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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBERÃO PRETO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA
MARCEL MONTELS TREVISANI
IL-17 no curso da infecção por Rhodococcus equi
Ribeirão Preto 2015
MARCEL MONTELS TREVISANI
IL-17 no curso da infecção por Rhodococcus equi
Tese apresentada ao curso de Pós-graduação em Imunologia Básica e Aplicada da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo, para a obtenção do grau de Doutor em Ciências – Área de concentração: Imunologia Básica e Aplicada. Orientador: Prof. Dra. Maria Cristina Roque Antunes Barreira
Ribeirão Preto 2015
FICHA CATALOGRÁFICA
Marcel Montels Trevisani
IL-17 no curso da infecção por Rhodococcus equi. Ribeirão
Preto, 2015.
112 p. : il. ; 30cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Imunologia Básica e
Aplicada.
Orientador: Roque-Barreira, Maria Cristina.
1. Rhodococcus equi. 2. IL-17. 3. Salmonella enterica Typhimurium.
4. Vacinas. 5. VAPs. 6. Potros.
Trabalho realizado no laboratório de Imunoquímica e Glicobiologia do Departamento
de Biologia Celular, Molecular e Bioagentes Patogênicos da Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo.
Apoio Financeiro: CAPES.
Dedico este trabalho . . .
À minha esposa Lilian, que esteve sempre presente, dando apoio e rezando pelo meu
sucesso, sendo um incentivo crucial nos momentos de decisões e frustrações. Obrigado pela
compreensão nos momentos de ausência, pela paciência, lealdade e amor.
Te amo muito . . . . . . . . .
Aos meus pais que sempre torceram e incentivaram para que eu alcançasse cada vez mais
os meus objetivos. Obrigado por me darem a benção da vida, pelos ensinamentos, apoio e incentivo
nos momentos de dificuldade.
Amo muito vocês . . . . . . . . .
A toda a minha família, pelo carinho e incentivo à busca de objetivos cada vez mais altos,
nos fazendo alcançar metas até então inimagináveis
Amo a todos . . . . . . . . .
A todos aqueles que criticam, pois,
“Prefiro os que me criticam, porque me corrigem,
aos que me elogiam, porque me corrompem.”
Santo Agostinho
Agradecimentos
Ao Dr. Sandro Gomes Soares, meu orientador novamente, registro aqui, minha eterna gratidão,
pela oportunidade de fazer parte novamente do grupo de pesquisa, pelos ensinamentos, conselhos,
paciência, disponibilidade e confiança.
Ao Thiago Aparecido da Silva (Tio desta Tese) pela grande ajuda e colaboração na obtenção e
interpretação de resultados.
À professora Dra. Maria Cristina Roque-Barreira pela disponibilidade do laboratório para a
realização deste trabalho.
Aos professores da banca pela disponibilidade e colaboração.
À Ana Cristine S. Ferreira e Rosangela C. P. Mesquita, pela ajuda e orientação aos assuntos
relacionados à secretaria.
À Maria Helena, pela indispensável ajuda na esterilização dos materiais.
À Érica Vendrusculo, pela amizade e auxílio com as questões burocráticas.
A todos os colegas de laboratório, Aline Sardinha, Aline Oliveira, Patrícia, Fausto, Mateus, Rafael,
Sandra, Lívia, Flávia, Ita, Camila pela gostosa e sempre prazerosa convivência diária.
A todos que direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.
A CAPES pelo apoio financeiro.
“A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original.”
Albert Einstein
8 RESUMO
RESUMO
TREVISANI, M. M. IL-17 no curso da infecção por Rhodococcus equi. 2015. 112f. Tese de Doutorado – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
Rhodococcus equi é a principal causa de broncopneumonia crônica em
potros e está emergindo como um patógeno oportunista em humanos,
especialmente em indivíduos imunocomprometidos. Progressos tem sido obtidos no
entendimento da patogênese da pneumonia induzida por R. equi e a resposta imune
do hospedeiro; particularmente o por quê dos potros serem susceptíveis e os adultos
permanecerem sadios. Há um consenso que a doença é regulada pelos fatores de
virulência do patógeno e pela susceptibilidade do hospedeiro. A imunidade em
potros depende provavelmente de ambos os componentes de imunidade celular e
humoral, mas há forte evidência para um papel parcialmente protetor dos anticorpos
na infecção por R. equi. Devido à sua natureza intracelular facultativa, os
mecanismos de imunidade celular parecem ter principal importância na resistência à
infecção por R. equi. No entanto, potros recém-nascidos exibem uma marcada
inabilidade de expressar o gene do IFN-γ e produzir sua proteína, sugerindo que os
potros nascem com uma inabilidade inerente de montar uma resposta imune celular
do tipo Th1, o que contribuiria para a sua susceptibilidade. Aqui, nós avaliamos a
produção de IL-17 no modelo murino de infecção por R. equi e sugerimos uma
hipótese mostrando o papel indireto dessa citocina na susceptibilidade à pneumonia
por R. equi.
9 ABSTRACT
ABSTRACT
TREVISANI, M. M. IL-17 no curso da infecção por Rhodococcus equi. 2015. 112f. Tese de Doutorado – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
Rhodococcus equi is a leading cause of chronic purulent bronchopneumonia
in foals and is emerging as a human opportunistic pathogen, especially in
immunocompromized hosts. Progress has been made into understanding the
pathogenesis of R. equi induced pneumonia and the host’s immune responses;
particularly why foals’ are susceptible, yet adult horses remain unaffected. There is a
consensus that the disease is regulated by the virulence of the pathogen and the
susceptibility of the host. Immunity to R. equi pneumonia in foals probably depends
on both the antibody and cell-mediated components of the immune system, but there
are strong evidence for a role partially protective of antibody in protection against R.
equi. Because of the facultative intracellular nature of R. equi, cell-mediated immune
mechanisms are thought to be of major importance in resistance to infection.
However, newborn foals exhibited a marked inability to express the IFN-γ gene and
produce IFN-γ protein, suggesting that foals are born with an inherent inability to
mount a Th1-based cell mediated immune response, which may contribute to their
susceptibility to R. equi infection. Here, we evaluated the production of IL-17 in
murine model of R. equi infection and suggested a hypothesis showing the indirect
role of IL-17 in the susceptibility to R. equi pneumonia.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Avaliação da cinética de infecção por Rhodococcus equi ........................ 44
Figura 2: Avaliação do antígeno de virulência contido no extrato de parede APTX
na produção de IL-17 e IFN- .............................................................................. 46/47
Figura 3: Avaliação da infecção em animais knockouts ..................................... 49/50
Figura 4: Avaliar a susceptibilidade a infecção utilizando camundongos knockouts do receptor Toll Like Receptor 2 ............................................................. 52
Figura 5: Avaliação do possível ligante do APTX in vitro pela produção de IL-17 e IFN-γ ......................................................................................................................... 54
Figura 6: Avaliação da ligação do APTX em esplenócitos pelo ensaio de binding .. 56
Figura 7: Avaliação da produção de IL-17 e do papel de linfócitos B na proteção induzida por Salmonella carreando a proteína vapG .......................................... 58/59
Figura 8: Avaliação da produção de IL-17 pós-imunização utilizando a linhagem vacinal de Salmonella carreando a proteína vapA ................................................... 61
LISTA DE ABREVIATURAS
- APTX: Antígeno total extraído da parede celular de R. equi – material rico em proteína vapA
- BHI: Caldo de Cérebro e Coração
- BSA: Albumina Sérica Bovina
- DO: Densidade Optica
- ELISA: Enzyme-linked immunosorbent Assay (Ensaio imuno-enzimático)
- GALT: Tecido Linfóide Associado ao Trato Gastrointestinal
- H2O2: Peróxido de Oxigênio (Água Oxigenada)
- IFN-: Interferon-gamma
- Ig: Imunoglobulina
- IL: Interleucina
- LB: Luria Broth
- NK: Células Natural killer
- NO: Óxido Nítrico
- PBS: Solução salina tamponada em fosfato
- PMSF: Fenilmetilsulfonilfluoride
- R. equi ATCC33701: cepa virulenta de Rhodococcus equi
- Th: Linfócito T auxiliar
- TLR: Toll Like Receptor
- TMB: 3, 3’5, 5’ tetrametilbenzidina
- TNF: Fator de Necrose Tumoral
- CFU: Colony-Forming Units (Unidades Formadoras de Colônia)
- PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells
- VAP: Virulence-Associated Protein (Proteína Associada à Virulência)
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 14
1 Rhodococcus equi .............................................................................................. 15
1.1 Morfologia e identificação bioquímica do Rhodococcus equi ...................... 17
1.2 Tratamento e profilaxia das infecções por R. equi ....................................... 18
1.3 Mecanismos de virulência ............................................................................ 19
1.4 Imunidade frente ao R. equi ........................................................................ 23
2. IL-17 .................................................................................................................. 28
OBJETIVOS .............................................................................................................. 31
MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................ 33
1 Animais ............................................................................................................... 34
2 Linhagens bacterianas ........................................................................................ 34
3 Cultivo e preparo de S. enterica Typhimurium contendo os plasmídeos pYA3137, pYA3137vapA ou pYA3137vapG .......................................................... 35
4 Cultivo e preparo de suspensões de R. equi para infecção de camundongos ........................................................................................................ 35
5 Obtenção da fração antigênica APTX ................................................................. 36
5.1 Cultivo e preparo da cepa virulenta de R. equi ............................................ 36
5.2 Extração de antígeno da parede de R. equi virulento .................................. 36
6 Imunização de camundongos com as linhagens vacinais de S. enterica Typhimurium .......................................................................................................... 37
7 Prepara o da suspens o de c lulas espl nicas de camundongos ................... 37
8 Biotinilação de proteínas para ensaio de binding .............................................. 38
9 n lise por citometria de fluxo da liga o do PT superf cie de c lulas espl nicas ................................................................................................. 38
10 Dosagem de citocinas ...................................................................................... 39
10.1 Dosagem de IFN-γ ..................................................................................... 39
10.2 Dosagem de IL-17 ...................................................................................... 39
11 Dosagem de citocinas nos órgãos de camundongos imunizados, imunizados-desafiados e infectados ..................................................................... 40
12 Análise da expressão de fator de transcrição t-bet .......................................... 40
13 Análise estatística ............................................................................................ 41
RESULTADOS .......................................................................................................... 42
1 Avaliação da cinética de infecção por Rhodococcus equi ................................. 43
2 Avaliação da capacidade do APTX em estimular a produção de IL-17 e
IFN- em células esplênicas ................................................................................. 45
3 Avaliação da infecção em animais knockouts (KO) ........................................... 48
4 Avaliação da susceptibilidade à infecção utilizando camundongos knockouts do receptor Toll Like Receptor 2 ........................................................... 51
5 Determinação do possível ligante do APTX in vitro, responsável pela produção de IL-17 e IFN-γ. .................................................................................... 53
6 Avaliação da ligação do APTX em esplenócitos pelo ensaio de binding ............ 55
7 Avaliação da produção de IL-17 em animais imunizados com linhagem vacinal de Salmonella carreando a proteína vapG ................................................ 57
8 Avaliação da produção de IL-17 em animais imunizados com linhagem vacinal de Salmonella carreando a proteína vapA ................................................. 60
DISCUSSÃO ............................................................................................................. 62
CONCLUSÕES ......................................................................................................... 70
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 72
ANEXOS .................................................................................................................... 88
Manuscrito ............................................................................................................. 97
Introdução
15 Introdução
1. Rhodococcus equi
O Rhodococcus equi foi descrito pela primeira vez em 1923 por Magnusson
que o classificou como Corynebacterium equi, baseado em isolados de pulmão de
potros com pneumonia piogranulomatosa (Magnusson, 1923). Em 1977 a cepa foi
reclassificada como Rhodococcus equi (Goodfellow & Alderson, 1977) baseado em
marcadores fenotípicos de cultura celular de gêneros já descritos na época e
baseando-se em uma análise taxonômica comparativa. Ainda há muita discussão
em torno da classificação dessa bactéria. Recentemente, Jones et al. (2013a)
estudaram 129 linhagens de Rhodococcus e com base em testes fenotípicos e
análise da sequência do gene 16S rRNA chegaram a conclusão que a distancia
filogenética entre a espécie Rhodococcus equi e os demais Rhodococcus é grande o
suficiente para a sua reclassificação como um novo gênero, chamado Prescottia
com Prescottia equi denominando a espécie. Meses depois, os autores propuseram
a mudança do nome do gênero para Prescottella em função de decisão do Comitê
Internacional de Sistemática de Procariotos que impede o uso de nomes idênticos de
gêneros no Código Botânico e Código Zoológico (Jones et al., 2013b). Essa decisão
tornou o nome Prescottia ilegítimo, uma vez que há um gênero de orquídea com o
mesmo nome. No entanto, essa classificação ainda gera muita controvérsia na
comunidade científica, não sendo plenamente adotada pelos pesquisadores que
estudam essa espécie (Goodfellow et al., 2015).
