticos. Ocorre em

indivduos heterozigticos que apresentam fentipos intermdios entre os seus progenitores

de linhagens puras, isto acontece porque uma nica copia do gene funcional no ser

suficiente para assegurar o fentipo, em outras palavras a expresso gnica de um nico

gene no suficiente para produzir uma quantidade mnima de enzima, por exemplo.

Codominncia- ocorre quando ambos os alelos de um gene se expressam integralmente nofentipo do heterozigoto.Ex: grupos sanguineos AB0Hemizigotia- presena de um nico alelo no genoma, condio que se verifica, normalmente,para a grande maioria dos loci do cromossoma X, nos indivduos do sexo masculino.

Corresponde tambm a condies anormais (ex. numa deleco), em que em vez de um

gentipo diplide, se encontra uma nica cpia de um alelo.

Pleiotropia- no pleitropismo, a mutao de um nico gene tem reflexos na expresso devrios fentipos, pelo facto de uma nica protena actuar em diversos orgos do corpo

humano. Um exemplo do efeito pleiotrpico observa-se na neurofibromatose tipo I (ver pgina

140). O reconhecimento do pleiotropismo pode permitir que, a partir de uma manifestao,

ainda que minor, pertencente ao espectro de efeitos conhecidos de uma mutao, seja

possvel a identificao de um portador dessa mutao ou se suspeite de anomalias internas

graves que exijam interveno mdica.Alelos letais-alelos cuja manifestao fenotpica corresponde morte do indivduo, seja nafase pr-natal ou ps-natal. Os alelos letais dominantes surgem de mutaes de um alelo

Fig.1: dominancia incompleta


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normal. Os alelos letais recessivos s resultam na morte do indivduo quando em

homozigotia.

Sries multiallicas= alelos mltiplos. Mais do que dois alelos por gene.

4. Histria clnica em gentica e a arvore genealgica_____________

Fig. 2: Smbolos utilizados na rvore genealgica

ANATOMIA E FISIOLOGIA DO MATERIAL GENTICO1. Estrutura do polinucletido e nucleoproteica___________________ DNA e RNADNA: Os cromossomas presentes no ncleo de cada clula, tm como constituinte principal,uma complexa molcula de peso molecular muito elevado, o cido desoxirribonucleico DNA. Este constitui o suporte material dos caracteres hereditrios. Na estrutura da molcula

esto efectivamente inscritas, segundo um cdigo particular, todas as informaes que

definem um ser vivo. O DNA encontra-se essencialmente no ncleo e nas mitocndrias.

uma macromolcula polimrica linear, formada pela polimerizao de unidades elementares

os nucletidos. Cada nucletido formado atravs da ligao covalente de trs molculas:

uma pentose, a 2- desoxirribose; uma base orgnica contendo azoto um grupo fosfato (cido fosfrico - H2PO3)

As bases azotadas so de dois tipos: purinas e pirimidinas. As purinas so compostas por

uma estrutura em anel duplo - adenina (A) e guanina (G). As pirimidinas- citosina (C) e timina

(T) so constitudas apenas por um anel.

DNA monocatenrio: os nucletidos so polimerizados em longas cadeias polinucleotdicaslineares atravs de ligaes fosfodister 5- 3. Estas ligaes efectuam-se entre o grupo

fosfato do carbono-5 da pentose de um dos nucletidos e o grupo hidroxilo livre do carbono

3 da pentose do nucletido que o precede na cadeia polinucleotdica formando a estrutura

primria do DNA DNA monocatenrio.


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DNA bicatenrio: embora certas formas de DNA celular possam existir sob a forma deestruturas de cadeia simples, a estrutura de DNA mais generalizada a dupla hlice do

modelo introduzido por Watson & Crick segundo o qual, o DNA constitudo pela reunio

(por pontes de hidrognio) de duas longas cadeias polinucleotdicas (anti-paralelas), cujaestrutura helicoidal se assemelha a uma escada em espiral orientada para a direita. Esta

estrutura secundria do DNA, sob a forma de dupla hlice, designada por DNA bicatenrio.

Topologicamente, o DNA pode existir na forma relaxada (relaxed DNA) ou na forma

superenrolada (supercoiledDNA). O DNA pode assumir vrias conformaes e pode haver

interconverso de formas:

A enrolado para a direita (+ longo e curto que B) B - enrolado para a direita (forma predominante. Modelo de Watson & Crick) Z enrolado para a esquerda (+ delgada e alongada que A e B); rico em G e C, que

podem formar zonas de regulao associadas a zonas de silenciamento. As bases

azotadas esto voltadas para o exterior. So pouco frequentes.

DNA Mitocondrial: ver pgina 35.RNA: o RNA cido ribonucleico um polmero linear de nucletidos de purina e pirimidina,unidos por ligaes fosfodister 5'-3 com uma estrutura semelhante do DNA

monocatenrio, sendo a principal diferena entre eles a pentose constituinte dos nucletidos,

que no DNA a 2-desoxirribose e no RNA a ribose. Os ribonucletidos presentes so de

adenina (A), citosina (C) e guanina (G), tal como no DNA, no entanto, no RNA, a timina

substituda pelo Uracilo (U). Tendo em conta que a molcula de RNA complementar apenas

de uma das cadeias de DNA, a soma das bases pricas no necessariamente igual soma

das bases pirimdicas. Qualquer que seja o tipo ou funo que desempenham, os RNA so

sempre sintetizados por cpia de fragmentos especficos bem delimitados do DNA que

constitui o genoma de cada espcie, obedecendo a sua sntese ao princpio da

complementaridade de bases, atravs de um processo de transcrio. Neste processo, a

sequncia de bases de uma das cadeias de DNA (template strand) enzimaticamente

copiada sob a forma de uma cadeia simples, pelo que esta resulta semelhante outra cadeia

de DNA (coding strand).

RNA mensageiro (mRNA): o mRNA transporta a informao necessria sntese dasprotenas, do ncleo ao local de sntese, isto , aos ribossomas (livres no citoplasma, nas

mitocndrias, associados ao retculo endoplasmtico). O mRNA sintetizado no ncleo

(podendo tambm ser sintetizado nas mitocndrias a partir do DNA mitocondrial), durante o


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processo de transcrio. O mRNA eucaritico sempre monocistrnico, ou seja, contm

informao para uma nica cadeia polipeptdica. Depois de ser transcrito e de sofrer o

processo de maturao, o mRNA passa aos ribossomas onde actua como molde indicador da

sequncia de aminocidos de uma cadeia polipeptdica a sintetizar. Tripletos de nucletidos,

ao longo da cadeia de mRNA, os codes, determinam, no processo de traduo, de um modo

especfico, a sequncia de aminocidos do polipptido. Portanto, a cada 3 bases do mRNA

corresponde um aminocido da protena. A esta correspondncia foi atribudo a designao

de cdigo gentico.

RNA ribossmico (rRNA): o rRNA constitui a maior parte do RNA celular, formando at 80%do RNA total da clula. Nele est contido a informao para a formao das duas

subunidades dos ribossomas. Os ribossomas so organelos citoplasmticos resultantes da

associao do rRNA com protenas (complexos ribonucleiproteicos) e cuja funo principal

a sntese proteica a partir do mRNA.

