Guía de TP 2016 - WordPress.comLa segunda recuperación se podrá realizar al final del cuatrimestre, en dicha ... Esquematice un mapa de restricción que muestre las posiciones relativas

Química Biológica Patológica 2016 Licenciatura en Bioquímica

Área de Química Biológica 1

G U Í A D E

T R A B A J O S P R Á C T I C O S

Curso: Química Biológica Patológica. Carrera: Licenciatura en Bioquímica.

Universidad Nacional de San Luis Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia Departamento de Bioquímica y Cs. Biológicas

Año: 2016



REGLAMENTO DE TRABAJOS PRÁCTICOS SEGÚN ORDENANZA Nº 13/03-y modificatoria Nº 32/14 .CS-año 2016

1- Los alumnos conocerán al comenzar el cuatrimestre, las fechas y los temas de los trabajos prácticos de aula y laboratorio, como así también las fechas de las Evaluaciones Parciales, todo lo cuál será informado oportunamente en la cartelera y el Blog de la Cátedra.

2- Los fundamentos teóricos de los trabajos prácticos de aula y laboratorio serán indicados por el personal docente antes de la realización de los mismos.

3- La bibliografía de cada uno de los temas a desarrollar estará a disposición de los alumnos en la Cátedra y conocerán la que se encuentre en Biblioteca y/o centros de copiado para su consulta con suficiente anticipación.

4- Previamente a la realización de los Trabajos Prácticos de aula y laboratorio, durante o al final de su desarrollo, los alumnos serán evaluados en forma escrita u oral por los jefes de trabajos prácticos a fin de evaluar sus conocimientos sobre la fundamentación teórica de los mismos.

5- Para la aprobación de los Trabajos Prácticos y ser considerados como Alumno Regular, los alumnos deberán obtener resultados adecuados, aprobar satisfactoriamente los cuestionarios de trabajos prácticos y las evaluaciones parciales programadas.

6- De acuerdo a la reglamentación vigente (Ord Nº 13/03) los alumnos deberán aprobar el cien por ciento (100 %) de los trabajos prácticos de aula y laboratorio y de las evaluaciones parciales sobre los mismos.

7- De acuerdo a la misma reglamentación, los alumnos tendrán 2 (dos) oportunidades de recuperación de los trabajos prácticos de laboratorio realizados (de un total de 7 TP), y 1 (una) oportunidad de recuperación de los trabajos prácticos de aula (de un total de 3 TP), debiendo aprobar en primera instancia el 75% de los trabajos prácticos de laboratorio y aula, completando la aprobación del (90%) en la primera recuperación. En la segunda recuperación deberá totalizar la aprobación del cien por ciento (100%) de los trabajos prácticos de laboratorio y aula.

8- Para poder rendir cada evaluación parcial sobre los temas de los trabajos prácticos, los alumnos deberán tener aprobado el cien por ciento (100%) de los trabajos prácticos cuyos contenidos se evaluarán en dicha evaluación parcial. Estas evaluaciones podrán ser escritas u orales.

9- Teniendo en cuenta la misma reglamentación y la ordenanza Nº 32/14, los alumnos tendrán derecho a dos recuperaciones para cada uno de los parciales. La primera recuperación deberá llevarse a cabo en no menos de 48 hs de publicado el resultado del Parcial. La segunda recuperación se podrá realizar al final del cuatrimestre, en dicha oportunidad cada alumno rendirá el o los parciales que mantuviera sin aprobar.

10-Los alumnos que hayan cumplido con los requisitos de regularización establecidos, mantendrán su condición de regular por el término que lo dispongan las reglamentaciones vigentes de la UNSL. Vencido eses plazo deberá cursar nuevamente la asignatura.



TP Nº 1: PROBLEMAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

APLICADAS AL DIAGNOSTICO

Dra. Silvia Mabel Varas Objetivos: - Detallar las técnicas y herramientas de biología molecular con especial

referencia a las utilizadas para el diagnóstico de enfermedades hereditarias. - Interpretar geles de corrida para la realización del diagnóstico de mutaciones

presentes en ADN de los pacientes, nomenclatura e informe de las mismas. - Integrar todos estos conocimientos con la realización de problemas típicos de

enfermedades hereditarias. - Conocer las nuevas técnicas de diagnóstico aplicadas a la detección de

mutaciones. 1) Referida a las enzimas de restricción, marque la opción correcta: A) Reconocen determinadas secuencias de nucleótidos del ADN. B) Cortan las dos cadenas del ADN. C) Suelen producir colas de una sola cadena. D) Hacen todo lo mencionado. E) No hacen nada de lo mencionado. 2) Dadas las siguientes secuencias, complete adecuadamente para obtener

secuencias palindrómicas.

3) Ud. desea hacer un mapeo de restricción de un fragmento de 3.0 Kb obtenido

por digestión con Bam HI. Para ello digiere las 3 muestras del fragmento con Eco RI, Hpa II y una mezcla de Eco RI y Hpa II. Luego separa por electroforesis en agarosa y visualiza las bandas de ADN por el agregado de bromuro de etidio (Ver figura). Esquematice un mapa de restricción que muestre las posiciones relativas de los sitios de reconocimiento de Eco RI y HpaII y la distancia en Kilobases (Kb) que los separa entre ellos.



4) La figura muestra un ejemplo de un gel de secuenciamiento utilizando los

dideoxinucleótidos (Método de Sanger).

Teniendo en cuenta que debe ser leído desde la parte inferior a la superior, le

pedimos que nos brinde la secuencia del ARNm correspondiente para la síntesis de una determinada proteína y si puede hallar el marco de lectura en esta secuencia.



5) Ud desea amplificar un fragmento de ADN (cuyos extremos se ven en la figura).

Le pedimos que elija que primer utilizaría para la reacción de amplificación del listado brindado, especificando cual sería el primer forward y cual el reverse.

5’ - GACCTGTGGAAGC-------------------------------------CATACGGGATTG 3’ 3’ - CTGGACACCTTCG--------------------------------------GTATGCCCTAAC 5’ Primers 5’ - GACCTGTGGAAGC -3’ 5’ - CATACGGGATTG - 3’ 5’ - CTGGACACCTTCG -3’ 5’ - GTATGCCCTAAC - 3’ 5’ - CGAAGGTGTCCAG-3’ 5’ - GTTAGGGCATAC - 3’ 5’- GCTTCCACAGGTC -3’ 5’ - CAATCCCGTATG - 3’ Recordar que: - Primer Forward o S: es el que posee la secuencia de la cadena S (+) y que es

complementario a la cadena AS (-). - Primer Reverse o AS: es el que tiene la secuencia de la cadena AS (-) y que es

complementario a la cadena S (+) o codificante. 6) La técnica de PCR seguida de un ensayo de Ligamiento de Oligonucleótidos,

OLA (Oligonucleotide Ligation Assay) es un método importante para testeo de numerosas muestras, provee un rápido camino para detectar diferencias de un único nucleótido. Este ensayo usa pares de oligonucleótidos: uno para secuencia (normal o mutada) marcado con biotina y otro común marcado con fluoresceína.

Básicamente la técnica consiste en el ligamiento enzimático de dos oligonucleótidos que hibridan uno al lado del otro de la mutación sobre el fragmento de ADN amplificado por PCR. Cuando hay un mal alineamiento de bases (mismatch) no se produce el ligamiento entre los oligonucleótidos.



El ligamiento de oligonucleótidos ha sido un método muy utilizado para la

detección de la mutación responsable para la anemia falciforme. (A)Secuencia de β-globina: Secuencia normal (β-WT) ATGGTGCACCTGACTCCTG A GGAGAAGGTCTGCCGTTACTG Secuencia de células falciformes (βF) ATGGTGCACCTGACTCCTG T GGAGAAGGTCTGCCGTTACTG (B) Oligonucleótidos:

1) βWT Oligo biotina-ATGGTGCACCTGACTCCTGA

2) βF Oligo biotina-ATGGTGCACCTGACTCCTGT 3) Oligo marcado con fluoresceína: GGAGAAGGTCTGCCGTTACTG* En este ensayo, pares de oligos se hibridan sobre ADN de los individuos e incubados

en presencia de ADN ligasa. Los oligos biotinilados son unidos a estreptavidina que tapiza una microplaca de 96well. Luego se agregan reactivos para el desarrollo de color por ELISA.



- En la línea 1 se incuba con los oligos 1+3 y en la línea 2 se incuba con los oligos 2+3.

