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Ana Rita Ladeira Courelas da Silva
Licenciada
Importacircncia do Complexo Mediador na Actividade
Transcricional do Yap8
Dissertaccedilatildeo para obtenccedilatildeo do Grau de Mestre em
Geneacutetica Molecular e Biomedicina
Orientadora Regina Menezes Doutora ITQBUNL
Co-orientadora Claudina Rodrigues-Pousada Professora Doutora ITQBUNL
Setembro de 2011
Juacuteri
Presidente Prof Doutor Joseacute Paulo Sampaio Arguente Prof Doutor Adriano Henriques Vogal Doutora Regina Menezes Vogais
Ana Rita Ladeira Courelas da Silva
Licenciada
Importacircncia do Complexo Mediador na Actividade
Transcricional do Yap8
Dissertaccedilatildeo para obtenccedilatildeo do Grau de Mestre em
Geneacutetica Molecular e Biomedicina
Orientadora Regina Menezes Doutora ITQBUNL
Co-orientadora Claudina Rodrigues-Pousada Professora Doutora ITQBUNL
Setembro de 2011
Juacuteri
Presidente Prof Doutor Joseacute Paulo Sampaio Arguente Prof Doutor Adriano Henriques Vogal Doutora Regina Menezes Vogais
Importacircncia do Complexo Mediador na Actividade Transcricional do Yap8
Copyright Ana Rita Ladeira Courelas da Silva FCTUNL UNL
A Faculdade de Ciecircncias e Tecnologia e a Universidade Nova de Lisboa tecircm o direito perpeacutetuo e sem
limites geograacuteficos de arquivar e publicar esta dissertaccedilatildeo atraveacutes de exemplares impressos
reproduzidos em papel ou de forma digital ou por qualquer outro meio conhecido ou que venha a ser
inventado e de a divulgar atraveacutes de repositoacuterios cientiacuteficos e de admitir a sua coacutepia e distribuiccedilatildeo
com objectivos educacionais ou de investigaccedilatildeo natildeo comerciais desde que seja dado creacutedito ao autor
e editor
O trabalho aqui descrito foi desenvolvido no
Laboratoacuterio Genomics and Stress Instituto de
Tecnologia Quiacutemica e Bioloacutegica Universidade
Nova de Lisboa
i
Agradecimentos
Eacute com enorme satisfaccedilatildeo que exponho aqui o meu sincero agradecimento a todos aqueles que tornaram
possiacutevel a realizaccedilatildeo deste trabalho
Em primeiro lugar venho expressar os meus agradecimentos agrave Professora Doutora Claudina Rodrigues-
Pousada co-orientadora deste trabalho por ter-me recebido no seu laboratoacuterio e por ter acreditado nas
minhas capacidades
Em segundo lugar um profundo agradecimento agrave Doutora Regina Menezes pela excelecircncia na orientaccedilatildeo
cientiacutefica leccionaccedilatildeo apoio e disponibilidade em todos os momentos
Aos meus Pais pelo apoio incondicional
Ao Andreacute por toda a compreensatildeo e amor
Agrave Soraia por todas as dicas uacuteteis e amizade
Aos meus colegas do laboratoacuterio Genomics and Stress pelo excelente conviacutevio o que me proporcionou uma
enorme satisfaccedilatildeo em desenvolver este trabalho neste laboratoacuterio
Aos meus amigos Daniel e Carina pelos cafeacutes e conversas que tanto me ajudaram a aliviar o cansaccedilo
ii
iii
Sumaacuterio
Os processos adaptativos agraves mudanccedilas ambientais ocorrem principalmente atraveacutes da reprogramaccedilatildeo da
expressatildeo geneacutetica A activaccedilatildeo de genes de stress eacute controlada por factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que
facilitam o recrutamento do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras O
complexo Mediador eacute um co-activador necessaacuterio para a activaccedilatildeo de vaacuterios genes tanto em leveduras como
em mamiacuteferos O domiacutenio da cauda deste complexo interage com alguns factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos
transmitindo o sinal de activaccedilatildeo para a maquinaria basal de transcriccedilatildeo enquanto o domiacutenio CDK8 eacute
responsaacutevel pela regulaccedilatildeo do complexo podendo exercer uma funccedilatildeo activadora ou repressora Em
Saccharomyces cerevisiae o factor de transcriccedilatildeo Yap8 desempenha um papel primordial na resposta ao
stress induzido pelo arseacutenio Na presenccedila de arseacutenio o Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo regulando a activaccedilatildeo
transcricional dos genes ACR2 e ACR3 que codificam para uma redutase de arsenato e uma proteiacutena da
membrana respectivamente Neste trabalho investigaram-se os mecanismos atraveacutes dos quais o Yap8 induz
a activaccedilatildeo transcricional do gene ACR2 e avaliou-se a importacircncia do complexo Mediador neste processo
Os resultados obtidos indicam que as subunidades Med2 Med3 Med14 Med15 e Med16 da cauda do
complexo Mediador satildeo importantes para a sobrevivecircncia da levedura ao stress imposto pelo arseacutenio Na
ausecircncia destas subunidades a capacidade do Yap8 em activar a transcriccedilatildeo dos genes lacZ e ACR2 eacute
drasticamente reduzida Foi tambeacutem demonstrado que o Yap8 estabelece interacccedilotildees fiacutesicas com a
subunidade Med2 e desta forma transmite o sinal de activaccedilatildeo para maquinaria basal de transcriccedilatildeo Aleacutem
disso os resultados mostram que o moacutedulo CDK8 exerce a funccedilatildeo de regulador negativo da actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 destabilizando quer oYap8 quer o Med2
Palavras-chave S cerevisiae arseacutenio Yap8 Mediador transcriccedilatildeo
iv
v
Abstract
The adaption to environmental changes is mainly promoted through reprogramming of gene expression
This process is tightly orchestrated by specific transcription factors which sense the stress signal and
mediate the recruitment of the pre-initiation complex to the promoter of its target genes The Mediator
complex is also required for full activation of many genes in yeast and mammals The tail domain of this
complex interacts with some transcription factors and transduces the activation signal to the basal
transcription machinery The CDK8 domain regulates the activity of the Mediator complex exerting either a
positive or negative regulatory role In Saccharomyces cerevisiae the Yap8 regulatory protein plays a pivotal
role in arsenic stress responses It is accumulated in the nucleus upon arsenic insult and regulates
transcriptional activation of ACR2 and ACR3 which encodes the arsenate-reductase and the plasma
membrane arsenite-efflux protein respectively This work aimed to study the mechanisms by which Yap8
induces the transcriptional activation of ACR2 and to evaluate the importance of the Mediator complex in
this process The results indicate that the subunits Med2 Med3 Med14 Med15 and Med16 of the Mediator
tail domain are important for the adaptation of yeast cells to arsenic stress In the mutants for the respective
subunits Yap8 failed to activate transcription of the lacZ reporter gene and ACR2 Furthermore it was
shown that Yap8 physically interacts with Mediator through the Med2 subunit which thus transmits the
activation signal to the basal transcription machinery The CDK8 module serves as a negative regulator of
Yap8 trans-activation activity since it destabilizes bothYap8 and Med2
Key-words S cerevisiae arsenic Yap8 Mediator transcription
vi
vii
Iacutendice Geral
1 Introduccedilatildeo 1
11 O arseacutenio no ambiente e na sauacutede 1
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico 2
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap 2
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio 5
15 O complexo Mediador 7
16 Objectivos 12
2 Materiais e Meacutetodos 13
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento 13
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 14
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura 17
24 Anaacutelises fenotiacutepicas 17
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido 18
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido 18
27 Ensaio de Two-hybrid 18
28 Northern-blot 19
29 Western-blot 20
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo 21
3 Resultados e Discussatildeo 23
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio 23
32 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do Yap8 mas natildeo
interferem nos seus niacuteveis de mRNA e proteiacutena 25
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 27
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8 29
viii
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da ceacutelula
ao stress pelos compostos de arseacutenio 33
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 35
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2 36
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais 39
5 Referecircncias Bibliograacuteficas 41
ix
Iacutendice de Figuras
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4 4
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap 5
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e destoxificaccedilatildeo
do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae 7
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador 9
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo 10
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae e humano 11
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio 24
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada 26
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura 28
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 29
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura 30
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema Two-hybrid 31
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo 32
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 33
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido
pelos compostos de arseacutenio 34
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8 36
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 37
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo 40
x
xi
Iacutendice de Tabelas
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo 13
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho 15
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 16
xii
xiii
Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Ana Rita Ladeira Courelas da Silva
Licenciada
Importacircncia do Complexo Mediador na Actividade
Transcricional do Yap8
Dissertaccedilatildeo para obtenccedilatildeo do Grau de Mestre em
Geneacutetica Molecular e Biomedicina
Orientadora Regina Menezes Doutora ITQBUNL
Co-orientadora Claudina Rodrigues-Pousada Professora Doutora ITQBUNL
Setembro de 2011
Juacuteri
Presidente Prof Doutor Joseacute Paulo Sampaio Arguente Prof Doutor Adriano Henriques Vogal Doutora Regina Menezes Vogais
Importacircncia do Complexo Mediador na Actividade Transcricional do Yap8
Copyright Ana Rita Ladeira Courelas da Silva FCTUNL UNL
A Faculdade de Ciecircncias e Tecnologia e a Universidade Nova de Lisboa tecircm o direito perpeacutetuo e sem
limites geograacuteficos de arquivar e publicar esta dissertaccedilatildeo atraveacutes de exemplares impressos
reproduzidos em papel ou de forma digital ou por qualquer outro meio conhecido ou que venha a ser
inventado e de a divulgar atraveacutes de repositoacuterios cientiacuteficos e de admitir a sua coacutepia e distribuiccedilatildeo
com objectivos educacionais ou de investigaccedilatildeo natildeo comerciais desde que seja dado creacutedito ao autor
e editor
O trabalho aqui descrito foi desenvolvido no
Laboratoacuterio Genomics and Stress Instituto de
Tecnologia Quiacutemica e Bioloacutegica Universidade
Nova de Lisboa
i
Agradecimentos
Eacute com enorme satisfaccedilatildeo que exponho aqui o meu sincero agradecimento a todos aqueles que tornaram
possiacutevel a realizaccedilatildeo deste trabalho
Em primeiro lugar venho expressar os meus agradecimentos agrave Professora Doutora Claudina Rodrigues-
Pousada co-orientadora deste trabalho por ter-me recebido no seu laboratoacuterio e por ter acreditado nas
minhas capacidades
Em segundo lugar um profundo agradecimento agrave Doutora Regina Menezes pela excelecircncia na orientaccedilatildeo
cientiacutefica leccionaccedilatildeo apoio e disponibilidade em todos os momentos
Aos meus Pais pelo apoio incondicional
Ao Andreacute por toda a compreensatildeo e amor
Agrave Soraia por todas as dicas uacuteteis e amizade
Aos meus colegas do laboratoacuterio Genomics and Stress pelo excelente conviacutevio o que me proporcionou uma
enorme satisfaccedilatildeo em desenvolver este trabalho neste laboratoacuterio
Aos meus amigos Daniel e Carina pelos cafeacutes e conversas que tanto me ajudaram a aliviar o cansaccedilo
ii
iii
Sumaacuterio
Os processos adaptativos agraves mudanccedilas ambientais ocorrem principalmente atraveacutes da reprogramaccedilatildeo da
expressatildeo geneacutetica A activaccedilatildeo de genes de stress eacute controlada por factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que
facilitam o recrutamento do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras O
complexo Mediador eacute um co-activador necessaacuterio para a activaccedilatildeo de vaacuterios genes tanto em leveduras como
em mamiacuteferos O domiacutenio da cauda deste complexo interage com alguns factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos
transmitindo o sinal de activaccedilatildeo para a maquinaria basal de transcriccedilatildeo enquanto o domiacutenio CDK8 eacute
responsaacutevel pela regulaccedilatildeo do complexo podendo exercer uma funccedilatildeo activadora ou repressora Em
Saccharomyces cerevisiae o factor de transcriccedilatildeo Yap8 desempenha um papel primordial na resposta ao
stress induzido pelo arseacutenio Na presenccedila de arseacutenio o Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo regulando a activaccedilatildeo
transcricional dos genes ACR2 e ACR3 que codificam para uma redutase de arsenato e uma proteiacutena da
membrana respectivamente Neste trabalho investigaram-se os mecanismos atraveacutes dos quais o Yap8 induz
a activaccedilatildeo transcricional do gene ACR2 e avaliou-se a importacircncia do complexo Mediador neste processo
Os resultados obtidos indicam que as subunidades Med2 Med3 Med14 Med15 e Med16 da cauda do
complexo Mediador satildeo importantes para a sobrevivecircncia da levedura ao stress imposto pelo arseacutenio Na
ausecircncia destas subunidades a capacidade do Yap8 em activar a transcriccedilatildeo dos genes lacZ e ACR2 eacute
