Identificação e Diagnostico De Trichomonas Vaginalis

8/18/2019 Identificação e Diagnostico De Trichomonas Vaginalis

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10/03/2016 C apítulo 12 - Identi ficação e D iagnostico de T richom onas vaginal is

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Capítulo 12 - Identificação e Diagnóstico deTrichomonas vaginalis

Trichomonas vaginalis é o patógeno mais freqüentemente encontrado nas doenças sexualmente tranmissíveis. Estima-se que 3milhões de mulheres nos EUA e 180 milhões no mundo são infetadas anualmente (Honigberg, 1978, 1989), o que corresponde 1

/ 3 de todas as vaginites diagnosticadas. Apesar de ter sido a doença caracterizada e o protozoário descrito em 1836 por Donné,o diagnóstico clínico e laboratorial da tricomonose, especialmente no homem, continua apresentando inúmeras dificuldades. Um

diagnóstico clínico diferencial dessa doença, tanto no homem como na mulher, dificilmente poderá ser realizado através desintomas e sinais específicos. A investigação laboratorial é essencial na diagnose dessa patogenia, permitindo, também,diferenciar a tricomonose de outras doenças sexualmente transmissíveis.

O tratamento da tricomonose específico é eficiente. Por isso, tomam-se importantes a identificação e o tratamento das pessoasinfectadas, evitando assim a transmissão sexual do parasita (Gardner & Culberson, 1989; Lossick, 1989).

Colheita da AmostraOrientação do Paciente

Homem

Para que os procedimentos de diagnóstico tenham sucesso, os homens deverão comparecer ao local da coleta, pela manhã, semterem urinado no dia e nem tomado qualquer medicamento tricomonicida há mais de 15 dias (De Carli & Machado, 1973).

Mulher

As mulheres não deverão realizar a higiene vaginal, durante um período de 18 a 24 horas antes da coleta do material, e nãodevem ter feito uso de medicamentos tricomonicidas, tanto (geléias e cremes) como orais, há mais de 15 dias.

Amostra e ColheitaHomem

O material uretral é colhido com uma alça de platina ou com de algodão não absorvente ou de poliéster (Oates, Selwyn àBreach, 1971; MaeMillan, 1989). O organismo é mais facilmente encontrado no sêmen do que na urina ou em esfregaçosuretrais. Uma amostra fresca poderá ser obtida pela. masturbação em um recipiente limpo e estéril (MaeMillan, 1989).Também, deve ser examinado o sedimento centrifugado (600 x g por 5 min) dos primeiros 20 ml da urina matinal. A secreçãoprostática e o material subprepucial são coletados com um swab molhado em solução salina isotônica (0, 15 M) tépida.

Solução Salina Isotônica (0, 15 M)

Cloreto de sódio (NaCI) 8.767 gÁgua destilada-deionizada 1.000 ml

Dissolver o NaCI em uma pequena quantidade de água, completando após o volume.

Mulher

A vagina é o local mais facilmente infectado e os tricomonas são mais abundantes durante os primeiros dias após amenstruação. O material é usualmente coletado na vagina com swab de algodão não absorvente, com o auxilio de um espéculonão lubrificado. Embora a quantidade de exsudato absorvido possa ser pequena; os melhores resultados são obtidos com swabde poliéster. Apesar de o trato urinário baixo poder ser, raramente, colonizado pelo T. vaginalis, o exame da urina ou de

esfregaços uretrais não é indicado para a pesquisa do protozoário, exceto em mulheres com sintomas de infecção urinária.Quando houver sinais clínicos, deverão ser examinadas a uretra, as grandes glândulas vestibulares e as parauretrais (Robertsonet al., 1969). O período mais favorável para coletar o fluido vaginal do saco posterior, quando o diagnóstico apresentadificuldades, é entre o quarto e o quinto dia pós-menstrual. Deverão ser colhidos, sempre, dois swabs de cada paciente parafacilitar os exames direto e cultural.