RNA transferncia (tRNA):O tRNA pode constituir at 15% do RNA total da clula. As suasmolculas, relativamente pequenas, funcionam como transportadores de aminocidos e

interagem especificamente com o rRNA e mRNA no processo de traduo. A sua funo ,

primeiramente, activar os aminocidos de forma a que o estabelecimento da ligao peptdica

seja energeticamente favorvel. Seguidamente, o aminocido transferido para o

polirribossoma, onde incorporado no polipptido que est a ser sintetizado. A segunda

funo do tRNA o reconhecimento dos codes de mRNA, atravs do seu prprio anticodo,

que complementar ao codo do mRNA correspondente ao aminocido que transporta, por

forma a que este ltimo seja incorporado correctamente. H, portanto, pelo menos uma

molcula de tRNA para cada aminocido, podendo contudo, haver mais (tRNAs especficos

para o mesmo aminocido designam-se de isoaceitadores). A molcula de tRNA consiste

numa cadeia polinucleotdica formada por 65 a 110 mononucletidos e caracteriza-se por

conter, alm das bases comuns, uma proporo relativamente elevada (que pode atingir 10%

do total) de bases azotadas modificadas (bases que sofreram metilao ou dimetilao) e

ainda timina, constituinte normal do DNA, mas que no aparece em nenhuma outra espcie

de RNA. A metilao tambm diminui o carcter hidrofbico de algumas regies de tRNA, o

que pode ser relevante na interaco com sintetases e protenas ribossomais. O tRNA

apresenta a extremidade 5' fosforilada. A extremidade 3' constituda por uma sequncia de

bases caracterstica-CCA ( ao grupo 3'-OH do resduo de adenina que se liga um

aminocido especfico atravs de uma ligao ster com o grupo carboxilo). Embora cada

tRNA difira dos outros na sua estrutura primria, a estrutura secundria e terciria de todoseles muito semelhante, possuindo uma conformao caracterstica em "folha de trevo"


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quando observada bidimensionalmente, devido existncia de uma extensa

complementaridade dentro da cadeia polinucleotdica. Deste modo, coexistem regies onde

as bases emparelham de forma idntica ao que se passa na cadeia dupla do DNA - regies

complementares denominadas braos (stems) e zonas onde as bases no so

complementares, constituindo ansas (loops). Cada tRNA possui na sua molcula dois stios

dotados de especificidade, que so a extremidade 3'-OH, que se liga ao aminocido e um

tripleto anticodo que se localiza no brao que ocupa a posio diametralmente oposta e

que ir reconhecer o codo correspondente no mRNA, por complementaridade de bases.

Para alm do brao aceitador (transportador de a.a.) e do brao anticodo, distingue-se,

ainda, um brao D (caracterizado pela presena da base dihidro-uridina) e um brao TC

(que possui a sequncia T, pseudouridina, C). Os tRNA so transcritos sob a forma de

grandes molculas precursoras, frequentemente contendo a sequncia para a sntese demais do que um tRNA, sendo seguidamente sujeitos a um processamento nucleoltico

catalisado por uma classe especfica de ribonucleases, aps o que adquirem dimenses mais

reduzidas. Para alm disto, as molculas de tRNA precursoras contm um intro contendo 10

a 40 nucletidos prximo da regio correspondente ao brao anticodo, pelo que o

processamento inclui tambm a clivagem dos intres e o splicing adequado da regio do

anticodo, de forma a originar uma molcula funcional. O sistema enzimtico responsvel

pelo processamento nucleoltico tem aparentemente a capacidade de reconhecer no

somente a estrutura primria do tRNA mas tambm a sua conformao espacial, pelo que sas molculas que possuam uma estrutura funcionalmente competente sero processadas. A

modificao posterior das molculas de tRNA inclui a alquilao de certos resduos

nucleotdicos, bem como a incorporao do tripleto de CCA caracterstico da extremidade 3.

Esta ltima modificao realizada j no citoplasma e ocorre regularmente, visto que a

degradao das extremidades moleculares ocorre no citoplasma a uma muito maior

velocidade do que a da prpria molcula.


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subunidades, agrupando-se num octmero e formando o chamado core proteico do

nucleossoma ou complexo histnico. Em volta deste enrola-se a dupla hlice de DNA,

descrevendo uma volta e . Apresentam uma extremidade bsica que permite a ligao

ao DNA e uma extremidade hidrofbica que permite a associao entre elas.

Fig. 3: nucleossoma e distribuio das histonas

Protenas cidas ou no histnicas (NHP)As protenas no histnicas constituem uma famlia muito heterognia com elevada

especificidade tecidular, que podem ser agrupadas em dois grupos distintos:

Protenas constitutivas a actina, essencial para o mecanismo de formao do fusoacromtico na metafase; molculas proteicas reguladoras, sensveis aco de

hormonas; protenas constituintes da arquitectura do prprio ncleo.

Enzimas todas as enzimas necessrias aos processos de replicao, transcrio,reparao e maturao do mRNA.

Protenas HMG (high motility group proteins): Grupo de protenas no histnicas cujo nomederiva do facto de estas migrarem mais rapidamente em electroforese em gel uma vez que

so muito pequenas e apresentam uma elevada densidade de cargas. Estas protenas so

uns dos elementos que promovem a transio da cromatina da forma compacta para a forma

descondensada, transcricionalmente activa, pois interagem preferencialmente com a

cromatina na forma de fibra de 10nm.

Do nucletido ao cromossomaNveis de organizao estrutural do DNA: a interaco das histonas com o DNA resulta, comoj falmos, numa estrutura denominada nucleossoma. Os nucleossomas encontram-seligados entre si por DNA linker. Cada nucleossoma uma estrutura discide, constituda por

um ncleo central histnico (um octmero formado por duas histonas de cada um dos tipos


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H3, H4, H2A e H2B) com cerca de 10 nm de dimetro, em torno do qual o DNA se dispe em

super-hlice, em duas voltas orientadas para a esquerda, estabilizadas pela histona H1. A

organizao do DNA em polinucleossomas parece ser mediada por uma protena no

histnica polianinica, a nucleoplasmina. Esta protena no tem a capacidade de se ligar ao

DNA nem cromatina, mas estabelece uma interaco reversvel com as histonas, de modo

que a interaco destas com o DNA se torna muito mais especfica, sendo libertada da

estrutura logo aps a formao do nucleossoma. Embora os nucleossomas se encontrem

periodicamente posicionados ao longo da estrutura polinucleossomal, a sua distribuio no

aleatria com respeito sequncia de bases com que interagem. Com efeito, os

nucleossomas parecem exibir preferncia para certas sequncias de DNA, fenmeno que

designado de phasing. Este parece estar relacionado com a flexibilidade relativa dos vrios

tipos de sequncia e com a consequente maior ou menor facilidade de acomodao do DNAem torno das histonas. Como as sequncias ricas em A-T so mais fceis de comprimir do

que as ricas em C-G, cada octmero de histonas tende a posicionar-se de modo a maximizar

a interaco com sequncias ricas em A-T. Uma outra caracterstica dos nucleossomas a

sua mobilidade. A maioria dos nucleossomas tem a capacidade de se posicionar mais a

montante ou mais a jusante numa distncia de 10 bp, o que facilita o acesso das DNA

polimerases e outras enzimas a essas sequncias.Nos nucleossomas, o DNA condensado para cerca de 1/10 do seu comprimento aparente,

dando origem chamada fibra de 10nm, correspondente ao dimetro do nucleossoma. Nestenvel, o DNA e as histonas constituem o nucleofilamento.Estes nucleofilamentos vo ainda ser compactados em estruturas helicoidais de cromatina,

designadas de solenides (ver figura 4), que ao microscpio electrnico aparecem comofibras grossas de 34 nm de dimetro, obtendo-se um encurtamento de 50%. Esta fibra,

designada por fibra de 30 nm, parece ser a unidade fundamental da cromatina. Cada volta do

solenide contm cerca de 6 nucleossomas.

Fig. 4: Estrutura do Solenide


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A histona H1 parece desempenhar um papel importante na compactao da fibra de 30 nm,

na medida em que tm a capacidade de se ligar cooperativamente entre si, aproximando os

nucleossomas uns dos outros. As fibras de 30 nm formam-se selectivamente em regies

especficas do DNA, caracterizadas pela ausncia de ligao a NHP especficas de

determinadas sequncias. Pensa-se que a presena destas protenas est relacionada com o

estado transcripcional das regies envolvidas. Os niveis de organizao desde a estrutura em

solenide ao cromossoma em metafase ainda no esto totalmente compreendidos

considerando-se porm a existncia um estado de maior compactao, que corresponde ao

super-solenide, cujas fibras apresentam um dimetro de 200 nm.Eucromatina: ou cromatina activa, encontra-se descondensada e corresponde s regies dogenoma transcricionalmente activas. Contm normalmente uma maior densidade de regiescodificantes e a primeira a ser a replicada na fase S.