Rhodococcus equi é descrito principalmente como um patógeno de potros
entre 1 e 3 meses de vida. Os sinais clínicos mais comuns incluem tosse, febre,
aumento da frequência e esforço respiratório, aumento da frequência cardíaca e
sons anormais das vias aéreas na traqueia e nos pulmões (Prescott, 1991; Giguère
et al., 2011). A progressão da pneumonia é insidiosa e lesões pulmonares podem
16 Introdução
ser bastante extensas antes do aparecimento dos sinais clínicos. Em raras ocasiões,
uma forma subaguda da doença pode ser reconhecida na qual potros previamente
saudáveis apresentam o início súbito de desconforto respiratório que progride
rapidamente à morte em menos de 48 horas (Giguère et al., 2011).
Os potros podem manifestar sinais extrapulmonares da infecção e essas
desordens podem ser encontradas concomitante com a pneumonia. As desordens
extrapulmonares mais frequentes são: diarreia, enterocolite ulcerativa, sinovite
presumivelmente imune-mediada, linfadenite ou abscesso intra-abdominal e uveíte
(Reuss et al., 2009).
R. equi é também um reconhecido patógeno oportunista em humanos
causando pneumonia cavitária e infecções sistêmicas muito semelhantes ao de
equinos (Topino et al., 2010), podendo-se isolar a bactéria de praticamente todos os
tecidos ou fluidos do organismo (revisto por Weinstock & Brown, 2002). O patógeno
é classificado como oportunista por estar principalmente associado a pacientes
imunocomprometidos, seja através de infecção, como é o caso de pacientes HIV
positivos; doenças, como o de pacientes com linfoma, insuficiência renal crônica,
câncer de pulmão, leucemia, diabetes mellitus; ou condicionados através de
tratamento a base de corticoterapia, quimioterapia, imunossupressores para o
tratamento de transplantes ou neoplasias (Weinstock & Brown, 2002; Basilio-de-
Oliveira et al., 2005). O primeiro caso de paciente infectado com R. equi descrito
ocorreu em 1967, onde um homem com hepatite foi tratado com imunossupressor
(Golub et al., 1967). A partir deste, mais de 200 outros casos foram descritos,
principalmente nos anos 80, com o crescimento logarítmico de indivíduos infectados
pelo vírus HIV (Kamboj et al., 2005). Infecção por R. equi pode ser identificada
erroneamente como infecção micobacteriana em humanos, atrasando o tratamento
17 Introdução
correto dos pacientes, causando recaídas e fatalidades, com taxas de mortalidade
de 50 a 55% em pacientes com HIV, 20 a 25% naqueles não-HIV com imunidade
comprometida e 11% em pacientes imunocompetentes (Kedlaya et al., 2001). Cepas
de R. equi com perfil plasmidial semelhante foram encontradas em isolados de
suínos e humanos, sugerindo que uma transmissão de origem alimentar poderia ser
considerada (Makrai et al., 2002, 2005, 2008).
A predominância de infecções pulmonares em potros sugere uma
transmissão por via aérea causada principalmente através da inalação de R. equi
virulento contido em solos contaminados com fezes, oriundas de potros infectados
(Takai et al., 1997, revisto por Giguère, 2011). O clima favorece a dispersão da cepa,
havendo um aumento do número de casos no verão. Esta estação do ano favorece a
multiplicação do microrganismo e a dispersão de partículas de poeira que beneficiam
sua inalação (Takai et al., 1997; Meijer & Prescott, 2004; Muscatello et al., 2007). O
R. equi é uma bactéria muito resistente a condições ambientais extremas (Benoit et
al., 2000 e 2002), o que explica o fato deste patógeno ser mais abundante no lugar
onde o homem cria cavalos por muitos anos (Wilson, 1997). O alto número de R.
equi virulento disperso no ambiente torna a doença endêmica (Takai et al., 1991;
Takai et al., 1997). A transmissão da pneumonia de potro para potro não está bem
documentada ainda, entretanto, é possível isolar o R. equi e comprovar a presença
de cepas viáveis exaladas pela respiração de potros doentes (Muscatello et al.,
2007).
1.1 Morfologia e identificação bioquímica do Rhodococcus equi
Rhodococcus equi é um microrganismo gram-positivo, aeróbico obrigatório,
variando da forma de bacilo à forma cocóide nas primeiras 4 horas, dependendo das
18 Introdução
condições de cultivo. Após 24 horas de cultivo em meio líquido ou em ágar sangue
assume somente a forma cocóide (Fuhrmann et al., 1997). Possui cápsula
polissacarídica e é parcialmente ácido resistente. As cepas de R. equi não possuem
flagelo (Prescott, 1991), mas algumas cepas possuem pili ou apêndices (Yanagawa
& Honda, 1976; Nordmann et al., 1994). São caracteristicamente mucóides,
irregulares, convalescentes, apresentando coloração róseo-salmão e amarelo após
uma semana de crescimento (Prescott, 1991). É caracterizada bioquimicamente
como catalase positiva, principalmente urease positiva e oxidase negativa com
temperatura de crescimento ótimo entre 30 e 37°C (Prescott, 1991). Requerem
nutrientes simples e obtém carbono de diferentes fontes (Prescott, 1991). Tem
predileção por lipídios como fonte de carbono, o que é comprovado por
sequenciamento onde foram identificados genes envolvidos no metabolismo de
lipídios e não sendo encontrados genes envolvidos com o transporte de açúcar
(Vazquez Boland et al., 2009).
1.2 Tratamento e profilaxia das infecções por R. equi
A contaminação com Rhodococcus equi está relacionada aos locais onde os
animais são mantidos ou manejados, portanto, o reconhecimento precoce da
pneumonia, isolamento e tratamento dos potros infectados, reduzem as perdas e
previne a disseminação de organismos virulentos. Outras medidas de controle
incluem a redução das partículas de poeira no ambiente dos potros por meio do
aguamento de passeios, remoção e compostagem de fezes, isolamento de potros
que retornaram de criações onde a doença é endêmica e exames cuidadosos e
regulares de potros anoréxicos, febris ou com tosse que evidenciem doenças
respiratórias (Prescott & Hoffman, 1993). Apesar desses cuidados, há evidências de
19 Introdução
que a doença ocorre primariamente em grandes fazendas com manejo sanitário
adequado. Assim, a ocorrência de R. equi não pode ser explicada simplesmente por
baixa higiene e manejo sub-ótimo (Cohen, 2014).
O principal tratamento empregado contra a rodococose é antibioticoterapia.
A administração de um macrolídeo em combinação com rifampicina tem sido o
tratamento padrão por mais de 30 anos. Nos primeiros 10 a 15 anos a eritromicina
tem sido o macrolídeo de escolha, mas nos anos recentes a azitromicina e a
claritromicina tem sido mais comumente usadas. Nos últimos anos, a co-
administração de rifampicina com macrolídeos tem sido questionada em relação à
sua capacidade de prevenir mutantes, assim sugere-se o desenvolvimento de
estudos clínicos de larga escala para avaliar a combinação de rifampicina e
macrolídeos no tratamento de potros infectados por R. equi (Cohen, 2014).
1.3 Mecanismos de virulência
A virulência do R. equi esta associado à sua capacidade de sobreviver e se
replicar no interior de macrófagos. R. equi resiste à defesa imune inata mediada por
macrófagos estabelecendo residência no meio intracelular do fagócito (Hondalus,
1997), por inibir a acidificação do fagolisossomo (Toyooka et al., 2005). Uma vez
dentro do vacúolo fagocítico, o Rhodococcus impede sua completa maturação e
fusão com o lisossomo por meio da perda de marcadores tais como catepsina D,
ácido β-glucuronidase e a bomba de próton-ATPase (Fernandez-Mora et al., 2005).
A doença progride e o parênquima pulmonar torna-se necrótico (Johnson et al.,
1983; Zink et al. 1986), e os brônquios e linfonodos mesentérico são afetados (Zink
et al., 1986; Yager, 1987).
20 Introdução
Os prováveis fatores de virulência do R. equi são: capsula polissacarídica
que inibe a fagocitose e sua subsequente lise no interior de macrófagos; produção
das enzimas fosfolipase C e colesterol oxidase, com ação membranolítica
combinada que pode ser letal para macrófagos entre outras células fagocíticas;
ácidos micólicos da parede celular; e produtos codificados pelo plasmídeo de
virulência 85-90Kb (Hondalus, 1997; Garton et al., 2002).
Somente certas linhagens de R. equi parecem ser capazes de produzir a
doença em potros. Estas linhagens são conhecidas como virulentas e possuem uma
ou mais cópias de um plasmídeo de virulência de aproximadamente 80-90 kb,
descrito inicialmente por Takai et al. (1993). Até o momento, 12 tipos de plasmídeos
de virulência têm sido reconhecidos com base em seu padrão de restrição à
endonucleases, alguns dos quais parecem ter especificidade geográfica (Takai et al.,
2001; Takai et al., 2003; Ribeiro et al., 2005).
O plasmídeo de virulência abriga uma ilha de patogenicidade que contém
genes necessários à sobrevivência intracelular e replicação, portanto à virulência. A
mais importante família de proteínas de virulência codificada por esta ilha são as
proteínas associadas à virulência (Vaps) (Muscatello, 2012). Dos nove genes vap já
identificados (vapA, vapC a vapI, pseudo-vapE), seis (vapA, vapC, vapD, vapE,
vapG e vapH) parecem codificar proteínas Vap totalmente funcionais (Takai et al.,
2000; Russel et al., 2004; Letek et al., 2008). A expressão de genes vap que
codificam para proteínas funcionais é upregulada quando o organismo está dentro
de macrófagos. A maioria dos vaps são regulados por temperatura, pH e nutrientes,
com ótima expressão ocorrendo sob condições ligeiramente ácidas, em
temperaturas próximas a 37oC e sob restrição de disponibilidade de ferro (Takai et
al., 1996; Byrne et al., 2001; Ren and Prescott, 2003). Segundo Benoit et al. (2002),
21 Introdução
a síntese da proteína vapA também pode ser aumentada em condições de estresse
oxidativo, pela exposição da bactéria a H2O2.
A função dos Vaps não é totalmente conhecida. No entanto, parece ter um
Vap que é essencial para a virulência em potros, uma lipoproteína de superfície de
15 a 17 KDa conhecida como proteína associada à virulência A (VapA). Cepas de R.
equi que possuem deleção do gene vapA exibem virulência atenuada (Jain et al.,
2003), Ambos, VapA e o plasmídeo de virulência são necessários para a virulência
em potros, sugerindo que há uma interação entre VapA e outras proteínas não-Vap
codificadas na patogênese da pneumonia causada por R. equi (Giguère et al.,
1999a).
Um número de genes codificados cromossomicamente tem sido implicado
na virulência. Estes incluem o gene isocitrato liase aceA, o gene nitrato redutase
narG, o gene que codifica a proteína de requerimento de alta temperatura A (HtrA) e
os genes que codificam os dois componentes do sistema de sinal de transdução, o
phoPR operon (Muscatello, 2012). Mutações nesses genes levam à completa
atenuação ou, no caso do phoPR operon, hipervirulência (Ren e Prescott, 2004; Wall
et al., 2005; Pei et al., 2007).
Jain et al. (2003) construíram um mutante de R. equi, no qual o gene vapA
foi deletado, tornando-o avirulento, já que este não conseguiu se replicar no interior
de macrófagos e foi rapidamente eliminado em comparação às cepas selvagens de
R. equi. Evidenciando assim, o papel da proteína vapA como um fator determinante
de virulência, porém, apenas o vapA não é suficiente para conferir virulência.
Determinantes de virulência adicionais como virR e orf8 também codificados pela
ilha de patogenicidade são responsáveis por regular proteínas que atuam na
22 Introdução
transcrição de vapA, atenuando o seu poder de sobreviver no interior de macrófagos
(Ren & Prescott, 2004; Russell et al., 2004).
