Upload
others
View
4
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
THIAGO AFONSO CARVALHO CELESTINO TEIXEIRA
Hábitos e estilos de vida como fatores de risco para
função testicular em infertilidade masculina
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo para obtenção do título de
Doutor em Ciências
Programa de Urologia
Orientador: Prof. Dr. Jorge Hallak
Coorientadora: Profa. Drª. Elaine Maria Frade Costa
(Versão corrigida. Resolução CoPGr 6018/11, de 1 de novembro de 2011. A versão
original está disponível na Biblioteca da FMUSP)
SÃO PAULO
2021
Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicação:
Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Vancouver).
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e Documentação. Guia de
apresentação de dissertações, teses e monografias.
Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva de
Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo: Divisão de Biblioteca e
Documentações; 2011.
Abreviatura dos títulos dos periódicos de acordo com List of Journals Indexed in Index Medicus.
Epígrafe
“Primeiro fazemos nossos hábitos,
depois nossos hábitos nos fazem.”
John Dryden Poeta, crítico literário e
dramaturgo
DEDICATÓRIA
Ao meu filho amado, Leonardo Palheta Carvalho
Teixeira, hoje com 17 anos, que em breve iniciará sua
vida universitária. Caso decida por seguir os passos da
Medicina, que esta tese sirva como inspiração.
À minha mãe, Helba Maria Carvalho Teixeira, que foi
meu alicerce na vida e nos estudos. Certamente não
alcançaria meus objetivos e conquistas sem uma mãe
tão dedicada e amorosa como tenho. Toda minha
jornada acadêmica dedico a ela.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Jorge Hallak, por ter me aceito como seu aluno,
demonstrando sempre não somente seu vasto conhecimento científico e seu
comportamento ético, mas também sua dedicação por querer me tornar um
Andrologista cada vez mais qualificado e uma pessoa melhor. A ele, minha
amizade e admiração eternas.
À Profa Dra Elaine Maria Frade Costa, minha querida coorientadora,
exemplo de médica e professora. Seus ensinamentos e sua conduta profissional
certamente nortearam minha vida médica e acadêmica sempre. A ela também,
minha amizade e admiração eternas.
À Divisão de Clínica Urológica do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo, onde aprimorei conhecimentos,
desenvolvi meu doutorado no Programa de Pós-Graduação em Urologia e,
sobretudo, cultivei amizades.
Ao Centro Androscience de Ciência e Inovação em Andrologia e todos os seus
funcionários que, sem exceção, ativamente colaboraram na confecção desta tese.
Outro ambiente de trabalho e estudos onde, acima de tudo, cultivei amizades.
Às Sras Elisa de Arruda Cruz e Maria Tereza dos Santos Souza, por toda
ajuda dentro da Divisão de Urologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP), porém mais ainda pelas
inúmeras conversas alegres quando chegava na enfermaria. A elas, todo meu
carinho.
Aos amigos médicos Paulo Cardoso, Kalystonia Almeida, Felipe
Bernardes e Felipe Carneiro, grandes companheiros nesta minha caminhada da
pós-graduação.
Aos alunos de iniciação científica Ivan Iori, Gustavo Andrade, Giovanna
Milani e Mariana Hsieh, membros do grupo de pesquisa, que ajudaram na coleta
de dados da tese.
Por fim, a minha companheira Yasmin Cristina, que participou ativamente
da logística e confecção da tese. A ela, meu amor e admiração.
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas e siglas
Lista de figuras
Lista de quadros
Lista de tabelas
Lista de gráficos
Resumo
Abstract
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1
1.1 Hábitos/Estilos de Vida Relacionados à Infertilidade Masculina....................... 3
1.1.1 Tabagismo ...................................................................................................... 4
1.1.2 Consumo habitual de bebidas alcoólicas ....................................................... 6
1.1.3 Consumo de maconha .................................................................................... 9
1.1.4 Sedentarismo, prática de exercícios físicos e obesidade .............................. 11
1.1.5 Outros ........................................................................................................... 13
1.2 Justificativa ....................................................................................................... 17
2 OBJETIVOS.............................................................................................................. 19
2.1 Objetivo Primário ............................................................................................. 20
2.2 Objetivo Secundário ......................................................................................... 20
3 MÉTODOS ............................................................................................................... 21
3.1 Desenho do estudo ............................................................................................ 22
3.2 Amostra populacional ....................................................................................... 22
3.3 Análises seminais e laboratoriais ...................................................................... 24
3.3.1 Coleta de amostra seminal ........................................................................... 26
3.3.2 Avaliação macroscópica das variáveis espermáticas ................................... 27
3.3.3 Avaliação microscópica das variáveis espermáticas.................................... 27
3.3.3.1 Concentração espermática ....................................................................... 28
3.3.3.2 Número total de espermatozoides ........................................................... 29
3.3.3.3 Motilidade espermática ........................................................................... 29
3.3.3.4 Morfologia espermática........................................................................... 30
3.3.3.5 Determinação do número de células redondas ........................................ 31
3.3.3.6 Determinação do número de leucócitos .................................................. 31
3.3.4 Testes funcionais dos espermatozoides ....................................................... 32
3.3.4.1 Avaliação da atividade da enzima creatina quinase ................................ 32
3.3.4.2 Quantificação de anticorpos anti-espermatozoides ................................. 33
3.3.4.3 Dosagem de Radicais Livres de Oxigênio .............................................. 34
3.3.4.4 Avaliação do DNA espermático .............................................................. 36
3.4 Análises dos dados clínicos e de hábitos e estilo de vida ................................. 38
3.5 Análise Estatística ............................................................................................. 42
3.6 Aspectos Éticos ................................................................................................. 43
4 RESULTADOS .......................................................................................................... 45
4.1 Característica da Amostra ................................................................................. 46
4.2 Hábitos/Estilo de Vida e Parâmetros Hormonais ............................................. 52
4.3 Hábitos/Estilo de Vida e Parâmetros Seminais ................................................ 56
4.4 Hábitos/Estilo de Vida e Volume Testicular .................................................... 59
4.5 Hábitos/Estilo de Vida e Parâmetros Bioquímicos ........................................... 60
5 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 69
5.1 Maconha ........................................................................................................... 70
5.1.1 Maconha e sua influência sobre parâmetros seminais e volume
testicular ....................................................................................................... 70
5.1.2 Maconha e sua influência sobre parâmetros hormonais .............................. 76
5.1.3 Maconha e sua influência sobre parâmetros bioquímicos ........................... 80
5.2 Sedentarismo .................................................................................................... 82
5.2.1 Sedentarismo e sua influência sobre parâmetros seminais e volume
testicular ....................................................................................................... 82
5.2.2 Sedentarismo e sua influência sobre parâmetros hormonais e
bioquímicos .................................................................................................. 83
5.3 Tabagismo ........................................................................................................ 85
5.3.1 Tabagismo e sua influência sobre parâmetros seminais e volume
testicular ....................................................................................................... 85
5.3.2 Tabagismo e sua influência sobre parâmetros hormonais e
bioquímicos .................................................................................................. 86
5.4 Consumo habitual de álcool ............................................................................. 87
5.4.1 Consumo habitual de álcool e sua influência sobre parâmetros
seminais e volume testicular ........................................................................ 87
5.4.2 Consumo habitual de álcool e sua influência sobre parâmetros
hormonais e bioquímicos ............................................................................. 88
5.5 Limitações do estudo ........................................................................................ 90
6 CONCLUSÕES .......................................................................................................... 92
7 ANEXOS.................................................................................................................. 94
8 REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 100
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
%DFI - Índice de fragmentação de DNA (DNA fragmentation index)
ADP - Adenosina difosfato
AhR - Receptor aril-hidrocarboneto (Aryl hydrocarbon receptor)
AMPc - Adenosina monofosfato cíclico
ANOVA - Análise de variância (Analysis of variance)
ARTs - Técnicas de Reprodução Assistida (Assisted Reproductive Techniques)
ATP - Adenosina trifosfato
CB1 - Receptor canabinoide tipo 1
CB-1R - Receptor canabinoide tipo 1 - cerebral
CB2 - Receptor canabinoide tipo 2
CBD - Canabidiol
CBD-C1 - Canabidiorcol
CBN - Canabinol
CBR - Canabiripsol
CBT - Canabitriol
CEP - Comitê de Ética em Pesquisa
CK - Creatina quinase
CNS - Comissão Nacional de Saúde
CPM - Fótons contados por minuto (counts per minute)
CYP1B - Citocromo P450, família 1, subfamília B
CYP3A - Citocromo P450, família 3, subfamília A
DA - Dopamina
DHT - Di-hidrotestosterona
DMBA - 7,12-dimetilbenzantraceno
DMSO - Dimetilsulfóxido (Dimethyl sulfoxide)
DNA - Ácido desoxirribonucleico (Deoxyribonucleic acid)
E2 - Estradiol
EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético (Ethylenediaminetetraacetic acid)
FMUSP - Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
FSH - Hormônio folículo-estimulante (Follicle stimulating hormone)
G-6-P - Glicose-6-fosfato
G-6-PDH - Glicose-6-fosfato desidrogenase
GABA - Ácido gama-aminobutírico (Gamma aminobutyric acid)
GnRH - Hormônio liberador de gonadotropinas (Gonadotropin releasing
hormone)
HbA1c - Hemoglobina glicada
HC - Hospital de Clínicas
HDL - Lipoproteína de alto peso molecular
HDS - Região do DNA de alta capacidade para corar-se no teste de estrutura
da cromatina espermática (High DNA stainability)
HK - Hexoquinase
HLPC - Cromatografia líquida de alta performance (High performance liquid
cromatography)
HPG - Eixo hipotalâmico-hipofisário-gonadal (Hypothalamic-Pituitary-
Gonadal Axis)
HTF - Fluído tubáreo humano (Human Tubal Fluid)
IgA - Imunoglobulina do tipo A
IgG - Imunoglobulina do tipo G
IMC - Índice de massa corporal
JPEG - Grupo de Especialistas Fotográficos Unidos (Joint Photographics
Experts Group)
LDL - Lipoproteína de baixo peso molecular
LH - Hormônio luteinizante (Luteinizing hormone)
LHRH - Hormônio liberador do hormônio luteinizante (Luteinizing hormone
releasing hormone)
LIFE - Longitudinal Investigation of Fertility and the Environment
NAD - Dinucleotídeo de nicotinamida adenina
NADH - Nicotinamida dinucleotídeo hidrogenase
OMS - Organização Mundial da Saúde
PAHs - Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (Polycyclic aromatic
hydrocarbons)
PRL - Prolactina
ROS - Radicais livres de oxigênio (Reactive Oxygen Species)
SCSA® - Teste da Estrutura da Cromatina espermática (Sperm Chromatin
Structure Assay)
SEC - Sistema endocanabinoide
SHBG - Globulina ligadora de hormônios sexuais (Sex hormone binding
globulin)
SPSS® - Statistical Package for the Social Science
T/E2 - Razão testosterona/estradiol
T4 livre - Tiroxina livre
TCLE - Termo de Consentimento Livre Esclarecido
THC - ∆-9 tetra-hidrocanabinol
TL - Testosterona livre
TSH - Hormônio tireo-estimulante (Thyroid-stimulating hormone)
TT - Testosterona total
Vitamina D - 25(OH) Vitamina D
VLDL - Lipoproteína de muito baixo molecular
VT - Volume testicular
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Diagrama de seleção da amostra ............................................................. 24
Figura 2 - Representação do procedimento de dosagem dos radicais livres
de oxigênio no sêmen .............................................................................. 35
Figura 3 - Representação da classificação dos espermatozoides de acordo
com a coloração adquirida pelos lasers FL1 e FL3 do citômetro
de fluxo .................................................................................................... 37
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Exames laboratoriais com unidades de medidas mais utilizadas
para mensurar as variáveis hormonais e bioquímicas, 2009 a
2017 ......................................................................................................... 25
Quadro 2 - Metodologia de dosagens mais utilizadas para mensurar as
variáveis hormonais e bioquímicas, 2009 a 2017 ................................... 26
Quadro 3 - Resumo dos resultados encontrados quanto às influências de
hábitos e estilo de vida em parâmetros seminais, hormonais e
bioquímicos de homens inférteis, 2009 a 2017 ....................................... 68
Quadro 4 - Resumo dos resultados encontrados quanto às influências de
hábitos e estilo de vida em parâmetros seminais, hormonais e
bioquímicos de homens inférteis, com prováveis mecanismos
relacionados, 2009 a 2017 ....................................................................... 91
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Resumo descritivo da amostra quanto aos dados clínicos-
epidemiológicos (n=280 homens), 2009-2017 ..................................... 46
Tabela 2 - Resumo descritivo da amostra quanto à análise seminal e aos
testes espermáticos funcionais (n=280 homens), 2009-2017 ............... 49
Tabela 3 - Resumo descritivo das alterações seminais encontradas na
amostra de homens inférteis estudada (n=280), 2009-2017 ................. 50
Tabela 4 - Resumo descritivo da amostra quanto aos parâmetros
hormonais e bioquímicos (n=280 homens), 2009-2017 ....................... 51
Tabela 5 - Divisão em quartis da amostra segundo valores de testosterona
total (TT) (n=280 homens), 2009-2017 ................................................ 51
Tabela 6 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente Estradiol .................................. 52
Tabela 7 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente Estradiol .................................. 53
Tabela 8 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente Prolactina ............................... 53
Tabela 9 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente Prolactina ............................... 54
Tabela 10 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente T/E2# ........................................ 54
Tabela 11 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente T/E2# ........................................ 55
Tabela 12 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para as demais variáveis hormonais e preditores
constantes* ............................................................................................ 55
Tabela 13 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente Testosterona livre (TL)............ 56
Tabela 14 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para as variáveis dependentes seminais e preditores
constantes* ............................................................................................ 57
Tabela 15 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente Volume Seminal....................... 58
Tabela 16 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente Nº total
espermatozoides móveis ........................................................................ 58
Tabela 17 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para as variáveis dependentes de volume testicular
e preditores constantes* ........................................................................ 59
Tabela 18 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente Globulina ligadora de
hormônios sexuais (SHBG) ................................................................... 60
Tabela 19 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente Globulina ligadora de
hormônios sexuais (SHBG) ................................................................... 61
Tabela 20 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente insulina .................................... 61
Tabela 21 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente insulina .................................... 62
Tabela 22 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente lipoproteína de muito
baixo molecular (VLDL) ....................................................................... 62
Tabela 23 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente lipoproteína de muito
baixo molecular (VLDL) ....................................................................... 63
Tabela 24 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente glicemia de jejum .................... 63
Tabela 25 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente glicemia de jejum .................... 64
Tabela 26 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente ferritina ................................... 64
Tabela 27 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente ferritina ................................... 65
Tabela 28 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para as demais variáveis bioquímicas e preditores
constantes* ............................................................................................ 66
Tabela 29 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente colesterol total......................... 66
Tabela 30 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente lipoproteína de baixo
peso molecular (LDL) ........................................................................... 67
Tabela 31 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente triglicerídeos ........................... 67
RESUMO
Teixeira TACC. Hábitos e estilos de vida como fatores de risco para função
testicular em infertilidade masculina [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina,
Universidade de São Paulo; 2021.
Esta pesquisa objetivou analisar as influências dos hábitos e do estilo de vida (tabagismo,
consumo habitual de bebidas alcoólicas, uso de maconha e sedentarismo) na função
testicular de homens inférteis atendidos em clínica de Andrologia. Foi realizado estudo
retrospectivo, quantitativo, com análise de dados de prontuários de 280 homens inférteis
com idade de 18 a 59 anos, e que realizaram análise seminal completa, dosagem sérica
de testosterona total e aferição de volume testicular (orquidômetro, paquímetro ou
ultrassonografia). Foram excluídos casos de infertilidade ligada a doenças genéticas,
infecção nos órgãos reprodutivos e disgenesia gonadal. Os exames incluídos foram a
análise seminal completa, atividade hormonal, marcadores bioquímicos e testes de
função espermática (atividade da enzima intracelular creatina kinase, anticorpos anti-
espermatozoides, radicais livres de oxigênio e teste de fragmentação de DNA
espermático). Regressão logística multifatorial foi realizada para determinar associações
do tabagismo, consumo de bebida alcoólica, uso regular de maconha ≥ 12 meses e
sedentarismo em cada um dos exames incluídos no estudo. Análise estatística foi
realizada usando o software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS®) 23.0 (p
< 0,05). Nenhum hábito ou estilo de vida correlacionou-se substancialmente os
parâmetros seminais, concentração sérica de testosterona ou volume testicular na
população infértil. A maconha se associou a menores concentrações de estradiol (P <
0,001; B = -11,61), e maiores de prolactina (P < 0,001; B = 3,21) e de globulina ligadora
de hormônios sexuais (SHBG) (P = 0,02; B = 7,49) e maiores valores da razão
testosterona/estradiol (T/E2) (P = 0,004; B = 14,03). O tabagismo de carga ≥ 10 anos-
maço está associado com menores concentrações de prolactina (P = 0,03; B = -2,40) e
glicemia de jejum (P = 0,04; B = -5,40), enquanto o consumo habitual de bebidas
alcoólicas em dose ≥ 37,2 mL/dia relaciona-se com menores níveis de VLDL (P = 0,03;
B = -3,72). O sedentarismo se relaciona a maiores concentrações de prolactina (P = 0,03;
B = 1,28) e ferritina séricas (P = 0,02; B = 63,87). Dos hábitos estudados, o consumo
regular de maconha por mais de 12 meses está associada a efeitos hormonais deletérios à
função testicular de homens inférteis.
Descritores: Estilo de vida; Hábitos; Infertilidade masculina; Testículos; uso da maconha.
ABSTRACT
Teixeira TACC. Habits and lifestyles studied as risk factors for testicular function in
male infertility [thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São
Paulo”; 2021.
This study aimed to investigate the influence of habits and lifestyle (cigarette
smoking, regular consumption of alcohol, marijuana use, and sedentary lifestyle)
correlated with the testicular function of infertile men attending an Andrology set up.
A retrospective quantitative study was performed with data analysis from medical
records of 280 infertile men aged 18 to 59 years old who performed a complete
seminal analysis, serum total testosterone, and testicular volume measurement
(orchidometer, pachymeter, or ultrasound). Individuals with infertility caused by
genetic diseases, infections in reproductive organs, and testicular dysgenesis were
excluded. A complete seminal analysis, hormonal levels, serum biochemical
markers, and sperm functional tests (creatine-kinase, anti-sperm antibodies, reactive
oxygen species, and sperm DNA fragmentation test) were applied. Multiple linear
regression analysis was performed to investigate possible associations of cigarette
smoking, regular consumption of alcohol, regular use of marijuana ≥ 12 months, and
sedentary lifestyle on each variable. Statistical analysis was conducted using SPSS®
23.0 (p < 0.05). No habit or lifestyle correlated with any seminal parameters,
testosterone concentration, or testicular volume in the infertile population. Marijuana
was associated with lower serum estradiol levels (P < 0.001; B = -11.61), higher
prolactin (P < 0.001; B = 3.21) and SHBG concentration (P = 0.02; B = 7.49), in
addition to higher values of T/E2 ratio (P = 0.004; B = 14.03). Cigarette smoking ≥
10 year-packs was associated with lower prolactin level (P = 0.03; B = -2.40) and
lower fasting blood glucose values (P = 0.04; B = -5.40), while regular consumption
of alcoholic beverages ≥ 37,2 mL/day was related to lower level of VLDL (P = 0.03;
B = -3.72). Sedentary lifestyle was associated to higher concentrations of prolactin
(P = 0.03; B = 1.28) and ferritin (P = 0.02; B = 63.87). Overall, regular marijuana
consumption ≥ 12 months was associated to deleterious hormonal effects on the
testicular function of infertile men.
Descriptors: Lifestyle; Habits; Male infertility; Testis; marijuana use.
INTRODUÇÃO - 2
Infertilidade é uma condição médica caracterizada pela falha do estabelecimento
de gravidez clinica após 12 meses de atividade sexual regular, desprovida de uso de
métodos contraceptivos, ou devido a impedimento da capacidade de uma pessoa de
reproduzir, seja como um indivíduo ou com sua/seu parceira(o)1.
Atualmente, a infertilidade masculina constitui-se um crescente problema de
saúde pública. Estima-se que 48,5 milhões de casais no mundo sofram as
consequências da infertilidade. Homens são responsáveis diretamente por cerca de
30% das situações, e em conjunto com a mulher em outros 20%, portanto, podendo
contribuir entre 20 a até mesmo 70% dos casos totais de infertilidade, dependendo da
região ao redor do mundo2,3.
A incapacidade involuntária de não conseguir se reproduzir e não gerar seus
próprios descendentes biológicos é um processo multifatorial resultante de uma
sequência de eventos nos órgãos do sistema reprodutor masculino e/ou nos
espermatozoides e suas interações com fatores ambientais e de hábitos e estilos de
vida4. Esta constante e crescente interação de fatores intrínsecos e extrínsecos
confirma a importância de causas genéticas, epigenéticas e moleculares e da
interrelação com cofatores ambientais e de estilo de vida para a falha biológica da
reprodução, afastando-se do que tradicionalmente se explica como componentes
masculinos isolados, como presença de varicocele, infecções genitais, alterações
hormonais e causas genéticas4,5.
INTRODUÇÃO - 3
Deve-se compreender, portanto, a subfertilidade ou infertilidade masculina
como uma extensão do complexo processo biológico da espermatogênese com suas
dezenas de etapas interrelacionadas e sujeitas a fatores intrínsecos (ex.: genética e
epigenética, disgenesia gonadal, desenvolvimento testicular, varicocele,
criptorquidia, obesidade, síndrome metabólica, diabetes, doenças crônico-evolutivas,
doenças autoimunes e oncológicas, etc.) e extrínsecos (poluição atmosférica e
ambiental, xenobióticos, medicamentos, uso abusivo de testosterona e derivados
esteroides anabolizantes, álcool, tabaco e outras drogas, sejam naturais ou sintéticas,
lícitas ou ilícitas), com crescimento porcentual exponencial no mundo industrializado
nas últimas décadas maior do que as mulheres5.
1.1 Hábitos/Estilos de Vida Relacionados à Infertilidade Masculina
Homens geneticamente subférteis que apresentem fator (es) de desequilíbrio
no eixo hipotalâmico-hipofisário-gonadal (do inglês Hypothalamic-Pituitary-
Gonadal Axis, HPG) e/ou alterações no desenvolvimento e maturação dos
espermatozoides podem ter sua fertilidade limítrofe ainda mais comprometida caso
sejam expostos a substâncias tóxicas, poluentes ambientais e drogas, ou exerçam
estilo de vida deletério ao já reduzido potencial reprodutivo6.
Dentre estes hábitos deletérios à fertilidade masculina, destacam-se:
tabagismo, consumo abusivo de bebidas alcoólicas, consumo de maconha e outras
drogas ilícitas, sedentarismo e prática de exercício físico em excesso, frequência de
intercursos sexuais, restrições dietéticas, consumo de cafeína e o abuso de
testosterona, esteroides anabolizantes e de diversos medicamentos5-10.
INTRODUÇÃO - 4
1.1.1 Tabagismo
O tabagismo é reconhecidamente um dos fatores de risco para infertilidade
masculina mais discutidos na literatura científica, muito embora não se tenha ainda
elucidado quais mecanismos são responsáveis por tal efeito. Têm-se como
proposições desde o aporte deficiente de oxigênio ao tecido testicular até a lesão do
ácido desoxirribonucleico (do inglês, Deoxyribonucleic acid, DNA) espermático por
agentes mutagênicos e metabólitos da fumaça do cigarro8,11.
O consumo do tabaco está intimamente ligado à disfunção erétil, inclusive
gerando forte impacto negativo na qualidade de vida sexual masculina12,13, além de
aumentar a chance de mutações cromossômicas e aneuploidias no gameta paterno,
com aumento consequente de abortos e incremento de mutações deletérias que são
transmitidas entre gerações14.
Estudos demonstram que o tabagismo está associado à diminuição da
concentração total, menor motilidade e menor porcentagem de espermatozoides com
morfologia considerada normal, inclusive quando ocorre exposição pré-natal aos
metabólitos do tabaco15-19.
Duas pesquisas com intervalo de 15 anos, realizadas na Divisão de Urologia
do Hospital de Clínicas (HC) da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo (FMUSP), demonstraram o mesmo efeito do tabagismo. Em ambos os estudos,
com tempo mínimo de 10 anos ininterruptos de uso de cigarro, o volume do
ejaculado apresentou-se reduzido de 2,8 mL nos não-usuários para 2,4 mL nos
tabagistas leves (≤ 10 cigarros/dia), 2,3 mL nos moderados (11 a 20 cigarros/dia) e
2,1 mL nos usuários severos (> 20 cigarros/dia)20,21. Em defesa de tese de Livre-
Docência no Departamento de Patologia da FMUSP sobre avaliação dos efeitos
INTRODUÇÃO - 5
deletérios da maconha e do tabaco na função seminal, foi descrita diminuição do
volume seminal ao comparar indivíduos tabagistas com indivíduos de um grupo
controle férteis não tabagistas (2,40 ±1,44 mL vs Controle: 3,09 ±1,87 mL, p
<0,001)22.
Todavia, alguns estudos não reportaram uma influência negativa significativa
do tabaco em um ou mais dos parâmetros seminais convencionais (concentração,
morfologia e motilidade), principalmente em homens inférteis. Em estudo
prospectivo com 1.104 homens inférteis, dentre os quais 478 são fumantes de cigarro
de tabaco, nenhuma diferença significativa foi observada quanto a alterações de
parâmetros seminais convencionais entre os grupos de fumantes e não fumantes15.
Em outro estudo com população infértil, noventa e cinco homens foram
divididos em dois grupos: fumantes (n=50) e não-fumantes (n=45), visando analisar
os efeitos do cigarro nos parâmetros seminais e na taxa de fragmentação de DNA.
Foram observados reduções significativas de concentração espermática, motilidade
progressiva, porcentagem de espermatozoides com morfologia normal e,
principalmente, um aumento da porcentagem de condensação anormal de cromatina
espermática, quando comparados os grupos de fumantes e não-fumantes23.
Importante destacar que os efeitos deletérios do tabaco na fertilidade
masculina são dependentes da carga tabágica do indivíduo, sendo mais pronunciados
nos consumidores de carga maior que 10 cigarros/dia23,24.
Quanto às alterações hormonais ligadas ao potencial reprodutivo masculino, o
cigarro de nicotina age como um desregulador endócrino. Em uma metanálise que
reuniu 22 estudos com 13.317 homens, com idade variando de 18 a 61 anos, foi
observado que fumantes tinham maior média de testosterona sérica do que os não-
INTRODUÇÃO - 6
fumantes25. Já um estudo no México demonstrou que além do aumento da
testosterona, o tabagismo está relacionado com o aumento da prolactina e, quando o
consumo ultrapassa cinco ou mais cigarros/dia, associa-se ainda a aumento de
hormônio luteinizante (do inglês, Luteinizing hormone, LH)26.
Especificamente com pacientes inférteis fumantes, há relato de associação
significativa deste hábito também com menores níveis de prolactina e concentrações
séricas mais elevadas de testosterona total, testosterona livre e LH15.
1.1.2 Consumo habitual de bebidas alcoólicas
Uso abusivo de bebidas alcoólicas também foi proposto como fator de risco para
infertilidade masculina, porém o potencial efeito deletério do álcool é menos claro que o
do tabagismo, principalmente devido a uma gama diversa de bebidas de teor alcoólico
variável e a dificuldade de se determinar o limite de frequência de consumo segura27.
Quanto à fisiopatologia da infertilidade masculina, observa-se que o álcool
pode exercer sua ação em três diferentes níveis: pré-testicular, testicular ou pós-
testicular28,29.
Em nível pré-testicular, dois são os principais sítios de ação: no hipotálamo, o
etanol bloqueia a secreção do hormônio liberador de gonadotropinas (do inglês
Gonadotropin releasing hormone, GnRH) e a clivagem do pré-pro-GnRH (precursor
do GnRH) em um hormônio GnRH fisiologicamente ativo. Já na hipófise ele exerce
ação inibitória direta, com consequente bloqueio da secreção de LH30,31.
Em estudo comparando 66 homens consumidores de bebidas alcoólicas
destiladas (mínimo de 180 mL/dia por um mínimo de 5 dias/semana durante período
≥1ano) e 30 não usuários, foi descrito que a ingestão do etanol aumentou de forma
INTRODUÇÃO - 7
significativa o hormônio folículo-estimulante (do inglês, Follicle stimulating
hormone, FSH), o LH e as concentrações séricas de estrogênios, com diminuição da
testosterona, sem alterações dos níveis séricos de prolactina. Quanto aos parâmetros
seminais, no grupo de usuários de álcool, foram encontrados menores valores no
número total, motilidade e na morfologia normal dos espermatozoides32.
Em nível pós-testicular, inúmeros são os mecanismos descritos na literatura,
como processos inflamatórios secundários como prostatite, epididimite, vesiculite e
aumento dos leucócitos no fluido seminal28.
Dose padrão é uma unidade de medida que corresponde à quantidade de
etanol puro encontrado em bebidas alcoólicas. Não há ainda consenso sobre a
dimensão exata desta unidade padrão, variando entre as mais diversas organizações e
países. Em geral, corresponde a 8 g a 14 g de etanol puro. A Organização Mundial de
Saúde (OMS) estabelece que uma dose padrão contém aproximadamente 10 g a 12 g
de álcool puro, o que equivale a uma dose de bebida destilada (30 mL), uma taça de
vinho tinto (100 mL) ou uma lata de cerveja (330 mL)33.
A relação entre os níveis de consumo de bebidas alcoólicas e infertilidade
masculina parece ser dose-dependente, entretanto, o nível de corte para o consumo
de álcool que afeta de forma prejudicial os parâmetros seminais ainda não foi bem
estabelecido8. Em estudo populacional transversal com 1.221 jovens dinamarqueses
com idade de 18 a 28 anos, os parâmetros seminais concentração, número total e
porcentagem de espermatozoides com morfologia normal foram negativamente
associados com crescente ingestão semanal de álcool, mesmo em doses moderadas
como cinco doses/semana34. Adicionalmente, em uma metanálise com 15 estudos
transversais e 16.395 homens participantes, ao se comparar etilistas ocasionais com
INTRODUÇÃO - 8
etilistas habituais (uso diário), o consumo do álcool em dose ≥10g de álcool puro/dia,
foi observado menor volume seminal e menor porcentagem de espermatozoides com
morfologia normal35. Entretanto, alguns estudos não encontraram associação
significativa entre o consumo de bebidas alcoólicas e redução de parâmetros
seminais convencionais, como um estudo dinamarquês com 347 homens jovens que
avaliou o consumo agudo de 5 dias, mesmo sob quantidades maiores que 16 doses
padrões36 e outro estudo em voluntários da província de Barcelona37.
O álcool também causa lesão no DNA espermático38. Nos mamíferos, o DNA
espermático nuclear se organiza ao redor de moléculas de protamina em substituição
às moléculas de histonas durante a espermiogênese. Durante a passagem no
epidídimo, o grupo cistina-tiol das moléculas de protamina são oxidados em ligações
di-sulfídicas, as quais são necessárias para a estabilidade da cromatina
espermática39,40. Em estudo experimental, foi avaliado o efeito do consumo de álcool
na integridade do DNA de espermatozoides aspirados do epidídimo de ratos.
Encontrou-se relação entre o álcool e o aumento da porcentagem de DNA
fragmentado e de apoptose nos espermatozoides, na ausência do aumento da taxa de
espermatozoides com histonas residuais e deficiência de protamina41.
Quanto às alterações hormonais, a ingestão aguda de bebidas alcoólicas
aparece na literatura relacionada com aumentos de testosterona livre34 e aumentos de
testosterona total42, enquanto que o consumo crônico usualmente se relaciona com
menores concentrações de testosterona32.
INTRODUÇÃO - 9
1.1.3 Consumo de maconha
A maconha é atualmente a droga ilícita mais consumida no mundo, com uma
prevalência anual estimada de 3,8% na população adulta. No Continente Americano,
o Escritório das Nações Unidas sobre Drogas e Crimes estima que 57 milhões de
pessoas faziam uso da droga no ano de 2017, cifra hoje de estimativa incerta ainda
pelas recentes adesões ao uso recreativo desta droga por países como o Uruguai e
Canadá, além de Estados Norte-Americanos selecionados43. Em inquérito
populacional francês, foi demonstrada prevalência de usuários de marijuana de 6,4%
em homens de casais inférteis44.
A maconha deriva de flores e folhas secas da planta Cannabis sativa e contém
os canabinoides delta-9-tetra-hidrocanabinol (THC), delta-8-tetra-hidrocanabinol, o
canabidiol (CBD) e o canabinol (CBN), as quais exercem seus efeitos no sistema
endocanabinoide (SEC) por meio da ligação com receptores canabinoides dos tipos
CB1 e CB245. O THC, canabinoide em maior abundância na maconha e com os
efeitos psicoativos de maior intensidade, atua no hipotálamo e na hipófise,
bloqueando respectivamente a liberação do hormônio liberador do hormônio
luteinizante (do inglês, Luteinizing hormone releasing hormone, LHRH) e a
produção do próprio LH, acarretando um quadro de hipogonadismo e prejuízo na
função espermática. Além disso, a presença de receptores canabinoides em múltiplas
regiões do eixo HPG acaba ampliando a ação deste componente pelos tecidos, órgãos
e sistemas biológicos envolvidos neste eixo45-47.
De uma forma geral, as evidências científicas atuais são contraditórias no
tocante à ação da maconha na função endócrina reprodutiva masculina, porém, há
forte sugestão de um efeito deletério no potencial fértil, pelo fato de que a maioria
INTRODUÇÃO - 10
dos estudos correlacionam o uso crônico de maconha com menores concentrações de
espermatozoides48.
Os poucos estudos in vivo em humanos com o THC demonstram a associação
deste canabinoide com as seguintes alterações de parâmetros seminais: redução da
motilidade49,50, aumento da motilidade51, redução da respiração mitocondrial52 e
diminuição da reação acrossômica50,53. Já com o próprio fumo da maconha, tem-se
publicado ainda menos estudos in vivo em humanos e estes descrevem os seguintes
efeitos: diminuição da concentração espermática54-56, diminuição da porcentagem de
espermatozoides com morfologia normal57 e quadros de apoptose prematura56.
Evidências comprovam ação da maconha em diferentes níveis do eixo HPG. No
hipotálamo, experimento com ratos adultos demonstrou uma inibição da produção de
LHRH pelo THC58. Na hipófise, o fumo da maconha causa diminuição da produção de
LH59,60. Quanto à sua ação no FSH, há controvérsias, com estudos não demonstrando
efeito algum54,59,60, enquanto que outro correlacionou-se com a diminuição do FSH, mas
somente quando o consumo foi maior que 10 cigarros/semana54. Nas células de Leydig,
a controvérsia de evidências científicas é ainda maior quanto aos efeitos da maconha,
pois estudos in vivo com humanos reportam três possíveis associações com a produção
de testosterona: redução54, aumento55 ou ainda nenhum efeito sobre as concentrações
séricas deste hormônio46,59,61. Portanto, claramente mais estudos são necessários sobre
esta causa de distúrbios reprodutivos e sexuais masculinos.
INTRODUÇÃO - 11
1.1.4 Sedentarismo, prática de exercícios físicos e obesidade
O sedentarismo tem associação com inúmeros malefícios, incluindo quadros de
subfertilidade/infertilidade masculina62. Em um estudo de coorte de pequena amostragem,
foram comparados 15 homens sedentários com 16 ativos fisicamente. O grupo fisicamente
ativo apresentou associação com maiores concentrações de testosterona e FSH e maiores
porcentagens de espermatozoides considerados morfologicamente normais, muito embora
não tenha ocorrido diferença estatística entre os grupos quanto à concentração de
espermatozoides63. Contudo, estudo de prevalência com 215 homens saudáveis, ao serem
estratificados conforme nível de atividade física, não demonstrou diferença nos parâmetros
seminais ao se comparar o quartil inferior (< três horas de atividade moderada/semana)
contra o maior quartil (> 9,5 horas de atividades semanal)64. Em outro estudo, foi
comparado o ato de “ver televisão” (como parâmetro de sedentarismo) e a qualidade do
sêmen em 189 homens de 18 a 22 anos. Aqueles que relataram o maior tempo vendo
televisão (> 20 h/semana) tinha concentrações de espermatozoides 44% menores do que
aqueles que não viam televisão65.
Apesar da gama de estudos divergentes quanto à associação entre aspectos da
atividade física no estilo de vida e a saúde reprodutiva masculina, aparentemente a
atividade física moderada é a mais relacionada à melhor qualidade seminal62.
A massa corporal possivelmente possui papel de destaque na fertilidade
masculina. Tanto o sobrepeso (índice de massa corporal [IMC] ≥ 25 kg/m2 e < 30
kg/m2), quanto o quadro de obesidade propriamente dita (IMC > 30 kg/m2) guardam
relação com subfertilidade e infertilidade em homens66,67.
Homens com sobrepeso e obesidade podem diminuir a qualidade seminal em
comparação aos de IMC normal no tocante à redução da concentração e motilidade
INTRODUÇÃO - 12
dos espermatozoides, diminuição da reação acrossômica e aumento da lesão do DNA
espermático68-74.
A obesidade atua por múltiplas vias ao afetar o potencial reprodutivo
masculino. Ela altera o eixo HPG, pois se associa com a desregulação de “neo-
hormônios” como a leptina e a kisspeptina, além de aumentar a insulinemia, o que
culminará em um estado final de hipogonadismo75-77. Outras comorbidades
associadas à obesidade como depressão e apneia obstrutiva do sono contribuem para
o estado hipogonádico78,79, além da disfunção erétil relacionada à síndrome
metabólica, que dificulta o ato reprodutivo em si80,81. Por fim, a obesidade se associa
a modificações epigenéticas, como metilação de DNA e modificação de histonas,
ligadas a fenótipos de fertilidade anormais em seres humanos82.
Evidências mais recentes derivadas de estudos metanalíticos questionam a
força de associação entre obesidade e infertilidade masculina, demonstrando fraca
correlação entre obesidade e parâmetros seminais convencionais83,84.
Atualmente também se discute se a obesidade se associa ou não a maiores
taxas de fragmentação de DNA espermático, com estudos de revisão sistemática e
metanálise demonstrando resultados completamente divergentes84,85.
Exercícios físicos vigorosos frequentes são relacionados na literatura com
piora da fertilidade masculina, porém quem pratica atividade física de intensidade
moderada, quando comparados a homens sedentários, apresenta um ambiente
hormonal mais equilibrado e com maior produção endógena de testosterona e sêmen
de melhor qualidade62,63,86.
INTRODUÇÃO - 13
1.1.5 Outros
O coito regular, com uma frequência de duas a três vezes semanalmente
iniciada logo após o período menstrual, é determinante para se obter a gravidez.
Idade maior que a parceira e disfunção erétil são os principais fatores de risco para
coito menos frequente em homens inférteis5,87.
A dieta mediterrânea (rica em frutas, legumes, peixe, grãos integrais e pobre
em carne vermelha) e dietas ricas em ácidos graxos insaturados estão associadas a
uma melhor qualidade dos parâmetros seminais e com melhor função testicular, ao
passo que uma dieta de alto teor lipídico, pobre em ácidos graxos poli-insaturados
leva à dislipidemia, hiperinsulinemia, hiperglicemia e consequente redução na
qualidade dos espermatozoides86,88-90.
Apesar das evidências derivadas de estudos epidemiológicos com parâmetros
seminais e fertilidade serem inconsistentes, parte razoável da literatura sugere que a
ingestão de cafeína pode prejudicar a função reprodutora masculina, possivelmente
através de lesão de DNA espermático91,92.
Infertilidade associada ao abuso de esteroides anabolizantes usualmente se
apresenta como azoospermia ou oligozoospermia, associada a anormalidades na
morfologia e/ou motilidade espermática, ocasionadas pela supressão do eixo HPG8,93.
Com o uso crônico dos esteroides anabolizantes e consequente supressão da
espermatogênese, ocorre diminuição do volume testicular94. Após descontinuação do
uso dos esteroides, a qualidade tende a se recuperar espontaneamente dentro de um
período de quatro meses a um ano, com a ressalva de que o efeito deletério seminal
pode persistir por períodos mais longos ainda93.
A fisiopatogenia da infertilidade associada aos esteroides anabolizantes se
inicia nos efeitos supressivos testiculares devido à um feedback negativo dos
INTRODUÇÃO - 14
andrógenos exógenos circulantes no eixo HPG. Clinicamente, o quadro se expressará
como um hipogonadismo hipogonadotrópico, caracterizado por concentrações
séricas baixas de testosterona, deficiência na espermatogênese e atrofia testicular95.
Estudos experimentais sugerem certo grau de lesão gonadal com o uso de
esteroides anabolizantes, demonstrando que talvez não seja somente transitório o seu
caráter deletério. Alterações nas células de Leydig induzidas por esteroides
anabolizantes em ratos96, aneuploidias e alterações ultraestruturais nos
espermatozoides em caso relatado em humano adulto97 e um aumento da taxa de
apoptose em ratos pós-administração de nandrolona, intensificado pelo exercício
físico98 são exemplos de lesões testiculares de possível caráter permanente
relacionadas ao uso indiscriminado desta classe de substâncias.
Usuários de cocaína apresentam lesão ultraestrutural testicular responsável
pelos efeitos deletérios seminais, provavelmente mediados por apoptose induzida
pela própria droga. Usuários com mais de 5 anos de cocaína associam-se com
menores concentrações de espermatozoides, assim como com menores velocidades
progressivas99-102.
Estudo toxicológico conduzido na Unidade de Toxicologia Reprodutiva do
Departamento de Patologia da FMUSP verificou que a inalação crônica de crack-cocaína
afeta a espermatogênese em ratos com aumento de células de Leydig apoptóticas nos
animais adultos expostos (p = 0,04) e uma redução de espermátides redondas (p < 0,001)
e do número de células de Sertoli (p < 0,001) nos animais jovens também expostos. Ao
se comparar os ratos jovens expostos com o grupo controle também jovem não exposto,
os animais submetidos à inalação da droga tiveram reduções significativas do número de
túbulos seminíferos do estágio IV por testículo (p = 0,02), do número de espermátides
INTRODUÇÃO - 15
alongadas (p = 0,001) e das células de Sertoli (p < 0,001)103. Em resumo, a inalação
crônica de crack-cocaína diminui células de Sertoli em ratos jovens e de Leydig, em
adultos.
O abuso de analgésicos opioides pode interferir na espermatogênese através
de dois mecanismos: (a) os opiáceos atuam em feedback negativo no hipotálamo,
causando supressão da liberação do LH pela hipófise, o que consequentemente
gerará menores concentrações séricas de testosterona; e (b) o aumento dos níveis de
globulina ligadora de hormônios sexuais (do inglês, Sex hormone binding globulin,
SHBG) induzido pelo próprio opiáceo, que vai ainda mais potencializar o
hipogonadismo por restringir o suporte fisiológico de testosterona biodisponível104.
Medicações influenciam o potencial fértil masculino e na maioria das vezes o
próprio médico não discute com seus pacientes estes efeitos colaterais ao prescrevê-
las. Os inibidores da 5 α-redutase reduzem em torno de 5% o número total de
espermatozoides e apresentam efeitos sexuais adversos, como diminuição da libido,
disfunções erétil e ejaculatória, em até 15% dos usuários105,106. Os α-bloqueadores
acarretam disfunção ejaculatória de 20% a 89% dos homens, reduzem a libido ou
causam disfunção erétil de 1% a 3%, e diminuem o número total e a motilidade
espermática107-110.
Medicamentos psicotrópicos, anti-hipertensivos, medicamentos anti-infecciosos
e anticâncer recebem destaque como classes que causam danos colaterais na fertilidade
do homem, quer seja pelos números de substâncias envolvidas em cada uma delas, quer
seja pela multiplicidade de mecanismo de lesão no potencial fértil masculino10.
Dentre os psicotrópicos, os inibidores seletivos de recaptação da 5-
hidroxitriptamina (serotonina) aumentam a secreção de prolactina, ocasionando
INTRODUÇÃO - 16
disfunção erétil e/ou ejaculatória, além de aumentarem a taxa de fragmentação de
DNA espermático111-114. Os antidepressivos tricíclicos associam-se com redução no
volume seminal e motilidade dos espermatozoides115,116. Inibidores da
monoaminoxidase reduzem a libido e estão relacionados diretamente com disfunção
erétil117. Já o lítio reduz a viabilidade espermática116.
Nos anti-hipertensivos, os betabloqueadores estão relacionados a disfunções
sexuais, principalmente à erétil e possivelmente tem associação com motilidade
espermática diminuída118,119. Os diuréticos de alça, os antagonistas da aldosterona e
os tiazídicos podem causar diminuição da libido e disfunção erétil, além de redução
da concentração e motilidade espermática120,121. Já os bloqueadores dos canais de
cálcio diminuem motilidade dos espermatozoides e a reação acrossômica122-124.
Nas medicações anti-infecciosas, o cetoconazol diminui a produção de
testosterona125; a nitrofurantoína em altas doses pode ocasionar parada do processo
espermatogênico e redução da contagem total de espermatozoides126; os
aminoglicosídeos afetam a espermatogênese127,128; enquanto que os macrolídeos,
também em doses altas, podem acarretar astenozoospermia e morte de
espermatozoides129,130.
Medicamentos anticâncer, como os agentes quimioterápicos, tem sua
gonadotoxicidade derivada de lesão direta em células-tronco, espermatogônias, nas
células de Leydig ou nas células de Sertoli131. Na maioria das vezes, a lesão nestas
células-tronco resulta em células da linhagem germinativa precursoras dos
espermatozoides geneticamente alterados que prejudicam a fertilidade masculina132,133.
INTRODUÇÃO - 17
1.2 Justificativa
Um dos fatores que provavelmente contribuiu para o declínio das taxas de
fertilidade nas últimas décadas foi a deterioração da saúde reprodutiva ocasionada por
fatores biológicos e ambientais adversos134. Estudo meta-analítico recente, por exemplo,
demonstrou uma queda estimada de 59,3% no número total de espermatozoides em
homens de países ocidentais135. Esta deterioração provavelmente se relaciona com o
aumento da incidência de doenças do sistema reprodutor masculino, fatores ambientais e
relacionados ao estilo de vida contemporâneo136-139.
Em análise de revisão sistemática, Cocuzza e Esteves destacam esta possível
associação entre o declínio das taxas de fertilidade e da qualidade do sêmen com
diferentes estilos de vida e com exposição ambiental a desreguladores endócrinos140.
Contudo, os autores ressaltam que permanece ainda sem evidência científica
confirmatória pra tal associação, e que devem ser incentivados a realização de
estudos colaborativos prospectivos que incluam não somente os parâmetros seminais
e endócrinos, mas também uma definição bem clara de fertilidade140.
Além disso, o aumento da procura de homens inférteis para atendimento
especializado, na maioria das vezes sem uma adequada investigação, leva à adoção
intempestiva de técnicas de reprodução assistida (do inglês: Assisted Reproductive
Techniques, ARTs), aumentando custos de tratamento, com aumento de malformações
congênitas maiores, hipospadia, criptorquidia, doenças cardiovasculares, dentre dezenas
de outras complicações que poderiam ser evitadas caso o componente masculino fosse
devidamente diagnosticado e tratado4.
Faz-se necessário, portanto, uma melhor compreensão dos possíveis fatores
ambientais, ocupacionais, de hábitos e estilos de vida que influenciam no risco para
INTRODUÇÃO - 18
infertilidade masculina, a fim de se estabelecerem estratégias e tecnologias não só de
tratamento, mas de prevenção para esta doença de prevalência exponencialmente
crescente na sociedade contemporânea141.
OBJETIVOS - 20
2.1 Objetivo Primário
Analisar a influência direta e indireta dos seguintes parâmetros de hábitos e
estilo de vida: tabagismo, consumo habitual de bebidas alcoólicas, uso de maconha e
sedentarismo na função testicular, mensurada por meio de parâmetros seminais e
concentração sérica de testosterona total de homens inférteis.
2.2 Objetivo Secundário
Avaliar a influência do sedentarismo, tabagismo, consumo habitual de
bebidas alcoólicas e uso de maconha em parâmetros hormonais e bioquímicos de
homens inférteis.
MÉTODOS - 22
3.1 Desenho do estudo
Trata-se de um estudo observacional, retrospectivo com análise de dados
quantitativa, de caráter exploratório, realizado a partir dos registros de prontuários de
pacientes atendidos na clínica “Androscience, Centro de Ciência e Inovação em
Andrologia; Clínica e Laboratório de Referência em Saúde Reprodutiva e Sexual
Masculina” localizada na cidade de São Paulo, Estado de São Paulo, Brasil.
3.2 Amostra populacional
No total foram analisados dados de 316 prontuários de pacientes do sexo
masculino com idade de 18 a 59 anos, que se apresentavam para investigação de
infertilidade (não conseguiram engravidar suas parceiras após, pelo menos, 12 meses
de relações sexuais periódicas sem utilizar métodos contraceptivos), seja como
queixa atual ou história de infertilidade durante sua vida conjugal, durante o período
de janeiro de 2009 e dezembro de 2017 e que realizaram análise seminal completa,
dosagem sérica de testosterona total e pelo menos um método de aferição de volume
testicular (orquidômetro de Prader, paquímetro de Seager e/ou ultrassonografia de
testículos), dentro do período de seis meses da consulta inicial.
MÉTODOS - 23
A população estudada abrange homens de todas regiões do país, pertencentes
às classes socioeconômicas mais elevadas, que atualmente corresponde à população
que tem acesso a atendimento especializado em Andrologia no Brasil. Raros serviços
ligados ao Sistema Único de Saúde oferecem atendimento específico em infertilidade
masculina, muitas vezes desprovidos de laboratório especializado para diagnóstico e
manejo do sêmen.
Para obtenção da amostra final do estudo foram utilizados os seguintes
critérios de exclusão: (a) pacientes com idade menor que 18 anos ou maior que 60
anos, (b) pacientes que não possuíam a dosagem sérica de testosterona total e/ou
análise seminal completa realizadas no período de seis meses a contar da consulta
inicial, (c) ausência de registro de método de aferição de volume testicular, quer seja
pelo orquidômetro de Prader, pelo paquímetro de Seager ou ainda por meio da
ultrassonografia dos testículos, (d) presença de doenças genéticas que afetam a
função testicular e levem à infertilidade como a fibrose cística, a microdeleção do
cromossomo Y e alterações de cariótipo como a Síndrome de Klinefelter e
mosaicismos em geral, (e) histórico de câncer submetido a tratamento radioterápico
e/ou quimioterápico, (f) presença de infecção nos órgãos reprodutivos (orquite,
epididimite, prostatite e/ou infecção sexualmente transmissível) detectada ao exame
físico e/ou no momento da realização da análise seminal, (g) história de criptorquidia
e/ou ectopia testicular.
A Figura 1 demonstra o fluxograma de obtenção da amostra final do estudo
com base no número total de pacientes do sexo masculino atendidos por infertilidade
no período de 2009 a 2017, ressaltando os fatores de inclusão e exclusão da pesquisa.
MÉTODOS - 24
316 pacientes inférteis com
dosagem de testosterona total,
análise seminal completa e
volume testicular aferido
1 paciente excluído por idade
1 paciente excluído por não possuir dosagem de
testosterona total e/ou análise seminal completa nos
primeiros 6 meses da consulta inicial
14 pacientes excluídos por ausência de registro de
volume testicular
15 pacientes excluídos por presença de infecção nos
órgãos reprodutivos
2 pacientes excluídos por doença genética
2 pacientes excluídos por tratamento prévio de câncer
1 paciente excluídos por criptorquidia
280 pacientes inférteis de 18-59 anos com
dosagem de testosterona total, análise
seminal completa e volume testicular
aferido
Figura 1 - Diagrama de seleção da amostra
3.3 Análises seminais e laboratoriais
Todas as análises seminais foram realizadas no Laboratório de Andrologia da
clínica em questão, seguindo os critérios de controle de qualidade interno e externo.
Os exames laboratoriais foram realizados em laboratórios escolhidos pelos pacientes,
em estabelecimentos que atendiam aos requisitos de qualidade. Foram considerados
para o estudo dosagens hormonais e bioquímicas. O Quadro 1 resume os exames
laboratoriais realizados pelos indivíduos da amostra com as unidades de medidas
utilizadas, enquanto o Quadro 2 demonstra as metodologias utilizadas para dosagens
hormonais e bioquímicas. Os valores de testosterona total foram também divididos
em quartis separados pelos percentis P25%, P50% e P75%. Os valores da fração livre
MÉTODOS - 25
de testosterona foram calculados com base na dosagem da testosterona total e a
dosagem do SHBG através do cálculo proposto por Vermeulen, Verdouk e
Kaufman142 (www.issam.ch/freetesto.htm). Por fim, calculou-se o valor da razão
testosterona total/estradiol (T/E2) para verificar se era influenciada pelas variáveis de
hábitos e estilo de vida.
Quadro 1 - Exames laboratoriais com unidades de medidas mais utilizadas
para mensurar as variáveis hormonais e bioquímicas, 2009 a 2017
Exame Laboratorial Abreviatura Unidade de medida
Testosterona total TT ng/dL
Testosterona livre TL ng/dL
Hormônio luteinizante LH UI/L
Hormônio folículo-estimulante FSH UI/L
Prolactina PRL ng/mL
Hormônio tireo-estimulante TSH mUI/L
Tiroxina livre T4 livre ng/dL
Estradiol E2 pg/mL
Di-hidrotestosterona DHT pg/mL
Glicemia de jejum - mg/dL
Hemoglobina glicada HbA1c %
Insulina - mUI/L
Colesterol total - mg/dL
Lipoproteína de alta densidade HDL mg/dL
Lipoproteína de baixa densidade LDL mg/dL
Lipoproteína de muito baixa densidade VLDL mg/dL
Triglicerídeos - mg/dL
Ferritina - μg/L
Globulina ligadora de hormônios sexuais SHBG nmol/L
25(OH) vitamina D Vitamina D ng/mL
FONTE: Exames laboratoriais constantes em prontuários
MÉTODOS - 26
Quadro 2 - Metodologia de dosagens mais utilizadas para mensurar as
variáveis hormonais e bioquímicas, 2009 a 2017
Variável Métodos utilizados pelos laboratórios
Testosterona Total Ensaio imunofluorométrico e eletroquimioluminescência
LH Ensaio imunofluorométrico e eletroquimioluminescência
FSH Ensaio imunofluorométrico e eletroquimioluminescência
Prolactina Ensaio imunométrico quimioluminescente
TSH Ensaio eletroquimioluminométrico de terceira geração
T4 Livre Imunoensaio competitivo por quimioluminescência
Estradiol Eletroquimioluminométrico
DHT Enzimaimunoensaio, Radioimunoensaio, Cromatografia líquida acoplada
à espectrometria de massas em tandem
Glicemia de jejum Enzimático (hexoquinase)
Hemoglobina glicada Cromatografia em Coluna de troca iônica em sistema de HPLC
Insulina Ensaio eletroquimioluminométrico
Colesterol total Enzimático colorimétrico
HDL Enzimático colorimétrico
LDL Enzimático colorimétrico
VLDL Enzimático colorimétrico
Ferritina Eletroquimioluminométrico
SHBG Ensaio imunofluorométrico e Eletroquimioluminescência
25(OH) vitamina D
Eletroquimioluminescência; Imunoensaio Competitivo
quimioluminescente; Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de
massas em tandem
FONTE: Exames laboratoriais constantes em prontuários - Androscience, 2018.
HLPC: Cromatografia líquida de alta performance (High performance liquid cromatography).
3.3.1 Coleta de amostra seminal
As amostras de sêmen foram obtidas por masturbação, após um período de dois a
sete dias de abstinência ejaculatória, de acordo com a Organização Mundial de Saúde
(OMS), em frasco de polipropileno estéril e descartável, em área anexa ao laboratório.
Uma alíquota da amostra fresca foi submetida à análise seminal completa para a rotina do
laboratório, e, em seguida, o restante foi utilizado para os testes funcionais espermáticos143.
MÉTODOS - 27
3.3.2 Avaliação macroscópica das variáveis espermáticas
A avaliação macroscópica do ejaculado foi realizado mediante a verificação
da cor, sendo normal a coloração branco-opaco. O volume do ejaculado foi aferido
pela aspiração de toda amostra com o auxílio de uma pipeta graduada acoplada a um
pipetador eletrônico.
A viscosidade foi avaliada pipetando-se a amostra seminal e se observando a
extensão do filamento, sendo que uma extensão superior a 2,0 cm foi considerada
alterada, ao passo que foi considerada viscosidade normal quando o sêmen saiu da
ponteira da pipeta em gotas. Na sequência, as amostras foram acondicionadas em
uma placa aquecida à temperatura de 36,7ºC durante 30 minutos, a fim de se
proceder a liquefação seminal antes da avaliação da concentração e demais
parâmetros. O pH do sêmen liquefeito foi determinado através da colocação de uma
gota de sêmen sobre um papel sensível ao pH e mediante comparação de cores, após
30 segundos, com a fita de calibragem. O intervalo temporal entre a coleta de uma
amostra seminal e sua avaliação inicial não excedeu 60 minutos143.
3.3.3 Avaliação microscópica das variáveis espermáticas
Após a avaliação das variáveis macroscópicas, a amostra foi manualmente
homogeneizada, agitando-se cuidadosamente o frasco coletor por cerca de cinco
segundos. A determinação destas variáveis foi obtida pela análise de alíquota de
sêmen homogeneizado. Foram adicionados cinco microlitros (μL) da amostra em
câmara de Makler (Sperm counting Chamber, Sefi-Medical Instruments, Israel) para
observação em microscópio com magnificação de 20 vezes (x) (Eclipse E400, Nikon,
Japão). Para análise morfológica, 10 microlitros de amostra foram adicionados em
MÉTODOS - 28
lâmina de vidro para a confecção de esfregado, seguido pela coloração com kit
Panótico. As lâminas foram analisadas em microscópio com aumento de 1000x
(Eclipse E400, Nikon, Japão)143.
Os seguintes aspectos microscópicos foram avaliados: número total de
espermatozoides móveis progressivos (milhões), número total de espermatozoides
móveis (milhões), número total de espermatozoides (milhões), concentração de
espermatozoides (milhões/ml), motilidade progressiva (%), motilidade total (%) e
morfologia espermática (%).
3.3.3.1 Concentração espermática
A concentração espermática foi determinada em câmera de Makler, sendo
utilizada alíquota de 5 µL de amostra e coberta por lâmina reticulada, apropriada
para a câmara em questão. Foi contado o número de espermatozoides móveis e
imóveis presentes em três fileiras não consecutivas, contendo 10 quadrados cada
uma. A concentração espermática foi determinada pela média das três fileiras,
expressa em milhões de espermatozoides por ml de sêmen (106/mL)143.
Concentração espermática = (106/mL) = Nº de espermatozoides móveis + imóveis
Quanto à concentração de espermatozoides, o limite de referência adotado foi
de 15 milhões de espermatozoides/ml (x106/mL) para ser classificado como
oligozoospermia quando menor que este limite. O número foi expresso em milhões
de espermatozoides por ml de ejaculado143.
MÉTODOS - 29
3.3.3.2 Número total de espermatozoides
O número total de espermatozoides no sêmen foi determinado pela multiplicação
do resultado da concentração espermática pelo volume ejaculado em mL143.
N° Total de espermatozoides = Concentração de espermatozoides x volume seminal
O número total de espermatozoides móveis no sêmen foi determinado pela
multiplicação do número de espermatozoides móveis (x106/mL) pelo volume
ejaculado em mililitro143.
N° Total de espermatozoides móveis = Concentração de espermatozoides móveis x volume seminal
3.3.3.3 Motilidade espermática
Foram avaliadas a motilidade qualitativa e quantitativa. A motilidade
quantitativa foi realizada utilizando-se a câmara de Makler e microscópio de
contraste de fase (magnificação: 200x). Uma alíquota de cinco µL da amostra foi
adicionada na câmara sob lamínula e realizada a avaliação de 100 espermatozoides.
Este mesmo procedimento foi repetido uma vez, e nos casos de diferença superior a
10%, uma terceira análise foi realizada. O valor final definido pela multiplicação do
número de espermatozoides móveis por 100, dividido pela concentração espermática.
O resultado foi expresso em porcentagem143.
Quanto a motilidade qualitativa, os espermatozoides então foram
classificados em: motilidade progressiva (espermatozoides que se deslocam
unidirecionalmente, correspondendo aos graus A+B do manual OMS 1999),
motilidade não-progressiva (espermatozoides que se movem, porém sem se deslocar,
sendo o grau C do manual OMS 1999) e imóveis (grau D do manual OMS
1999)143,144.
MÉTODOS - 30
A motilidade total foi calculada a partir da soma da motilidade progressiva e
da não-progressiva, conforme critério estabelecido pela OMS143. O limite de
referência para a motilidade progressiva é de 32% (porcentagem que indica a relação
entre número de espermatozoides progressivos e número de espermatozoides
total)143, abaixo disso a amostra é denominada como astenozoospermia, quando
existe uma baixa motilidade do espermatozoide, prejudicando a sua capacidade de
fecundar o óvulo.
3.3.3.4 Morfologia espermática
A forma dos espermatozoides foi analisada por critérios estabelecidos
segundo OMS e segundo critério estrito de Tygerberg ou, popularmente, critério de
Kruger143,145. Segundo a OMS143, os espermatozoides foram classificados como
normais quando apresentam cabeça oval, superfície lisa e regular, com acrossomo
compreendendo de 40% a 70% da área da cabeça com menos de dois vacúolos. A
peça intermediária deve ser delgada, regular, com eixo alinhado à cabeça e sem
citoplasma residual. A cauda deve ter aproximadamente 45 µm e mesmo calibre por
toda a sua extensão. Para a classificação segundo o critério estrito145, foram
considerados normais os espermatozoides com cabeças de forma oval, lisa e regular,
dimensões entre 5 µm a 6 µm de comprimento e 2,5 µm a 3,5 µm de largura e o
acrossomo regular, ocupando de 40% a 70% do segmento cefálico. Os
espermatozoides com deformidade da peça intermediária foram considerados
anormais, assim como aqueles que apresentaram gota citoplasmática remanescente
que compreendesse mais da metade do tamanho da cabeça do espermatozoide. Em
relação à cauda, foi considerada normal quando esta se apresentava levemente mais
MÉTODOS - 31
fina que a porção intermediária, não enrolada e com aproximadamente 45 µm de
comprimento. O resultado foi expresso em percentagem de espermatozoides ovais
normais. Tanto a OMS, quanto a morfologia de Kruger determinam valores acima de
4% como normais. Abaixo disso, denomina-se teratozoospermia143,145.
3.3.3.5 Determinação do número de células redondas
Células redondas correspondem a células germinativas imaturas e corpos
grandes anucleados de citoplasma residual, que se originam do epitélio dos túbulos
seminíferos, ou ainda leucócitos. Caso mais de uma célula redonda fosse encontrada
no esfregaço a fresco por campo microscópico em magnificação de 400x (Eclipse
E400, Nikon, Japão), o que equivale a uma concentração de aproximadamente 1 x
106/mL, é indicada a realização do teste de peroxidase (teste de Endtz), específico
para determinar a presença de leucócitos143.
3.3.3.6 Determinação do número de leucócitos
Na presença de concentração de células redondas na amostra ≥ 1 x 106/mL,
foi realizado o teste de Endtz, no qual foram contadas as células peroxidase positivas
(leucócitos polimorfonucleares, neutrófilos e macrófagos, coradas com benzidina).
A uma alíquota de 10 μL de sêmen liquefeito, adicionou-se 20 μL de solução
de peroxidase, composta de 25 mL de etanol 96%, 0,06 g de benzidina e 25 mL de
água destilada. Após homogeneização e incubação por oito minutos à temperatura
ambiente, foi realizada a leitura de toda câmara de Maklen utilizando-se um
microscópio óptico comum, em 100x de magnificação (Eclipse E400, Nikon, Japão).
MÉTODOS - 32
As células peroxidase positivas coraram-se em marrom. O número de leucócitos é
calculado multiplicando-se o número total de células por quatro visando a correção
do fator de diluição e dividindo-se por 10. Foram consideradas normais amostras
com Endtz abaixo de 1 x 106/mL143.
3.3.4 Testes funcionais dos espermatozoides
3.3.4.1 Avaliação da atividade da enzima creatina quinase
Os níveis de creatina quinase (CK) foram aferidos utilizando-se a técnica
descrita por Huszar et al.146, a qual determina o índice de redução do dinucleotídeo
de nicotinamida adenina (NAD). As reações enzimáticas envolvidas neste estudo são
as seguintes:
Fosfato de creatina + ADP CK
Creatina + ATP
ATP + Glicose HK
ADP + G-6-P
G-6-P + NAD G-6-PDH
6-PG + NADH
FONTE: Hallak22 e Huszar et al.146
A CK catalisa a reação entre o fosfato de creatina e a adenosina difosfato
(ADP), levando a formação de creatina e adenosina trifosfato (ATP). O ATP é
utilizado na fosforilação da glicose e consequente produção da glicose-6-fosfato (G-
6-P), na presença de hexoquinase (HK). A G-6-P é então oxidada a 6-fosfogliconato
(6-PG), na presença do NAD, catalisada pela glicose-6-fosfato desidrogenase (G-6-
PDH). Durante esta oxidação, uma quantidade equimolar de NAD é reduzida em
nicotinamida dinucleotídeo hidrogenase (NADH), aumentando a absorbância em 340
nm. O nível de alteração na absorbência aferido no espectrofotômetro é diretamente
proporcional à atividade da CK146.
MÉTODOS - 33
Na determinação dos níveis de CK, de início é realizada a lise dos
espermatozoides com Buffer Imidazole e Triton X-100 (Sigma®). Foram transferidos
250 μL de sêmen fresco para um tubo cônico com 3 mL de Buffer Imidasole (0,03 M em
0,154 M de NaCl, Sigma-Aldrich, Estados Unidos), misturados em vórtex e
centrifugados a 500xg por sete minutos (Eppendorf 5702-RH, Brasil). O sobrenadante
foi descartado e re-suspenso em 250 μL da solução Triton X100, misturados por 30
segundos em vórtex à força máxima e centrifugados a 500xg por 10 minutos. Em uma
cubeta 20 μL do sobrenadante foi misturado a 1 mL do reagente CK (BioClin, Brasil),
invertendo a cubeta 30x e foi incubado a 37% por dois minutos. A leitura foi realizada
em espectrofotômetro (Spectroquant Pharo 300, Marck, Alemanha) a 340 nm, a cada 30
segundos, por quatro minutos e o resultado expresso em U/108 espermatozoides147.
As fórmulas utilizadas para o cálculo dos níveis de CK foram:
ΔA = A final – A inicial ÷ 2
CK = ΔA x 809,5 ÷ concentração
3.3.4.2 Quantificação de anticorpos anti-espermatozoides
A avaliação da presença de anticorpos ligados a espermatozoides foi realizada
através do método de mixed antiglobulin reaction (MarScreen®, Estados Unidos), no qual
misturou-se 10 μL de sêmen fresco a 10 μL das esferas de imunoglobulina do tipo A (IgA)
e imunoglobulina do tipo G (IgG) com 10 μL de soro anti-IgA e anti-IgG em lâmina
coberta com lamínula. Após três minutos, esta mistura foi avaliada em microscopia óptica
comum com magnificação de 400x (Eclipse E400, Nikon, Japão). Espermatozoides
móveis com immunobeads positivos formaram um misto aglutinado de partícula, o que
indica a presença do anticorpo, seja IgA, seja IgG22.
MÉTODOS - 34
3.3.4.3 Dosagem de Radicais Livres de Oxigênio
A mensuração de espécies reativas de oxigênio ou radicais livres de oxigênio
(do inglês, reactive oxygen species, ROS) em sêmen puro foi realizada através o
método da quimiluminescência, tendo como reagente o luminol. A solução estoque
de luminol 100 mmol/L foi preparada dissolvendo-se 100 mg de pó luminol (5-
amino-2,3diidro-1,4 ftalazinediona, Sigma Chemical Co., catálogo #A8511, Saint
Louis, Estados Unidos) em 5,64 mL de dimetil sulfóxido (dimetilsulfóxido [DMSO],
Sigma Chemical Co., catálogo #D58790, Saint Louis, Estados Unidos). Já a solução
de trabalho de luminol foi preparada diluindo-o em 1:20 com o DMSO148,149.
Prévio à análise, cinco tubos de ensaio foram devidamente numerados. O tubo
1, considerado tampão, foi preenchido com 400 μL de meio de cultura Human Tubal
Fluid (HTF) modificado (modified HTF, Irvine Cientific, catálogo #90126, Santa Ana,
Estados Unidos). Os tubos 2 e 3, ditos controles, foram preenchidos com 400 μL de
HTF e 10 μL de solução de trabalho de luminol. Já os tubos 4 e 5, denominados testes
para o sêmen puro, foram preenchidos com 400 μL da amostra seminal total e 10 μL
da solução de trabalho do luminol. O tubo 1 foi utilizado para avaliar a
quimioluminescência do HTF sem adição do luminol, ao passo que os tubos-controle
foram usados para avaliar a quimioluminescência pós-adição do luminol. O agitador de
tubos vortex foi utilizado para misturar as alíquotas presentes nos tubos de forma
uniforme. Foram ainda utilizados dois tubos tanto na aferição dos tubos controle,
quanto dos tubos testes, com o intuito de minimizar os erros de pipetagem149.
As amostras foram pipetadas nos respectivos tubos apenas quando foram
avaliadas nos luminômetros (MicroBeta® Trilux [Perkin Elmer Life Sciences,
Finlândia, software versão 4,7] e Autolumat Plus [Bertold Technologies, Alemanha],
MÉTODOS - 35
sendo a quimioluminescência aferida durante 15 minutos à uma temperatura de 37ºC.
Os resultados obtidos dos tubos de 2 a 5 foram somados e divididos por dois,
buscando uma média aritmética. Os resultados obtidos nos tubos 4 e 5 foram
multiplicados por 20 x 106, sendo posteriormente divididos pela concentração de
espermatozoides em milhões/mL. Todos os resultados foram expressos em fótons
contados por minuto (do inglês, counts per minute, CPM). O cálculo do nível de
ROS no sêmen foi realizado através da fórmula148,149:
ROS (x 104cpm)/ 20 X 106 espermatozoides =ΔTp x 20 x 106 / [C]
Onde:
- ΔTp = sêmen total (tubo 4 + tubo 5)/2
- 20 x 106 = ajuste da concentração espermática para 20 x 106 mL de sêmen)
- [C] = concentrações de espermatozoides na amostra por milhões
- ΔTc = controle (tubo 2 + tubo 3) /2
Os valores considerados como normais para os níveis de ROS são148:
- Amostras com leucócitos: <1,25 x 104cpm/20x106
- Amostras sem leucócitos: <0,55 x 104cpm/20x106
FONTE: Cocuzza149.
Figura 2 - Representação do procedimento de dosagem dos radicais livres de oxigênio no sêmen
MÉTODOS - 36
3.3.4.4 Avaliação do DNA espermático
O método utilizado para avaliação da integridade do DNA espermático foi o
teste da estrutura da cromatina espermática (Sperm Chromatin Structure Assay,
SCSA®), considerado como padrão-ouro para a avaliação das taxas de fragmentação
do DNA e também para verificar-se o grau de instabilidade do DNA espermático150.
Uma alíquota de sêmen foi diluída em 200 μL de TNE buffer (0,15 M NaCl,
0,01 M Tris-HCl, 0,001 M de ácido etilenodiaminotetracético [EDTA], pH=7,4;
Sigma-Aldrich, Estados Unidos) para uma concentração de 1-2 x 106
espermatozoides/mL. Adicionou-se, então, 400 μL de solução ácido detergente (0,08
N HCl, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X 100, pH=1,2, Sigma-Aldrich, Estados Unidos)
e, após 30 segundos, as células foram coradas pela adição de 1,2 mL de solução de
laranja de acridina (6,0 μg de laranja de acridina [Polysciences Inc, Estados Unidos],
0,037 M de ácido cítrico, 0,126 M Na2HPO4, 0,0011 EDTA, 0,15 M NaCl, pH=6
[Sigma-Aldrich, Estados Unidos]). Três minutos após o início do procedimento,
5.000 espermatozoides foram avaliados em citômetro de fluxo (BD FacsCalibur)147.
Os dados inseridos no software SCSA para o cálculo dos índices de
fragmentação de DNA (%DFI) e de maturação de espermatozoides dependem
primariamente da coloração emitida por dois lasers FL1 e FL3 do citômetro de fluxo
e emitem coloração verde quando a cromatina é normal, e coloração vermelha
quando há fragmentação de DNA (Figura 3). Na espécie humana, o valor limite de
%DFI acima do qual há maior risco de abortos espontâneos e infertilidade é 25%150.
MÉTODOS - 37
FONTE: Evenson150 adaptado por Pariz151
Figura 3 - Representação da classificação dos espermatozoides de acordo com a coloração
adquirida pelos lasers FL1 e FL3 do citômetro de fluxo. Durante a passagem, caso a
cromatina esteja íntegra, os lazeres emitem coloração verde; caso esteja fragmentada,
emitem coloração avermelhada. Os dados são dispostos em um citograma, onde a
região “DNA íntegro” representa espermatozoides sem fragmentação mensurável,
enquanto a “Alta fragmentação de DNA” corresponde a região de mais intensa
fragmentação. O HDS (High DNA Stainability) representa a região com
espermatozoides com histonas anormais, devido sua alta coloração, porém o estresse
do teste não foi suficiente para quebrar a fita do DNA
MÉTODOS - 38
3.4 Análises dos dados clínicos e de hábitos e estilo de vida
Foram analisadas as seguintes informações individuais e de dados clínicos
dos pacientes constantes em sua primeira consulta: idade (em anos), índice de massa
corporal (IMC) calculado diretamente pela fórmula IMC = Peso (kg)/ altura (m2)152,
presença de varicocele clínica153 e volume testicular.
O volume testicular foi derivado de dados registrados através de análises
semiológicas (orquidômetro de Prader e/ou Paquímetro de Seager) realizado pelo
mesmo examinador e/ou de dados ultrassonográficos registrados, todos obedecendo
o intervalo de realização de até seis meses da consulta inicial.
O método utilizado para mensuração do volume testicular com orquidômetro
de Prader usa um conjunto de 14 modelos elipsoides com volumes crescentes de 1
cm3, 2 cm3, 3 cm3, 4 cm3, 5 cm3, 6 cm3, 8 cm3, 10 cm3, 12 cm3, 15 cm3, 20 cm3, 25
cm3, 30 cm3, 35 cm3. O volume então é estimado através de comparação visual ao
conjunto de modelos durante a palpação dos testículos154.
Já na biometria testicular realizada com o paquímetro de Seager foram
aferidos o comprimento (C) e a largura (L) de cada testículo para se calcular o
volume testicular (v) utilizando-se a fórmula de Hansen: v = C x L2 x 0,52155,156.
Os dados dos exames ultrassonográficos dos testículos foram retirados dos
prontuários dos pacientes, porém todos estes exames foram realizados por um único
profissional radiologista, de acordo com protocolo padronizado de metodologia e ajustes
de equipamento, com aparelho modelo Logic 9 da marca GE (Milwaukee, EUA),
fabricação de 2002, portador de sondas lineares multifrequenciais de 8 MHz a 14 MHz,
ajustadas com o mesmo número de focos. O exame ultrassonográfico dos testículos
constou de estudo em modo B, doppler colorido e análise espectral (doppler pulsado),
MÉTODOS - 39
sendo a documentação feita inclusive por meio digital com o arquivamento sendo feito
nos prontuários eletrônicos dos pacientes em formato Joint Photographics Experts
Group (JPEG). O exame foi realizado com paciente em supinação, apoiando-se
levemente o transdutor de 12 MHz sobre a pele do escroto e gel aquecido.
Posteriormente, com paciente em ortostase, foi avaliado o plexo pampiniforme, após
cinco minutos de espera. O volume testicular (VT) foi mensurado em centímetros (cm)
em três eixos: longitudinal (L - maior diâmetro bipolar), transverso (T - maior eixo do
equador do testículo) e anteroposterior (AP - ao nível do equador). Para o cálculo do VT,
utilizou-se a fórmula VT = (L x T x AP x 0,52), com resultado expresso em cm3 156.
Para fins de análise de regressão múltipla de hábitos e estilo de vida, foram
levadas em consideração as seguintes informações, sempre dos últimos 12 meses: (I)
histórico de sedentarismo, (II) usuário fumante regular de maconha, (III) uso
cotidiano de cigarros de nicotina (tabaco), (IV) consumo habitual de bebidas
alcoólicas (uísque, cerveja e vinho tinto), (V) diagnóstico de obesidade, (VI)
presença de varicocele clínica, e (VII) idade do paciente.
Importante ressaltar que estas informações de hábitos e estilo de vida encontradas
nos prontuários derivam todas de questionários auto-responsivos não validados
culturalmente, os quais são ofertados para preenchimento dos pacientes previamente ao
atendimento, em ambiente privativo e reservado, visando, como diretriz da própria
instituição, diminuir possíveis vieses de resposta e participação157.
Dentre o questionário da clínica utilizado para análise de estilo de vida quanto ao
perfil de atividade física, o qual aborda questões como “Pratica alguma atividade física
regularmente? Qual(is) tipo(s) de atividade(s) física(s) ou esporte(s) e com qual
frequência semanal? Você se considera sedentário?”, acabou-se por escolher como
MÉTODOS - 40
parâmetro para análise multivariada em regressão o estilo de vida sedentário por ser o
que tinha maior frequência de preenchimento por parte dos pacientes e por observar
empiricamente que homens que se afirmam sedentários dificilmente não o são. Partindo
destas premissas, o sedentarismo foi analisado através da confirmação em resposta tipo
sim ou não, em registro de prontuário, à pergunta: “Você se considera sedentário?”.
É ofertado também aos pacientes da clínica um questionário que aborda o uso
de medicamentos e drogas. Neste é registrado o uso de drogas ilícitas, especificando
qual(is) droga é (foi) utilizada, com referências à quantidade e peculiaridades de
consumo, como variações da droga, possíveis combinações, dentre outras.
Especificamente para a maconha, há a pergunta: “Você usa (fuma) maconha
regularmente há mais de um ano?”. Vale ressaltar da dificuldade de se conseguir
extrair tais informações sobre peculiaridades do uso de drogas ilícitas,
principalmente dos usuários de maconha, pois não se afirmam dependentes da
substância, muito menos reconhecem seus efeitos deletérios no organismo22. Desta
maneira, foi observado grande número de preenchimentos incompletos de
questionários com apenas confirmação do uso. Neste contexto, para efeitos da análise
regressiva, foi optado pela resposta afirmativa ou não se era usuário regular de
maconha nos últimos 12 meses, sem levar em consideração peculiaridades de uso.
Quanto à obesidade, os pacientes foram divididos em dois grupos, conforme
IMC, para efeitos de análise: não obesos (IMC < 30 kg/m2) e obesos (IMC ≥ 30 kg/m2).
Para o hábito do tabagismo, foi realizado o cálculo da carga tabágica em
anos-maço, derivando os dados do questionário sobre uso de medicamentos e drogas.
Através das perguntas: “Você é fumante de cigarros de nicotina? Se sim, quantos
cigarros fuma em média por dia? Com quantos anos começou a fumar?”, foram
obtidos os dados necessários para este cálculo. Para tanto, o número de cigarros
MÉTODOS - 41
fumados por dia foi dividido por 20 (quantidade de cigarros em um maço) e em
seguida multiplicado pelo número de anos durante os quais os pacientes referiram o
uso do tabaco (número de anos-maço).
O consumo habitual de bebidas alcoólicas também teve os dados coletados do
prontuário da parte que deriva do questionário utilizado para o tabagismo e uso de
maconha, através dos seguintes questionamentos, caso consumissem bebidas alcoólicas no
último ano: (I) Qual a quantidade em média de doses de uísque que você consome por dia
ou por semana nos últimos 12 meses? (II) Qual a quantidade de taças de vinho tinto que
você consome por dia ou por semana nos últimos 12 meses? (III) Qual a quantidade de
latas de cerveja que você consome por dia ou por semana nos últimos 12 meses?
Foi calculado o consumo diário de cada uma destas bebidas por indivíduo, em
mL/dia, com a seguinte escala de conversão de doses para mL de acordo com a OMS
201033:
- Uísque: uma dose = 30 mL
- Vinho tinto: uma dose = 100 mL
- Cerveja: uma dose = 330mL
Em seguida para se obter o consumo em ml de álcool puro/dia, multiplicou-se a
quantidade ingerida (em mL) pela graduação alcoólica (em porcentagem por volume,
%vol) estimada para cada tipo de bebida que foi estudada. A graduação alcoólica
equivale ao teor alcoólico de cada tipo de bebida, que no presente estudo foi estabelecido
o seguinte: uísque (graduação alcoólica de 40 %vol), cerveja (graduação alcoólica de 4
%vol) e vinho tinto (graduação alcoólica de 12 %vol). Portanto, para fins de cálculo,
multiplicou-se consumo diário (em mL/dia) pelos seguintes coeficientes: 0,40 para o
uísque; 0,04 para a cerveja e 0,12 para o vinho tinto33.
MÉTODOS - 42
3.5 Análise Estatística
Os dados foram coletados de prontuários e organizados em planilha
Excel® (for Mac) e, após conferência, foram importados para ambiente de análise
de dados do software Statistical Package for the Social Science (SPSS®) 23 (for
Mac). Os dados do tipo contínuo foram submetidos a teste de normalidade na
distribuição pelo teste de Shapiro-Wilk e posteriormente os dados obtidos de cada
variável foram resumidos pelos valores de média e seu respectivo desvio-padrão.
Os dados categóricos foram descritos pela sua ocorrência absoluta e sua
respectiva proporção categórica.
Na análise de regressão múltipla com objetivo de identificar fatores que
influenciaram sobre os desfechos das medidas de função testicular foram
utilizadas as variáveis independentes idade, IMC, presença de varicocele clínica,
sedentarismo, tabagismo, consumo habitual de bebidas alcoólicas e uso de
maconha ≥12 meses. O IMC foi dividido em dois grupos [obesos (IMC ≥ 30
kg/m2) e não obesos (IMC < 30 kg/m2)]. Já o tabagismo em grupos de acordo com
a carga tabágica (≥ 10 anos-maço e < 10 anos-maço).
Para o cálculo do ponto de corte em álcool puro em mL/dia de consumo de
bebidas alcoólicas, foi calculada uma média aritmética entre o ponto de corte de
três doses para cada uma das três diferentes bebidas: uísque (90 mL x 0,4 = 36
mL); cerveja (990 mL x 0,04 = 39,6 mL); vinho tinto (300 mL x 0,12 = 36 mL).
Média aritmética – (36 mL + 39,6 mL + 36mL) / 3 = 37,2 mL. Ressalta-se que o
corte de três doses deriva de publicação da OMS que afirma que há risco de
problemas à saúde especialmente se o indivíduo beber mais de duas doses por dia
e se não deixar de beber ao menos dois dias na semana33. Portanto, o grupo de
MÉTODOS - 43
consumo de bebidas alcoólicas ficou dividido de acordo com uma média
aritmética estimada consumo de álcool puro diário (≥ 37,2 mL/dia e < 37,2
mL/dia).
Foi aceito como diferença estatisticamente significante um erro do tipo I
menor ou igual a 0,05 para a validação (ajuste) do modelo e um alfa de até 0,1
para as variáveis independentes.
3.6 Aspectos Éticos
O estudo seguiu as considerações éticas dispostas na resolução 466 do
Conselho Nacional de Saúde, tendo sido submetido à avaliação do Comitê de
Ética do HC-FMUSP158.
Foi garantido o sigilo e, portanto, assegurado a privacidade quanto aos
dados confidenciais envolvidos no estudo, mesmo estes sendo derivados de
informação armazenada em prontuários médicos.
A assinatura do Termo de Consentimento Livre Esclarecido (TCLE) foi
dispensada com base na resolução da Comissão Nacional de Saúde (CNS)
nº466/2012- IV.8 por se tratar de uma análise retrospectiva de registros de
prontuários de pacientes, sem a necessidade de novo exame clínico dos pacientes
em questão158. Mesmo assim, todos pacientes atendidos autorizaram por escrito o
uso de todos os dados armazenados em prontuários para fins de pesquisa
científica.
Aqueles que não autorizam por escrito tal procedimento, o software
próprio do prontuário eletrônico da Clínica não os inclui nos mecanismos de
busca.
MÉTODOS - 44
O Anexo A se refere ao parecer consubstanciado do Comitê de Ética em
Pesquisa (CEP) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da
Universidade de São Paulo (HC-FMUSP), órgão responsável pela aprovação
deste estudo (CAAE 92728018.0.0000.0068), ao passo que o Anexo B
corresponde à carta de pedido de dispensa do TCLE ao CEP do HC-FMUSP. Já o
anexo C se refere ao termo de anuência da instituição onde foi realizada coleta
dos dados.
RESULTADOS - 46
4.1 Característica da Amostra
No total, a amostra final foi composta por 280 pacientes (Figura 1), com uma
média de idade de 38,05 ± 8,81 anos, com valor mínimo de 18 e máximo de 59 anos.
O tempo médio de abstinência ejaculatória para coleta do exame seminal foi de 72 horas.
A Tabela 1 demonstra o descritivo da amostra quanto aos dados clínicos-
epidemiológicos, ressaltando hábitos e estilo de vida.
Tabela 1 - Resumo descritivo da amostra quanto aos dados clínicos-
epidemiológicos (n=280 homens), 2009-2017
Dado descritivo Valores
Idade (anos), média ± DP (IC95 min-máx.) 38,05 ± 8,81 (37,01-39,08)
IMC (kg/m2), média ± DP (IC95 min-máx.) * 27,02 ± 3,86 (26,52-27,52)
Baixo peso, (N) % 1 (0,35)
Eutrófico, (N) % 76 (27,14)
Sobrepeso, (N) % 114 (40,71)
Obeso, (N) % 42 (15,00)
NR, (N) % 47 (16,80)
Presença de varicocele, N (%) 173 (61,8)
Direita, N (%) 2 (0,7)
Esquerda, N (%) 47 (16,8)
Bilateral, N (%) 124 (44,3)
Sem varicocele, N (%) 52 (18,9)
NR, N (%) 54 (19,3)
Volume testicular
Orquidômetro (mL)
Testículo direito, média ±DP (IC95 min-máx.) 14,50 ± 5,44 (13,77-15,22)
Testículo esquerdo, média ±DP (IC95 min-máx.) 15,83 ± 5,63 (15,07-16,58)
Continua
RESULTADOS - 47
Conclusão
Dado descritivo Valores
Paquímetro (mL)
Testículo direito, média ±DP (IC95 min-máx.) 13,88 ± 5,39 (13,05-14,71)
Testículo esquerdo, média ±DP (IC95 min-máx.) 16,72 ± 23,68 (13,07-20,37)
Ultrassonografia (mL)
Testículo direito, média ±DP (IC95 min-máx.) 16,57 ± 5,23 (15,40-16,79)
Testículo esquerdo, média ±DP (IC95 min-máx.) 16,10 ± 5,31 (15,89-17,26)
Tabagismo
Atual, N(%) 13 (4,6)
<10 anos-maço, N(%Atual) 0 (0,0)
≥10 anos-maço, N(%Atual) 13 (100,0)
Ex-tabagista, N(%) 15 (5,4)
<10 anos-maço, N(%Ex) 2(13,33)
≥10 anos-maço, N(%Ex) 13(86,67)
Nunca, N(%) 252 (90,0)
Sedentarismo
Sim, N(%) 105 (37,50)
Não, N(%) 111(39,64)
NR, N (%) 64 (22,86)
Consumo habitual de bebidas alcoólicas
Não, N(%) 179 (63,9)
Sim, N(%) 101 (36,1)
Destilados (Uísque)
Tempo (anos), média ±DP (IC95 min-máx.) 15,33 ±9,16 (12,36-18,30)
Consumo (mL/dia), média ±DP (IC95 min-máx.) 13,77 ±11,35 (9,93-17,61)
Fermentado (Cerveja)
Tempo (anos), média ±DP (IC95 min-máx.) 14,47 ±7,60 (12,38-16,57)
Consumo (mL/dia), média ±DP (IC95 min-máx.) 158,66 ±112,77 (128,17-189,14)
Fermentado (Vinho tinto)
Tempo (anos), média ±DP (IC95 min-máx.) 11,38 ±8,38 (8,58-14,17)
Consumo (mL/dia), média ±DP (IC95 min-máx.) 75,07 ±53,54 (60,16-89,97)
Usuários de drogas ilícitas
Não usuários, N (%) 235 (83,9)
Usuários de apenas 1 droga, N (%) 34 (12,1)
Usuário de 2 drogas, N (%) 4 (1,5)
Usuário de 3 drogas, N (%) 7(2,5)
FONTE: Prontuários - Androscience, 2018.
NR = Sem registro em prontuário; IC95 = intervalo de confiança de 95% * De acordo com Guidelines da OMS, 2010143
RESULTADOS - 48
A droga ilícita de maior consumo referida pela população estudada foi a
maconha (Cannabis sativa), com 15,36% da população estudada referindo seu uso,
com frequência bastante superior à de todas as outras relatadas (o LSD, por exemplo,
vem em segundo lugar em frequência com 2,50% da população). O Gráfico 1 ilustra
as drogas de uso ilícito referidas em uso ≥ 12 meses pela amostra estudada.
Gráfico 1 - Drogas ilícitas referida em uso pela população estudada, São Paulo
2009 a 2017
As médias, desvio padrão, valores mínimo e máximo dos parâmetros da
análise seminal e dos testes espermáticos funcionais estão descritos na Tabela 2, com
destaque para as médias elevadas obtidas em todos os testes funcionais,
principalmente na taxa de fragmentação de DNA (média 42,21 ± DP 21,89 %) e
níveis de ROS fresco (média 7,20 ± 19,53 104cpm/20x106).
RESULTADOS - 49
Tabela 2 - Resumo descritivo da amostra quanto à análise seminal e aos testes
espermáticos funcionais (n=280 homens), 2009-2017
Dado descritivo Média ± DP (Min-Máx)
Parâmetros seminais
pH 8,04 ± 0,29 (7,00-9,00)
Volume (mL) 3,01 ± 1,70 (0,25-10,00)
Concentração (106/mL) 72,59 ± 91,26 (0,00-800,00)
Nº total de espermatozoide (106) 189,98 ± 216,31(0,00-1440,00)
Nº total de espermatozoide móveis (106) 124,05 ±155,25 (0,00-1152,00)
Nº total de espermatozóides móveis progressivos (106) 66,33 ± 99,99 (0,00-748,00)
Motilidade total (%) 53,01 ± 24,64 (0,00-90,00)
Motilidade total progressiva (%) 32,46 ± 21,39 (0,00-75,00)
Morfologia normal OMS (%) 11,53 ± 8,14 (0,00-49,00)
Morfologia normal Kruger (%) 2,32 ± 2,67 (0,00-13,00)
Nº de células redondas (106/mL) 3,96 ± 5,64 (0,00-31,25)
Teste de Endtz - leucocitospermia (106/mL) 0,90 ± 2,58 (0,00-20,00)
Testes espermáticos funcionais
Atividade da Creatina Kinase (U/108 esperm) 2,39 ± 10,75 (0,00-103,62)
Anticorpos anti-espermatozoides + (%) 20,19 ± 13,74 (1,00-66,00)
Níveis de ROS fresco (104cpm/20x106) 7,20 ± 19,53 (0,00-137,50)
Taxa de fragmentação DNA (%) 42,21 ± 21,89 (5,00-90,00)
FONTE: Exames laboratoriais constantes em prontuários
As alterações seminais mais frequentes encontradas nas amostras estudadas
foram a teratozoospermia segundo Kruger145 com 72,7% dos homens (n=189) e a
astenozoospermia com 49,6% (n=139), segundo manual OMS143. A Tabela 3
descreve o resumo da amostra quanto à frequência de alterações seminais
encontradas.
RESULTADOS - 50
Tabela 3 - Resumo descritivo das alterações seminais encontradas na amostra
de homens inférteis estudada (n=280), 2009-2017
Parâmetro seminal Alteração* Frequência %
pH Normal OMS# 277 98,9
Ácido (< 7,2) 3 1,1
Volume (mL) Normal OMS# 249 88,9
Diminuído (< 1,5) 31 11,1
Concentração (106/mL) Normal OMS# 214 76,4
Oligozoospermia 66 23,6
Nº total de espermatozoide (106) Normal OMS# 208 74,3
Diminuído 72 25,7
Motilidade total (%) Normal OMS# 217 77,5
Diminuído 63 22,5
Motilidade total progressiva (%) Normal OMS# 141 50,4
Astenozoospermia 139 49,6
Morfologia normal OMS (%) Normal OMS# 214 84,9
Teratozoospermia 38 15,1
NR 28 10,0
Morfologia normal Kruger (%) Normal 71 27,3
Teratozoospermia 189 72,7
NR 20 7,1
FONTE: Prontuários - Androscience, 2018. NR = Sem registro em prontuário/ * De acordo com Guidelines da OMS, 2010143
# Normal OMS – dentro dos critérios adotados pela OMS, a qual estabeleceu o percentil 5% como mínimo de
“normalidade” para se avaliar fertilidade masculina.
Na Tabela 4, podem se observar as médias, desvio padrão, valores mínimo e
máximo dos parâmetros hormonais e bioquímicos encontrados na amostra. Já a
Tabela 5 resume os quartis que foram divididos os valores de testosterona total do
estudo.
RESULTADOS - 51
Tabela 4 - Resumo descritivo da amostra quanto aos parâmetros hormonais e
bioquímicos (n=280 homens), 2009-2017
Dado descritivo Média ± DP (Min-Máx)
Parâmetros hormonais
Testosterona total (ng/dL) 495,47 ± 188,33 (164,00 – 1231,00)
Testosterona livre calculada (ng/dL) 10,67 ± 4,58 (1,66 – 41,13)
LH (UI/L) 4,31 ± 2,51 (0,06-19,20)
FSH (UI/L) 5,23 ± 5,18 (0,22-41,50)
Estradiol (pg/mL) 25,46 ± 12,49 (1,00-62,00)
Prolactina (ng/mL) 8,33 ± 4,34 (1,40-31,00)
DHT (pg/mL) 449,37 ± 239,12 (42,50-1963,00)
TSH (mUI/L) 1,95 ± 1,10 (0,11-8,20)
T4 livre (ng/dL) 1,25 ± 1,28 (0,09-16,00)
Parâmetros bioquímicos
SHBG (nmol/L) 35,36 ± 35,35 (6,70-415,00)
Glicemia de jejum (mg/dL) 92,24 ± 15,67 (62,00-264,00)
Hemoglobina glicada (%) 5,36 ± 0,38 (4,40-7,06)
Insulina (mUI/L) 9,51 ± 8,09 (1,70-91,00)
Ferritina (μg/L) 315,13 ± 211,85 (25,00-1416,00)
Colesterol total (mg/dL) 198,17 ± 39,97 (317,00-90,00)
HDL (mg/dL) 47,57 ± 11,51 (25,00-117,00)
LDL (mg/dL) 125,60 ± 37,07 (11,00-229,00)
VLDL (mg/dL) 23,47 ±14,56 (6,00-138,00)
Triglicerídeos (mg/dL) 115,61 ± 64,38 (18,00-426,00)
25(OH) vitamina D (ng/mL) 28,50 ± 11,78 (7,00-75,00)
FONTE: Exames laboratoriais constantes em prontuários
Tabela 5 - Divisão em quartis da amostra segundo valores de testosterona total
(TT) (n=280 homens), 2009-2017
1ºQ 2ºQ 3ºQ 4ºQ
TT (ng/mL) 164,00-342,00 342,01-479,00 479,01-606,00 606,01-1231,00
N 72 73 71 70
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários
NOTA: Percentis da testosterona total – P25% (342,00ng/mL), P50% (479,00ng/mL), P75% (606,00ng/mL)
RESULTADOS - 52
4.2 Hábitos/Estilo de Vida e Parâmetros Hormonais
A partir da análise com regressão múltipla realizada, observou-se que
algumas variáveis de hábitos e estilo de vida influenciaram de forma significativa
certos parâmetros hormonais na população masculina infértil. Dentre elas, destacou-
se o uso (fumo) de maconha ≥ 12 meses como a de maior relevância, visto ter se
correlacionado de forma negativa com os níveis de estradiol (P < 0,001; B = -11,61)
(Tabelas 6 e 7), de forma positiva tanto com os níveis de prolactina (P < 0,001; B =
3,21) (Tabelas 8 e 9), quanto com a razão T/E2 (P = 0,004; B = 14,03) (Tabelas 10 e
11).
O tabagismo e o sedentarismo exerceram influência também nos níveis de
prolactina da população masculina infértil estudada. Contudo enquanto o hábito
sedentário correlacionou-se com maiores concentrações de prolactina (P = 0,03; B =
1,28), o tabagismo (≥ 10 anos-maço de consumo atual) apresentou correlação com
menores níveis de prolactina (P = 0,03; B = -2,40) (Tabela 9).
As demais variáveis hormonais, incluindo os quartis de testosterona total, não
sofreram influência considerada estatisticamente significativa nos hábitos e estilo de
vida adotados, o que se mostra resumido na Tabela 12, com destaque à variável
hormonal, testosterona livre, que demonstrou correlação tão somente com parâmetro
idade (P < 0,001), porém clinicamente não significativa (B = -0,10) (Tabela 13).
Tabela 6 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla (ANOVA)
para a variável dependente Estradiol
Modelo R R2 R2 ajustado P
Preditores constantes* 0,44 0,19 0,15 < 0,001
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05 * (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5)
consumo de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
RESULTADOS - 53
Tabela 7 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente Estradiol
Modelo
(Preditores*)
Coeficientes não
Padronizados
Coeficiente
Padronizado P
95% Intervalo de
confiança para
Beta
B Erro
Padrão Beta
Limite
inferior
Limite
superior
Estradiol 38,42 4,27 - <0,01 29,97 46,87
Idade -0,27 0,10 -0,21 0,01 -0,47 -0,08
Obesidade -1,23 2,12 -0,04 0,56 -5,43 2,96
Sedentarismo 2,05 1,71 0,01 0,23 -1,32 5,42
Tabagismo atual 2,57 3,34 0,06 0,44 -4,03 9,17
Consumo de
álcool -0,04 1,76 -0,00 0,99 -3,53 3,44
Uso de maconha -11,61 2,55 -0,35 <0,01 -16,66 -6,56
Varicocele -2,14 1,86 -0,09 0,25 -5,82 1,54
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05 * (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5)
consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
Tabela 8 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla (ANOVA)
para a variável dependente Prolactina
Modelo R R2 R2 ajustado P
Preditores constantes* 0,40 0,16 0,12 < 0,001
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5) consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
RESULTADOS - 54
Tabela 9 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente Prolactina
Modelo
(Preditores*)
Coeficientes não
Padronizados
Coeficiente
Padronizado
P
95% Intervalo de
confiança para
Beta
B Erro
Padrão Beta
Limite
inferior
Limite
Superio
r
Prolactina 10,99 1,43 - <0,01 8,16 13,82
Idade -0,08 0,03 -0,18 0,02 -0,14 -0,01
Obesidade -0,21 0,70 -0,02 0,76 -1,61 1,18
Sedentarismo 1,28 0,58 0,18 0,03 0,14 2,42
Tabagismo atual -2,40 1,10 -0,17 0,03 -4,58 -0,22
Consumo de
álcool -0,10 0,59 -0,01 0,87 -1,28 1,08
Uso de maconha 3,21 0,84 0,30 <0,01 1,54 4,88
Varicocele -0,83 0,63 -0,10 0,19 -2,08 0,42
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5)
consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
Tabela 10 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente T/E2#
Modelo R R2 R2 ajustado P
Preditores constantes* 0,35 0,12 0,08 0,01
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários, 2018. NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
# Razão testosterona total-estradiol séricos
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5)
consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
RESULTADOS - 55
Tabela 11 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente T/E2#
Modelo
(Preditores*)
Coeficientes não
Padronizados
Coeficiente
Padronizado P
95% Intervalo de
confiança para
Beta
B Erro
Padrão Beta
Limite
inferior
Limite
superior
T/E2 10,40 7,13 - 0,15 -3,69 24,49
Idade 0,21 0,16 0,10 0,20 -0,11 0,54
Obesidade -3,69 3,41 -0,09 0,28 -10,44 3,05
Sedentarismo -2,42 2,73 -0,07 0,37 -7,82 2,97
Tabagismo atual 6,26 5,38 0,09 0,25 -4,39 16,90
Consumo de
álcool 4,181 2,87 0,11 0,15 -1,49 9,85
Uso de maconha 14,03 4,80 0,24 <0,01 4,55 23,51
Varicocele 2,81 3,02 0,07 0,35 -3,17 8,79
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05 # Razão testosterona total-estradiol séricos
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5)
consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥12 meses
Tabela 12 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para as demais variáveis hormonais e preditores
constantes*
Hormônios R R2 R2 ajustado P
Testosterona total 0,22 0,05 0,00 0,36
1ºQ TT 0,35 0,12 -0,10 0,79
2ºQ TT 0,41 0,17 0,02 0,32
3ºQ TT 0,44 0,19 0,04 0,30
4ºQ TT 0,42 0,17 -0,03 0,55
Testosterona livre calculada 0,30 0,09 0,05 0,04
LH 0,24 0,06 0,01 0,29
FSH 0,27 0,07 0,02 0,16
DHT 0,24 0,06 0,00 0,36
TSH 0,21 0,04 0,00 0,47
T4livre 0,25 0,06 0,01 0,23
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05 / * (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4)
Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5) consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6)
usuário frequente de maconha ≥12 meses
RESULTADOS - 56
Tabela 13 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente Testosterona livre (TL)
Modelo
(Preditores*)
Coeficientes não
Padronizados
Coeficiente
Padronizado P
95% Intervalo de
confiança para Beta
B Erro
padrão Beta
Limite
inferior
Limite
superior
TL 14,23 1,28 - <0,01 11,69 16,77
Idade -0,10 0,03 -0,28 <0,01 -0,16 -0,04
Obesidade 0,18 0,62 0,02 0,77 -1,04 1,40
Sedentarismo 0,09 0,52 0,01 0,85 -0,91 1,10
Tabagismo atual -0,66 0,99 -0,05 0,50 -2,62 1,30
Consumo de
álcool -0,73 0,53 -0,11 0,17 -1,78 0,31
Uso de maconha 0,34 0,76 0,04 0,65 -1,16 1,84
Varicocele -0,12 0,57 -0,02 0,83 -1,24 1,00
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05 / * (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4)
Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5) consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6)
usuário frequente de maconha ≥12 meses
4.3 Hábitos/Estilo de Vida e Parâmetros Seminais
A análise de regressão múltipla demonstrou que no modelo adotado nenhum
hábito ou variável de estilo de vida exerceu influência que fosse relevante
estatisticamente nos parâmetros da análise seminal completa e estudos funcionais
espermáticos em pacientes inférteis (Tabela 14).
Merecem ser relatados ainda dois destaques. O volume seminal, embora não
influenciado pelas variáveis de hábitos e estilo de vida, apresentou correlação
positiva com a presença de varicocele em homens inférteis (P = 0,04; B = 0,53) e
negativa com a idade nesses indivíduos (P = 0,02; B = -0,03), como expresso na
Tabela 15. Já o número total de espermatozoides móveis apresentou valor de
significância estatística limítrofe (P = 0,06), que na análise de regressão múltipla tem
correlação com a presença de varicocele (P < 0,001; B = - 47,42) (Tabela 16).
RESULTADOS - 57
Tabela 14 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para as variáveis dependentes seminais e preditores
constantes*
Variáveis Seminais R R2 R2
ajustado P
pH 0,18 0,03 -0,01 0,70
Volume 0,34 0,11 0,07 0,02
Concentração 0,29 0,08 0,04 0,08
Nº total de espermatozoides 0,27 0,07 0,02 0,16
Nº total de espermatozoides móveis 0,30 0,09 0,04 0,06
Nº total de espermatozoides móveis progressivo 0,23 0,05 0,01 0,32
Motilidade total 0,21 0,05 0,00 0,41
Motilidade total progressiva 0,20 0,04 -0,01 0,53
Morfologia normal OMS 0,25 0,06 0,01 0,28
Morfologia normal Kruger 0,25 0,06 0,01 0,30
Nº de células redondas 0,46 0,21 -0,21 0,82
Teste de Endtz 0,25 0,06 -0,02 0,62
Atividade de Creatinina Kinase 0,28 0,08 -0,03 0,67
Anticorpos anti-espermatozoides + 0,29 0,08 0,00 0,40
Níveis de ROS fresco 0,49 0,24 0,11 0,12
Taxa de fragmentação de DNA 0,23 0,05 -0,14 0,96
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018. NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5)
consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
RESULTADOS - 58
Tabela 15 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente Volume Seminal
Modelo
(Preditores*)
Coeficientes não
Padronizados
Coeficiente
Padronizado P
95% Intervalo de
confiança para
Beta
B Erro
padrão Beta
Limite
Inferior
Limite
superior
Volume seminal 3,74 0,59 - <0,01 2,58 4,90
Idade -0,03 0,01 -0,19 0,02 -0,06 -0,00
Obesidade -0,47 0,29 -0,14 0,10 -1,04 0,09
Sedentarismo -0,20 0,23 -0,07 0,39 -0,65 0,26
Tabagismo atual -0,56 0,47 -0,10 0,23 -1,49 0,36
Consumo de
álcool 0,25 0,24 0,08 0,29 -0,22 0,72
Uso de maconha -0,15 0,35 -0,03 0,67 -0,85 0,55
Varicocele 0,53 0,26 0,17 0,04 0,02 1,04
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05 /* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5) consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6)
usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
Tabela 16 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente Nº total espermatozoides
móveis
Modelo
(Preditores*)
Coeficientes não
padronizados
Coeficiente
Padronizado
P
95% Intervalo de
confiança para
Beta
B Erro
padrão Beta
Limite
Inferior
Limite
Superio
r
Nº total espermatozoides
móveis 159,29 37,43 - <0,01 85,28 233,30
Idade -0,73 0,88 -0,07 0,41 -2,465 1,00
Obesidade -21,35 18,68 -0,09 0,25 -58,28 15,57
Sedentarismo 11,93 15,24 0,07 0,43 -18,20 42,07
Tabagismo atual -45,76 30,80 -0,12 0,14 -106,70 15,14
Consumo de álcool -19,05 15,80 -0,10 0,23 -50,29 12,19
Uso de maconha -9,14 22,48 -0,03 0,68 -53,59 35,31
Varicocele -47,42 16,35 -0,24 <0,01 -79,75 -15,09
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05 / * (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4)
Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5) consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6)
usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
RESULTADOS - 59
4.4 Hábitos/Estilo de Vida e Volume Testicular
Assim como os parâmetros seminais, o volume testicular não sofreu alteração
estatisticamente significante por nenhuma das variáveis de estilo de vida e hábitos
analisada no modelo multivariado de regressão em pacientes inférteis. Este resultado
se repetiu para ambos os lados e com qualquer um dos métodos utilizado para
aferição do volume do órgão (orquidômetro de Prader, Paquímetro de Seager e
método ultrassonográfico), conforme ficou resumido na Tabela 17.
Tabela 17 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para as variáveis dependentes de volume testicular e
preditores constantes*
Volume testicular R R2 R2
ajustado P
Testículo direito (orquidômetro) 0,29 0,08 0,03 0,16
Testículo esquerdo (orquidômetro) 0,30 0,09 0,04 0,12
Testículo direito (paquímetro) 0,32 0,10 0,04 0,14
Testículo esquerdo (paquímetro) 0,27 0,07 0,02 0,07
Testículo direito (ultrassonografia) 0,18 0,03 -0,01 0,67
Testículo esquerdo (ultrassonografia) 0,11 0,01 -0,03 0,47
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5) consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
RESULTADOS - 60
4.5 Hábitos/Estilo de Vida e Parâmetros Bioquímicos
A partir da análise com regressão múltipla realizada, observou-se que as
variáveis uso de Maconha ≥ 12 meses, consumo habitual de bebida alcoólica,
tabagismo e sedentarismo influenciaram de forma significativa alguns parâmetros
bioquímicos na população de homens inférteis estudada.
O uso de maconha como droga de adição correlacionou-se positivamente com
maiores níveis de SHBG (P = 0,02; B = 7,49) (Tabelas 18 e 19). O consumo habitual
de bebidas alcoólicas apresentou influência estatisticamente significativa nos níveis
séricos de VLDL, diminuindo-os (P = 0,03; B = -3,72) (Tabelas 22 e 23). Já o
tabagismo apresentou correlação negativa com a dosagem da glicemia de jejum (P =
0,04; B = -5,40) (Tabelas 24 e 25). Por último, o hábito sedentário apresentou
influência direta e positiva sobre os níveis da ferritina sérica (P = 0,02; B = 63,87)
(Tabelas 26 e 27). Lembrando que o SHBG, o VLDL, a glicemia de jejum e a
ferritina também sofreram influência estatística da idade (Tabelas 19, 23, 25 e 27),
assim como a obesidade demonstrou ter correlação direta com maiores níveis séricos
de insulina (< 0,001; B = 5,80) (Tabelas 20 e 21).
Tabela 18 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente Globulina ligadora de
hormônios sexuais (SHBG)
Modelo R R2 R2 ajustado P
Preditores constantes* 0,34 0,12 0,07 0,01
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários, 2018. NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5)
consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
RESULTADOS - 61
Tabela 19 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente Globulina ligadora de
hormônios sexuais (SHBG)
Modelo
(Preditores*)
Coeficientes não
Padronizados
Coeficiente
Padronizado P
95% Intervalo de
confiança para
Beta
B Erro
padrão Beta
Limite
inferior
Limite
superior
SHBG 16,98 5,15 - <0,01 6,81 27,16
Idade 0,40 0,12 0,26 <0,01 0,16 0,64
Obesidade -3,89 2,53 -0,12 0,13 -8,89 1,11
Sedentarismo 2,97 2,07 0,12 0,15 -1,12 7,07
Tabagismo atual -1,36 4,06 -0,03 0,74 -9,39 6,66
Consumo de
álcool 1,48 2,15 0,05 0,49 -2,77 5,74
Uso de maconha 7,49 3,10 0,19 0,02 1,36 13,62
Varicocele -1,65 2,28 -0,06 0,47 -6,15 2,84
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5) consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
Tabela 20 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente insulina
Modelo R R2 R2 ajustado P
Preditores constantes* 0,50 0,25 0,20 < 0,001
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5)
consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
RESULTADOS - 62
Tabela 21 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente insulina
Modelo
(Preditores*)
Coeficientes não
Padronizados
Coeficiente
Padronizado P
95% Intervalo de
confiança para
Beta
B Erro
padrão Beta
Limite
inferior
Limite
superior
Insulina 5,52 2,34 - 0,02 0,88 10,16
Idade 0,05 0,05 0,08 0,35 -0,05 0,15
Obesidade 5,80 1,13 0,44 <0,01 3,56 8,04
Sedentarismo 1,11 0,93 0,10 0,23 -0,73 2,96
Tabagismo atual 0,32 1,81 0,01 0,86 -3,26 3,91
Consumo de
álcool -0,48 0,95 -0,04 0,61 -2,37 1,40
Uso de maconha 0,36 1,33 0,02 0,78 -2,26 2,99
Varicocele -0,31 1,00 -0,02 0,75 -2,30 1,67
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5)
consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
Tabela 22 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente lipoproteína de muito baixo
molecular (VLDL)
Modelo R R2 R2 ajustado P
Preditores constantes* 0,42 0,18 0,14 < 0,001
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5)
consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
RESULTADOS - 63
Tabela 23 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente lipoproteína de muito baixo
molecular (VLDL)
Modelo
(Preditores*)
Coeficientes não
Padronizados
Coeficiente
Padronizado P
95% Intervalo de
confiança para
Beta
B Erro
Padrão Beta
Limite
inferior
Limite
superior
VLDL 5,51 4,06 - 0,18 -2,52 13,54
Idade 0,39 0,09 0,32 <0,01 0,21 0,58
Obesidade 3,26 2,04 0,12 0,11 -0,77 7,29
Sedentarismo 1,28 1,63 0,06 0,46 -2,01 4,44
Tabagismo atual 3,73 3,34 0,09 0,26 -2,87 10,34
Consumo de
álcool -3,72 1,71 -0,17 0,03 -7,10 -0,34
Uso de maconha -0,89 2,44 -0,03 0,71 -5,72 3,94
Varicocele 1,35 1,80 0,06 0,45 -2,20 4,90
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5) consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
Tabela 24 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente glicemia de jejum
Modelo R R2 R2 ajustado P
Preditores constantes* 0,31 0,09 0,05 0,04
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5)
consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
RESULTADOS - 64
Tabela 25 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente glicemia de jejum
Modelo
(Preditores*)
Coeficientes não
Padronizados
Coeficiente
Padronizado P
95% Intervalo de
confiança para
Beta
B Erro
Padrão Beta
Limite
inferior
Limite
superior
Glicemia de
jejum 83,26 3,42 - <0,01 76,49 90,03
Idade 0,18 0,08 0,19 0,02 0,02 0,34
Obesidade 2,81 1,66 0,14 0,09 -0,47 6,10
Sedentarismo 0,07 1,34 0,00 0,96 -2,57 2,71
Tabagismo atual -5,40 2,70 -0,16 0,04 -10,75 -0,05
Consumo de
álcool 0,71 1,37 0,04 0,60 -2,00 3,42
Uso de maconha 3,24 2,03 0,13 0,11 -0,78 7,27
Varicocele -1,12 1,43 -0,06 0,44 -3,95 1,72
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018. NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5)
consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2 mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
Tabela 26 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente ferritina
Modelo R R2 R2 ajustado P
Preditores constantes* 0,34 0,11 0,07 0,02
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05 * (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5)
consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
RESULTADOS - 65
Tabela 27 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente ferritina
Modelo
(Preditores*)
Coeficientes não
Padronizados
Coeficiente
Padronizado P
95% Intervalo de
confiança para
Beta
B Erro
Padrão Beta
Limite
inferior
Limite
superior
Ferritina 61,26 65,44 - 0,35 -68,20 190,73
Idade 4,72 1,52 0,26 <0,01 1,72 7,73
Obesidade -32,51 34,79 -0,08 0,35 -101,34 36,32
Sedentarismo 63,87 26,45 0,21 0,02 11,54 116,19
Tabagismo atual 6,21 49,77 0,01 0,90 -92,26 104,67
Consumo de
álcool -15,00 28,16 -0,04 0,59 -70,72 40,71
Uso de maconha -3,76 39,10 -0,01 0,92 -81,11 73,60
Varicocele 34,65 28,77 0,10 0,23 -22,27 91,57
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5)
consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
Os exames bioquímicos estudados que não sofreram influência de hábitos e
estilo de vida estão resumidos na Tabela 28, com a ressalva que os parâmetros
colesterol total, LDL e triglicerídeos, que apresentaram P < 0,05, correlacionaram-se
positivamente apenas com a variável idade no modelo de regressão (Tabelas 29, 30 e
31).
RESULTADOS - 66
Tabela 28 - Resumo do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para as demais variáveis bioquímicas e preditores
constantes*
Hormônios R R2 R2
ajustado P
Colesterol total 0,34 0,11 0,07 0,01
HDL 0,25 0,06 0,02 0,21
LDL 0,37 0,13 0,09 < 0,001
Triglicerídeos 0,43 0,18 0,14 < 0,001
Vitamina D 0,26 0,06 0,02 0,18
HbA1c 0,26 0,07 0,02 0,23
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
HDL: lipoproteína de alto peso molecular / LDL: lipoproteína de baixo peso molecular Vitamina D: 25(OH) vitamina D / HbA1c: hemoglobina glicada
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5)
consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
Tabela 29 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente colesterol total
Modelo
(Preditores*)
Coeficientes não
Padronizados
Coeficiente
Padronizado P
95% Intervalo de
confiança para
Beta
B Erro
padrão Beta
Limite
inferior
Limite
superior
Colesterol total 149,75 15,98 - <0,01 118,17 181,33
Idade 1,30 0,37 0,27 <0,01 0,56 2,03
Obesidade 3,37 7,86 0,034 0,67 -12,17 18,91
Sedentarismo 9,08 6,39 0,11 0,16 -3,56 21,72
Tabagismo atual 12,79 12,63 0,08 0,31 -12,17 37,74
Consumo de
álcool 2,14 6,64 0,02 0,75 -10,98 15,27
Uso de maconha 0,99 9,64 0,01 0,92 -18,05 20,04
Varicocele -12,13 7,01 -0,13 0,08 -25,99 1,72
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5)
consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
RESULTADOS - 67
Tabela 30 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente lipoproteína de baixo peso
molecular (LDL)
Modelo
(Preditores*)
Coeficientes não
Padronizados
Coeficiente
Padronizado P
95% Intervalo de
confiança para
Beta
B Erro
padrão Beta
Limite
inferior
Limite
superior
LDL 84,84 13,43 - <0,01 58,28 111,39
Idade 1,10 0,31 0,27 <0,01 0,48 1,71
Obesidade 3,72 6,69 0,04 0,58 -9,51 16,95
Sedentarismo 10,39 5,42 0,15 0,06 -0,32 21,10
Tabagismo atual 14,01 10,62 0,10 0,19 -6,97 34,99
Consumo de
álcool 1,23 5,64 0,02 0,83 -9,91 12,38
Uso de maconha 3,80 8,11 0,04 0,64 -12,22 19,83
Varicocele -11,05 5,92 -0,14 0,06 -22,74 0,63
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5) consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
Tabela 31 - Coeficientes do modelo de análise de regressão linear múltipla
(ANOVA) para a variável dependente triglicerídeos
Modelo
(Preditores*)
Coeficientes não
Padronizados
Coeficiente
Padronizado P
95% Intervalo de
confiança para
Beta
B Erro
padrão Beta
Limite
inferior
Limite
superior
33333 24,79 19,46 - 0,20 -13,68 63,27
Idade 1,97 0,45 0,33 <0,01 1,07 2,86
Obesidade 18,35 9,83 0,15 0,06 -1,07 37,78
Sedentarismo 0,94 7,84 0,01 0,90 -14,56 16,44
Tabagismo atual 20,48 15,88 0,10 0,20 -10,91 51,87
Consumo de
álcool -12,77 8,13 -0,12 0,12 -28,85 3,31
Uso de maconha -5,13 11,61 -0,03 0,66 -28,09 17,82
Varicocele 9,91 8,70 0,09 0,26 -7,29 27,11
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários - Androscience, 2018.
NOTA: Teste ANOVA, p <0,05
* (1) Idade, (2) Obesidade [IMC ≥ 30kg/m2], (3) Sedentarismo, (4) Tabagismo atual ≥ 10 anos-maço, (5) consumo médio de bebida alcoólica ≥ 37,2mL álcool puro/dia, (6) usuário frequente de maconha ≥ 12 meses
RESULTADOS - 68
Por fim, o Quadro 3 resume todas as correlações encontradas entre hábitos e
estilos de vida e parâmetros analisados no presente estudo.
Quadro 3 - Resumo dos resultados encontrados quanto às influências de
hábitos e estilo de vida em parâmetros seminais, hormonais e
bioquímicos de homens inférteis, 2009 a 2017
Hábito/ Estilo de vida
Drogadição de Maconha
Prolactina
SHBG
T/E2
Estradiol
Sedentarismo Prolactina
Ferritina
Tabagismo Prolactina
Glicemia de jejum
Consumo habitual de álcool VLDL
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários, 2018
DISCUSSÃO - 70
O estilo de vida contemporâneo em cidades de médio e grande porte no mundo
ocidental industrializado comporta uma multiplicidade de hábitos deletérios à saúde
geral e ao potencial reprodutivo e sexual de cada indivíduo, com susceptibilidades e
interações com o meio-ambiente ainda em grande parte desconhecidas. Tais
comportamentos na maioria das vezes são adotados em conjunto pelo indivíduo, o que
usualmente se traduz em danos exponencialmente mais complexos do que se fosse
analisado cada fator etiopatogênico de forma isolada. A análise multivariada do presente
estudo examina os potenciais efeitos concorrentes de hábitos e estilos de vida comuns ao
ambiente urbano na saúde reprodutiva masculina, especificamente em indivíduos
inférteis. Destacou-se, pois, o uso da maconha (Cannabis sativa) como um dos
potenciais fatores deletérios indiretos à esta função, incluindo outros já citados na
literatura (etilismo, tabagismo e sedentarismo).
5.1 Maconha
5.1.1 Maconha e sua influência sobre parâmetros seminais e volume testicular
Neste estudo, a frequência do uso crônico da maconha (15,36%) se destacou
por ser amplamente superior à somatória das demais drogas citadas (Gráfico 1),
motivo pelo qual foi a escolhida para ser incluída no modelo regressivo de análise
multivariada.
DISCUSSÃO - 71
Não foi demonstrada alteração seminal, seja na análise completa, ou nos
testes funcionais espermáticos, relacionada ao hábito regular de fumar maconha, fato
diverso do que se frequentemente encontra na literatura em estudos in vivo em
humanos fumantes de Cannabis, cuja principal alteração demonstrada é a diminuição
da concentração de espermatozoides22,54-56.
Em tese de livre-docência, Hallak22 observou resultados seminais divergentes
em população semelhante à do presente estudo. Nesta referida tese, pacientes
usuários de maconha apresentaram alterações significativas estatisticamente em sete
parâmetros seminais convencionais ao serem comparados com grupo controle de
homens férteis pré-vasectomia22. Tais achados foram o aumento do pH seminal e
menores médias dos demais parâmetros (concentração espermática, número total de
espermatozoides, número total de espermatozoides móveis, número total de
espermatozoides móveis progressivos, porcentagem de espermatozoides com
morfologia normal tanto pelo critério estrito145, quanto pelo critério da OMS
2010143). Além disso, houve relevante associação da elevação de níveis ROS seminal
nos fumantes de maconha, tanto quando comparados a grupo de homens inférteis não
usuários da droga, quanto ao grupo controle de homens férteis (controle 0,68 ±1,67 vs
Inférteis 8,89±14,58 vs maconha 14,31±31,62x104 cpm/20x106espermatozoides)22.
Desde meados da década de 1970 do século passado, diversos estudos
demonstram que o uso crônico intenso de maconha acarreta a diminuição da
concentração de espermatozoides. Estudo com homens de 18 a 28 anos, usuários
exclusivos de maconha por pelo menos 4 dias na semana, reportou que seis de 17
indivíduos (35%) desenvolveram concentração de espermatozoides menor que 30
milhões/mL, quando o uso da droga foi ≥ 10 cigarros por semana no intervalo de 6
DISCUSSÃO - 72
meses54. Em estudo experimental com homens saudáveis fumantes crônicos de
maconha, submetidos a curso de quatro semanas de uso de altas doses da droga
(cerca de oito a 20 cigarros/dia), foram relatados como significativos a redução na
concentração e no número total de espermatozoides durante a 5ª e 6ª semanas após o
início do experimento. Estas mudanças foram ainda precedidas por decréscimo na
motilidade espermática e redução na porcentagem de espermatozoides com
morfologia normal56. Tais mudanças temporais evolutivas e cumulativas demonstram
possivelmente uma relação direta entre a quantidade de maconha utilizada e as
alterações seminais observadas. No presente estudo, tal avaliação é prejudicada, visto
ser um modelo retrospectivo onde infelizmente não se tem o controle exato sobre a
quantidade e o padrão de uso de Cannabis pelos pacientes. Inclusive em defesa de
tese de livre-docência, foi discutida dificuldade da coleta de dados sobre padrões de
consumo de maconha em paciente atendidos no ambiente público e privado no
Brasil, principalmente pela visão não-maleficente que se propaga entre a maioria de
seus usuários22.
Outras alterações seminais são discutidas na literatura quanto ao hábito
regular de fumar maconha. Além de alterações já citadas22,56, estudo prospectivo do
Reino Unido encontrou relação com uso de Cannabis nos últimos três meses em
homens até 30 anos de idade e alterações na morfologia espermática57. Já em estudo
brasileiro que comparou parâmetros seminais de 68 homens de 19 a 58 anos,
usuários crônicos de maconha, com grupo controle fértil (indivíduos pré-
vasectomia), mantendo distribuições semelhantes em relação a faixas etárias e média
de IMC, demonstrou-se piora não só nos padrões seminais de concentração e número
total de espermatozoides, mas também no número total de espermatozoides móveis,
DISCUSSÃO - 73
número total de espermatozoides móveis progressivos e na porcentagem de
espermatozoides com morfologia normal tanto pelos critérios da OMS, quanto pelos
critérios estritos de Kruger22.
Duas prováveis razões contribuíram para ausência de correlação entre maconha e
alterações seminais nos pacientes inférteis do presente estudo. O modelo de regressão
não contemplou doses de consumo da droga, por ser estudo retrospectivo com dados
relatados pelos pacientes e não aferidos quantitativamente. Além disso, houve número
absoluto pequeno de usuários de maconha dentro da população estudada (n=43), apesar
de percentualmente relevante dentro deste mesmo grupo (15,36%).
Incluída no modelo como fator de confusão na análise, a presença de
varicocele clínica foi o único fator que se relacionou com alterações seminais
encontradas (Tabelas 14, 15 e 16). Varicocele é a dilatação varicosa das veias do
plexo pampiniforme e que permanece como a causa identificável mais prevalente de
infertilidade masculina, afetando de 40% a 45% de homens com infertilidade
primária e ate 85% dos homens com infertilidade secundária159. Em clínicas de
referência em Andrologia, como a que forneceu dados para presente análise, a
prevalência desta patologia pode ser maior do que a encontrada normalmente na
população em geral, devido ao natural viés de seleção da população que busca
atendimento especializado (neste estudo, 61,8% versus 45% em geral em populações
sabidamente inférteis/subférteis - Tabela 1)157.
Escassa é a literatura científica sobre os efeitos dos canabinoides nos
testículos160. Apesar de inúmeros modelos animais demonstrarem redução da massa
testicular como efeito deletério do uso dos canabinoides por degeneração dos túbulos
seminíferos e alterações degenerativas de espermátides e espermatócitos161-163, os
DISCUSSÃO - 74
resultados aqui reportados não demonstraram tal diminuição volumétrica (Tabela 17).
Ressalta-se o fato de todos os pacientes desse estudo já terem o diagnóstico inicial de
infertilidade masculina, portanto, há uma uniformidade no motivo pelo qual procuraram
atendimento especializado, não cabendo nesse estudo comparação com grupos controle.
Aceita-se como volume testicular adequado ao desenvolvimento espermatogênico
normal aquele compreendido entre 15 mL a 25 mL164. No presente estudo, as médias de
volumes testiculares dos homens inférteis estudados aferidas pelo método
ultrassonográfico foram inclusive superiores a 15 mL (16,57 ±5,23 mL para o direito e
16,10 ±5,31 mL para o esquerdo). Já quando aferidos pelos métodos semiotécnicos, houve
diferença na comparação entre lados, com médias maiores que 15 mL no lado esquerdo
(15,83 mL ±5,63 mL pelo orquidômetro e 16,72 mL ± 23,68 mL pelo paquímetro) e
menores que 15 mL no lado direito (14,50 mL ±5,44 mL pelo orquidômetro e 13,88 mL
±5,39 mL pelo paquímetro). Estas diferenças entre médias de volume em um mesmo
testículo refletem as diferentes modalidades de aferição volumétrica utilizadas165, porém
atualmente se considera a ultrassonografia como o melhor método para aferição do
volume testicular, principalmente em testículos <18 mL156.
Como não há na literatura um valor de referência para o volume testicular
dito normal para população brasileira, nosso grupo de pesquisa costuma utilizar a
média do grupos-controle pré-vasectomia para realizar comparações. Em tese de
livre-docência oriunda da FMUSP, as médias dos grupos controle pré-vasectomias
foram na ultrassonografia 17,27 mL ±4,71 mL para o direito e 16,58 mL ±4,61 mL
para o esquerdo22. Estas médias foram ligeiramente maiores das aferidas na
população de homens inférteis analisadas para a presente tese (16,57 mL ±5,23 mL
para o direito e 16,10 mL ±5,31 mL para o esquerdo).
DISCUSSÃO - 75
Vale a observação que o ultrassom mede o formato externo definido pela
túnica albugínea, que tem um citoesqueleto bem estruturado e um arcabouço de
tecido conjuntivo denso não modelado1. Portanto, tal método estima o volume
testicular maior em relação aos métodos que empregam exame físico, onde o
médico-assistente faz uma leve compressão do testículo contra as camadas que
formam o escroto165.
O volume testicular final é determinado pelo número de células de Sertoli,
que são as células-mãe dos túbulos seminíferos, produtores da linhagem
germinativa164. Na tese de livre-docência previamente citada, o exame físico dos
usuários crônicos de maconha demonstrou consistência testicular mais amolecida na
comparação com homens não-usuários da droga e sem doenças nesta gônada,
provavelmente por perda progressiva das células de Sertoli ao longo da vida e
relativa preservação do arcabouço externo22. Estudos experimentais com animais
reforçam a evidência de atrofia testicular com o uso regular prolongado de Cannabis,
parcialmente justificado por lesão direta dos túbulos seminíferos, provavelmente
mediada por estresse oxidativo166. Trabalhos translacionais são indispensáveis para
verificar se tal fenômeno poderia ocorrer em humanos, particularmente se
quantificando dose e duração de consumo da droga, que acarretaria mudanças
morfológicas equivalentes. Fica aqui a ressalva.
DISCUSSÃO - 76
5.1.2 Maconha e sua influência sobre parâmetros hormonais
Os canabinoides exógenos encontrados na maconha agem competindo com os
endocanabinoides por sítios de ligação de receptores canabinoides distribuídos por
todo sistema hipotálamo-hipófise-testicular45. O THC age em receptores
endocanabinoides neuronais hipotalâmicos, inibindo a liberação do GnRH por meio
da interação com múltiplos neurotransmissores, principalmente o sistema do ácido
gama-aminobutírico (do inglês, Gamma aminobutyric acid, GABA)167.
No presente estudo, demonstrou-se forte correlação entre o uso crônico de
maconha e concentrações séricas menores de E2. Escassos são os estudos que
abordam os efeitos estrogênicos e antiestrogênicos da maconha, sendo baseados em
modelos celulares168,169 e clínico-epidemiológicos22,170.
Utilizando-se um modelo experimental baseado na proliferação de células de
câncer de mama humano, foram testados os principais canabinoides encontrados na
maconha (THC, CBD e o CBN) mais um preparado do condensado do fumo da droga. O
mesmo grupo de pesquisadores conseguiu concluir em dois estudos bastante semelhantes
metodologicamente que não há efeito algum, seja estrogênico ou antiestrogênico, com o
uso isolado dos endocanabinoides testados. Contudo, o preparado do condensado do fumo
da maconha apresentou em cada estudo efeitos estrogênicos antagônicos, provavelmente
mediado por componentes diferentes. Enquanto que os hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos (do inglês, Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs) devem ser os
responsáveis pela ação antiestrogênica do condensado169, os compostos fenólicos
provavelmente exercem a ação estrogênica encontrada em um dos estudos168.
Os PAHs são compostos formados basicamente pela combustão incompleta
de matéria orgânica, contendo dois ou mais anéis aromáticos condensados171. Os
DISCUSSÃO - 77
compostos fenólicos são estruturas moleculares constituídas por anéis aromáticos e
grupos hidroxilas, seja nas formas simples ou em polímeros, amplamente
encontrados no reino vegetal172.
Considerando que o E2 desempenha um papel regulatório na função da célula
de Leydig e no sistema reprodutor masculino, a ação de diferentes agentes
ambientais, incluindo-se os PAHs da condensado do fumo da maconha,
provavelmente ocorre por um efeito antagônico na ação estrogênica endógena173.
Nos testículos, as células de Leydig são o sítio de ligação de um principais PAHs
denominado 7,12-dimetilbenzantraceno (DMBA)174. Modelos celulares
experimentais demonstraram que a exposição ao DMBA inibe a esteroidogênese
dependente da adenosina monofosfato cíclico (AMPc)175, assim como alguns de seus
metabólitos inibem a replicação de DNA nos túbulos seminíferos176.
Especificamente, as características antiestrogênicas dos PAHs são mediadas
por uma interação célula-célula (adaptado do inglês, cross-talk) entre as vias do
receptor de estrogênio e do receptor aril-hidrocarboneto (do inglês, Aryl hydrocarbon
receptor, AhR), que acarreta aumento do metabolismo do E2 e redução dos níveis
intracelulares deste hormônio177,178. Em humanos, os canabinoides poderiam ainda
provocar uma resposta antiestrogênica in vivo por meio da redução dos níveis de E2.
Algumas enzimas podem ser essenciais para hidroxilação causada pelo THC, CBD e
CBN, como a citocromo P450, família 3, subfamília A (CYP3A) e a citocromo P450,
família 1, subfamília B (CYP1B)179,180.
Além da ação antiestrogênica do condensado da maconha, outra possível
explicação seria um efeito inibitório de um ou mais componentes da maconha na
atividade da enzima aromatase, o que inclusive se fortalece pelo achado de
DISCUSSÃO - 78
correlação positiva entre o uso da maconha e a razão T/E2 no estudo (Tabela 11). Em
homens, a maioria do E2 sérico é produzido pela aromatização periférica dos
androgênios produzidos pelas células de Leydig e esta reação é catalisada pela
enzima aromatase, da família do citocromo P450181. A aromatase é
predominantemente encontrada no tecido adiposo, porém também se distribui pelo
fígado, pele e testículos182. Nos testículos, a atividade da aromatase é encontrada nas
células de Leydig183 e de Sertoli184. O efeito inibitório da aromatase não foi
demonstrado para o THC, CBD e CBN169, entretanto outros canabinoides se
apresentam como candidatos promissores para tal efeito, como o canabidiorcol
(CBD-C1), o canabitriol (CBT) e o canabiripsol (CBR)185.
Outra alteração hormonal associada ao uso de maconha no modelo de
regressão estudado aqui, foi a correlação com maiores concentrações séricas de
prolactina (Tabela 9), muito embora a média destes indivíduos ainda permaneça
dentro da faixa de normalidade para o hormônio (8,33 ng/mL ± 4,34 ng/mL). Este
achado difere do usualmente encontrado na literatura, que normalmente demonstra
que o uso crônico de maconha não altera as concentrações de prolactina sérica22,54,61
ou apenas diminuem seu nível basal, porém sem sair do intervalo considerado como
normal186.
A prolactina é secretada de forma pulsátil pela hipófise anterior, sob
influência hipotalâmica inibitória mediada pela Dopamina (DA). Receptores
canabinoides cerebrais (CB-1R) são dispostos bem próximos a receptores
dopaminérgicos hipotalâmicos187. A administração aguda de THC aumenta a
liberação de DA, o qual vai exercer um feedback negativo na secreção
endocanabinoide que vai inibir posteriormente a liberação de DA187. O uso crônico
DISCUSSÃO - 79
de maconha pode interferir neste processo de feedback, resultando em alteração da
resposta dopaminérgica, o que determina em última instância em qual nível se
manterá a prolactina do indivíduo61,186. Ressalto que em todos os estudos, incluindo o
presente em tese, as médias de concentração de prolactina permaneceram dentro da
faixa da normalidade22,54,61,186.
Por fim, sabe-se que os efeitos da maconha na produção de testosterona
permanecem contraditórios à luz das evidências científicas atuais. Estudos in vivo
com humanos fumantes de maconha apresentam resultados divergentes, desde o
aumento dos níveis de testosterona55, diminuição da concentração sérica deste
hormônio54 até não demonstrar efeito algum sobre este hormônio22,46,59,61, como foi
inclusive descrito na presente tese. Devo ressaltar que mesmo ao se dividir em
diferentes quartis de concentração de testosterona, não houve correlação
estatisticamente significativa com quaisquer hábito ou estilo de vida adotado por
pacientes inférteis (Tabela 12).
Evidências atuais revelam o conhecimento sobre os efeitos da Cannabis
sativa sobre a testosterona sérica dependem predominantemente ainda de um único
estudo dinamarquês contemporâneo de larga escala baseado em questionário55 e por
diversos estudos de coorte de menor escala mais antigos46,54,59,61. Portanto, o
resultado encontrado no presente estudo pouco contribui para elucidação dos reais
efeitos da maconha na testosterona de homens inférteis, unindo-se apenas àqueles
que advogam que esta droga não altera valores séricos deste hormônio em homens
inférteis. São, pois, necessários estudos de coorte de maior escala, visando uma
melhor compreensão de tal mecanismo.
DISCUSSÃO - 80
5.1.3 Maconha e sua influência sobre parâmetros bioquímicos
A análise regressiva multivariada deste estudo com homens inférteis
demonstrou correlação positiva entre o uso da maconha e maiores concentrações
séricas de SHBG (Tabela 19).
A SHBG é produzida no fígado sob o controle de hormônios e fatores
nutricionais, sendo posteriormente secretada no sangue onde se liga a androgênios e
estrogênios, regulando sua biodisponibilidade188. Até recentemente o IMC era
considerado o principal determinante das concentrações de SHBG circulantes189,
contudo foi demonstrado que a gordura visceral hepática é sim o maior determinante
de tais concentrações190. A concentração sérica de SHBG é considerada como
biomarcador de inúmeras condições em saúde, como síndrome metabólica, diabetes
tipo 2 e risco de doença cardiovascular191.
Variações consideráveis da concentração sérica de SHBG podem ocorrer
entre indivíduos da mesma população e consequentemente podem influenciar na
fisiologia dos hormônios sexuais (referência de normalidade: homens de 21 a 49
anos, de 14,6 nmol/L a 94,6 nmol/L; de 50 a 89 anos, valores de 21,6nmol/L a
113,1nmol/L)192. Além da função de transporte de androgênios e estrogênios, a
SHBG atua como mediadora da sinalização dos hormônios esteroidais; assim
alterações nas concentrações séricas desta proteína e ainda o polimorfismo do gene
SHBG são associados com quadros de infertilidade masculina193.
Estudo populacional dinamarquês de 1.215 homens jovens (de 18 a 28 anos)
apresentou resultado semelhante ao deste estudo, onde o uso da marijuana foi
correlacionado com maiores concentrações de SHBG séricas em seu primeiro
modelo de regressão multivariada (aumento de 8% no valor da mediana de SHBG,
DISCUSSÃO - 81
quando frequência de uso era maior que um cigarro de maconha/semana, sem uso
concomitante de outras drogas recreativas)55. Contudo, vale ressaltar que após
controle de variáveis de confusão como IMC e tabagismo, esta correlação não foi
mais demonstrada55. Já no modelo de regressão multivariado usado para esse estudo
em tese, houve preocupação do controle de tais variáveis de confusão desde o
princípio e mesmo assim foi mantido a correlação com maiores concentrações de
SHBG. Uma hipótese plausível para tal achado poderia ser que o hábito de fumar
regularmente maconha poderia acarretar certo grau de hepatoxicidade, fato
observado para alguns canabinoides, como o CBD em modelos animais194.
Recentemente buscou-se estabelecer o papel do SHBG em testes de rotina de
homens inférteis e conclui-se que ela pode auxiliar principalmente em pacientes
inférteis com sintomas sugestivos de hipogonadismo e concentrações séricas de TT
dentro da normalidade, auxiliando no cálculo da testosterona biodisponível e
consequente diagnóstico de tal condição clínica, além de ser importante preditora de
parâmetros seminais como concentração e motilidades dos espermatozoides195. Os
níveis de SHBG em homens classicamente hipogonádicos (testosterona total menor
que 300ng/dL) foram diferentes daqueles com quadro clínico de hipogonadismo,
com testosterona considerada normal, porém fração biodisponível menor que 210
ng/dL195. Por fim, o valor de corte (adaptado do inglês, cutoff) para verificação de
alterações de motilidade espermática foi estabelecido para valores menores que
156ng/dL de testosterona biodisponível calculada baseando-se nos valores de
SHBG195. Por fim, carecem estudos mais conclusivos sobre uma possível ação dos
canabinoides sobre a regulação da produção e/ou ação desta proteína.
DISCUSSÃO - 82
5.2 Sedentarismo
5.2.1 Sedentarismo e sua influência sobre parâmetros seminais e volume
testicular
Neste estudo, o sedentarismo não influenciou de forma estatisticamente
significativa os parâmetros da análise seminal completa, os testes funcionais
espermáticos e o volume testicular (Tabelas 14 e 17), diferente do que hoje se
observa na literatura científica, onde existem inúmeros trabalhos demonstrando os
benefícios de uma atividade física moderada em detrimento ao estilo de vida
sedentário, principalmente no tocante aos parâmetros seminais
convencionais62,63,65,196,197. Apenas um único trabalho não demonstrou relação entre
menores níveis de atividade física e parâmetros seminais, similar ao encontrado no
presente estudo64.
Incluída na análise multivariada como variável de controle de confusão, a
obesidade, quadro clínico clinicamente associado ao hábito do sedentarismo, não foi
também associado a alterações seminais ou de volume testicular (Tabelas 14 e 17),
fato consonante com resultados de revisões sistemáticas recentes acompanhadas de
metanálises83,84.
Em metanálise realizada por grupo neozelandês, não foi encontrada evidência de
associação entre o IMC e dois parâmetros seminais (concentração e número total de
espermatozoides), ressaltando ainda que, na revisão sistemática realizada com 31 estudos,
há fraca evidência na associação entre obesidade e parâmetros seminais83. Em outra
revisão sistemática com metanálise mais recente, realizada por grupo australiano,
com um total de 115.158 indivíduos, a obesidade não foi associada a alterações
clinicamente significativas dos parâmetros da análise seminal completa (apenas a
motilidade progressiva teve um decréscimo significativo, porém mínimo)84.
DISCUSSÃO - 83
O presente estudo não encontrou associação entre obesidade e maiores taxas
de fragmentação de DNA (Tabela 14), fato hoje que gera divergência inclusive entre
metanálises. Dados derivados do Longitudinal Investigation of Fertility and the
Environment (LIFE) Study não encontraram evidência desta associação85, ao passo
que a metanálise australiana anteriormente citada não só reportou tal correlação,
como também concluiu pela necessidade da incorporação deste exame na avaliação
inicial de homens obesos com resultados da análise seminal completa dentro dos
valores considerados normais84. Faz-se necessário um maior número de estudos com
dados de maior homogeneidade para se poder concluir de forma definitiva sobre o
papel da obesidade na fragmentação do DNA espermático.
Por fim, vale ressaltar que os resultados observados no sedentarismo e na
variável de controle “obesidade” podem ser decorrentes da baixa porcentagem de
obesos na população estudada retrospectivamente (n = 42; 15% do total).
5.2.2 Sedentarismo e sua influência sobre parâmetros hormonais e bioquímicos
Na população masculina infértil estudada, o estilo de vida sedentário teve
correlação com as concentrações séricas de prolactina e de ferritina, ambas em níveis
maiores nestes indivíduos (Tabelas 9 e 27).
Não foram encontrados até o presente momento na literatura estudos que
correlacionem prolactina e sedentarismo em pacientes inférteis. A hipófise anterior
secreta pequenas quantidades de prolactina durante o exercício físico, ocasionando
um aumento de menos que 50 ng/mL198. De forma oposta, nosso estudo
correlacionou o aumento dos níveis de prolactina com o sedentarismo, apesar dos
valores do hormônio se manterem dentro da variação considerada fisiológica (abaixo
DISCUSSÃO - 84
de 20 ng/mL)199, provavelmente indicando que este achado não tenha significado
clínico em cenários práticos.
O sedentarismo apresenta associação com maiores concentrações séricas de
ferritina, pois esta funciona como biomarcador de risco cardiovascular elevado, não
somente em homens inférteis, mas também naqueles aparentemente saudáveis200. O
exercício aeróbico regular diminui as reservas de ferro do organismo, com resultados
mais pronunciados no sexo masculino. Homens que se exercitam de forma aeróbica
por pelo menos 45 minutos por semana possuem concentrações séricas de ferritina
menores do que homens sedentários201.
Apesar da forte evidência na literatura de correlação negativa entre
testosterona total, SBHG e testosterona livre com maiores valores no IMC83, este
estudo em tese não encontrou influência estatisticamente significativa entre maiores
valores do IMC e as dosagens hormonais realizadas (Tabela 12).
Hoje, sabe-se que o hipogonadismo masculino associado à obesidade é uma
condição clínica subdiagnosticada e bastante prevalente202. Possivelmente, sua
etiologia é multifatorial, resultando de diversas alterações, como a redução dos níveis
de SHBG, o baixo grau de inflamação sistêmica ocasionada pelo tecido adiposo
disfuncional, o excesso de leptina e o aumento da aromatização da testosterona em
estradiol acarretando mudanças no feedback negativo hipotálamo-hipofisário67,202,
com todo quadro apresentado interferindo negativamente na fertilidade masculina84.
No tocante aos parâmetros bioquímicos, apenas se evidenciou a já consagrada
na literatura associação entre maiores valores de insulinemia e obesidade (Tabela
21), reflexo do papel da insulina na modulação de múltiplas vias bioquímicas de
lipogênese, lipólise e controle de captação de lipídios203.
DISCUSSÃO - 85
Homens obesos, principalmente os diabéticos, desenvolvem resistência
insulínica periférica e central, levando a redução da biossíntese hepática de SHBG, o
que possibilita que maior parte da testosterona permaneça livre, aumentando o efeito
do feedback negativo do E2 através da aromatização, culminando em um estado de
down-regulation do eixo HPG204.
5.3 Tabagismo
5.3.1 Tabagismo e sua influência sobre parâmetros seminais e volume testicular
Diferente do que usualmente é encontrado na literatura23,24,205,206, não houve
correlação entre os parâmetros seminais, quer sejam os convencionais, quer sejam os
estudos espermáticos funcionais, com o uso do tabaco no presente estudo (Tabela
14). Também não se demonstrou associação entre o tabagismo e o volume testicular
dos homens inférteis estudados (Tabela 17), muito embora haja na literatura dados
correlacionando a redução do volume seminal com a intensidade e a cronicidade do
tabagismo20-22. Reforça-se o fato desse estudo ser inteiramente realizado dentro de
uma população com infertilidade masculina, não cabendo comparação com grupo-
controle ou outros.
O tabagismo está associado a uma diversidade de alterações seminais, porém
há uma enorme variação nos resultados encontrados por diferentes grupos de
pesquisadores, alguns muitas vezes até contraditórios205. Alguns estudos relatam
diminuição do volume seminal em tabagistas20,21. Recente revisão sistemática que
incluiu 20 estudos com total de 5.865 participantes concluiu que o tabagismo é
associado com a diminuição da concentração espermática, da motilidade e da
morfologia normal dos espermatozoides, fenômeno este mais intenso em homens
DISCUSSÃO - 86
inférteis do que na população em geral24. O fumo do cigarro de nicotina também se
associa à lesão na cromatina espermática, diretamente proporcional à carga
tabágica23.
Contudo já há na literatura relato prévio da ausência de efeitos deletérios do
cigarro em relação aos parâmetros seminais convencionais. Em um grande estudo
austríaco com 1.104 homens inférteis, três grupos de comparação (517 não-fumantes,
109 ex-fumantes e 478 fumantes atuais) tiveram seus parâmetros seminais avaliados
e não houve diferença significativa entre os grupos de não-fumantes e fumantes
quanto aos parâmetros de concentração, motilidade e morfologia normal dos
espermatozoides, resultado bastante similar ao presente estudo, exceto por haver
aumento das células redondas e leucocitospermia no estudo austríaco15.
5.3.2 Tabagismo e sua influência sobre parâmetros hormonais e bioquímicos
O uso crônico do cigarro de nicotina exerceu influência somente nas
concentrações de prolactina, associando-se com menores níveis séricos (Tabela 9),
achado semelhante ao descrito em tese de livre-docência defendida na FMUSP, onde
na comparação com três grupos (tabagistas, usuários de maconha e homens férteis
não-usuários das duas drogas), os usuário de cigarro de tabaco também se associaram
a menores concentrações séricas de prolactina22.
Quanto aos efeitos do cigarro sobre este hormônio, as evidências na literatura
ainda permanecem controversas. Existem estudos que, como o presente, associam-se
negativamente com os níveis de prolactina15,207, porém há ainda aqueles que
demonstram correlação positiva entre concentrações séricas de nicotina pós-
exposição ao tabaco e níveis aumentados de prolactina sérica26,208.
DISCUSSÃO - 87
Uma possível justificativa para o achado de menores concentrações séricas de
prolactina em fumantes seria a ação da nicotina do cigarro nas vias mesolímbicas,
elevando o tônus dopaminérgico, que consequentemente inibiria a produção de
prolactina pela hipófise15,207. Outra provável explicação seria uma inibição da
expressão do gene da prolactina, demonstrada em estudo experimental em ratos209.
Quanto à análise bioquímica, a associação com menores valores de glicemia
de jejum em homens inférteis tabagistas (Tabela 25) diverge do que é demonstrado
pela literatura, onde justamente o hábito de fumar cigarros de tabaco está associado à
progressão da normoglicemia para intolerância à glicose e, em última instância, para
diabetes e suas complicações210,211. Estudos com conclusões divergentes muitas
vezes expressam diferenças nas características populacionais. Possivelmente o
achado deste estudo pode guardar relação com a média de idade mais jovem da
população, com menor número de comorbidades, ou ainda hábitos e perfil genético
que necessita de melhor esclarecimento em pesquisas delineadas para tal propósito.
5.4 Consumo habitual de álcool
5.4.1 Consumo habitual de álcool e sua influência sobre parâmetros seminais e
volume testicular
A ausência de associação entre o consumo habitual de bebidas alcoólicas e os
parâmetros seminais e volume testicular descrita nesta tese (Tabelas 14 e 17) reflete a
discussão da literatura atual, que demonstra resultados não uniformes quanto à
influência do uso de bebidas alcoólicas nos parâmetros da análise seminal completa.
Enquanto alguns estudos sugerem uma correlação negativa entre os parâmetros do
sêmen e à ingestão de bebidas alcoólicas32,212, outras refutam tal associação36,37.
DISCUSSÃO - 88
Estudo metanalítico recente demonstrou que o fato de ingerir regularmente
bebidas alcoólicas em comparação com não fazer uso crônico delas está associado
com redução do volume seminal e da porcentagem de espermatozoides com
características morfológicas normais, sem afetar de forma consistente a concentração
e a motilidade espermáticas. Contudo, tais associações parecem ser limitadas aos
usuários regulares, ao passo que os etilistas eventuais não demonstram tais alterações
ao serem comparados com não usuários do álcool35.
Tal divergência de resultados e a necessidade atual da pesquisa dos limites de
ingestão em doses deletérios à saúde reprodutiva masculina são os maiores
motivadores para estudos contemporâneos na área.
5.4.2 Consumo habitual de álcool e sua influência sobre parâmetros hormonais e
bioquímicos
Muito embora não se tenha demonstrado relação direta entre consumo de
álcool e alterações hormonais na população estudada (Tabela 12), há relatos de
associações entre o consumo agudo/crônico de bebidas alcoólicas e menores
concentrações de testosterona sérica. Estudo na Índia comparando 66 consumidores
de uísque (≥180 mL por dia por no mínimo cinco dias por semana por pelo menos
um ano) e 30 homens não usuários encontrou que o consumo crônico de álcool
diminuiu significativamente as concentrações de testosterona e progesterona e
aumentou os níveis de LH, FSH e E2, mantendo inalterada a prolactina sérica32.
Em ensaio duplo cego controlado com placebo, foi demonstrado aumento
agudo da concentração de testosterona após consumo de 0,5 g/kg de álcool42. Já em
outro estudo com ingestão de 40 g/dia de álcool, foi demonstrada uma redução aguda
DISCUSSÃO - 89
de 6,8% na concentração sérica de testosterona total, sem alteração dos níveis de
E2213. Portanto, evidências ainda persistem conflitantes quanto ao real papel da
ingestão de bebidas alcoólicas em alterações hormonais, quer sejam agudas ou
crônicas, principalmente em indivíduos do sexo masculino.
Já o resultado demonstrado no presente estudo quanto às análises
bioquímicas, que é a correlação negativa entre ingestão de álcool e níveis séricos de
VLDL, já é descrito na literatura desde a década de 80 do século passado214.
Quando a ingestão de álcool exceder 60-80 g/dia, a síntese de VLDL será
estimulada, com consequente aumento da taxa de transferência de componentes da
superfície do VLDL para o HDL. Com a continuidade do consumo, a ação da lipase
lipoproteica é estimulada nos adipócitos e consequentemente as concentrações
séricas de VLDL ficam dentro da normalidade ou pouco inferior, similar ao
encontrado no presente estudo214.
Por fim, o Quadro 4 resume todas as correlações encontradas entre hábitos e
estilos de vida e parâmetros analisados no presente estudo, com os prováveis
mecanismos discutidos na presente tese.
DISCUSSÃO - 90
5.5 Limitações do estudo
Certas limitações metodológicas do estudo devem ser destacadas. Como em
todos estudos transversais, a causalidade de muitas questões permanece obscura.
Estudos retrospectivos são projetados para avaliar dados pré-existentes e, portanto,
estão sujeitos a algum viés como resultado. Devido ao caráter exploratório do estudo,
não foram realizados testes estatísticos para correções de múltiplas comparações. No
uso de informações derivadas de prontuários, grande parte dos dados sobre hábitos e
estilo de vida foram coletados através de questionários não-validades culturalmente.
No que diz respeito à definição aplicada de “uso regular de maconha”, é difícil
distinguir o usuário pesado (três a cinco vezes ao dia) dos consumidores leve, porque
as relações temporais e quantitativas foram difíceis de avaliar com estes dados
ausentes ou incompletos nos prontuários.
Quanto aos exames laboratoriais, certos testes realizados por laboratórios
independentes podem incorrer em vieses de informação e de registro dos dados.
Além disso, é bem conhecido que os níveis séricos de E2 medidos por imunoensaios
diretos (sem extração) são de alguma forma imprecisos em amostras masculinas.
Sendo assim, estudos de coorte são necessários como passos consequentes deste
estudo exploratório, onde estes vieses decorrentes do caráter transversal do estudo e
das limitações ora apresentadas possam ser ajustados, visando principalmente a
determinação da causalidade dos parâmetros analisados.
DISCUSSÃO - 91
Quadro 4 - Resumo dos resultados encontrados quanto às influências de
hábitos e estilo de vida em parâmetros seminais, hormonais e
bioquímicos de homens inférteis, com prováveis mecanismos
relacionados, 2009 a 2017
Hábito/ Estilo de
vida Alterações Provável Mecanismo
Drogadição de
Maconha
Prolactina Alteração da resposta dopaminérgica hipotalâmica
mediada pelo THC61,186,187
SHBG Hepatotoxicidade por canabinoides (CBD)?194
T/E2
Ação antiestrogênica dos PAHs169,173-178
Ação antiestrogênica in vivo de canabinoides179,180
Inibição da enzima aromatase pelo CBD-C1, CBT e
CBR185
E2
Ação antiestrogênica dos PAHs169,173-178
Ação antiestrogênica in vivo de canabinoides179,180
Inibição da enzima aromatase pelo CBD-C1, CBT e
CBR185
Sedentarismo
Prolactina Desconhecido
Ferritina Diminuição das reservas de Fe++ com exercício
aeróbico regular201
Tabagismo
Prolactina
Alteração da resposta dopaminérgica mediada pela
nicotina15,207
Inibição da expressão do gene da prolactina209
Glicemia de jejum Desconhecido
Consumo habitual
de álcool VLDL Ação da lipase lipoprotéica dos adipócitos214
FONTE: Análise de dados constantes em prontuários, 2018
CONCLUSÕES - 93
Nenhum hábito ou estilo de vida avaliados apresentou efeitos diretos sobre a
função testicular em grupo de homens inférteis, não estando associados a parâmetros
seminais, à concentração sérica de testosterona ou a variações de volume testicular.
Dentre os hábitos, o hábito de fumar maconha ≥ 12 meses apresentou os
efeitos indiretos mais deletérios sobre a função testicular destes homens inférteis, ao
se associar significativamente a menores concentrações séricas de E2 e maiores de
prolactina e SHBG, além de se correlacionar com maiores valores da razão T/E2.
Nesta população infértil, o tabagismo de carga ≥ 10 anos-maço correlaciona-
se com menores concentrações de prolactina e menores valores de glicemia em
jejum, ao passo que consumo habitual de bebidas alcoólicas em dose ≥ 37,2mL de
álcool puro/dia se relaciona com menores de VLDL.
O sedentarismo associa-se a maiores concentrações de prolactina e de
ferritina sérica e a obesidade está relacionada com maiores valores de insulinemia
nos homens inférteis avaliados.
REFERÊNCIAS - 101
1. Zegers-Hochschild F, Adamson GD, Dyer S, Racowsky C, de Mouzon J, Sokol
R, Rienzi L, Sunde A, Schmidt L, Cooke ID, Simpson JL, van der Poel S. The
International Glossary on Infertility and Fertility Care, 2017. Fertil Steril.
2017;108(3):393-406.
2. Mascarenhas MN, Flaxman SR, Boerma T, Vanderpoel S, Stevens GA.
National, regional, and global trends in infertility prevalence since 1990: a
systematic analysis of 277 health surveys. Plos Medicine. 2012;9(12):12.
3. Agarwal A, Mulgund A, Hamada A, Chyatte MR. A unique view on male
infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 2015;13:9.
4. Hallak J. A call for more responsible use of Assisted Reproductive
Technologies (ARTs) in male infertility: the hidden consequences of abuse,
lack of andrological investigation and inaction. Transl Androl Urol.
2017;6(5):997-1004.
5. Vander Borght M, Wyns C. Fertility and infertility: Definition and
epidemiology. Clin Biochem. 2018 Mar 16. pii: S0009-9120(18)30220-0.
6. Bonde JP, Storgaard L. How work-place conditions, environmental toxicants
and lifestyle affect male reproductive function. Int J Androl. 2002;25(5):262-8.
REFERÊNCIAS - 102
7. Giwercman A, Giwercman YL. Environmental factors and testicular function.
Bert Pract Res Clin Endrocrinol Metab. 2011;25(2):391-402.
8. Barazani Y, Katz BF, Nagler HM, Stember DS. Lifestyle, environment, and
male reproductive health. Urol Clin North Am. 2014;41(1):55-66.
9. Durairajanayagam D. Lifestyle causes of male infertility. Arab J Urol.
2018;16(1):10-20.
10. Samplaski MK, Nangia AK. Adverse effects of common medications on male
fertility. Nat Rev Urol. 2015;12(7):401-13.
11. Abdul-Ghani R, Qazzaz M, Dabdoub N, Muhammad R, Abdul-Ghani AS.
Studies on cigarette smoke induced oxidative DNA damage and reduced
spermatogenesis in rats. J Envirol Bio. 2014;35(5):943-7.
12. Corona G, Mannucci E, Petrone L, Ricca V, Mansani R, Cilotti A, Balercia G,
Chiarini V, Giommi R, Forti G, Maggi M. Psychobiological correlates of
smoking in patients with erectile dysfunction. Int J Import Res.
2005;17(6):527-34.
13. Allen MS, Walter EE. Health-Related lifestyle factors and sexual dysfunction:
a meta-analysis of population-based research. J Sex Med. 2018;15(4):458-75.
14. Beal MA, Yauk CL, Marchetti F. From sperm to offspring: assessing the
heritable genetic consequences of paternal smoking and potential public health
impacts. Mutat Res. 2017;773:26-50.
REFERÊNCIAS - 103
15. Trummer H, Habermann H, Haas J, Pummer K. The impact of cigarette
smoking on human semen parameters and hormones. Hum Reprod.
2002;17(6):1554-9.
16. Jensen TK, Joffe M, Scheike T, Skytthe A, Gaist D, Petersen I, Christensen K.
Early exposure to smoking and future fecundity among Danish twins. Int J
Androl. 2006;29(6):603-13.
17. Ramlau-Hansen CH, Thulstrup AM, Storgaard L, Toft G, Olsen J, Bonde JP. Is
prenatal exposure to tobacco smoking a cause of poor semen quality? A
follow-up study. Am J Epidemiol. 2007;165(12):1372-9.
18. Li Y, Lin H, Li YF, Cao J. Association between socio-psycho-behavioral
factors and male semen quality: systematic review and meta-analyses. Fertil
Steril. 2011;95(1):116-23.
19. Priskorn L, Nordkap L, Bang AK, Krause M, Holmboe SA, Palme DLE,
Winge SB, Mørup N, Carlsen E, Joensen UN, Blomberg Jensen M, Main KM,
Juul A, Skakkebaek NE, Jensen TK, Jørgensen N. Average sperm count
remains unchanged despite reduction in maternal smoking: results from a large
cross-sectional study with annual investigations over 21 years. Hum Reprod.
2018;33(6):998-1008.
20. Sobreiro BP, Lucon AM, Pasqualotto FF, Hallak J, Athayde KS, Arap S.
Semen analysis in fertile patients undergoing vasectomy: reference values and
variations according to age, length of sexual abstinence, seasonality, smoking
habits and caffeine intake. Sao Paulo Med J. 2005;123(4):161-6.
REFERÊNCIAS - 104
21. Pasqualotto FF, Sobreiro BP, Hallak J, Pasqualotto EB, Lucon AM. Cigarette
smoking is related to a decrease in semen volume in a population of fertile
men. BJU Int. 2006;97(2):324-6.
22. Hallak J. Os efeitos do uso continuado da maconha e do cigarro na função
testicular e suas relações com hipogonadismo e infertilidade masculina [tese
livre-docência]. São Paulo: Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo; 2018.
23. Mostafa RM, Nasrallah YS, Hassan MM, Farrag AF, Majzoub A, Agarwal A.
The effect of cigarette smoking on human seminal parameters, sperm
chromatin structure and condensation. Andrologia. 2018;50(3) e12910.
24. Sharm R, Harlev A, Agarwal A, Esteves SC. Cigarette smoking and semen
quality: a new meta-analysis examining the effect of the 2010 World Health
Organization Laboratory Methods for the Examination of Human Semen. Eur
Urol. 2016;70(4):635-45.
25. Zhao J, Leung JYY, Lin SL, Schooling CM. Cigarette smoking and
testosterone in men and women: A systematic review and meta-analysis of
observational studies. Prev Med. 2016;85:1-10.
26. Blanco-Munoz J, Lacasana M, Aguilar-Garduno C. Effect of current tobacco
consumption on the male reproductive hormone profile. Sci Total Environ.
2012;426:100-5.
27. Alvarez S. Do some addictions interfere with fertility? Fertil Steril.
2015;103(1):22-6.
REFERÊNCIAS - 105
28. Condorelli RA, Calogero AE, Vicari E, La Vignera S. Chronic consumption of
alcohol and sperm parameters: our experience and the main evidences.
Andrologia. 2015;47(4):368-79.
29. Rachdaoui N, Sarkar DK. Effects of alcohol on the endocrine system.
Endocrino Metab Clin North Am. 2013;42(3):593-615.
30. Uddin S, Wilson T, Emanuele MA, Williams D, Kelley MR, Emanuele N.
Ethanol-induced alterations in the posttranslational processing, but not
secretion of luteinizing Hormone-releasing hormone in vitro. Alcohol Clin Exp
Res. 1996;20(3):556-60.
31. Kim JH, Kim HJ, Noh HS, Roh GS, Kang SS, Cho GJ, Park SK, Lee BJ, Choi
WS. Suppression by ethanol of male reproductive activity. Bain Res.
2003;989(1):91-8.
32. Muthusami KR, Chinnaswamy P. Effect of chronic alcoholism on male fertility
hormones and semen quality. Fertil Steril. 2005;84(4):919-24.
33. OMS. Self-help strategies for cutting down or stopping substance use: a guide.
ed. Geneva: Geneva World Health Organization; 2010.
34. Jensen TK, Gottschau M, Madsen JOB, Andersson AM, Lassen TH,
Skakkebaek NE, Swan SH, Priskorn L, Juul A, Jørgensen N. Habitual alcohol
consumption associated with reduced semen quality and changes in
reproductive hormones; a cross-sectional study among 1221 young Danish
men. BMJ Open. 2014;4(9):9.
REFERÊNCIAS - 106
35. Ricci E, Al Beitawi S, Cipriani S, Candiani M, Chiaffarino F, Viganò P, Noli
S, Parazzini F. Semen quality and alcohol intake: a systematic review and
meta-analysis. Reprod Biomed Online. 2017;34(1):38-47.
36. Hansen ML, Thulstrup AM, Bonde JP, Olsen J, Hakonsen LB, Ramlau-Hansen
CH. Does last week's alcohol intake affect semen quality or reproductive
hormones? A cross-sectional study among healthy young Danish men. Reprod
Toxicol. 2012;34(3):457-62.
37. Teijon ML, Garcia F, Serra O, Moragas M, Rabanal A, Olivares R, Alvarez JG.
Semen quality in a population of volunteers from the province of Barcelona.
Reprod Biomed Online. 2007;15(4):434-44.
38. Pourmasumi S, Sabeti P, Rahiminia T, Mangoli E, Tabibnejad N, Talebi AR.
The etiologies of sperm DNA abnormalities in male infertility: An assessment
and review. Int J Reprod Biomed (Yazd). 2017;15(6):331-44.
39. Poccia D. Remodeling of nucleoproteins during gametogenesis, fertilization,
and early development. Int Rev Cytol. 1986;105:1-65.
40. Said S, Funahashi H, Niwa K. DNA stability and thiol-disulphide status of rat
sperm nuclei during epididymal maturation and penetration of oocytes. Zygote.
1999;7(3):249-54.
41. Talebi AR, Sarcheshmeh AA, Khalili MA, Tabibnejad N. Effects of ethanol
consumption on chromatin condensation and DNA integrity of epididymal
spermatozoa in rat. Alcohol. 2011;45(4):403-9.
REFERÊNCIAS - 107
42. Sarkola T, Eriksson CJ. Testosterone increases in men after a low dose of
alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 2003;27(4):682-5.
43. Crime UNOoDa. World Drug Report 2017. United Nations. [internet]. 2017.
[citado em 2018 nov 19]. Disponível em:
https://www.unodc.org/wdr2017/index.html.
44. Alvarez S, Devouche E. First French national survey on lifestyle and toxic
factors in infertile couples. Gynecol Obstet Fertil. 2012;40(12):765-71.
45. du Plessis SS, Agarwal A, Syriac A. Marijuana, phytocannabinoids, the
endocannabinoid system, and male fertility. J Assist Reprod Genet.
2015;32(11):1575-88.
46. Mendelson JH, Kuehnle J, Ellingboe J, Babor TF. Plasma testosterone levels
before, during and after chronic marihuana smoking. N Engl J Med.
1974;291(20):1051-5.
47. Huizink AC, Ferdinand RF, Ormel J, Verhulst FC. Hypothalamic-pituitary-
adrenal axis activity and early onset of cannabis use. Addiction.
2006;101(11):1581-8.
48. Hsiao P, Clavijo RI. Adverse effects of cannabis on male reproduction. Eur
Urol Focus. 2018;4(3):324-8.
49. Hong CY, Desaintonge DMC, Turner P, Fairbairn JW. Comparison of the
inhibitory-action of delta-9-tetrahydrocannabinol and petroleum spirit extract
of herbal cannabis on human-sperm motility. Hum Toxicol. 1982;1(2):151-4.
REFERÊNCIAS - 108
50. Whan LB, West MCL, McClure N, Lewis SEM. Effects of delta-9-
tetrahydrocannabinol, the primary psychoactive cannabinoid in marijuana, on
human sperm function in vitro. Fertil Steril. 2006;85(3):653-60.
51. Close CE, Roberts PL, Berger RE. Cigarettes, alcohol and marijuana are
related to pyospermia in infertile men. J Urol. 1990;144(4):900-3.
52. Badawy ZS, Chohan KR, Whyte DA, Penefsky HS, Brown OM, Souid AK.
Cannabinoids inhibit the respiration of human sperm. Fertil Steril.
2009;91(6):2471-6.
53. Schuel H, Burkman LJ, Lippes J, Crickard K, Mahony MC, Giuffrida A,
Picone RP, Makriyannis A. Evidence that anandamide-signaling regulates
human sperm functions required for fertilization. Mol Reprod Dev.
2002;63(3):376-87.
54. Kolodny RC, Masters WH, Kolodner RM, Toro G. Depression of plasma
testosterone levels after chronic intensive marihuana use. N Engl J Med.
1974;290(16):872-4.
55. Gundersen TD, Jørgensen N, Andersson AM, Bang AK, Nordkap L,
Skakkebæk NE, Priskorn L, Juul A, Jensen TK. Association Between Use of
Marijuana and Male Reproductive Hormones and Semen Quality: A Study
Among 1,215 Healthy Young Men. Am J Epidemiol. 2015;182(6):473-81.
56. Hebree WC, Nahas GG, Zeidenberg P, Huang HFS. Changes in human
spermatozoa associated with high-dose marihuana smoking. Adv Biosci.
1978;22-23:429-39.
REFERÊNCIAS - 109
57. Pacey AA, Povey AC, Clyma JA, McNamee R, Moore HD, Baillie H, Cherry
NM; Participating Centres of Chaps-UK. Modifiable and non-modifiable risk
factors for poor sperm morphology. Hum Reprod. 2014;29(8):1629-36.
58. Wenger T, Rettori V, Snyder GD, Dalterio S, McCann SM. Effects of delta-9-
tetrahydrocannabinol on the hypothalamic-pituitary control of luteinizing-
hormone and follicle-stimulating-hormone secretion in adult male-rats.
Neuroendocrinology. 1987;46(6):488-93.
59. Cone EJ, Johnson RE, Moore JD, Roache JD. Acute effects of smoking
marijuana on hormones, subjective effects and performance in male human-
subjects. Pharmacol Biochem Behav. 1986;24(6):1749-54.
60. Vescovi PP, Pedrazzoni M, Michelini M, Maninetti L, Bernardelli F, Passeri
M. Chronic effects of marijuana smoking on luteinizing-hormone, follicle-
stimulating-hormone and prolactin levels in human males. Drug Alcohol
Depend. 1992;30(1):59-63.
61. Block RI, Farinpour R, Schlechte JA. Effects of chronic marijuana use on
testosterone, luteinizing-hormone, follicle-stimulating-hormone, prolactin and
cortisol in men and women. Drug Alcohol Depend. 1991;28(2):121-8.
62. Hayden RP, Flannigan R, Schlegel PN. The role of lifestyle in male infertility:
diet, physical activity, and body habitus. Curr Urol Rep. 2018;19(7):10.
63. Vaamonde D, Da Silva-Grigoletto ME, Garcia-Manso JM, Barrera N,
Vaamonde-Lemos R. Physically active men show better semen parameters and
hormone values than sedentary men. Eur J Appl Physiol. 2012;112(9):3267-73.
REFERÊNCIAS - 110
64. Minguez-Alarcon L, Chavarro JE, Mendiola J, Gaskins AJ, Torres-Cantero
AM. Physical activity is not related to semen quality in young healthy men.
Fertil Steril. 2014;102(4):1103-9.
65. Gaskins AJ, Mendiola J, Afeiche M, Jorgensen N, Swan SH, Chavarro JE.
Physical activity and television watching in relation to semen quality in young
men. Br J Spoorts Med. 2015;49(4):265-U84.
66. Hassan MAM, Killick SR. Effect of male age on fertility: evidence for the
decline in male fertility with increasing age. Fertil Steril. 2003;79:1520-7.
67. Liu Y, Ding ZD. Obesity, a serious etiologic factor for male subfertility in
modern society. Reproduction. 2017;154(4):R123-R31.
68. Jensen TK, Andersson AM, Jorgensen N, Andersen AG, Carlsen E, Petersen
JH, Skakkebaek NE. Body mass index in relation to semen quality and
reproductive hormones among 1,558 Danish men. Fertil Steril.
2004;82(4):863-70.
69. Dupont C, Faure C, Sermondade N, Boubaya M, Eustache F, Clément P, Briot
P, Berthaut I, Levy V, Cedrin-Durnerin I, Benzacken B, Chavatte-Palmer P,
Levy R. Obesity leads to higher risk of sperm DNA damage in infertile
patients. Asian J Androl. 2013;15(5):622-5.
REFERÊNCIAS - 111
70. Sermondade N, Faure C, Fezeu L, Shayeb AG, Bonde JP, Jensen TK, Van
Wely M, Cao J, Martini AC, Eskandar M, Chavarro JE, Koloszar S, Twigt JM,
Ramlau-Hansen CH, Borges E Jr, Lotti F, Steegers-Theunissen RP, Zorn B,
Polotsky AJ, La Vignera S, Eskenazi B, Tremellen K, Magnusdottir EV, Fejes
I, Hercberg S, Lévy R, Czernichow S. BMI in relation to sperm count: an
updated systematic review and collaborative meta-analysis. Hum Reprod
Update. 2013;19(3):221-31.
71. Samavat J, Natali I, Degl'Innocenti S, Filimberti E, Cantini G, Di Franco A,
Danza G, Seghieri G, Lucchese M, Baldi E, Forti G, Luconi M. Acrosome
reaction is impaired in spermatozoa of obese men: a preliminary study. Fertil
Steril. 2014;102(5):10.
72. Shukla KK, Chambial S, Dwivedi S, Misra S, Sharma P. Recent scenario of
obesity and male fertility. Andrology. 2014;2(6):809-18.
73. McPherson NO, Lane M. Male obesity and subfertility, is it really about
increased adiposity? Asian J Androl. 2015;17(3):450-8.
74. Soubry A, Guo LS, Huang ZQ, Hoyo C, Romanus S, Price T, Murphy SK.
Obesity-related DNA methylation at imprinted genes in human sperm: Results
from the TIEGER study. Clin Epigenetics. 2016;8:51.
75. Munzberg H, Myers MG. Molecular and anatomical determinants of central
leptin resistance. Nat Neurosci. 2005;8(5):566-70.
76. Farooqi IS, O'Rahilly S. Leptin: a pivotal regulator of human energy
homeostasis. Am J Clin Nutr. 2009;89(3):980S-4S.
REFERÊNCIAS - 112
77. Clarke H, Dhillo WS, Jayasena CN. Comprehensive review on kisspeptin and its
role in reproductive disorders. Endocrinol Metab (Seoul). 2015;30(2):124-41.
78. Luboshitzky R, Lavie L, Shen-Orr Z, Herer P. Altered luteinizing hormone and
testosterone secretion in middle-aged obese men with obstructive sleep apnea.
Obes Res. 2005;13(4):780-6.
79. Torres M, Laguna-Barraza R, Dalmases M, Calle A, Pericuesta E, Montserrat JM,
Navajas D, Gutierrez-Adan A, Farré R. Male fertility is reduced by chronic
intermittent hypoxia mimicking sleep apnea in mice. Sleep. 2014;37(11):1758-66.
80. Burnett AL, Strong TD, Trock BI, Jin L, Bivalacqua TJ, Musicki B. Serum
biomarker measurements of endothelial function and oxidative stress after
daily dosing of sildenafil in type 2 diabetic men with erectile dysfunction. J
Urol. 2009;181(1):245-51.
81. RosaínzMDA, Ojeda MO, Acosta JR, Elías-Calles LC, González NO, Herrera OT,
García Álvarez CT, Rodríguez EM, Báez ME, Seijas EÁ, Valdés RF. Imbalanced
low-grade inflammation and endothelial activation in patients with type 2 diabetes
mellitus and erectile dysfunction. J Sex Med. 2011;8(7):2017-30.
82. Craig JR, Jenkins TG, Carrell DT, Hotaling JM. Obesity, male infertility, and
the sperm epigenome. Fertil Steril. 2017;107(4):12.
83. MacDonald AA, Herbison GP, Showell M, Farquhar CM. The impact of body
mass index on semen parameters and reproductive hormones in human males: a
systematic review with meta-analysis. Hum Reprod Update. 2010;16(3):293-311.
REFERÊNCIAS - 113
84. Campbell JM, Lane M, Owens JA, Bakos HW. Paternal obesity negatively
affects male fertility and assisted reproduction outcomes: a systematic review
and meta-analysis. Reprod Biomed Online. 2015;31(5):593-604.
85. Eisenberg ML, Kim S, Chen Z, Sundaram R, Schisterman EF, Louis GMB.
The relationship between male BMI and waist circumference on semen quality:
data from the LIFE study (vol 29, pg 193, 2014). Hum Reprod.
2015;30(2):493-4.
86. Ferramosca A, Di Giacomo M, Moscatelli N, Zara V. Obesity and male
infertility: role of fatty acids in the modulation of sperm energetic metabolism.
Eur J Lipid Sci Technol. 2018;120(4):6.
87. Perlis N, Lo KC, Grober ED, Spencer L, Jarvi K. Coital frequency and
infertility: which male factors predict less frequent coitus among infertile
couples? Fertil Steril. 2013;100(2):511-5.
88. Karayiannis D, Kontogianni MD, Mendorou C, Douka L, Mastrominas M,
Yiannakouris N. Association between adherence to the Mediterranean diet and
semen quality parameters in male partners of couples attempting fertility. Hum
Reprod. 2017;32(1):215-22.
89. Minguez-Alarcón L, Chavarro JE, Mendiola J, Roca M, Tanrikut C, Vioque J,
Jørgensen N, Torres-Cantero AM. Fatty acid intake in relation to reproductive
hormones and testicular volume among young healthy men. Asian J Androl.
2017;19(2):184-90
REFERÊNCIAS - 114
90. Ricci E, Al-Beitawi S, Cipriani S, Alteri A, Chiaffarino F, Candiani M, Gerli S,
Viganó P, Parazzini F Dietary habits and semen parameters: a systematic
narrative review. Andrology. 2018;6(1):104-16.
91. Ricci E, Vigano P, Cipriani S, Somigliana E, Chiaffarino F, Bulfoni A,
Parazzini F. Coffee and caffeine intake and male infertility: a systematic
review. Nutr J. 2017;16:14.
92. Macit MS, Akdevelioglu Y. An overview of the relationship between fertility
and caffeine intake. Clin Exp Neurol. 2018;8(2):138-45.
93. de Souza GL, Hallak J. Anabolic steroids and male infertility: a comprehensive
review. BJU Int. 2011;108(11):1860-5.
94. Anawalt BD. Diagnosis and management of anabolic androgenic steroid use. J
Clin Endocrinol Metab. 2019;104(7):2490-2500.
95. Gazvani MR, Buckett W, Luckas MJM, Aird IA, Hipkin LJ, LewisJones DI.
Conservative management of azoospermia following steroid abuse. Hum
Reprod. 1997;12(8):1706-8.
96. Feinberg MJ, Lumia AR, McGinnis MY. The effect of anabolic-androgenic
steroids on sexual behavior and reproductive tissues in male rats. Physiol
Behav. 1997;62(1):23-30.
REFERÊNCIAS - 115
97. Moretti E, Collodel G, La Marca A, Piomboni P, Scapigliati G, Baccetti B.
Structural sperm and aneuploidies studies in a case of spermatogenesis
recovery after the use of androgenic anabolic steroids. J Assist Reprod Genet.
2007;24(5):195-8.
98. Shokri S, Aitken RJ, Abdolvahhabi M, Abolhasani F, Ghasemi FM, Kashani I,
Ejtemaeimehr S, Ahmadian S, Minaei B, Naraghi MA, Barbarestani M.
Exercise and supraphysiological dose of nandrolone decanoate increase
apoptosis in spermatogenic cells. Basic Clin Pharmacol Toxicol.
2010;106(4):324-30.
99. Fronczak CM, Kim ED, Barqawi AB. The Insults of illicit drug use on male
fertility. J Androl. 2012;33(4):515-28.
100. George VK, Li HK, Teloken C, Grignon DJ, Lawrence WD. Effects of long-
term cocaine exposure on spermatogenesis and fertility in peripubertal male
rats. J Urol. 1996;155(1):327-31.
101. Rodriguez MC, Sanchezyague J, Paniagua R. Effects of cocaine on testicular
structure in the rat. Reprod Toxicol. 1992;6(1):51-5.
102. Li HK, Jiang Y, Rajpurkar A, Dunbar JC, Dhabuwala CB. Cocaine induced
apoptosis in rat testes. J Urol. 1999;162(1):213-6.
103. Pires A, Pieri P, Hage M, Santos ABG, Medeiros MCR, Garcia RCT,
Yonamine M, Hallak J, Saldiva PH, Zorzetto JC, Bueno HM. Repeated
inhalation of crack-cocaine affects spermatogenesis in young and adult mice.
Inhal Toxicol. 2012;24(7):439-46.
REFERÊNCIAS - 116
104. Bawor M, Bami H, Dennis BB, Plater C, Worster A, Varenbut M, Daiter J,
Marsh DC, Steiner M, Anglin R, Coote M, Pare G, Thabane L, Samaan Z.
Testosterone suppression in opioid users: A systematic review and meta-
analysis. Drug Alcohol Depend. 2015;149:1-9.
105. Amory JK, Wang C, Swerdloff RS, Anawalt BD, Matsumoto AM, Bremner
WJ, Walker SE, Haberer LJ, Clark RV. The effect of 5alpha-reductase
inhibition with dutasteride and finasteride on semen parameters and serum
hormones in healthy men. J Clin Endocrinol Metab. 2007;92(5):1659-65.
106. Wessells H, Roy J, Bannow J, Grayhack J, Matsumoto AM, Tenover L,
Herlihy R, Fitch W, Labasky R, Auerbach S, Parra R, Rajfer J, Culbertson J,
Lee M, Bach MA, Waldstreicher J; PLESS Study Group. Incidence and
severity of sexual adverse experiences in finasteride and placebo-treated men
with benign prostatic hyperplasia. Urology. 2003;61(3):579-84.
107. Hellstrom WJG, Sikka SC. Effects of acute treatment with tamsulosin versus
alfuzosin on ejaculatory function in normal volunteers. J Urol.
2006;176(4):1529-33.
108. Hellstrom WJG, Sikka SC. Effects of Alfuzosin and Tamsulosin on Sperm
Parameters in Healthy Men: Results of a Short-Term, Randomized, Double-
Blind, Placebo-Controlled, Crossover Study. J Androl. 2009;30(4):469-74.
109. Lepor H, Kazzazi A, Djavan B. Alpha-blockers for benign prostatic
hyperplasia: the new era. Curr Opn Urol. 2012;22(1):7-15.
REFERÊNCIAS - 117
110. Roehrborn CG, Siami P, Barkin J, Damiao R, Major-Walker K, Morrill B,
Montorsi F; CombAT Study Group. The effects of dutasteride, tamsulosin and
combination therapy on lower urinary tract symptoms in men with benign
prostatic hyperplasia and prostatic enlargement: 2-year results from the
CombAT study. J Urol. 2008;179(2):616-21.
111. Montejo AL, Llorca G, Izquierdo JA, Rico-Villademoros F. Incidence of
sexual dysfunction associated with antidepressant agents: a prospective
multicenter study of 1022 outpatients. Spanish Working Group for the Study of
Psychotropic-Related Sexual Dysfunction. J Clin Psychiatry. 2001;62 Suppl
3:10-21.
112. Tanrikut C, Schlegel PN. Antidepressant-associated changes in semen
parameters. Urology. 2007;69(1):3.
113. Tanrikut C, Feldman AS, Altemus M, Paduch DA, Schlegel PN. Adverse effect
of paroxetine on sperm. Fertil Steril. 2010;94(3):1021-6.
114. Safarinejad MR. Sperm DNA damage and semen quality impairment after
treatment with selective serotonin reuptake inhibitors detected using semen
analysis and sperm chromatin structure assay. J Urol. 2008;180(5):2124-8.
115. Maier U, Koinig G. Andrological findings in young-patients under long-term
antidepressive therapy with clomipramine. Psychopharmacology.
1994;116(3):357-9.
116. Levin RM, Amsterdam JD, Winokur A, Wein AJ. Effects of psychotropic-
drugs on human-sperm motility. Fertil Steril. 1981;36(4):503-6.
REFERÊNCIAS - 118
117. Serretti A, Chiesa A. Sexual side effects of pharmacological treatment of
psychiatric diseases. Clin Pharmacol Ther. 2011;89(1):142-7.
118. Ko DT, Hebert PR, Coffey CS, Sedrakyan A, Curtis JP, Krumholz HM. Beta-
blocker therapy and symptoms of depression, fatigue, and sexual dysfunction.
JAMA. 2002;288(3):351-7.
119. White DR, Clarkson JS, Ratnasooriya WD, Aitken RJ. Complementary effects
of propranolol and nonoxynol-9 upon human sperm motility. Contraception.
1995;52(4):241-7.
120. Caminostorres R, Ma L, Snyder PJ. Gynecomastia and semen abnormalities
induced by spironolactone in normal men. J Clin Endocrino Metab.
1977;45(2):255-60.
121. Clark E. Spironolactone therapy and gynecomastia. JAMA. 1965;193(2):163-4.
122. Saha L, Bhargava VK, Garg SK, Majumdar S. Effect of nimodipine on male
reproductive functions in rats. Indian J Physiol Pharmacol. 2000;44(4):449-55.
123. Lee JH, Ahn HJ, Lee SJ, Gye MC, Min CK. Effects of L- and T-type Ca2+
channel blockers on spermatogenesis and steroidogenesis in the prepubertal
mouse testis. J Assist Reprod Genet. 2011;28(1):23-30.
124. Feng HL, Han YB, Hershlag A, Zheng LJ. Impact of Ca2+ flux inhibitors on
acrosome reaction of hamster spermatozoa. J Androl. 2007;28(4):561-4.
125. Pont A, Williams PL, Azhar S, Reitz RE, Bochra C, Smith ER, Stevens DA.
Ketoconazole blocks testosterone synthesis. Arc Intern Med. 1982;142(12):2137-40.
REFERÊNCIAS - 119
126. Nelson WO, Bunge RG. The effect of therapeutic dosages of nitrofurantoin
(furadantin) upon spermatogenesis in man. J Urol. 1957;77(2):275-81.
127. Schlegel PN, Chang TSK, Marshall FF. Antibiotics - Potential hazards to male-
fertility. Fertil Steril. 1991;55(2):235-42.
128. Timmerma L. Influence of antibiotics on spermatogenesis. J Urol.
1974;112(3):348-9.
129. Hargreaves CA, Rogers S, Hills F, Rahman F, Howell RJS, Homa ST. Effects
of co-trimoxazole, erythromycin, amoxycillin, tetracycline and chloroquine on
sperm function in vitro. Hum Reprod. 1998;13(7):1878-86.
130. White IG. The Toxicity of some antibacterials for bull, ram, rabbit and human
spermatozoa. Aust J Exp Biol Med Sci. 1954;32(1):41-8.
131. Boekelheide K. Mechanisms of toxic damage to spermatogenesis. J Natl
Cancer Inst Monogr. 2005(34):6-8.
132. De Mas P, Daudin M, Vincent MC, Bourrouillou G, Calvas P, Mieusset R,
Bujan L. Increased aneuploidy in spermatozoa from testicular tumour patients
after chemotherapy with cisplatin, etoposide and bleomycin. Hum Reprod.
2001;16(6):1204-8.
133. Genesca A, Caballin MR, Miro R, Benet J, Bonfill X, Egozcue J. Human
sperm chromosomes - long-term effect of cancer-treatment. Cancer Genet
Cytogenet. 1990;46(2):251-60.
REFERÊNCIAS - 120
134. Munnell A, Chen A, Sanzenbacher G. Is the drop in fertility due to the great
recession or a permanent change? CRR WP. 2019:7. Chestnut Hill, Mass.:
Center for Retirement Research at Boston College, March 2019[internet].
20196 [citado em 2021 jan 25]. Disponível em:
http://hdl.handle.net/2345/bc-ir:108363.
135. Levine H, Jørgensen N, Martino-Andrade A, Mendiola J, Weksler-Derri D,
Mindlis I, Pinotti R, Swan SH. Temporal trends in sperm count: a systematic
review and meta-regression analysis. Hum Reprod Update. 2017;23(6):646-659.
136. Carlsen E, Giwercman A, Keiding N, Skakkebaek NE. Evidence for decreasing
quality of semen during past 50 years. BJM. 1992;305(6854):609-13.
137. Giwercman A, Bonde JP. Declining male fertility and environmental factors.
Endocrino Metab Clin North Am. 1998;27(4):807-30.
138. Geoffroy-Siraudin C, Loundou AD, Romain F, Achard V, Courbiere B, Perrard
MH, Durand P, Guichaoua MR. Decline of semen quality among 10 932 males
consulting for couple infertility over a 20-year period in Marseille, France.
Asian J AndrolJ Androl. 2012;14(4):584-90.
139. Borges E, Setti AS, Braga D, Figueira RDS, Iaconelli A. Decline in semen
quality among infertile men in Brazil during the past 10 years. Int Braz J Urol.
2015;41(4):757-63.
140. Cocuzza M, Esteves SC. Shedding Light on the Controversy Surrounding the
Temporal Decline in Human Sperm Counts: A Systematic Review. Scientific
World Journal. 2014;365691. doi:10.1155/2014/365691
REFERÊNCIAS - 121
141. Girela JL, Gil D, Johnsson M, Gomez-Torres MJ, De Juan J. Semen
parameters can be predicted from environmental factors and lifestyle using
artificial intelligence methods. Biol Reprod. 2013;88(4):8.
142. Vermeulen A, Verdonck L, Kaufman JM. A critical evaluation of simple
methods for the estimation of free testosterone in serum. J Clin Endocrino
Metab. 1999;84(10):3666-72.
143. OMS. WHO laboratory manual for the examination and processing of human
semen. 5th ed. ed. Geneva: Geneva World Health Organization; 2010.
144. WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-
cervical mucus interaction. 4th ed. ed. Published on behalf of the World Health
Organization [by] Cambridge University Press; 1999.
145. Kruger TF, Menkveld R, Stander FSH, Lombard CJ, Van der Merwe JP, van
Zyl JA, Smith K. Sperm morphological features as a prognostic factor in
invitro fertilization. Fertil Steril. 1986;46(6):1118-22.
146. Huszar G, Vigue L, Walliman T, editors. Creatine kinase in sperm: the
presence of mitochondrial and brain-type creatine kinase isozymes (Abstr. P-
64). Forty-First Annual Meeting of The American Fertility Society, Chicago,
Illinois, September; 1985.
147. Hallak J, Sharma RK, Pasqualotto FF, Ranganathan P, Thomas AJ, Agarwal A.
Creatine kinase as an indicator of sperm quality and maturity in men with
oligospermia. Urology. 2001;58(3):446-51.
REFERÊNCIAS - 122
148. Athayde KS, Cocuzza M, Agarwal A, Krajcir N, Lucon AM, Srougi M, Hallak
J. Development of normal reference values for seminal reactive oxygen species
and their correlation with leukocytes and semen parameters in a fertile
population. J Androl. 2007;28(4):613-20.
149. Cocuzza MAS. Avaliação do impacto da varicocele clínica no volume
testicular, parâmetros seminais e níveis de radicais livres de oxigênio no
sêmen de homens com fertilidade comprovada [Tese]. São Paulo: Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo; 2011.
150. Evenson DP. The Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA®) and other sperm
DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNA integrity as
related to fertility. Anim Reprod Sci. 2016;169:56-75.
151. Pariz JR. Efeito da suplementação de melatonina e cafeína nas características
estruturais e funcionais de espermatozoides pré-criopreservação e pós-
descongelamento [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina da Universidade de
São Paulo; 2017.
152. WHO Global Database on Body Mass Index (BMI): an interactive surveillance
tool for monitoring nutrition transition. Public Health Nutr. 2006;9(5):658-660.
153. Dubin L, Amelar RD. Varicocele size and results of varicocelectomy in
selected subfertile men with varicocele. Fertil Steril. 1970;21(8):606-9.
154. Prader A. Testicular size: assessment and clinical importance. Triangle.
1966;7(6):240-3.
REFERÊNCIAS - 123
155. Chipkevitch E, Nishimura RT, Tu DGS, GaleaRojas M. Clinical measurement
of testicular volume in adolescents: Comparison of the reliability of 5 methods.
J Urol. 1996;156(6):2050-3.
156. Lin CC, Huang WJS, Chen KK. Measurement of Testicular Volume in Smaller
Testes: How Accurate Is the Conventional Orchidometer? J Androl.
2009;30(6):685-9.
157. Fenton KA, Johnson AM, McManus S, Erens B. Measuring sexual behaviour:
methodological challenges in survey research. Sex Transm Infec.
2001;77(2):84-92.
158. Brasil. Conselho Nacional de Saúde. Resolução nº 466, de 12 de dezembro de 2012.
Diretrizes e normas regulamentadoras de pesquisa envolvendo seres humanos.
Disponível em: http://conselho.saude.gov.br/resolucoes/2012/Reso466.pdf.
159. McIntyre M, Hsieh TC, Lipshultz L. Varicocele repair in the era of modern
assisted reproductive techniques. Curr Opn Urol. 2012;22(6):517-20.
160. Wang HB, Dey SK, Maccarrone M. Jekyll and Hyde: Two faces of
cannabinoid signaling in male and female fertility. Endocr Rev.
2006;27(5):427-48.
161. Dixit VP, Sharma VN, Lohiya NK. The effect of chronically administered
cannabis extract on the testicular function of mice. Eur J Pharmacol.
1974;26(1):111-4.
REFERÊNCIAS - 124
162. Vyas DK, Singh R. Effect of cannabis & opium on the testis of the pigeon
Columba livia Gmelin. Indian J Exp Biol. 1976;14(1):22-5.
163. Jeelani R, Bluth MH, Abu-Soud HM. Toxicology in reproductive
endocrinology. Clin Lab Med. 2016;36(4):709.
164. Rey RA, Grinspon RP, Gottlieb S, Pasqualini T, Knoblovits P, Aszpis S,
Pacenza N, Stewart Usher J, Bergadá I, Campo SM. Male hypogonadism: an
extended classification based on a developmental, endocrine physiology-based
approach. Andrology. 2013;1(1):3-16.
165. al Salim A, Murchison PJ, Rana A, Elton RA, Hargreave TB. Evaluation of
testicular volume by three orchidometers compared with ultrasonographic
measurements. Br J Urol. 1995;76(5):632-5.
166. Banerjee A, Singh A, Srivastava P, Turner H, Krishna A. Effects of chronic
bhang (cannabis) administration on the reproductive system of male mice.
article. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol. 2011;92(3):195-205
167. Pagotto U, Marsicano G, Cota D, Lutz B, Pasquali R. The emerging role of the
endocannabinoid system in endocrine regulation and energy balance. Endocr
Rev. 2006;27(1):73-100.
168. Lee SY, Oh SM, Chung KH. Estrogenic effects of marijuana smoke condensate
and cannabinoid compounds. Toxicol Appl Pharmacol. 2006;214(3):270-8.
REFERÊNCIAS - 125
169. Lee SY, Oh SM, Lee SK, Chung KH. Antiestrogenic effects of marijuana
smoke condensate and cannabinoid compounds. Arch Pharm Res.
2005;28(12):1365-75.
170. Maseroli E, Rastrelli G, Corona G, Boddi V, Amato AML, Mannucci E, et al.
Gynecomastia in subjects with sexual dysfunction. J Sex Med. 2015;12:235.
171. Caruso MSF, Alaburda J. Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos -
benzo(a)pireno: uma revisão. Rev Inst Adolfo Lutz. 2008;67(1):1-27.
172. Angelo PM, Jorge N. Compostos fenólicos em alimentos – Uma breve revisão.
Rev Inst Adolfo Lutz 2007;66(1):1-9.
173. Lambard S, Silandre D, Delalande C, Denis-Galeraud I, Bourguiba S, Carreau
S. Aromatase in testis: expression and role in male reproduction. Journal of J
Steroid Biochem Mol Biol. 2005;95(1-5):63-69.
174. Georgellis A, Rydstrom J. Cell-specific metabolic-activation of 7,12-dimethylbenz
a anthracene in rat testis. Chem Biol Interact.1989;72(1-2):65-78.
175. Mandal PK, McDaniel LR, Prough RA, Clark BJ. 7,12-dimethylbenz a
anthracene inhibition of steroid production in MA-10 mouse leydig tumor cells
is not directly linked to induction of CYP1B1. Toxicol Appl Pharmacol.
2001;175(3):200-8.
176. Georgellis A, Parvinen M, Rydström J. Inhibition of stage-specific DNA
synthesis in rat spermatogenic cells by polycyclic aromatic hydrocarbons.
Chem Biol Interact. 1989;72(1-2):79-92.
REFERÊNCIAS - 126
177. Arcaro KF, O'Keefe PW, Yang Y, Clayton W, Gierthy JF. Antiestrogenicity of
environmental polycyclic aromatic hydrocarbons in human breast cancer cells.
Toxicology. 1999;133(2-3):115-27.
178. Safe S, Wormke M. Inhibitory aryl hydrocarbon receptor-estrogen receptor alpha
cross-talk and mechanisms of action. Chem Res Toxicol. 2003;16(7):807-16.
179. Yamazaki H, Shaw PM, Guengerich FP, Shimada T. Roles of cytochromes
P450 1A2 and 3A4 in the oxidation of estradiol and estrone in human liver
microsomes. Chem Res Toxicol. 1998;11(6):659-65.
180. Tsuchiya Y, Nakajima M, Yokoi T. Cytochrome P450-mediated metabolism of
estrogens and its regulation in human. Cancer Lett. Sep 2005;227(2):115-24.
181. Finkelstein JS, Lee H, Burnett-Bowie SAM, Pallais JC, Yu EW, Borges LF,
Jones BF, Barry CV, Wulczyn KE, Thomas BJ, Leder BZ. Gonadal steroids
and body composition, strength, and sexual function in men. N Engl J Med.
2013 Sep 12;369(11):1011-22.
182. Kavoussi P, Costabile RA, Salonia A. Clinical urologic endocrinology:
principles for men’s health. London: Springer; 2012.
183. Inkster S, Yue W, Brodie A. Human testicular aromatase - immunocytochemical
and biochemical-studies. J Clin Endocrino Metab. 1995;80(6):1941-7.
184. Foucault P, Carreau S, Kuczynski W, Guillaumin JM, Bardos P, Drosdowsky
MA. Human Sertoli cells-invitro lactate, estradiol-17-beta and transferrin
production. J Androl. 1992;13(5):361-7.
REFERÊNCIAS - 127
185. Baroi S, Saha, A, Bachar, R, Bachar, S. Cannabinoid as Potential Aromatase
Inhibitor Through Molecular Modeling and Screening for Anti-Cancer
Activity. Dhaka Univ J Pharm Sci. 2020;19(1):47-58.
186. Ranganathan M, Braley G, Pittman B, Cooper T, Perry E, Krystal J, D'Souza
DC. The effects of cannabinoids on serum cortisol and prolactin in humans.
Psychopharmacology. 2009;203(4):737-44.
187. Rodriguez De Fonseca F, Gorriti MA, Bilbao A, Escuredo L, Garcia-Segura
LM, Piomelli D, Navarro M. Role of the endogenous cannabinoid system as a
modulator of dopamine transmission: implications for Parkinson's disease and
schizophrenia. Neurotox Res. 2001;3(1):23-35.
188. Pugeat M, Nader N, Hogeveen K, Raverot G, Dechaud H, Grenot C. Sex
hormone-binding globulin gene expression in the liver: drugs and the metabolic
syndrome. Mol Cell Endocrinol. 2010;316(1):53-9.
189. Glass AR, Swerdloff RS, Bray GA, Dahms WT, Atkinson RL. Low serum
testosterone and sex-hormone-binding-globulin in massively obese men. J Clin
Endocrinol Metab. 1977;45(6):1211-9.
190. Peter A, Kantartzis K, Machann J, Schick F, Staiger H, Machicao F, Schleicher E,
Fritsche A, Häring HU, Stefan N. Relationships of circulating sex hormone-
binding globulin with metabolic traits in humans. Diabetes. 2010;59(12):3167-73.
191. Simo R, Saez-Lopez C, Barbosa-Desongles A, Hernandez C, Selva DM. Novel
insights in SHBG regulation and clinical implications. Trends Endocrinol
Metab (Seoul). 2015;26(7):376-83.
REFERÊNCIAS - 128
192. Cui YR, Guo YH, Qiao SD, Leng LF, Xie ZH, Chen H, Wang XL. Correlation
between SHBG gene polymorphism and male infertility in Han population of
Henan province of China: A STROBE-compliant article. Medicine (Baltimore).
2017;96(32):e7753.
193. Safarinejad MR, Shafiei N, Safarinejad S. Association of the (TAAAA)n
repeat and Asp327Asn polymorphisms in the sex hormone-binding globulin
(SHBG) gene with idiopathic male infertility and relation to serum SHBG
concentrations. J Steroid Biochem Mol Biol. 2011;123(1-2):37-45.
194. Ewing LE, Skinner CM, Quick CM, Kennon-McGill S, McGill MR, Walker
LA, ElSohly MA, Gurley BJ, Koturbash I. Hepatotoxicity of a cannabidiol-rich
cannabis extract in the mouse model. Molecules. 2019;24(9):1694.
195. Ring J, Welliver C, Parenteau M, Markwell S, Brannigan RE, Kohler TS. The
utility of sex hormone-binding globulin in hypogonadism and infertile males. J
Urol. 2017;197(5):1326-31.
196. Rosety MA, Diaz A, Rosety JM, Pery MT, Brenes-Martin F, Bernardi M,
García N, Rosety-Rodríguez M, Ordoñez FJ, Rosety I. Exercise improved
semen quality and reproductive hormone levels in sedentary obese adults. Nutr
Hosp. 2017;34(3):608-12.
197. Lalinde-Acevedo PC, Mayorga-Torres BJM, Agarwal A, du Plessis SS, Ahmad
G, Cadavid ÁP, Cardona Maya WD. Physically active men show better semen
parameters than their sedentary counterparts. Int J Fertil Steril.
2017;11(3):156-65.
REFERÊNCIAS - 129
198. Majumdar A, Mangal NS. Hyperprolactinemia. J Hum Reprod Sci.
2013;6(3):168-75.
199. Dabbous Z, Atkin SL. Hyperprolactinaemia in male infertility: clinical case
scenarios. Arab J Urol. 2018;16(1):44-52.
200. Suárez MF, Arbeláez A, Mosquera M, Ramírez-Vélez R, Aguilar de Plata AC.
Los niveles de ferritina y los marcadores de riesgo cardiovascular se
correlacionan con mayor tiempo sedentario auto-reportado en hombres
aparentemente sanos. Rev Colomb Cardiol. 2012;19(1):4-10.
201. Bartfay WJ, Bartfay E, Axelsson J, Sigurdsson SB, Naimark B. The
relationship of serum ferritin with sex and exercise in canadians of icelandic
descent - Implications for prevention of coronary-artery disease. Can J
Cardiol. 1995;11(4):305-10.
202. Lamm S, Chidakel A, Bansal R. Obesity and hypogonadism. Urol Clin North
Am. 2016;43(2):239-45.
203. Templeman NM, Skovso S, Page MM, Lim GE, Johnson JD. A causal role for
hyperinsulinemia in obesity. J Endocrinol. 2017;232(3):R173-R83.
204. Mokdad AH, Ford ES, Bowman BA, Dietz WH, Vinicor F, Bales VS, Marks
JS. Prevalence of obesity, diabetes, and obesity-related health risk factors,
2001. JAMA. 2003;289(1):76-9.
205. Harlev A, Agarwal A, Gunes SO, Shetty A, du Plessis SS. Smoking and male
infertility: an evidence-based review. World J Mens Health. 2015;33(3):143-60.
REFERÊNCIAS - 130
206. Kovac JR, Khanna A, Lipshultz LI. The effects of cigarette smoking on male
fertility. Postgrad Med. 2015;127(3):338-41.
207. Andersen AN, Semczuk M, Tabor A. Prolactin and pituitary-gonadal function
in cigarette-smoking infertile patients. Andrologia. 1984;16(5):391-6.
208. Xue Y, Morris M, Ni L, Guthrie SK, Zubieta J-K, Gonzalez K, McConnell DS,
Domino EF. Venous plasma nicotine correlates of hormonal effects of tobacco
smoking. Pharmacol Biochem Behav. 2010;95(2):209-15.
209. Coleman DT, Bancroft C. Nicotine acts directly on pituitary GH3 cells to
inhibit prolactin promoter activity. J Neuroendocrinol. 1995;7(10):785-9.
210. Mouhamed DH, Ezzaher A, Hellara I, Neffati F, Douki W, Gaha L, Najjar MF.
Effect of cigarette smoking on insulin resistance risk. Eur Phychiatry. 2013;28.
211. Sliwinska-Mosson M, Milnerowicz H. The impact of smoking on the
development of diabetes and its complications. Diab Vasc Dis REs.
2017;14(4):265-76.
212. Martini AC, Molina RI, Estofan D, Senestrari D, de Cuneo MF, Ruiz RD.
Effects of alcohol and cigarette consumption on human seminal quality. Fertil
Steril. 2004;82(2):374-7.
REFERÊNCIAS - 131
213. Sierksma A, Sarkola T, Eriksson CJP, van der Gaag MS, Grobbee DE,
Hendriks HFJ. Effect of moderate alcohol consumption on plasma
dehydroepiandrosterone sulfate, testosterone, and estradiol levels in middle-
aged men and postmenopausal women: A diet-controlled intervention study.
Alcohol Clin Exp Res. 2004;28(5):780-5.
214. Taskinen MR, Nikkilä EA, Välimäki M, Sane T, Kuusi T, Kesäniemi A,
Ylikahri R. Alcohol-induced changes in serum-lipoproteins and in their
metabolism. Am Heart J. 1987;113(2):458-64.