drasticamente reduzida Foi tambeacutem demonstrado que o Yap8 estabelece interacccedilotildees fiacutesicas com a
subunidade Med2 e desta forma transmite o sinal de activaccedilatildeo para maquinaria basal de transcriccedilatildeo Aleacutem
disso os resultados mostram que o moacutedulo CDK8 exerce a funccedilatildeo de regulador negativo da actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 destabilizando quer oYap8 quer o Med2
Palavras-chave S cerevisiae arseacutenio Yap8 Mediador transcriccedilatildeo
iv
v
Abstract
The adaption to environmental changes is mainly promoted through reprogramming of gene expression
This process is tightly orchestrated by specific transcription factors which sense the stress signal and
mediate the recruitment of the pre-initiation complex to the promoter of its target genes The Mediator
complex is also required for full activation of many genes in yeast and mammals The tail domain of this
complex interacts with some transcription factors and transduces the activation signal to the basal
transcription machinery The CDK8 domain regulates the activity of the Mediator complex exerting either a
positive or negative regulatory role In Saccharomyces cerevisiae the Yap8 regulatory protein plays a pivotal
role in arsenic stress responses It is accumulated in the nucleus upon arsenic insult and regulates
transcriptional activation of ACR2 and ACR3 which encodes the arsenate-reductase and the plasma
membrane arsenite-efflux protein respectively This work aimed to study the mechanisms by which Yap8
induces the transcriptional activation of ACR2 and to evaluate the importance of the Mediator complex in
this process The results indicate that the subunits Med2 Med3 Med14 Med15 and Med16 of the Mediator
tail domain are important for the adaptation of yeast cells to arsenic stress In the mutants for the respective
subunits Yap8 failed to activate transcription of the lacZ reporter gene and ACR2 Furthermore it was
shown that Yap8 physically interacts with Mediator through the Med2 subunit which thus transmits the
activation signal to the basal transcription machinery The CDK8 module serves as a negative regulator of
Yap8 trans-activation activity since it destabilizes bothYap8 and Med2
Key-words S cerevisiae arsenic Yap8 Mediator transcription
vi
vii
Iacutendice Geral
1 Introduccedilatildeo 1
11 O arseacutenio no ambiente e na sauacutede 1
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico 2
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap 2
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio 5
15 O complexo Mediador 7
16 Objectivos 12
2 Materiais e Meacutetodos 13
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento 13
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 14
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura 17
24 Anaacutelises fenotiacutepicas 17
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido 18
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido 18
27 Ensaio de Two-hybrid 18
28 Northern-blot 19
29 Western-blot 20
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo 21
3 Resultados e Discussatildeo 23
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio 23
32 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do Yap8 mas natildeo
interferem nos seus niacuteveis de mRNA e proteiacutena 25
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 27
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8 29
viii
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da ceacutelula
ao stress pelos compostos de arseacutenio 33
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 35
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2 36
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais 39
5 Referecircncias Bibliograacuteficas 41
ix
Iacutendice de Figuras
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4 4
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap 5
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e destoxificaccedilatildeo
do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae 7
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador 9
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo 10
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae e humano 11
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio 24
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada 26
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura 28
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 29
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura 30
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema Two-hybrid 31
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo 32
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 33
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido
pelos compostos de arseacutenio 34
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8 36
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 37
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo 40
x
xi
Iacutendice de Tabelas
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo 13
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho 15
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 16
xii
xiii
Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Importacircncia do Complexo Mediador na Actividade Transcricional do Yap8
Copyright Ana Rita Ladeira Courelas da Silva FCTUNL UNL
A Faculdade de Ciecircncias e Tecnologia e a Universidade Nova de Lisboa tecircm o direito perpeacutetuo e sem
limites geograacuteficos de arquivar e publicar esta dissertaccedilatildeo atraveacutes de exemplares impressos
reproduzidos em papel ou de forma digital ou por qualquer outro meio conhecido ou que venha a ser
inventado e de a divulgar atraveacutes de repositoacuterios cientiacuteficos e de admitir a sua coacutepia e distribuiccedilatildeo
com objectivos educacionais ou de investigaccedilatildeo natildeo comerciais desde que seja dado creacutedito ao autor
e editor
O trabalho aqui descrito foi desenvolvido no
Laboratoacuterio Genomics and Stress Instituto de
Tecnologia Quiacutemica e Bioloacutegica Universidade
Nova de Lisboa
i
Agradecimentos
Eacute com enorme satisfaccedilatildeo que exponho aqui o meu sincero agradecimento a todos aqueles que tornaram
possiacutevel a realizaccedilatildeo deste trabalho
Em primeiro lugar venho expressar os meus agradecimentos agrave Professora Doutora Claudina Rodrigues-
Pousada co-orientadora deste trabalho por ter-me recebido no seu laboratoacuterio e por ter acreditado nas
minhas capacidades
Em segundo lugar um profundo agradecimento agrave Doutora Regina Menezes pela excelecircncia na orientaccedilatildeo
cientiacutefica leccionaccedilatildeo apoio e disponibilidade em todos os momentos
Aos meus Pais pelo apoio incondicional
Ao Andreacute por toda a compreensatildeo e amor
Agrave Soraia por todas as dicas uacuteteis e amizade
Aos meus colegas do laboratoacuterio Genomics and Stress pelo excelente conviacutevio o que me proporcionou uma
enorme satisfaccedilatildeo em desenvolver este trabalho neste laboratoacuterio
Aos meus amigos Daniel e Carina pelos cafeacutes e conversas que tanto me ajudaram a aliviar o cansaccedilo
ii
iii
Sumaacuterio
Os processos adaptativos agraves mudanccedilas ambientais ocorrem principalmente atraveacutes da reprogramaccedilatildeo da
expressatildeo geneacutetica A activaccedilatildeo de genes de stress eacute controlada por factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que
facilitam o recrutamento do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras O
complexo Mediador eacute um co-activador necessaacuterio para a activaccedilatildeo de vaacuterios genes tanto em leveduras como
em mamiacuteferos O domiacutenio da cauda deste complexo interage com alguns factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos
transmitindo o sinal de activaccedilatildeo para a maquinaria basal de transcriccedilatildeo enquanto o domiacutenio CDK8 eacute
responsaacutevel pela regulaccedilatildeo do complexo podendo exercer uma funccedilatildeo activadora ou repressora Em
Saccharomyces cerevisiae o factor de transcriccedilatildeo Yap8 desempenha um papel primordial na resposta ao
stress induzido pelo arseacutenio Na presenccedila de arseacutenio o Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo regulando a activaccedilatildeo
transcricional dos genes ACR2 e ACR3 que codificam para uma redutase de arsenato e uma proteiacutena da
membrana respectivamente Neste trabalho investigaram-se os mecanismos atraveacutes dos quais o Yap8 induz
a activaccedilatildeo transcricional do gene ACR2 e avaliou-se a importacircncia do complexo Mediador neste processo
Os resultados obtidos indicam que as subunidades Med2 Med3 Med14 Med15 e Med16 da cauda do
complexo Mediador satildeo importantes para a sobrevivecircncia da levedura ao stress imposto pelo arseacutenio Na
ausecircncia destas subunidades a capacidade do Yap8 em activar a transcriccedilatildeo dos genes lacZ e ACR2 eacute
drasticamente reduzida Foi tambeacutem demonstrado que o Yap8 estabelece interacccedilotildees fiacutesicas com a
subunidade Med2 e desta forma transmite o sinal de activaccedilatildeo para maquinaria basal de transcriccedilatildeo Aleacutem
disso os resultados mostram que o moacutedulo CDK8 exerce a funccedilatildeo de regulador negativo da actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 destabilizando quer oYap8 quer o Med2
Palavras-chave S cerevisiae arseacutenio Yap8 Mediador transcriccedilatildeo
iv
v
Abstract
The adaption to environmental changes is mainly promoted through reprogramming of gene expression
This process is tightly orchestrated by specific transcription factors which sense the stress signal and
mediate the recruitment of the pre-initiation complex to the promoter of its target genes The Mediator
complex is also required for full activation of many genes in yeast and mammals The tail domain of this
complex interacts with some transcription factors and transduces the activation signal to the basal
transcription machinery The CDK8 domain regulates the activity of the Mediator complex exerting either a
positive or negative regulatory role In Saccharomyces cerevisiae the Yap8 regulatory protein plays a pivotal
role in arsenic stress responses It is accumulated in the nucleus upon arsenic insult and regulates
transcriptional activation of ACR2 and ACR3 which encodes the arsenate-reductase and the plasma
membrane arsenite-efflux protein respectively This work aimed to study the mechanisms by which Yap8
induces the transcriptional activation of ACR2 and to evaluate the importance of the Mediator complex in
this process The results indicate that the subunits Med2 Med3 Med14 Med15 and Med16 of the Mediator
tail domain are important for the adaptation of yeast cells to arsenic stress In the mutants for the respective
subunits Yap8 failed to activate transcription of the lacZ reporter gene and ACR2 Furthermore it was
shown that Yap8 physically interacts with Mediator through the Med2 subunit which thus transmits the
activation signal to the basal transcription machinery The CDK8 module serves as a negative regulator of
Yap8 trans-activation activity since it destabilizes bothYap8 and Med2
Key-words S cerevisiae arsenic Yap8 Mediator transcription
vi
vii
Iacutendice Geral
1 Introduccedilatildeo 1
11 O arseacutenio no ambiente e na sauacutede 1
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico 2
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap 2
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio 5
15 O complexo Mediador 7
16 Objectivos 12
2 Materiais e Meacutetodos 13
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento 13
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 14
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura 17
24 Anaacutelises fenotiacutepicas 17
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido 18
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido 18
27 Ensaio de Two-hybrid 18
28 Northern-blot 19
29 Western-blot 20
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo 21
3 Resultados e Discussatildeo 23
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio 23
32 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do Yap8 mas natildeo
interferem nos seus niacuteveis de mRNA e proteiacutena 25
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 27
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8 29
viii
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da ceacutelula
ao stress pelos compostos de arseacutenio 33
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 35
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2 36
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais 39
5 Referecircncias Bibliograacuteficas 41
ix
Iacutendice de Figuras
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4 4
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap 5
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e destoxificaccedilatildeo
do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae 7
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador 9
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo 10
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae e humano 11
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio 24
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada 26
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura 28
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 29
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura 30
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema Two-hybrid 31
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo 32
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 33
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido
pelos compostos de arseacutenio 34
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8 36
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 37
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo 40
x
xi
Iacutendice de Tabelas
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo 13
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho 15
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 16
xii
xiii
Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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O trabalho aqui descrito foi desenvolvido no