Jacks et al. (2007) buscaram avaliar, além da expressão do gene vapA, os
demais genes funcionalmente conhecidos, e ficou demonstrado também o aumento
da expressão dos genes vapD e vapG in vivo, além de um aumento significativo na
expressão de vapG em relação aos demais genes vap quando realizado ensaio in
vitro. Estes achados foram confirmados por Monego et al. (2009), que avaliaram por
PCR multiplex, os genes associados à virulência. Para este estudo, foram obtidas
amostras de 108 animais de 6 fazendas com histórico de infecção por Rhodococcus
equi nas cidades de Bajé, São Borja e Foz do Iguaçu no sul do Brasil. Como
resultado, constatou-se que 100% das amostras colhidas de R. equi eram vapA,
vapD e vapG positivas, 86,6% apresentavam o gene vapF, 76,6% vapH, 43,3%
vapC, e 36,6% vapE. O perfil molecular mais frequente foi vapA, D, F, G e H estava
presente em 37,7% das cepas avaliadas.
Um plasmídeo de virulência intermediária codificando VapB, uma
lipoproteína de superfície celular de 20 KDa análoga ao VapA, é frequentemente
associada à isolados de R. equi recuperados de tecidos linfáticos cervicais de suínos
e humanos (a maioria pacientes imunocomprometidos) com pneumonia cavitária
(Makrai et al., 2002 e Ocampo-Sosa et al., 2007). Essas linhagens são classificadas
como de virulência intermediária com base em sua relativa patogenicidade em
modelo murino, com letalidade observada apos a administração de 107 unidades
formadoras de colônia, o que é 10 vezes maior que a dose necessária para as cepas
contendo a proteína VapA (Takai et al., 1995). Cepas intermediariamente virulentas
de R. equi não são encontradas em potros ou no seu ambiente (Letek et al., 2008). A
maioria dos pacientes humanos são infectados com as cepas intermediariamente
23 Introdução
virulentas, sugerindo o suíno, mais do que o equino, como ligação zoonótica (Takai
et al., 1995 e Ocampo-Sosa et al., 2007).
1.4 Imunidade frente ao R. equi
Tipicamente, a pneumonia por R. equi é vista em potros entre 1 a 3 meses,
podendo chegar a ser observada no máximo em animais com 6 meses de vida. Os
fatores imunológicos que predispõe potros nesta idade a desenvolver a rodococose
não estão claros, mas acredita-se que estejam relacionados à imaturidade do
sistema imune dos equinos ao nascer. Todos os componentes do sistema imune; a
imunidade inata, a imunidade humoral e a imunidade celular parecem ter um papel
na susceptibilidade à pneumonia por R. equi (Giguère et al., 1999b; Darrah et al.,
2004; Cauchard et al., 2004; Dawson et al., 2010)
Os potros quando nascem obtém todos os seus anticorpos por meio da
ingestão de colostro, devido a placenta epiteliocorial dos equinos. Esta transferência
passiva de imunidade tem um papel critico na resistência de potros a uma série de
agentes infecciosos e a falha da transferência passiva está associada com o
aumento da susceptibilidade a infecções (Kohn et al., 1989). Em potros, o declínio
dos níveis séricos de anticorpos maternos coincide com a típica idade na qual a
pneumonia por R. equi é diagnosticada, assim sugerindo um papel protetor dos
anticorpos para esta doença. Isto tem sido a base para os protocolos preventivos
envolvendo a administração de plasma hiperimune durante o período de maior risco
(Dawson et al., 2010).
Imunização passiva utilizando plasma hiperimune oriundo de animais adultos
infectados tem sido aplicada comercialmente. Há relatos conflitantes indicando
24 Introdução
proteção contra a infecção por Rhodococcus equi (Martens et al., 1989; Madigan et
al., 1991; Prescott et al., 1997) ou diminuição da severidade da doença sem a
diminuição da mortalidade dos potros (Caston et al., 2006), ou que o tratamento foi
completamente ineficiente (Hurley & Begg, 1995). As razões para esses resultados
discrepantes ainda não esta clara. As diferenças no desenho do estudo, as
avaliações de resultados clínicos e o tempo de administração podem explicar a
variabilidade da eficácia. A extrapolação de dados de infecção experimental para a
doença natural é complicada pelas variações de dose e idade dos animais utilizados.
Além disso, a variabilidade nos produtos de plasma e sua distribuição no potro
poderia afetar os resultados, conforme discutido por Sanz et al. (2014).
Foi demonstrado por Hooper et al. (2001) que a administração passiva de
imunoglobulinas purificadas, provenientes de cavalos imunizados com antígeno
enriquecido de vapA, protegeu potros contra o desafio experimental. Resultado
semelhante já tinha sido observado por Fernandez et al. (1997), que administraram
em camundongos IgG anti-vapA de éguas vacinadas com preparação enriquecida
de vapA e constataram seu efeito protetor. Possivelmente, este efeito protetor está
associado à capacidade dos anticorpos anti-vapA em opsonizar o R. equi (Becú et
al., 1997; Hooper et al., 2001). Baseado nisto, foram feitas tentativas de imunização
ativa de éguas (Madigan et al., 1991) ou de potros (Prescott et al., 1997) com
preparações enriquecidas com vapA, porém não levaram a geração de uma
resposta imune eficiente na prevenção da rodococose. Esta falha pode estar
relacionada à qualidade da preparação vacinal ou ao isotipo do anticorpo gerado
pela vacinação (Meijer & Prescott, 2004).
Até o momento, pouco se sabe sobre o papel protetor das subclasses de
IgG de equinos na infecção por R. equi. Assim, em cavalos adultos
25 Introdução
experimentalmente desafiados com R. equi, várias respostas de subclasses tem sido
relatadas, incluindo o aumento de IgGa VapA-específica (Hooper-McGrevy et al.,
2003), IgGb (Jacks et al., 2007b) ou ambos IgGa e IgGb (Lopez et al., 2002). Em
potros infectados intrabronquicamente houve um aumento de IgGa e IgGb Vapa-
específicas (Jacks et al., 2007b). Ao contrario, potros com ocorrência natural de
pneumonia por Rhodococcus produziram significante quantidades de IgG(T) VapA-
específicas (Hooper-McGrevy et al., 2003). Além disso, uma resposta IgG(T) VapA-
específica não foi vista após exposição natural de cavalos adultos ou potros sadios
(Hooper-McGrevy et al., 2003). No entanto, IgG(T) VapA-específica foi
significativamente maior quando um grande inoculo de R. equi foi usado para
desafiar os potros neonatos (Jacks and Giguère, 2010). Recentemente, IgG(T)
VapA-especifica foi mostrada ser um bom indicador de pneumonia por Rhodococcus
em potros neonatos desafiados usando uma dose baixa de R. equi, mimetizando a
infecção natural (Sanz et al., 2013; Sanz et al., 2015). Embora os estudos iniciais de
R. equi indicaram que IgG(T) não ativaria o sistema complemento e, por tanto, era
uma resposta indesejada à infecção (Hooper-McGrevy et al., 2003), agora foi
demonstrado que IgG(T) é a mais potente subclasse de IgG equina ativadora de
complemento (Lewis et al., 2008). Além disso, a imunização oral com R. equi
virulento que resultou na proteção dos potros foi associada com aumento de IgG(T)
Vap-específico (Hooper-McGrevy et al., 2005). Esse dado foi confirmado em nosso
estudo de prova de conceito da vacina de Salmonella atenuada carreando VapA
aplicada em potros infectados naturalmente (Porto et al., artigo em submissão).
Diversos estudos em camundongos têm confirmado que a imunidade celular
exerce papel central na proteção contra R. equi. Kanaly et al. (1993 e 1996)
demonstraram que camundongos BALB/c, ao serem infectados com R. equi
26 Introdução
virulento, desenvolveram uma resposta do padrão Th1 com progressivo controle da
infecção. Quando os animais foram tratados com anti-IFN-, estes não conseguiram
controlar a infecção e desenvolveram extensos granulomas pulmonares (Kanaly et
al., 1995). Estudos recentes têm ligado a secreção de IFN- à produção de
anticorpos opsonizantes capazes de induzir proteção em equinos (Lopez et al.,
2002). Camundongos imunodeficientes (NUDE e SCID) são susceptíveis à
pneumonia rodococócica, por incapacidade de realizar o “clearance” do R. equi no
pulmão (Yager et al., 1991). Nordmann et al. (1992) demonstraram que
camundongos BALB/c depletados de linfócitos T CD4+ e / ou T CD8+, quando
desafiados por via endovenosa com R. equi virulento, apresentaram um aumento
significativo do número de bactérias no baço e no fígado, em comparação a animais
não depletados. Desta forma, os autores concluíram que tanto células T CD4+,
quanto T CD8+ são de grande importância no clearance do R. equi.
Cavalos adultos desafiados com R. equi virulento são capazes de realizar
eficiente clearance pulmonar e apresentam um aumento do número de células T
CD4+ e T CD8+ produtoras de IFN- (Hines et al., 2003), seguido por um aumento
significativo da expressão de RNA mensageiro (RNAm) para a citocina IL-4 (Jacks et
al., 2007b). Há evidências de que a infecção de potros por R. equi resulte no
desenvolvimento de uma ineficiente resposta imunitária de padrão Th2 que acarreta
na morte do hospedeiro.
Os detalhes ainda não estão claros, mas é provável que a ilha de
patogenicidade tenha papel crucial na modulação da resposta do hospedeiro (Meijer
& Prescott, 2004). Boyd et al. (2003) e Breathnach et al. (2006) verificaram que
potros recém-nascidos são incapazes de produzir IFN-, e ainda produzem grande
quantidade de IL-10 (citocina de padrão Th2 e Treg com função anti-inflamatória),
27 Introdução
favorecendo a persistência do patógeno. No entanto, a expressão gênica e a
produção de IFN- aumentam gradualmente durante os primeiros seis meses de
vida, atingindo níveis semelhantes ao de cavalos adultos após um ano de vida.
Assim, os autores sugerem que essa incapacidade de potros recém-nascidos em
montar uma resposta imune Th1 eficiente possa ser responsável pela maior
susceptibilidade a patógenos intracelulares, como é o caso do R. equi. Porém, Jacks
et al. (2007b) demonstraram que potros infectados podem montar uma resposta
imune com secreção de IFN- de maneira semelhante ao de cavalos adultos quando
desafiados por via intrabronquial com R. equi virulento. Isto porque, quando avaliada
a razão de IFN- / IL-4, houve uma significativa alta de IFN- em relação a IL-4
quando comparado a animais adultos.
Mais recentemente, Sun et al. (2013) demonstraram que a susceptibilidade
de potros frente a infecção por R. equi está ligada a incapacidade de células T CD4+
e T CD8+ produzirem IFN- devido a metilação no promotor do gene. Além disso, a
demetilação do promotor está ligada à idade, mas pode ser acelerada por fatores
ambientais como antígenos bacterianos presentes no feno. Isso poderia explicar em
parte o sucesso da imunização de potros com vacina baseada no uso da Salmonella
atenuada como vetor (Porto et al., em submissão). Além disso, a vacina
desenvolvida pelo nosso grupo induz forte resposta de padrão Th1 demonstrada em
modelo murino (Oliveira et al., 2007), com proteção de longa duração e dependente
de uma resposta T CD4+ (Cardoso et al., 2013).
Citocinas como IL-12, IFN- e TNF-α induzem a produ o de óxido n trico
(NO), e este por sua vez é de extrema importância no combate à rodococose, pois
são os principais mediadores envolvido na defesa contra a infecção (Darrah et al.,
2000 e 2004). A citocina IL-12 produzida na fase inicial da resposta imune inata é
28 Introdução
responsável pela diferenciação e ativação de linfócitos T CD4+ naive em linfócitos T
CD4+ efetores que passarão a secretar IL-2, IFN- e linfotoxinas. Além de aumentar
a capacidade microbicida de macrófagos, o IFN- atua na ativação de linfócitos T
CD8+, importante na eliminação de células infectadas por patógenos intracelulares e
produção de citocinas.
Darrah et al. (2004) demonstraram que a infecção de macrófagos por R. equi
ocorre através da interação da bactéria com Toll Like Receptor 2 (TLR2), seguido de
rápida translocação do NF-κB para o núcleo, seguida pela produ o de NO e das
citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-12. Verificaram ainda, que a proteína vapA
purificada interage com TLR2, induzindo a maturação de células dendríticas e a
produção de citocinas por macrófagos. Diante disso, investigamos se a resposta
imune protetora induzida pela vacina baseada em Salmonella atenuada carreando o
antígeno VapA dependeria de TLR2, mas os resultados obtidos demonstram que
não há influência significativa desse receptor na resposta montada (Cardoso et al.,
2013).