Heterocromatina: ou cromatina inactiva constitui cerca de 80% do DNA nuclear e apresenta-se condensada, sendo bem visvel no ncleo em interfase, onde se evidencia como regies

densas e fortemente coradas, os crommeros.

- Heterocromatina facultativa: corresponde eucromatina, em condio inactiva para

a transcrio (ex. cromossoma X sujeito lionizao)

- Heterocromatina constitutiva: encontra-se junto dos centrmeros de todos oscromossomas, no brao longo do cromossoma Y e nos satlites dos cromossomas

acrocntricos. Corresponde ao DNA satlite.

Territrios cromossmicos no ncleo:- Os cromossomas ocupam no ncleo territrios no aleatrios.

- Os territrios cromossmicos no so entidades slidas, mas so permeadas por canais.

- Alteraes relativas de regies genmicas podem ser funcionalmente relevantes para

activao, represso e para translocaes.

- Pode determinar translocaes recprocas preferenciais entre cromossomas.

Genoma: % de DNA codante total do genoma 1,5% % de DNA codante/gene 5% Possui alguns genes ortlogos (1,5%) Possui graus de repetio muito grandes.


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Fig.5: % relativa de genes por funo- Genes ortlogos genes de espcies diferentes que evoluram de um gene ancestral

comum por especiao. Os ortlogos retm habitualmente a mesma funo ao longo da

evoluo. A identificao de ortlogos critica na predio da funo genica em genomas

sequenciados.

- Gene parlogos genes relacionados, originados por duplicao dentro de um genoma. Os

ortlogos mantm a mesma funo ao longo da evoluo, enquanto os parlogos

desenvolvem novas funes (neofuncionalizao) ainda que relacionados ou prximos da

funo original ou parte das funes do gene original (subfuncionalizao). Levam a doenas

gnicas pois uma duplicao divergente pode alterar a estrutura que tinha inicialmente.

2. Material gentico, ciclo celular e ciclo biolgico_________________ Fases G1, S, G2 e M do ciclo celular

Fig. 6: Fases do ciclo celular


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Noo de ponto de restrioPonto de restrio: momento do ciclo celular em que as clulas ficam comprometidas paraentrar na Fase S. O ponto de restrio um checkpoint do ciclo celular fase G1 (R1). Clulasque passam este ponto de restrio entram na fase S do ciclo celular. Os checkpoints do

ciclo celular so mecanismos de controlo que asseguram uma fidelidade da diviso celular

nas clulas eucariotas. Cada checkpoint verifica se os processos de cada fase do ciclo

celular foram completos de forma adequada antes de entrar na fase seguinte. O ponto de

restrio da fase G1 o primeiro checkpoint pelo qual as clulas passam no ciclo celular e

determina a passagem da clula para a fase S iniciando depois a diviso celular, o atraso na

entrada da fase S ou mesmo a passagem para um estado de interfase por tempo indefenido-

G0. Este ponto de restrio controlado essencialmente pela aco do CKI- p16 (p16 inibidor

da CDK). Esta protena inibe a CDK4/6 garantindo que esta no interage com a ciclina D1que promove a progresso do cilco celular. A ciclina D induzida por factores oncognicos ou

factores de crescimento aumenta a sua expresso formando com CDK4/6 um complexo que

fosforila o retinoblastoma supressor de tumor que estimula o factor de transcrio E2F. Este

factor de transcrio aumenta a expresso da ciclina E que interage com CDK2 e promove a

passagem da fase G1 para a fase S.

G1/G0 quiescnciaQuando as clulas permanecem um longo tempo em G1, sem avanarem para a fase

subsequente do ciclo, designam-se por clulas em G0 ou quiescentes. Como exemplo da

variabilidade temporal de G1 refira-se que nas clulas do fgado pode ter uma extenso de

anos, em comparao com o que se verifica nas clulas da medula ssea em que a fase G1

tem uma durao de cerca de 20 horas e nas fases mais precoces das clulas embrionrias

em que a fase G1 est praticamente ausente. A deciso de uma clula permanecer em G0

ou entrar em diviso depende de factores extracelulares (ex. condies nutritivas) e celulares

(ex. tamanho celular suficiente para originar duas clulas). Na fase G0, as clulas diminuem

de tamanho, as proteinas e o RNA degradados no so rapidamente substitudos, a sntese

de macromolculas mais lenta, a actividade enzimtica e transporte transmembranar so

baixos e os ribossomas raramente se apresentam como polissomas.

A passagem de clulas de G0 para G1 permite que estas entrem no ciclo. Em clulas G0,

sujeitas a um estmulo extracelular, ocorre a activao de genes de activao precoce, cuja

transcrio se verifica alguns minutos aps a estimulao por factores de crescimento, sem

prvia sntese proteca. No grupo dos genes de activao precoce encontram-se os

protooncogenes FOSe JUN


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Controlo da proliferao celular e cascatas de transduo de sinalO controlo preciso do ciclo celular exige uma complexa rede de vias de sinalizao que

integram sinais extra e intracelulares. No controlo da diviso celular intervm cinases

heterodimricas constitudas por ciclinas (sub-unidade reguladora) e cinases dependentes de

ciclinas (sub-unidade cataltica) = CDKs; e ainda protenas inibidoras das CDK (CDKIs). As

ciclinas activam as CDKs formando complexos moleculares Ciclinas- CDK. Estes

heterodmeros (MPFs-mitosis promoting factors) regulam a actividade de outras protenas

cruciais no ciclo celular, fosforilando-as nos seus locais reguladores promovendo a sua

activao ou desactivao. ainda importante mencionar os inibidores da CDK (CDKI) que

controlam a transio entre fases do ciclo celular, bloqueando a actividade das CDK; e o ciclo

de destruio de protenas (as j usadas e as que esto a inibir a progresso fase seguinte)

ciclo da Ubiquitina/Proteossoma.

Quadro. 1: tipos de ciclinas e CDK em cada fase do ciclo celular

Regulao das Ciclinas-CDK por CDKIs:- p21CIP, p27 KIP2, p57 KIP2 inibem a actividade da Ciclina A-CDK2, e devem ser

degradadas antes de comear a replicao do DNA.

- INK 4S inibidores da cinase 4, inclui protenas que interagem com CDK4, CDK6, que ao

ligarem a INK4 bloqueiam a sua ligao Ciclina D. Controlam especificamente o princpio

de G1. ex. p16INK4a, p15INK4b, p18 INK4c e p19INK4d

Os sinais extracelulares podem ser mitognios, hormonas ou factores de crescimento e vopromover a trancrio de dois tipos de genes:Genes de resposta precoce:

- Induzidos por cascatas de transduo de sinal, que activam factores de transcrio pr-

existentes no citosol e no ncleo, Ex. c-fos, c-jun

- Esto presentes em G0

- Activados por fosforilao ou remoo de inibidor

Genes de resposta tardia:

- Genes de resposta precoce estimulam a transcrio de genes de resposta tardia- No so transcritos em G0


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- Codificam factores de transcrio (ex. E2F), ciclinas tipo D e E, CDK2, CDK4, CDK6.

Regulao a nvel da fase G1:O E2F- factor de transcrio codificado por genes de resposta tardia- activa genes que

codificam protenas envolvidas na sntese de DNA, ciclinas E e A e CDK2; autoestimula a

transcrio dos seus prprios genes e repressor da transcrio quando ligado protena

Rb, que liga complexos de Histona deacetilase. A Protena RB produto do gene supressor

tumoral RB est hipofosforilada no incio de G1 e o substracto mais importante dos

complexos ciclina-CDK em G1. A sua fosforilao previne a associao com E2F, no

impedindo a actividade deste ltimo. A fosforilao de Rb iniciada por ciclinaD-CDK4/6 e

terminada por ciclinaE-CDK2. Como consequncia: aumento da acumulao de ciclina E e

CDK2 (aco de E2F) e fosforilao de Rb mesmo na ausncia de ciclinaD-CDK4/6!