Laboratoacuterio Genomics and Stress Instituto de
Tecnologia Quiacutemica e Bioloacutegica Universidade
Nova de Lisboa
i
Agradecimentos
Eacute com enorme satisfaccedilatildeo que exponho aqui o meu sincero agradecimento a todos aqueles que tornaram
possiacutevel a realizaccedilatildeo deste trabalho
Em primeiro lugar venho expressar os meus agradecimentos agrave Professora Doutora Claudina Rodrigues-
Pousada co-orientadora deste trabalho por ter-me recebido no seu laboratoacuterio e por ter acreditado nas
minhas capacidades
Em segundo lugar um profundo agradecimento agrave Doutora Regina Menezes pela excelecircncia na orientaccedilatildeo
cientiacutefica leccionaccedilatildeo apoio e disponibilidade em todos os momentos
Aos meus Pais pelo apoio incondicional
Ao Andreacute por toda a compreensatildeo e amor
Agrave Soraia por todas as dicas uacuteteis e amizade
Aos meus colegas do laboratoacuterio Genomics and Stress pelo excelente conviacutevio o que me proporcionou uma
enorme satisfaccedilatildeo em desenvolver este trabalho neste laboratoacuterio
Aos meus amigos Daniel e Carina pelos cafeacutes e conversas que tanto me ajudaram a aliviar o cansaccedilo
ii
iii
Sumaacuterio
Os processos adaptativos agraves mudanccedilas ambientais ocorrem principalmente atraveacutes da reprogramaccedilatildeo da
expressatildeo geneacutetica A activaccedilatildeo de genes de stress eacute controlada por factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que
facilitam o recrutamento do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras O
complexo Mediador eacute um co-activador necessaacuterio para a activaccedilatildeo de vaacuterios genes tanto em leveduras como
em mamiacuteferos O domiacutenio da cauda deste complexo interage com alguns factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos
transmitindo o sinal de activaccedilatildeo para a maquinaria basal de transcriccedilatildeo enquanto o domiacutenio CDK8 eacute
responsaacutevel pela regulaccedilatildeo do complexo podendo exercer uma funccedilatildeo activadora ou repressora Em
Saccharomyces cerevisiae o factor de transcriccedilatildeo Yap8 desempenha um papel primordial na resposta ao
stress induzido pelo arseacutenio Na presenccedila de arseacutenio o Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo regulando a activaccedilatildeo
transcricional dos genes ACR2 e ACR3 que codificam para uma redutase de arsenato e uma proteiacutena da
membrana respectivamente Neste trabalho investigaram-se os mecanismos atraveacutes dos quais o Yap8 induz
a activaccedilatildeo transcricional do gene ACR2 e avaliou-se a importacircncia do complexo Mediador neste processo
Os resultados obtidos indicam que as subunidades Med2 Med3 Med14 Med15 e Med16 da cauda do
complexo Mediador satildeo importantes para a sobrevivecircncia da levedura ao stress imposto pelo arseacutenio Na
ausecircncia destas subunidades a capacidade do Yap8 em activar a transcriccedilatildeo dos genes lacZ e ACR2 eacute
drasticamente reduzida Foi tambeacutem demonstrado que o Yap8 estabelece interacccedilotildees fiacutesicas com a
subunidade Med2 e desta forma transmite o sinal de activaccedilatildeo para maquinaria basal de transcriccedilatildeo Aleacutem
disso os resultados mostram que o moacutedulo CDK8 exerce a funccedilatildeo de regulador negativo da actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 destabilizando quer oYap8 quer o Med2
Palavras-chave S cerevisiae arseacutenio Yap8 Mediador transcriccedilatildeo
iv
v
Abstract
The adaption to environmental changes is mainly promoted through reprogramming of gene expression
This process is tightly orchestrated by specific transcription factors which sense the stress signal and
mediate the recruitment of the pre-initiation complex to the promoter of its target genes The Mediator
complex is also required for full activation of many genes in yeast and mammals The tail domain of this
complex interacts with some transcription factors and transduces the activation signal to the basal
transcription machinery The CDK8 domain regulates the activity of the Mediator complex exerting either a
positive or negative regulatory role In Saccharomyces cerevisiae the Yap8 regulatory protein plays a pivotal
role in arsenic stress responses It is accumulated in the nucleus upon arsenic insult and regulates
transcriptional activation of ACR2 and ACR3 which encodes the arsenate-reductase and the plasma
membrane arsenite-efflux protein respectively This work aimed to study the mechanisms by which Yap8
induces the transcriptional activation of ACR2 and to evaluate the importance of the Mediator complex in
this process The results indicate that the subunits Med2 Med3 Med14 Med15 and Med16 of the Mediator
tail domain are important for the adaptation of yeast cells to arsenic stress In the mutants for the respective
subunits Yap8 failed to activate transcription of the lacZ reporter gene and ACR2 Furthermore it was
shown that Yap8 physically interacts with Mediator through the Med2 subunit which thus transmits the
activation signal to the basal transcription machinery The CDK8 module serves as a negative regulator of
Yap8 trans-activation activity since it destabilizes bothYap8 and Med2
Key-words S cerevisiae arsenic Yap8 Mediator transcription
vi
vii
Iacutendice Geral
1 Introduccedilatildeo 1
11 O arseacutenio no ambiente e na sauacutede 1
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico 2
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap 2
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio 5
15 O complexo Mediador 7
16 Objectivos 12
2 Materiais e Meacutetodos 13
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento 13
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 14
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura 17
24 Anaacutelises fenotiacutepicas 17
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido 18
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido 18
27 Ensaio de Two-hybrid 18
28 Northern-blot 19
29 Western-blot 20
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo 21
3 Resultados e Discussatildeo 23
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio 23
32 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do Yap8 mas natildeo
interferem nos seus niacuteveis de mRNA e proteiacutena 25
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 27
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8 29
viii
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da ceacutelula
ao stress pelos compostos de arseacutenio 33
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 35
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2 36
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais 39
5 Referecircncias Bibliograacuteficas 41
ix
Iacutendice de Figuras
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4 4
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap 5
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e destoxificaccedilatildeo
do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae 7
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador 9
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo 10
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae e humano 11
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio 24
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada 26
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura 28
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 29
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura 30
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema Two-hybrid 31
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo 32
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 33
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido
pelos compostos de arseacutenio 34
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8 36
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 37
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo 40
x
xi
Iacutendice de Tabelas
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo 13
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho 15
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 16
xii
xiii
Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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i
Agradecimentos
Eacute com enorme satisfaccedilatildeo que exponho aqui o meu sincero agradecimento a todos aqueles que tornaram
possiacutevel a realizaccedilatildeo deste trabalho
Em primeiro lugar venho expressar os meus agradecimentos agrave Professora Doutora Claudina Rodrigues-
Pousada co-orientadora deste trabalho por ter-me recebido no seu laboratoacuterio e por ter acreditado nas
minhas capacidades
Em segundo lugar um profundo agradecimento agrave Doutora Regina Menezes pela excelecircncia na orientaccedilatildeo
cientiacutefica leccionaccedilatildeo apoio e disponibilidade em todos os momentos
Aos meus Pais pelo apoio incondicional
Ao Andreacute por toda a compreensatildeo e amor
Agrave Soraia por todas as dicas uacuteteis e amizade
Aos meus colegas do laboratoacuterio Genomics and Stress pelo excelente conviacutevio o que me proporcionou uma
enorme satisfaccedilatildeo em desenvolver este trabalho neste laboratoacuterio
Aos meus amigos Daniel e Carina pelos cafeacutes e conversas que tanto me ajudaram a aliviar o cansaccedilo
ii
iii
Sumaacuterio
Os processos adaptativos agraves mudanccedilas ambientais ocorrem principalmente atraveacutes da reprogramaccedilatildeo da
expressatildeo geneacutetica A activaccedilatildeo de genes de stress eacute controlada por factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que
facilitam o recrutamento do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras O
complexo Mediador eacute um co-activador necessaacuterio para a activaccedilatildeo de vaacuterios genes tanto em leveduras como
em mamiacuteferos O domiacutenio da cauda deste complexo interage com alguns factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos
transmitindo o sinal de activaccedilatildeo para a maquinaria basal de transcriccedilatildeo enquanto o domiacutenio CDK8 eacute
responsaacutevel pela regulaccedilatildeo do complexo podendo exercer uma funccedilatildeo activadora ou repressora Em
Saccharomyces cerevisiae o factor de transcriccedilatildeo Yap8 desempenha um papel primordial na resposta ao
stress induzido pelo arseacutenio Na presenccedila de arseacutenio o Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo regulando a activaccedilatildeo
transcricional dos genes ACR2 e ACR3 que codificam para uma redutase de arsenato e uma proteiacutena da
membrana respectivamente Neste trabalho investigaram-se os mecanismos atraveacutes dos quais o Yap8 induz
a activaccedilatildeo transcricional do gene ACR2 e avaliou-se a importacircncia do complexo Mediador neste processo
Os resultados obtidos indicam que as subunidades Med2 Med3 Med14 Med15 e Med16 da cauda do
complexo Mediador satildeo importantes para a sobrevivecircncia da levedura ao stress imposto pelo arseacutenio Na
ausecircncia destas subunidades a capacidade do Yap8 em activar a transcriccedilatildeo dos genes lacZ e ACR2 eacute
drasticamente reduzida Foi tambeacutem demonstrado que o Yap8 estabelece interacccedilotildees fiacutesicas com a
subunidade Med2 e desta forma transmite o sinal de activaccedilatildeo para maquinaria basal de transcriccedilatildeo Aleacutem
disso os resultados mostram que o moacutedulo CDK8 exerce a funccedilatildeo de regulador negativo da actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 destabilizando quer oYap8 quer o Med2
Palavras-chave S cerevisiae arseacutenio Yap8 Mediador transcriccedilatildeo
iv
v
Abstract
The adaption to environmental changes is mainly promoted through reprogramming of gene expression
This process is tightly orchestrated by specific transcription factors which sense the stress signal and
mediate the recruitment of the pre-initiation complex to the promoter of its target genes The Mediator
complex is also required for full activation of many genes in yeast and mammals The tail domain of this
complex interacts with some transcription factors and transduces the activation signal to the basal
transcription machinery The CDK8 domain regulates the activity of the Mediator complex exerting either a
positive or negative regulatory role In Saccharomyces cerevisiae the Yap8 regulatory protein plays a pivotal
role in arsenic stress responses It is accumulated in the nucleus upon arsenic insult and regulates
transcriptional activation of ACR2 and ACR3 which encodes the arsenate-reductase and the plasma
membrane arsenite-efflux protein respectively This work aimed to study the mechanisms by which Yap8
induces the transcriptional activation of ACR2 and to evaluate the importance of the Mediator complex in
this process The results indicate that the subunits Med2 Med3 Med14 Med15 and Med16 of the Mediator
tail domain are important for the adaptation of yeast cells to arsenic stress In the mutants for the respective
subunits Yap8 failed to activate transcription of the lacZ reporter gene and ACR2 Furthermore it was
shown that Yap8 physically interacts with Mediator through the Med2 subunit which thus transmits the
activation signal to the basal transcription machinery The CDK8 module serves as a negative regulator of
Yap8 trans-activation activity since it destabilizes bothYap8 and Med2
Key-words S cerevisiae arsenic Yap8 Mediator transcription
vi
vii
Iacutendice Geral
1 Introduccedilatildeo 1
11 O arseacutenio no ambiente e na sauacutede 1
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico 2
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap 2
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio 5
15 O complexo Mediador 7
16 Objectivos 12
2 Materiais e Meacutetodos 13
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento 13
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 14
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura 17
24 Anaacutelises fenotiacutepicas 17
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido 18
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido 18
27 Ensaio de Two-hybrid 18
28 Northern-blot 19
29 Western-blot 20
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo 21