2 IL-17
A IL-17, também conhecida como IL-17A, foi identificada e vem sendo
descrita a cerca de duas décadas como citocina produzidas por linfócitos T. É
membro de uma superfamília de citocinas composta ainda por IL-17B, C, D, E
(também conhecida como IL-25) e F (Kolls et al., 2004; Moseley et al., 2003). A IL-
17A é o membro mais estudado da família e está associada a muitas doenças
inflamatórias como artrite reumatoide, asma, lúpus (Kolls et al., 2004; Moseley et al.,
2003). IL-17 potencialmente regula a expressão de quimiocinas por células teciduais,
29 Introdução
e sua superexpressão no pulmão resulta em alto número de infiltrado leucocitário e
inflamação das vias aéreas (Park et al., 2005), enquanto a ausência de IL-17
compromete a barreira protetora contra infecções bacterianas (Ye et al., 2001). IL-17
é descrito também como um quimioatraente para neutrófilos em doenças
pneumológicas como a asma e artrite em humanos. IL-17 estimula o aumento da
expressão de IL-6 e IL-8, recrutando e ativando células inflamatórias durante a
infecção (Korn et al., 2007).
Em 2006, três estudos independentes descreveram que uma combinação de
citocinas imunoreguladoras, como TGF-β e próinflamatórias IL-6, são requeridas
para a polarização de uma célula Th0 murina em uma célula Th17 (Veldhoen et al.,
2006; Mangan et al., 2006; Bettelli et al., 2006). Após ativação, estas células passam
a secretar IL-23, responsável pela manutenção deste perfil e formação de células de
memória. Porém, quando IL-1β passa a ser secretado junto com IL-23, há uma
amplificação da sinalização para a diferenciação de Th0 em Th17 (revisto por Korn
et al., 2009).
Em potros, há pouca descrição sobre o papel de IL-17 no combate à
infecções. Liu et al. (2011) demonstraram que IL-17 é a citocina mais produzida por
células isoladas de lavado pulmonar de potros quando infectadas in vitro com R.
equi. Células mononucleares derivadas de medula óssea (PBMCs), quando
infectadas in vitro com R. equi, também produzem um elevado número de cópias de
RNAm para IL-17. Liu et al. (2009), observaram a presença de alta concentração de
RNAm para IL-23, responsável pela manutenção do perfil Th17, quando infectadas
in vitro por R. equi. A infecção experimental intrabronquial em potros (18 a 23 dias
de idade), utilizando em um grupo a cepa virulenta (103+) e em outro a cepa
avirulenta de R. equi (103-), causou em ambos os grupos, expressão similar de
30 Introdução
RNAm para IFN- e IL-12p35, enquanto apenas potros infectados com a cepa 103+
apresentaram um aumento significativo na expressão de RNAm para IL-1β, IL-10, IL-
12p40 e TNF-α nos tecidos pulmonares (Giguère et al., 1999b).
A presença de IL-17 e IL-23 induzidas por R. equi durante a infecção ainda
permanece uma incógnita sobre a quem esta citocina estaria beneficiando e quais
seriam os ligantes envolvidos nesta indução. O seu papel na infecção por R. equi
merece ser investigado, uma vez que células do perfil Th17 estão presentes nos
primeiros dias de vida dos potros, inclusive adquiridas via transferência materna por
meio do colostro (Perkins et al., 2014).
Objetivos
32 Objetivos
No presente trabalho objetivamos descrever os efeitos da presença de IL-17
na infecção por R. equi em modelo experimental murino, e os possíveis mecanismos
envolvidos na indução de IL-17 no contexto infeccioso.
1) Avaliar a cinética da carga bacteriana, dos níveis de IL-17 e IFN-γ em
camundongos C57BL/6 durante a infecção por R. equi.
2) Investigar a indução de IL-17 e IFN- por APTX em células esplênicas obtidas
de camundongos C57BL/6.
3) Mensurar a carga bacteriana de R. equi em animais knockouts (KOs) para IL-
23, IL-17R, IL-1R e IFN-.
4) Avaliar a susceptibilidade de camundongos knockouts do receptor Toll Like
Receptor 2 após a infecção por R. equi.
5) Quantificar a liberação de IL-17 e IFN- induzida por APTX em células
esplênicas oriundas de camundongos KOs para MyD88, TLR2 e IL-1R.
6) Determinar as populações celulares alvos de APTX e a contribuição de TLR2
na interação de APTX com a superfície celular.
Buscamos ainda finalizar o estudo da resposta imune protetora induzida por
vacina baseada em Salmonella enterica Typhimurium 3987 carreando a proteína
VapG. Para tanto, as seguintes etapas foram delineadas:
1) Avaliar a modulação de IL-17 em camundongos BALB/c oralmente imunizados
frente ao desafio com R. equi.
2) Avaliar a curva de sobrevivência de animais vacinados frente ao desafio com
uma dose letal.
3) Avaliar o papel da resposta imune humoral em animais vacinados com
Salmonella atenuada carreando o antígeno vapG.
Materiais e Métodos
34 Materiais e Métodos
1 Animais
Para os experimentos contidos neste trabalho, foram utilizados
camundongos isogênicos BALB/c fêmeas e C57BL/6 machos, entre 5 e 7 semanas
de idade, provenientes do biotério de criação de animais isogênicos da Faculdade de
medicina de Ribeirão Preto (USP). Animais knockouts para o receptor do tipo Toll-2
(TLR2), para MyD88, para os receptores das citocinas IL-17 e IL-1 (denominados IL-
17RKO e IL-1RKO), para as citocinas IL-23 e IFN-, e para a população de linfócitos
B, foram todos machos, entre 6 e 8 semanas de idade, obtidos do Centro de Criação
de Camundongos Especiais do Departamento de Genética da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto (USP).
2 Linhagens bacterianas
Em todos os ensaios de infecção e obtenção de APTX, foi utilizada a cepa
virulenta de Rhodococcus equi obtida junto a ATCC (American Type Culture
Collection) registrada como ATCC33701. Em alguns ensaios também foi utilizada
uma cepa de Rhodococcus equi derivada da cepa ATCC33701, deletada do
plasmídeo de virulência, gentilmente cedida pelo Dr. Shinji Takai.
Em todos os ensaios de imunização foi utilizada a linhagem bacteriana
Salmonella enterica Typhimurium 3987 transformada com o plasmídeo pYA3137,
gentilmente cedida pelo Dr. Roy Curtiss III, ou transformada com as construções
pYA3137vapA, desenvolvida no Laboratório de Imunoquímica e Glicobiologia, e
pYA3137vapG, gentilmente fornecida pela empresa Invent Biotecnologia Ltda.
Durante todo o trabalho a Salmonella enterica Typhimurium 3987
transformada com o plasmídeo pYA3137vapA foi denominada vapA+, a S. enterica
Typhimurium 3987 transformada com o plasmídeo pYA3137vapG foi denominada
35 Materiais e Métodos
vapG+ e a Salmonella enterica Typhimurium 3987 pYA3137 foi denominada como
controle.
3 Cultivo e preparo de S. enterica Typhimurium contendo os plasmídeos
pYA3137, pYA3137vapA ou pYA3137vapG
O cultivo e preparo das linhagens transformadas foi realizado conforme
descrito por Covone et al. (1998). Resumidamente, as linhagens de S. enterica
Typhimurium foram inoculadas em 10 mL de meio LB (Acumedia) acrescido de
glicose na concentração de 0,1% e incubadas sem agitação, por 12 horas a 37ºC.
Em seguida, 700 µL de cada cultura foram transferidas para 20 mL de meio LB com
a mesma modificação. Estas novas culturas foram incubadas a 37ºC sob agitação
constante (200 RPM) até atingir a densidade óptica (DO) de 0,7 a um comprimento
de onda de 600 nm. Posteriormente, as culturas foram centrifugadas por 15 minutos
a 2.000 g, os sobrenadantes foram desprezados e as células ressuspendidas em 20
mL de PBS. O procedimento foi repetido duas vezes. Foram feitas diluições seriadas
da última ressuspensão e as diluições dos tubos 10-7, 10-8 e 10-9 foram plaqueadas
em triplicata em ágar MacConkey para determinar o número de colônias (UFC/mL)
na cultura e, assim, confirmar o inoculo utilizado na imunização dos camundongos.
4 Cultivo e preparo de suspensões de R. equi para infecção de camundongos
Inicialmente foi feito um inoculo de R. equi em 250 mL de meio BHI (brain
heart infusion). Em seguida, a cultura foi mantida por 66 horas a 37ºC sob agitação a
100 rpm. Foram realizadas leituras de absorbância a 600 nm até atingir uma leitura
igual a 1,3. Obtida a absorbância desejada, o material foi centrifugado a 2.000 g, 4ºC
e lavado com PBS. O sedimento foi ressuspendido em 1 mL de PBS e a suspensão
36 Materiais e Métodos
de R. equi foi diluída de maneira seriada (10-1 a 10-9). Posteriormente, 100 µL das
diluições 10-7 a 10-9 foram semeadas em placas de petri contendo ágar BHI. Após 48
horas de incubação a 37ºC, foi feita a contagem das colônias e o número de
bactérias na amostra foi estimado.
5 Obtenção da fração antigênica APTX
5.1 Cultivo e preparo da cepa virulenta de R. equi
Seguiu-se o mesmo procedimento de cultivo adotado para a preparação dos
inóculos para o protocolo de desafio dos animais. Após a ressuspensão do
sedimento em 1 mL de PBS, o material foi dividido em alíquotas de 50 mg (peso
seco aproximado) que foram estocadas a -20ºC para posterior obtenção do antígeno
de parede de R. equi.
5.2 Extração de antígeno da parede de R. equi virulento
O APTX foi obtido através da incubação das alíquotas de 50 mg do
sedimento bacteriano com Triton X-114 (Sigma) a 2% em PBS 1 mM de PMSF
(Sigma), sob agitação por 12 horas a 4ºC. Após a incubação, o material foi
centrifugado a 12.000 g por 15 minutos a 4°C. O sobrenadante recuperado foi
incubado com sacarose 6% (Merck) por 10 minutos a 37ºC. O material foi
centrifugado novamente e o procedimento repetido por duas vezes. Em seguida o
sobrenadante foi desprezado e o sedimento incubado por uma noite a -20ºC com
acetona (Merck). O precipitado foi recuperado por centrifugação e em cada tubo, o
sedimento foi ressuspenso com 100µl de PBS estéril. Os volumes de todos os tubos
foram juntados e diluídos para um volume final de 10ml. Em seguida, o material foi
37 Materiais e Métodos
quantificado, aliquotado e estocado a -80ºC para posterior utilização nos estímulos in
vitro e dosagem de anticorpos.
6 Imunização de camundongos com as linhagens vacinais de S. enterica
Typhimurium
O protocolo de imunização adotado foi o inoculo nos dias 0 e 15 de
aproximadamente 1x109 UFC de Salmonella ressuspensos em 200 µL de PBS, dados
por via oral, com auxílio de uma agulha para gavagem. Em alguns protocolos foi
realizado o desafio experimental com cepa virulenta de R. equi no dia 30. Para tanto,
foram inoculados aproximadamente 4x106 UFC por via endovenosa, via plexo ocular.
De acordo com o protocolo experimental os grupos foram divididos em animais tratados
com a linhagem de Salmonella experimental (vapG+), tendo como controles negativos
animais imunizados com linhagem controle ou apenas tratados com PBS. Como
controles positivos foram utilizados animais imunizados com linhagem de Salmonella
vapA+. Os animais foram avaliados cinco dias apos o desafio com R. equi.
7
Ba os de camundongos naive das linhagens citadas no item 3.1 foram
removidos assepticamente e macerados em peneira de nylon com 40 m para
obten o de c lulas espl nicas. s c lulas obtidas foram destitu das de hem cias
pela adi o de 1 mL de tamp o de lise constitu do de partes de cloreto de am nio
a 0,16 e 1 parte de Tris- l a 0,17 , durante 4 minutos em gelo.
Posteriormente, as c lulas espl nicas foram lavadas duas vezes em P I 1640
suplementado com 10 . contagem celular foi realizada em c mara de
Neubauer e a viabilidade determinada por azul de Tripan, considerando-se para o
38 Materiais e Métodos
ensaio uma viabilidade superior a 90%. Após a distribuição das células em placa de
cultivo apropriada e o tratamento com os devidos estímulos, as células esplênicas
foram cultivadas em estufa com temperatura de 37°C e 5% CO2.
8. Biotinilação de proteínas para ensaio de binding.
Para a análise da ligação do APTX a superfície das células esplênicas,
500µg de APTX foram diluídos em 1 mL de tampão carbonato-bicarbonato 0,1 M, pH
9,6, e acrescido de 50µL da solução de biotina (1mg de Sulfo NHS-LC-Biotin (Pierce)
em 100 l de gua ultrapura . A solução foi incubada por 30 minutos a temperatura
ambiente. Após esta etapa, a amostra foi dialisada com PBS em sistema centricon.
Após as lavagens, a amostra foi concentrada para 1µg/µL e estocada em freezer -
20°C
por citom
.
intera o do APTX superf cie de c lulas espl nicas foi analisada
utilizando a proteína biotinilada preparada como descrito no item anterior. As células
esplênicas (5 x 105 c lulas foram fixadas PB - paraformalde do 3 por 20min e
tratadas com PB - licina 1 por 10min. m seguida, as c lulas foram lavadas com
PBS e incubadas com APTX biotinilado 20 g/mL por 40 minutos. epois, foi
realizada uma lavagem das c lulas com PB e, em seguida, adicionado
streptavidina- IT 5 g/mL). As células foram novamente incubadas por 40
minutos. Posteriormente, o excesso de streptavidina-FITC foi retirado com 2
lavagens de PBS. A marcação foi analisada por citometria de fluxo (Guava
EasyCyte, Guava Technologies, Millipore). Os resultados foram expressos em
39 Materiais e Métodos
porcentagem de c lulas positivas, intensidade m dia de fluoresc ncia I e
Mediana da Intensidade de Fluoresc ncia para a marca o da liga o PT e
populações celulares.
10 Dosagem de citocinas
A dosagem de citocinas foi realizada por ensaio imunoenzimático (ELISA)
utilizando o sistema OptEIATMSET: Mouse (Pharmingen, San Diego, CA, USA). As
concentrações de cada citocina nos sobrenadantes foram calculadas utilizando-se a
curva de regressão linear, a partir da curva padrão realizada para as respectivas
citocinas.
10.1 Dosagem de IFN-γ
Para a dosagem de IFN as placas de poliestireno de alta afinidade (Corning
Costar Europe Badhoevedorp, The Netherlands) foram sensibilizadas com 100 µL /
poço de anticorpo de captura anti-IFN, diluído 1:2.000 em tampão carbonato-
bicarbonato 0,1 M, pH 9,6, conforme instruções do fabricante, seguindo-se
incubação por 24 horas a 4ºC. A concentração inicial de IFN murino recombinante
foi de 2.000 pg / mL). O anticorpo anti-IFN biotinilado (anticorpo de detecção) foi
diluído 1:250.
10.2 Dosagens de IL-17
Para a dosagem de IL-17 as placas de poliestireno de alta afinidade
(Corning Costar Europe Badhoevedorp, The Netherlands) foram sensibilizadas com
100 µL / poço de anticorpo de captura anti-IL17A, diluído 1:250 em tampão fosfato
fornecido pelo kit, conforme instruções do fabricante, seguindo-se incubação por 24
40 Materiais e Métodos
horas a 4ºC. A concentração inicial de IL-17A murino recombinante foi de 500 (pg /
mL). O anticorpo anti-IL17A biotinilado (anticorpo de detecção) foi diluído 1:250.
11 Dosagem de citocinas nos órgãos de camundongos imunizados,
imunizados-desafiados e infectados.
Para a realização deste ensaio, grupos de 5 animais foram submetidos à
eutanásia nos dia 30 e 35 após a primeira imunização, de acordo com o protocolo
experimental. Os órgãos (baço e fígado) foram colhidos, pesados, diluídos em 1 mL
de PBS estéril contendo inibidor enzimático (Boehringer Mannheim) e divulsionados
em homogenizador elétrico (04728-00/OMNI Mixer Homogeneizer Sistems). O
homogeneizado obtido foi centrifugado a 1500g por 10 minutos a 4ºC e o
sobrenadante estocado a -20ºC para posterior dosagem de citocinas.
12 Análise da expressão de fator de transcrição t-bet
A extração de RNA total das células presentes no baço de animais
imunizados e/ou desafiados foi feita com Trizol Reagent (Invitrogen Life
Technologies, Carlsbad, CA, USA), segundo o protocolo do fabricante. A conversão
do RNA total em cDNA por transcrição reversa, foi realizada com volume final de
20L, para cada reação. Inicialmente, 2g de RNA e 20pmol de Oligo dT (Invitrogen
Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) foram incubados a 70°C por 5 minutos e, em
seguida, mantidos em gelo por mais 5 minutos. A seguir, adicionou-se às amostras
uma mistura contendo 0,5 M de dATP, dCTP, dGTP e dTTP (100mM dNTP Set,
PCR Grade, Invitrogen), 20 unidades de inibidor de RNAse (RNaseOut Ribonuclease
Inhibitor, Invitrogen), 1L de transcriptase reversa (ImProm-II Reverse Transcriptase,
41 Materiais e Métodos
Promega Corporation, Madison, WI, USA), 3mM de MgCl2 e 4L de tampão da
reação. A reação de RT foi realizada segundo instruções do fabricante.
As reações de PCR em Tempo Real foram preparadas em volume final de
20L, contendo 4L de cDNA, 0,5pmol de cada primer e 10L de YB reen™
PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). O sistema de PCR em
tempo real da Applied Biosystems 7300 foi utilizado para detectar e quantificar a
amplifica o do N com YB reen™. Os parâmetros de ciclagem termal
seguiram as instruções do fabricante. Todas as quantificações de t-bet foram
normalizadas em rela o ao controle endógeno β-actina).
13 Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão. Os valores foram
analisados por teste t com correção de Welch. Quando pertinente os dados foram
comparados usando o teste Bonferroni após análise de variância (ANOVA) com nível
de significância de p<0,05.
Resultados
43 Resultados
1 Avaliação da cinética de infecção por Rhodococcus equi.
Durante a infecção por R. equi virulento (cepa ATCC33701) e pela cepa
avirulenta (denominada P-, controle negativo), com inóculo de 1 x 108 bactérias/mL,
avaliamos a cinética da carga bacteriana e os níveis de IL-17 e IFN-γ no baço e
pulmão. Esses parâmetros foram mensurados diariamente durante 4 dias de
infecção. Observou-se no baço o aumento significativo da carga bacteriana,
principalmente nos primeiros dois dias de infecção, enquanto no pulmão há uma
elevação crescente em todo período analisado (Figuras 1A e B). A quantificação de
IL-17 e IFN-γ no baço demonstra claramente o antagonismo no perfil da curva de
citocinas no decorrer da infecção (Figuras 1C e E). Em relação à análise dessas
citocinas no pulmão, observamos que os níveis de IL-17 permanecem aumentados
nos 4 dias de infecção. No entanto, IFN-γ se eleva diariamente após a infecção
(Figuras 1D e F), sugerindo uma infecção tardia e/ou mais branda deste órgão.
Esses dados evidenciam a diferença nos níveis de IL-17 e IFN-γ no início da
infecção, sendo sugerido no baço a capacidade do IFN-γ em atuar como regulador
dos níveis de IL-17.
44 Resultados
Figura 1. Avaliação da cinética de infecção por Rhodococcus equi.
Camundongos C57BL/6 foram divididos em 2 grupos de 20 animais cada e
infectados por via endovenosa no dia 0 com 100 µL (1x108 CFU) de solução
contendo R. equi virulento (ATCC33701) ou com a cepa desprovida do plasmídio de
virulência (P-). Após a infecção, 5 animais de cada grupo foram submetidos a
eutanásia a cada dia, retirados o baço e o pulmão para contagem de bactérias por
CFU (A e B) e dosagem das citocinas IL-17A (C e D) e IFN- (E e F). Cada barra
representa a média ± erro padrão. *p<0,05 significante em relação ao dia 0
(ANOVA).
A
D
F E
C
B
45 Resultados
2 Avaliação da capacidade do APTX em estimular a produção de IL-17 e IFN-
em células esplênicas.
O próximo passo foi avaliar se o APTX, uma preparação rica no antígeno
VapA, o principal antígeno de virulência presente na parede do Rhodococcus equi, é
capaz de estimular a produção das citocinas IL-17 e IFN- em esplenócitos. Para
isso, coletamos células esplênicas de um camundongo C57BL/6 WT naive e
estimulamos ex vivo com APTX em diferentes concentrações e diferentes tempos
(12 horas, figuras 2 A e D; 24 horas, figura 2 B e E; 48 horas, figura 2 C e F).
Observamos aqui, que há um aumento significativo na produção de IL-17 com
estímulos de 1µg/mL em todos os períodos analisados. Notamos ainda, que o
estímulo para a produção de IFN-γ é muito mais acentuado, mesmo utilizando baixas
doses de APTX como estímulo.
46 Resultados
A B
C
47 Resultados
Figura 2. Avaliação do antígeno de virulência contido no extrato de parede APTX na
produção de IL-17 e IFN-. Células esplênicas obtidas de camundongos da linhagem
C57BL/6 naive, foram plaqueadas na concentração de 5 x 105 células/poço e
estimuladas com 0,125; 0,250; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 ou 8,0 g/mL de APTX. A placa foi
mantidaem estufa com temperatura de 37°C e 5% CO2 por 12 horas (A e D), 24
horas (B e E) e 48 horas (C e F). Após estes períodos, os sobrenadantes foram
coletados para dosagem de IL-17A e IFN-γ. Cada barra representa a média ± erro
padrão e o resultado é representativo de dois experimentos distintos. *p<0,01
significante em relação ao meio sem estímulo (ANOVA).
D E
F
48 Resultados
3 Avaliação da infecção em animais knockouts (KO).
Como descrito na introdução, potros são transitoriamente deficientes de IFN-
ao nascer devido a hipermetilação do seu promotor. Assim, utilizamos animais KO
para avaliar a produção de IL-17 durante a infecção, na ausência de interferon. A
carga bacteriana no baço (Figura 3A) e pulmão (Figura 3B) é significativamente
maior em animais KO para IFN- como esperado, e a produção de IL-17A é
significativamente maior nesses animais (Figura 3C), sugerindo que IL-17 não tem
um papel protetor na infecção por Rhodococcus.
Para confirmar essa observação, animais KO para o receptor de IL-17 e para
o receptor de IL-1 e citocina IL-23, ambas citocinas importantes para a polarização e
manutenção dos níveis de IL-17, foram infectados com Rhodococcus e a carga
bacteriana avaliada no baço (Figura 3D) e pulmão (3E), bem como os níveis de IL-17
(Figuras 3F e G) e IFN- (Figuras 3H e I). No baço, a carga bacteriana foi
significativamente menor, sugerindo que estes animais foram mais resistentes que o
grupo controle. Quando avaliado os níveis de citocinas, observamos uma diminuição
significativa de IL-17 com concomitante aumento dos níveis de interferon,
corroborando com o papel protetor do IFN-. No entanto, no pulmão observamos um
aumento significativo da carga bacteriana nos animais KO para IL-23 e receptor de
IL-17. Surpreendentemente, nesse órgão não houve redução dos níveis de IL-17A e
nem mesmo um aumento significativo de IFN-, o que pode explicar o perfil de
susceptibilidade.
49 Resultados
A B
C
50 Resultados
Figura 3 Avaliação da infecção em animais knockouts. Cinco camundongos
C57BL/6 WT ou knockouts para as citocinas IFN-γ e IL-23 ou para os receptores das
citocinas IL-1 e IL-17 foram inoculados por via endovenosa no dia 0 com cerca de 1
x 108 CFU / mL da cepa virulenta ATCC33701 de R. equi. Quatro dias após a
infecção experimental, os animais foram submetidos à eutanásia para a retirada do
baço e pulmão para contagem da carga bacteriana por CFU (A, B, D e E) e
dosagem de citocinas (IL-17, figuras C, F, G e IFN-γ, figuras H e I). Cada barra
representa a média ± erro padrão e o resultado é representativo de dois
experimentos distintos. *p<0,05 significante em relação aos grupos controle (teste t
utilizando o animal WT como referência nos ensaios de CFU e o animal não
infectado nos ensaios de citocinas).