A) En las líneas A-G se colocan los productos de PCR (ADN) de los distintos

pacientes analizados. Interprete el genotipo y fenotipo para cada paciente. 7) Referido al problema anterior, explique cómo realiza los controles de la técnica: A) Control de hibridación. B) Control de contaminación de PCR. C) Control de mutación.

- Si en la línea 3 se incuba con los oligos 1+3 y en la línea 4 se incuba con los oligos 2+3, dibuje como se observaría, los controles antes mencionados.

8) El receptor de insulina es una glicoproteína de superficie que media una

acción de la insulina sobre las células blanco. El receptor es el producto de un único gen autosómico en humanos. Una mutación recesiva en este gen es la causa de un tipo de diabetes mellitus no insulino dependiente. Se estudió una familia en la cual el casamiento entre primos produjo dos hijos con diabetes con insulino resistencia. A continuación se muestra el árbol genealógico que incluye a dicha pareja y su descendencia.

Usando como sonda el gen clonado del receptor de insulina humano se detectaron

RFLPs que definen tres haplotipos (alelos A, B y C) para una combinación de dos enzimas de restricción:

Alelo A: da dos bandas: 9.3Kb y 5,4Kb. Alelo B: da dos bandas: 9.3y 5.8 Kb. Alelo C: da dos bandas: 7.5y 5.8 Kb Los Southern Blot de los 8 integrantes de la familia son los siguientes:

Teniendo en cuenta que los padres son portadores sanos del gen defectuoso, resuelva: A) Escriba los genotipos (AA, AB, BB, BC, CC, etc.,) de todos los integrantes de



esta familia. B) ¿Cuáles son los dos hijos enfermos? C) ¿Cuál es el haplotipo asociado al defecto genético? D) ¿Qué genotipo no resultó representado en la progenie? 9) Se estudiaron 6 pacientes diagnosticados bioquímicamente con β-talasemias en

la Unidad de Hematología del CSSL. Se extrajo ADN genómico a partir de una muestra de sangre. Se amplifico un fragmento de 536 pb del gen y se analizó por DOT BLOT las mutaciones puntuales ubicadas en el nucleótido 1, 6 y 110 del IVS-I (intrón 1) y el codón 39 del exón 2 del gen de β-globina. Se usaron sondas ASO, (ver figura a continuación).

En donde N: es la secuencia normal y M: es la secuencia mutada.

Los pacientes se enumeran desde 1 al 6. Los ADN 7 y 8 corresponden a controles

del laboratorio. (7) paciente que no presenta ninguna de las mutaciones analizadas; (8) paciente con talasemia mayor, homocigoto para la mutación codón 39 del exón 2 del



gen. A) Confeccione un informe para los pacientes con las mutaciones analizadas. B) De acuerdo al genotipo: ¿cuál sería el fenotipo de cada uno de los pacientes

(talasemia mayor o talasemia menor)? 10) Los RFLP pueden ser usados para seguir la herencia de una determinada

enfermedad. Una pareja se somete a consejo genético debido a la presencia de antecedentes familiares de una enfermedad genética que produce retraso mental y anormalidades en el desarrollo del SNC y que se transmite con un rasgo autosómico recesivo. Se sabe que un hermano de la abuela paterna sufrió la enfermedad.

Los posibles alelos correspondientes a los polimorfismos hallados podrían generar el

siguiente patrón de bandas: A: 19,9 + 17,5. B: 32,5 + 4,9. C: 36,2 + 1,2. D: 32,5 + 3,7 + 1,2. E: 18,7 + 17,5 + 1,2. F: 17,5 + 15 + 4,9. G: 17,5 + 15 + 3,7 + 1,2

A) A partir de los alelos planteados escriba el genotipo de cada uno de los

integrantes de la familia.



B) Marque adecuadamente en el árbol genealógico los individuos portadores de la mutación.

C) Dibuje el patrón de restricción que indicaría que el feto posee la enfermedad. Indique cuál es el alelo asociado a la enfermedad.

D) ¿Pueden existir en la población individuos que no presenten esta enfermedad y que posean un patrón de restricción igual al de los individuos de esta familia? Justifique

11) Las β-talasemias son enfermedades comunes en personas de origen

mediterráneo. En la mutación non sense en el codón 39 del exón 2 del gen de β-globina hay un cambio de una C por T que genera una perdida (*) de un sitio de corte para la enzima MaeI. Es la mutación más común en población de origen español. Basándose en la siguiente figura, resuelva:

A) Complete en el esquema indicando cual es alelo talasémico y el normal. B) Determine el genotipo de los pacientes 1,2 y 3.

12) Se estudia una familia numerosa en la que existen algunos miembros que están

afectados de una enfermedad autosómica dominante de manifestación tardía (aproximadamente a los 40 años). Se liga la mutación a la presencia de un RFLP asociado a un corte de la enzima de restricción TaqI. Se extrae ADN de los integrantes de la familia, se digiere con TaqI y se somete a electroforesis, se transfiere a una membrana por técnicas de Southern Blot y se hibrida con una sonda marcada. La sonda usada es un fragmento de ADN humano clonado en un plásmido bacteriano. A continuación se muestra el autorradiograma correspondiente a cada miembro del pedigrí, en base a ello, resuelva:

A) Esquematice los alelos dominante y recesivo (A y a) para el segmento estudiado,



indique longitud en Kb y los sitios de corte de la enzima TaqI. B) Basado en lo anterior, indique el genotipo de todos los integrantes de la familia. C) ¿Cómo podría explicarse el patrón de restricción hallado en el último hijo?

13) Se extrae ADN de dos alumnos diferentes 1 y 2. En separados experimentos el

ADN de cada alumno se corta con las enzimas de restricción A, B y C. Los fragmentos se separan por electroforesis. Se muestra el mapa hipotético de un fragmento de 10 Kb de un cromosoma humano. El alumno 2 tiene mutaciones puntuales que eliminan los sitios de restricción B* y C*. Se transfiere a una membrana por técnicas de Southern Blot y se incuba con una sonda mostrada en el esquema, marcada radiactivamente. Se expone la membrana a una película de rayos X.

A) ¿Cuál es el fundamento de marcación de una sonda por el método de random primer?

B) Indique donde se verían las bandas en la película.





Ejercicios Propuestos 1) Se ha descrito la presencia en la población mediterránea de un alelo mutado en

posición IVS-1 nt1 (G-A) del gen β-globina que gana un sitio de corte para la enzima BspMI. La familia representada en el árbol se somete al estudio molecular para esta mutación. Los individuos representados como enfermos presentan β-talasemia mayor. Le pedimos:

A) Escriba la estrategia de laboratorio para la realización de una PCR-RFLP, que seguiría para el diagnóstico de esta mutación (paso a paso).

B) Dibuje como se verá el gel con cada uno de los integrantes de la familia. Suponga un producto de PCR de 600pb y el corte de BspMI origina dos fragmentos (450 y 150pb)

2) Una familia de un paciente con fibrosis cística se somete a estudio molecular para la detección de portadores y confirmación de homocigotas. Para ello se extrajo ADN de los 6 integrantes de la familia por el método de extracción salina, mutagénesis mediada por PCR para la mutación dF508 y corte con la enzima de restricción MboI. Al final se corrió un gel de poliacrilamida al 12% y se tiño con bromuro de etidio y se observó en el transiluminador.

A) Dibuje el pedigrí de la familia indicando el genotipo y el fenotipo de cada uno

de sus integrantes. (Señale como -/- Ausencia de la mutación analizada; +/+ homocigota para la mutación analizada y +/- heterocigota o portador para la mutación analizada).

B) Explique que son cada una de las bandas observadas en el padre, y en los hijos 1, 2 e Indique tamaño.



C) ¿Qué es un heteroduplex y cuando se forman? ¿Cuántos homoduplex conoce y a que pacientes corresponden?

3) Defina temperatura de fusión del ADN. 4) Defina que es sonda o probe y cuál es su utilidad. 5) La hebra molde de un ADN sufre el proceso de la transcripción para dar un ARN

primario. Por ello, dicha hebra recibe también el nombre de cadena no-codificante, no-informativa, antisentido o cadena (-). ¿Es esto correcto?