3 Resultados e Discussatildeo 23
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio 23
32 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do Yap8 mas natildeo
interferem nos seus niacuteveis de mRNA e proteiacutena 25
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 27
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8 29
viii
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da ceacutelula
ao stress pelos compostos de arseacutenio 33
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 35
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2 36
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais 39
5 Referecircncias Bibliograacuteficas 41
ix
Iacutendice de Figuras
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4 4
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap 5
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e destoxificaccedilatildeo
do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae 7
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador 9
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo 10
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae e humano 11
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio 24
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada 26
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura 28
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 29
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura 30
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema Two-hybrid 31
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo 32
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 33
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido
pelos compostos de arseacutenio 34
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8 36
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 37
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo 40
x
xi
Iacutendice de Tabelas
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo 13
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho 15
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 16
xii
xiii
Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Yujun D e Tamaacutes MJ 2006 Regulation of the arsenic-responsive transcription factor Yap8p
involves the ubiquitin-proteasome pathway Journal of Cell Science 120 256-264
Zhou X Arita A Ellen TP Liu X Bai J Rooney JP Kurtz AD Catherine BK Dai W
Begley TJ e Costa M 2009 A genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae reveals pathways
affected by arsenic toxicity Genomics 94(5) 294-307
ii
iii
Sumaacuterio
Os processos adaptativos agraves mudanccedilas ambientais ocorrem principalmente atraveacutes da reprogramaccedilatildeo da
expressatildeo geneacutetica A activaccedilatildeo de genes de stress eacute controlada por factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que
facilitam o recrutamento do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras O
complexo Mediador eacute um co-activador necessaacuterio para a activaccedilatildeo de vaacuterios genes tanto em leveduras como
em mamiacuteferos O domiacutenio da cauda deste complexo interage com alguns factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos
transmitindo o sinal de activaccedilatildeo para a maquinaria basal de transcriccedilatildeo enquanto o domiacutenio CDK8 eacute
responsaacutevel pela regulaccedilatildeo do complexo podendo exercer uma funccedilatildeo activadora ou repressora Em
Saccharomyces cerevisiae o factor de transcriccedilatildeo Yap8 desempenha um papel primordial na resposta ao
stress induzido pelo arseacutenio Na presenccedila de arseacutenio o Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo regulando a activaccedilatildeo
transcricional dos genes ACR2 e ACR3 que codificam para uma redutase de arsenato e uma proteiacutena da
membrana respectivamente Neste trabalho investigaram-se os mecanismos atraveacutes dos quais o Yap8 induz
a activaccedilatildeo transcricional do gene ACR2 e avaliou-se a importacircncia do complexo Mediador neste processo
Os resultados obtidos indicam que as subunidades Med2 Med3 Med14 Med15 e Med16 da cauda do
complexo Mediador satildeo importantes para a sobrevivecircncia da levedura ao stress imposto pelo arseacutenio Na
ausecircncia destas subunidades a capacidade do Yap8 em activar a transcriccedilatildeo dos genes lacZ e ACR2 eacute
drasticamente reduzida Foi tambeacutem demonstrado que o Yap8 estabelece interacccedilotildees fiacutesicas com a
subunidade Med2 e desta forma transmite o sinal de activaccedilatildeo para maquinaria basal de transcriccedilatildeo Aleacutem
disso os resultados mostram que o moacutedulo CDK8 exerce a funccedilatildeo de regulador negativo da actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 destabilizando quer oYap8 quer o Med2
Palavras-chave S cerevisiae arseacutenio Yap8 Mediador transcriccedilatildeo
iv
v
Abstract
The adaption to environmental changes is mainly promoted through reprogramming of gene expression
This process is tightly orchestrated by specific transcription factors which sense the stress signal and
mediate the recruitment of the pre-initiation complex to the promoter of its target genes The Mediator
complex is also required for full activation of many genes in yeast and mammals The tail domain of this
complex interacts with some transcription factors and transduces the activation signal to the basal
transcription machinery The CDK8 domain regulates the activity of the Mediator complex exerting either a
positive or negative regulatory role In Saccharomyces cerevisiae the Yap8 regulatory protein plays a pivotal
role in arsenic stress responses It is accumulated in the nucleus upon arsenic insult and regulates
transcriptional activation of ACR2 and ACR3 which encodes the arsenate-reductase and the plasma
membrane arsenite-efflux protein respectively This work aimed to study the mechanisms by which Yap8
induces the transcriptional activation of ACR2 and to evaluate the importance of the Mediator complex in
this process The results indicate that the subunits Med2 Med3 Med14 Med15 and Med16 of the Mediator
tail domain are important for the adaptation of yeast cells to arsenic stress In the mutants for the respective
subunits Yap8 failed to activate transcription of the lacZ reporter gene and ACR2 Furthermore it was
shown that Yap8 physically interacts with Mediator through the Med2 subunit which thus transmits the
activation signal to the basal transcription machinery The CDK8 module serves as a negative regulator of
Yap8 trans-activation activity since it destabilizes bothYap8 and Med2
Key-words S cerevisiae arsenic Yap8 Mediator transcription
vi
vii
Iacutendice Geral
1 Introduccedilatildeo 1
11 O arseacutenio no ambiente e na sauacutede 1
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico 2
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap 2
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio 5
15 O complexo Mediador 7
16 Objectivos 12
2 Materiais e Meacutetodos 13
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento 13
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 14
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura 17
24 Anaacutelises fenotiacutepicas 17
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido 18
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido 18
27 Ensaio de Two-hybrid 18
28 Northern-blot 19
29 Western-blot 20
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo 21
3 Resultados e Discussatildeo 23
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio 23
32 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do Yap8 mas natildeo
interferem nos seus niacuteveis de mRNA e proteiacutena 25
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 27
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8 29
viii
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da ceacutelula
ao stress pelos compostos de arseacutenio 33
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 35
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2 36
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais 39
5 Referecircncias Bibliograacuteficas 41
ix
Iacutendice de Figuras
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4 4
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap 5
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e destoxificaccedilatildeo
do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae 7
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador 9
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo 10
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae e humano 11
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio 24
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada 26
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura 28
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 29
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura 30
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema Two-hybrid 31
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo 32
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 33
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido
pelos compostos de arseacutenio 34
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8 36
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 37
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo 40
x
xi
Iacutendice de Tabelas
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo 13
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho 15
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 16
xii
xiii
Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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iii
Sumaacuterio
Os processos adaptativos agraves mudanccedilas ambientais ocorrem principalmente atraveacutes da reprogramaccedilatildeo da
expressatildeo geneacutetica A activaccedilatildeo de genes de stress eacute controlada por factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que
facilitam o recrutamento do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras O
complexo Mediador eacute um co-activador necessaacuterio para a activaccedilatildeo de vaacuterios genes tanto em leveduras como
em mamiacuteferos O domiacutenio da cauda deste complexo interage com alguns factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos
transmitindo o sinal de activaccedilatildeo para a maquinaria basal de transcriccedilatildeo enquanto o domiacutenio CDK8 eacute
responsaacutevel pela regulaccedilatildeo do complexo podendo exercer uma funccedilatildeo activadora ou repressora Em
Saccharomyces cerevisiae o factor de transcriccedilatildeo Yap8 desempenha um papel primordial na resposta ao
stress induzido pelo arseacutenio Na presenccedila de arseacutenio o Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo regulando a activaccedilatildeo
transcricional dos genes ACR2 e ACR3 que codificam para uma redutase de arsenato e uma proteiacutena da
membrana respectivamente Neste trabalho investigaram-se os mecanismos atraveacutes dos quais o Yap8 induz
a activaccedilatildeo transcricional do gene ACR2 e avaliou-se a importacircncia do complexo Mediador neste processo
Os resultados obtidos indicam que as subunidades Med2 Med3 Med14 Med15 e Med16 da cauda do
complexo Mediador satildeo importantes para a sobrevivecircncia da levedura ao stress imposto pelo arseacutenio Na
ausecircncia destas subunidades a capacidade do Yap8 em activar a transcriccedilatildeo dos genes lacZ e ACR2 eacute
drasticamente reduzida Foi tambeacutem demonstrado que o Yap8 estabelece interacccedilotildees fiacutesicas com a
subunidade Med2 e desta forma transmite o sinal de activaccedilatildeo para maquinaria basal de transcriccedilatildeo Aleacutem
disso os resultados mostram que o moacutedulo CDK8 exerce a funccedilatildeo de regulador negativo da actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 destabilizando quer oYap8 quer o Med2
Palavras-chave S cerevisiae arseacutenio Yap8 Mediador transcriccedilatildeo
iv
v
Abstract
The adaption to environmental changes is mainly promoted through reprogramming of gene expression
This process is tightly orchestrated by specific transcription factors which sense the stress signal and
mediate the recruitment of the pre-initiation complex to the promoter of its target genes The Mediator
complex is also required for full activation of many genes in yeast and mammals The tail domain of this
complex interacts with some transcription factors and transduces the activation signal to the basal
transcription machinery The CDK8 domain regulates the activity of the Mediator complex exerting either a
positive or negative regulatory role In Saccharomyces cerevisiae the Yap8 regulatory protein plays a pivotal
role in arsenic stress responses It is accumulated in the nucleus upon arsenic insult and regulates
transcriptional activation of ACR2 and ACR3 which encodes the arsenate-reductase and the plasma
membrane arsenite-efflux protein respectively This work aimed to study the mechanisms by which Yap8
induces the transcriptional activation of ACR2 and to evaluate the importance of the Mediator complex in
this process The results indicate that the subunits Med2 Med3 Med14 Med15 and Med16 of the Mediator
tail domain are important for the adaptation of yeast cells to arsenic stress In the mutants for the respective
subunits Yap8 failed to activate transcription of the lacZ reporter gene and ACR2 Furthermore it was
shown that Yap8 physically interacts with Mediator through the Med2 subunit which thus transmits the
activation signal to the basal transcription machinery The CDK8 module serves as a negative regulator of
Yap8 trans-activation activity since it destabilizes bothYap8 and Med2
Key-words S cerevisiae arsenic Yap8 Mediator transcription
vi
vii
Iacutendice Geral
1 Introduccedilatildeo 1
11 O arseacutenio no ambiente e na sauacutede 1
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico 2
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap 2
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio 5
15 O complexo Mediador 7
16 Objectivos 12
2 Materiais e Meacutetodos 13
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento 13
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 14
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura 17
24 Anaacutelises fenotiacutepicas 17
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido 18
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido 18
27 Ensaio de Two-hybrid 18
28 Northern-blot 19
29 Western-blot 20
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo 21
3 Resultados e Discussatildeo 23
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio 23
32 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do Yap8 mas natildeo
interferem nos seus niacuteveis de mRNA e proteiacutena 25
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 27
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8 29
viii
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da ceacutelula
ao stress pelos compostos de arseacutenio 33
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 35
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2 36
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais 39
5 Referecircncias Bibliograacuteficas 41
ix
Iacutendice de Figuras
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4 4
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap 5
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e destoxificaccedilatildeo
do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae 7
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador 9
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo 10
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae e humano 11
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio 24
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada 26
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura 28
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 29
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura 30
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema Two-hybrid 31
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo 32
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 33
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido
pelos compostos de arseacutenio 34
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8 36
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 37
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo 40
x
xi
Iacutendice de Tabelas
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo 13
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho 15
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 16
xii
xiii
Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Begley TJ e Costa M 2009 A genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae reveals pathways
affected by arsenic toxicity Genomics 94(5) 294-307
iv
v
Abstract
The adaption to environmental changes is mainly promoted through reprogramming of gene expression
This process is tightly orchestrated by specific transcription factors which sense the stress signal and
mediate the recruitment of the pre-initiation complex to the promoter of its target genes The Mediator
complex is also required for full activation of many genes in yeast and mammals The tail domain of this
complex interacts with some transcription factors and transduces the activation signal to the basal
transcription machinery The CDK8 domain regulates the activity of the Mediator complex exerting either a
positive or negative regulatory role In Saccharomyces cerevisiae the Yap8 regulatory protein plays a pivotal
role in arsenic stress responses It is accumulated in the nucleus upon arsenic insult and regulates
transcriptional activation of ACR2 and ACR3 which encodes the arsenate-reductase and the plasma
membrane arsenite-efflux protein respectively This work aimed to study the mechanisms by which Yap8
induces the transcriptional activation of ACR2 and to evaluate the importance of the Mediator complex in
this process The results indicate that the subunits Med2 Med3 Med14 Med15 and Med16 of the Mediator
tail domain are important for the adaptation of yeast cells to arsenic stress In the mutants for the respective
subunits Yap8 failed to activate transcription of the lacZ reporter gene and ACR2 Furthermore it was
shown that Yap8 physically interacts with Mediator through the Med2 subunit which thus transmits the
activation signal to the basal transcription machinery The CDK8 module serves as a negative regulator of
Yap8 trans-activation activity since it destabilizes bothYap8 and Med2
Key-words S cerevisiae arsenic Yap8 Mediator transcription
vi
vii
Iacutendice Geral
1 Introduccedilatildeo 1
11 O arseacutenio no ambiente e na sauacutede 1
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico 2
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap 2
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio 5
15 O complexo Mediador 7
16 Objectivos 12
2 Materiais e Meacutetodos 13
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento 13
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 14
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura 17
24 Anaacutelises fenotiacutepicas 17
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido 18
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido 18
27 Ensaio de Two-hybrid 18
28 Northern-blot 19
29 Western-blot 20
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo 21
3 Resultados e Discussatildeo 23
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio 23
32 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do Yap8 mas natildeo
interferem nos seus niacuteveis de mRNA e proteiacutena 25
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 27
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8 29
viii
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da ceacutelula
ao stress pelos compostos de arseacutenio 33
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 35
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2 36
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais 39
5 Referecircncias Bibliograacuteficas 41
ix
Iacutendice de Figuras
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4 4
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap 5
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e destoxificaccedilatildeo
do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae 7
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador 9
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo 10
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae e humano 11
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio 24
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada 26
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura 28
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 29
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura 30
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema Two-hybrid 31
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo 32
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 33
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido
pelos compostos de arseacutenio 34
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8 36
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 37
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo 40
x
xi
Iacutendice de Tabelas
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo 13
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho 15
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 16
xii
xiii
Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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v
Abstract
The adaption to environmental changes is mainly promoted through reprogramming of gene expression
This process is tightly orchestrated by specific transcription factors which sense the stress signal and
mediate the recruitment of the pre-initiation complex to the promoter of its target genes The Mediator
complex is also required for full activation of many genes in yeast and mammals The tail domain of this
complex interacts with some transcription factors and transduces the activation signal to the basal
transcription machinery The CDK8 domain regulates the activity of the Mediator complex exerting either a
positive or negative regulatory role In Saccharomyces cerevisiae the Yap8 regulatory protein plays a pivotal
role in arsenic stress responses It is accumulated in the nucleus upon arsenic insult and regulates
transcriptional activation of ACR2 and ACR3 which encodes the arsenate-reductase and the plasma
membrane arsenite-efflux protein respectively This work aimed to study the mechanisms by which Yap8
induces the transcriptional activation of ACR2 and to evaluate the importance of the Mediator complex in
this process The results indicate that the subunits Med2 Med3 Med14 Med15 and Med16 of the Mediator
tail domain are important for the adaptation of yeast cells to arsenic stress In the mutants for the respective
subunits Yap8 failed to activate transcription of the lacZ reporter gene and ACR2 Furthermore it was
shown that Yap8 physically interacts with Mediator through the Med2 subunit which thus transmits the
activation signal to the basal transcription machinery The CDK8 module serves as a negative regulator of
Yap8 trans-activation activity since it destabilizes bothYap8 and Med2
Key-words S cerevisiae arsenic Yap8 Mediator transcription
vi
vii
Iacutendice Geral
1 Introduccedilatildeo 1
11 O arseacutenio no ambiente e na sauacutede 1
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico 2
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap 2
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio 5
15 O complexo Mediador 7
16 Objectivos 12
2 Materiais e Meacutetodos 13
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento 13
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 14
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura 17
24 Anaacutelises fenotiacutepicas 17
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido 18
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido 18
27 Ensaio de Two-hybrid 18
28 Northern-blot 19
29 Western-blot 20
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo 21
3 Resultados e Discussatildeo 23
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio 23
32 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do Yap8 mas natildeo
interferem nos seus niacuteveis de mRNA e proteiacutena 25
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 27
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8 29
viii
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da ceacutelula
ao stress pelos compostos de arseacutenio 33
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 35
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2 36
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais 39
5 Referecircncias Bibliograacuteficas 41
ix
Iacutendice de Figuras
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4 4
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap 5
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e destoxificaccedilatildeo
do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae 7
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador 9
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo 10
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae e humano 11
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio 24
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada 26
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura 28
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 29
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura 30
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema Two-hybrid 31
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo 32
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 33
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido
pelos compostos de arseacutenio 34
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8 36
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 37
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo 40
x
xi
Iacutendice de Tabelas
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo 13
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho 15
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 16
xii
xiii
Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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therapy The Oncologist 6(2)3-10
Yujun D e Tamaacutes MJ 2006 Regulation of the arsenic-responsive transcription factor Yap8p
involves the ubiquitin-proteasome pathway Journal of Cell Science 120 256-264
Zhou X Arita A Ellen TP Liu X Bai J Rooney JP Kurtz AD Catherine BK Dai W
Begley TJ e Costa M 2009 A genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae reveals pathways
affected by arsenic toxicity Genomics 94(5) 294-307
vi
vii
Iacutendice Geral
1 Introduccedilatildeo 1
11 O arseacutenio no ambiente e na sauacutede 1
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico 2
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap 2
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio 5
15 O complexo Mediador 7
16 Objectivos 12
2 Materiais e Meacutetodos 13
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento 13
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 14
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura 17
24 Anaacutelises fenotiacutepicas 17
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido 18
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido 18
27 Ensaio de Two-hybrid 18
28 Northern-blot 19
29 Western-blot 20
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo 21
3 Resultados e Discussatildeo 23
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio 23
32 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do Yap8 mas natildeo
interferem nos seus niacuteveis de mRNA e proteiacutena 25
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 27
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8 29
viii
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da ceacutelula
ao stress pelos compostos de arseacutenio 33
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 35
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2 36
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais 39
5 Referecircncias Bibliograacuteficas 41
ix
Iacutendice de Figuras
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4 4
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap 5
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e destoxificaccedilatildeo
do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae 7
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador 9
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo 10
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae e humano 11
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio 24
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada 26
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura 28
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 29
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura 30
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema Two-hybrid 31
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo 32
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 33
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido
pelos compostos de arseacutenio 34
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8 36
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 37
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo 40
x
xi
Iacutendice de Tabelas
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo 13
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho 15
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 16
xii
xiii
Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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vii
Iacutendice Geral
1 Introduccedilatildeo 1
11 O arseacutenio no ambiente e na sauacutede 1
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico 2
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap 2
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio 5
15 O complexo Mediador 7
16 Objectivos 12
2 Materiais e Meacutetodos 13
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento 13
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 14
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura 17
24 Anaacutelises fenotiacutepicas 17
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido 18
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido 18
27 Ensaio de Two-hybrid 18
28 Northern-blot 19
29 Western-blot 20
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo 21
3 Resultados e Discussatildeo 23
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio 23
32 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do Yap8 mas natildeo
interferem nos seus niacuteveis de mRNA e proteiacutena 25
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 27
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8 29
viii
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da ceacutelula
ao stress pelos compostos de arseacutenio 33
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 35
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2 36
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais 39
5 Referecircncias Bibliograacuteficas 41
ix
Iacutendice de Figuras
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4 4
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap 5
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e destoxificaccedilatildeo
do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae 7
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador 9
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo 10
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae e humano 11
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio 24
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada 26
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura 28
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 29
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura 30
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema Two-hybrid 31
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo 32
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 33
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido
pelos compostos de arseacutenio 34
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8 36
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 37
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo 40
x
xi
Iacutendice de Tabelas
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo 13
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho 15
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 16
xii
xiii
Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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viii
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da ceacutelula
ao stress pelos compostos de arseacutenio 33
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 35
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2 36
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais 39
5 Referecircncias Bibliograacuteficas 41
ix
Iacutendice de Figuras
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4 4
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap 5
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e destoxificaccedilatildeo
do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae 7
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador 9
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo 10
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae e humano 11
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio 24
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada 26
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura 28
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 29
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura 30
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema Two-hybrid 31
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo 32
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 33
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido
pelos compostos de arseacutenio 34
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8 36
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 37
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo 40
x
xi
Iacutendice de Tabelas
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo 13
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho 15
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 16
xii
xiii
Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Iacutendice de Figuras
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4 4
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap 5
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e destoxificaccedilatildeo
do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae 7
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador 9
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo 10
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae e humano 11
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio 24
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada 26
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura 28
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo do
Yap8 29
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura 30
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema Two-hybrid 31
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo 32
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 33
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido
pelos compostos de arseacutenio 34
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8 36
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 37
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo 40
x
xi
Iacutendice de Tabelas
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo 13
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho 15
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 16
xii
xiii
Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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x
xi
Iacutendice de Tabelas
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo 13
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho 15
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 16
xii
xiii
Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Iacutendice de Tabelas
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo 13
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho 15
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho 16
xii
xiii
Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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xii
xiii
Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Listagem de Abreviaturas e Siglas
As(V) ndash arsenato
As(III) ndash arsenito
HSF ndash Heat shock factors
HSP ndash Heat shock proteins
STRE ndash Stress responsive element
PKA ndash proteiacutena cinase A
YRE ndash Yeast responsive elements
YAP ndash yeast AP-1 like proteins
ACR ndash Arsenic compounds resistance
NES ndash Nuclear export signal
Cys ndash Cisteiacutena
YCF1 ndash Yeast cadmium factor 1
GSH ndash glutationo reduzido
ROS ndash espeacutecies reactivas de oxigeacutenio
TBP ndash TATA-Binding protein
RNA Pol II ndash RNA polimerase II
Med ndash Mediador
CTD ndash Domiacutenio C-terminal
YPD ndash Yeast peptone dextrose
MSC ndash Meio sinteacutetico completo
SD ndash drop-out
CAA ndash casaminoaacutecidos
YNB ndash Yeast nitrogen base
LB ndash Luria Bertani
dNTPs ndash desoxirribonucleoacutetidos
Ura ndash Uracilo
Leu ndash Leucina
Trp ndash Triptofano
UV ndash ultra-violeta
TCA ndash Aacutecido tricloroaceacutetico
EDTA ndash Aacutecido etilenodiamina tetra-aceacutetico
PVDF - polyvinylidene fluoride
L- litro
mL ndash mililitro
xiv
h ndash horas
ordmC ndash graus Celsius
DO600 ndash densidade oacuteptica a 600 nanoacutemetros
microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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microL ndash microlitro
min ndash minuto
mg ndash miligrama
ng ndash nanograma
microg ndash micrograma
nm ndash nanoacutemetros
mM ndash milimolar
M ndash molar
V ndash volts
WT ndash Wild type (estirpe selvagem)
Yap ndash Proteiacutena
YAP ndash Gene
yap ndash Mutante
1
1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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1 Introduccedilatildeo
11 O Arseacutenio no ambiente e na sauacutede
O arseacutenio eacute um metaloacuteide toacutexico e um potente carcinogeacutenio humano largamente distribuiacutedo na
natureza podendo ser encontrado em rochas no solo no ar e na aacutegua De facto a presenccedila de
compostos de arseacutenio nos lenccediloacuteis freaacuteticos que satildeo utilizados como aacutegua potaacutevel em diversos paiacuteses
tais como Bangladesh Chile e China (Jaumlrup 2003) representa um grave problema de sauacutede puacuteblica
Tambeacutem em Portugal existem localidades onde a aacutegua eacute contaminada com arseacutenio sendo a aacuterea mais
criacutetica o concelho de Ponte de Socircr (IRARERSAR)
O arseacutenio pode ser encontrado na natureza sob quatro estados oxidativos As(V) (arsenato) As(III)
(arsenito) As(0) (arseacutenio orgacircnico) e As(-III) (arsenido) As formas inorgacircnicas arsenato e arsenito
satildeo libertadas para o ambiente atraveacutes de fenoacutemenos naturais como as erupccedilotildees vulcacircnicas e tambeacutem
devido a causas antropogeacutenicas destacando-se as actividades de extracccedilatildeo de minerais fundiccedilatildeo do
cobre queima do carvatildeo e outros processos de combustatildeo O arseacutenio inorgacircnico tambeacutem eacute utilizado
como composto activo de diversos insecticidas herbicidas e rodenticidas
Os microrganismos possuem um papel importante na acumulaccedilatildeo de arseacutenio no ambiente sendo o
arsenito produzido e libertado por microrganismos que utilizam o arsenato como aceitador final de
electrotildees na respiraccedilatildeo anaeroacutebia Por outro lado os microrganismos capazes de oxidar o arsenito
utilizam o seu poder redutor na obtenccedilatildeo de energia para o crescimento celular enquanto outros
conseguem converter o arseacutenio inorgacircnico em gaacutes de arsenido metilado ou em espeacutecies de arseacutenio
orgacircnico soluacuteveis em liacutepidos e na aacutegua que incluem derivados do arseacutenio di e tri-metilado
(Bhattacharjee e Rosen 2007)
A exposiccedilatildeo croacutenica aos compostos de arseacutenio estaacute associada a inuacutemeras doenccedilas que incluem o
cancro de fiacutegado rins pulmatildeo pele bexiga ovaacuterios e proacutestata (Vahter 2009 Evens et al 2004)
Embora seja classificado como um agente carcinogeacutenico do grupo A pela Agecircncia de Protecccedilatildeo do
Ambiente (Environmental Protection Agency EPA) a exposiccedilatildeo croacutenica ao arseacutenio tambeacutem ocasiona
outras doenccedilas como hiperqueratose diabetes mellitus doenccedilas cardiovasculares neuroloacutegicas e
respiratoacuterias (Vahter 2009)
Apesar da sua conhecida toxicidade diversos faacutermacos que contecircm arseacutenio como princiacutepio activo
fazem parte da terapia moderna O trioacutexido de arseacutenio eacute utilizado no tratamento da leucemia
promielociacutetica aguda uma vez que eacute capaz de induzir a maturaccedilatildeo e apoptose dessas ceacutelulas
canceriacutegenas inibir a proliferaccedilatildeo das ceacutelulas tumorais e a angiogeacutenese e reduzir a densidade
microvascular da medula oacutessea associada agrave doenccedila (Momeny et al 2010 Ghavamzadeh et al 2006
Evens et al 2004 Waxman e Anderson 2001) Aleacutem do mais a utilizaccedilatildeo do trioacutexido de arseacutenio tem-
-se revelado eficaz no tratamento de cancros hematoloacutegicos e soacutelidos (Evens et al 2004) e de doenccedilas
2
causadas por protozoaacuterios como Trypanosoma spp e Leishmania spp (Thorsen et al 2006 Murray
2004 Barrett et al 2003)
Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Para uma utilizaccedilatildeo eficaz destes compostos na terapia meacutedica torna-se imperativo uma
caracterizaccedilatildeo exaustiva das vias celulares de absorccedilatildeo o estudo das proteiacutenas reguladoras que
modulam a actividade dessas vias tal como os sistemas que medeiam a destoxificaccedilatildeo e toleracircncia ao
niacutevel molecular
12 Saccharomyces cerevisiae como modelo bioloacutegico
A levedura Saccharomyces cerevisiae tem provado ao longo dos anos ser um excelente organismo
modelo para o estudo de uma grande variedade de funccedilotildees celulares baacutesicas que satildeo conservadas em
ceacutelulas de eucarioacutetas superiores
Satildeo diversas as caracteriacutesticas que fazem da levedura um organismo adequado para o estudos
geneacuteticos bioquiacutemicos e celulares As leveduras podem ser cultivadas em meios de crescimento
relativamente baratos e possuem um tempo de duplicaccedilatildeo curto (Sherman 2002) comparativamente
com as ceacutelulas eucarioacuteticas superiores aspectos estes que permitem o isolamento de uma grande
quantidade de material bioloacutegico para estudos moleculares e bioquiacutemicos (Altmann et al 2007) O
facto de ser de faacutecil manipulaccedilatildeo geneacutetica e do seu genoma ter sido tornado puacuteblico em 1996 tendo
cerca de 6000 genes codificantes para proteiacutenas muitos apresentando ortoacutelogos em eucariotas
superiores torna a levedura torna um modelo ideal para a caracterizaccedilatildeo funcional destes genes
(Goffeau et al 1996 Dujon et al 1994) Uma das aplicaccedilotildees mais recentes eacute a sua utilizaccedilatildeo como
modelo experimental para o estudo das doenccedilas neurodegenerativas De facto em 2003 foi
demonstrado que leveduras expressando o gene que codifica para a α-sinucleiacutena podem servir como
rdquotubos de ensaio vivosrdquo Esta proteiacutena compromete a funccedilatildeo do ceacuterebro humano em pessoas com
doenccedila de Parkinson e nas leveduras uma coacutepia deste gene natildeo altera o crescimento celular enquanto
que duas coacutepias tornam-se letais (Outeiro e Lindquist 2003) Outras aplicaccedilotildees mais recentes estatildeo
relacionadas com o estudo dos efeitos citotoacutexicos genotoacutexicos e mutageacutenicos de diversos compostos
como o difenil ditelluride (DPDT) (Degrandi et al 2010) ou com a identificaccedilatildeo dos compostos
toacutexicos e genotoacutexicos em sedimentos marinhos (Frassinetti et al 2011)
13 Resposta ao stress na levedura e a famiacutelia dos factores de transcriccedilatildeo Yap
A capacidade de adaptaccedilatildeo dos organismos agraves alteraccedilotildees das condiccedilotildees intra- e extra-celulares eacute
um preacute-requisito para a sua sobrevivecircncia e evoluccedilatildeo A existecircncia de mecanismos moleculares
responsaacuteveis pela resposta reparaccedilatildeo e adaptaccedilatildeo a estas condiccedilotildees tornam as ceacutelulas suficientemente
3
plaacutesticas para se ajustarem ao meio ambiente em constante alteraccedilatildeo evento homeostaacutetico este
tambeacutem designado por resposta ao stress (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Quando exposta a uma panoacuteplia de agressotildees ambientais a levedura Saccharomyces cerevisiae
desencadeia uma complexa reprogramaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica que envolve a diminuiccedilatildeo da
expressatildeo de genes housekeeping e da siacutentese proteica e o aumento da expressatildeo de genes que
codificam para proteiacutenas de stress Entre as proteiacutenas de stress estatildeo incluiacutedas as chaperonas
moleculares responsaacuteveis pela manutenccedilatildeo da conformaccedilatildeo das proteiacutenas de certos factores de
transcriccedilatildeo que modulam a expressatildeo geneacutetica dos transportadores de membrana das proteiacutenas
envolvidas na reparaccedilatildeo do DNA e das vias de destoxificaccedilatildeo de elementos toacutexicos para as ceacutelulas
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
Entre os vaacuterios factores de transcriccedilatildeo envolvidos na resposta geral ao stress estatildeo os HSFs (Heat
Shock Factors) que se ligam ao elemento cis HSE (Heat Shock Element) 5rsquonGAAn3rsquo e modulam a
expressatildeo das Hsps (Heat Shock Proteins) particularmente necessaacuterias na manutenccedilatildeo da estrutura de
proteiacutenas danificadas por condiccedilotildees de stress como choque teacutermico stress oxidativo privaccedilatildeo de
azoto transiccedilatildeo para a fase estacionaacuteria e exposiccedilatildeo a diamida Os factores Msn2 e Msn4 reconhecem
a sequecircncia 5rsquoCCCCT3rsquo denominada elemento de resposta ao stress (STRE) e satildeo regulados
negativamente pelos niacuteveis de cAMP e pela actividade da proteiacutena cinase A (PKA) (Rodrigues-
Pousada et al 2010 Martinez-Pastor et al 1996 Hightower 1991)
No entanto condiccedilotildees de stress especiacuteficas originam respostas celulares diferentes isto eacute a
reprogramaccedilatildeo geneacutetica necessaacuteria para garantir a sobrevivecircncia a uma determinada condiccedilatildeo de stress
depende dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que satildeo estimulados e do conjunto de genes que estes
regulam Os factores de transcriccedilatildeo da famiacutelia Yap (Yeast AP1-like Protein) actuam como reguladores
da transcriccedilatildeo de genes relacionados com a resposta a vaacuterias condiccedilotildees de stress em S cerevisiae Esta
famiacutelia eacute constituiacuteda por oito membros do Yap1 ao Yap8 cujos domiacutenios de ligaccedilatildeo ao DNA
apresentam semelhanccedila com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gcn4 a proteiacutena AP-1 convencional de
S cerevisiae (figura 11) O domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA dos membros desta famiacutelia designado por b-
ZIP DNA-binding-domain eacute composto por uma regiatildeo conservada (regiatildeo baacutesica) responsaacutevel pela
interacccedilatildeo com o DNA que antecede um motivo proteico denominado ldquofecho com leucinasrdquo (figura
12) Este motivo eacute essencial para a dimerizaccedilatildeo destes factores de transcriccedilatildeo estrutura em que satildeo
activos (Rodrigues-Pousada et al 2010)
Embora exista uma grande semelhanccedila na estrutura primaacuteria do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA entre
os membros da famiacutelia Yap e o Gcn4 alguns resiacuteduos especiacuteficos conferem diferentes propriedades de
ligaccedilatildeo ao DNA (figura 12) De uma maneira geral os membros da famiacutelia Yap reconhecem
sequecircncias genoacutemicas designadas por YRE (Yeast Responsive Elements) Os membros Yap1-Yap6
reconhecem a sequecircncia canoacutenica TTACGTAA enquanto o Yap8 reconhece a sequecircncia
4
TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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TGATTAATAATCA O local de ligaccedilatildeo do Yap7 ainda natildeo foi caracterizado (Amaral et al
resultados natildeo publicados Rodrigues-Pousada et al 2010 Ilina et al 2008)
Figura 11 Representaccedilatildeo da estrutura do domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do factor de transcriccedilatildeo Gcn4
(adaptado de httphigheredbcswileycom)
Em S cerevisiae o Yap1 eacute o principal regulador envolvido na resposta ao stress oxidativo e ao
stress imposto por vaacuterios metais enquanto o Yap2 estaacute principalmente relacionado com a resposta ao
stress induzido pelo caacutedmio O Yap4 e o Yap6 satildeo reguladores importantes no stress osmoacutetico e
nutricional o Yap5 estaacute envolvido no metabolismo do ferro o Yap3 participa nos mecanismos de
toleracircncia aos metabolitos fenoacutelicos do benzeno e o Yap8 desempenha um papel fundamental na
destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio (North et al 2011 Rodrigues-Pousada et al 2010) Ao Yap7
ainda natildeo foram atribuiacutedas funccedilotildees especiacuteficas Apesar destes factores de transcriccedilatildeo possuiacuterem
funccedilotildees especiacuteficas parece haver um certo grau de sobreposiccedilatildeo funcional entre eles O Yap1 regula a
activaccedilatildeo transcricional do YAP4 enquanto o Yap4 parece ser capaz de formar heterodiacutemeros com o
Yap6 (Rodrigues-Pousada et al 2010) No stress imposto pelos compostos de arseacutenio o Yap1 eacute capaz
de se ligar agraves sequecircncias de reconhecimento do Yap8 e activar a expressatildeo dos seus genes alvo
(Rodrigues-Pousada et al 2010) Estes aspectos demonstram que a regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica
em condiccedilotildees de stress implica a cooperaccedilatildeo entre vaacuterios reguladores transcricionais
DNA
Diacutemero de Gcn4
5
Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
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consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Figura 12 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos domiacutenios funcionais dos membros da famiacutelia Yap
(Rodrigues-Pousada et al 2010)
14 Yap1 e Yap8 na destoxificaccedilatildeo dos compostos de arseacutenio
Quando a levedura S cerevisiae eacute exposta a ambientes contaminados com arseacutenio vaacuterios
mecanismos celulares para a sua destoxificaccedilatildeo satildeo activados O principal mecanismo eacute composto por
proteiacutenas codificadas pelos genes pertencentes ao cluster ACR (Arsenic Compounds Resistance) O
gene ACR1YAP8 codifica para o Yap8 que eacute constitutivamente expresso e maioritariamente
localizado no citoplasma da ceacutelula em condiccedilotildees fisioloacutegicas Apoacutes a induccedilatildeo pelos compostos de
arseacutenio o Yap8 eacute activado possivelmente devido agrave alquilaccedilatildeo dos resiacuteduos de cisteiacutena Cys132
Cys137
e
Cys274
e retido no nuacutecleo Esta retenccedilatildeo deve-se agrave importaccedilatildeo constitutiva para o nuacutecleo atraveacutes da
importina PseI e interrupccedilatildeo da sua exportaccedilatildeo para o citoplasma devido agrave disrupccedilatildeo da interacccedilatildeo
entre o NES (Nuclear Export Signal) e a exportina Crm1 causada pela modificaccedilatildeo das cisteiacutenas do
Yap8 pelo arseacutenio Uma vez acumulado no nuacutecleo o Yap8 activa os genes ACR2 e ACR3 que
6
codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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codificam para uma redutase de arsenato e uma bomba de efluxo de arsenito respectivamente
(Menezes et al 2004)
Outro membro da famiacutelia Yap o Yap1 tambeacutem contribui para adaptaccedilatildeo celular aos compostos de
arseacutenio Aleacutem de cooperar com o Yap8 na activaccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 o Yap1 eacute o principal
regulador da activaccedilatildeo transcricional do gene YCF1 (Yeast Cadmium Factor 1) o qual codifica para
uma ATPase que facilita o sequestro de arsenito conjugado com glutationo para o vacuacuteolo
(Bhattacharjee e Rosen 2007 Menezes et al 2004) O Yap1 tambeacutem executa um papel importante na
manutenccedilatildeo do equiliacutebrio redox alterado pelos compostos de arseacutenio atraveacutes da activaccedilatildeo de genes
antioxidantes como TRX2 GSH1 e SOD1 que codificam respectivamente para a tiorredoxina -
glutamilcisteiacutenasintetase e superoacutexido dismutase (Menezes et al 2008)
Tanto o arsenato como o arsenito entram na ceacutelula de uma maneira fortuita utilizando sistemas de
importe celulares Devido agrave sua semelhanccedila estrutural com o fostato o arsenato eacute internalizado atraveacutes
dos transportadores de fosfatos Pho84 Pho86 Pho87 Pho88 e Pho90 (Ghillebert et al 2011 Rosen
2002 Bun-ya et al 1996) Por outro lado a associaccedilatildeo de vaacuterias moleacuteculas de arseacutenio no seu estado
trivalente (As(OH)3) mimetiza um anel de seis membros tal como o anel das hexoses sendo por este
motivo transportado pelos transportadores de hexoses Hxts (Bhattacharjee e Rosen 2007) Entretanto
na presenccedila de glucose a entrada de arsenito na ceacutelula eacute maioritariamente catalisada pela
aquagliceroporina Fps1 (Bhattacharjee e Rosen 2007 Thorsen et al 2006 Rosen 2002)
Uma vez no citoplasma da ceacutelula o arsenato eacute reduzido a arsenito pela enzima redutase de arsenato
sendo este eliminado para o meio extracelular atraveacutes da bomba de efluxo Acr3 ou sequestrado no
vacuacuteolo apoacutes a conjugaccedilatildeo com o glutationo atraveacutes da proteiacutena Ycf1 com dispecircndio de ATP (figura
13) (Menezes et al 2008)
Os efeitos toacutexicos do arseacutenio na levedura satildeo sentidos a diversos niacuteveis O arseacutenio no estado
trivalente eacute mais toacutexico que o pentavalente devido ao facto de este possuir quatro pares de electrotildees
natildeo partilhados que podem interagir com vaacuterias moleacuteculas bioloacutegicas (Kitchin e Ahmad 2003) O
arsenito acumulado no citoplasma eacute capaz de interagir com os grupos tiol das proteiacutenas provocando a
inibiccedilatildeo de vaacuterias vias metaboacutelicas Por exemplo foi demonstrado que o arsenito modifica os resiacuteduos
de cisteiacutena da tubulina interferindo com a sua organizaccedilatildeo e com a montagem dos microtuacutebulos (Zhou
et al 2009) Sendo um anaacutelogo do fosfato o arsenato interfere com as reacccedilotildees de fosforilaccedilatildeo que
satildeo necessaacuterias para a activaccedilatildeo de proteiacutenas e vias metaboacutelicas
A depleccedilatildeo do GSH ocasionada pela reduccedilatildeo do arsenato e conjugaccedilatildeo com As(III) juntamente
com a inibiccedilatildeo da tiorredoxina-redutase leva agrave acumulaccedilatildeo de espeacutecies reactivas de oxigeacutenio (ROS) no
citoplasma e a perturbaccedilatildeo do equiliacutebrio redox As ROS reagem com os centros de ferro-enxofre das
proteiacutenas como descrito pelas reacccedilotildees de Fenton e de Haber-Weiss (Fe2+
+ H2O2 HO + HO
- + Fe
3+
Fe3+
+ O2- O2
+ Fe
2+) produzindo novas espeacutecies reactivas que por sua vez provocam
lipoperoxidaccedilatildeo e danos ao niacutevel do DNA e proteiacutenas (Menezes et al 2008 Dickman 2007 Toledano
7
et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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et al 2003) Aleacutem disto ambas as formas inorgacircnicas de arseacutenio satildeo capazes de libertar iotildees ferro
acumulados na ferritina (Kitchin e Ahmad 2003) resultando numa desregulaccedilatildeo do metabolismo do
ferro
Figura 13 Representaccedilatildeo esquemaacutetica dos transportadores envolvidos na internalizaccedilatildeo e
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio na levedura Saccharomyces cerevisiae (adaptado de Menezes et al 2008)
15 O complexo Mediador
A transcriccedilatildeo de genes eucariotas que codificam para proteiacutenas eacute um processo que envolve muitos
factores transcricionais que actuam em diversos niacuteveis sendo a iniciaccedilatildeo da siacutentese de RNA
mensageiro o passo mais importante da regulaccedilatildeo da expressatildeo geneacutetica Este processo eacute catalisado
pela RNA polimerase (Pol) II e controlado pela maquinaria basal de transcriccedilatildeo que envolve os
factores de transcriccedilatildeo gerais TBP (TATA-binding protein) TFIIA -B -D -E -F e -H necessaacuterios
para a eficiente iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Casamassimi e Napoli et al 2007 Lodish et al 2000) Aleacutem
destes factores de transcriccedilatildeo gerais a actividade dos complexos remodeladores e modificadores da
cromatina como o SAGA e o SwiSnf eacute tambeacutem fundamental para a correcta iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo
O SAGA eacute um complexo proteico que conteacutem a proteiacutena Gcn5 a qual tem como funccedilatildeo a acetilaccedilatildeo
preferencial da histona H3 dos nucleossomas levando ao relaxamento do empacotamento dos
cromossomas Esta acetilaccedilatildeo das histonas promove locais de ligaccedilatildeo para as proteiacutenas remodeladoras
da cromatina do complexo SwiSnf como as Swi2Snf2 Por sua vez o complexo SAGA tambeacutem
pode actuar independentemente da sua funccedilatildeo de histona acetiltransferase em alguns promotores Este
eacute capaz de interagir directamente com a TBP atraveacutes das suas subunidades Spt3 e Spt8 promovendo o
iniacutecio da transcriccedilatildeo (Leroy et al 2006)
A identificaccedilatildeo do complexo Mediador em S cerevisiae foi efectuada na deacutecada de 90 utilizando-
se teacutecnicas de geneacutetica e bioquiacutemica (Kelleher et al 1990) Este complexo desempenha a funccedilatildeo de
As(III)
As(V)
As(III)
As(V)
As(III)
As(III)
Vacuacuteolo
As(III)
GSH
As(III)-3GS
As(III)-3GS
Acr3
ATP
ADP+Pi
Hxt
Fps1
Pho87
Ycf1
Acr2
Pho84
Pho89
Pho86
Pho90
8
ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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ldquoMediadorrdquo entre os factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos como activadores ou repressores e a
maquinaria basal de transcriccedilatildeo contendo a RNA polimerase II e os factores de transcriccedilatildeo gerais
(Kornberg 2006 Biddick e Young 2005) A principal funccedilatildeo do Mediador estaacute associada ao aumento
da eficiecircncia na formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo bem como ao recrutamento da RNA
polimerase II TFIID e outros factores de transcriccedilatildeo gerais para a regiatildeo promotora dos genes sob o
seu controlo atraveacutes da interacccedilatildeo directa com estes elementos (Casamassimi e Napoli 2007)
O Mediador eacute um complexo proteico constituiacutedo por quatro moacutedulos designados por cauda cabeccedila
domiacutenio intermeacutedio e domiacutenio Cdk8 (figura 14) cada um desempenhando funccedilotildees especiacuteficas
(Casamassimi e Napoli 2007) A cauda do Mediador inclui as proteiacutenas Med2 Med3 Med5 Med14
Med15 e Med16 e interage com os activadores e repressores transcricionais (Herbig et al 2010) O
moacutedulo intermeacutedio que conteacutem as subunidades Med1 Med4 Med7 Med9 Med10 Med21 e Med31
transfere o sinal regulatoacuterio da cauda para a cabeccedila do Mediador apoacutes a sua ligaccedilatildeo com os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Lewis e Reinberg 2003) Por sua vez o moacutedulo da cabeccedila eacute o que contacta e
transfere o sinal de induccedilatildeo para a RNA polimerase II (Soutourina et al 2011 Davis et al 2002) e
para a TBP sendo constituiacutedo pelas proteiacutenas Med6 Med8 Med11 Med17 Med18 Med19 Med20 e
Med22 (Casamassimi e Napoli 2007) O domiacutenio regulatoacuterio do complexo eacute composto pelas
subunidades Med12 Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e uma ciclina designada por
CycC (Bourbon 2008) Quando o domiacutenio regulatoacuterio natildeo estaacute associado aos outros moacutedulos do
Mediador este eacute designado por C(ldquocorerdquo)-Mediador enquanto os complexos que contecircm os quatro
moacutedulos eacute designado por L-Mediador (Casamassimi e Napoli 2007)
A actividade do complexo Mediador eacute importante natildeo soacute para a activaccedilatildeo transcricional de genes
sob condiccedilotildees ambientais especiacuteficas (Bjorklund e Gustafsson 2005 Kornberg 2005 Fan et al
2006) mas tambeacutem para a expressatildeo basal de muitos genes in vitro (Thompson e Young 1995
Holstege et al 1998) e in vivo (Andrau et al 2006) Na sua forma inactiva o complexo Mediador
encontra-se sob uma conformaccedilatildeo fechada com as subunidades do domiacutenio intermeacutedio e cabeccedila
interagindo entre si Apoacutes a ligaccedilatildeo de determinados elementos regulatoacuterios como os factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos o Mediador sofre uma mudanccedila na sua estrutura adoptando uma conformaccedilatildeo
aberta e criando uma superfiacutecie de contacto para recrutar os factores de transcriccedilatildeo gerais e a RNA
polimerase II (Chadick e Asturias 2005) (figura 15) A forma desfosforilada do domiacutenio C-terminal
(CTD) da RNA polimerase II estaacute associada agrave formaccedilatildeo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo enquanto que a
sua fosforilaccedilatildeo leva ao iniacutecio da elongaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Bjoumlrlund e Gustafsson 2005) Foi
demonstrado que o Mediador atraveacutes do seu domiacutenio regulatoacuterio CDK8 fosforila o CTD da RNA
polimerase II (Sogaard e Svejstrup 2007 Liu et al 2004) levando agrave abertura do complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo e dissociaccedilatildeo da RNA polimerase II do Mediador (Casamassimi e Napoli 2007) Entretanto
o Mediador e alguns componentes do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo incluindo a TBP TFIIE e TFIIH
permanecem ligados agrave regiatildeo promotora de alguns genes apoacutes a libertaccedilatildeo da RNA polimerase II que
9
vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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vai dar iniacutecio agrave elongaccedilatildeo para facilitar a formaccedilatildeo de novo do complexo de preacute-iniciaccedilatildeo (figura 15)
(Chadick e Asturias 2005)
Figura 14 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura e organizaccedilatildeo das subunidades que compotildeem o
complexo Mediador (adaptado de Gluglielmi et al 2004)
As primeiras evidecircncias relacionadas com a actividade do complexo Mediador indicavam que o C-
Mediador actuava como regulador positivo da transcriccedilatildeo enquanto o L-Mediador possuiacutea uma
actividade repressora devido agrave fosforilaccedilatildeo de proteiacutenas especiacuteficas pela Cdk8 Corroborando esta
ideia foi descrito que a fosforilaccedilatildeo do Gcn4 pela Cdk8 serve como um sinal para a sua degradaccedilatildeo
pelo protesossoma enquanto a fosforilaccedilatildeo do Msn2 impede a sua acumulaccedilatildeo nuclear (Chi et al
2001) Aleacutem disso tambeacutem foi descrito que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de se ligar ao domiacutenio
intermeacutedio e agrave cabeccedila do Mediador bloqueando estericamente a sua interacccedilatildeo com a RNA polimerase
II (Elmund et al 2006) No entanto algumas evidecircncias sugerem que o moacutedulo CDK8 tambeacutem pode
exercer actividades de regulaccedilatildeo positiva Por exemplo a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a
activaccedilatildeo da transcriccedilatildeo do gene PDR5 induzida pela perda do genoma mitocondrial (Shahi et al
2010) e a activaccedilatildeo de genes controlados pelo factor de transcriccedilatildeo Sip4 eacute dependente da cinase Cdk8
em condiccedilotildees de privaccedilatildeo de glucose (Vincent et al 2001) Em conjunto estes resultados satildeo
Cauda Domiacutenio Intermeacutedio Cabeccedila
Domiacutenio Cdk8
10
consistentes com a ideia de que o moacutedulo CDK8 influencia a regulaccedilatildeo da transcriccedilatildeo de uma maneira
que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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que eacute dependente do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos sendo capaz de
inibir ou estimular a expressatildeo geneacutetica
Figura 15 Representaccedilatildeo esquemaacutetica da estrutura do Mediador nas diversas etapas da iniciaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo (adaptado de Chadick e Asturias 2005)
A estrutura do complexo Mediador das leveduras exibe extensa similaridade com o Mediador de
humanos (figura 16) (Cai et al 2009) Todas as subunidades do Mediador humano possuem ortoacutelogos
em S cerevisiae agrave excepccedilatildeo das subunidades Med2 Med3 e Med5 (Conaway et al 2005) e tal como
na levedura a RNA polimerase II parece interagir com o domiacutenio intermeacutedio e a cabeccedila do Mediador
(i) (ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
Montagem
DNA-factor de transcriccedilatildeo
Complexo fechado
Mediador-DNA
Montagem RNA
Pol II-promotor
Recrutamento
RNA Pol II-
TFIIF
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo fechado
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo aberto
Elongaccedilatildeo da
transcriccedilatildeo
Re-iniciaccedilatildeo
da
transcriccedilatildeo
Complexo de
preacute-iniciaccedilatildeo
11
sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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sendo ambos sujeitos a alteraccedilotildees conformacionais similares para que este contacto possa ocorrer (Cai
et al 2009) A similaridade estrutural e molecular do complexo Mediador em leveduras e humanos
reflecte-se tambeacutem em semelhanccedila funcional O Mediador humano encontra-se organizado sob os
mesmos moacutedulos tendo a cauda a cabeccedila e a zona intermeacutedia as mesmas funccedilotildees que o Mediador em
S cerevisiae (Casamassimi e Napoli 2007) Agrave semelhanccedila do moacutedulo CDK8 da levedura tambeacutem o
moacutedulo CDK8 do Mediador de humanos parece executar funccedilotildees de regulador positivo ou negativo A
cinase Cdk8 de humanos eacute capaz de fosforilar e inibir o TFIIH (Akoulitchev et al 2000) e bloquear as
interacccedilotildees entre o Mediador e a RNA polimerase II (Knuesel et al 2008) ou de promover a activaccedilatildeo
da transcriccedilatildeo do receptor da hormona tiroacuteide (Belakavadi e Fondell 2010) Foi demonstrado que
quando hiper-activa a cinase Cdk8 induz a sobre-expressatildeo de β-catenina sendo assim capaz de
transformar ceacutelulas do coacutelon normais em canceriacutegenas (Firestein et al 2008) Por esta razatildeo o gene
CDK8 pode ser considerado um proto-oncogene
Figura 16 Comparaccedilatildeo entre a estrutura do complexo Mediador de S cerevisiae obtida por
computador atraveacutes da reconstruccedilatildeo de imagens de cryo-EM e estrutura do Mediador humano obtida
por cryo-EM (adaptado de Cai et al 2009)
Humano Humano Levedura Levedura
Anterior Direita
Esquerda
Frente
Posterior
12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Begley TJ e Costa M 2009 A genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae reveals pathways
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12
16 Objectivos
Apesar de se conhecer o mecanismo pelo qual a ceacutelula combate o arseacutenio e qual a contribuiccedilatildeo do
Yap8 para este efeito continua por se desvendar o mecanismo pelo qual o Yap8 induz o recrutamento
da maquinaria basal de transcriccedilatildeo de forma a activar a transcriccedilatildeo dos genes ACR2 e ACR3 em
resposta ao stress por arseacutenio Neste contexto o presente trabalho teve como objectivo geral a
caracterizaccedilatildeo do papel do complexo Mediador na activaccedilatildeo do gene ACR2
Assim pretendeu-se
1) Determinar a contribuiccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador para a adaptaccedilatildeo celular
ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
2) Avaliar a importacircncia do Mediador para a transcriccedilatildeo do YAP8 e do seu gene alvo ACR2
3) Avaliar a importacircncia do Mediador para a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8
4) Estabelecer as possiacuteveis interacccedilotildees fiacutesicas entre o Yap8 e as subunidades da cauda do
Mediador
5) Determinar a importacircncia do moacutedulo regulatoacuterio CDK8 do Mediador na adaptaccedilatildeo da
levedura ao stress pelo arseacutenio
6) Investigar o papel regulador do moacutedulo CDK8 na actividade do Yap8
13
2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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2 Materiais e Meacutetodos
21 Estirpes e condiccedilotildees de crescimento
As estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo estatildeo indicadas na tabela 21 Os
inoacuteculos celulares foram incubados a 30ordmC em meio completo Yeast Peptone Dextrose (YPD)
[extracto de levedura 1 (BD Biosciences) bacto-peptona 2 (BD Biosciences) glucose 2
(VWR)] em meio sinteacutetico completo (MSC) [yeast nitrogen base (YNB) 67 gL (BD Biosciences)
casCAA 06 (BD Biosciences) glucose 2 triptofano 002 (Sigma) adenina 001 (Sigma)
uracilo 002 (Sigma)] meio rico com casaminoacidos natildeo suplementado com uracilo (CAA-Ura)
(YNB 67gL casCAA 06 glucose 2 triptofano 002 adenina 001) ou meio sinteacutetico ldquodrop-
outrdquo (SD) [(arginina 002 (Sigma) isoleucina 003 (Sigma) lisina 003 (Sigma) metionina
002 (Sigma) fenilalanina 005 (Sigma) treonina 02 (Sigma) tirosina 003 (Sigma) valina
015 (Sigma) glucose 2 YNB 67gL] suplementado com os aminoaacutecidos apropriados de acordo
com a auxotrofia das diferentes estirpes A estirpe de Escherichia coli XL1-Blue (genoacutetipo recA1
endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lacI [FrsquoproAB lacIqZDM15 Tn10 (Tetr)] Stratagene) foi
usada como hospedeira para os procedimentos de amplificaccedilatildeo e clonagem de DNA As culturas
celulares bacterianas foram incubadas a 37ordmC em meio Luria-Bertani (LB) [triptona 1 (Merck)
extracto de levedura 05 NaCl2 05 (Merck) pH 75] Para selecccedilatildeo dos plasmiacutedeos utilizados
neste estudo foi adicionado antibioacutetico ampicilina (Sigma) ou canamicina (AppliChem) numa
concentraccedilatildeo final de 100microgmL e 50microgmL respectivamente
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo
