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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
HISTOMORFOMETRIA, MICROTOMOGRAFIA BIDIMENSIONAL E
TRIDIMENSIONAL, TESTE DE NANODUREZA E COMPOSIÇÃO
BIOQUÍMICA DO ESTOJO CÓRNEO DE BUBALINOS
Bruno Moraes Assis
Orientador: Prof. Dr. Rogério Elias Rabelo
GOIÂNIA
2015
ii
BRUNO MORAES ASSIS
HISTOMORFOMETRIA, MICROTOMOGRAFIA BIDIMENSIONAL E
TRIDIMENSIONAL, TESTE DE NANODUREZA E COMPOSIÇÃO
BIOQUÍMICA DO ESTOJO CÓRNEO DE BUBALINOS
Dissertação apresentada para
obtenção do título de Mestre em
Ciência Animal junto a Escola de
Veterinária e Zootecnia da
Universidade Federal de Goiás
Área de concentração:
Patologia, clínica e cirurgia animal
Orientador:
Prof. Dr. Rogério Elias Rabelo – PPGCA/EVZ
Comitê de Orientação:
Prof. Dr. Valcinir Aloísio ScallaVulcani – PPGCA/EVZ
Prof. Dr. Adilson Donizeti Damasceno–PPGCA/EVZ
GOIÂNIA
2015
iii
BRUNO MORAES ASSIS
Dissertação defendida e aprovada em 29/10/2015, pela Banca Examinadora
constituída pelos professores:
_____________________________
Prof. Dr. Rogério Elias Rabelo
(Orientador)
_____________________________
Prof. Dr. Luiz Antônio Franco da Silva
_____________________________
Profa. Dra. Maria Ivete de Moura
iv
Dedico esse trabalho à minha família! Aos
meus pais, Sebastião Gonçalves de Assis
Sobrinho e Maria Aparecida Lima de Moraes
Assis em especial e aos meus irmãos e amigos
que me suportam em oração e em amor.
v
AGRADECIMENTOS
Toda honra e toda glória sejam dadas ao DEUS vivo! Meu único Senhor e
suficiente Salvador, a quem devo toda minha vida, tudo o que tenho e o que sou. Agradeço a
DEUS por me dar direção em tudo o que faço, me guiando pelo melhor e mais seguro
caminho. Nem sempre o mais fácil, porém, tem colocado os meus pés sobre a rocha da Sua
salvação, onde eu me encontro sempre no centro da Sua boa, perfeita e agradável vontade.
Cursar uma pós-graduação foi um presente dos céus e resposta de oração, Obrigado meu
Senhor. ALELUIA! Como é bom compreender um pouquinho de tudo o que o Senhor criou
com tanta perfeição, beleza e complexidade. Os resultados desse trabalho mostraram quão
grande é o Senhor e quão pequenos nós somos diante de Ti. Mesmo assim, o Senhor escolheu
nos amar.
Aos meus pais, Sebastião e Maria Aparecida, que com amor, cuidado e apoio me
incentivaram a retornar aos estudos. Obrigado pelo suporte e por compreenderem as
mudanças ocorridas nesse período de ausência. Vocês são a prova de uma das mais belas
manifestações de DEUS na terra. Esse amor que vem do alto e que foi posto sobre a vida de
vocês, me dá força e coragem para seguir em frente, mesmo quando as circunstâncias operam
de forma opositora e opressiva. Obrigado por tudo. Amo vocês.
Agradeço os meus irmãos de sangue, Ana Isabel e Eder Paulo e aos meus irmãos
em Cristo que tem pago um preço de intercessão em favor da minha vida e da realização desse
trabalho. Obrigado por lutarem comigo e dividir esse fardo. Ao Caíque Torres deixo minha
admiração e gratidão por me cobrir com suas orações, mesmo sendo tão jovem e ao mesmo
tempo tão maduro e por sempre buscar excelência diariamente servindo no reino de DEUS
amando as pessoas que estão a sua volta. Em especial às minhas tias Alda e Silvia, por serem
verdadeiras guerreiras de oração e por cada palavra de animo e encorajamento. Como todo
meu coração amo todos vocês.
Ao meu orientador Professor Doutor Rogério Elias Rabelo, minha eterna
admiração e gratidão por tudo o que fez e tem feito em meu favor. Obrigado por acreditar em
mim quando eu não acreditava. Obrigado pelo cuidado e sabedoria em extrair de mim algo
que eu mesmo não sabia que tinha para oferecer. Agradeço pela paciência ao me mostrar o
caminho nos momentos de falhas e equívocos ao redigir os trabalhos e nos momentos das
apresentações orais. Obrigado por me ensinar que a excelência não é um objetivo e sim um
padrão a ser estabelecido. Obrigado, por abrir as portas da sua casa e por abdicar tempo com
sua família nos domingos e feriados para me auxiliar nas atividades da pós-graduação.
vi
Agradeço ainda, por sua generosidade em me permitir fazer parte de um experimento tão
grande e tão relevante para a comunidade científica, médicos veterinários e produtores rurais.
Obrigado pela parceria de pai para filho, que irá nos permitir colher muitos e bons frutos.
Tamo junto.
Aos meus co-orientadores: Prof. Dr. Valcinir Aloísio Scalla Vulcani, agradeço por
sua atenção, paciência e contribuição na construção da metodologia desse trabalho e pelas
incontáveis vezes que deixou seus afazeres para discutir e compreender os resultados dessa
pesquisa comigo. Ao Prof. Dr. Adilson Donizete Damasceno, agradeço pelo cuidado, atenção
e toda logística que permitiu ter um local de estudo para realizar as atividades da pós-
graduação e ainda realizar as coletas destinadas ao meu experimento. Muito obrigado pela
generosidade de vocês e pela parceria.
Gostaria de agradecer de forma muito especial aos meus colegas de pós-graduação
que me auxiliaram nas coletas das amostras referentes ao meu experimento. Obrigado pela
disposição e paciência em virar algumas noites comigo para que essa etapa fosse realizada
com excelência. A minha gratidão a vocês, Andressa Rabbers e Elizama Txucarramae da área
de Patologia, Clínica e Cirurgia Animal e Ana Flávia Royers, e Stanley Centurion do
programa de Pós-graduação em Produção Animal. A minha oração é que DEUS derrame Seu
cuidado e amor sobre a vida de cada um e que preencha o coração de vocês com a paz que
excede todo entendimento. Amo muito vocês meus amigos.
Ao meu amigo Darlan e a Prof. Dra. Marcia Dias do Laboratório de Análise de
Alimentos da Universidade Federal de Goiás – Regional Jataí, os meus sinceros
agradecimentos. Obrigado por gastar tempo em me auxiliar a padronizar as análises de
bioquímica destrutiva, que por sua vez, nos deu tanto trabalho. A disposição, o cuidado e o
carinho de vocês fizeram toda diferença. Que DEUS continue a abençoa-los sempre.
Gostaria de agradecer ainda a Dra. Josy Fraccaro de Marins e ao Prof. Dr. José
Benedito Guimaraes Junior que abriram as portas do Laboratório de Tecnologia da Madeira
do Departamento de Engenharia Florestal da Universidade Federal de Goiás – Regional Jataí,
para a realização da moagem das amostras destinadas aos testes bioquímicos. Essa etapa foi
determinante para a realização dessas análises. Obrigado pela orientação e disposição em
contribuir com esse trabalho.
Com todo carinho do meu coração, gostaria de agradecer imensamente a
Professora Doutora Caroline Rocha da Universidade Estadual de Goiás, por sua relevante
contribuição na correção dos seminários da pós-graduação e dos artigos que compõe essa
vii
dissertação. Com toda certeza o seu apoio foi determinante para elevar a qualidade dos nossos
trabalhos.
Gostaria de agradecer aos professores doutores, Luiz Antônio Franco, Naida
Borges e Cíntia Minafra pelo apoio e encorajamento nos momentos difíceis e por me
ajudarem a entender como deve pensar e enxergar como um cientista. O meu muito obrigado
para a secretária da pós-graduação Andreia Santana, por sua atenção e disposição em
solucionar os nossos problemas burocráticos, sempre sorrindo.
Agradeço de maneira especial, a todos os membros do Setor de Cirurgia de
Grandes Animais (SCGA) da Universidade Federal de Goiás – Regional Jataí, pelo apoio,
suporte e dedicação na realização dos trabalhos. A participação de vocês foi essencial para o
resultado final desse estudo.
Que DEUS continue derramando graça, força e fé sobre a vida de todos vocês que
fazem parte da minha vida e da minha história, hoje e sempre. Meus sinceros agradecimentos.
viii
“Quem é fiel no mínimo, também é fiel no
muito; quem é injusto no mínimo, também é
injusto no muito.”
Bíblia Sagrada: Lucas 16:10
ix
SUMÁRIO
CAPITULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS .......................................................... 1
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1
2. MORFOFISIOLOGIA DOS CASCOS DE BUBALINOS....................................... 2
3. TÉCNICAS DE AVALIAÇÃO DA MICROESTRUTURA DO CASCO .............. 5
3,1. Histomorfometria..................................................................................................... 5
3.2. Microtomografia 2D e 3D ....................................................................................... 6
3.3. Teste de Nanodureza ............................................................................................... 7
3.4. Composição bioquímica destrutiva e não destrutiva................................................ 8
REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 10
CAPÍTULO 2 - CARACTERÍSTICAS HISTOLÓGICAS E MORFOMÉTRICAS
DO ESTOJO CÓRNEO DOS CASCOS DE
BUBALINOS.....................................................................................
1
RESUMO........................................................................................................................ 1
ABSTRACT.................................................................................................................... 1
INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 2
MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 3
RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................................... 5
CONCLUSÕES............................................................................................................... 14
AGRADECIMENTOS.................................................................................................... 14
REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 14
CAPÍTULO 3 - MICROTOMOGRAFIA BIDIMENSIONAL, TRIDIMENSIONAL
E TESTE DE NANODUREZA VICKERS DO ESTOJO CÓRNEO
DE BUBALINOS...............................................................................
1
RESUMO........................................................................................................................ 1
ABSTRACT.................................................................................................................... 2
INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 2
x
MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 3
RESULTADOS............................................................................................................... 5
DISCUSSÃO................................................................................................................... 11
CONCLUSÕES............................................................................................................... 14
AGRADECIMENTOS.................................................................................................... 15
REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 15
CAPÍTULO 4 - COMPOSIÇÃO BIOQUÍMICA DO ESTOJO CÓRNEO DE
BUBALINOS E SUA INFLUÊNCIA NA QUALIDADE DO
CASCO.............................................................................................
1
RESUMO........................................................................................................................ 1
ABSTRACT.................................................................................................................... 1
INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 2
MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 3
RESULTADOS............................................................................................................... 5
DISCUSSÃO................................................................................................................... 8
CONCLUSÕES............................................................................................................... 11
AGRADECIMENTOS.................................................................................................... 11
REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 11
CAPÍTULO 5 - CONSIDERACÕES FINAIS............................................................... 12
ANEXOS.......................................................................................................................... 14
xi
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
Figura 1 Aspectos macroscópicos do estojo córneo dos cascos de búfalos.
Observa-se em A - a muralha abaxial (1), muralha dorsal (2) e pinça
(3). Pode verificar em B - o bulbo do talão (*), sola pré-bulbar (1),
sola subapical (2), sola apical (3), linha branca (seta amarela) e talão
(seta branca).........................................................................................
2
Figura 2 Fotomicrografia do córion coronário do estojo córneo de cascos de
bubalinos. Observa-se em (A), o estrato basal (seta branca). Em (B),
estrato espinhoso (seta branca). Em (C) nota-se o estrato granuloso
e em (D), o estrato córneo. HE............................................................
3
Figura 3 Fotomicrografia da epiderme queratinizada do estojo córneo de
cascos de bubalinos. Observa-se em (A), o estrato basal (seta
branca). Em (B), estrato espinhoso (seta branca). HE.........................
4
Figura 4 Avaliação histomorfométrica do córion laminar dos cascos de
bubalinos. Em (A), observa-se linhas longitudinais referentes à
medida de comprimento das papilas epidérmicas, enquanto a linha
horizontal refere-se a contagem de papilas por área. Em (B), pode-
se observar a medida de espessura das papilas indicada pela linha
amarela e a medida de espaçamento entre as papilas pela linha azul..
5
Figura 5 Representação esquemática do teste de nanodureza. Em (A)
observa-se a curva de carga máxima e descarga. Em (B), pode-se
verificar que o F-max representa a força máxima (carga máxima)
aplicada sobre a amostra, o a, a área de contato projetada e a relação
Pd/Re (poder de penetração / recuperação elástica) que determina o
modulo elástico no momento da descarga da força..............................
8
xii
LISTA DE FIGURAS (Cont.)
CAPÍTULO 2
Figura 1 Fotomicrografia da epiderme do estojo córneo do casco de
bubalinos. Observa-se em (A), papilas epidérmicas do córion
coronário (perioplo). Em (B), papilas da muralha abaxial. Em (C),
observa-se as papilas da sola. Em (D), o estrato basal do córion
laminar da muralha abaxial evidenciando intensa divisão mitótica
dos queratinócitos na ponta da seta vermelha. Em (E), verifica-se o
estrato basal (asterisco amarelo), estrato espinhoso (seta vermelha) e
em (F), observa-se o estrato granuloso (seta vermelha) e estrato
córneo (asterisco amarelo), HE............................................................
6
Figura 2 Fotomicrografia da epiderme do córion coronário do estojo córneo
do casco de bubalinos. Em (A) pode-se observar que maior
quantidade de melanina nos queratinócitos próximos à base da
papila epidérmica e menor quantidade em direção ao ápice. Em (1)
nota-se o estrato basal, em (2) o estrato espinhoso e em (3) estrato
granuloso. Em (B) apresenta-se a epiderme queratinizada (asterisco
amarelo). Nota-se no (circulo branco) inúmeros melanossomas
(pontos escuros) espalhados no tecido queratinizado. Em (C), na
base da papila epidérmica do córion coronário, evidencia-se intensa
produção de melanina e sua liberação para os queratinócitos, por
meio dos melanossomas (seta vermelha). Em (D), observa-se que os
melanossomas, ricos em melanina e organizados em formato de
guarda-chuva ao redor do núcleo da célula.
HE........................................................................................................
7
Figura 3 Fotomicrografia da epiderme do estojo córneo dos dígitos de
bubalinos. Observa-se em (A), os queratinócitos anucleados do
estrato córneo da sola pré-bulbar, repletos de queratina, organizados
de forma concêntrica e formando os túbulos córneos (setas brancas).
Em (B) nota-se que a estrutura da queratina intratubular assume uma
forma helicoidal (setas amarelas). Em (C) verifica-se a queratina
extratubular, composta por queratinócitos anucleados firmemente
aderidos pelo cemento (seta amarela) e no circulo branco observa-se
a grânulos citoplasmáticos de melanina. Em (D), o corpo de uma
papila epidérmica do córion laminar da muralha abaxial, em um
corte longitudinal evidenciando um vaso aferente (seta amarela) e
um vaso eferente (seta preta). Em (E), evidencia capilares no interior
da papila epidérmica (setas amarelas). HE...........................................
9
xiii
LISTA DE FIGURAS (Cont.)
Figura 4 Fotomicrografia da epiderme queratinizada do estojo córneo de
bubalinos. Pode-se observar em (A), a vista frontal de um
fragmento da muralha abaxial do estojo córneo. Nota-se que os
túbulos córneos estão dispostos paralelamente uns aos outros, e
acompanham a direção do crescimento do casco, no sentido
proximal para distal (seta vermelha). Em (B), observa-se um corte
transversal do fragmento evidenciando os túbulos córneos em forma
circular (circulo vermelho). Em (C) pode-se observar a vista lateral
de um fragmento da sola do estojo córneo com os túbulos córneos
dispostos paralelamente uns aos outros e acompanhando a direção
do crescimento do casco (seta vermelha). Observa-se que os
túbulos córneos possuem uma forma helicoidal (seta preta). Em (D),
apresenta-se a vista frontal de um fragmento da sola do estojo
córneo com os túbulos córneos em forma circular (circulo
vermelho).............................................................................................
10
CAPÍTULO 3
Figura 1 Organização estrutural do tecido córneo que compõe a epiderme
queratinizada. Em (A), microtomográfica bidimensional da muralha dorsal
do estojo córneo do casco de bubalinos. Em (B) reconstrução
tridimensional da muralha dorsal do estojo córneo do casco de
bubalinos.......................................................................................................
5
Figura 2 Imagem microtomográfica bidimensional do estojo córneo de bubalinos.
Em (A), observa-se a muralha dorsal do estojo córneo de bubalinos. Nota-
se predominância das cores azul, rosa e verde claro, representando região
com maior dureza. Em (B), observa-se a muralha abaxial do estojo córneo
de bubalinos. Verificou-se predominância das cores azul, rosa e amarela,
representando uma região com dureza intermediária. Em (C), observa-se a
sola do estojo córneo de bubalinos. Pode-se observar predominância das
cores amarela, rosa e marrom, indicando região com menor dureza. O
asterisco (*) branco representa a escala
colorimétrica................................................................................................
6
xiv
LISTA DE FIGURAS (Cont.)
Figura 3 Microtomografia bidimensional do estojo córneo de bubalinos. Em (A e
B), observa-se a muralha dorsal e a muralha abaxial do estojo córneo de
bubalinos, respectivamente, evidenciando a queratina intratubular de cor
rosa (círculo branco) e a queratina extratubular de cor azul e verde claro
(seta vermelha), indicando menor dureza da queratina intratubular em
relação à queratina extratubular. Em (C), na região da sola do casco a
queratina intratubular apresenta cor azul (círculo branco) e a queratina
extratubular cor rosa (seta vermelha), indicando maior dureza da queratina
intratubular em relação à queratina extratubular. O asterisco (*) branco
representa a escala
colorimétrica...................................................................................................
7
Figura 4 Microtomografia tridimensional (modelo-3D obtido no CTvol) do estojo
córneo dos dígitos de bubalinos. Em (A) observa-se a queratina
intratubular da região da muralha dorsal. Em (B) observa-se os túbulos
córneos organizados de forma concêntrica helicoidal, conforme
evidenciado pelas setas vermelhas.................................................................
8
Figura 5 Imagens microtomográficas do estojo córneo dos dígitos de bubalinos. Em
(A), muralha dorsal evidenciando o ângulo dos túbulos córneos de 90o
(seta vermelha) em relação ao córion coronário. Em (B), muralha abaxial
apresentando uma angulação dos túbulos córneos de 65o (seta vermelha)
em relação ao córion coronário. Em (C), na região da sola do casco os
túbulos córneos apresentam uma angulação de 70o (seta vermelha) em
relação ao córion
laminar............................................................................................................
8
xv
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
Tabela 1 Média (µm) e desvio-padrão do comprimento, espessura e
espaçamento entre as papilas epidérmicas do casco de bubalinos....
13
Tabela 2 Média (µm) e desvio-padrão do número de papilas/mm, do córion
coronário e córion laminar do casco de bubalinos............................
13
CAPÍTULO 3
Tabela 1 Diâmetro, percentual e número total de túbulos córneos dos dígitos
de bubalinos analisados por meio de microtomografia
tridimensional....................................................................................
9
Tabela 2 Resultado do teste de Nanodureza Vickers para o estojo córneo
dos dígitos de bubalinos, associado ao resultado do módulo
elástico...............................................................................................
10
CAPÍTULO 4
Tabela 1 Análise bioquímica da matéria seca, matéria mineral, matéria
orgânica, proteína bruta e estrato etéreo do estojo córneo dos
cascos de bubalinos pela técnica destrutiva......................................
6
Tabela 2 Análise bioquímica dos minerais, enxofre, cálcio, potássio,
fósforo, zinco e cobre do estojo córneo dos cascos de bubalinos
pela técnica não destrutiva................................................................
10
xvi
RESUMO
As enfermidades de cascos, apesar de ser alvo de poucos estudos na espécie bubalina,
apresentam aspectos científicos importantes uma vez que estes animais, mesmo criados em
condições adversas, apresentam resistência diferenciada quanto à ocorrência de doenças
podais, quando comparados aos bovinos, com destaque para os de aptidão leiteira. Acredita-se
que o conhecimento microestrutural do casco de bubalinos gerou informações importantes
para melhor entendimento da resistência podal intrínseca dos bubalinos às enfermidades
podais. O presente estudo teve por finalidade pesquisar a microestrutura do estojo córneo de
búfalas adultas, raça Jafarabadi, por meio de avaliações histomorfométricas, microtomografia
bidimensional, tridimensional, teste de nanodureza e composição bioquímica. As avaliações
histomorfométricas em bubalinos revelaram características importantes ainda não
investigadas por outros pesquisadores, destacando o comportamento estrutural das papilas
epidérmicas nas diferentes regiões do estojo córneo, a morfologia e disposição dos túbulos
córneos, a arquitetura da queratina extratubular e intratubular e ainda organização dos
melanossomas. Pode-se observar nessas avaliações que as médias de comprimento das
papilas, espessura e espaçamento nos dígitos dos membros pélvicos e torácicos não
apresentaram diferenças estatísticas significativas entre si. Todavia, ao comparar as médias do
córion coronário, córion laminar da muralha e sola, observou-se entre as regiões do estojo
córneo, um aumento da espessura das papilas do córion laminar da muralha e do espaçamento
comparando-se as demais regiões. Os achados dessa pesquisa quando comparados aos
achados de outros pesquisadores, demonstraram que as papilas epidérmicas nos cascos desses
animais, apresentam-se maiores que as papilas epidérmicas de bovinos das raças, Holandesa e
Gir, sugerindo que possuem maior capacidade de produção de queratina e melhor fixação da
epiderme ao estojo córneo. Contudo, pôde-se conjecturar tais características com a maior
resistência desses animais as enfermidades podais, embora haja a necessidade de estudos
adicionais. Por meio das análises de microtomografia e teste de nanodureza, pode-se verificar
que os dígitos mediais dos membros torácicos e os dígitos laterais dos membros pélvicos
apresentaram maior quantidade de túbulos córneos com diâmetros maiores. Porém, a muralha
abaxial dos dígitos dos membros torácicos apresentaram valores superiores aos dígitos dos
membros pélvicos. Apesar de não ter sido observada diferença significativa entre os dígitos
estudados, o presente estudo pôde esclarecer, ainda, aspectos importantes sobre a nanodureza
das diferentes regiões do estojo córneo dos dígitos de bubalinos. A análise de
microtomografia 3D revelou que a muralha dorsal apresenta maior dureza quando comparada
com a muralha abaxial, de dureza intermediária, bem como, com a sola do casco, que
apresentou menor dureza entre as regiões avaliadas. Inferiu-se assim que o teste de
microtomografia tridimensional seja mais específico que o teste de nanodureza de Vickers
para a estrutura considerada. No entanto, tal afirmação requer pesquisas adicionais. Os testes
bioquímicos geraram parâmetros quanto aos elementos estruturais do estojo córneo, que
demonstraram diferentes concentrações em relação à região e posição anatômica do casco,
sendo essas diferenças associadas aos dígitos que recebem maior sobrecarga de massa
corporal e impacto. O presente estudo gerou conhecimento e parâmetros a serem utilizados
em outras investigações científicas, em outras espécies e raças de bovídeos.
Palavras - chave: biossegurança, doenças podais, estojo córneo, muralha do casco, sola do
casco, túbulos córneos.
xvii
ABSTRACT
Despite not being a common subject of studies about buffalo, the incidence of hulls diseases
has important scientific aspects as these animals, as they are breeded in adverse conditions,
have different resistance for the occurrence of podais diseases when compared to cattle,
especially dairy cattle. The knowledge about microstructural structures of buffalo’s hoof
generated important information for understanding of the intrinsic resistance of buffaloes foot
diseases. This study aimed to investigate the microstructure of adult Jafarabadi buffaloes,
through histomorphometric ratings, two-dimensional microtomography, three-dimensional,
nanohardness test and biochemical composition. Histomorphometric ratings revealed
important features not yet investigated by other researchers, highlighting the structural
behavior of epidermal papillae in different regions of corneal layer, the morphology and
disposition of the horn tubules, the architecture of extratubular and intratubular keratin and
even organization of melanosomes . It was observed that the average length of buds, thickness
and spacing in pelvic and thoracic digit did not show statistically significant differences.
However, an increase in thickness of the laminar corium papillae of the wall and spacing was
observed when comparing the average of the coronary corium and wall and sole laminar
corium. When compared to the findings of other researchers, this study have shown that the
epidermal papillae on the hulls of these animals are presented larger than the epidermal
papillae of Holstein and Gir animals, suggesting that the buffalo’s has greater keratin
production and better epidermis and horny case fixing. It can be conjectured that such
characteristics are associate with greater resistance to foot diseases of this animals, although
additional studies are needed. Analysis of microtomography and nanohardness test showed
increased medial digit of forelimbs and side-digit of hindlimbs exhibit increased horn tubules
with larger diameters. But the abaxial wall of forelimbs digit showed higher values than
hindlimbs digit. Even there was not significant difference between the digits analyzed, this
study could clarify important aspects of the nanohardness of different regions of the corneal
case of buffalo’s digits. 3D microtomography analysis revealed that the dorsal wall presents a
greater hardness compared to the abaxial wall of intermediate hardness, and with the sole of
the hoof, that showed the lowest hardness among the evaluated areas. It was inferred that
tridimensional microtomography testing is more specific than Vickers nanohardness test for
this structure. However, further research are required. Biochemical tests generated parameters
about structural elements of the corneal case, which showed different concentrations in
relation to the region and anatomical position of the hull. These differences are related to the
digits wich recive higher load of body weight and impact. This study generated knowledge
and parameters to be used in further researches on different bovine species and breeds.
Key words: biosafety, podal diseases, corneal case, hoof wall, the hoof sole, horn tubules.
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES INICIAIS
1. INTRODUÇÃO
A bubalinocultura no Brasil vem se expandindo, pelo fato do leite da búfala
apresentar características que confere maior rendimento em produtos lácteos agregando valor
e elevando o poder de comercialização dos mesmos. A população de búfalos no território
brasileiro segue na ordem das 1.135.191 cabeças1, 2.
Diante da importância desse rebanho no Brasil e as características positivas,
principalmente quanto a rusticidades apresentadas pela espécie, projetos de melhoramento
genético de búfalos foram criados para identificar animais com maiores potencialidades, com
o intuito de aumentar e melhorar a produtividade. Entretanto, estudos científicos abordando
aspectos epidemiológicos sobre as enfermidades que acometem esses animais, com destaque
para as doenças podais e os fatores relacionados à resistência dos cascos dessa espécie ainda
são motivos de especulação.
Os bubalinos são expostos a vários fatores de risco, muitas vezes manejados em
ambientes hostis, com presença constante de contaminação e excesso de umidade. A
incidência de doenças afetando o estojo córneo, quando comparada aos animais de aptidão
leiteira, com destaque para as raças Holandês e Girolando, apresenta-se pequena e merece,
por parte dos pesquisadores, estudos adicionais. Neste contexto, estudos morfofuncionais,
utilizando diferentes técnicas de caracterização quanto aos aspectos microestruturais,
bioquímicos e de nanodureza do estojo córneo entre essas espécies são necessárias para
melhor entendimento e busca de ferramentas que possam trazer melhorias no controle e
prevenção das doenças que acometem os cascos dos animais.
Diante dos desafios impostos aos bovinos nos atuais sistemas de produção, as
doenças de casco são preocupantes e estão relacionadas a causas multifatoriais, com destaque
para os aspectos genéticos, morfofuncionais, infecciosos, nutricionais e ambientais. Já quanto
aos bubalinos, pesquisas básicas focadas no aspecto morfofuncional do casco dessa espécie e
os fatores que influenciam a resistência e qualidade dos mesmos são escassas. Desse modo,
acredita-se que este estudo apresenta informações científicas inéditas contribuindo de forma
significativa para o crescimento e controle sanitário da pecuária brasileira.
O presente estudo objetivou avaliar e descrever a microestrutura do estojo córneo
do casco de bubalinos por meio de técnicas inovadoras na medicina veterinária como a
histomorfometria, microtomografia 3D, composição bioquímica não destrutiva e nanodureza.
2
2. MORFOFISIOLOGIA DOS CASCOS DE BUBALINOS
O estojo córneo dos dígitos, também denominado cápsula digital ou casco é
constituído de tecido epidérmico queratinizado, que por sua vez pode ser dividido em partes
conforme sua constituição, localização e função. A muralha, talão, sola, bulbo do talão, linha
branca e pinça, fazem parte dessas estruturas3,4 (Figura 1). A muralha ou parede do casco é
constituída por uma estrutura córnea resistente, sendo a porção mais externa da extremidade
digital, que suporta a maior parte da massa corporal animal. A sola é separada da muralha
pela linha branca e está parcialmente em contato com o solo. O talão está situado na porção
caudal do estojo córneo digital, servindo de ponte entre a parede e a sola5.
FIGURA 1 – Aspectos macroscópicos do estojo córneo dos cascos de búfalos. Observa-se em
A - a muralha abaxial (1), muralha dorsal (2), pinça (3) e muralha abaxial (4).
Pode verificar em B - o bulbo do talão (*), sola pré-bulbar (1), sola subapical
(2), sola apical (3), linha branca (seta amarela) e talão (seta branca).
O casco é dividido em regiões envolvendo tanto a epiderme, com seu tecido
queratinizado (estojo córneo), quanto à derme subjacente. Essa segmentação é baseada nas
características das diferentes camadas do tegumento, tendo como partes principais o perioplo,
coroa, parede (segmento laminar), sola e bulbo6. O perioplo é a lamina córnea que reveste o
bordo superior do casco, que se une a banda coronária e se estende na transição do casco para
a pele e em direção palmar/plantar onde encontra o bulbo7. Na camada subcutânea do
perioplo, especialmente nas regiões dorsal e abaxial, se encontra o coxim perióplico e sua
derme forma papilas esparsadamente6.
3
Histologicamente, o casco é composto por três camadas: epiderme, derme e
subcútis. A epiderme pode ser dividida em camadas: a mais interna, em contato direto com a
membrana basal, é denominada estrato basal, local onde as células estão em constante divisão
mitótica; a camada seguinte é denominada estrato espinhoso, onde ocorre intensa produção de
filamentos de queratina (tonofibrilas) que compõe o citoesqueleto, e existe ainda uma terceira
camada chamada estrato granuloso, no qual são evidenciados os grânulos de querato-hialina
no citoplasma e a desintegração do núcleo7 (Figura 2). O tecido córneo é formado por um
processo dinâmico de proliferação, diferenciação (queratinização) e morte celular. As células
novas “empurram” as células mais antigas rumo ao exterior do casco. Nesse deslocamento
ocorrem os processos de diferenciação e morte celular. Durante a diferenciação, as células
epidermais produzem grandes quantidades de queratina. Ao final da diferenciação, as
moléculas de queratina, no interior dessas células, formam pontes dissulfeto entre si,
constituindo um complexo proteico que provê estabilidade mecânica e química ao tecido
córneo7.
FIGURA 2 – Fotomicrografia do córion coronário do estojo córneo de
cascos de bubalinos. Observa-se em (A), o estrato basal
(seta branca). Em (B), estrato espinhoso (seta branca). Em
(C) nota-se o estrato granuloso e em (D), o estrato córneo.
HE.
4
A camada mais externa da epiderme é formada por sucessivas camadas de células
mortas queratinizadas e cemento intercelular, formando o tecido córneo, ou estrato córneo8
(Figura 3). No final da diferenciação, durante o processo de cornificação, as proteínas ligam-
se através de pontes dissulfeto, formando complexos de proteínas estáveis nas células que se
organizam de forma concêntrica formando os túbulos córneos7.
FIGURA 3 – Fotomicrografia da epiderme queratinizada do estojo córneo de cascos de
bubalinos. Observa-se em (A), corte transversal da epiderme queratinizada da
muralha dorsal, evidenciando os túbulos córneos organizados de forma
circunscrita (seta branca). Em (B), pode-se observar em um corte longitudinal
da epiderme queratinizada da sola, os túbulos córneos dispostos paralelamente
uns aos outros (seta branca). HE.
5
3. TÉCNICAS DE AVALIAÇÃO DA MICROESTRUTURA DO CASCO
3.1. Histomorfometria
A avaliação histomorfométrica, é essencial ao analisar estruturas de cascos
saudáveis bem como de cascos acometidas por enfermidades podais, seja em bovinos,
bubalinos ou equinos9-11. Pesquisas sobre a macroestrutura e microestrutura do casco, por
meio de estudos macroscópicos e microscópicos, empregando a morfometria e
histomorfometria têm se apresentado como importantes ferramentas para o entendimento da
dinâmica e da sanidade podal. Contudo, elucidando aspectos como crescimento e qualidade
do estojo córneo em animais manejados em diferentes sistemas de produção. Essas
informações têm auxiliado técnicos e pesquisadores não só no diagnóstico, direcionando a
etiopatogenia do processo mórbido, como também revelando fatores que de forma direta ou
indireta contribuem para maior resistência do casco e, consequentemente, maior
suscetibilidade às enfermidades podais que determinadas raças e espécies apresentam em
relação a outras5,12.
A técnica de histomorfometria, embora conhecida na medicina veterinária, vem se
modernizando com a utilização de softwares mais precisos, que permitem realizar avaliações
mais fidedignas das estruturas anatômicas investigadas. Por meio dessa técnica é possível
obter medidas de diâmetro e espessura das papilas epidermais, distância entre elas e ainda
contar o número de papilas, como demonstrado na (Figura 4). Desse modo, a espessura da
papila é aferida do estrato basal esquerdo ao estrato basal direito. O espaçamento entre as
papilas é mensurado do estrato basal de uma papila ao estrato basal de outra papila 13.
6
FIGURA 4 - Avaliação histomorfométrica do córion laminar dos cascos de
bubalinos. Em (A), observa-se linhas longitudinais referentes à
medida de comprimento das papilas epidérmicas, enquanto a
linha horizontal refere-se a contagem de papilas por área. Em
(B), pode-se observar a medida de espessura das papilas
indicada pela linha amarela e a medida de espaçamento entre as
papilas pela linha azul.
Nesse contexto, alguns estudos realizados com cascos de bovinos, utilizaram a
histomorfometria como método de mensuração e identificação das papilas epidérmicas e dos
túbulos córneos5,13. Para os autores este método de avaliação permitiu verificar que há
diferenças estruturais importantes, tanto no diâmetro como no espaçamento dessas estruturas,
sendo estes fatores passíveis de determinarem diferenças na resistência do casco.
3.2. Microtomografia 2D e 3D
A microtomografia computadorizada (µTC) se assemelha, em princípio, à
tomografia computadorizada médica, e tem sido utilizada na medicina, engenharia de
materiais, geologia e, recentemente, utilizada na medicina veterinária. Essa técnica pode ser
classificada, quanto à fonte de raios-X, em Radiação Síncrotron (SR) e µTC de laboratório
com Micro/Nano foco de raios-X. Portanto, o seu funcionamento ocorre por meio da captação
de dados obtidos em diversos ângulos de visualização de até 360 graus, a partir da atenuação
de raios-X. Desse modo, é possível reconstruir em três dimensões (3D) uma imagem da
amostra a ser analisada14. O tamanho do foco tubo de raios X é o diferencial dessa técnica,
permitindo avaliar amostras que variam de poucos milímetros a centímetros. Este parâmetro
pode variar desde 4 à 1 mm (foco normal) até 100 à 1μm (microfoco), passando pelas
dimensões de 1 à 0,1 mm (minifoco). O pequeno diâmetro do foco do tubo de raios X é um
atributo muito importante do ensaio de Micro-CT15,16.
Diante disso, com a microtomografia tridimensional é possível inspecionar
características básicas como espessura, volume e porosidade (ligações internas do tecido
analisado). Desse modo, Lima et al.15 e Lopes et al.17, descreveram a técnica de
microtomografia empregando-se o microtomógrafo SkyScan 1272® para análise de rochas e
ossos de ratos. Na técnica descrita por esses autores, cada amostra é fixada em um template
7
circular a fim de se obter um alinhamento vertical, evitando deslocamentos durante a
movimentação angular e manutenção no campo visual do detector de radiação (câmera CCD).
As análises 2D e 3D dos parâmetros microestruturais são realizadas nos softwares,
DataViewer, CTvox, CTan e CTvol .
As tecnologias de imagens 3D mais utilizadas na bioengenharia tecidual e na
medicina regenerativa, para a avaliação do reparo tecidual ou substituição de tecidos ou
órgãos, são a ultrassom, microscopia fotoacústica, ressonância magnética, imagens obtidas a
partir de equipamentos ópticos, cintilógrafos, raios-X. Nesse contexto, a µTC tem se mostrado
promissora na engenharia tecidual óssea em seres humanos e animais, na engenharia de
materiais e biomateriais e ainda, vem crescendo a sua utilização na medicina veterinária, com
destaque no estudo da podologia de bovinos, bubalinos e equinos14.
3.3. Teste de Nanodureza
O teste de nanodureza Vickers permite medir a resistência à penetração ou a
resistência à deformação de um material18. Essa técnica tem sido muito utilizada nas
engenharias de materiais, aeronáutica, civil, na odontologia e ainda de forma experimental na
distração da osteogênese em mandíbulas de coelhos19,20. O emprego dessa tecnologia no
estudo básico da podologia é recente. Porém, pesquisas com chifres de bovídeos silvestres
foram desenvolvidas, revelando dados importantes quanto às diferenças de dureza entre as
regiões de crescimento, região média e ápice18. Contudo, podem-se aplicar essas informações
sobre a dureza Vickers e módulo elástico no estudo das diferentes regiões do estojo córneo de
bubalinos e bovinos de produção13 e equinos21-23. Desse modo, associando ainda, essa
característica com a maior resistência das referidas espécies às enfermidades podais .
Os espécimes clínicos destinados a essa avaliação são adicionados em resina
polimérica, resina T208 (Cristal®), monômero de estireno, catalisador MEK TGDM50 e
Dimetilamina em proporções para endurecimento de tempo aproximado de três minutos, a fim
de conferir estabilidade às amostras. Dessa forma, os fragmentos são inseridos em cilindros de
alumínio, de cinco centímetros de diâmetro, sendo a resina depositada sobre a amostra. Após
a secagem da resina, promove-se o desgaste da superfície, utilizando-se de lixas d’água
(Politriz Arotec – Aropol E®), com numeração variando de 80 a 2.500, para a exposição dos
fragmentos de cascos. Em sequencia, utiliza-se o equipamento Mechanical Tester PB1000®
(Nanovea – USA)13.
8
O resultado do teste de nanodureza revela o poder de penetração da ponteira do
nanoindenter na amostra (dureza Vickers - DV) e o retorno do material analisado ao seu
estado normal (módulo elástico - ME). Desse modo, a amostra a ser analisada é submetida a
uma carga de força (Milinewton – mN – unidade de força) por um período de tempo (em
segundos), e em seguida a força em sua carga máxima é retirada (a força e o tempo variam de
acordo com o tipo de material analisado). Portanto, a dureza vickers é calculada a partir da
carga de indentação dividida pela área de contato projetada e o módulo elástico é determinado
a partir do declive da curva de carga máxima e descarga24 (Figura 5).
FIGURA 5 - Representação esquemática do teste de nanodureza. Em (A) observa-se a curva
de carga máxima e descarga. Em (B), pode-se verificar que o F-max representa
a força máxima (carga máxima) aplicada sobre a amostra, o a, a área de contato
projetada e a relação Pd/Re (poder de penetração / recuperação elástica) que
determina o modulo elástico no momento da descarga da força.
Fonte: Figura 5: B – Adaptada de Fischer-Cripp24
3.4. Composição bioquímica destrutiva e não destrutiva
As análises bioquímicas destrutivas com a necessidade de moer as amostras a
serem analisadas são essenciais para detectar a concentração de matéria seca (MS), matéria
mineral (MM), proteína bruta (PB) e estrato etéreo (EE) em forrageiras e grãos que são
utilizados na alimentação animal25. Porém, essas mesmas técnicas vem sendo empregadas
para verificar a composição bioquímica de cascos de diferentes espécies de bovídeos e
equídeos, com o intuito de descrever a microestrutura do estojo córneo e associar essas
9
características a maior resistência às enfermidades podais. Nesse contexto, alguns
pesquisadores tem se voltado para a pesquisa básica a fim de conhecer o comportamento dos
cascos de animais pigmentados e despigmentados. Dessa forma, busca-se desvendar as
características intrínsecas referentes à pigmentação e sua influencia na resistência do casco26.
Para realizar a análise de matéria seca (MS), as amostras são encaminhadas à
estufa a 105oC, a fim de eliminar toda umidade. Em sequencia é realizada a análise de
matéria mineral (MM) em um forno MUFLA - JUNG a 600oC, com o intuito de destruir toda
matéria orgânica das amostras evidenciando apenas a (MM). Em relação à proteína bruta (PB)
a amostra é misturada a uma substância catalizadora e inserida em um bloco digestor, e
sequencialmente submetida a um destilador de nitrogênio que posteriormente é realizada sua
titulação. Para a análise do extrato etéreo (EE), as amostras são envoltas em um envelope de
papel filtro qualitativo e inseridas em um balão volumétrico acoplado a um extrator e a um
condensador (Sistema Soxlet) com lavagem intermitente com solvente de éter de petróleo25.
Quanto à análise não destrutiva, dispensa a necessidade de fragmentar as amostras
a serem avaliadas. Essa análise tem sido muito utilizada para avaliar amostras de solos e
águas contaminadas com metais pesados, rochas27, 28 e, recentemente, na avaliação de cascos
de bubalinos. Portanto, essa técnica é capaz de quantificar os minerais, enxofre (S), cálcio
(Ca), potássio (K), fósforo (P), zinco (Zn) e cobre (Cu), empregando espectroscopia de
florescencia de raios X por dispersão em energia29,30. Para essas análises é utilizado um
espectrômetro de fluorescência de raios-x da marca Shimadzu, modelo EDX-720. Tal
equipamento detecta elementos na faixa do sódio (Na) até o urânio (U), e fornece um espectro
de fluorescência com os picos de energia liberada por cada elemento, os quais são
identificados por um programa específico e depois quantificados, conforme os parâmetros
escolhidos.
10
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CAPÍTULO 2 - Características histológicas e morfométricas do estojo córneo dos 1
cascos de bubalinos 2
Histological and morphometric characteristics of corneal layer of hooves of 3
buffaloes 4
5
RESUMO 6
A baixa ocorrência de enfermidades podais nos bubalinos ainda é motivo de 7
especulação. Esse estudo objetivou avaliar a microestrutura do estojo córneo de 8
bubalinos, empregando a histomorfometria e a microscopia óptica computadorizada. 9
Foram analisadas 56 peças anatômicas, dos membros torácicos e pélvicos, de quatorze 10
fêmeas bubalinas adultas, entre 24 e 60 meses, totalizando 112 dígitos. Os espécimes 11
clínicos foram colhidos no córion coronário (perioplo), córion laminar da muralha 12
dorsal, abaxial e da sola pré-bulbar. Os resultados foram analisados empregando o teste-13
T para comparação de duas médias e ANOVA para três médias em nível de 14
significância de 5%. Concluiu-se que a microestrutura do estojo córneo dos cascos de 15
bubalinos é composta por papilas epidérmicas com tamanho superior de algumas raças 16
de bovinos, sugerindo maior capacidade de produção de queratina, melhor fixação da 17
epiderme ao estojo córneo e maior resistência desses animais as enfermidades podais. 18
Os túbulos córneos da epiderme queratinizada apresentam-se em forma helicoidal e 19
indicam a possibilidade dessa característica ser aplicada aos cascos de outras espécies 20
unguladas. A metodologia empregada e a espécie estudada representam novas 21
perspectivas para o estudo das enfermidades podais nos bovinos, os resultados são 22
inovadores e outras tecnologias avançadas devem ser usadas especialmente para avaliar 23
comparativamente, bubalinos e diferentes raças e categorias de bovinos. 24
Palavras chave: bubalinos, papilas epidérmicas, queratina, queratinócitos, túbulos 25
córneos. 26
ABSTRACT 27
The lower incidence of diseases affecting the keratin hoof of buffaloes as compared to 28
other bovine breeds with dairy aptitude presents fewer, and, deserves, further studies. 29
The research aimed to investigate the microstructure of corneal hoof of adult buffaloes 30
of Jafarabadi Breed, by means of histomorphometric and computerized optical 31
microscopy evaluations. Fifty six (56) anatomical specimens were collected from 32
2
fourteen adult female buffaloes, age between 24 and 60 months. The digits of 28 33
thoracic and of 28 pelvic members were evaluated. In order to preparation, the samples 34
were included following: fourteen (14) of left members and fourteen (14) of right 35
members, thoracic and pelvic, totalizing one hundred and twelve (112) digits. Clinical 36
specimens were collected at three points of the hull, coronary corium, laminar corium of 37
the abaxial wall and pre-bulbar soles of approximately 10 x 3 mm and samples of 38
keratinized epidermis of the dorsal wall, abaxial wall and sole with 10 x 10 mm. The 39
statistical test used to compare the means was the T-test for two means and ANOVA for 40
more group comparisons, both at 5% of significance level. The microstructural 41
knowledge of buffalo hoof generated is important information for understanding this 42
intrinsic resistance of buffaloes to foot diseases. It was concluded that the medium 43
length of the papillae, thickness and spacing in the pelvic and thoracic digit did not 44
show statistically significant differences. However, when comparing the data of 45
coronary corium, laminar corium of wall and soles were observed at regions of corneal 46
case an increase in thickness of the laminar corium papillae of the wall and spacing 47
compared to other regions. However, it could be conjectured such characteristics with 48
greater resistance to such animal foot diseases, although there is a need for further 49
studies. 50
Keywords: buffaloes, epidermal papillae, keratin, keratinocytes, corneal tubules. 51
52
INTRODUÇÃO 53
O estojo córneo dos dígitos dos bovídeos é dividido em muralha, sola, talão, bulbo do 54
talão, linha branca e pinça, de acordo com sua constituição, localização e função 55
(Greenough, 2007). Essa estrutura córnea está apoiada sobre uma epiderme modificada 56
a partir da derme. A junção dessas duas estruturas formam o córion coronário e o córion 57
laminar. As modificações ocorridas na epiderme resultam em papilas epidérmicas co-58
participantes da proliferação dos queratinócitos, os quais sintetizam queratina e cemento 59
intercelular, substancias atreladas a qualidade e integridade das regiões do casco 60
(Bragulla et al., 2004; Greenough, 2007). 61
A queratina tubular são estruturas tubulares originadas a partir da sua compactação e 62
são arquitetadas de forma concêntrica apenas na camada de queratina, não sendo 63
observados na epiderme modificada (Banks, 1991). A quantidade de túbulos conectados 64
3
pelo cemento intercelular interfere diretamente nas propriedades mecânicas do tecido 65
córneo, com ênfase à sua resistência (Mulling e Hagen, 2012), cuja diminuição pode 66
predispor às enfermidades podais. Dentre os fatores de risco que cursam com 67
diminuição da resistência do casco, o manejo inadequado dos animais, presença 68
constante de contaminação e o excesso de umidade são apontados como importantes. 69
Mas, esses fatores podem não ter mesma importância nos bubalinos, pois aparentemente 70
são mais resistentes às enfermidades podias quando comparados aos bovinos (Silva et. 71
al., 2015). Contudo, ainda que as enfermidades podais apresentem menor ocorrência 72
nos bubalinos, existem indagações não esclarecidas sobre o tema, particularmente 73
relacionadas a micoestrutura do casco. Sobre esse quesito ainda é necessário 74
caracterizar seus aspectos microestruturais. 75
O presente estudo objetivou-se descrever a microestrutura do estojo córneo dos cascos 76
de bubalinos, com destaque para os aspectos morfométricos das papilas epidérmicas e 77
túbulos córneos da epiderme queratinizada, por meio da avaliação histomorfométrica e 78
da microscopia óptica computadorizada. 79
80
MATERIAL E MÉTODOS 81
A pesquisa foi desenvolvida na Universidade Federal de Goiás - Regional Jataí – GO, 82
Setor de Cirurgia de Grandes Animais e em Instituições e laboratórios parceiros, como 83
o Laboratório de Engenharia de Materiais do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e 84
Materiais (CNPEM) da Universidade de São Paulo (USP), São Carlos-SP, o Laboratório 85
Nacional de Nanotecnologia (LNNano), Campinas – SP e o Laboratório de Patologia 86
Veterinária Universidade de Brasília (UnB-DF). A pesquisa ocorreu entre os meses de 87
junho de 2014 a agosto de 2015, obedecendo aos preceitos éticos em experimentação 88
animal e aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais, Pró Reitoria de Pesquisa 89
e Inovação da UFG (CEUA-PRPI-UFG), protocolo no20/2014. 90
No estudo empregaram-se 56 estojos córneos dos dígitos de 14 fêmeas bubalinas da 91
raça Jafarabadi, adultas, com idades entre 24 e 60 meses, obtidas em estabelecimentos 92
frigoríficos sob o Serviço de Inspeção Federal, totalizando 28 membros torácicos e 28 93
membros pélvicos e 112 dígitos. Desse total, 56 dígitos foram destinadas às avaliações 94
histológicas e morfométricas e 56 às análises de microscopia óptica computadorizada. 95
Foram colhidos espécimes clínicos do córion coronário (perioplo), córion laminar da 96
4
muralha abaxial e da sola pré-bulbar, de aproximadamente 10mm x 3mm, totalizando 97
três pontos de colheita em cada dígit. As amostras fixadas em solução de formalina 98
neutra e tamponada a 10%, incluídas em parafina e coradas pela hematoxilina-eosina 99
(HE). O processamento das amostras para as avaliações, histológica e morfométrica, 100
seguiu a metodologia descrita por Rabelo et al. (2015). 101
As análises dos cortes histológicos foram realizadas no fotomicroscópio Leica DM 750, 102
com câmera digital embutida ICC50 (HD-521420221). Para as apreciações 103
morfométricas, incluindo comprimento, número e espessura das papilas epidérmicas e 104
seus respectivos espaçamentos, nas regiões do córion coronário, córion laminar da 105
muralha dorsal, muralha abaxial e da sola, as imagens foram capturas e avaliadas 106
empregando software LAS EZ®. Considerou-se para o comprimento das papilas 107
epidérmicas a medida obtida entre a derme e o estrato basal no ápice da papila. A 108
espessura da papila foi aferida do estrato basal esquerdo ao estrato basal direito. O 109
espaçamento entre as papilas foi mensurado do estrato basal de uma papila ao estrato 110
basal de outra papila. 111
O material colhido nas mesmas regiões e destinado as avaliações empregando 112
microscopia óptica computadorizada respeitou-se as dimensões aproximadas de 10mm 113
x 10mm. Durante o processamento das amostras, assegurou-se a retirada de sujidades e 114
tecidos moles, seguido do acondicionamento em embalagens plásticas e congelamento a 115
-15° C. Na sequência, forma enviadas ao Laboratório de Engenharia de Materiais da 116
USP – São Carlos e analisadas segundo a técnica padronizada e empregada na rotina 117
desse laboratório. Primeiramente o material foi descongelado e embutido em resina 118
T208 (Cristal®, monômero de estireno, catalisador MEK TGDM 50 e dimetilamina) em 119
proporções para endurecimento em tempo aproximado de três minutos. Após esse 120
período, as amostras foram lixadas com lixas d’água no 80 a 2.200 para a exposição dos 121
fragmentos de cascos com a utilização de uma Politriz Arotec – Aropol E®, sendo ao 122
final, analisadas em microscópio óptico (Zeiss AxioPlan 2ie motorizado e 123
computadorizado, com câmera digital embutida Axiocam HR – 3900 x 3090 pixels). As 124
imagens foram analisadas por meio da utilização do Software KS400 da Zeiss. 125
Os resultados obtidos foram tratados a partir do Software SigmaPlot 12.0®. Utilizou-se 126
o teste-T para comparação de duas médias e ANOVA para três médias, considerando-se 127
um nível de significância de 5% 128
5
RESULTADOS E DISCUSSÃO 129
As análises histomorfométricas revelaram que o estojo córneo dos bubalinos apresenta 130
características histológicas similares as da espécie bovina, Holandesa e Nelore, 131
concordando com as descrições de Rabelo et al. (2015) e Silva et al. (2015) com o 132
tecido epidermal distribuído em estratos basal, espinhoso e granuloso. A estratificação 133
da epiderme modificada no estojo córneo dos bubalinos equivale as descrições de 134
Bragulla et al. (2004) e Greenough (2007) em bovinos. Nos animais analisados, a maior 135
estratificação e número de papilas foram observadas no córion coronário, 136
comparativamente, as regiões, do córion laminar, muralha abaxial e da sola (Fig. 1 , A, 137
B e C). A semelhança de relatos de outros estudos científicos (Mendonça et al., 2003; 138
Rabelo et al., 2015), as avaliações aqui realizadas indicaram que a camada basal é 139
responsável pela renovação dos queratinócitos, está em constante mitose, origina o 140
estrato espinhoso, estrato granuloso e o estrato córneo (Fig. 1, D, E e F). Pela magnitude 141
desse mecanismo fisiológico na espécie bubalina, em pare, pode-se inferir a ele uma 142
importância fundamental na manutenção da integridade e qualidade do estojo córneo 143
(Bragulla et al., 2004; Tombolato et al., 2010), proporcionando maior resistência do 144
casco dessa espécie animal. 145
146
147
148
6
149
Figura 1. Fotomicrografia da epiderme do estojo córneo do casco de bubalinos. 150
Observa-se em (A), papilas epidérmicas do córion coronário (perioplo). Em (B), papilas 151
da muralha abaxial. Em (C), observa-se as papilas da sola. Em (D), o estrato basal do 152
córion laminar da muralha abaxial evidenciando intensa divisão mitótica dos 153
queratinócitos na ponta da seta vermelha. Em (E), verifica-se o estrato basal (asterisco 154
amarelo), estrato espinhoso (seta vermelha) e em (F), observa-se o estrato granuloso 155
(seta vermelha) e estrato córneo (asterisco amarelo), HE. 156
No interior dos queratinócitos evidenciou-se uma quantidade expressiva de 157
melanossomas, ricos em melanina (Fig. 2, A e B), distribuídos nos estratos epidermais 158
do casco. Macroscopicamente, estes achados histológicos são traduzidos por intensa 159
pigmentação dos cascos dos búfalos, permitindo-se especular que tal pigmentação 160
também atue na resistência do casco nesses animais. Como a correlação entre a 161
pigmentação e a resistência do casco de bubalinos ainda não foi alvo de investigação 162
científica (Marques, 2000), o assunto requer esforços de estudiosos da área para elucidar 163
os fatores que cercam essa característica. Mas, paralelamente, observou-se maior 164
quantidade da melanina na base da papila epidermal, em comparação as quantidades do 165
referido pigmento no corpo e no ápice da mesma estrutura. Evidenciou-se ainda que, 166
7
este pigmento envolve o núcleo celular e se organiza em forma de “guarda-chuva”, 167
sempre em direção contrária à superfície do estojo córneo (Fig. 2, C e D). 168
É possível, que esta disposição da melanina possa proteger a molécula de DNA das 169
ações da radiação ultravioleta (UV), contribuindo, em parte, para aumentar a resistência 170
do tecido córneo dos cascos em bubalinos. Estudos revelam que as radiações 171
ultravioletas UV- B, juntamente com a UV-C, podem comprometer a epiderme e 172
estruturas derivadas, induzindo a produção de radicais livres pela peroxidação de 173
lipídeos, lesando indiretamente o DNA. Este mecanismo pode determinar a morte 174
celular e apresentar efeito carcinogênico (Sgarbi et al., 2007; Charles et al., 2011; Silva 175
et al., 2001). Portanto, extrapolando esses resultados para a espécie bovina, os mesmos 176
argumentos podem ser empregados para justificar a maior fragilidade verificada em 177
cascos despigmentados quando comparados aos cascos pigmentados (Rabelo et al., 178
2015). Mas ao contrário desse estudo, esses autores após analisar o tamanho, espessura 179
e espaçamento entre as papilas epidérmicas, não apontaram a disposição do pigmento de 180
melanina em forma de “guarda-chuva”, como possível fator de proteção ao DNA do 181
casco frente às radiações ultravioletas. 182
183
184
8
Figura 2. Fotomicrografia da epiderme do córion coronário do estojo córneo do 185
casco de bubalinos. Em (A) pode-se observar que maior quantidade de melanina 186
nos queratinócitos próximos à base da papila epidérmica e menor quantidade em 187
direção ao ápice. Em (1) nota-se o estrato basal, em (2) o estrato espinhoso e em 188
(3) estrato granuloso. Em (B) apresenta-se a epiderme queratinizada (asterisco 189
amarelo). Nota-se no (circulo branco) inúmeros melanossomas (pontos escuros) 190
espalhados no tecido queratinizado. Em (C), na base da papila epidérmica do 191
córion coronário, evidencia-se intensa produção de melanina e sua liberação para 192
os queratinócitos, por meio dos melanossomas (seta vermelha). Em (D), observa-se 193
que os melanossomas, ricos em melanina e organizados em formato de guarda-194
chuva ao redor do núcleo da célula. HE. 195
196
A análise histológica do epitélio do córion laminar apresentou os queratinócitos do 197
estrato córneo repletos de queratina (primeiro produto da queratinização) organizada de 198
forma concêntrica para formar os túbulos córneos. A queratina intratubular apresenta-se 199
na forma helicoidal e os queratinócitos sem núcleo celular (Fig. 3, A, B e C). A forma 200
helicoidal da queratina intratubular, semelhante à estrutura da alfa-queratina, principal 201
proteína constituinte da epiderme queratinizada também foi descrita por McKittrick et 202
al. (2012). O cemento intercelular, segundo produto da queratinização, que adere os 203
queratinócitos e auxilia na impermeabilização do estojo córneo, evidenciado no presente 204
estudo não foi relatado em outras pesquisas realizadas com bubalinos (Silva et al. 205
2015), mas foi descrito na espécie equina (Hendry et al.,1999; Mulling e Budras, 206
2011). (Fig. 4). Observou-se também, intensa formação de rede vascular dérmica ao 207
redor das papilas epidérmicas, além de vasos centrais papilares (Fig.3, D e E ). 208
209
9
210
Figura 3. Fotomicrografia da epiderme do estojo córneo dos dígitos de bubalinos. 211
Observa-se em (A), os queratinócitos anucleados do estrato córneo da sola pré-bulbar, 212
repletos de queratina, organizados de forma concêntrica e formando os túbulos córneos 213
(setas brancas). Em (B) nota-se que a estrutura da queratina intratubular assume uma 214
forma helicoidal (setas amarelas). Em (C) verifica-se a queratina extratubular, composta 215
por queratinócitos anucleados firmemente aderidos pelo cemento (seta amarela) e no 216
circulo branco observa-se a grânulos citoplasmáticos de melanina. Em (D), o corpo de 217
uma papila epidérmica do córion laminar da muralha abaxial, em um corte longitudinal 218
evidenciando um vaso aferente (seta amarela) e um vaso eferente (seta preta). Em (E), 219
evidencia capilares no interior da papila epidérmica (setas amarelas). HE. 220
221
A microscopia óptica computadorizada indicou que os túbulos córneos da muralha 222
dorsal e muralha abaxial do estojo córneo dos dígitos dos bubalinos iniciam-se no 223
córion coronário e se projetam acompanhando a mesma direção do crescimento do 224
casco, do sentido proximal para distal até a linha branca. Essa característica também foi 225
evidenciada na sola, porém, o desenvolvimento dos túbulos córneos nessa região teve 226
inicio no córion laminar (Fig. 4, A e B). O mesmo método de avaliação evidenciou 227
10
túbulos córneos em formato helicoidal (Fig.4, C e D), concordando com as descrições 228
de McKittrick et al. (2012). 229
230
231
Figura 4. Fotomicrografia da epiderme queratinizada do estojo córneo de 232
bubalinos. Pode-se observar em (A), a vista frontal de um fragmento da muralha 233
abaxial do estojo córneo. Nota-se que os túbulos córneos estão dispostos 234
paralelamente uns aos outros, e acompanham a direção do crescimento do casco, 235
no sentido proximal para distal (seta vermelha). Em (B), observa-se um corte 236
transversal do fragmento evidenciando os túbulos córneos em forma circular 237
(circulo vermelho). Em (C) pode-se observar a vista lateral de um fragmento da 238
sola do estojo córneo com os túbulos córneos dispostos paralelamente uns aos 239
outros e acompanhando a direção do crescimento do casco (seta vermelha). 240
Observa-se que os túbulos córneos possuem uma forma helicoidal (seta preta). 241
Em (D), apresenta-se a vista frontal de um fragmento da sola do estojo córneo 242
com os túbulos córneos em forma circular (circulo vermelho). 243
244
11
O comprimento médio das papilas epidérmicas dos cascos dos bubalinos aferido pela 245
histomorfometria revelou uma média de 1.721,590 µm. Ao comparar as médias dos 246
dígitos dos membros torácicos e pélvicos, observou valores de 1.657,079 µm e 247
1.797,088 µm, respectivamente. Quando se comparou as médias dos dígitos laterais dos 248
membros, pélvicos e torácicos, verificou-se os valores de 1.617,023 µm e 1.660,156 249
µm, respectivamente. Em relação às médias dos dígitos mediais dos membros pélvicos e 250
torácicos obteve-se 1.707,149 µm e 1.890,727 µm, respectivamente. Ao comparar as 251
médias do perioplo, muralha abaxial e sola dos dígitos dos membros torácicos e 252
pélvicos, verificou os valores de 1.800,717 µm, 1.832,997 µm e 1.522,238 µm, 253
respectivamente (Tab. 1). Não foram observadas diferenças significativas em nenhuma 254
das comparações (p>0,05), mas apresentaram valores superiores em relação às papilas 255
epidérmicas do casco de bovinos das raças, Holandesa e Gir (Rabelo et al., 2015). 256
Quanto à espessura das papilas epidérmicas, notou-se uma média de 62,94 µm, 257
sendo59,027 para os membros torácicos e 64,265 µm para os membros pévicos . Em 258
relação às médias dos dígitos laterais dos membros torácicos e pélvicos evidenciaram-se 259
os valores de 66,666 µm e 58,469 µm, respectivamente. Quando se comparou as médias 260
dos dígitos mediais dos membros pélvicos e torácicos obteve-se 62,807 µm e 62,926 261
µm, respectivamente (Tab. 1). Não foram observadas diferenças significativas (p>0,05). 262
Dados semelhantes foram descritos por Mendonça et al. (2003), embora os autores 263
tenham denominado as papilas epidérmicas como túbulos córneos. 264
Os valores médios da espessura das papilas localizadas no perioplo, muralha abaxial e 265
sola dos dígitos dos membros torácicos e pélvicos foram de 95,667 µm, 112,367 µm e 266
89,401 µm, respectivamente (Tab. 1). Nessa avaliação as papilas da sola apresentaram-267
se menos espessas, havendo diferença significativa entre as médias obtidas para a 268
muralha abaxial e sola (p<0,05). Estudos prévios em bovinos apontaram que papilas 269
mais espessas, em tese, apresentariam uma maior capacidade de produzir queratina 270
(Rabelo et al., 2015). Quanto ao número de papilas epidérmicas por área, o presente 271
estudo revelou que o córion coronário apresenta a maior quantidade, justificando o fato 272
de essa região apresentar-se como a base do crescimento do estojo córneo em relação à 273
sola e muralha abaxial. Observou-se os valores de 16 papilas/2000µm para o córion 274
coronário, 13 papilas/2000µm para o córion laminar da muralha e 13 papilas/2000µm 275
para sola (Tab. 2), notando-se diferença estatística entre essas regiões (p<0,5). Esse 276
12
achado pode ser justificado, em parte, devido ao córion laminar da muralha e da sola 277
não serem regiões responsáveis pelo crescimento do casco, mas pela absorção de 278
impacto. É possível que essa particularidade da sola justifique ainda o fato de as papilas 279
epidérmicas apresentarem-se menos espessas e menos numerosas nessa região. 280
Ao comparar o espaçamento entre as papilas epidérmicas das regiões do córion 281
coronário e córion laminar das régios do estojo córneo analisadas nesse estudo, notou-se 282
uma média de 49,02 µm. Quando se comparou as médias dos dígitos dos membros 283
torácicos e pélvicos, observou-se valores de 52,585 µm e 45,240 µm, respectivamente. 284
As médias do espaçamento entre as papilas dos dígitos laterais dos membros torácicos e 285
pélvicos foram de 57,501 µm e 41,922 µm, respectivamente. Também verificou-se que 286
os valores das medias encontrados nos dígitos mediais dos membros torácicos e 287
pélvicos foram de 50,639 µm e 51,316 µm, respectivamente (Tab. 1). Não foram 288
observadas diferenças significativas (p>0,05). 289
Ao comparar as médias do perioplo, muralha abaxial e sola dos dígitos dos membros 290
torácicos e pélvicos, verificou os valores de 56,084 µm, 76,999 µm e 55,972 µm, 291
respectivamente (Tab. 1). Houve diferença significativa (p<0,05), evidenciando valor 292
superior no espaçamento entre papilas da muralha em relação ao córion coronário e 293
sola. O espaçamento das papilas dos cascos dos bubalinos apresentou valores superiores 294
em relação às papilas dos bovinos das raças, Holandesa e Gir, (Rabelo et al., 2015), 295
embora a metodologia empregada por esse autores para aferir essa medida não tenha 296
sido elucidativa. 297
298
299
300
301
302
303
304
305
306
13
Tabela 1. Média (µm) e desvio-padrão do comprimento, espessura e espaçamento entre 307
as papilas epidérmicas do córion coronário, muralha dorsal, muralha abaxial e sola do 308
cascos dos membros pélvicos e torácicos de bubalinos. 309
Díg/Reg. Comp. Papilas Espess. corp. Papilas Espaç. Papilas
MT 1.657,079 + 412,673 a 59,027 +13,056 a 52,585 + 14,039 a
MP 1.797,088 + 457,692 a 64,265 + 11,467 a 45,240 + 12,564 a
MT-DL 1.617,023 + 461,861 a 66,666 + 21,114 a 57,501 + 12,353 a
MP-DL 1.660,156 + 373,336 a 58,469 + 12,387 a 41,922 + 13,564 a
MT-DM 1.707,149 + 355,119 a 62,807 + 11,922 a 50,639 + 13,967 a
MP-DM 1.890,727 + 528,611 a 62,926 + 16,104 a 51,316 + 14,318 a
CCOR 1.800,717 ± 264,216 a 95,667 ± 17,451 ab 56,084 ± 9,821 a
MAB 1.832,997 ± 562,411 a 112,367 ± 21,817 b 76,999 ± 14,910 b
SOL 1.522,238 ± 379,704 a 89,401 ± 27,496 a 55,972 ± 13,056 a
MÉDIA 1.721,59 62,94 49,02
Médias seguidas de letras iguais, na mesma coluna e mesma variável, não diferem entre 310
si (p>0,05). Díg/Reg. – Dígitos e Regiões; Comp. – comprimento; Espess. – espessura; 311
Espaç. – espaçamento; CCOR – córion coronário; MT – membro torácico; MP – 312
membro pélvico; MT-DL – membro torácico dígito lateral; MP-DL – membro pélvico 313
dígito lateral; MT-DM – membro torácico dígito medial; MP-DM – membro pélvico 314
dígito medial. 315
316
Tabela 2. Média (µm) e desvio-padrão do número de papilas/mm, do córion coronário e 317
córion laminar do casco de bubalinos. 318
Regiões do estojo córneo Número de papilas/2000µm
Córion coronário 16 ± 0.121 b
Muralha abaxial 13 ± 0,143 a
Sola 13 ± 0,115 a
MÉDIA 14
Médias seguidas de letras iguais, na mesma coluna, não diferem entre si (p>0,05). 319
Por último, ainda que as médias de comprimento, espessura e espaçamento das papilas 320
epidérmicas dos dígitos dos membros pélvicos e torácicos de bubalinos não 321
apresentaram diferenças estatísticas significativas entre si, os valores obtidos foram 322
14
superiores em relação às papilas dos bovinos das raças, Holandesa e Gir (Rabelo et al., 323
2015). Portanto, é possível especular que essas estruturas anatômicas, na espécie 324
bubalina, possuem maior capacidade de produção de queratina, além de promover 325
melhor fixação da epiderme ao estojo córneo. 326
327
CONCLUSÕES 328
A microestrutura do estojo córneo dos cascos de bubalinos avaliada pela 329
histomorfometria e microscopia óptica computadorizada é composta por papilas 330
epidérmicas com tamanho superior de algumas raças de bovinos, sugerindo maior 331
capacidade de produção de queratina, melhor fixação da epiderme ao estojo córneo e 332
maior resistência desses animais as enfermidades podais. Os túbulos córneos da 333
epiderme queratinizada apresentam-se em forma helicoidal e indicam a possibilidade 334
dessa característica ser aplicada aos cascos de outras espécies unguladas. A metodologia 335
empregada e a espécie estudada representam novas perspectivas para o estudo das 336
enfermidades podais nos bovinos, os resultados são inovadores e outras tecnologias 337
avançadas devem ser usadas especialmente para avaliar comparativamente, bubalinos e 338
diferentes raças e categorias de bovinos. 339
AGRADECIMENTOS 340
CNPq: Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (Processo: 449753/2014-0). 341
Fapeg: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Goiás (Processo: 342
20122012267001141). 343
344
REFERENCIAS 345
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1
CAPITULO 3 - Microtomografia bidimensional, tridimensional e teste de 1
nanodureza Vickers do estojo córneo de bubalinos 2
3
Bidimensional, tridimensional microtomography and nanohardness vickers of hoof 4
capsule of buffaloes 5
6
RESUMO 7
Exames de microtomografia bidimensional, microtomografia tridimensional e teste de 8
nanodureza Vickers são ferramentas importantes na avaliação da microestrutura do 9
estojo córneo dos dígitos dos animais. O presente estudo objetivou descrever a 10
microestrutura do estojo córneo, com destaque para os aspectos morfométricos dos 11
túbulos córneos e a nanodureza Vickers da muralha dorsal, muralha abaxial e sola dos 12
dígitos dos membros torácicos e pélvicos de bubalinos da raça Jafarabadi. Nas análises 13
foram empregados os exames de microtomografia bidimensional, microtomografia 14
tridimensional e nanodureza. Os dígitos mediais dos membros torácicos e os dígitos 15
laterais dos membros pélvicos apresentaram maior quantidade de túbulos córneos com 16
diâmetros maiores. A muralha abaxial dos dígitos dos membros torácicos exibiu valores 17
superiores aos dígitos dos membros pélvicos. A análise de microtomografia 3D indicou 18
que a muralha dorsal apresenta maior densidade quando comparada com a muralha 19
abaxial. Esta apresentou densidade intermediária e a sola foi a estrutura de menor 20
densidade entre as regiões avaliadas. A diferença de densidade está diretamente 21
relacionada aos diversos graus de dureza e resistência, mas o exame de nanodureza não 22
revelou diferenças entre as regiões do casco estudas. Concluiu-se que microtomografia 23
bidimensional e tridimensional demonstram a organização estrutural, diferença de 24
densidade e dureza das diferentes regiões do casco, detalhar a disposição, a angulação, o 25
diâmetro dos túbulos córneos e a quantificação do número de túbulos por mm2 e os 26
testes de nanodureza de Vickers permitem mensurar a dureza de diferentes estruturas do 27
estojo córneo dos dígitos de bubalinos. 28
Palavras-chave: dureza do casco, parede do casco, queratina, sola do casco, túbulos 29
córneos. 30
31
32
2
ABSTRACT 33
The present study was developed with the objective to describe the microstructure of 34
corneal case of buffaloes, highlighting the morphometric aspects of horn tubules and 35
Vickers nanohardness the dorsal wall, abaxial wall and sole of the digits of fore and 36
hindlimbs of buffalo animals, adults , the Jafarabadi race, through the analysis of two-37
dimensional microtomography, tridimensional microtomography and nanohardness, 38
considering the regions of the dorsal wall of the abaxial wall and sole of the digit fore 39
and hindlimbs. The results of this research have shown that the medial digit forelimbs 40
and hindlimbs side-digit exhibit increased horn tubules with larger diameters. But the 41
abaxial wall of digit forelimbs showed higher values than digit hindlimbs. Although it 42
was not significant difference between the digits studied, this study could clarify also 43
important aspects of the nanohardness the different regions of the corneal case the digits 44
of buffalo. In contrast, the 3D microtomography analysis revealed that the dorsal wall 45
presents a greater hardness compared to the abaxial wall of intermediate hardness, and 46
with the sole of the hoof, that showed the lowest hardness among the evaluated areas. 47
Thus, one could also infer that the tridimensional microtomography test is more specific 48
than the Vickers nanohardness test for the considered structure. However, such a claim 49
requires further research. 50
Keywords: hardness of the hoof, hoof wall, hoof sole, horn tubules, keratin. 51
52
INTRODUÇÃO 53
Devido a baixa ocorrência de doenças podais nos bubalinos, avaliar a microestrutura do 54
estojo córneo dos dígitos dessa espécie animal, pode representar um avanço nas 55
pesquisas envolvendo a podologia bovina. O estojo córneo dos dígitos é constituído por 56
tecido epidérmico queratinizado e dividido em muralha, talão, sola, bulbo do talão, 57
linha branca e pinça (Greenough, 2007). A epiderme do estojo córneo é responsável 58
pela proliferação dos queratinócitos, síntese de queratina, cemento intercelular e 59
manutenção da qualidade e da integridade das regiões do casco (Bragulla et al., 2004). 60
A compactação de forma concêntrica da queratina tubular forma estruturas tubulares, 61
exceto na epiderme modificada (Banks, 1991). A quantidade de túbulos conectados pelo 62
cemento intercelular interfere diretamente na resistência e à dureza desta estrutura 63
3
anatômica (Mulling e Hagen, 2012), mas os estudos científicos que abordam esta 64
temática ainda são escassos. 65
Exames de microtomografia bidimensional, microtomografia tridimensional e teste de 66
nanodureza Vickers são ferramentas importantes nos setores de geologia, engenharia 67
mecânica e civil, aeronáutica, odontologia e ortopedia. Envolvem tecnologia de ponta e 68
ensaios com alta especificidade, mas não se tem informações no estudo da 69
microestrutura do casco, dureza e resistência do estojo córneo de bubalinos e outros 70
bovídeos. A microtomografia bidimensional permite avaliar a microestrutura e através 71
de diferenças de atenuação de raios-X, pode-se ter uma estimativa da diferença de 72
densidade no material. Assim é possível diferenciar a dureza do material analisado, com 73
base em uma escala colorimétrica efetuada com o auxílio do software DataViewer®. O 74
exame permite detalhar o comportamento dos materiais e até mesmo quantificar 75
determinados componentes de sua estrutura, em pregando os softwares CTvox®, CTan® 76
e CTvol® (Bruker). O teste de nanodureza Vickers mede a resistência à penetração ou a 77
resistência à deformação de um material em tempo real. Os valores da força aplicada e 78
da profundidade de penetração gera uma curva característica contendo informações 79
sobre as propriedades elásticas e plásticas do material ensaiado que indicam a dureza 80
Vickers e módulo elástico. 81
O presente estudo objetivou descrever a microestrutura do estojo córneo, com destaque 82
para os aspectos morfométricos dos túbulos córneos e a nanodureza Vickers da muralha 83
dorsal, muralha abaxial e sola dos dígitos dos membros torácicos e pélvicos de 84
bubalinos. 85
MATERIAL E MÉTODOS 86
A pesquisa foi desenvolvida no Setor de Cirurgia de Grandes Animais da Universidade 87
Federal de Goiás - Regional Jataí – GO, em parceria com o Laboratório de 88
Transformação de Fases do Departamento de Engenharia de Materiais da Universidade 89
de São Paulo (USP) – São Carlos - SP e do Laboratório Nacional de Nanotecnologia 90
(LNNano) do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM) – 91
Campinas – SP. O estudo foi realizado após aprovação do projeto pela Comissão de 92
Ética no Uso de Animais, Pró Reitoria de Pesquisa e Inovação da UFG (CEUA-PRPI-93
UFG), protocolo no20/2014, entre os meses de junho de 2014 a agosto de 2015. 94
4
Foram colhidos 56 estojos córneos distribuídos de forma igualitária entre, membros 95
torácicos e pélvicos, de sete fêmeas bubalinas adultas, raça Jafarabadi, idade entre 24 e 96
60 meses, correspondendo a 56 dígitos que foram identificados em laterais ou mediais. 97
Colheram-se amostras em duplicata, do tecido queratinizado do estojo córneo da 98
muralha dorsal, muralha abaxial e sola pré-bulbar, na região do terço medial dos dígitos 99
mediais dos membros torácicos e laterais dos membros pélvicos. A dimensão dos 100
fragmentos foi de 10 mm x 10 mm. A escolha fundamentou-se no fato de esses dígitos 101
receberem maior sobrecarga de peso e apresentarem maior incidência de lesões e 102
enfermidades podais (Tomlinson et al., 2004). Para as avaliações de microtomografia 103
bidimensional, microtomografia tridimensional e nanodureza Vickers omaterial foi 104
preparado assegurando-se a retirada de tecido mole e de sujidades e acondicionado em 105
embalagens plásticas, identificados e congelados a -15° C. 106
As avaliações das microtomografias bidimensional e tridimensional foram efetuadas no 107
LNNano/CNPEM, empregando microtomógrafo SkyScan 1272®, source voltage 108
(kv)= 25, source current (ua) = 180, number of rows= 820, number of columns= 1224, 109
scaled image pixel size (um) = 17, filter = al 0.25mm ( Lima et al.,2009; Lopes et al., 110
2012). Para as avaliações em 2D, foi utilizado e o software DataViewer® e para as 111
avaliações em 3D os softwares CTvox®, CTan® e CTvol® (Bruker). As avaliações das 112
amostras em 2D, foram realizadas por meio da interpretação da escala colorimétrica 113
produzida pelos mesmos softwares. A escala variava de marrom escuro ao verde claro, 114
de acordo com as regiões que apresentavam menor e maior dureza, respectivamente. 115
O teste de nanodureza Vickers foi realizado segundo metodologia preconizada pelo 116
Laboratório de Transformação de Fases, do Departamento de Engenharia de Materiais – 117
Escola de Engenharia de São Carlos, USP – São Carlos, SP. Os espécimes clínicos 118
destinados a essa avaliação foram adicionados em resina polimérica, resina T208 119
(Cristal®), monômero de estireno, catalisador MEK TGDM50 e Dimetilamina em 120
proporções para endurecimento em cerca de três minutos, a fim de conferir estabilidade 121
às amostras. Primeiramente os fragmentos foram inseridos em cilindros de alumínio, de 122
cinco centímetros de diâmetro para em seguida depositar a resina sobre a amostra. Após 123
a secagem do material, promoveu-se o desgaste da superfície, utilizando-se de lixas 124
d’água (Politriz Arotec – Aropol E®), com numeração variando de 80 a 2.500 até expor 125
os fragmentos dos cascos envolvidos na resina. Ao final, o cilindro era removido e as 126
5
amostras, devidamente preparadas eram analisadas no equipamento Mechanical Tester 127
PB1000® (Nanovea – USA), segjundo Fischer-Cripps (2011). 128
Os resultados foram analisados empregando-se o Software Sigma Plot 12.0®. O teste 129
estatístico utilizado para comparação entre as médias foi o teste-T para duas médias e 130
ANOVA para três médias, em nível de significância de 5% (Sampaio, 2010). 131
132
RESULTADOS 133
Por meio da análise de microtomografia bidimensional e tridimensional observaram-se 134
aspectos importantes da organização estrutural do tecido córneo que compõe a epiderme 135
queratinizada dos bubalinos. As distintas regiões do estojo córneo dessa espécie animal 136
foram evidenciadas pelos raios-X, sugerindo diferenças na densidade, resistência e 137
dureza da epiderme queratinizada (Fig. 1). 138
139
Figura 1. Organização estrutural do tecido córneo que compõe a epiderme queratinizada 140
do casco de bubalinos. Em (A), microtomográfica bidimensional da muralha dorsal do 141
estojo córneo. Em (B), a reconstrução tridimensional da muralha dorsal do estojo 142
córneo e escala colorimétrica que permite avaliar as diferenças na densidade pela 143
atenuação de raios-x. 144
145
A avaliação microtomográfica bidimensional indicou que a região da muralha dorsal 146
apresentou maior predominância das cores azul, rosa e verde claro, sugerindo maior 147
densidade. Na sequência, a muralha abaxial apresentou predominância das cores azul, 148
rosa e amarela, indicando densidade intermediária. N sola, notou-se uma predominância 149
6
das cores amarela, rosa e marrom, apontando como a região anatômica de menor 150
densidade (Fig. 2). 151
152
153
Figura 2. Imagem microtomográfica bidimensional do estojo córneo de bubalinos. Em 154
(A), observa-se a muralha dorsal do estojo córneo. Nota-se predominância das cores 155
azul, rosa e verde claro, representando região com maior densidade. Em (B), observa-se 156
a muralha abaxial do estojo córneo com predominância das cores azul, rosa e amarela, 157
representando uma região com densidade intermediária. Em (C), a sola apresenta 158
predominância das cores amarela, rosa e marrom, indicando região com menor 159
densidade. O asterisco (*) branco representa a escala colorimétrica. 160
161
A queratina intratubular e extratubular dos túbulos córneos se apresentou de forma 162
concêntrica, sendo a primeira com menor densidade em relação à segunda. (Fig. 3). Na 163
muralha dorsal e muralha abaxial a queratina intratubular foi identificada com coloração 164
rosa e a extratubular de cor azul e verde claro. A sola do casco apresentou queratina 165
intratubular de cor azul e queratina extratubular de cor rosa. Nesse caso, verificou-se 166
que as queratinas intratubular e extratubular apresentaram densidade inversamente 167
proporcional a dureza das muralhas abaxial e dorsal. 168
169
7
170
Figura 3. Microtomografia bidimensional do estojo córneo de bubalinos. Em (A e B), 171
observa-se a muralha dorsal e a muralha abaxial do estojo córneo, respectivamente, 172
evidenciando a queratina intratubular de cor rosa (círculo branco) e a queratina 173
extratubular de cor azul e verde claro (seta vermelha), indicando menor densidade da 174
queratina intratubular em relação à queratina extratubular. Em (C), na região da sola do 175
casco a queratina intratubular apresenta cor azul (círculo branco) e a queratina 176
extratubular cor rosa (seta vermelha), indicando maior densidade da queratina 177
intratubular em relação à queratina extratubular. O asterisco (*) branco representa a 178
escala colorimétrica. 179
180
Por meio da microtomografia tridimensional, pode-se confirmar que não há presença de 181
poros no estojo córneo, sendo esta estrutura anatômica formada exclusivamente por 182
túbulos córneos. Verificou-se ainda que os túbulos córneos apresentam-se dispostos 183
paralelamente uns aos outros, se organizando de forma concêntrica helicoidal em todas 184
as regiões do estojo córneo dos dígitos de bubalinos (Fig. 4), característica que pode 185
intensificar a dureza do estojo córneo nessa espécie animal. 186
187
8
188
Figura 4. Microtomografia tridimensional (modelo-3D obtido no CTvol) do estojo 189
córneo dos dígitos de bubalinos. Em (A) observa-se a queratina intratubular da região da 190
muralha dorsal. Em (B) observa-se os túbulos córneos organizados de forma concêntrica 191
helicoidal, conforme evidenciado pelas setas vermelhas. 192
193
A avaliação microtomográfica tridimensional também permitiu verificar que, em cada 194
região do casco de bubalinos, os túbulos córneos assumem angulações diferentes em 195
relação ao córion coronário (Fig. 5). Na muralha dorsal apresentam um ângulo de 90o e 196
na muralha abaxial nota-se angulação de 65o. Quanto aos túbulos córneos da sola 197
verificou-se que essa angulação foi de aproximadamente, 70o em relação ao córion 198
laminar. 199
200
201
9
Figura 5. Imagens microtomográficas do estojo córneo dos dígitos de bubalinos 202
indicando angulação dos túbulos córneos. Em (A), 90o (seta vermelha) e em (B), uma 203
angulação de 65o (seta vermelha), ambos em relação ao córion coronário. Em (C), 204
apresentam uma angulação de 70o (seta vermelha) em relação ao córion laminar. 205
206
Por meio da microtomografia tridimensional foi possível mensurar o diâmetro dos 207
túbulos córneos e seus respectivos percentuais em cada região do estojo córneo e 208
quantificar o número exato dessas estruturas nas diferentes regiões do casco. Também 209
foi possível comparar o diâmetro e a quantidade de túbulos córneos presentes na 210
muralha dorsal, muralha abaxial e sola do casco, tanto nos dígitos mediais quanto nos 211
laterais dos membros torácicos e pélvicos (Tab. 1). 212
213 Tabela 1. Diâmetro, percentual e número total de túbulos córneos dos dígitos de 214
bubalinos analisados por meio de microtomografia tridimensional. 215
DÍG/RC/LA
DIÂMETRO
PERCENTUAL DE TÚBULOS CÓRNEOS (%)
N°TB/mm2 (17 µm) (51 µm) (85 µm) (119 µm) (153 µm)
MT-medial 37,23±9,46a 49,16±2,16a 10,85±7,17a 2,56±0,97b 0,03±0,01a 30,03±3,51a
MP-lateral 43,25±2,48a 50,34±0,66a 6,06±0,43a 0,35±0,34a 0,00±0,00a 28,72±1,83a
MT-MD 42,36±0,95a 49,63±1,23a 7,58±2,69a 0,42±0,026a 0,00±0,00a 25,80±2,48a
MT-MAB 26,31±1,67b 46,84±1,56a 19,07±3,25b 7,14±1,45b 0,10±0,00a 36,72±5,75a
MT-SOL 43,01±1,41a 50,99±1,80a 5,88±2,12a 0,11±0,01a 0,00±0,00a 27,98±2,55a
MP-MD 45,84±2,34a 49,67±1,65a 4,29±1,23ab 0,12±0,002a 0,00±0,00a 27,35±2,36a
MP-MAB 40,89±0,85a 50,35±2,97a 8,07±2,45b 0,74±0,03a 0,00±0,00a 30,80±2,45a
MP-SOL 46,51±2,66a 50,72±1,76a 2,76±0,06 a 0,00±0,00a 0,00±0,00a 30,14±2,67a
MT-MAB 26,31±1,67a 46,84±1,89a 19,07±3,25b 7,14±1,45b 0,10±0,01a 36,72±5,75a
MP-MAB 40,89±0,85b 50,35±2,97a 8,07±2,45a 0,74±0,03a 0,00±0,00a 30,80±2,45a
MT-MD 42,36±0,95a 49,63±1,23a 7,58±2,69a 0,42±0,026a 0,00±0,00a 25,80±2,48a
MP-MD 45,84±2,34a 49,67±1,65a 4,29±1,23a 0,12±0,002a 0,00±0,00a 27,35±2,36a
MT-SOL 43,01±1,41a 50,99±1,80a 5,88±2,12a 0,11±0,001a 0,00±0,00a 27,98±2,55a
MP-SOL 46,51±2,66a 50,72±1,76a 2,76±0,06a 0,00±0,00a 0,00±0,00a 30,14±2,67a
MÉDIA 40,24 49,75 8,46 1,45 0,03 29,56
10
Médias seguidas de letras diferentes, na mesma coluna e mesma variável diferem entre si 216
(p<0,05). Médias seguidas de letras iguais, na mesma coluna e mesma variável não diferem 217
entre si (p>0,05). DIG – dígitos; RC – Região do casco; LA – localização anatômica; DL – 218
dígito lateral; DM – dígito medial; MT – membro torácico; MP – membro pélvico. MT – 219
membro torácico; MP – membro pélvico; MD – muralha dorsal; MAB – muralha abaxial; SOL 220
– sola; N°TB/mm2 – número de túbulos córneos por mm2. 221
222
Quanto à nanodureza Vickers, os resultados apresentados para o estojo córneo dos 223
dígitos de bubalinos, considerando-se os dígitos mediais e laterais dos membros 224
torácicos e pélvicos, e as regiões do casco, muralha dorsal, muralha abaxial e sola, 225
podem ser visibilizados abaixo (Tab. 2). Desse modo, foi possível comparar a dureza e 226
o módulo elástico dessas diferentes regiões, tanto nos dígitos mediais quanto nos 227
laterais dos bubalinos, nos membros torácicos e pélvicos, respectivamente. 228
229
Tabela 2. Resultado do teste de Nanodureza Vickers para o estojo córneo dos dígitos de 230
bubalinos, associado ao resultado do módulo elástico. 231
DÍG/RC/LA NANODUREZA VICKERS MÓDULO ELÁSTICO
MT 25,37 ± 3,31a 4,57 ± 0,36a
MP 26,28 ± 2,95a 4,50 ± 0,32a
MD 26,55 ± 4,08a 4,50 ± 0,22a
MAB 26,19 ± 2,42a 4,75 ± 0,38a
SOL 24,46 ± 2,60a 4,71 ± 0,40a
MT-MD 25,31 ± 4,20a 4,47 ± 0,19a
MT-MAB 26,50 ± 2,38a 4,64 ± 0,28a
MT-S 24,28 ± 3,32a 4,86 ± 0,37a
MP-MD 28,45 ± 4,12a 4,54 ±0,28a
MP-MAB 25,61 ± 1,56a 4,90 ± 0,49a
MP-S 24,55± 1,45a 4,48 ± 0,35a
MT – DM 24,32 ± 3,10a 4,45 ± 0,40a
MT – DL 26,40 ± 3,35a 4,75 ± 0,27a
MP – DM 25,39 ± 3,37a 4,50 ± 0,31a
MP – DL 27,18 ± 2,42a 4,67 ± 0,51a
11
MT – DL 26,40 ± 3,35a 4,75 ± 0,27a
MP – DL 27,18 ± 2,42a 4,67 ± 0,51a
MT – DM 24,32 ± 3,10a 4,45 ± 0,40a
MP – DM 25,39 ± 3,37a 4,50 ± 0,31a
CT 26,07 ± 4,66a 5,12 ± 0,12b
CL 26,42 ± 3,19a 4,57 ± 0,20a
MÉDIA 25,74 4,65
Médias seguidas de letras iguais na mesma coluna não diferem entre si (p>0,05). 232
Médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem entre si (p<0,05). DL – 233
dígito lateral; DM – dígito medial; MT – membro torácico; MP – membro pélvico; MD 234
– muralha dorsal; MAB – muralha abaxial; SOL – sola; CT – corte transversal; CL – 235
corte longitudinal. 236
237
DISCUSSÃO 238
Ponderando sobre os resultados da microtomografia bidimensional pode-se inferir que a 239
muralha dorsal do casco apresentou-se como a região anatômica de maior densidade, 240
seguida da muralha abaxial. Diferentemente, a sola se apresentou como a estrutura de 241
menor densidade dentre as regiões investigadas. Essa diferença de densidade pode ser 242
associada à diferença de dureza e resistência entre as regiões avaliadas e ao córion 243
laminar que da origem ao tecido. A sola é formada a partir do córion solear. Budras e 244
Mulling (1998) e Tomlinson et al. (2004), atribuíram essa diferença de dureza entre as 245
regiões do casco de bovinos a deposição de maior sobrecarga de massa corporal sobre a 246
muralha dorsal e abaxial em relação a sola. Portanto, o achado não sugere uma 247
característica particular da espécie bubalina. 248
Os resultados permitem inferir que teste de microtomografia é um método sensível e 249
preciso na mensuração da densidade de diversas regiões do casco de bubalinos e a 250
diferença de dureza em ordem decrescente, partindo da muralha dorsal, abaxial até a 251
sola também pode ter relação com a queratina extratubular e intratubular. 252
Primeiramente, a maior dureza da muralha em relação à sola pode ter relação com maior 253
sobrecarga de massa corporal, uma vez que estes animais apoiam pela muralha (Barsuto 254
et al. 2008; Greenough, 2007). Mas, para explicar o comportamento inverso de dureza 255
apresentado pela queratina extra e intratubular na sola é preciso avançar nessa linha de 256
12
pesquisas. Fundamentando em algumas pesquisas realizadas (Budras e Mulling 1998; 257
Tomlinson et al. 2004; Tombolato et al. 2010) , é possível atribuir essa inversão ao fato 258
de essa região anatômica exercer a função de absorção de impacto, e por consequência, 259
apresentar maior maciez. 260
Apesar de não encontrar citações na literatura (Tomlinson et al. 2004; Mulling e Hagen, 261
2012), pondera-se que, a ausência de poros no estojo córneo de bubalinos observado 262
nessa pesquisa pode conferir maior dureza e resistência ao casco desses animais. Nessas 263
circunstâncias, tornam mais resistentes ao desenvolvimento de lesões e enfermidades 264
podais, quando comparados aos animais da espécie bovina. 265
Outro aspecto que desperta curiosidade é o fato dos túbulos córneos se apresentarem de 266
forma concêntrica helicoidal. Na literatura consultada (Tombolato et al. 2010; 267
McKittrick et al., 2012; Rabelo et al., 2015), não foi possível resgatar quaisquer 268
descrições semelhantes. Porém, análises microestruturais do casco foram realizadas a 269
em bovinos e equinos (McKittrick et al., 2012), sem, contudo, aprofundarem a 270
discussão sobre este achado. Mas, fundamentando-se nos achados de Tombolato et al. 271
(2010), sugere-se que a forma concêntrica helicoidal dos túbulos córneos esteja 272
relacionada à disposição da queratina intratubular que forma a alfa-queratina, principal 273
proteína constituinte da epiderme queratinizada. 274
A diferença na angulação dos túbulos córneos nas distintas regiões do estojo córneo de 275
bubalinos foi outro achado importante revelado nesse estudo, por meio da análise de 276
microtomografia tridimensional. A maior angulação identificada na muralha dorsal, 277
seguida da sola e da muralha abaxial com a menor angulação ainda não foi investigado 278
pela literatura especializada (Tombolato et al. 2010; McKittrick et al., 2012). Mas, 279
acredita-se que a inclinação dos túbulos córneos siga a direção do crescimento do estojo 280
córneo. Contudo para relacionar esse achado com a dureza do casco é preciso realizar 281
estudos complementares, comparando bubalinos com diferentes raças e categorias de 282
bovinos. Ponderando sobre o percentual e número de túbulos córneos verificou-se que 283
os membros torácicos apresentaram percentual e número total de túbulos córneos mais 284
elevados e com maior diâmetro em relação aos pélvicos. O achado pode estar 285
relacionado à maior sobrecarga de peso do animal sobre o membro torácico. Estudos 286
realizados em bovinos, por Budras e Mulling (1998) e Tomlinson et al. (2004), 287
demonstraram resultados semelhantes aos descritos nesta investigação. No entanto, a 288
13
muralha abaxial apresentou percentual superior de túbulos córneos de maior diâmetro 289
frente às demais estruturas consideradas. Assim, acredita-se que a muralha abaxial dos 290
dígitos mediais dos membros torácicos, sofreram uma adaptação funcional para suportar 291
maior sobrepeso. Greenough (2007) e Tombolato et al. (2010) demonstraram que a 292
muralha abaxial recebe maior sobrecarga de peso, podendo, consequentemente, ocorrer 293
maior deposição de queratina. Ainda analisando o percentual e número de túbulos 294
córneos, a muralha abaxial dos membros pélvicos laterais, apresentou percentual e 295
número total de túbulos córneos mais elevados e com maior diâmetro em relação à 296
muralha dorsal e sola dos mesmos dígitos. Acredita-se que esse achados sejam 297
justificados pelo fato dessa região anatômica receber maior sobrecarga de peso do 298
animal em relação à muralha abaxial dos dígitos mediais desses membros. 299
O diâmetro dos túbulos córneos da muralha abaxial dos dígitos dos membros torácicos 300
mediais frente aos túbulos da muralha abaxial dos dígitos dos membros pélvicos laterais 301
apresentaram menor percentual de túbulos córneos de menor diâmetro e maior 302
percentual de túbulos córneos de maior diâmetro em comparação aos túbulos analisados 303
na região pélvica. Estudos realizados em bovinos (Schaller., 1999; König e Liebich., 304
2004; Greenough.,2007) apontaram que os dígitos mediais dos membros torácicos 305
recebem maior sobrecarga do peso corporal do animal. Por analogia, os resultados do 306
estudo aqui desenvolvido concordam com os achados desses autores. Assim, infere que 307
em virtude dessa particularidade ocorre maior deposição de queratina nos dígitos dos 308
membros torácicos e, por consequência, apresentam túbulos córneos de maior diâmetro. 309
Confrontando os resultados da contagem dos números totais de túbulos córneos por 310
mm2, não foi possível justificar a ausência de diferença entre as regiões avaliadas nos 311
dígitos dos membros torácicos e pélvicos dos bubalinos. Em contrapartida, estudos 312
realizados por Barsuto et al. (2008), em bovinos, e por Tombolato et al. (2010), em 313
bovinos e equinos, sugeriram que um maior número de túbulos córneos no estojo 314
córneo pode lhe conferir maior resistência. Porém esses pesquisadores não 315
correlacionaram às regiões estudadas no presente estudo. Devido a complexidade do 316
assunto, há necessidade de estudos adicionais para melhor esclarecimento desse achado, 317
inclusive , comparando o estojo córneo dos dígitos de animais sadios frente aos animais 318
portadores de enfermidades podais, doenças carenciais, ou ainda, entre espécies. 319
14
Os testes de nanodureza Vickers não revelaram diferenças entre as regiões da muralha 320
dorsal, muralha abaxial e sola dos dígitos laterais e mediais nos membros torácicos e 321
pélvicos. Mas pesquisadores como Abduhalli et al. (2014) utilizando chifres de bovinos 322
e antílopes afirmaram que a técnica de Nanoindentação indicou que o estojo córneo 323
dessa estrutura apresenta maior dureza na base do crânio, aumentando até a metade do 324
chifre e diminuindo, gradativamente, a partir desse segmento até a porção sua apical. 325
Com base nessas informações, acredita-se que a ausência de diferenças quanto ao nível 326
de dureza nas diferentes regiões do estojo córneo dos bubalinos desse estudo esteja 327
relacionado à padronização da localização da colheita das amostras, que se deu no terço 328
medial de cada dígito. 329
Ainda em relação aos testes de nanodureza de Vickers, o módulo elástico apresentou 330
diferenças estatísticas, com maior expressão no corte transversal quando comparado ao 331
corte longitudinal. Acredita-se que este fato possa ser explicado levando em 332
consideração que, na direção transversal, exista uma maior elasticidade das regiões do 333
estojo córneo, visto que, nesse sentido dos túbulos córneos requerem maior flexibilidade 334
em virtude da maior sobrecarga de massa corporal imposta a essa estrutura. 335
336
CONCLUSÕES 337
O estudo da microestrutura do estojo córneo de bubalinos por meio da microtomografia 338
bidimensional e tridimensional permitiu demonstrar a organização estrutural, diferença 339
de densidade e dureza das diferentes regiões do casco, além de detalhar a disposição, a 340
angulação, o diâmetro dos túbulos córneos e a quantificação do número de túbulos por 341
mm2. 342
Os testes de nanodureza de Vickers permitem mensurar a dureza de diferentes estruturas 343
do estojo córneo dos dígitos de bubalinos 344
A aplicação de técnicas com elevado nível de especificidade, empregadas nessa área do 345
conhecimento, sugerem a necessidade de implementar novos avanços nas pesquisas e 346
configuram um novo paradigma no contexto da podologia de ruminantes. 347
348
349
350
351
15
AGRADECIMENTOS 352
CNPq: Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (Processo: 449753/2014-0). 353
Fapeg: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Goiás (Processo: 354
20122012267001141). 355
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398
CAPÍTULO 4 - Composição bioquímica do estojo córneo de bubalinos e sua 1
influência na qualidade do casco 2
Biochemical composition of hoof capsule of buffaloes and their influence on the 3
quality of hoof 4
5
RESUMO 6
A epiderme queratinizada (estojo córneo do casco) é considerada uma barreira biológica 7
que confere proteção às estruturas internas essenciais à locomoção, influenciando assim 8
a vulnerabilidade ou a resistência dos ruminantes às enfermidades podais. Com o 9
presente estudo, objetivou-se estabelecer os parâmetros bioquímicos das diferentes 10
regiões do casco de bubalinos, muralha abaxial, muralha dorsal e sola do caso dos 11
dígitos torácico medial e pélvico lateral. Assim, foram analisados os teores de matéria 12
seca (MS), matéria mineral (MM), matéria orgânica (MO), proteína bruta (PB) e extrato 13
etéreo (EE). Incluiu-se também a análise dos minerais enxofre (S), cálcio (Ca), potássio 14
(K), fósforo (P), zinco (Zn) e cobre (Cu). Os achados foram analisados com a utilização 15
do Software SigmaPlot 12.0®. O teste estatístico utilizado para comparação entre as 16
médias foi o teste-T para duas médias e ANOVA para três médias, em nível de 17
significância de 5%. Concluiu-se que, os parâmetros bioquímicos do casco 18
apresentaram diferentes concentrações em relação à região e posição anatômica do 19
casco, sendo essas diferenças associadas aos dígitos que recebem maior sobrecarga de 20
massa corporal e impacto. 21
Palavras-chave: estojo córneo, estrato etéreo, minerais, proteína bruta, matéria seca. 22
23
ABSTRACT 24
The keratinized epidermis (corneal case) is considered a biological barrier protection of 25
internal structures essential to the movement and influencing vulnerability or foot 26
resistance of ruminants to disease. This study aimed to establish biochemical parameters 27
of buffalo hoof, especially dry matter (DM), mineral matter (MM), organic matter 28
(OM), crude protein (CP) and ethereal layer (EE) and minerals, sulfur (S), calcium (Ca), 29
potassium (K), phosphorus (P), zinc (Zn) and copper (Cu). The findings were analyzed 30
using the software SigmaPlot 12.0®. The statistical test used to compare the means was 31
2
the T-test for two means and ANOVA for three average, 5% significance level. 32
However, the dry matter, mineral matter, organic matter, crude protein and ether extract 33
and different minerals in their different concentrations revealed in this study were 34
associated with digits receiving higher overhead and impact of body mass. 35
Keywords: dry matter, horny case, lipids, minerals, protein. 36
37
INTRODUÇÃO 38
Estudos básicos voltados à compreensão da morfologia, composição celular e 39
bioquímica dos cascos de ruminantes, especialmente de bubalinos, são escassos e 40
merecem atenção por parte dos pesquisadores. 41
Eventos celulares e bioquímicos relacionados à formação e à composição do estojo 42
córneo dos cascos de bubalinos e bovinos podem elucidar questionamentos acerca da 43
qualidade do casco e a vulnerabilidade deste às enfermidades podais. A maior 44
resistência às doenças de casco observada em bubalinos, quando comparados aos 45
bovinos, principalmente os de aptidão leiteira, já foi alvo de investigações científicas 46
(Campos, 2012; Silva et al., 2015), entretanto, muitos questionamentos ainda são 47
controversos. 48
Sabe-se que a qualidade e a resistência do estojo córneo do casco podem sofrer 49
influência de inúmeros fatores, com destaque para os nutricionais, metabólicos, 50
hormonais e ambientais (Ferreira et al., 2005; Muelling, 2009). Os fatores nutricionais 51
merecem destaque, pois sabe-se que os ácidos graxos, os minerais, as vitaminas e em 52
especial os aminoácidos, sobretudo os associados ao enxofre, como a cisteína, são 53
componentes essenciais à formação de um estojo córneo de qualidade (Tomlinson, et 54
al., 2004; Ferreira, et al., 2005; Bertenchini, 2013). 55
Diante disso, objetivou-se nesta pesquisa, estudar e estabelecer parâmetros da 56
composição bioquímica do estojo córneo de bubalinos, por meio da quantificação de 57
matéria seca (MS), matéria mineral (MM), matéria orgânica (MO), proteína bruta (PB), 58
estrato etéreo (EE) e os minerais, enxofre (S), cálcio (Ca), potássio (K), fósforo (P), 59
zinco (Zn) e cobre (Cu) em diferentes regiões do casco, com destaque para a muralha 60
abaxial, a muralha dorsal e a sola pré-bulbar dos dígitos mediais e laterais dos membros 61
pélvicos e torácicos. 62
63
3
MATERIAL E MÉTODOS 64
A pesquisa foi desenvolvida no Setor de Cirurgia de Grandes Animais e nos 65
Laboratórios de Física e de Análises de Alimentos da Universidade Federal de Goiás – 66
Regional Jataí – GO. A pesquisa ocorreu entre os meses de junho de 2014 a agosto de 67
2015, obedecendo aos preceitos éticos em experimentação animal, sendo o projeto de 68
pesquisa aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais, Pró Reitoria de Pesquisa 69
e Inovação da UFG (CEUA-PRPI-UFG), protocolo no20/2014. 70
Foram colhidas 56 peças anatômicas (estojos córneos) de 14 fêmeas de bubalinos 71
adultos, criadas a pasto, sem suplementação com alimento concentrado e sua dieta, com 72
idade entre 24 e 60 meses, raça Jafarabadi, sendo 28 membros torácicos e 28 membros 73
pélvicos, totalizando 112 dígitos. Os 112 dígitos foram identificados quanto a sua 74
localização em pélvicos ou torácicos e laterais ou mediais. 75
Do terço medial de cada dígito foram retiradas amostras, em duplicata, do tecido 76
queratinizado do casco (epiderme) da muralha dorsal, muralha abaxial e sola pré-bulbar, 77
com dimensões aproximadas de 10mm x 10mm. As amostras foram higienizadas, 78
assegurando-se a retirada de tecido mole e sujidades. Sequencialmente, os espécimes 79
clínicos foram acondicionados em embalagens plásticas e congelados a -15° C. 80
A avaliação da composição bioquímica do casco envolveu duas técnicas distintas, a 81
técnica destrutiva, com a necessidade de moer as amostras, e a técnica não destrutiva, 82
sem a necessidade de promover a fragmentação das amostras. 83
A técnica destrutiva foi destinada as análises de matéria seca (MS), matéria mineral 84
(MM), proteína bruta (PB), extrato estéreo (EE), seguindo a metodologia preconizada 85
por Silva e Queiroz (2002). Assim, as amostras foram moídas em um micro-moinho 86
MAO 48 – Marconi, peneira intermediária, a fim de fracioná-las em fragmentos de 87
aproximadamente 0,5mm, com peso mínimo padronizado de dois gramas. 88
Para realizar a análise de matéria seca (MS), as amostras foram pesadas em uma balança 89
de precisão e inseridas em um cadinho de cerâmica, previamente pesado. 90
Sequencialmente, as amostras foram encaminhadas à estufa a 105oC, por duas horas. 91
Em seguida, foram submetidas a um dessecador de vidro com sílica por 40 minutos 92
visando estabilizar as amostras, sendo estas novamente pesadas. Pela diferença entre o 93
peso original da amostra e o segundo peso, evidenciou-se o valor da MS. 94
4
A análise para matéria mineral (MM) foi realizada sequencialmente à análise da matéria 95
seca. Para isso, as amostras foram inseridas em um forno MUFLA - JUNG a 600oC, por 96
quatro horas. Após este período, o forno foi desligado e a temperatura decai de forma 97
gradativa até atingir 200oC. Em seguida, as amostras foram levadas a estufa a 105oC, 98
por uma hora e, sequencialmente, encaminhadas ao dessecador de vidro com sílica por 99
40 minutos. Por fim, realizou-se a pesagem novamente e pela diferença entre o peso da 100
MS e o peso das amostras nesse momento, evidenciou-se o valor da MM. 101
Para realizar a análise de proteína bruta (PB), as amostras foram previamente pesadas e 102
inseridas em um tubo de ensaio com uma substância catalizadora (sulfato de sódio + 103
sulfato de cobre) na proporção de 10:1. Em seguida, acrescentou-se cinco mililitros de 104
ácido sulfúrico puro. Na sequência encaminhou-se as amostras a um bloco digestor, por 105
uma hora e meia, a uma temperatura crescente de 70oC até atingir os 400oC. As 106
amostras permaneceram a essa temperatura até se observar mudança de coloração, de 107
negra para esverdeada. Após esta etapa, a mistura descansou por 20 minutos e ao final 108
foram acrescentados 20 mL de água destilada a esta. Em seguida as amostras foram 109
destiladas em um destilador de nitrogênio, por três minutos, até atingirem 100 mL de 110
destilado. Sequencialmente realizou-se a titulação com HCL, até o destilado mudar da 111
colocação amarelada para róseo claro. A quantidade de HCL utilizado na titulação foi 112
convertida para (PB) em relação à (MS). 113
Para a análise do extrato etéreo (EE), as amostras foram pesadas e envoltas em um 114
envelope de papel filtro qualitativo de 15 cm e inseridas em um balão volumétrico 115
previamente pesado. Em seguida, o balão foi acoplado a um extrator e a um 116
condensador (Sistema Soxlet) com lavagem intermitente com 200 mL de solvente de 117
éter de petróleo com aquecimento nível três, por quatro horas. Após esse período 118
retirou-se o cartucho e realizou-se o refluxo do solvente, e ainda sob aquecimento, 119
recuperou-se até 0,1 cm de solvente no balão volumétrico. Após essa etapa o balão foi 120
submetido à estufa a 105oC por uma hora e, em sequência, ao dessecador de vidro com 121
sílica por 40 minutos. Dando continuidade pesou-se o balão novamente e, pela diferença 122
entre a pesagem do balão final e pesagem inicial, evidenciou-se o valor do (EE). 123
Quanto aos minerais foi realizada a análise não destrutiva para quantificar o enxofre (S), 124
cálcio (Ca), potássio (K), fósforo (P), zinco (Zn) e cobre (Cu), empregando 125
espectroscopia de raios X por dispersão em energia em equipamento EDX-720, 126
5
seguindo metodologia preconizada por Bajanowski (2001). Para essas análises foi 127
utilizado um espectrômetro de fluorescência de raios-x da marca Shimadzu, modelo 128
EDX-720, com tubo de ródio (Rh). Tal equipamento detecta elementos na faixa do 129
sódio (Na) até o urânio (U), e fornece um espectro de fluorescência com os picos de 130
energia liberada por cada elemento, os quais são identificados por um programa 131
específico e depois quantificados, conforme os parâmetros escolhidos. Os arquivos de 132
dados que o difratômetro forneceu foram salvos em arquivos de texto (txt) e 133
transformados em arquivos de dados (dat). Com um programa gráfico, montou-se os 134
gráficos do ângulo (2θ) vs. contagem (u. a.). Os achados foram analisados com a 135
utilização do Software Sigma Plot 12.0®. O teste estatístico preconizado para 136
comparação entre as médias foi o teste-T para duas médias e ANOVA para três médias, 137
em nível de significância de 5% (Sampaio, 2010). 138
139
RESULTADOS 140
As análises bioquímicas dos cascos dos bubalinos, empregando-se a técnica destrutiva, 141
revelaram médias de 85,55% para MS, 0,733% para MM, 99,23% para MO, 91,67% 142
para PB e 0,876% para EE para os dígitos dos membros torácicos e pélvicos (Tab. 1). 143
Quando se comparou as médias de MS, MM, MO, PB e EE dos dígitos laterais e 144
mediais dos membros torácicos, notaram-se valores superiores de MS e PB para os 145
dígitos mediais em relação aos laterais, sendo verificados valores de 87,2% MS, 93,2% 146
(PB) para os dígitos mediais e 84,5% (MS) e 90,1 (PB) para os dígitos laterais (Tab. 1), 147
apresentando diferença estatística (p<0,05). 148
Ao comparar as médias de MS, MM, MO, PB e EE entre os dígitos laterais e mediais 149
dos membros pélvicos, entre os dígitos laterais dos membros torácicos e pélvicos, e 150
entre os dígitos mediais dos membros torácicos e pélvicos (Tab. 1), não observou 151
diferenças significativas entre as comparações das médias (p>0,05). 152
153
154
155
156
157
158
6
Tabela 1. Análise bioquímica da matéria seca, matéria mineral, matéria orgânica, 159
proteína bruta e estrato etéreo do estojo córneo dos cascos de bubalinos pela técnica 160
destrutiva. 161
DÍG/
RAC
Composição Bioquímica – Técnica destrutiva
MS MM (%MS) MO (%MS) PB (%MS) EE (%MS)
MT 85,9 ± 1,77 a 0,660 ± 0,101 a 99,3 ± 0,205 a 91,6 ± 2,45 a 0,87 ± 0,034 a
MP 85,2 ± 0,99 a 0,545 ± 0,045 a 99,5 ± 0,104 a 91,7 ± 2,57 a 0,90 ± 0,026 a
MT-DL 84,5 ± 1,07 a 0,713 ± 0,203 a 99,3 ± 0,203 a 90,1 ± 2,41 a 0,777 ± 0,022 a
MT-DM 87,2 ± 1,02 b 0,607 ± 0,101 a 99,4 ± 0,101 a 93,2 ± 1,42 b 0,917 ± 0,083 a
MP-DL 85,1 ± 0,320 a 0,490 ± 0,0529 a 99,5 ± 0,0529 a 92,2 ± 2,80 a 0,893 ± 0,011 a
MP-DM 85,3 ± 1,52 a 1,12 ± 0,095 a 98,9 ± 0,950 a 91,3 ± 2,83 a 0,917 ± 0,025 a
MT-DL 84,5 ± 1,07 a 0,713 ± 0,203 a 99,3 ± 0,203 a 90,1 ± 2,41 a 0,777 ± 0,220 a
MP-DL 85,1 ± 0,320 a 0,490 ± 0,0529 a 99,5 ± 0,0529 a 92,2 ± 2,80 a 0,893 ± 0,011 a
MT-DM 87,2 ± 1,02 a 0,607 ± 0,101 a 99,4 ± 0,101 a 93,2 ± 1,42 a 0,917 ± 0,083 a
MP-DM 85,3 ± 1,52 a 1,12 ± 0,950 a 98,9 ± 0,950 a 91,3 ± 2,83 a 0,917 ± 0,025 a
MD 85,9 ± 1,78 a 0,775 ±0,201 a 99,2 ±0,120 a 91,0 ±1,55 a 0,895 ±0.037 a
MAB 85,0 ± 1,86 a 0,545 ±0,012 a 99,5 ±0,142 a 91,7 ±1,33 a 0,965 ±0,042 a
SOL 85,8 ± 0,29 a 0,535 ±0,023 a 99,5 ±0,201 a 92,3 ±2,45 a 0,870 ±0,023 a
MÉDIA 85,55 0,733 99,23 91,67 0,876
MS - matéria seca, MM - matéria mineral; MO - matéria orgânica; PB - proteína bruta; 162
EE - estrato etéreo; DIG – dígitos; RAC – Região anatômica do casco; MT – membro 163
torácico; MP – membro pélvico; MT-DL – membro torácico dígito lateral; MP-DL – membro 164
pélvico dígito lateral; MT-DM – membro torácico dígito medial; MP-DM – membro pélvico 165
dígito medial; MD – muralha dorsal; MAB – muralha abaxial; SOL – sola. Médias seguidas de 166
letras diferentes, na mesma coluna entre os dígitos laterais e mediais dos membros pélvicos, os 167
dígitos laterais entre os membros, torácicos e pélvicos, e os dígitos mediais entre membros 168
torácicos e pélvicos diferem entre si (p<0,05). 169
170
O resultado da análise bioquímica não destrutiva quantificou os minerais do estojo 171
córneo dos bubalinos revelando médias de 83,53% para S, 8,13% para Ca, 3,47% para 172
K, 3,74% para P, 0,81% para Zn e 0,31% para Cu, como demonstrado na Tab. 2. 173
Quando se comparou as médias dos valores dos minerais entre os dígitos laterais e 174
mediais dos membros torácicos, entre os dígitos laterais e mediais dos membros 175
7
pélvicos, não foram observadas diferenças estatisticamente significantes (p>0,05) (Tab. 176
2). 177
Porém, houve diferença estatística significante para o fósforo na comparação entre duas 178
médias, sendo que, os dígitos laterais apresentaram valores superiores de P em relação 179
aos dígitos mediais dos membros pélvicos (p<0,05) (Tab. 2). 180
Quando se comparou as médias entre os dígitos laterais dos membros torácicos e 181
pélvicos, não observou diferenças significativas entre as médias de K, P, Zn e Cu 182
(p>0,05). Porém, houve diferença estatística significante para o S e Ca entre os dígitos 183
laterais dos membros torácicos e pélvicos (p<0,05) (Tab. 2). 184
Ao comparar as médias entre dígitos mediais dos membros torácicos e pélvicos, não 185
observou diferenças estatísticas significantes (p>0,05), para os minerais S, Ca, K, P, Zn 186
e Cu (Tab. 2). 187
Ao analisar e comparar as médias das regiões da muralha dorsal, muralha abaxial e sola, 188
pôde-se observar que houve diferença estatística significante (p<0,05). Os resultados 189
apontam que a muralha abaxial e sola apresentam maior percentual K em relação à 190
muralha dorsal. Pode-se verificar também que a muralha dorsal apresentou valor 191
superior de Zn em relação à sola. Os dados ainda demonstraram que a muralha abaxial e 192
a sola possuem percentual de Cu superior ao da muralha dorsal (Tab. 2). 193
194
195
196
197
198
199
200
201
202
203
204
205
206
8
Tabela 2. Análise bioquímica dos minerais, enxofre, cálcio, potássio, fósforo, zinco e 207
cobre do estojo córneo dos cascos de bubalinos pela técnica não destrutiva. 208
DÍG/
RC/LA
Composição Bioquímica – Técnica destrutiva
S Ca K P Zn Cu
MT 82,8 ± 3,51 a 8,70 ± 2,41 a 3,53 ± 1,51 a 3,85 ± 0,56 a 0,79 ± 0,13 a 0,31 ± 0,04 a
MP 84,2 ± 2,38 a 7,57 ± 1,08 a 3,41 ± 1,83 a 3,64 ± 0,39 a 0,82 ± 0,07 a 0,31 ± 0,03 a
MT-DL 81,0 ± 1,74 a 10,3 ± 1,51 a 3,44 ± 1,66 a 4,24 ± 0,41 a 0,73 ± 0,16 a 0,30 ± 0,03 a
MT-DM 84,7 ± 4,22 a 7,10 ± 2,15 a 3,62 ± 1,69 a 3,46 ± 0,39 a 0,85 ± 0,08 a 0,30 ± 0,05 a
MP-DL 84,5 ± 0,73 a 7,21 ± 0,86 a 3,18 ± 1,12 a 3,96 ± 0,05 b 0,83 ± 0,09 a 0,33 ± 0,04 a
MP-DM 84,3 ± 3,71 a 7,92 ± 1,33 a 3,63 ± 2,64 a 3,32 ± 0,29 a 0,82 ± 0,05 a 0,29 ± 0,02 a
MT-DL 81,0 ± 1,74 a 10,3 ± 1,51b 3,44 ± 1,66 a 4,24 ± 0,41 a 0,73 ± 0,16 a 0,31 ± 0,03 a
MP-DL 84,5 ± 0,73 b 7,21 ± 0,86 a 3,18 ± 1,12 a 3,96 ± 0,05 a 0,83 ± 0,09 a 0,33 ± 0,04 a
MT-DM 84,7 ± 4,22 a 7,10 ± 2,15 a 3,62 ± 1,69 a 3,46 ± 0,39 a 0,85 ± 0,08 a 0,30 ± 0,05 a
MP-DM 84,3 ± 3,71 a 7,92 ± 1,33 a 3,63 ± 2,64 a 3,32 ± 0,29 a 0,82 ± 0,06 a 0,29 ± 0,02 a
MD 86,2 ± 2,66 a 6,93 ± 1,80 a 2,07 ± 0,49 a 3,61 ± 0,52 a 0,91 ± 0,31 b 0,27 ± 0,01 a
MAB 82,2 ± 2,17 a 9,25 ± 1,87 a 3,40 ± 1,35 b 4,00 ± 0,50 a 0,84 ± 0,42 ab 0,34 ± 0,02 b
SOL 82,2 ± 2,42 a 8,22 ± 1,61 a 4,94 ±1,33 b 3,63 ± 0,42 a 0,74 ± 0,32 a 0,32±0,04 b
MÉDIA 83,53 8,13 3,47 3,74 0,81 0,31
S – enxofre; Ca – cálcio; K – potássio; P – fósforo; Zn – zinco; Cu – cobre; DIG – dígitos; RC – 209
Região do casco; LA – localização anatômica; DÍG – dígitos; MT – membro torácico; MP – 210
membro pélvico; MT-DL – membro torácico dígito lateral; MP-DL – membro pélvico dígito 211
lateral; MT-DM – membro torácico dígito medial; MP-DM – membro pélvico dígito medial; 212
MD – muralha dorsal; MAB – muralha abaxial; SOL – sola. Médias seguidas de letras 213
diferentes, na mesma coluna e mesma variável diferem entre si (p<0,05). Médias seguidas de 214
letras iguais, na mesma coluna e mesma variável não diferem entre si (p>0,05). 215
216
DISCUSSÃO 217
Acredita-se que os resultados dessa pesquisa, revelando maior deposição de (PB) e, 218
consequentemente, maior porcentagem de (MS), utilizando as médias dos pontos 219
anatômicos (muralha dorsal, muralha abaxial e sola) nos dígitos mediais do membro 220
torácico. Contudo, esses achados podem ser justificados em virtude da maior sobrecarga 221
de massa corporal nos referidos pontos anatômicos, quando comparados aos dígitos 222
laterais dos membros torácicos. Outros pesquisadores, apesar de não apresentarem 223
9
explicações para o fato, atestaram que os dígitos mediais dos membros torácicos 224
recebem maior sobrecarga de massa corporal do animal e que este fato poderia 225
influenciar na resistência do estojo córneo (Schaller, 1999; König e Liebich (2004); 226
Greenough, 2007 e Campos, 2012). 227
Os cascos de bubalinos apresentam coloração pigmentada, não sendo possível 228
conjecturar qualquer informação acerca da influência exercida do pigmento sobre a 229
concentração dos elementos bioquímicos investigados. 230
Apesar de não ter sido possível resgatar na literatura consultada estudos avaliando a 231
concentração bioquímica do estojo córneo em bubalinos ou bovinos, pigmentados e 232
despigmentados, pesquisas realizadas por Faria et al. (2002), avaliando a composição 233
bioquímica de cascos de equinos da raça Mangalarga Machador, afirmaram que a 234
pigmentação não influenciou, de forma significativa, na concentração bioquímica das 235
amostras avaliadas. Todavia, os mesmos autores citaram que na raça Pantaneira notou-236
se maior concentração de (MM), em especial o fósforo, podendo este fato influenciar na 237
qualidade e resistência do casco. Este achado demonstra a importância em se ter 238
parâmetros destes elementos bioquímicos para futuras investigações científicas, o que 239
reforça a importância do presente estudo. 240
A diferença estatística observada na concentração do elemento fósforo entre os dígitos 241
laterais e mediais dos membros pélvicos também pode ser justificada tendo em vista a 242
sobrecarga de peso. Já o fato das concentrações deste elemento mostrarem valores 243
similares, quando comparados os dígitos mediais e laterais dos membros torácicos e 244
dígitos laterais dos membros pélvicos, respectivamente, podem ter relação com o tipo 245
de inserção dos membros locomotores à estrutura corporal do animal, podendo essa 246
influenciar na absorção de impacto. Este fato, em tese, pode direcionar o maior aporte 247
do fósforo para os dígitos que recebem maior sobrepeso, visando o fortalecimento da 248
estrutura. De acordo com outros pesquisadores, o cemento intercelular, substância rica 249
em fosfolipídios e que confere maior adesão e resistência ao estojo córneo, pode sofrer 250
influência direta em sua concentração em regiões do casco submetidas a constantes 251
desafios, corroborando assim, com a justificativa e achados apresentados neste estudo 252
(König e Liebich, 2004; Greenough, 2007). Acrescente-se ainda, que a quantificação do 253
elemento fósforo nos cascos dos bubalinos pode servir como parâmetro no estudo da 254
podologia de ruminantes. 255
10
Quanto ao enxofre (S), evidenciou-se nesta investigação, que esse elemento apresentou-256
se também em maior concentração em dígitos que recebem maior sobrecarga de massa 257
corporal do animal e impacto. Sabe-se que o S apresenta-se como importante 258
componente estrutural de aminoácidos sulfidrílicos, como metionina, cistina e cisteína, 259
essenciais na formação da queratina, principal constituinte do estojo córneo que, quando 260
unidos pelas pontes dissulfeto, formam uma rede tridimensional muito resistente 261
(Schrooyen et al. 2001). Tendo como base a informação científica acima descrita, 262
acredita-se que a concentração deste elemento encontrada neste estudo nas regiões 263
supracitadas se justifica. 264
O presente estudo revelou que o zinco (Zn) apresentou concentrações mais elevadas nas 265
regiões da muralha dorsal e abaxial. Acredita-se que esse achado esteja relacionado ao 266
intenso crescimento que essas duas regiões apresentam em relação à sola. Este fato pode 267
ser explicado, tendo em vista, a intensa proliferação celular no córion coronário, 268
responsável pelo crescimento da muralha dorsal e abaxial. Por ser o zinco um elemento 269
importante na síntese da queratina, essa maior concentração se justifica. Outros 270
pesquisadores também corroboram com as informações acima citadas, acrescentando 271
ainda que o Zn, quando utilizado em sua forma quelatada na dieta dos animais, 272
formando o complexo zinco/metionina influencia o maior crescimento do estojo córneo 273
e organização da morfologia dos túbulos córneos (Barsuto et al., 2008). 274
As concentrações de cobre (Cu) evidenciadas nos cascos de bubalinos podem ser 275
utilizadas como parâmetro bioquímico a ser comparado com outros ruminantes. Sabe-se 276
que o cobre é um importante mineral relacionado à resistência do estojo córneo, e que 277
sua concentração, pode implicar na melhor qualidade do casco. Apesar de não encontrar 278
na literatura consultada dados desse elemento no casco de bovinos acredita-se, que 279
possa haver um comportamento diferente entre os ruminantes quanto ao elemento cobre, 280
sendo investigações necessárias. Dando respaldo a importância que o Cu representa na 281
qualidade do casco, estudos realizados por Hoblet (2001) e Lana (2007) relataram que 282
este elemento atua em diferentes processos fisiológicos como a síntese da melanina, 283
formação de grupos dissulfídricos, dentre eles a metionina, cisteína e cistina, conferindo 284
maior resistência ao casco. 285
286
287
11
CONCLUSÕES 288
A composição bioquímica do casco de bubalinos, ainda não estudada por outros 289
pesquisadores, apresentou inquestionável importância para o conhecimento estrutural 290
dos cascos desses animais. A matéria seca, matéria mineral, matéria orgânica, proteína 291
bruta e extrato etéreo e diferentes minerais, em suas diferentes concentrações, foram 292
associados aos dígitos que recebem maior sobrecarga de massa corporal e impacto. O 293
presente estudo gerou conhecimento e parâmetros a serem utilizados em outras 294
investigações científicas em outras espécies e raças de bovídeos. 295
296
AGRADECIMENTOS 297
CNPq: Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (Processo: 449753/2014-0). 298
Fapeg: Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Goiás (Processo: 299
20122012267001141). 300
301
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13
CAPÍTULO 5 – CONSIDERACÕES FINAIS
Os estudos científicos relacionados às afecções dos cascos de bovídeos foram
focalizados até o momento, na pesquisa aplicada às enfermidades podais, sendo voltadas aos
aspectos epidemiológicos, diagnóstico, tratamento e as medidas de prevenção e
biossegurança31-33. No entanto, a falta de conhecimento básico da microestrutura do casco dos
animais de produção, fez com que o referido assunto, se tornasse inovador diante da escassez
de informações relacionadas ao tema proposto neste estudo. A técnica de histomorfometria,
embora conhecida na medicina veterinária e utilizada por alguns pesquisadores19 vem se
modernizando com a utilização de softwares mais precisos, que permite realizar avaliações
mais fidedignas das estruturas anatômicas investigadas. Essa avaliação tornou possível
verificar particularidades das regiões responsáveis pelo crescimento e qualidade do estojo
córneo de bubalinos como o córion coronário e laminar.
As informações acerca da histomorfometria dos cascos dos membros torácicos e
pélvicos de bubalinos forneceram informações científicas inéditas e de importância
indiscutível. Pode-se verificar a organização e comportamento das papilas epidêmicas,
túbulos córneos nas diferentes regiões do casco dessa espécie e ainda a sua relação com
resistência do casco. Verificou-se ainda a distribuição dos melanossomas nos estratos do
córion coronário e laminar, que possibilitou compreender melhor o papel da melanina na
proteção dos queratinócitos contra as radiações UVs, nos animais com cascos pigmentados.
Outra técnica inovadora utilizada nesse estudo foi a microtomografia
bidimensional e tridimensional por raios-X, realizada pelo microtomógrafo de alta resolução e
que permitiu a visualização de seções transversais de um objeto de forma não destrutiva10.
Esta avaliação revelou dados inéditos quanto ao comportamento e disposição da queratina
intratubular e extratubular do estojo córneo de bubalinos.
Os testes realizados por microtomografia bidimensional, tridimensional e
nanodureza revelaram dados importantes quanto à morfologia dos túbulos córneos, o que
possibilitou conjecturar essas características com a diferença de dureza entre as regiões do
estojo córneo. Fatores como o diâmetro dos túbulos córneos e sua percentagem no estojo
córneo podem estar relacionados com a maior resistência do casco. Portanto, foi evidenciado
nesse estudo, que as regiões que recebem maior sobrecarga de massa corporal apresentam
maior dureza e as regiões cuja função é absorver impacto se mostraram mais macias. Essa
pesquisa revelou que existem técnicas que demonstram maior precisão para analisar essas
14
características em relação a outras. No entanto, há necessidade de estudos adicionais que
venham complementar essas informações.
O teste de nanodureza Vickers, técnica muito utilizada nas engenharias de
materiais, aeronáutica, civil, permite medir a resistência à penetração ou a resistência à
deformação de um material. O emprego dessa tecnologia no estudo básico de chifres e da
podologia permitiu extrair informações sobre a dureza Vickers e módulo elástico das
diferentes regiões do estojo córneo de bubalinos18.
Quanto à análise da bioquímica não destrutiva empregou-se espectroscopia de
raios X por dispersão em energia em equipamento EDX-72030, para verificar concentração
dos minerais presentes no estojo córneo. Essa técnica se mostrou de fácil realização e revelou
resultados inovadores dos minerais presentes no estojo córneo de bubalinos.
Os resultados das análises bioquímicas revelaram informações importantes quanto
aos elementos que constituem a microestrutura do estojo córneo de bubalinos. Desse modo, as
diferentes concentrações desses elementos encontrados nas regiões do estojo córneo, poderão
elucidar a cerca de alguns questionamentos quanto à resistência desses animais as
enfermidades podais. Contudo, pode-se dizer que os resultados desse estudo, irão servir de
parâmetros para auxiliar no desenvolvimento de novas pesquisas no campo da nutrição e
melhoramento genético dos animais de produção.
Diante dessa realidade, outros pesquisadores têm utilizado outras técnicas de
ponta, pouco exploradas na medicina veterinária como a termografia e venografia
contrastada34,35. Essas técnicas tem se mostrado importantes para a compreensão das
características intrínsecas relacionadas às diferentes espécies, contribuindo para o melhor
entendimento do comportamento e microestrutura do estojo córneo dos cascos de animais de
produção.
Assim, visitar as áreas básicas da medicina veterinária e trabalhar com
equipamentos até então pouco usuais de nossa realidade, mostrou-se preciso e desafiador.
Desse modo, acredita-se que os dados advindos dessa pesquisa apresentaram relevante
contribuição à comunidade científica e implicaram em mudanças no cenário atual da
podologia em ruminantes, em especial a dos bovídeos. Ressalte-se que a padronização
morfológica do estojo córneo, com destaque para os bubalinos, além de desvendar
questionamentos até então controversos, contribuiu de maneira significativa, para dar
subsídios a novas linhas de pesquisa sobre o tema.
15
ANEXOS
INSTRUÇÕES AOS AUTORES
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia (Brazilian Journal of Veterinary and Animal Sciences)
Política Editorial O periódico Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia (Brazilian Journal of Veterinary and Animal Science), ISSN 0102-0935 (impresso) e 1678-4162 (on-line), é editado pela FEPMVZ Editora, CNPJ: 16.629.388/0001-24, e destina-se à publicação de artigos científicos sobre temas de medicina veterinária, zootecnia, tecnologia e inspeção de produtos de origem animal, aquacultura e áreas afins. Os artigos encaminhados para publicação são submetidos à aprovação do Corpo Editorial, com assessoria de especialistas da área (relatores). Os artigos cujos textos necessitarem de revisões ou correções serão devolvidos aos autores. Os aceitos para publicação tornam-se propriedade do Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia (ABMVZ) citado como Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. Os autores são responsáveis pelos conceitos e informações neles contidos. São imprescindíveis originalidade, ineditismo e destinação exclusiva ao ABMVZ. Reprodução de artigos publicados A reprodução de qualquer artigo publicado é permitida desde que seja corretamente referenciado. Não é permitido o uso comercial dos resultados. A submissão e tramitação dos artigos é feita exclusivamente on-line, no endereço eletrônico <www.abmvz.org.br>. Não serão fornecidas separatas. Os artigos encontram-se disponíveis nos endereços www.scielo.br/abmvz ou www.abmvz.org.br. Orientação para tramitação de artigos
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Comunicação
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ultrapassar 150 dígitos. Autores e Filiação. Os nomes dos autores são colocados abaixo do título, com
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Resumo e Abstract. Deve ser o mesmo apresentado no cadastro contendo até 2000 dígitos incluindo os espaços, em um só parágrafo. Não repetir o título e incluir os principais resultados numéricos, citando-os sem explicá-los, quando for o caso. Cada frase deve conter uma informação. Atenção especial às conclusões.
Palavras-chave e Keywords. No máximo cinco. Introdução. Explanação concisa, na qual são estabelecidos brevemente o problema,
sua pertinência e relevância e os objetivos do trabalho. Deve conter poucas referências, suficientes para balizá-la.
Material e Métodos. Citar o desenho experimental, o material envolvido, a descrição dos métodos usados ou referenciar corretamente os métodos já publicados. Não usar subtítulos. Nos trabalhos que envolvam animais e organismos geneticamente modificados deverá constar, obrigatoriamente, o número do protocolo de aprovação do Comitê de Bioética e/ou de Biossegurança, quando for o caso.
Resultados. Apresentar clara e objetivamente os resultados encontrados. Tabela. Conjunto de dados alfanuméricos ordenados em linhas e colunas. Usar
linhas horizontais na separação dos cabeçalhos e no final da tabela. A legenda recebe inicialmente a palavra Tabela, seguida pelo número de ordem em algarismo arábico e é referida no texto como Tab., mesmo quando se referir a várias tabelas. Pode ser apresentada em espaçamento simples e fonte de tamanho menor que 12 (menor tamanho aceito é 8).
Figura. Qualquer ilustração que apresente linhas e pontos: desenho, fotografia, gráfico, fluxograma, esquema, etc. A legenda recebe inicialmente a palavra Figura, seguida do número de ordem em algarismo arábico e é referida no texto como Fig., mesmo se referir a mais de uma figura. As fotografias e desenhos com alta qualidade em formato jpg, devem ser também enviadas, em um arquivo zipado, no campo próprio de submissão. Nota:
Toda tabela e/ou figura que já tenha sido publicada deve conter, abaixo da legenda, informação sobre a fonte (autor, autorização de uso, data) e a correspondente referência deve figurar nas Referências.
As tabelas e figuras devem preferencialmente, ser inseridas no texto no parágrafo seguinte à sua primeira citação.
Discussão. Discutir somente os resultados obtidos no trabalho. (Obs.: As seções Resultados e Discussão poderão ser apresentadas em conjunto a juízo do autor, sem prejudicar qualquer das partes).
Conclusões. As conclusões devem apoiar-se nos resultados da pesquisa executada. Agradecimentos. Não obrigatório. Devem ser concisamente expressados. Referências. As referências devem ser relacionadas em ordem alfabética. Evitar
referenciar livros e teses. Dar preferência a artigos publicados em revistas nacionais e internacionais, indexadas. São adotadas as normas ABNT/NBR-6023 de 2002, adaptadas conforme exemplos:
Como referenciar:
1. Citações no texto Citações no texto deverão ser feitas de acordo com ABNT/NBR 10520 de
2002. A indicação da fonte entre parênteses sucede à citação para evitar interrupção na sequência do texto, conforme exemplos:
autoria única: (Silva, 1971) ou Silva (1971); (Anuário..., 1987/88) ou Anuário... (1987/88)
dois autores: (Lopes e Moreno, 1974) ou Lopes e Moreno (1974) mais de dois autores: (Ferguson et al., 1979) ou Ferguson et al. (1979) mais de um artigo citado: Dunne (1967); Silva (1971); Ferguson et al.
(1979) ou (Dunne, 1967; Silva, 1971; Ferguson et al., 1979), sempre em ordem cronológica ascendente e alfabética de autores para artigos do mesmo ano.
Citação de citação. Todo esforço deve ser empreendido para se consultar o
documento original. Em situações excepcionais pode-se reproduzir a informação já citada por outros autores. No texto, citar o sobrenome do autor do documento não consultado com o ano de publicação, seguido da expressão citado por e o sobrenome do autor e ano do documento consultado. Nas Referências, deve-se incluir apenas a fonte consultada.
Comunicação pessoal. Não fazem parte das Referências. Na citação coloca-se o sobrenome do autor, a data da comunicação, nome da Instituição à qual o autor é vinculado.
2. Periódicos (até 4 autores, citar todos. Acima de 4 autores citar 3 autores et al.):
ANUÁRIO ESTATÍSTICO DO BRASIL. v.48, p.351, 1987-88.
FERGUSON, J.A.; REEVES, W.C.; HARDY, J.L. Studies on immunity to alphaviruses in foals. Am. J. Vet. Res., v.40, p.5-10, 1979.
HOLENWEGER, J.A.; TAGLE, R.; WASERMAN, A. et al. Anestesia general del canino. Not. Med. Vet., n.1, p.13-20, 1984.
3. Publicação avulsa (até 4 autores, citar todos. Acima de 4 autores citar 3 autores et al.):
DUNNE, H.W. (Ed). Enfermedades del cerdo. México: UTEHA, 1967. 981p.
LOPES, C.A.M.; MORENO, G. Aspectos bacteriológicos de ostras, mariscos e mexilhões. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA, 14., 1974, São Paulo. Anais... São Paulo: [s.n.] 1974. p.97. (Resumo).
MORRIL, C.C. Infecciones por clostridios. In: DUNNE, H.W. (Ed). Enfermedades del cerdo. México: UTEHA, 1967. p.400-415.
NUTRIENT requirements of swine. 6.ed. Washington: National Academy of Sciences, 1968. 69p.
SOUZA, C.F.A. Produtividade, qualidade e rendimentos de carcaça e de carne em bovinos de corte. 1999. 44f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte.
4. Documentos eletrônicos (até 4 autores, citar todos. Acima de 4 autores citar 3 autores et al.):
QUALITY food from animals for a global market. Washington: Association of American Veterinary Medical College, 1995. Disponível em: <http://www. org/critca16.htm>. Acessado em: 27 abr. 2000.
JONHNSON, T. Indigenous people are now more cambative, organized. Miami Herald, 1994. Disponível em: <http://www.summit.fiu.edu/ MiamiHerld-Summit-RelatedArticles/>. Acessado em: 5 dez. 1994.
Nota: Artigos que não estejam rigorosamente dentro das normas acima não serão aceitos
para avaliação. O Sistema reconhece, automaticamente, como “Desistência do Autor” artigos em
diligência ou “Aguardando diligência do autor”, que não tenha sido respondido no prazo dado pelo Sistema.
Taxas de submissão e de publicação:
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Taxa de publicação. A taxa de publicação de R$70,00, por página impressa em preto e R$220,00 por página impressa em cores será cobrada do autor indicado para correspondência, por ocasião da prova final do artigo. A taxa de publicação deverá ser paga por meio de boleto bancário emitido pelo sistema eletrônico de submissão de artigos. Ao solicitar o boleto bancário, o autor informará os dados para emissão da nota fiscal.
Recursos e diligências:
No caso de o autor encaminhar resposta a diligências solicitadas pelo ABMVZ, ou documento de recurso, o mesmo deverá constar como a(s) primeira(s) página(s) do texto do artigo somente na versão em Word.
No caso de artigo não aceito, se o autor julgar pertinente encaminhar recurso, o mesmo deve ser feito pelo e-mail [email protected].