6) Un fragmento de ADN tiene esta secuencia en una de sus hebras:

5'-GTAGCCTACCCATAGG-3' Si se transcribe un ARNm a partir de este ADN, usando como molde la hebra

complementaria a la mostrada, ¿cuál será la secuencia de dicho ARNm? 7) La región estructural de un gen eucariótico contiene: (a) secuencias internas no codificantes, llamadas: (b) secuencias internas codificantes, llamadas: (c) secuencias terminales no codificantes, llamadas: Indicar a continuación cuál de las siguientes afirmaciones es correcta: A) Las secuencias (a) desaparecen en la transcripción del gen. B) Las secuencias (b) desaparecen en la maduración postranscripcional del ARNm

primario. C) Las secuencias (c) desaparecen en la traducción del ARNm. D) Las secuencias (c) desaparecen durante la maduración postraduccional de las

proteínas. 8) Indique la terminología empleada en la transcripción para: A) Distinguir entre la hebra de ADN que se transcribe y la que no se transcribe. B) Identificar la posición (orientación) de los nucleótidos en la hebra que se

transcribe con referencia al nucleótido +1 considerado como origen de la transcripción. 9) ¿Qué es un intrón? ¿Dónde se encuentra? ¿Conoces otro nombre equivalente? 10) En la figura se observa la secuencia del exón 11 del gen CFTR humano. Se

encuentra la mutación G542X. Ud. debe realizar un diagnóstico molecular. Desea amplificar por PCR la zona comprendida entre los nt 310 y 603. Las regiones denotadas con corchetes marcan donde hibridan los primers.



Sería entonces correcto afirmar: A) El primer que hibrida en la posición 580-603 se lo llama Sense porque tiene la

secuencia de la hebra (+). B) La secuencia del primer F es G CAG AGA AAG ACA ATA TAG TTC T. C) La secuencia del primer F es A TTA TGG TTA CTC AGA ATC TGT GC. D) El primer que hibrida en la posición 310-332 se lo llama AS porque tiene la

secuencia de la hebra (-). E) El tamaño del producto de amplificación es de 247 pb. 11) Usted solicitó la síntesis de 4 primers a la empresa IDT® (Biodynamics,

Argentina). Según los datos suministrados con los mismos, marque la opción correcta

A) El primer ∆F508-S debe resuspenderse en 250.6 µl de buffer TE, a fin de obtener

una solución que contenga 50 pmoles/µl. B) El primer ∆F508-AS debe resuspenderse en 1230 µl de buffer TE para obtener

una solución con concentración final de 100 pmoles/µl. C) El primer G542X-S debe resuspenderse en 4680 µl de buffer TE para obtener

una solución con concentración de 25 pmoles/µl. D) El primer G542X-AS debe resuspenderse en 2420 µl para obtener una solución

con concentración de 50 nmoles/µl. E) Ninguna opción es correcta. 12) Ud necesita preparar 150 µl de una mix de los 4 dNTPs que tenga una

concentración de 5mM de cada uno de ellos, para llevar a cabo una reacción de PCR. Las soluciones madre de las que dispone son:

dATP: C: 100mM; V: 100µl. dCTP: C: 100mM; V: 100µl. dTTP: C: 100mM; V: 200µl. dGTP: C: 100mM; V: 100µl. C: concentración; V: volúmen Le pedimos que marque la opción correcta:



A) Ud. Debe tomar 0.75 µl de cada uno de los 4 dNTPs y completar a 150 µl con agua.

B) Ud. Debe tomar 7.5 µl de cada uno de los 4 dNTPs y completar el volumen con 120µl de agua.

C) Ud. Debe tomar 10 µl de cada uno de los 4 dNTPs y completar con agua, para lograr la concentración deseada.

D) No importa el volumen que se tome de las soluciones madre de dNTPs, ya que todas vienen con concentración 100mM.

E) Ninguna opción es correcta.



Guía de estudio: Trabajo Práctico Nº1

Fuente: Genética en Medicina, Thompson y Thompson. 7ma Edición. Capítulo 4: Herramientas Utilizadas por la Genética Molecular Humana.

1) Definición de los conceptos más usados en genética molecular humana:Hibridación; Reacción en Cadena de la Polimerasa; Cebadores para PCR; Sonda;Endonucleasas de restricción; Transferencia Southern.

2) Métodos de análisis de los ácidos nucleicos. A) Transferencia Southern: Características; Fundamento de la técnica; usos. B) Análisis con sondas de oligonucleótidos con especificidad de alelo: Definición de

sonda alelo específica. Características. Diferencias entre este tipo de análisis y la técnica del Southern Blot.

C) Transferencia Northern: Características. 3) Reacción en Cadena de la Polimerasa: Fundamento de la técnica; características.

Distintas aplicaciones. 4) Análisis de secuencias de DNA: Secuenciación de Sanger; fundamentos. Usos

relacionados con la genética en humanos.

Capítulo 5: Ensayos de hibridación del DNA Todo el capítulo, a excepción del título: “La cinética de la rasociación del DNA está

definida por el producto de la concentración del DNA por el tiempo (C0t)”.

Fuente: La Célula, Alberts. Capítulo 7: Tecnología del DNA Recombinante

1) Fragmentación, Separación y Secuenciación de moléculas de DNA. A) Endonucleasas de Restricción: características; modo de acción; usos. B) Mapas de Restricción: concepto; obtención de mapas de restricción. C) Separación de Moléculas de DNA Mediante Electroforesis en Gel: fundamento

de la técnica; tipo de geles usados; características de cada uno. D) Marcación de Moléculas de DNA: marcación interna y terminal; usos. 2) Hibridación de Ácidos Nucleicos. A) Análisis de Polimorfismos de Longitud de los Fragmentos de Restricción

(RFLP): conceptos de mutación y polimorfismo; concepto de mapa de ligamiento. Análisis de RFLPs: fundamento; aplicaciones; consideraciones más importantes de la técnica.

B) Hibridación Poco Rigurosa de Sondas: condiciones de hibridación rigurosa y no rigurosa de ácidos nucleicos; usos de la detección de secuencias mediante hibridación rigurosa y no rigurosa con sondas de ácidos nucleicos.



GLOSARIO Alelo: Una de las diferentes formas de un gen que pueden darse en un único locus Alelo recesivo: Alelo cuyo fenotipo no se manifiesta en el heterocigota. RFLP, Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción: Son las

variaciones entre individuos de una población, en la longitud de ciertos fragmentos de restricción dentro de las que se dan ciertas secuencias genómicas. Estas variaciones aparecen como resultados de cambios raros de secuencia que crean o destruyen sitios de restricciones en el genoma.

Wild Type, Tipo salvaje: Fenotipo normal (sin mutar).



BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:

1- Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT, Lewontin RC, G elbart WM . Genética. Mc Graw – Hill. Interamericana. 7° Edición. Capítulo 12 y 13: Tecnología del ADN Recombinante y Aplicaciones de la Tecnología del ADN Recombinante (Disponible copia digital en la cátedra).

2- Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts y James D. Watson: Biología Molecular de la Célula: Capitulo 7: Tecnología del ADN recombinante. Garland Publishing.

3- Albert L. Lehninger, David L. Nelson y Michael M. Cox. Principios de Bioquímica. Capitulo 25: Metabolismo RNA. Ediciones Omega SA

4- JD Watson, TA Baker, JP Bell, A Gann, M Levine & R Losick: Molecular Biology of the gene. Fifth Edition. Benjamin Cummings & Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2004. (Disponible copia digital en la cátedra).

5- Wilson J & Hunt T . Molecular Biology of the Cell. The problem book. Garland Publishing.



TP N°2: PCR-I PROBLEMAS PRÁCTICOS PARA LA ESTANDARIZACION DE

UNA REACCION DE PCR

Dra. Silvia Mabel Varas Objetivos:

- Establecer las tareas a realizar en cada área de un laboratorio que realiza PCR. - Analizar y resolver problemas prácticos que surgen en la estandarización de una

reacción de PCR. - Realizar todos los cálculos necesarios para preparar la mezcla maestra de la

reacción de PCR. - Conocer la nomenclatura para la solicitud de síntesis de oligonucleótidos. - Integrar todos estos conocimientos con la preparación de todos los reactivos

usados en la etapa pos-PCR. Las tareas a realizar en cada área de PCR son:

I. Área de Pre-PCR: � Preparación de reactivos: Mix de dNTPs, pedido y dilución de primers. � Preparación de la dilución de las muestras de ADN.

II. Área de PCR: � Realización de la Master Mix. � Reparto de la Master Mix y realización de la PCR. � Cuidados con la contaminación.

III. Área de Post-PCR: � Preparación de geles de poliacrilamida: reactivos. � Preparación de las muestras para sembrar en los geles. � Siembra de las muestras. � Teñido del gel. Reactivos y cuidados. � Interpretación de los resultados.

I. ÁREA DE PRE-PCR: � PREPARACIÓN DE REACTIVOS: MIX DE dNTPS, PEDIDO Y

DILUCIÓN DE PRIMERS.

1. PREPARACIÓN DE LA MIX DE dNTPS. Ud. necesita preparar 100 µl de una mezcla (mix de los 4 d-NTPs) necesarios para la

reacción de PCR y que tenga una concentración de 2,5 mM de c/u de ellos. ¿Cómo realiza esta preparación?

PD: le suministramos copia de las características provistas por el proveedor (PROMEGA, Biodynamics, Argentina).



2. PEDIDO DE PRIMERS: ESTUDIO Y CONFIRMACIÓN DE LA SECUENCIA DE LOS INICIADORES O CEBADORES (PRIMERS).

Dada la secuencia del gen CFTR (Exón 10) se muestran los corchetes donde

deseamos que hibriden los primers. Le pedimos que complete la planilla de pedido de oligonucleótidos, para solicitar al proveedor que sintetice los primers.

Human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene, exon 10.

ACCESSION: M55115 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=306520) ORIGIN 1 cactgtagct gtactacctt ccatctcctc aacctattcc aactatctga atcatgtgcc 61 cttctctgtg aacctctatc ataatacttg tcacactgta ttgtaattgt ctcttttact 121 ttcccttgta tcttttgtgc atagcagagt acctgaaaca ggaagtattt taaatatttt 181 gaatcaaatg agttaataga atctttacaa ataagaatat acacttctgc ttaggatgat 241 aattggaggc aagtgaatcc tgagcgtgat ttgataatga cctaataatg atgggtttta 301 tttccagact tcacttctaa tgatgattat gggagaactg gagccttcag agggtaaaat 361 taagcacagt ggaagaattt cattctgttc tcagttttcc tggattatgc ctggc[accat 421 taaagaaaat atcat]ctttg gtgtttccta tgatgaatat agatacagaa gcgtcatcaa 481 agcatgccaa ctagaagagg taagaaacta tgtgaaaact ttttgattat gcatatgaac 541 ccttcacact acccaaatta tatatttggc tccatattca atcggttagt ctacatatat 601 ttatgtttcc tctatgggta agctactgtg aatggatcaa ttaataaaac acatgacc[ta 661 tgctttaaga agcttgca]aa cacatgaaat aaatgcaatt tattttttaa ataatgggtt 721 catttgatca caataaatgc attttatgaa atggtgagaa ttttgttcac tcattagtga 781 gacaaacgtc tcaatggtta tttatatggc atgcatatag tgatatgtgg t





3. PREPARACIÓN DE LA DILUCIÓN DE PRIMERS. Ud. solicito la síntesis de los primers que necesita a la empresa Annovis Inc.

(Biodynamics, Argentina). Le envían el par de primers y la siguiente planilla adjunta a los mismos:

En el protocolo de PCR Ud. necesita que 25 pmol de c/u estén contenidos en 1 µl de

solución Buffer TE (Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH= 8,0). ¿Con qué volumen retoma esos primers para tener esa solución y cómo prepara el buffer de dilución?

PMTris= 121,1 g/mol PMEDTA.2H2O= 372,2g/mol



� PREPARACIÓN DE LA DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS DE ADN. 1. CUANTIFICACIÓN DEL ADN. Para realizar la cuantificación del ADN existen dos métodos ampliamente usados: a) Espectrofotométricamente: Tiene como condición para su lectura que debe

tratarse de muestras puras (sin cantidades significantes de contaminantes tales como proteínas, fenol, agarosa u otros ácidos nucleicos). Se basa en la cantidad de luz ultravioleta que absorben las distintas bases nitrogenadas que conforman la muestra. La lectura se realiza a 260 nm.

b) Cuantificación Fluorescente con GelRed: Si la cantidad de ADN es muy pequeña o si contiene cantidades significativas de impurezas, la cantidad de ácidos nucleicos puede ser estimada por la intensidad de fluorescencia emitida corriendo un gel de agarosa con GelRed.

a) Determinación Espectrofotométrica de las cantidades de ADN Se cuantifica el ADN leyendo a 260 nm y 280 nm. La lectura a 260 nm calcula la concentración de ácidos nucleicos en la muestra. La lectura a 280 nm da idea de la presencia de proteínas como factor de impureza. Una densidad óptica de 1 corresponde a ≅ 50 µg /ml ADN doble cadena o ≅ 40 µg

/ ml ADN simple cadena y ARN. La relación entre las lecturas a 260 y 280 nm (A260/A280) da una idea de la pureza del

ácido nucleico. Preparaciones puras de ADN y ARN tienen valores de A260/A280 entre 1,8 y 2,0. Si hay contaminación con proteínas o fenol la relación será significativamente menor. Ejemplo de cuantificación: ¿Cuál es la concentración de ADN doble cadena de una

muestra cuya absorbancia es de A260=0,089? Se realizó una dilución 1/100 de la solución madre.

Rta: La concentración de ADN doble cadena es = 0,089x 50 x 100= 445 µg/ml b) Cuantificación Fluorescente con testigos de concentración conocida de

ADN. Se realiza una electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Se siembra en una calle una

muestra de ADN de concentración conocida y en las otras, las muestras a cuantificar. Se calcula la concentración por la intensidad de fluorescencia emitida al UV con

GelRed, comparándola con la emitida por los testigos. Concentración de ADN de los testigos: 1, 1.5, 2, 3 y 5 μg/ml.

2. PREPARACIÓN DE LA DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS DE ADN En la preparación de la master mix se necesita que 1µg de ADN estén contenidos en

5µl de agua bidestilada estéril. Complete la siguiente tabla a partir de las densidades ópticas dadas. Suponga que todas las muestras han sido cuantificadas en una dilución 1/100.



Muestra A260 ADN µg/ml Volumen de solución madre que contienen 1 μg de

µl de H2O (c.s.p.* 5 µl)

1 0,0571 µl

2 0,0785 µl

3 0,2828 µl

4 0,0663 µl

5 0,0750 µl

6 0,0877 µl

*c.s.p.: cantidad suficiente para.

II. ÁREA DE PCR: � REALIZACIÓN DE LA MASTER MIX. En un tubo eppendorf de 1,5 ml estéril medir los siguientes componentes:

8. Repartir 20 µl de la master mix en cada tubo de PCR (200 µl) que contiene 1 µg

de ADN en 5 µl de agua Ciclado:



III. ÁREA DE POST-PCR: � PREPARACIÓN DE GELES DE AGAROSA Y POLIACRILAMIDA:

REACTIVOS Y PROCEDIMIENTO. 1. PREPARACIÓN DE GELES DE AGAROSA:

a) Agregar la agarosa al 1% p/v en un erlenmeyer que contenga el volumen necesario de buffer TBE (Tris-Ácido Bórico-EDTA) 1X.

b) Disolver la agarosa en el horno de microondas. c) Dejar enfriar la solución a 50ºC y agregar una solución stock de GelRed, a una

concentración final de 0,5 X. d) Volcar en la gelera preparada con el peine. e) Dejar solidificar. f) Extraer el peine. g) Agregar 150 ml del buffer de corrida en la gelera. h) Siembra: colocar en un Eppendorf de 0,5 ml: • 5 µl del ADN resuspendido + 7 µl del Buffer de siembra i) Realizar un spin en la centrifuga y sembrar los 12 µl por inmersión, ver figura.

2. ELECTROFORESIS:

1. Conectar los terminales eléctricos a la fuente de poder. 2. Aplicar un voltaje constante, a razón de 4V/ cm. 3. Dejar correr hasta ≅ unos 4-5 cm por lo menos desde el lugar de siembra. 4. Desconectar la fuente de poder. 5. Retirar el gel y llevarlo al cuarto oscuro para observar la fluorescencia emitida en

el transiluminador. � Llegado este momento los alumnos se protegerán de la radiación ultravioleta

emitida con protectores oculares adecuados (�) y no se expondrán por demasiado tiempo a dicha radiación.



Reactivos utilizados:

• Buffer de corrida: TBE 1X con GelRed 0,5X. • Solución Madre de TBE 5X, pH=8:

Tris Base……...........54 g Ac. Bórico….….…27,5g EDTA 0,5M…..….. 20 ml H2O csp…..……..1000 ml

• Solución Stock de GelRed: 10.000X en agua. • Buffer de siembra 6 X:

30 % glicerol (v/v en H2O ). 0,25 % azul de bromo fenol.

Consideraciones importantes:

• Los buffer de siembra cumplen tres funciones: (1) aumentan la densidad de la muestra, de esa forma permanecen en el well o pocillo de siembra del gel, (2) añaden color a la muestra, de esa forma permiten una mayor visualización de la misma, como así también del frente de corrida y (3) contienen sustancias que en un campo eléctrico se mueven hacia el ánodo (+) a velocidades predecibles. Así, el Azul de Bromo Fenol migra en un gel de agarosa al 1% ≅ como un ADN doble cadena lineal de 300 pb.

• El GelRed es un colorante diseñado para reemplazar al bromuro de etidio cuando se trabaja con transiluminadores de luz UV clásicos. Tiene una sensibilidad aun mayor que el EtBr y es más seguro. La seguridad es tanto para el operador como para el medio ambiente, las soluciones de trabajo y los geles pueden descartarse directamente en la pileta o con el resto de la basura no peligrosa del laboratorio. Presenta un espectro de absorción de alrededor de 280-300nm y de emisión de la fluorescencia en los 600 nm (Ver figura). Una característica sobresaliente es la estabilidad, aun frente a la luz y la



posibilidad de almacenarlo incluso a temperatura ambiente sin que esto se traduzca en ningún tipo de detrimento de su actividad o funcionalidad. Otra ventaja, también desde el punto de vista de su toxicidad, es que vienen diluido en agua y no en DMSO como por ejemplo el SYBR Safe.

En resumen, las principales características del colorante GelRed son:

• No es mutagénico. • No es citotóxico. • Detecta ADN simple doble cadena y RNA en gel de agarosa y poliacrilamida. • Compatible para calentarse en microonda. • No necesita protección de la luz para cuando se tiñe el gel.

3. PREPARACIÓN DE GELES DE POLIACRILAMIDA: Ud. debe preparar 10 ml de un gel de poliacrilamida al 12 %. En la siguiente tabla se

le suministran los volúmenes que debe medir de acrilamida, agua, TBE 5X, Persulfato de amonio (PSA) y TEMED de acuerdo al porcentaje final de acrilamida en el gel.

Reactivos 3,5% 5,0% 8,0% 12,0% 20%

Agua 67,7 ml 62,7 ml 52,7 ml 39,3 ml 12,7 ml

Acrilamida 30% 11,6 ml 16,6 ml 26,6 ml 40,0 ml 66,6 ml

TBE 5X 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml 20 ml

PSA 10% 0,7 ml 0,7 ml 0,7 ml 0,7 ml 0,7 ml

Añadir 35 µl de TEMED por cada 100 ml de solución de acrilamida

En un tubo eppendorf colocar 2 µl del buffer de siembra + 8 µl del producto de PCR.

Sembrar todas las muestras. En otra calle, sembrar 5 µl del Marcador de Peso Molecular (100pb).



El Buffer de siembra contiene azul de bromofenol y xilenocianol como marcadores

del frente de corrida. De acuerdo a la concentración del gel, marcan el frente de corrida en los tamaños indicados en la siguiente tabla:

% gel Azul de bromofenol Xilanocianol

3,5 100 pb 460 pb 5,0 65 pb 260 pb 8,0 45 pb 160 pb 12,0 20 pb 70 pb 15,0 15 pb 60 pb 20,0 12 pb 45 pb

ELECTROFORESIS: 1. Para los geles de poliacrilamida se usa un sistema de electroforesis vertical. 2. Conectar los terminales eléctricos a la fuente de poder. 3. Correr a 100 V en Buffer TBE 0,5X 4. Desconectar la fuente de poder. 5. Terminada la corrida, sacar el gel y teñir 10 minutos con una solución de GelRed

1X dentro de un recipiente. Solución Madre: 10.000X contenidos en 0,5 ml Solución de Trabajo Recomendada por los proveedores: 1X (1µg/ml) Problema: ¿Qué volumen de GelRed debe medir para 10 ml de agua tengan la concentración

recomendada (1X)? 6. Retirar el gel y llevarlo al cuarto oscuro para observar la fluorescencia emitida

en el transiluminador.





BIBLIOGRAFIA CONSULTADA: 1- Curso: Aplicaciones de la Ingeniería Genética al Diagnóstico de Enfermedades

Hereditarias y Filiación. Cátedra de Genética y Biología Molecular. FFyB. UBA. 2- Sambrook, Fritsch and Maniatis: “Molecular Cloning”. A Laboratory Manual 2º

Edición- Tomo 1, 2 y 3. 1989.



TP N°3: PCR-II AMPLIFICACIÓN DE UN FRAGMENTO DEL GEN DE CFTR

MEDIANTE LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

� Diagnóstico molecular de Portadores de la Mutación ∆F508 por Mutagénesis Dirigida

� Diagnóstico molecular de la mutación ∆F508 y G542X por MAS-PCR (PCR Múltiple Alelo Específica)

Dra. Silvia Mabel Varas – Dra. María Gabriela Lacoste

Objetivos: - Conocer el fundamento de la reacción de amplificación de fragmentos de ADN. - Establecer las normas de seguridad para impedir riesgos de contaminación de

los productos amplificados. - Aplicar las técnicas de PCR Múltiple Alelo Específica (MAS-PCR) y de

Mutagénesis Dirigida mediada por PCR para ser utilizadas como herramientas diagnósticas de las mutaciones dF 508 y G452X.

- Interpretación de los resultados obtenidos; justificación del uso de controles. - Conocer la nomenclatura para la solicitud de primers.

NORMAS QUE SE DEBEN CUMPLIR EN UN LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR CLÍNICO

Además de las prácticas habituales de bioseguridad en el laboratorio y del

cumplimiento de los programas de control de calidad requeridos para garantizar la calidad de un resultado, el laboratorio de diagnóstico molecular clínico debe cumplir con otros requisitos, como son las áreas de trabajo separadas. Dichas áreas son:

AREA 1: Preparación de reactivos. AREA 2: Preparación de muestras. AREA 3: Amplificación y detección de resultados. AREA 1 En ésta se preparan las soluciones de trabajo, se almacenan los reactivos y las mezclas

para las reacciones de amplificación. Consideraciones: • La superficie de trabajo debe limpiarse y descontaminarse con una solución de

hipoclorito de sodio al 10% (ésta debe ser preparada diariamente) seguido de un lavado con Etanol 70%. Además, siempre se trabajará sobre papel absorbente, el cual debe ser removido una vez terminado el trabajo.

• Las pipetas son exclusivas de esta área y no deben ser trasladadas a otras. • Dentro de lo posible, utilizar tips antiaerosoles (especialmente al trabajar con

ARN). • Por su seguridad y para evitar contaminación, DEBE USAR GUANTES EN

TODO MOMENTO. • Los guantes deben cambiarse al cambiar de área de trabajo y deben ser

cambiados periódicamente durante el trabajo. • Las muestras deben guardarse separadas de los reactivos para no contaminar

estos últimos.



AREA 2 En esta área se preparan las muestras y las mezclas para las reacciones de

amplificación. Aquí se debe disponer de cabinas biológicas especiales, en las que se debe considerar:

• En caso de usarse campana UV, desconectar la luz ultravioleta antes de introducir los brazos y las manos en esta área de trabajo.

• La superficie de trabajo debe estar lista media hora antes de iniciar el procedimiento de preparación de la muestra.

• Las pro-pipetas, pipetas y otros componentes del equipo que se usan en la preparación de la muestra deben permanecer en esta cabina todo el tiempo.

• Todo el material remanente debe ser descartado en contenedores con hipoclorito de 10%.

AREA 3 Las muestras listas para amplificación son sometidas a PCR y a continuación los

productos de la misma podrán ser detectados utilizando diferentes alternativas. • Esta área debe mantenerse aislada para evitar la contaminación por aerosoles. • Las pipetas de esta área nunca deben ser trasladadas a las anteriores. • Dentro de lo posible, los productos de amplificación deben ser pipeteados con

tips con puntas antiaerosoles, ya que una pipeta contaminada puede dar lugar a resultados FALSOS POSITIVOS.

• Una vez realizada la interpretación de resultados, todo el material debe ser descartado en hipoclorito 10% y se debe limpiar exhaustivamente el lugar de trabajo.

• Cuando los productos sean visualizados en geles de agarosa expuestos a luz UV, recordar que la exposición del operador debe ser mínima y siempre se debe usar máscara protectora y anteojos.



REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) Reacción que involucra repetidos ciclos de calentamiento y enfriamiento, en el cual

se producen copias en forma logarítmica de un segmento de ADN determinado, el cual está limitado por un par de primers específicos.

Pasos de la Reacción 1) El inicio de la reacción es a partir del ADN aislado de células, el cual es

calentado hasta que se separan las hebras complementarias, es la desnaturalización del ADN. Esto ocurre aproximadamente a 92-94 °C.

2) Estas hebras luego hibridan con un exceso de dos oligonucleótidos (de no más de 20 nucleótidos) que se sintetizaron químicamente y que se denominan “primers” o “cebadores”. Es el proceso conocido como hibridación o “annealing” . El segmento a amplificar (de una longitud de X nucleótidos, donde X generalmente está entre 50 hasta 2000 nucleótidos) se encuentra flanqueado por el par de “primers” como se muestra en el siguiente esquema:

Donde F es el primer “Forward ” (“va hacia adelante”), tiene la secuencia “sense”

y por lo tanto, se une por complementariedad a la cadena antisense. R: es el primer “Reverse” (“en contra”), tiene la secuencia de la cadena antisense y

entonces se une por complementariedad a la cadena sense. Esto ocurre aproximadamente entre 55-60 °C, siendo la temperatura específica para

cada primer. 3) Una vez unidos los primers, la temperatura se eleva para que pueda actuar la

ADN Polimerasa en el paso de elongación, copiando por complementariedad, a partir de los primers, las dos hebras de ADN. La enzima que se utiliza es la ADN Polimerasa aislada de una bacteria acuática termófila llamada Thermus aquaticus, de manera entonces, que a esta enzima se la nombró Taq ADN polimerasa, cuya temperatura óptima es de 72°C.

Estos tres pasos constituyen UN CICLO. La reacción se lleva a cabo durante “n”

ciclos (entre 30- 40 ciclos); de manera que la cantidad del fragmento de ADN deseado que se obtiene es de a x 2n (donde a: es la concentración inicial de ADN, 2 por ser 2 las hebras de la molécula de ADN y n: el número de ciclos realizados). En realidad este es el producto teórico que se obtiene, ya que también habría que tener en cuenta la EFICIENCIA de la reacción, que podría disminuir un poco este resultado).



Factores importantes a controlar: Temperatura de annealing o hibridación: es muy importante, ya que si es baja, la

hibridación es INESPECIFICA; y si es muy alta, no se da el apareamiento de los primers y no existe síntesis de ADN. Para que dicha temperatura sea la adecuada, hay que tener en cuenta: (1) la concentración de cationes de la mezcla y (2) el porcentaje de bases G y C en los primers.

La presencia de agentes que mejoran la especificidad en la hibridación, como la formamida, que por ejemplo, disminuye la temperatura de annealing.

Contaminación de la PCR Uno de los mayores problemas de la PCR es la posible contaminación con otros

ADN. Por este motivo, hay que usar guardapolvos, guantes, tips individuales, material estéril, etc.

Las posibles fuentes de contaminación son: 1. Contaminación pre-PCR: En la recolección del material estéril (siempre rellenar los envases y cajas de tips con

guantes) Contaminación con ADN de personas (piel, cabellos, manos, saliva, etc.) Por mala ventilación, siendo entonces una contaminación esporádica, En los reactivos de “Grado PCR” (enzimas, productos biológicos, Taq polimerasa,

buffer, etc). Existencia de productos amplificados en PCR previas (denominados contaminación

por amplicones). 2. Contaminación post-PCR: 1 µg de ADN humano contiene aproximadamente 1.4 x 105copias de un gen de copia

única, de manera que si al transferir producto de amplificación lo hago, por ejemplo, con un tip usado o mal esterilizado, aunque sea un volumen de 0.1µl, estoy transfiriendo 109 copias de un ADN “extraño”, pudiendo luego puedo obtener FALSOS positivos y contaminar el control negativo y, por lo tanto, invalidar la reacción global.

Preparación de las muestras: Antes de amplificar un lote de muestras de ADN se deben estandarizar las

condiciones tanto de la concentración óptima de MgCl2, como de la temperatura de annealing (la cual es específica para cada primer por los factores enumerados más arriba).

Se debe preparar primero una MASTER MIX, que contiene Buffer para la Taq polimerasa, nucleótidos a la concentración correspondiente, MgCl2, los dos primers, H2O y la enzima Taq polimerasa.

A esta Mix se la distribuye en los respectivos tubos de reacción, se agrega el ADN problema y se llevan los tubos al termociclador.



BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA: 1- Curso: Biología Molecular y Diagnóstico Clínico. Hospital Privado. Centro

Médico de Córdoba y Fundación para el Progreso de la Medicina. 2- Quantitation of mRNA by polymerase chain reaction. Nonradioactive PCR

Methods. Springer Lab.Manual. Köhler et al. ISBN 3540591923. 3- Giménez MS, Ciuffo GM, Oliveros LB, Zirulnik Z, Varas SM, Ramirez DC,

Alvarez SM, Depetris- Boldini C, Dodelson de Kremer R, Oller de Ramirez AM y Frechtel GD. Bioquímica Molecular. 2003. Nueva Editorial Universitaria. ISBN987-98436-7-3.

4- Publicaciones de la especialidad.



TRABAJO PRÁCTICO Introducción La fibrosis quística es la enfermedad autosómica recesiva más frecuente en la

población de raza caucásica. Aparece como consecuencia de mutaciones en el gen que codifica para el CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), esta proteína reguladora actúa como un canal iónico interviniendo en el transporte activo de electrolitos como son los iones cloruros. El gen para la CFTR consta de 250 Kb y está ubicado en el cromosoma 7. La mutación más frecuente que da origen a la enfermedad es la conocida como ∆F508 que implica una deleción de 3 pb en el exón 10 con la consiguiente pérdida de Fenilalanina en la estructura proteica. Esta mutación es la responsable de la patología con un 60-90% de frecuencia en las poblaciones de origen caucásico; aunque existen otras mutaciones que producen modificaciones en el marco de lectura, afectan el sitio de splicing, producen codones stop, etc, todas ellas alterando la proteína CFTR y dando origen la enfermedad.

Diagnóstico El diagnóstico estándar de la fibrosis quística se realiza basado en la sintomatología

clínica del paciente, sus antecedentes familiares y realizando el Test del sudor. Se sospecha de FQ con:

• La presencia de una o más de las siguientes características fenotípicas: 1) Enfermedad sinusopulmonar crónica 2) Anormalidades gastrointestinales o nutricionales 3) Síndrome de pérdida de sal 4) Azoospermia • un hermano/a con FQ, • pesquisa neonatal positiva. Se confirma la patología con: • Resultado positivo de la prueba del sudor en al menos 2 ocasiones, • presencia de 2 mutaciones del CFTR causantes de FQ, • demostración de diferencia de potencial nasal transepitelial anormal. La Pesquisa Neonatal de FQ se realiza mediante la determinación de Tripsina

Inmunorreactiva (TIR) en manchas de sangre. En caso de que esta prueba resultase positiva, existen distintas estrategias para la confirmación de la enfermedad. Las mismas pueden ser: TIR/TIR o TIR/TIR/ADN (ver figura a continuación).



La confirmación bioquímica de FQ se realiza mediante el Test del Sudor. La prueba

consiste en la estimulación de las glándulas sudoríparas mediante iontoforesis con pilocarpina, la recolección del sudor y la cuantificación de la concentración de electrólitos en sudor (cloruro o cloruro y sodio) colectados en papel de filtro

Valores de referencia de Cloruros: • Valores normales: inferiores a 40 mmol/l. • Valores intermedios o dudosos: de 40-60 mmol/l. • Valores patológicos compatibles con diagnóstico de FQ: superiores a 60 mmol/l. Algunos datos evidencian que, en menores de 3 meses, una concentración mayor a

40 mmol/l es altamente sugestiva de diagnóstico de FQ. Estudios Moleculares realizados en la Argentina han mostrado un amplio espectro

de alteraciones en el gen CFTR. En total se han descrito 52 mutaciones diferentes: la mutación ΔF508 está presente en el 58-60% de los cromosomas FQ. La segunda mutación más frecuente es la G542X, presente en alrededor del 5% de los cromosomas. Otras 16 mutaciones (N1303K, W1282X, 1717-1G>A, 3849+10KbC>T, R334W, G85E, DI507, 2183AA>G, 2789+5G>A, 1811+1.6KbA>G, R1162X, R553X, R1066C, 621+1G-T, 3659delC y 1898+1G>A) presentan frecuencias cercanas al 1-2%, de acuerdo a la población analizada. El resto de las mutaciones se presentan con frecuencias menores.

El análisis conjunto de las mutaciones más frecuentes permite detectar, en promedio, alrededor del 75% de los alelos afectados en nuestra población.



A. AMPLIFICACION DE UN FRAGMENTO DEL GEN CFTR: DETECCIÓN DE LA MUTACIÓN ΔF508 POR MUTAGÉNESIS

DIRIGIDA MEDIADA POR PCR

Esta técnica se basa en la inserción artificial de un sitio de corte para una enzima de restricción generado por una modificación de un nucleótido en uno de los cebadores o primers. Específicamente, en esta técnica se utiliza un cebador forward (F) con un cambio puntual (C�G) en la base 433 (�) del exón 10 del gen del CFTR. Dicho cambio artificial es vecino al sitio de mutación ΔF508 (recordemos que en dicha mutación hay una pérdida del triplete CTT que codifica para el aminoácido fenilalanina).

La enzima MboI reconoce la secuencia (↓GATC). El cambio introducido genera un sitio de corte para la enzima MboI en el alelo sano, pero no aparece en el alelo con la deleción ΔF508, ya que debido a la ausencia del triplete no se puede completar la secuencia de reconocimiento para el corte de la enzima.

En el alelo normal hay corte con la ER (+) mientras que en el alelo mutado no hay corte (-).

Además, se eligió un cebador reverse (R) que permitiera la inclusión de un sitio de corte constitutivo para la enzima MboI, a efectos de servir como control interno de la actividad de la enzima de restricción (posición 634�).

Sin el corte con la enzima, el tamaño de los productos de amplificación será de 262 pb para el alelo normal y de 259 pb para el mutado. Luego del corte con la enzima, se observan los siguientes fragmentos para el alelo normal: 17 pb, 201 pb y 44 pb y para el alelo mutado: 215 pb y 44 pb.

PROTOCOLO



1) Preparación de las muestras: El volumen final de reacción de PCR será de 25 µl, de los cuales 20 µl son de la master mix o mezcla de reactivos. Conclusión: el ADN de la muestra debe estar contenido en 5 µl. A partir de los datos de concentración de su ADN muestra, calcule qué volumen de ADN debe tomar para tener 1 µg. En el caso de que este volumen sea menor a 5 µl, llevar a volumen con agua destilada estéril.

2) Rotular todos los tubos con el número de comisión que le corresponde. Identificar cuatro de los tubos de PCR con una M1, M2 y M3 (M: muestra) y al restante con el signo (-), ya que será su Control Negativo.

3) El tubo Eppendorf más grande (de 1500 µl) es el que usted utilizará para preparar la Master MIX. Antes de iniciar su preparado, tenga en cuenta el número de tubos que procesará: n (en su caso, 4). Multiplique TODOS los volúmenes de los componentes de la master mix por el número obtenido n + 1 (para asegurarse de que todos los tubos recibirán la misma cantidad de mix). En nuestro caso: son cuatro (4) tubos por mesada, entonces n+1=5. Multiplique entonces, todo por cinco.

Composición de la Master Mix

H2O (c.s.p. 20 μl)……………. 11,25 μl ….56,25 μl Buffer 10X………………….. 2,5 μl ….12,5 μl MgCl2 25 mM……………….. 2 μl ….10 μl dNTPs 2,5 mM………………. 2 μl x5 ….10 μl Primer S (25 pmol//μl)………. 1 μl ….5 μl Primer AS (25pmol/μl)……… 1 μl ….5 μl Taq pol (5U/μl)……………… 0,25 μl ….1,25 μl

(ACLARACION: c.s.p.: cantidad suficiente para) 4) Preparación de la master mix: Adicionar al tubo de 1500 µl los distintos

reactivos en orden de volumen decreciente (y vaya tildándolos para no agregar nuevamente un reactivo). La Taq polimerasa es la última en agregarse para evitar que esté demasiado tiempo fuera del freezer.

PRECAUCIONES: • Trabajar SIEMPRE sobre hielo. • NO HABLAR durante la preparación de la mix, para evitar contaminaciones. 5) Agregar el ADN genómico (5 µl) a cada tubo M. En el tubo de Control Negativo

colocar 5 µl de agua para PCR estéril. Realizar un spin (centrifugación de unos pocos segundos) y llevar al termociclador.

CONTROL NEGATIVO: tiene los mismos componentes que el tubo “M” (ya que se

usa la misma master mix) pero NO tiene ADN, DE MANERA QUE EN EL NO DEBE HABER AMPLIFICACION. Entonces el objeto de realizar el control negativo es: detectar cualquier contaminación que exista; ya que al revelar el gel corrido con GelRed, si se ve alguna banda el control negativo está contaminado, lo que inutiliza toda la reacción (ya que si una muestra presenta una banda, no sabré con certeza si es positiva o si es un falso positivo por contaminación de la master mix).



Programa de ciclado

Temperatura (ºC) Tiempo

Ciclo Inicial 94 3 minutos

Se repiten 35 ciclos

95 1 minuto

50 2 minutos

72 1 minuto

Ciclo Final 72 5 minutos

6) Una vez culminada la amplificación, se hace una corrida electroforética en gel

de poliacrilamida al 12% en una cuba vertical para la visualización del producto. La migración de ADN a través de los geles de poliacrilamida depende de:

• tamaño molecular del ADN • la concentración de poliacrilamida • la conformación espacial del ADN • la corriente aplicada. Preparación del gel poliacrilamida al 12%: (cantidad suficiente para 10 ml)

Reactivos ↓/ Concentración de poliacrilamida→ 12 % Acrilamida (30%) 4 ml Agua 3,93 ml TBE 5X 2 ml Persulfato de amonio (25%) 70 µl TEMED 3,5 µl Rango de separación 40-200 pb

Buffer para electroforesis: TBE 1X, pH 8. 7) Preparación de las muestras a sembrar: a) Enumerar tantos tubos como muestras (incluido el control negativo) más un tubo

para un control de peso molecular. b) Colocar en cada tubo 8 µl del amplificado + 2µl de buffer de siembra. c) En el tubo para el control de PM, en cambio: colocar 5µl del Marcador de Peso

Molecular. d) Realizar un spin. e) Sembrar en el gel con micropipeta, en forma vertical. f) Correr a 100 V aproximadamente. g) Terminada la corrida, sacar el gel y teñir aproximadamente 10 minutos en una

solución 1X de GelRed. h) Visualizar en el transiluminador, con protección adecuada, las bandas del

amplificado.



Posición Nombre Muestra Resultado 1 . 2 . 3 . 4 . 5 . 6 . 7 . 8 . 9 . 10 . Notas generales Al visualizar en el transiluminador, puede ocurrir que:

1) No observe bandas en ningún carril ⇒ olvidó agregar alguno de los reactivos a la Master Mix o el ADN (en todos los tubos). Debe realizar otra vez la reacción.

2) Observe bandas en todos los carriles. En este caso, debe proceder de la siguiente forma: dejar correr más tiempo y volver a observar:

• si continúa observando bandas en todos los carriles y las mismas son de igual tamaño, se contaminó la Master Mix con un ADN extraño. Esto inutilizó toda la reacción y deberá procesar nuevamente las muestras.

• si observa dos bandas (una más gruesa y una más fina y pequeña ⇒ que corre por delante) en los carriles de las muestras y en el carril del control negativo observa una sola banda que se corresponde con la más pequeña de las observadas en las muestras, la reacción estuvo bien realizada; sólo que hubo un exceso de primers que son los que forman la banda más pequeña. Al ser de pocos nucleótidos, migran rápidamente, de manera que si se deja correr el tiempo suficiente, desaparecerán con el frente y sólo quedarán en el gel las bandas del producto de amplificación.

3) Observe bandas en los carriles de las muestras y nada en el control negativo. Esta es la condición óptima de reacción de PCR.

Interpretación de resultados: Los pacientes homocigotas, tanto sanos como enfermos, presentan la formación de

homoduplex de 262 y 259 pb (indistinguibles entre sí), luego de la PCR. Los pacientes heterocigotos presentan alelos normales como mutados, por lo que al final de la PCR se forman 2 homoduplex y el heteroduplex. En caso de observar el producto de PCR, sin tratamiento con la enzima de restricción, mediante esta técnica solo podrán reconocerse los heterocigotas, por visualización del heterodúplex.



Cuando al producto de amplificación se lo somete a digestión con la enzima MboI

previo a la electroforesis, se observan las siguientes bandas:

Los pacientes homocigotos normales (N) presentan un homoduplex de 201pb y los mutados (M) de 215 pb que en un gel al 12% son perfectamente distinguibles. Los pacientes heterocigotos (H) presentan los homoduplex de 201 y de 215 pb y el heteroduplex.

A partir de la información obtenida, se le pide que: 1- Interprete los siguientes geles en donde se usa la técnica de Mutagénesis Dirigida

mediada por PCR para realizar el diagnóstico de la mutación ΔF508 en el gen CFTR, causante de fibrosis cística.

2- Escriba el informe del análisis de la mutación para todos los pacientes cuyos ADN fueron analizados por esta técnica.

M

N



a) Productos de PCR sin corte de enzima de restricción:

b) Productos de PCR con corte de enzima de restricción:



B. AMPLIFICACION DE UN FRAGMENTO DEL GEN CFTR: Detección de la Mutación ΔF508 y G542X por PCR Múltiple Alelo

Específica (MAS-PCR) La PCR Múltiple Alelo Especifica (MAS-PCR) es la amplificación, en un único tubo,

de múltiples fragmentos de una determinada secuencia. Esta estrategia involucra la elección correcta de pares de primers que deberán dar lugar a fragmentos de diferente tamaño y que deberán ser fácilmente resueltos en una única línea de corrida de un gel. Los primers usados son alelo-específicos. Esta técnica se ha usado con éxito en el diagnóstico de enfermedades como la distrofia muscular de Duchenne, Lesch-Nyhan, beta talasemia y el screnning de 4 de las mutaciones más comunes para fibrosis cística (dF508, G542X, G551D y N1303K).

Los tamaños de los productos de amplificación son: N1303K (240pb), G551D (202pb), G542X (174pb) y ∆F508 (136pb), WT-CF508 (139).

Línea 1 y 12 Marcador de Peso Molecular (ϕX174 digerido con HaeIII). En las líneas

2,4, 6, 8 y 10 se usaron los primers con las secuencias normales. Líneas 2 y 3: Paciente 1 con primers N y M. Líneas 4 y 5: Paciente 2 con primers N y M. Líneas 6 y 7: Paciente 3 con primers N y M Líneas 8 y 9: Paciente 4 con primers N y M. Líneas 10 y 11: Paciente 5 con primers N y M.



Basado en los datos brindados por esta publicación, realice el informe de las mutaciones analizadas de los pacientes 1 al 5

En el TP se realizara el diagnóstico de las mutaciones ∆F508 y G542X. Cada muestra se amplifica en dos tubos: en el primer tubo se colocarán los pares de cebadores para los alelos normales (cebadores F: CF-W1468-N y R: CF-508 RP para la mutación ∆F508 y cebadores F: 5’IVS-11 y R: G542X-N para la mutación G542X). En el segundo tubo se colocarán los pares de cebadores para los alelos mutados (cebadores F: ∆F508 y R: CF-508 RP para la mutación ∆F508 y cebadores F: 5’IVS-11 y R: G542X-M para la mutación G542X).

Primers Secuencia Tipo

CF-W1468-N 5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATC TT -3’ F1 CF-508 RP 5’-TAG TGT GAA GGG TTC ATA TGC ATA AT-3’ R1

∆F 508 5’-GGC ACC ATT AAA GAA AAT ATC ATT GG-3’ F2

5’IVS-11 5’-CAA CTG TGG TTA AAG CAA TAG TGT-3’ F3 G542X-N 5’-GTG TGA TTC CAC CTT CTC C-3’ R3 G542X-M 5’-GTC TGA TTC CAC CTT CTC A-3’ R4 Los tamaños de los productos de amplificación obtenidos serán de 139 pb para el

alelo normal de ∆F508 136 pb para el alelo con la mutación dF508, 174 pb para el alelo normal G542X y de 174 pb para el alelo mutado de G542X.

PROTOCOLO

1) Preparación de las muestras: El volumen final de reacción de PCR será de 25 µl, de los cuales 20 µl son de la master mix o mezcla de reactivos y 5 µl a la muestra de ADN. A partir de los datos de concentración de su ADN muestra, calcule qué volumen de ADN debe tomar para tener 0,1 µg.

2) Rotular todos los tubos con el número de comisión que le corresponde. 3) Identificar ocho de los tubos más pequeños (de 500 µl) con una M1N, M1M, M2N,

M2M, M3N y M3M y a los dos restantes con el signo (-N) y (-M). 4) Se utilizarán dos tubos Eppendorf (de 1500 µl) para preparar la Master MIX N

(que amplificará los alelos normales, en caso de estar presentes) y la Master MIX M (que amplificará los alelos que presenten las mutaciones analizadas). Antes de iniciar su preparado, tenga en cuenta el número de tubos que procesará: n (en su caso, 4 para cada MIX). Multiplique TODOS los volúmenes de los componentes de la master mix por el número obtenido n + 1 (para asegurarse de que todos los tubos recibirán la misma cantidad de mix). En nuestro caso: son cuatro (4) tubos por mesada, entonces n+1=5. Multiplique entonces, todo por cinco.



Entonces se deben realizar DOS MASTER MIX : a) Composición de la Master Mix NORMAL:

1. H2O (csp 20µl)………………………..... 11,4 µl ……... 34,2 µl 2. Buffer 10X……………………………… 2,5 µl ……... 7,5 µl 3. Mg Cl2 50mM………………………….. 1 µl ……... 3 µl 4. dNTPs 2,5 mM………………………….. 2 µl X 3 ……... 6 µl 5. Primer CF-W1468-N (25 pM/µl)...……. 0,6 µl ……... 1,8 µl 6. Primer CF-508-RP (25pM/µl)…………... 0,6 µl ……... 1,8 µl 7. Primer G-542-X N (25pM/µl)…………... 0,8 µl ……... 2,4 µl 8. Primer 5´IVS-11 (25pM/µl)…………….. 0,8 µl ……... 2,4 µl 9. Taq pol. (5U/µl)……………………….... 0,3 µl ……... 0,9 µl

(ACLARACION: c.s.p.: cantidad suficiente para) b) Composición de la Master Mix MUTANTE:

1. H2O (csp 20µl)…………………………... 11,4 µl ……... 34,2 µl 2. Buffer 10X……………………………… 2,5 µl ……... 7,5 µl 3. Mg Cl2 50mM………………………….. 1 µl ……... 3 µl 4. dNTPs 2,5 mM………………………….. 2 µl X 5 ……... 6 µl 5. Primer ∆F508 (25 pM/µl)...……………… 0,6 µl ……... 1,8 µl 6. Primer CF-508-RP (25pM/µl)…………... 0,6 µl ……... 1,8 µl 7. Primer G-542-X M (25pM/µl)…………... 0,8 µl ……... 2,4 µl 8. Primer 5´IVS-11 (25pM/µl)…………….. 0,8 µl ……… 2,4 µl 9. Taq pol. (5U/µl)…………………………. 0,3 µl ……... 0,9 µl

(ACLARACION: c.s.p.: cantidad suficiente para) 5) Preparación de la master mix: Adicionar al tubo de 1,5 ml los distintos

reactivos en orden de volumen decreciente (y vaya tildándolos para no agregar nuevamente un reactivo). La Taq polimerasa es la última en agregarse para evitar que esté demasiado tiempo fuera del freezer.

PRECAUCIONES: • Trabajar SIEMPRE sobre hielo. • NO HABLAR durante la preparación de la mix, para evitar contaminaciones. 6) Agregar el ADN genómico (5 µl) a cada tubo. En el tubo de Control Negativo

colocar 5 µl de agua para PCR estéril. Realizar un spin (centrifugación de unos pocos segundos) y llevar al termociclador.

Programa de ciclado

Temperatura (ºC) Tiempo

Ciclo Inicial 95 5 minutos

Se repiten 30 ciclos

95 1 minuto

60 1 minutos

72 1 minuto

Ciclo Final 72 5 minutos



8) Una vez culminada la amplificación, se hace una corrida electroforética en gel de agarosa al 3% en una cuba horizontal para la visualización del producto.

9) Preparación de las muestras a sembrar: Enumerar tantos tubos como muestras (incluido el control negativo) más un tubo para

un control de peso molecular. Colocar en cada tubo 8 µl del amplificado + 2µl de buffer de siembra. En el tubo para el control de PM, en cambio: colocar 5µl del Marcador de Peso

Molecular. Realizar un spin. Sembrar en el gel con micropipeta, en forma vertical, tratando de no romper el gel. Correr a 100 V aproximadamente. Terminada la corrida, sacar el gel y observar en el transiluminador. Interpretación de los resultados Los tamaños de los productos de amplificación obtenidos serán de 139 pb para el

alelo normal de ∆F508, 136 pb para el alelo con la mutación dF508, 174 pb para el alelo normal G542X y de 174 pb para el alelo mutado de G542X.



BIBLIOGRAFÍA: Fortina P, Conant R, Monokian G, Dotti G, Parrella T, Hitchcock W, Kant J, Scanlin

T, Rappaport E, Schwartz E, et al. 1992. Non-radioactive detection of the most common mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene by multiplex allele-specific polymerase chain reaction. Hum. Genet. 90: 375-378.

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