Maltose (C 12H22O11) (DIFCO) 5 gL-cisteína, cloreto (C3H7NO2S.HCI) 1 gÁcido ascórbico (C6H8O6) 0,2 gHidrogenofosfato dipotássico (K2HPO4) 0,8 gDiidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) 0,8 gÁgar (Difco Bacto) 0,5 gÁgua destilada-deionizada1 ( MQP ) 900 ml

pH 6,0

- Dissolver os sais tampões em 600 ml de água ( MQP )1. Acrescentar e dissolver os ingredientes remanescentes na ordemapresentada, com exclusão do ágar; ajustar o pH em 6,0 com solução de NaOH 1N e adicionar o ágar. Para outros tricomonasestabelecer o pH entre 6,8 e 7,0. Distribuir nos volumes requeridos e autoclavar (121°C por 15 min). Antes do uso, suplementarcom 10% (v/v) de soro de cavalo ou de bovino, estéril e inativado (56ºC por 30 min). Após, acrescentar 1.000 UI/ml depenicilina G potássica e 1 mg/ml de sulfato de estreptomicina. Incubar o meio completo durante a noite, a 37ºC, para teste de


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esterilidade. Armazenar o meio completo à temperatura de 4-5ºC até 10 dias. Diamond (1957. 1983) recomenda suplementar omeio com 10% de soro de ovelha ou bovino. Em nosso laboratório obtivemos excelentes resultados com soro de cavalo oubovino a 10%.

Meio STS (Simplified-Trypticase-Serum)(Kupferberg, Johnson & Sprince, 1948)

Trypticase (BBL) 20 gL-cisteina, cloreto (C3H7NO25.HCL) 1,5 gMaltose (C12H22O11 )(DIFCO) 1 gÁgar (Difco Bacto) 1 gÁgua destilada-deionizada (MQP) 950 ml

pH 6,0

- Dissolver os componentes em água ( MQP ) e ajustar o pH em 6,0 com NaOH IN ou HCI IN. Adicionar o ágar e aquecer embanho de água até a completa dissolução, se necessário acrescentar 0,6 ml de azul-de-metileno a 0,5 % (m/v), como indicadorde redução. Ajustar o volume e distribuir nas quantidades requeridas e autoclavar (121°C por 15 min). Antes do uso,suplementar com 10% (v/v) de soro de cavalo ou bovino, estéril e inativado (56°C por 30 min). Após, acrescentar 1.000 Ul /m1 de penicilina G potássica e 1 mg/ml de sulfato de estreptomicina. Incubar o meio completo, durante a noite, a 37ºC, parateste de esterilidade. Arma zenar o meio completo à temperatura de 4-5°C até 10 dias. O ágar nesse meio é essencial, nãodevendo ser omitido (De Carli & Machado, 1973).

Meio de Amies (1967)

Cloreto de sódio (NaCI) 3,00 gCloreto de potássio (KCI) 0,20 gCloreto de cálcio (CaCl2). 0,10 g

Cloreto de magnésio (MgCl2) 0,10 gDiidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) 0,20 gHidrogenofosfato dissódico anidro (Na2HPO4) 1,15 gTioglicolato de sódio 1,00 gCarvão, pó 10,0 gÁgar (Difco) 4,0 gÁgua destilada-deionizada 1.000 ml

pH 7,4

Preparação e Colheita

1. Dissolver os componentes em 1.000 ml de água tépida.2. Distribuir o meio em tubos com tampa de rosca (screw-capped) 10 x 10 mm, Pyrex nº 9825, na razão de 7 ml por tubo.

3. Fechar os tubos e autoclavar (121°C por 15 min).4. Antes da solidificação do carvão, agitar e inverter os tubos, a fim de obter uma perfeita homogeneização. Reapertar astampas, se necessário.5. Usar swabs estéreis e secos, de algodão ou de poliéster, previamente mergulhados na solução tampão de fosfato de SörensenpH 7,4 (ver Apêndice 1).6. Os swabs são introduzidos no meio de transporte até a metade de seu tamanho. Os tubos são fechados hermeticamente emantidos sob refrigeração (4-5°C) até o momento do exame microscópico e da inoculação nos meios de cultura.