D E
F G
I H
51 Resultados
4 Avaliação da susceptibilidade à infecção utilizando camundongos knockouts
do receptor Toll Like Receptor 2.
Como é amplamente aceito na literatura desde a descrição de Darrah et al.
(2004), o receptor do tipo Toll 2 é tido como o principal ligante de ativação do
sistema imune inato, responsável pelo reconhecimento e desencadeamento da
resposta imune protetora ao principal fator de virulência do R. equi (vapA).
Assim, buscamos avaliar a produção de IL-17 nesse modelo de
susceptibilidade. Para nossa surpresa, não houve um aumento significativo da carga
bacteriana em camundongos TLR2KO, tanto no baço (Figura 4A), quanto no pulmão
(Figura 4B). Além disso, observamos que em animais TLR2KO, após a infecção,
ocorre uma diminuição dos níveis de IL-17 no baço, de maneira semelhante a
ocorrida em animais WT (Figura 4C). Já no pulmão, não há um aumento significativo
na produção de IL-17 como a observada em animais WT (Figura 4D).
52 Resultados
Figura 4. Avaliar a susceptibilidade a infecção utilizando camundongos
knockouts do receptor Toll Like Receptor 2. Cinco camundongos C57BL/6 WT ou
knockouts para o receptor TLR2 foram inoculados por via endovenosa no dia 0 com
cerca de 1 x 108 UFC da cepa virulenta ATCC33701 de R. equi. Quatro dias após a
infecção experimental, os animais foram submetidos à eutanásia para a retirada do
baço e pulmão para contagem da carga bacteriana por CFU (A e B respectivamente)
e dosagem da citocina IL-17 no baço e pulmão (C e D respectivamente). Cada barra
representa a média ± erro padrão. *p<0,05 significante em relação ao grupo WT ou
comparado ao grupo controle, sem infecção (teste t).
A B
C
D
53 Resultados
5 Determinação do possível ligante do APTX in vitro, responsável pela
produção de IL-17 e IFN-γ.
Buscamos aqui, identificar o possível ligante do APTX vinculado à produção
de IL-17 e IFN-γ. Para isso, estimulamos células esplênicas ex vivo oriundas de
camundongos WT, TLR2KO e ainda oriundas MyD88KO para avaliarmos a possível
interação com outro receptor do tipo Toll, cuja cascata de ativação, recrute esta
proteína adaptadora MyD88. Estimulamos células esplênicas com 1µg/mL de APTX
durante 12 horas e mensuramos a quantidade de IL-17 (Figura 5A) e IFN-γ (Figura
5B) no sobrenadante. Como podemos observar, os resultados sugerem que o APTX
é capaz de estimular a produção de IL-17A na ausência de TLR2, mas não na
ausência de MyD88. Apesar dos resultados não serem conclusivos, APTX pode
estar estimulando outro receptor do tipo Toll para a indução das citocinas IL-17 e
IFN-γ.
54 Resultados
Figura 5 Avaliação do possível ligante do APTX in vitro pela produção de IL-17
e IFN-γ. Foram removidos assepticamente e macerados o baço de um camundongo
de cada linhagem; C57BL/6 naive WT, MyD88KO, TLR2KO e IL-1RKO. Cerca de 5 x
105 células foram utilizadas por poço e estimuladas com 1g/mL de APTX e mantido
em estufa com temperatura de 37°C e 5% CO2 por 12 horas. Após este período,
foram mensuradas a quantidade de IL-17A (A) e IFN-γ (B) dos sobrenadantes. Cada
barra representa a média ± erro padrão.
B
A
55 Resultados
6 Avaliação da ligação do APTX em esplenócitos pelo ensaio de binding.
Demonstramos nos resultados anteriores, que o APTX estimula a produção
de IL-17 e IFN-γ por esplenócitos murinos. Como TLR2 é descrito como o ligante
para o antígeno de virulência VapA, analisamos a capacidade do APTX biotinilado
ligar-se em esplenócitos de animais WT e TLR2KO. Corroborando com o resultado
anterior que sugere outros ligantes para a proteína VapA, esplenócitos de animais
TLR2KO foram marcados em proporções idênticas à de animais WT (Figura 6A),
mas com uma leve diminuição da intensidade de fluorescência (Figura 6B). Quando
analisou-se as subpopulações de células marcadas (Figura 6C), verificou-se que
aproximadamente 50% dos linfócitos B e macrófagos foram marcados, enquanto
para os linfócitos T CD4+ e T CD8+ a marcação foi de aproximadamente 25%.
56 Resultados
Figura 6. Avaliação da ligação do APTX em esplenócitos pelo ensaio de
binding. Esplenócitos de camundongos C57BL/6 WT ou knockouts para o receptor
TLR2 foram marcados com 20µg /mL de APTX biotinilado ligada a streptavidina-
IT 5 g/mL) Os resultados foram expressos em porcentagem total de células
positivas (A), intensidade m dia de fluoresc ncia I (B) para a marcação da
ligação APTX e análise das populações celulares marcadas (C). Cada barra
representa a média ± erro padrão. *p<0,05 significante em relação ao grupo WT
(teste t).
A
B
C
57 Resultados
7 Avaliação da produção de IL-17 em animais imunizados com linhagem
vacinal de Salmonella carreando a proteína vapG.
Resultados prévios (manuscrito em anexo), demonstraram que a imunização
de camundongos com vacina baseada em Salmonella atenuada carreando o
antígeno VapG foi capaz de diminuir significativamente a carga bacteriana frente ao
desafio experimental com R. equi, polarizando a resposta imune para um padrão
Th1 e com um aumento significativo da população total de linfócitos B. Como os
resultados aqui apresentados sugerem um papel negativo para a IL-17, buscamos
avaliar se a vacina é capaz de modular negativamente essa citocina. Os dados
demonstram que a construção vacinal usando o antígeno vapG é capaz de diminuir
a produção de IL-17 (Figura 7A), o que junto com o aumento de IFN- descrito
previamente, corrobora com o perfil protetor. Para confirmar se a vacina VapG é
capaz de proteger os animais, foi realizado um ensaio de sobrevivência com o
desafio com dose letal de R. equi (Figura 7B) e 50% dos animais sobreviveram,
sugerindo uma proteção parcial e esse efeito protetor foi independente do estímulo
de LPS contido na Salmonella (Figuras 7C e D).
Como foi observado previamente um aumento da população de linfócitos B,
resolvemos identificar o papel dessas células na proteção induzida por VapG. O
resultado obtido em animais BKO (Figuras 7E e F) sugere um papel significativo da
resposta humoral para a proteção induzida pela vacinação por Salmonella carreando
o antígeno VapG.
58 Resultados
A
C D
B
59 Resultados
Figura 7. Avaliação da produção de IL-17 e do papel de linfócitos B na proteção
induzida por Salmonella carreando a proteína vapG. (A) Camundongos BALB/c
foram inoculados por via oral com 200µL (1x109 UFC) de S. enterica Typhimurium
pYA3137vapG, S. enterica Typhimurium pYA3137 (controle) ou PBS nos dia 0.
Trinta dias após a imunização, cinco animais foram submetidos à eutanásia para a
coleta dos baços para dosagem da citocina IL-17A. (B) Curva de sobrevivência de
camundongos BALB/c imunizados com S. enterica Typhimurium pYA3137vapG,
100µg de APTX emulsificado em adjuvante de Freud incompleto ou PBS, e
desafiados com dose letal de R. equi. Camundongos C3H/HEJ (TLR4LPS-d) e
C3H/HEPAS foram imunizados pelo mesmo protocolo experimental e desafiados
com dose subletal de R. equi para avaliação da carga bacteriana no baço (C) e
fígado (D). Camundongos BKO e WT foram imunizados pelo mesmo protocolo
experimental e desafiados com dose subletal de R. equi para avaliação da carga
bacteriana no baço (E) e pulmão (F). Cada barra representa a média ± erro padrão.
*p<0,05 significante em relação ao grupo controle PBS (teste t).
E F
60 Resultados
8 Avaliação da produção de IL-17 em animais imunizados com linhagem
vacinal de Salmonella carreando a proteína vapA.
Como foi observado a diminuição significativa da produção de IL-17 no baço
de animais imunizados com a linhagem vacinal expressando VapG, resolvemos
avaliar se o mesmo ocorre quando os animais são imunizados com a linhagem
vacinal de Salmonella carreando a proteína vapA (Oliveira et al. 2007).
Corroborando com o observado para a vacina expressando VapG, a construção
vacinal expressando a proteína VapA apresenta diminuição significativa da
expressão de IL-17 (Figura 8A), acompanhada de uma polarização da resposta
imune para o perfil Th1 (Figura 8B) e uma diminuição da carga bacteriana
independente do efeito da presença do LPS contido na Salmonella (Figura 8C).
61 Resultados
Figura 8. Avaliação da produção de IL-17 pós-imunização utilizando a linhagem
vacinal de Salmonella carreando a proteína vapA. (A) Camundongos BALB/c
foram inoculados por via oral com 200 µL (1x109 UFC) de S. enterica Typhimurium
pYA3137vapA, S. enterica Typhimurium pYA3137 (controle) ou PBS nos dia 0. Trinta
dias após a imunização, cinco animais foram submetidos à eutanásia para a coleta
dos baços para dosagem da citocina IL-17A. (B) Animais imunizados e desafiados
foram avaliados quando a polarização da resposta imune para o perfil Th1 por meio
da análise da expressão de t-bet. (C) Camundongos C3H/HePAS e C3H/HeJ foram
imunizados conforme o protocolo padrão e a carga bacteriana foi avaliada como
descrito em materiais e métodos. Cada barra representa a média ± erro padrão.
*p<0,05 significante em relação ao grupo PBS (ANOVA).
C
A B
Discussão
63 Discussão
Doenças pneumológicas são consideradas a maior causa de morte em
potros entre os seis primeiros meses de vida e o Rhodococcus equi é um dos
principais causadores de infecções piogranulomatosas acarretando
broncopneumonia com abscessos (Giguère et al., 2011). Aos poucos, novas
informações a respeito da biologia da infecção estão sendo elucidadas,
demonstrando as causas da susceptibilidade de potros à infecções como a
rodococose. A ausência de uma resposta imune celular com produção de IFN-γ por
células T CD4+ e T CD8+, tem demonstrado ser crucial no controle e resolução da
rodococose (HINES et al., 2003; PATTON et al., 2004). Já foi demonstrado que a
produção de IFN-γ é deficiente em potros (BOYD et al., 2003; BREATHNACH et al.,
2006) e essa deficiência contribui para sua susceptibilidade frente a infecção por R.
equi (MARODI, 2006). A expressão reduzida de IFN-γ também é observada em
humanos e neonatos murinos (Lewis et al., 1991; Wilson et al., 1986). Em humanos,
esta deficiência está associada ao aumento do risco a infecções, como por
Mycobacterium tuberculosis (Aubert-Pivert et al., 2000). Assim, o IFN-γ é necessário
para a prevenção de várias infecções (Gasparoni et al., 2003; Schoenborn e Wilson,
2007), mas, ainda pouco se conhece sobre esta regulação no início da vida. Em
2013, Sun e colaboradores demonstraram que ao nascerem, potros possuem o
promotor para o gene do IFN-γ hipermetilado, e que sua demetilação e consequente
produção de interferon-gama ocorre com o tempo, mas podendo ser acelerada por
estímulos ambientais.
Sabe-se muito pouco ainda sobre a presença de IL-17 no contexto
infeccioso por R. equi. Recentemente, avaliando-se in vitro diferentes perfiz de
resposta imune estimuladas por R. equi em células do lavado bronco-alveolar
retiradas de potros com 10 dias de vida, nota-se um aumento substancial no número
64 Discussão
de cópias de RNAm para IL-17, comparadas ao número de cópias de RNAm para
outras citocinas (Liu et al., 2011). Essa expressão marcante de IL-17 em potros com
presença tardia de IFN-γ, pode afetar a produção desta última, uma vez que IL-17
pode exercer uma regulação negativa sobre a sua expressão (Yang et al., 2008).
Corroborando com a descrição do papel do interferon-gama na proteção
contra a rodococose equina, nós demonstramos que a redução da carga bacteriana
no baço de camundongos infectados é acompanhada por um aumento da presença
desta citocina nesses órgãos. Interessantemente, esse aumento não é observado
quando os animais são infectados com cepa deletada do plasmídeo de virulência, o
que demonstra o papel dos antígenos de virulência na modulação da resposta
imune, como sugerido por Hondalus, (1997) e Garton e colaboradores (2002).
Concomitante ao aumento dos níveis de interferon, observamos uma queda na
expressão de IL-17, o que sugere um papel regulador do interferon, como já
discutido por Yang e colaboradores (2008). Em outra mão, observamos uma cinética
de infecção diferente no pulmão dos animais infectados. Nesses animais, a carga
bacteriana é menor, mas crescente ao longo dos quatro dias observados. Com
relação às citocinas, há um aumento da produção de interferon-gama no primeiro dia
de infecção, o que permanece estabilizado durante o período de observação. Já os
níveis de IL-17 permanecem praticamente inalterados. Esse padrão de resposta
pode ser reflexo de uma infecção localizada ainda não controlada e/ou pela
presença de níveis de IL-17 significativamente maiores observados no pulmão.
Para comprovar o papel dos antígenos de virulência na modulação da
resposta imune, demonstramos que o APTX, um extrato da parede celular do
Rhodococcus equi rico no antígeno VapA, é capaz de estimular a produção de
interferon-gama em esplenócitos murinos, assim como é capaz de estimular também
65 Discussão
a produção de IL-17. Sendo o antígeno de virulência capaz de estimular ambas as
citocinas, e sabendo-se que uma citocina pode ser capaz de regular a outra,
postulamos que animais deficientes na produção de interferon-gama, assim como os
potros, tenham níveis aumentados de IL-17. Tal postulado foi comprovado pelos
experimentos com animais knockouts de interferon-gama. Como esses animais
apresentam maior carga bacteriana em seus órgãos, podemos postular também que
a polarização para Th-17 pode não trazer um perfil protetor frente à infecção por
Rhodococcus equi. Além disso, podemos inferir que a grande quantidade de IL-17
produzida no pulmão de potros, com carência de IFN-γ, pode ter um efeito regulador,
inibindo ou diminuindo a sua produção quando seu promotor já estiver demetilado,
favorecendo assim a infecção. A contraprova para o que foi observado é que
animais knockouts para citocina e receptores responsáveis por induzir e manter o
perfil Th17, como IL-23, IL-1R e IL-17R, apresentam reduzida carga bacteriana no
baço, acompanhada de um aumento significativo dos níveis de interferon-gama. O
mesmo padrão de resposta não foi observado no pulmão, entretanto os níveis de IL-
17 ainda estão aumentados neste órgão, acompanhado de níveis mais baixos de
interferon-gama.
Estudos com Mycobacterium tuberculosis, bactéria com perfil de infecção
comumente relacionado ao Rhodococcus, demonstraram inicialmente que a perda
de células Th17 específicas tinha pouco efeito no controle da infecção (Khader et al.,
2005). No entanto, Umemura et al. (2007) e Lockhart et al. (2006) demonstraram que
IL-17 é primariamente produzido por células T e estas células estão implicadas
como um “player” positivo na forma o de granulomas em resposta a altas doses de
infecção intratraqueal de M. Tuberculosis (Umemura et al., 2007; Yoshida et al.,
66 Discussão
2010). Rhodococcus equi forma granuloma em potros, mas é incapaz de fazê-lo no
modelo murino, dificultando avaliar o papel da IL-17 na sua formação.
O reconhecimento inato de patógenos por células fagocíticas também é um
ponto crucial ao início de uma resposta imune adaptativa contra infecções a
microrganismos. A descoberta dos receptores do tipo Toll, tem elucidado os
mecanismos pelo qual microrganismos possam ser reconhecidos. Este
reconhecimento induzir uma cascata de ativação, culminando em uma produção de
citocinas que leva a eliminação do microrganismo. Por outro lado, a ativação de um
receptor do tipo Toll que não leve a produção de citocinas específicas para a
eliminação deste microrganismo, pode acabar por favorecê-lo.
Os receptores do tipo Toll, são componentes críticos da resposta imune
inata (Lemaitre et al., 1996). A sinalização através dos TLRs levam a uma cascata
de sinalização celular que culminam na ativação e translocação do NF-κB, levando a
upregulação de moléculas co-estimulatórias de APCs e a produção de citocinas que
são chaves para o início de uma resposta imune adotiva (Anderson et al., 2002;
Schnare et al., 2001).
Em 2004, Darrah e colaboradores demonstraram que o ligante do tipo Toll 2
(TLR2) é crucial para o reconhecimento do principal fator de virulência do R. equi, a
proteína vapA. Demonstraram ainda que na ausência deste receptor não há o
desencadeamento de uma resposta imune protetora e que esta, poderia ser a causa
de susceptibilidade à infecção por R. equi. A partir deste trabalho, outros trabalhos
basearam-se na expressão do receptor TLR2 para avaliar a susceptibilidade a
infecção por R. equi em potros. Porém, em nossos estudos observamos que a
ausência do TLR2 não influência significativamente no curso da infecção,
principalmente quando avaliamos a carga bacteriana no pulmão, órgão não avaliado
67 Discussão
no trabalho de Darrah e colaboradores (2004). A ausência de TLR2 leva a uma
significativa redução da produção de IL-17 no baço, mas a um leve aumento no
pulmão, o que poderia explicar uma carga bacteriana maior neste órgão.
Interessantemente, o APTX foi capaz de estimular IL-17 e IFN- em células
esplênicas de animais TLR2KO, ao passo que não foi capaz de induzir ambas as
citocinas em animais MyD88, sugerindo que há outros receptores, possivelmente da
família dos Tolls, capazes de interagir com a proteína VapA. Notamos ainda que IL-1
não está envolvida nesta ativação, e resultados preliminares mostram que TLR-4
também parece ser dispensável para a produção de IL-17 (dados não mostrados).
Corroborando com esses dados, células esplênicas de animais TLR2KO são
marcadas de maneira similar à de animais WT em ensaio de binding. Estudos mais
aprofundados são necessários para confirmar o envolvimento de outras moléculas
do tipo TLR no reconhecimento de antígenos de virulência de R. equi.
Nosso grupo tem trabalhado há algum tempo no desenvolvimento de vacina
baseada em linhagem atenuada de Salmonella enterica carreando proteínas
heterólogas de R. equi. Oliveira et al. (2007 e 2010) demonstraram que a
administração oral de Salmonella carreando o antígeno VapA é capaz de induzir
uma resposta imune protetora de longa duração. Cardoso et al. (2013)
demonstraram que esta construção vacinal induz uma resposta protetora
dependente de células T CD4+ e que uma possível interação entre o antígeno VapA
e TLR2 não é requerida para a montagem da resposta efetora. Trevisani (2011)
demonstrou que o antígeno de virulência VapG também pode ser usado para
compor uma formulação vacinal, uma vez que estimula uma resposta protetora, com
indícios de participação de linfócitos B. Aqui, nós investigamos se a o papel da IL-17
na modulação da resposta imune induzida pela vacina baseada em Salmonella
68 Discussão
como vetor. Corroborando com nossos resultados que sugerem um papel negativo
de IL-17, ambas as construções vacinais, carreando o antígeno VapA ou VapG, são
capazes induzir uma diminuição da expressão de IL-17, que ao lado do aumento da
produção de interferon-gama, garante a modulação de uma resposta imune
protetora.
Uma característica interessante da vacina baseada no antígeno VapG é que
a resposta efetora montada é dependente de linfócitos B, como sugerido pelos
ensaios com animais BKO. Tal fato pode explicar a proteção parcial observada no
ensaio de sobrevivência e reflete à proteção parcial observada em potros tratados
com plasma hiperimune. Uma diferença crucial entre os antígenos VapA e VapG, é
que o primeiro compõe a membrana da bactéria, enquanto o segundo é secretado.
No entanto, se isto tem algum efeito na modulação da resposta imune para um perfil
mais humoral, novos estudos são necessários para elucidar esse mecanismo.
Porém, uma formulação vacinal baseada nos dois antígenos parece ser promissora
em função da montagem de uma resposta efetora mais completa.
Concluímos o presente trabalho com a hipótese de que o padrão Th17 de
resposta imune pode ter um efeito indireto no curso da infecção por R. equi em
potros. Em animais adultos imunocompetentes, a infecção é facilmente controlada
pelo estímulo à produção de IFN-, a qual regula os níveis de IL-17 durante a
resposta imune. Ao contrario, em potros deficientes da produção de IFN-, o
estímulo à produção de IL-17 pelos antígenos de virulência do R. equi, favorece a
infecção por meio da regulação negativa do IFN- quando o animal torna-se apto à
produzi-lo. Ou seja, o curso da infecção depende do momento exato em que o
animal é infectado. Quanto mais cedo ocorrer a infecção maior será o nível de IL-17
nos órgãos afetados no momento em que ocorrer o estímulo à produção de IFN-,
69 Discussão
mantendo os seus níveis tão baixos, que o sistema imune não consegue controlar a
infecção. Apesar de o animal ser considerado susceptível até os três meses de
idade, quanto mais tardia a infecção dentro deste intervalo, melhor o prognóstico.
Com algumas semanas de idade, o animal já é capaz de produzir níveis de IFN-,
mesmo que baixos, mas talvez suficientes para se contrapor aos níveis de IL-17
induzidos (Figura 9).
Figura 9. Modelo de resposta à infecção por R. equi em potros. Cavalos adultos
são capazes de controlar a infecção por R. equi (indicado pela seta) pela sua
capacidade de produzir níveis altos de IFN- (azul) e regular a produção de IL-17
(vermelho). Potros infectados nos primeiros dias de vida são incapazes de produzir
IFN-, mas aptos a produzir IL-17, o que acaba regulando negativamente a produção
futura de IFN-. Por outro lado, se a infecção por R. equi ocorrer tardiamente,
quando o animal já é capaz de produzir IFN-, mesmo que de forma basal, há
chances de ele estabelecer uma resposta imune apropriada, de forma a produzir
IFN- suficiente para regular o IL-17 e controlar a infecção.
Conclusões
71 Conclusões
Podemos concluir através destes resultados que;
- R. equi é capaz de induz através de seus antígenos de virulência uma resposta
imune com produção de IL-17A em modelos de infecção experimental murino, e que
esta IL-17A não tem efeito de clearance e parece favorecer a infecção.
- APTX liga-se a receptores ainda desconhecidos, mas dependentes de MyD88, de
células esplênicas levando a ativação com produção de IL-17A e IFN-γ.
- Os modelos vacinais utilizando Salmonella enterica Typhimurium carreando os
antígenos vapA e vapG, são capazes de gerar proteção frente a infecção
experimental com R. equi diminuindo os níveis de IL-17. Além disso, a proteção
conferida a Salmonella enterica Typhimurium carreando o antígeno vapG é
dependente de resposta imune humoral baseada em anticorpos.
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Anexos
89 Anexos
90 Anexos
91 Anexos
92 Anexos
93 Anexos
94 Anexos
95 Anexos
96 Anexos
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Title: Attenuated Salmonella carrying VapG antigen induce protective response
based on humoral response against Rhodococcus equi.
Trevisani, M.M.; Hanna, E.S.; Oliveira, A.F.; Cardoso, S.A.; Roque-Barreira, M.C.;
Soares, S.G.
Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos, Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Av. Bandeirantes, 3900,
14049-900, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil
1. Introduction
Rhodococcus equi is one of most important pathogens with worldwide
distribution that affects newly born foals and is emerging as a human opportunistic
pathogen, especially in immunocompromized hosts (Prescott, 1991; Topino et al.,
2010). Pulmonary infections in young foals by Rhodococcus equi result in severe
pneumonia, leading to death a large number of animals every year. There is no
globally accepted vaccine for the prevention of equine rhodococosis so far. To date,
the only acceptable treatment is based on antibiotics, but the clinical protocols are
long lasting, expensive, having side effects and favoring the emergence of drug
resistant strains (Cohen, 2014). Several strategies for developing a safe and effective
vaccine against rhodococosis have been proposed, however, none has induced a
significant protective effect.
R. equi harbours an 80-90 Kb plasmid that encodes a group of virulence
proteins named Vaps involved in R. equi`s ability to survive, persist and replicate
within host macrophages (Muscatello, 2012). There are six full-length vap genes
(vapA, -C, -D, -E, -G, and -H) and three vap pseudogenes (vapF, -I, and –X) that
exhibit either truncation and/or mutations in their coding sequences (Takai et al.,
2000; Russel et al, 2004; Letek et al, 2008). All virulent R. equi isolated from
infected foals are positive for vapA, a bacterial surface lipoprotein required for
intracellular growth in macrophages, and a vapA gene deletion causes attenuation of
virulent strains (Jain et al., 2003). However, vapA alone is not sufficient to trigger
virulence, since Guigère et al. (1999) demonstrated that expression of wild-type
99 Manuscrito
levels of vapA in plasmid-cured virulent strain does not restore virulence in mice
model and challenged foals. Thus, in addition to vapA, other factors must be involved
in the R. equi ability to colonize and induce clinical findings in foals.
Ren and Prescott (2003) showed all gene of vaps are induced when R. equi
grown inside equine macrophages. In another study, vapA and vapG were
predominantly induced by H2O2 treatment, suggesting a dominant role in protection
against macrophage-related stresses (Benoit et al., 2002). In infected foals, Jacks et
al. (2007) observed significantly higher expression of vapG, followed by vapA and
vapD in lung tissue, suggesting that they are the most biologically relevant vap
genes. However, only recombinant vapA and vapC induced higher
lymphoproliferative in bronchial lymph nodes cells. Monego et al. (2009)
demonstrated that the vapG gene is present in all virulent strains isolated of horses
from South Brazil. All of these results stimulate investigate other vaps, besides vapA,
as candidate vaccine antigens.
Our group has already been working with an attenuated Salmonella enterica
Typhimurium strain expressing the VapA protein, demonstrating that oral
immunization induces protection against experimental rhodococcosis in mice
(Oliveira et al., 2007). Then, Oliveira et al. (2010) demonstrated that the oral
immunization protocol induces a strong and specific humoral and cell-mediated Th1-
immunity against the heterologous antigen, with an appropriate regulatory response
and a long-term protection against R. equi infection. Cardoso et al. (2013) reported
that nasal delivery is an effective route for immunization, which confers protection
with a single dose of the vaccine. More recently, a proof-of-concept in foals naturally
infected suggested the efficacy of this vaccine in the target species (Porto et al., in
submission).
In the present study, we showed that VapG virulence antigen is a candidate to
compose a vaccine formulation based on attenuated Salmonella as vector for
delivery. We found that oral immunization induces a Th1 immune response, with
protective profile based on humoral immune response.
100 Manuscrito
2. Material and methods
2.1. Experimental animals, bacterial strains and APTX
Groups of female mice, 6–8 weeks of age, including BALB/c, C57BL/6, B KO
mice (Igh-6tm1Cgn), C3H/HeJ, C3H/HePAS, were housed under specific pathogen-free
conditions in the Animal Research acilities of the edical chool of ibeir o Preto-
P. The studies were conducted as required by the thics ommittee on nimal
esearch of the niversity of o Paulo.
For construction of attenuated Salmonella vapG+ a DNA fragment corresponding to
the 519 bp vapG gene was amplified by PCR using the virulence plasmid of R. equi
ATCC 33701 as template. The primers vapG- w 5’-
GCGGCCGTCGACAAGAGAGGATGATATCATGAGT) and vapG- v 5’-
GCGCGCTGCAGCTATTGCCACCCTCCGGTTC-3’ were used to create the BamHI
and the SalI sites to cloning at the pYA3137 plasmid, as described by Oliveira et al.
(2007).
The attenuated S. enterica Typhimurium �3987 strains, carrying either the
Vap antigen vap + , Vap antigen Vap + or the empty vector control Vap − ,
as well as the virulent strain of R. equi (ATCC 33701) were grown and prepared as
described by Oliveira et al. (2010). Triton X-extracted (APTX) antigen was prepared
as described by Prescott et al. (1997).
2.2. Immunization and challenge protocols
Groups of animals were immunized via oral as described by Oliveira et al.
(2007), on days 0 and 14, with attenuated Salmonella harbouring the VapG antigen
or controls. The challenges were conducted using sublethal dose of an ATCC
virulent, R. equi strain 33701, 30 days after first immunization. Organs were collected
5 days after challenge for R. equi clearance evaluation and other analyses as
described below.
The cumulative survival curve of mice immunized and challenged with lethal
dose of R. equi was determined using the Kaplan-Meier method (Kaplan and Meier,
1958). Mice were immunized with either treatment and challenged 30 days after.
Mortalities were recorded daily for 15 days after challenge.
101 Manuscrito
2.3. R. equi loads in organs of mice immunized with Salmonella based vaccine
and controls
Quantification of viable R. equi recovered from the spleen and liver of
challenged mice was performed on day 5 post-infection as reported elsewhere
(Oliveira et al., 2007). Briefly, 30 days after first immunization, mice were infected
with 4 × 106 CFUs (Colony Forming Units) of virulent R. equi via intravenous route.
Five days after the challenge, spleen and liver were collected and aseptically
homogenized. To determine the number of CFU, aliquots of 100 l of the
homogenates were serially diluted in sterile PBS, plated onto BHI agar in duplicate,
and incubated at 37 oC for 36 h.
2.4. Cytokine determination
Spleen homogenate samples obtained 30 days after first immunization or 5
days after challenge were analyzed by ELISA for IL- 12p70, IFN-, and TNF- using
commercially available kits (OptEIA set; Pharmingen, San Diego, CA, USA). The
assays were performed according to the manufacturer’s recommendations.
2.5. Flow cytometry analysis
Staining for flow cytometry was performed on spleen cells isolated from
immunized and control mice 15 days post-immunization. After harvesting the spleen
cells, 1 × 107 cells were washed with ice-cold PBS and incubated for 30 min at 4 oC
with anti- CD16/CD32 mAb (Fc block, clone 2.4G2, BD Pharmingen, San Diego, CA).
Next, the cells were incubated for over 40 minutes with anti-CD19, anti-CD3, anti-
CD4, anti-CD8, anti-CD62L and/or anti-CD44, PE- or FITC-labeled (BD Pharmingen,
San Diego, CA). Washing steps were performed with PBS 0.5% BSA and the cells
were then submitted for analysis on a Guava flow cytometer (Millipore, Billerica, MA,
USA) using Guava CytoSoft version 4.2.1 (Millipore, Billerica, MA, USA).
102 Manuscrito
2.6. Statistical analysis
Statistical analysis was performed using GraphPad Prism6 software.
Comparison of data between two groups were performed using Student`s t-test.
Responses between three or more groups were compared by one-way analysis of
variance (ANOVA) with Welch correction. The survival times of each group were
statistically analyzed by Log-rank test (Peto et al., 1977).
3. Results
3.1. VapG antigen carried by attenuated Salmonella induces protection in mice
against R. equi challenge.
Our previous studies have demonstrated the potential use of attenuated
Salmonella carrying VapA antigen to confer resistance to R. equi infection (Oliveira et
al., 2007; 2010; Cardoso et al., 2013). In the present study, we evaluated the ability
of Salmonella vector in induce protection using a VapG, an antigen present on
virulence plasmid of R. equi and highly expressed in the lung of infected foals
(Coulson et al., 2010). The attenuated Salmonella carrying VapG antigen was able to
induce a significant reduction of R. equi burden in spleen and liver, target organs in
mice (Figs. 1A-B), comparable to the VapA based vaccine. These protection was
independent of TLR4 activation by Salmonella as suggested by experiments using a
Toll-like Receptor 4 (TLR4)-deficient mice (Figs. 1C-D). When challenged with a
lethal dose of R. equi, 50% of animals immunized with Salmonella VapG+ survived,
while control animals treated with PBS died after one week and animals immunized
with APTX to induce a strong VapA specific humoral response died within 10 days
(Fig. 1E).
3.2. Attenuated Salmonella carrying VapG antigen elicit interferon-gamma
response in mice.
To evaluate whether the protection conferred by VapG was associated with
appropriate cytokine response, we assessed the level of Th1-type cytokines IL-12,
IFN- and TNF-. Animals treated with Salmonella VapG+ presented higher levels of
103 Manuscrito
IL-12 after immunization (Fig. 2A), with significant expression after R. equi challenge
(Fig. 2B). The levels of interferon-gamma followed the IL12 response and were
significantly higher in both, immunized (Fig. 2C) and challenged (Fig. 2D) animals,
compared to control animals, PBS or empty vector treated. As previously observed in
animals immunized with Salmonella VapA+ (Oliveira et al., 2010 and Cardoso et al.,
2013), VapG based vaccine induced lower levels of TNF- only after challenge, when
compared to control groups (Figs. 2E-F). In fact, the levels of TNF- remained
invariable in VapG immunized group, while the group treated with Salmonella
carrying empty vector presented a significant increased for reasons yet to be
investigated. Vaccinated animals displayed lower levels of IL-17 (Fig 2G)
3.3. VapG immunization induces high frequency of B cells and stimulates T cell
CD4+ with memory phenotype.
To determine if VapG vaccine stimulates lymphocyte proliferation, we
evaluated the frequency of CD19+, CD3+CD4+ and CD3+CD8+ cells on splenocytes
of animals immunized or control groups. We determined that compared with PBS and
Salmonella carrying empty vector groups, VapG group exhibit a significantly higher
frequency of B cells, but not T cells (Figs 3A-C). Despite not having been observed
differences on CD4+ and CD8+ populations, when were analyzed the T cell
population with memory phenotype (Figs 3D-F), CD4+ memory cells exhibit a
significantly higher frequency in animals immunized with Salmonella carrying VapG
antigen.
3.4. VapG antigen delivered by attenuated Salmonella induces a protective
humoral immune response.
To assess if the higher frequency of B cells is important to establish a
protective response against R. equi, B cell KO mice were immunized with Salmonella
carrying VapG antigen or treated with PBS, and challenged with virulent R. equi.
BKO animals were unable to reduce the bacterial load from spleen (Fig 4A) and lung
(Fig 4B), suggesting that B cells are important player of protective immune response
modulated by VapG.
104 Manuscrito
4. Discussion
For many years, some of the most promising research to develop vaccines for
R. equi was based on the major virulence antigen, VapA. Recently, with the difficulty
in launching effective vaccines using this strategy, new pathways are being driven
based on inactivated R. equi strains (Bordin et al., 2014; van der Geize et al., 2011)
or search for new antigens (Cauchard et al., 2014; Barbey et al., 2012). Since
Giguére et al. (1999) showed that expression of wild-type levels of VapA alone is not
sufficient to restore the virulence phenotype on plasmid-cured R. equi strain, other
Vaps were investigated, including VapG. Recently, Coulson et al. (2010)
hypothesized that VapG could be an important virulence determinant, but
experiments using a vapG mutant strain suggest that it does not play important role
in virulence. Despite of these results, the question about potential use of VapG
antigen remains open.
In the present study, we assessed vapG in the context of Salmonella-based
vectored vaccine, previously evaluated for delivery vapA antigen. Like vapA, vapG
induces a protective Th1 immune response with significant reduction of bacterial load
on affected organs. Surprisingly, IL-17, a pro-inflammatory cytokine was down
regulated in vaccinated animals. The role of IL-17 remains unclear and additional
studies are necessary to elucidate its function more precisely.
Differently of vapA, vapG induces higher frequency of B cells and these cells
are central to defense against Rhodococcus in the context of vapG vaccine. Specific-
antibodies to R. equi are used commercially as hyperimmune plasma to prevention of
infection, but its use is controversy. While R equi hyperimmune plasma appeared to
be effective in some field studies (Madigan et al., 1991; Becu et al., 1997; Higuchi et
al., 1999) and after experimental challenge (Martens, 1989; Hooper-McGrevy, 2001),
other studies showed no positive effect (Giguere, 2002; Caston et al., 2006). The
reasons for these disparate results are unclear, but suggesting that antibodies
partially protect foals. This observation could explain the partial protection of vapG
vaccine.
In conclusion, attenuated Salmonella carrying vapG antigen induces a
protective humoral immune response against R. equi in a different way of immune
modulation induced by vapA antigen. This suggest that vapG antigen could
105 Manuscrito
complement vapA in the development of an effective vaccine formulation for the
prevention of R. equi pneumonia.
FIGURES:
Figure 1: Attenuated Salmonella Typhimurium carrying VapG antigen induces
protection in mice against Rhodococcus equi challenge.
106 Manuscrito
Figure 2: Attenuated Salmonella Typhimurium carrying VapG antigen inducing Th1
immune response
107 Manuscrito
Figure 3: Attenuated Salmonella Typhimurium carrying VapG antigen increasing B
cell frequency.
108 Manuscrito
Figure 4: vapG vaccine is unable to protect animals knockout for B cells.
109 Manuscrito
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