Fig. 7: Regulao Rb/E2F

Para que haja passagem pelo Ponto de Restrio necessrio que:

- os estmulos externos interajam com receptores desencadeando vias de transduo de

sinal, que chegam ao ncleo

- expresso dos complexos Ciclina-CDK de G1

- activao de Factores de Transcriio (ex. E2F) que promovem a transcrio de genes que

codificam protenas necessrias para sntese de DNA e que codificam as ciclinas e as CDKs

da Fase S (Ciclina A e E e CDK2)

- degradao dos inibidores da Fase S (CDKIs) por fosforilao e poliubiquitinao pela SCFubiquitina ligase e respectiva degradao no proteassoma (Ciclina A-CDK2)

Regulao de Rb e E2F na transio da fase Fase G1 para S:E2F induz transcrio de ciclina A na transio entre G1 e S, formando complexos estveis,

impedindo a sua ligao ao DNA. As CDK2 so activadas pela fosfatase Cdc24A, no final de

G1. As ciclinas de G1 activam E2F via fosforilao de Rb e as ciclinas A--CDK2 inactivam-no

por fosforilao. A ciclina E-CDK2 tambm pode contribuir para a activao de complexos

pr-replicao: degradao da Ciclina E. A ciclina A--CDK2 marca a iniciao da sntese de

DNA e a traniio definitiva para S.


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Regulao a nvel da fase S:Depois de haver a transio definitiva para a fase S d-se a sntese de ciclinas mitticas (final

de S) e a degradao, no proteossoma, dos inibidores da Fase S que liberta os complexos

ciclina-CDKs da Fase S (Ciclina ACDK2), activando-os. D-se a fosforilao de locais

reguladores de protenas que vo formar os complexos de pr-replicao de DNA dando

inicio replicao do DNA e produo de complexos ciclinaA-CDK2 mitticos fosforilados.

Regulao de Rb e E2F na passagem da fase G2 para M:CDK1 a principal CDK em G2 e M e associa-se s ciclinas mitticas A e B. Esta CDK1

activada pela remoo do fosfato inactivador pela Cdc25C. a fosforilao de vrios

substractos que asseguram a transio G2/M.

Regulao da fase M:Temos ento a activao, por desfosforilao, dos complexos Ciclina B-CDK1 mitticos e a

fosforilao de protenas envolvidas em processos de:

- Condensao cromosssmica

- Retraco do envelope nuclear

- Organizao do fuso acromtico

- Alinhamento dos cromossomas na placa metafsica

No final da mitose vamos ter os seguintes processos:

- O complexo promotor da anafase (APC): ubiquitina ligase, marca protenas reguladoras-

chave para degradao no proteassoma.

- Poliubiquitinao da securina d-se no incio da anafase, com a libertao dos cromatdeos-

irmos.

- Ubiquitinao das ciclinas B mitticas pelo APC

- Inactivao da actividade de cinase das CDK1 associadas s ciclinas mitticas

- Remoo de grupos fosfato adicionados a protenas por fosfatases-descondensao dos

cromossomas, reconstituio do envelope nuclear, reunio do complexo de Golgi

- Clula fica em G1 ou em G0.

Checkpoints:A passagem nestas fases irreversvel, por serem marcadas pela degradao de protenas,

processo este tambm irreversvel.


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Fig. 8: CheckpointsG1 check-point ou Ponto de Restrio:

Perodo do ciclo, no final de G1, onde a clula toma a deciso (ou no) de replicar o seu

DNA. Assegura que a clula possui a dimenso suficiente para se dividir, que existem

nutrientes em quantidade para suportar as clulas filhas resultantes e que no h danos nos

cromossomas. A deciso tomada mediante a presena de substncias indutoras

provenientes de outras clulas.

G2 check-point:Assegura que a replicao correu bem e que o DNA no tem erros. As clulas que no

tenham replicado os seus cromossomas no entram na fase M. Envolve o reconhecimento de

DNA no-replicado e a inibio de MPF. Ex. ATR e Chk1 inibe a fosfatase Cdc25C logo h

inibio da ciclina A/B-CDK 1 e no se inicia a Fase M.

Check-point da Metafase:Assegura que todos os cromossomas se encontram associados a um microtbulo

cinetocorial. Ex. Mad2 associa-se ao complexo cinetocorial que no est associado a

microtbulos, e inibe Cdc20, o que impede a poliubiquitinao da securina pela APC,

impedindo a anafase.

Fase S e replicao semi-conservativa e semi-descontnua do DNAReplicao semi-conservativa do DNA:

um processo semi-conservativo.Inicia-se em pontos especficos denominados unidades de replicao (originando o garfode replicao).

Sempre na direco 5 3. um processo semi-descontnuo.Participam vrias classes de protenas


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Quadro 2: Tipos de DNA polimerasePCR: um mtodo para a amplificao de sequncias-alvo de DNA definidas, presentes numa

preparao de DNA. utilizado DNA genmico ou uma populao completa de cDNA. necessria informao prvia a respeito das sequncias-alvo para permitir desenhar dois

oligonucletidos iniciadores- primers que limitam a zona a ser ampliada. Estes primers vo

ligar-se cadeia complementar sua sequncia.

Fig. PCR

Consiste numa srie de ciclos de trs reaces sucessivas:

- Desnaturao- que ocorre entre 93-95 no DNA humano (cromossomas em interfase)- Emparelhamento- entre 50-70.


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- DNA sntese- que ocorre entre 70-75, e utiliza uma DNA polimerase termoestvel (estvel

ao calor) como por exemplo a Taq DNA polimerase.

Limitaes:

- Necessidade de conhecimento prvio da sequncia-alvo.- A dimenso dos produtos amplificados- pequena

- A quantidade limitada de material que pode ser clonado.

- Infidelidade na replicao do DNA.

- Contaminao por DNA estranho

Vantagens:

- Determina sequncias de DNA a partir de quantidades muito reduzidas de DNA

- um mtodo rpido e fcil de executar.

- um mtodo sensvel.

- um mtodo fivel mesmo em tecidos ou clulas degradadas.

Aplicaes:

- Deteco de polimorfismos, mutaes pontuais, infeces virais e bacterianas

- Medicina Forense.

- Linkage Gentico.

Sequenciao do DNA:Os fragmentos de DNA usados na sequenciao podem ser obtidos tanto por clonagem

como por PCR. O DNA pode ser sequenciado por mtodos quimcos (Mtodo de Maxam and

Gilbert) mas a sequenciao do DNA por mtodo enzimtico (Mtodo de dideoxy),

actualmente o mais utilizado. Os dois mtodos exigem electroforese com capacidade para

diferenciar fragmentos de DNA em que o tamanho diverge apenas por uma base.

Mtodo Dideoxy: o DNA fornecido em cadeia simples, e actua como molde para a sntese

duma cadeia complementar pela DNA polimerase. Efectuam-se 4 reaces paralelas, cadauma contendo os 4 dNTP, mais uma pequena proporo de um dos 4 didesoxinucletidos

(ddNTPs) anlogo, que actua como finalizador da cadeia. Marca-se um dos 4 dNTPs ou o

primer com um radioistopo ou um fluorocromo, de modo que o DNA sintetisado fique

marcado. Os fragmentos so separados numa electroforese com gel desnaturante de

polyacrylamida.

Sequenciao automtica: utiliza marcadores fluorocromos diferentes para cada uma das 4

reaces, marcando os ddNTPs ou o primer. As 4 reaces podem ser efectuadasjuntas,devido colorao diferencial dos ddNTPs. Durante a electroforese um monitor


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detecta e recorda o padro de fluorescncia diferente para cada um dos fluorocromos, e

armazena esta informao num computador.

Aplicaes da sequenciao:

- deteco de mutaes.- deteco de polimorfismos (genotipagem).

- identificao de novos genes e a elucidao da sua sequncia.

Normal Mutao (185del A)

Protenas estabilizadoras da cadeia simples, helicases e topoisomerases 1 e 2Helicase: uma enzima utilizada para separar as duas cadeias de DNA que formam a dupla

hlice utilizando energia da hidrlise do ATP e actuando ao nvel da quebra das pontes de

hidrognio entre as bases azotadas. H 24 tipos de helicases nos seres humanos uma vez

que h vrias situaes em que necessrio separar as cadeias da dupla hlice.

Topoisomerase: ajuda no desenrolamento da dupla hlice de DNA atravs da quebra das

ligaes de fosfato. A topoisomerase I actua sobre uma cadeia de DNA enaquanto que a

topoisomerase II actua em ambas as cadeias de DNA. As topoisomerases tambm esto

envolvidas em mecanismos de reparao de DNA.

O problema do fim da replicao: telomeraseSequencing of telomeres from a dozen or so organisms, including humans, has shown that

most are repetitive oligomers with a high G content in the strand with its 3 end at the end of

the chromosome. The telomere repeat sequence in humans and other vertebrates is

TTAGGG. These simple sequences are repeated at the very termini of chromosomes for a

total of a few hundred base pairs in yeasts and protozoans and a few thousand base pairs in

vertebrates. The 3 end of the G-rich strand extends 1216 nucleotides beyond the 5 end ofthe complementary C-rich strand. This region is bound by specific proteins that both protect

start


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the ends of linear chromosomes from attack by exonucleases and associate telomeres in

specific domains within the nucleus. The need for a specialized region at the ends of

eukaryotic chromosomes is apparent when we consider that all known DNA polymerases

elongate DNA chains at the 3 end, and all require an RNA or DNA primer. As the growing fork

approaches the end of a linear chromosome, synthesis of the leading strand continues to the

end of the DNA template strand, completing one daughter DNA double helix. However,

because the lagging-strand template is copied in a discontinuous fashion, it cannot be

replicated in its entirety. When the final RNA primer is removed, there is no upstream strand

onto which DNA polymerase can build to fill the resulting gap. Without some special

mechanism, the daughter DNA strand resulting from lagging-strand synthesis would be

shortened at each cell division. The problem of telomere shortening is solved by an enzyme

that adds telomeric sequences to the ends of each chromosome. The enzyme is a protein andRNA complex called telomere terminal transferase, ortelomerase. Because the sequence of

the telomerase-associated RNA serves as the template for addition of deoxyribonucleotides to

the ends of telomeres, the source of the enzyme and not the source of the telomeric DNA

primer determines the sequence added. Telomerase is a specialized form of a reverse

transcriptase that carries its own internal RNA template to direct DNA elongating the 3 end of

the single-stranded DNA at the end of the G-rich strand. The absence of telomere DNA results

in adverse effects, including fusion of chromosome termini and chromosomal loss.Para alm da telomerase, existe outro processo atravs do qual os tumores conseguemfazer de forma alternativa a manuteno dos telmeros: o ALT.No ALT, uma cadeia de DNA de um telmero liga-se a uma cadeia complementar de outro

telmero, obtendo assim o modelo para a sntese do novo DNA telomrico. Abrem-se as

duas cadeias como se v no esquema seguinte, servindo uma de molde outra. Aps a crise

celular, alguns telmeros ficam to curtos que as repeties telomricas encontram-se logo

aps a zona subtelomrica do cromossoma, onde j no existem as repeties da sequncia

telomrica. Quando se d o mecanismo ALT, possveis sequncias GGTTAG perdidas nas

zonas subtelomricas podem agir como primer de adio de novo DNA telomrico,

resultando isto na substituio das variaes subtelomricas por repeties telomricas

GGTTAG. Os telmeros mantidos pelo ALT apresentam elevada heterogeneidade e so

observados em clulas que tambm apresentam telomerase.

Fase MCondensao de cromatina- ver regulao e organizao da cromatina (pg. 41)


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Mitose

Fuso acromtico e protenas contrcteis do citoplasmaDesigna-se por fuso acromtico ou mittico a estrutura dinmica que se forma durante amitose, fundamentalmente constituda pelos microtbulos e centrosomas. A formao do fuso

acromtico inicia-se na prometafase, completa-se na metafase e dissipa-se, graudalmente,

na anafase B. O fuso morfologicamente constitudo por dois plos diametralmente opostos,

sendo cada um formado por uma regio polar onde se localiza um centrossoma formado por

dois centrolos que se encontram situados a curta distncia um do outro em posio

ortogonal. Os polos esto interligados entre si por um conjunto de microtubulos, muitos dos

quais esto directamente ligados ao cinetocoro dos cromossomas. Entre as duas regies

polares, numa posio perpendiclar aos microtbulos e, sensivelmente a igual distncia entre

os dois polos, encontra-se uma zona complanar que, genericamente, se chama plano

equatorial do fuso (tambm conhecida por placa equatorial ou mittica) o qual separa o fuso

acromtico em duas zonas iguais. Associado aos microtbulos encontra-se um grupo de


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protenas que participam em muitos processos celulares e que tm um papel central na

formao e funo do aparelho mittico. Estas protenas, denominadas protenas motoras,pertencem a duas famlias: as cinesinas e as dineinas. Estas protenas tm varios domnios,

nomeadamente um domnio para a formao de dmeros que permita a ligao aos

microtbulos, e um outro domnio para a associao com outros componentes celulares.

Estas protenas ligam os microtbulos e utilizam a energia proveniente da hidrlise do ATP

para mover estruturas celulares tanto na direco (-) no caso das dineinas, como na direco

(+) no caso das cinesinas. No incio da fase S, junto a cada centrolo, forma-se um esboo

microtubular chamado procentrolo. Os esboos microtubulares de cada procentrolo

organizam-se e crescem por adio de monmeros de tubulinas. Os tripletos microtubulares

atingem a sua organizao centriolar completa geralmente no fim da fase S. Cada centrolo

fica acompanhado de um novo centrolo ficando a existir 2 centrossomas (4 centrolos) namesma regio cromossmica. Quando se inicia a mitose, cada centrossoma comea a

deslocar-se para uma posio diametralmente oposta, atingindo essa posio na metafase

quando se completa o fuso acromtico.

Recombinao mittica e troca de cromtides irms (SCEs)Recombinao mittica: most spontaneous RCOs (reciprocal crossovers) are initiated by DNAdouble-strand breaks (DSBs). Recombinational repair of a DSB requires a template; when the

homologous chromosome serves that role, it provides the opportunity for an RCO. Since there

is also evidence that single-stranded nicks and gaps are recombinogenic, it is likely that

several types of DNA lesions may be important for spontaneous mitotic recombination events.

In addition, some recombinogenic agents (such as ultraviolet radiation) are thought to produce

nicks that result in DSBs when the nicked DNA is replicated. Thus, the question of why

becomes tied up with the question of when.Whereas meiotic recombination occurs during

meiosis, most mitotic recombination probably does not occur during mitosis, but during

interphase.

A SCE (Sister Cromatid Change) consiste numa troca simtrica e exacta de material genticoentre cromtides irms. Estas trocas ocorrem em qualquer mitose, sendo mais frequentes

contudo na presena de agentes lesivos do genoma. Pensa-se que podem ter um papel de

reparao. Este fenmeno no acarreta nenhuma alterao morfolgica ou funcional no

cromossoma, desde que no se trate de uma troca desigual, j que, como foi dito, envolve

uma troca entre pores idnticas de DNA. A frequncia de SCE muito elevada na

sndroma de Bloom. O ciclo biolgico e a reduo meitica da ploidia


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MeioseCompreende duas divises celulares sucessivas mas somente um ciclo de replicao de

DNA de modo a qua as clulas filhas finais so haplides. A primeira diviso (meiose I)

uma diviso de reduo (heterotpica) produzindo duas clulas haplides oriundas de umanica clula diplide. A segunda diviso (meiose II) uma diviso equacional (homotpica)

que separa os cromatdios irmos das clulas haplides. A meiose faz parte de um ciclo

celular designado ciclo celular meitico que corresponde a duas fases distintas: interfase pr-

meitica e a fase M (meiose). Ver pgina 397 do Carlos Azevedo.

Quiasmata e crossing-overDurante a profase da meiose I, os cromossomas sinpticos em cada bivalente (cromossoma

materno unido ao cromossoma homlogo paterno), trocam segmentos entre si de forma

aleatria. No estgio de zigoteno (ver meiose), cada par de homlogos comea a formar um

complexo sinaptonmico que consiste em dois cromossomas intimamente emparelhados,

separados por um longo eixo linear de protenas. A finalizao desse complexo marca o incio

do estgio de paquiteno, que quando ocorre a recombinao- crossing-over). O crossing-over envolve a quebra fsica da dupla hlice de uma cromtide paterna e uma materna e a

troca de informao gentica entre elas. A recombinao resulta ento da troca de grupos de

genes produzida por ruptura e nova fuso de fragmentos anlogos correspondentes a

cromatdeos internos no irmos de um bivalente. Em conjunto, a recombinao entre

homlogos na profase I e a distribuio independente dos homlogos na anafase I assegura

que cada indivduo possa produzir um nmero quase ilimitado de gmetas geneticamente

diferentes. O mecanismo que proporciona o alinhamento dos homlogos no est

determinado. Entretanto, considera-se que essa aposio ntima seja necessria para a

recombinao. Supe-se que os ndulos de recombinao- grandes acumulados de mltiplas

protenas localizados a intervalos especficos no complexo sinaptonmico- realizem a

mediao nos eventos da recombinao. Pode-se ver que os dois homlogos estofisicamente em contacto em pontos especficos. Cada conexo considerada um quiasma

(ou quiasmata) e marca um ponto de crossing-over. Alm do seu papel na recombinao,supe-se que os quiasmas sejam essenciais para a segregao cromossmica correcta na

meiose I. Ao manter os homlogos materno e paterno de cada par de cromossomas juntos no

fuso at anafase I, eles tm um papel anlogo ao dos centrmeros na mitose e meiose II.

H evidncias genticas de que crianas com um nmero errado de cromossomas

frequentemente resultam de gmetas provenientes de uma clula na qual um bivalente no

sofreu crossing-over.


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Converso e complementao gnicaConverso gnica: fenmeno associado existncia de sequncias homlogas. Naconverso gnica, uma sequncia modificada a partir de outra, provavelmente porformao de heteroduplexes entre as duas cadeias de DNA. O mecanismo de reparao deerros de emparelhamento (MMR) reconhece uma das cadeias como errada e procede

correco a partir da outra cadeia.

Fig. 9: Converso gnica

Complementao gnica: refere-se hibridao entre 2 genomas com dfice emdeterminados genes diferentes, sendo o resultado obtido um genoma normal por

complementariedade. Dois exemplos so a doena de Hurler e a doena de Hunter, em que

o fentipo pode ser normal se os defeitos no forem allicos (ver pg. 110).

3. Genes e expresso do material gentico_______________________


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TranscrioRNA polimerases I, II e III

A RNA polimerase constituda por 4 subunidades 2, , e que compem a

holoenzima. A subunidade responsvel pela identificao de um local promotor local de

reconhecimento onde a transcrio tem incio, actuando apenas durante a iniciao da

transcrio, constantemente reciclada, existindo em muito menores concentraes nas

clulas, que a enzima mnima. Existem diversas subunidades que reconhecem diferentes

sequncias de consenso, caractersticas de genes diferentes. A RNA polimerase sem a

subunidade designada porcoreenzima (2, , ). Estas subunidades constituem o local

cataltico, sendo a subunidade responsvel pela ligao cadeia de DNA padro e a

pela ligao aos substratos ribonucletidos trifosfatados. Alm destas subunidades convm

tambm referir o factor rho (Erro! Marcador no definido.), responsvel pela terminao.H

trs tipos de RNA polimerase descritas no quadro seguinte:

Fig. 10: Expresso do material gentico numa clula animal


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Quadro 2: Trs tipos de RNA polimerase dos eucariticosLocais de iniciao

As RNA polimerases dos eucariotas no tm autonomia para iniciar a transcrio. preciso

que combinaes de elementos, com sequncias curtas, adjacentes ao gene, actuem como

sinais de reconhecimento para que os factores de transcrio possam ligar-se ao DNA para

guiar e activar a polimerase. Frequentemente, um conjunto desses elementos com

sequncias curtas fica agrupado a montante da sequncia codificadora de um gene

constituindo colectivamente, o promotor. Depois de vrios factores comuns de transcrio se

ligarem regio do promotor, uma RNA-polimerase liga-se ao complexo desses factores e

activada para iniciar a sntese de RNA a partir de um nico ponto.

Elementos cis e elementos transDiz-se que os factores de transcrio so trans-actuantes pois so sintetizados por genes

situados em locais distantes, migrando para os seus locais de aco. Os elementos

promotores, reforadores e silenciadores por sua vez so cis-actuantes uma vez que a sua

funo se limita ao local de DNA onde se encontram.

Locais de ligao TATA, GC, CAAT e factores de transcrioOs elementos promotores dos genes que so transcritos activamente pela RNA polimerase II,

incluem sempre uma TATA box, frequentemente a TATA-AA ou uma variante, situada cerca

de 25pb a montante (-25) do local de incio da transcrio. Uma mutao no elemento TATA

no impede o incio da transcrio, mas desloca o seu ponto de incio da sua posio normal.

Os promotores de muitos outros genes, inclusive os dos genes de manuteno, no tm

TATA boxes, mas, frequentemente tm uma GC box contendo varitantes da sequncia

consensual GGGCGG. Outro elemento promotor frequente a CAAT box, situado

aproximadamente a -80 que usualmente o maior determinante da eficincia do promotor.

Note porm que, embora as sequncias da GC box e da CAAT box sejam assimtricas,


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ambas parecem capazes de funcionar em qualquer orientao. Alm dos elementos comuns

de transcrio, localizados a montante e reconhecidos por factores de transcrio ubquos,

existem elementos de reconhecimento mais especficos, que s so identificados por factores

de transcrio restritos a determinados tecidos. (ver pgina 42)

Fig. 11: Promotores eucariticos. chevron orientation: > = normal orientation; < = reverse orientation.

Maturao do RNA:Faz parte da regulao ps-transcripcional.

Formao do capOcorre logo aps a transcrio. No caso dos transcritos primrios, que sero processados

para produzir mRNA, um nucleosdeo metilado, a 7-metilguanosina (m7G), ligado ao

primeiro nucletido 5 do transcrito de RNA por uma ligao fosfodister especial 5-5. Tendo

em conta que o carbono 5 do resduo m7G e o carbono 5 do primeiro nucletido so

efectivamente ligados, diz-se que a extremidade 5 est bloqueada ou capeada (cap). Os

transcritos dos genes de snRNA tambm so capeados, mas as suas capas podem sofrer

ainda outras modificaes. Supe-se que o cap possa ter as seguintes funes:

- proteger o transcrito do ataque da exonuclease 5 3 (molculas de mRNA sem cap

so desnaturadas rapidamente)

- facilitar o transporte do ncleo para o citoplasma

- facilitar o encadeamento de RNA

- desempenhar um papel importante no encaixe da subunidade menor (40S) dos

ribossomas citoplasmticos no mRNA


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Poli-adenilaoA transcrio pelas RNA-polimerases I ou II pra logo que a enzima reconhece um stio

especfico de fim da transcrio. No entanto, este reconhecimento dificultado porque as

extremidades 3 das molculas do mRNA so determinadas por uma reaco de clivagem

posterior transcrio. A sequncia AAUAAA o elemento principal para assinalar a

clivagem 3 na grande maioria dos transcritos por polimerase II (os transcritos dos genes de

histonas e dos genes de snRNA so excepes importantes). A clivagem ocorre num stio

especfico, localizado a jusante do elemento AAUAAA. Em busca do ponto de clivagem, a

transcrio pode continuar por muitos nucletidos at que termine alguns stios depois. Nas

clulas de mamferos, uma vez ocorrida a clivagem a jusante do elemento AAUAAA, cerca de

200 resduos de adenilato (ex. AMP) so adicionados sequencialmente pela enzima poli(A)-

polimerase para formar uma cauda poli(A). Supe-se que essa cauda tenha vrias funes:- facilitar o transporte das molculas de mRNA para o citoplasma

- estabilizar ao menos parte das molculas de mRNA no citoplasma (o encurtamento da

extenso da poli(A) est associado com a degradao do mRNA, mas algumas espcies

de mRNA (ex. o mRNA da actina) permanecem estveis com pouca ou nenhuma poli(A)

- facilitar a traduo, ao permitir uma intensificao do reconhecimento do mRNA pela

maquinaria ribossmica

Intres e exesAs sequncias codificadoras da maioria dos genes dos vertebrados, tanto os que codificam

polipptidos quanto os que codificam outras molculas de RNA que no o mRNA, so

divididas em segmentos- os exes- que so separados por sequncias intercaladas no

codificadoras- os intres. A transcrio consiste na produo de uma sequncia de RNA

complementar ao comprimento total do gene, abrangendo exes e intres. Frequentemente o

RNA transcrito sofre splicing.

snRNAs, spliceossoma e splicing dos RNAs. Splicing alternativoSplicing: Relativamente ao splicing, este processo consiste na introduo de alteraes nasequncia original de exes. Desta forma, a clula pode gerar diferentes mRNA a partir de

um nico gene e consequentemente produzir diferentes protenas. O mecanismo de splicing

de RNA dependente da identidade das sequncias de nucletidos nos limites exes/intres

(junes de splicing). particularmente sensvel ao que tem sido denominada a regra GT-

AC: os intres quase sempre comeam com GT (GU ao nvel do RNA) e terminam com AG.

Embora os dinucletidos conservadores GU e AG sejam cruciais no splicing, no sosuficientes para indicar a presena de um intro. As sequncias adjacentes aos dinucletidos


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GT e AC mostram um grau considervel de conservao. Existe uma terceira sequncia

conservada nos intres que funcionalmente importante para o splicing, o local de

ramificao, quase sempre localizado perto do final do intro, antes do dinucletido terminal

AG. O mecanismo de splicing o seguinte:

- clivagem na juno da cadeia 5

- ataque nucleoltico ao A invariante do stio de ramificao pelo nucletido G terminal do stio

dador de splicing, a fim de formar uma estrutura em forma de lao

- clivagem na juno da cadeia 3, com a libertao do RNA do intro sob a forma de um lao

e o splicing dos exes do RNA.

Estas reaces so mediadas por um complexo de RNA e de protenas, o spliceosoma, que

consiste em cinco tipos de snRNA (small nuclear RNA) e de mais de 50 protenas.

Cada molcula de snRNA est ligada a protenas especficas, formando partculas de snRNA(small nuclear ribonucleoproteins) e a especificidade da reaco de splicing estabelecida

pela formao de pares de bases RNA-RNA entre o RNA transcrito e as molculas de

snRNA. Na grande maioria dos intres de genes que codificam polipptidos, as cinco

espcies de snRNA so U1, U2, U4, U5, U6. O terminal 5 do snRNA U1 tem uma sequncia

UACUUAC, cujas bases emparelham com a sequncia de consenso do stio dador de

splicing (GUAAGUA). Depois da snRNP U1 se ligar, o snRNA U2 reconhece o local de

ramificao por uma reaco semelhante ao emparelhamento de base e logo aps, a

interaco entre os snRNP U1 e U2 aproxima intimamente as duas extremidades que serounidas. Em seguida, uma partcula com mltiplos snRNP, contento snRNAs U4 U5 e U6

associa-se ao complexo snRNPs U1-U2. Supe-se que o spliceosoma age de modo

progressivo e depois de reconhecer um local de splicing 5 percorre a sequncia de RNA at

encontrar o local de splicing 3.

Fig. 12: (A) Mecanismo de splicing (B) Papel dos snRNPs.


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Stios cripticos de splicing: Sequncias que so muito semelhantes s sequnciasconsensuais dos stios dador ou receptor de splicing podem, coincidentemente existir em

intres e exes. Essas sequncias no so normalmente utilizadas no splicing e, por isso,

so conhecidas como stios crpticos de splicing. Uma mutao pode activar um destes stios

ao tornar a sequncias mais parecida com a sequncia consensual do stio dador ou receptor

de splicing e o stio crptico pode, ento, ser reconhecido e utilizado pelo spliceosoma. Um

exemplo pode ser visto na figura seguinte que mostra uma mutao identificada num

paciente com distrofia muscular dos membros. A mutao foi encontrada no gene da calpaina

3, um lcus conhecido para esse tipo de distrofia muscular, mas ocorreu na posio da

terceira base de um codo e parecia ser uma mutao silenciosa (subsitutio de um codo

de glicina por outro de glicina tambm). No entanto, acredita-se que, a mutao seja

patognica uma vez que a substituio resulta na activao de uma sequncia dadora desplicing, oculta no exo 16, resultando num splicing aberrante, com a perda da sequncia

codificadora do exo 16 e a introduo de uma mudana na fase de leitura.

Fig. 13: Exemplo de stio crptico de splicing

Splicing alternativo: A large percentage of human genes undergo alternative splicing wherebydifferent exon combinations are included in transcripts from the same gene during RNA

processing. For many genes, numerous isoforms can be generated at the RNA level, but often

the functional significance is poorly appreciated. In some genes, alternative splicing results invery considerable diversity in the untranslated regions. For example, in the liver alternative

splicing results in at least 8 different 5 UTR sequences for human growth hormone receptor

mRNA, but the functional significance, if any, is not understood. Alternative splicing of coding

sequence exons is also common and some of the resulting protein isoforms have been shown

to be tissue specific, so that individual exons present in one isoform but not in others may be

termed muscle-specific , brain-specific etc. The different isoforms can provide a variety of

possibilities for altered functional properties but detailed knowledge of the functional

significance of the different isoforms is still comparatively sparse. The best understood modelsystem for understanding the regulation of splicing is the sex determination pathway in


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Drosophila which also controls gene dosage. Alternative splicing is used in each branch of this

pathway to control the expression of transcriptional regulators or chromatin-associated

proteins that influence transcription, and both positive and negative control of splicing is

evident. In mammalian cells candidate splice regulators are the SR family of RNA-binding

proteins (which have a distinctive C terminal domain rich in serine (S)-arginine (R) dipeptides]

and some HnRNP (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein particle) proteins. These proteins

are known to promote various steps in assembly of spliceosomes and they are also known to

bind to splicing enhancer sequences, regulatory sequences which can enhance splice site

recognition. Aumenta a capacidade para originar diversidade proteica.

Edio do RNA: uma forma de processamento posterior transcrio que pode envolver a insero oudeleco de nucletidos, mediada por enzimas, ou a substituio de nucletidos individuais a

nvel de RNA. A expresso do gene da apolipoprotena B humana no intestino envolve a

edio do RNA tecido-especfica (figura seguinte). O codo 2153, especificado pelo tripleto

CAA na posio 6666-6668 especfico para a glutamina na ApoB100 sintetizada no fgado.

No intestino, porm, o codo CAA convertido, pela edio de RNA, no codo de terminao

UAA, resultando num produto mais curto- ApoB48.

Fig. 14: Exemplo de edio de RNA

RNAs no codificantes (ncRNA):The term non-coding RNA (ncRNA) is commonly employed for RNA that does not encode a

protein, but this does not mean that such RNAs do not contain information nor have function.

Although it has been generally assumed that most genetic information is transacted by

proteins, recent evidence suggests that the majority of the genomes of mammals and other

complex organisms is in fact transcribed into ncRNAs, many of which are alternatively spliced

and/or processed into smaller products. These ncRNAs include microRNAs and snoRNAs

(many if not most of which remain to be identified), as well as likely other classes of yet-to-be-


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discovered small regulatory RNAs, and tens of thousands of longer transcripts (including

complex patterns of interlacing and overlapping sense and antisense transcripts), most of

whose functions are unknown. These RNAs (including those derived from introns) appear to

comprise a hidden layer of internal signals that control various levels of gene expression in

physiology and development, including chromatin architecture/epigenetic memory,

transcription, RNA splicing, editing, translation and turnover. RNA regulatory networks may

determine most of our complex characteristics, play a significant role in disease and constitute

an unexplored world of genetic variation both within and between species.

Fig. 15: Classes de ncRNA microRNA e o mecanismo de interferncia de RNAMicroRNA (miRNA) is a short (about 21 to 23 nucleotides) single-stranded RNA molecule thatis now recognized as playing an important role in gene regulation even though the term has

been in use only since 2001. It is similar to, but distinct from, another type of short RNA,

known as small interfering RNA (siRNA).

Mecanismo de interferncia de RNA: Long double-stranded RNAs (dsRNAs; typically >200 nt)can be used to silence the expression of target genes in a variety of organisms and cell types

(e.g., worms, fruit flies, and plants). Upon introduction, the long dsRNAs enter a cellular

pathway that is commonly referred to as the RNA interference (RNAi) pathway. First, the

dsRNAs get processed into 20-25 nucleotides small interfering RNAs- siRNAs by an RNase

III-like enzyme called Dicer (initiation step). Then, the siRNAs assemble into

endoribonuclease-containing complexes known as RNA-induced silencing complexes

(RISCs), unwinding in the process. The siRNA strands subsequently guide the RISCs to

complementary RNA molecules, where they cleave and destroy the cognate RNA (effecterstep). Cleavage of cognate RNA takes place near the middle of the region bound by the


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siRNA strand. In mammalian cells, introduction of long dsRNA (>30 nt) initiates a potent

antiviral response, exemplified by nonspecific inhibition of protein synthesis and RNA

degradation. The mammalian antiviral response can be bypassed, however, by the

introduction or expression of siRNAs.

Fig. 16: Mecanismo de interferncia de RNA

Rede de regulao mediada pelos ncRNAsncRNA so os RNA no codificantes dos quais se destaca o miRNA (micro RNA) que um

RNA de regulao codificado por regies intrnicas e o siRNA. O mecanismo de

transferncia atravs do siRNA foi descrito anteriormente. O mecanismo de regulao

atravs do miRNA est descrito na figura seguinte:


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Mecanismo de regulao atravs do miRNA (fig. 21):

1) microRNAs so transcritos como parte de uma molcula de RNA: Pri-miRNA.

2) O pri-miRNA processados no ncleo pela ribonuclease Drosha Pre-miRNA.

3) Pre- miRNA transportado para o citoplasma pelo mecanismo exportin 5-dependent

4) No citoplasma, o Pre-miRNA digerido por uma ribonuclease- Dicer originando uma

cadeia de miRNA especfica e maturada.

5) O miRNA de cadeia simples vai ligar-se ao RNA- induced Silencing Complex (RISC) que

participa no RNAi (interferncia)

6) O miRNA+RISC vai unir-se ao mRNA (3UTR) impedidno a sua traduo resultando na

diminuio da expresso gnica do respectivo gene.

Aproximadamente 60% dos miRNAs so expressos independentemente, 15% so expressos

em clusters, e 25% em intres. Although miRNA and siRNA both have gene regulation

functions, there are subtle differences. miRNA may be slightly shorter than siRNA (which has

20 to 25 nucleotides). miRNA is single-stranded, while siRNA is formed from two


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complementary strands. The two kinds of RNA are encoded slightly differently in the genome.

And the mechanism by which they regulate genes is slightly different. miRNA attaches to a

piece of messenger RNA (mRNA) which is the master template for building a protein in a

non-coding part at one end of the molecule. This acts as a signal to prevent translation of the

mRNA into a protein. SiRNA, on the other hand, attaches to a coding region of mRNA, and so

it physically blocks translation. Os miRNAs so molculas endgenas de regulao enquanto

os siRNAs so molculas exgenas processadas atravs de RNA de cadeia dupla. No

entanto, ambos so processados por Dicer. A Dicer encaminha o produto para o RISC que

o efector do silenciamento/interferncia. O RISC pode silenciar mRNAs por 2 mecanismos:

1. Se h emparelhamento perfeito entre ncRNA (miRNA essencialemnte) e mRNA este degradado por Argonauta (subunidade que degrada mRNA emparelhado com miRNA);

2. Se h erros de emparelhamento (mismatches) o mRNA pode ser localizado em focoscitoplasmticos de processamento (P-bodies) onde degradado ou sequestrado da

traduo.

Cdigo genticoDegenerescncia do cdigo gentico

A sequncia de aminocidos de uma protena determinada pela sequncia de bases do

DNA correspondente. Esta correspondncia conseguida pela utilizao de grupos de trsbases, denominadas codes, que correspondem a um nico aminocido. Deste modo, pela

utilizao de 4 bases combinadas, possvel obter 43 arranjos diferentes, ou seja, 64

diferentes codes. Se a cada codo corresponder um aminocido diferente e considerando

os 20 aminocidos normalmente utilizados na sntese proteica, observaramos que 44 das

combinaes no codificariam qualquer aminocido. No entanto, muitos dos aminocidos

podem ser codificados por mais de uma combinao, ou seja, o cdigo degenerado (com

excepo da metionina e da triptofana, todos ou outros aminocidos so codificados por

vrios tripletos sinnimos).

A quase universalidade do cdigo genticoA universalidade do cdigo gentico tem como base o facto de que mRNA de clulas

distintas pode ser traduzido em sistemas heterlogos. No entanto, presentemente conhecem-

se limites universalidade; existem preferncias na utilizao de codes consoante o tipo

celular. Esta diversidade aplica-se igualmente aos tripletos que no codificam para nenhum

aminocido e que correspondem a sinais de paragem da traduo do mRNA. Uma excepo

universalidade o facto de nas mitocndrias existirem 3 codes que designam informao


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diferente relativamente ao citoplasma da mesma clula codo UGA um codo de

terminao no cdigo usual e codifica triptofana no cdigo mitocondrial; o codo AUA codifica

para a isoleucina no cdigo usual e para a metionina na mitocndria; o codo CUA codifica

para a leucina no cdigo usual e para a treonina na mitocndria.

Cdigo gentico mitocondrialDiferente do DNA nuclear que forma longas fitas, constitudas cada uma por dupla hlice e

que codificam aproximadamente 100.000 genes, o mtDNA representa 1 a 2% do DNA celular,

em duplo filamento circular, codificando 37 genes. O mtDNA codifica aproximadamente 10%

das protenas constitutivas das mitocndrias, como consequncia, para um bom

funcionamento destas, necessria uma boa cooperao entre o DNA nuclear e o DNA

mitocondrial. O mtDNA no tem nada de especial na sua composio qumica que odiferencie do DNA nuclear, entretanto, possui um cdigo gentico prprio. Por outro lado, a

sua organizao bastante econmica, j que apenas 10% da sua totalidade no

codificante. O seu genoma haplide devido sua herana ser estritamente materna, por

isso no est submetido a processos de recombinao. O mecanismo pelo qual a

mitocndria paterna excluda do embrio logo aps a fertilizao ainda no est bem

esclarecida. Os filamentos de DNA mitocondrial tm uma distribuio assimtrica de

guaninas e citosinas, o que gera uma cadeia pesada (H) e outra leve (L). Cada filamento

transcrito a partir de um promotor PL e PH1, localizados na regio controle, na qual se inclui

o D-Loop que uma regio gerada pela sntese de um segmento curto da cadeia pesada (H)

denominado 7SDNA, onde se encontra a origem da replicao da cadeia H. Esta regio

muito importante do ponto de vista forense, devido ao facto de ser uma regio hipervarivel e

suficientemente pequena para ser abordada por meio de seqenciamento por PCR.

Caractersticas do mtDNA:

- muito sensvel ao dano oxidativo causado principalmente por um grande nmero de

radicais livres proporcionado um ambiente favorvel a mutao do DNA.

- no possui histonas, que exercem um papel protector no DNA nuclear

- a mtDNA polimerase tm uma pobre actividade reparadora comparada com a nuclear.

- a reparao do DNA dependente de exciso de nucleotdeos no est presente

- a tpica estrutura D-Loop, onde h formao momentnea de fitas simples pode influenciar o

padro de mutao pontual, j que a taxa de despurinao do DNA de cadeia simples 4x

maior do que a do DNA cadeia dupla.

- codifica componente

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GenÃ©tica FCM-UNL [Sebenta] Ana Carlota Dias