Permanente

A solução do fixador APV preserva os microrganismos fixados sem que haja alterações na sua morfologia, estando assim essesorganismos preparados para serem corados pelos métodos de Leishman, Giemsa, e pela hematoxilina férrica, segundoHeidenhain. Os protozoários e o sedimento de cultura fixados com o fixador APV podem ser armazenados por meses ou anospara serem usados como material de referência e/ou para o ensino. O fixador APV mantém-se em condições satisfatórias para ouso, por um período de 6 meses a 1 ano, enquanto permanecer em recipiente de vidro ou de plástico opaco, hermeticamentefechado (De Carli, 1992) (ver Capítulo 1).

Exame MicroscópicoO exame microscópico convencional de preparações a fresco de esfregaços fixados e corados, junto com os métodos culturais, éo procedimento laboratorial mais comumente empregado no diagnóstico da tricomonose urogenital. Apesar de o examemicroscópico direto do líquido prostático e do sedimento urinário não apresentar problemas na sua observação, a densidade dosleucócitos polimorfonucleares e as células epiteliais do exsudato vaginal tendem a dificultar e a obscurecer a pesquisa doprotozoário, principalmente a visualização dos movimentos dos flagelos ( MacMillan, 1989). O diagnóstico da tricomonose,tradicionalmente, depende da observação microscópica do protozoário móvel, através do exame direto de esfregaços a frescocom auxilio da microscopia de campo claro e/ou de campo escuro e/ou de contraste de fase, como também pela microscopia deesfregaços fixados e corados (Honigberg, 1978). Esses métodos requerem o mínimo de equipamento e são específicos para apesquisa desse protozoário. Quando esse estudo apresentar resultados negativos, ele deve ser complementado pelo examecultural (Petru & Jirovec, 1968; Honigberg, 1978; MacMillan, 1989).

Exame Direto a Fresco Preparações Não Coradas

A microscopia da secreção vaginal ou cervical dos exsudatos uretrais e do liquido prostático diluídos em solução salina isotônica(0, 15 M) tépida (ver p. 161) é o exame de rotina usual para a identificação do flagelado (Jirovec & Petrú, 1968; Rothenberg et aL, 1976; Honigberg, 1978; Warton & Honigberg, 1979; Krieger, 1989; Honigberg & Brugerolle, 1989). Esse método tem umabaixa sensibilidade quando comparado com os métodos culturais (Rothemberg et al., 1976; Honigberg, 1978; Krieger, 1981,1989). O protozoário perde a sua mobilidade característica quando as preparações permanecem em temperatura ambiente fria,tornando-se, assim, necessária uma observação microscópica rápida. Por essa razão, os esfregaços salinos do exame pélvico de

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mulheres assintomáticas não são freqüentemente examinados logo após a colheita. O número de tricomonas por unidade devolume de exsudato vaginal varia de paciente para paciente, tomando-se necessária urna pesquisa cuidadosa e prolongada,quando poucos organismos estão presentes (MacMillan, 1989). As duchas vaginais baixam consideravelmente a sensibilidade dosesfregaços microscópicos a fresco, não ocorrendo o mesmo com os procedimentos culturais (Foust & Kraus, 1980). Robertson et al. (1969) descreveram um método de concentração (sedimento centrifugado) que aumentou a sensibilidade da pesquisa de T.vaginalis no exsudato vaginal. Inúmeros erros ocorrem no diagnóstico do flagelado em preparações a fresco (Perl, 1972). Nasinfecções discretas, o número de protozoários é tão pequeno que o exame pode ser considerado negativo. Por outro lado, osleucócitos podem estar em movimento devido às espiroquetas, às bactérias flageladas, aos espermatozóides e/ou às célulasciliadas aderidas a eles, simulando, assim, um tricomona (Jirovec & Petrú, 1968; Perl, 1972). Coutts, Silva-Insunza & Tallman(1959) recomendam a observação de esfregaços a fresco pela microscopia de campo escuro. Entretanto, Robertson et al. (1969)concluíram que a de contraste de fase do sedimento centrifugado do exsudato vaginal é mais sensível e mais precisa do que amicroscopia de campo claro no estudo das preparações frescas. Em montagens afresco, o flagelado mantém a sua mobilidade

porvárias horas, quando mantido à temperatura de 200 °C entre lamínula e lamínula selada com parafina. Temperaturas queexcedem a 440 °C matam imediatamente o parasita; por essa razão os esfregaços nunca deverão ser aquecidos na chama diretado bico de Bunsen. A pressão da lamínula inúmeras vezes causa mudanças na forma do organismo e, eventualmente, oprotozoário flagelado desenvolve formações semelhantes a pseudópodes (Perl, 1972).

Preparações Coradas

Com o objetivo de aumentar a sensibilidade do exame microscópico direto, vários corantes são adicionados às montagenssalinas. Apesar dos tricomonas não se corarem com: a safranina, o verde de malaquita, o azul-de-metileno e com o azul cresilbrilhante, os elementos celulares tomam os corantes e contrastam com os organismos vivos não corados; somente os flageladosmortos são corados intensamente (MacMillan, 1989; Petrú & Jirovec, 1968). Esses corantes, entretanto, não se têm mostradoconvincentes na melhoria do grau de identificação dos tricomonas nas secreções, e não devem ser recomendados para a rotinalaboratorial. Coutts & Silva-Insunza (1954) sugeriram a coloração vital com solução aquosa de fluoresceína adicionada àspreparações salinas para melhorar a pesquisa do parasita no material fresco. Barchet (1972) desenvolveu o método "vaginal indentification of pathogens" (VIP), para corar os tricomonas no material obtido de pacientes. Este procedimento de coloração

com o cristal violeta diluído no tampão de fosfato de Sörenson (pH 6,0), é especialmente útil quando os organismos estão empequeno número e são freqüentemente atípicos. A sensibilidade dos esfregaços microscópicos a fresco é geralmente baixa, masa especificidade é alta (Kean & Day, 1954; Feimberg & Whittington, 1957; MacCann, 1974; Mason, Super & Fripp. 1976;Rothenberg et al., 1976; Krieger et al., 1988).

Corante - "Vaginal Identidication of Pathogens" (VIP)

Reagentes

1. Cristal violeta, cristais (CI 42555)

2. Solução tampão de Sörensen (ver Apêndice 1)

Preparação das Soluções

1. Solução Estoque

Cristal violeta, cristais 200 mgSolução tampão de Sörensen, pH 6,0 100 ml

Dissolver o cristal violeta em 100 ml de solução tampão. Aquecer em banho de água a 600°C durante 2 horas. Filtrar em filtrobacteriológico Millipore. Armazenar sob refrigeração (4 a 5ºC), em frasco opaco hermeticamente fechado. Validade de 1 ano.

2. Corante

Solução estoque 10 mlSolução tampão de Sörensen, pH 6,0 40 ml

Misturar as soluções. Aquecer em banho de água a 60ºC durante 1 hora. Preparar o corante mensalmente.

Método

Colocar em uma lâmina duas gotas do corante VIP e igual volume exsudato. Cobrir com lamínula e examinar com objetiva depequeno aumento.

Características da Coloração

A coloração a fresco VIP é um acurado e eficiente método para o diagnóstico das vaginites. Os tricomonas móveis com atividadeintensa são facilmente diagnosticados, neste caso, a coloração não favorece o reconhecimento dos flagelados. A identificação édificultada diante de: organismos imóveis, pacientes submetidos a uma ducha recente, e terapêutica ineficiente. O efeito docorante entre os tricomonas móveis é variável. No entanto, nos menos ativos ou presumivelmente mortos o núcleo apresenta-secorado azul intenso.

Preparações Fixadas e Coradas

Devido às limitações do exame microscópico direto, uma variedade de métodos de coloração tem sido indicada para odiagnóstico do T. vaginalis no homem e na mulher. Os principais são: alaranjado de acridina (Ortoloni & Campanile, 1966;Levett, 1980; Greenwood & Kirk, 1981); Giemsa (Sorel, 1954; Lowe, 1954; Rothenbacher & Hitchcock, 1962; Mason, Super & Fripp, 1976; Levett, 1980); Leishman (Levett, 1980); Diff-Quik (Balson et al 1979; Levett, 1980); Fontana (Negesha,Anathakrishna & Solochama, 1970); Gram (Cree, 1968; Sobrepena, 1980); ácido periódico de Schiff (Rodriguez-Martinez et al.,1973); imunoperoxidase (Hayes, Kotcher, 1960; Bennett, Bailey & Gardner, 1980; Krieger et aL, 1985); hematoxilina férricasegundo Heidenhain (De Carli et aL, 1977). No entanto, poucos estudos foram realizados com o objetivo de comparar a cultura

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com as preparações fixadas e coradas. Teras & Kaarma (1969) recomendaram simultaneamente o emprego de vários examesmicroscópicos de preparações fixadas e coradas para a obtenção de melhores resultados. Em contraste com os outrosprocedimentos de coloração, a identificação de tricomonas pela técnica de Papanicolaou para esfregaços de secreções cervicais evaginais tem sido usada com muita freqüência (Krieger et aL, 1988), embora uma série de óbices e erros sejam atribuídos aodiagnóstico dos esfregaços citólogicos corados por essa técnica (Krieger et al., 1988).

Observação: No laboratório de Parasitologia da Faculdade de Farmácia, UFRGS, é usado com grande sucesso o método deGiemsa para a coloração dos tricomonas em exsudatos e de culturas.

Coloração de Giemsa

Reagentes, Preparação e Coloração da Amostra

Ver Capítulo 18

Preparação dos Esfregaços

Em uma lâmina de microscopia, misturar uma gota de solução salina isotônica (0, 15M) e uma pequena quantidade de exsudatoou sedimento de urina, e preparar um esfregaço. Esse procedimento também pode ser realizado com sedimento de culturas.Deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente.

Características da Coloração

O parasita flagelado apresenta o citoplasma corado do rosa ao violeta-escuro, mostrando a zona central mais clara. A membranaondulante e os flagelos coram-se de violeta-escuro.

Exame CulturalMuitos meios de cultura líquidos ou semi-sólidos têm sido descritos para o isolamento e manutenção axênica do T. vaginalis.Depois que foi possível cultivar amostras de tricomonas pela adição de penicilina e estreptornicina aos meios (Adler & Pulvertaft,1944; Johnson & Trussel, 1944; Magara, Amino & Yokouti, 1953; Jirovec & Petrú, 1968), o diagnóstico, o isolamento e amanutenção dos tricomonas tomaram-se fáceis e as culturas puderam ser padronizadas, facilitando o diagnóstico laboratorial datricomonose e o controle dos resultados da terapêutica. T. vaginalis é um organismo anaeróbio facultativo. Cresce perfeitamentebem na ausência de oxigênio em meios com faixa de pH compreendida entre 5,0 e 6,0 e em temperaturas entre 20 e 400°C.Todos os meios têm em comum os seguintes componentes: (1) nutrientes: extrato de fígado ou extrato de levedo, ou triptona,ou tripticase, ou peptona; (2) agentes de redução (potencial redox): cloreto de L-cisteína, ou tioglicolato de sódio; (3) fonte deenergia (carboidratos): glicose ou maltose; (4) sais tampões: fosfato (5) soro (1-20%) para a manutenção da anaerobiose(cavalo, ou bovino, ou bezerro): (6) estimulação da multiplicação celular: ácido ascórbico, ou ácido glutâmico, ou colina; (7)ágar (0,05-1 %) para a redução lenta da difusão do oxigênio e para a estabilização da suspensão de coles terol As culturas,axênicas são obtidas pela associação da penicilina (1.000UI / ml) e do sulfato de estreptornicina (1 mg/ml). Entretanto, no casode bactérias resistentes, a gentamicina MW-400 µg/ml), a floxacilina (500 µg/ml), a neomicina (500 µg/ml), e o cloranfenicol(250 µg / ml, poderão, também, ser utilizados associada ou isoladamente (Petrú & Jirovec, 1979; Linstead, 1989). O

micoplasma (Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum) é muito comum na vagina (Lowe. 1965), e poderá ser eliminadodas culturas pela adição de canamicina (100 µg / ml) ou de tilosina (60-120µg/ml). Os fungos também estão presentes nomaterial clínico, e são excluídos das culturas com a nistatina (50 U/ ml), com a anfotericina B (15 µg / ml) ou com o nitrato demiconazol (50-100 µg / ml) (Linstead, 1989). Apesar de muitos pesquisadores discutirem os méritos dos diferentes meios decultura, realmente não existem evidências absolutas se um meio é superior ao outro nos propósitos de diagnóstico. Váriosparasitologistas estudaram a capacidade dos meios em isolar o flagelado, entre os quais: Lowe (1965, 1972), Rayner (1968);Cox & Nicol (1973); Thomason et al. (1988); Gelbart et al. (1989), Schmid et al. (1989). Os principais meios de cultura usadossão: o de Johnson & Trussell (1943) (CPLM), o de Kupferberg, Johnson & Sprince (1948) (STS) e o de Diamond (1957) (TYM).Quando o meio é usado para o diagnóstico, o ágar é mantido. Porém, para a preparação de células em experimentos naBioquímica ou em Imunologia, o ágar pode ser suprimido.

Meio TYM (Trypticase-Yeast Extract-Maltose) (Diamond, 1957)

Tryptone (Difco) ou Trypticase (BBL) 20 gExtrato de levedo (Difco) 10 gMaltose (C

12H

22O

11) (DIFCO)

5 gL-cisteína, cloreto (C3H7NO2S.HCI) 1 gÁcido ascórbico (C6H8O6) 0,2 gHidrogenofosfato dipotássico (K2HPO4) 0,8 gDiidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) 0,8 gÁgar (Difco Bacto) 0,5 gÁgua destilada-deionizada1 ( MQP ) 900 ml

pH 6,0

- Dissolver os sais tampões em 600 ml de água ( MQP )1. Acrescentar e dissolver os ingredientes remanescentes na ordemapresentada, com exclusão do ágar; ajustar o pH em 6,0 com solução de NaOH 1N e adicionar o ágar. Para outros tricomonasestabelecer o pH entre 6,8 e 7,0. Distribuir nos volumes requeridos e autoclavar (121°C por 15 min). Antes do uso, suplementarcom 10% (v/v) de soro de cavalo ou de bovino, estéril e inativado (56ºC por 30 min). Após, acrescentar 1.000 UI/ml de

penicilina G potássica e 1 mg/ml de sulfato de estreptomicina. Incubar o meio completo durante a noite, a 370°C, para teste deesterilidade. Armazenar o meio completo à temperatura de 4-5ºC até 10 dias. Diamond (1957. 1983) recomenda suplementar omeio com 10% de soro de ovelha ou bovino. Em nosso laboratório obtivemos excelentes resultados com soro de cavalo oubovino a 10%.

Meio STS (Simplified-Trypticase-Serum)(Kupferberg, Johnson & Sprince, 1948)

Trypticase (BBL) 20 g

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L-cisteina, cloreto (C3H7NO25.HCL) 1,5 gMaltose (C 12H22O11 )(DIFCO) 1 gÁgar (Difco Bacto) 1 gÁgua destilada-deionizada (MQP) 950 ml

pH 6,0

- Dissolver os componentes em água ( MQP ) e ajustar o pH em 6,0 com NaOH IN ou HCI IN. Adicionar o ágar e aquecer embanho de água até a completa dissolução, se necessário acrescentar 0,6 ml de azul-de-metileno a 0,5 % (m/v), como indicadorde redução. Ajustar o volume e distribuir nas quantidades requeridas e autoclavar (121°C por 15 min). Antes do uso,suplementar com 10% (v/v) de soro de cavalo ou bovino, estéril e inativado (56°C por 30 min). Após, acrescentar 1.000 Ul /

m1 de penicilina G potássica e 1 mg/ml de sulfato de estreptomicina. Incubar o meio completo, durante a noite, a 37°C, parateste de esterilidade. Armazenar o meio completo à temperatura de 4-5°C até 10 dias. O ágar nesse meio é essencial, nãodevendo ser omitido (De Carli & Machado, 1973).

Meio CPLM (Cysteíne-Peptone-Liver Maltose) (Johnson & Trussel, 1943;Trussel & Johnson, 1945)

Peptona (Difco) 32 gÁgar (Difco Bacto) 1,6 gL-cisteína, cloreto (C3H7NO25.HCI) 2,4 gMaltose (C12H22O11 ) (DIFCO) 1,6 gInfusão de fígado (Difco Bacto)* 320 mlSolução de Ringer 960 ml

pH 6,0

Misturar a infusão de fígado e a solução de Ringer (ver Apêndice 1). Adicionar os outros componentes e dissolverindividualmente pela agitação e aquecimento em banho de água. Adicionar 0,7 ml de azul-de-metileno a 0,5 % (m/v). Ajustar opH em 6,0 com NaOH 1 N ou HCI 1 N. Autoclavar (121°C por 16 min), imediatamente antes do uso suplementar com 10%(v/v), de soro de cavalo ou bovino, estéril e inativado (56°C por 30 min), e acrescentar 1.000 UI/ml de penicilina G potássica e1 mg / ml de sulfato de estreptornicina. Incubar o meio completo, durante a noite, a 37°C, para teste de esterilidade.

1. Infuso de Fígado

Preparação

Bacto Liver, pó (Difco) 20 gÁgua destilada-deionizada (MQP) 330 ml

- Misturar. em um beaker, o Bacto Liver e a água (MQP). Aquecer durante 1 hora à temperatura de 50°C. Elevar a temperaturapara 80°C por 5 minutos, para coagular as proteínas. Deixar esfriar e filtrar.

Observações: No Laboratório de Parasitologia da Faculdade de Farmácia, UFRGS, é usado o meio de Diamond (1957) (TYM)acima descrito, suplementado com 10% (v/v) de soro de cavalo ou bovino. A canamicina (100 µg/ml) e a nistatina (50 U / mI)são adicionadas ao meio para os isolamentos nos exsudatos vaginais e, emprega se somente canamicina (100 µg/ml Para osisolamentos nas secreções uretrais de homens. O meio é distribuído em tubos com rosca (screw-capped) 15 x 180 mm, à razãode 9 ml por tubo. O meio é autoclavado (121ºC por 15 min) e incubado a 370 °C durante 48 horas para o teste de esterilidade.Após, é estocado à temperatura de 5°C até 10 dias. Imediatamente antes do uso é adicionado 1,0 ml de soro de cavalo oubovino não diluído, estéril e inativado ( 56°C por 30 min); penicilina G potássica (1.000 UI / ml) te sulfato de estreptornicina (1mg/ml). Os tubos são agitados a fim de obter uma perfeita homogeneização. permanecendo após 30 minutos à temperatura de37°C para estabilizar a temperatura do meio. As culturas são incubadas a 37°C e examinadas diariamente até 5 dias. Todas asinoculações são realizadas em condições de assepsia total.

InPouchTMTV - Um Novo Método de Cultura para o Diagnóstico da

Tricomonose UrogenitalO InPouchTM TV ,desenvolvido pela Biomed Diagnostics (Biomed Diagnosis, San Jose, Ca, USA) é um meio de cultura seletivopara o diagnóstico da tricomonose humana. Este novo método é simultaneamente um sistema de transporte e de cultivo doparasita. A bolsa é de plástico, construída com folhas finas, claras e transparentes. Cada bolsa é dividida em duas câmaras comformato em "V", as quais são separadas por um canal, que somente permite a passagem do meio entre elas, quandopressionadas. A câmara inferior contém 4 ml de meio seletivo, que é inibitório para leveduras e bactérias. O InPouchTM TV suprime, mas não elimina totalmente o crescimento das leveduras. Um pequeno volume do meio é deslocado sob pressão dacâmara inferior para a superior. O meio é composto pelos seguintes ingredientes: trypticase, proteose peptona, extrato delevedo, maltose e outros açúcares, aminoácidos, sais, antibióticos e antifúngicos; dissolvidos em solução salina tamponada comfosfatos. Um adaptador tipo grampo, colocado na parte superior da câmara, é usado para fechar a bolsa. A secreção vaginalcolhida com swab estéril. Amostras uretrais, e o sedimento de 15 ml de urina de homens também são usados como inóculo Osespécimes, após a colheita, são mistu rados ao meio na câmara superior (Figura 12-1 A). As amostras não devem serrefrigeradas ou congeladas. Um inóculo contendo de um a 10 organismos é suficiente para positivar o teste. Antes de seremintroduzidos os espécimes no meio de cultura da câmara inferior, a bolsa deve ser incubada na posição vertical, durante 30minutos a 37°C e, após, examinada ao microscópio com pequeno aumento (10x), buscando a presença de tricomonas. Esseprocedimento substitui o exame das preparações a fresco em solução salina isotônica (0, 15 M). Após, a mistura é pressionada eimpulsionada para dentro da câmara inferior e a parte superior da câmara é selada (Figura 12-1B). Depois da incubação, naposição vertical, 24 horas a 37°C, a parte inferior e o lado de junção da bolsa devem ser vigorosamente massageados. Essa açãoliberta os tricomonas presos ao meio. Uma armação de plástico, para facilitar a observação, é colocada sobre a parte inferior dabolsa antes do exame microscópico (Figura 12- 1C). Isso permite colocar a bolsa sobre a platina do microscópio e imobilizar omeio para facilitar o exame. Os organismos poderão ser concentrados, deixando a bolsa na posição vertical durante 15 minutos

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antes da observação microscópica. Os tricomonas são reunidos no fundo da câmara inferior. O adaptador de plástico colocadonesse local facilita a pesquisa. A observação microscópica deverá ser realizada com pequeno aumento e, se necessário, comaumento de 40x para confirmar o diagnóstico (Figura 12- 1 D). Os espécimes negativos deverão ser novamente incubados comleituras diárias até 5 dias. As culturas positivas poderão ser mantidas pela inoculação de 60 µl de cultura com bom crescimentopara uma nova bolsa. As subculturas se mantêm de 5 dias a 2 semanas. O meio não deve ser congelado. O InPouchTM TV deveser estocado na posição vertical, no escuro e à temperatura ambiente (15-25°C ). Borchardt & Smith, 1991, concluíram que o

InPouchTM TV oferece multas vantagens quando comparado com os outros procedimentos de rotina usados pelos laboratórios dediagnóstico-. A bolsa apresenta uma estabilidade de 6 meses à temperatura ambiente, e a versatilidade de poder ser usadacomo um meio de transporte e de cultura. Os. espécimes poderão ser enviados pelo Correio, mantendo os tricomonas viáveispor aproximadamente 1 semana. Somente são necessários um adaptador de plástico e um microscópio para a leitura. A cultura,sendo eliminada, assim, a preparação de lâminas. As mais importantes vantagens do InPouchTM TV são a sua eficácia, a

sensibilidade e a especificidade (De Carli, 1993).Notas

1 Água ultrapura, Sistema Milli-Q-PIus. Millipore [MQP])

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Identificação e Diagnostico De Trichomonas Vaginalis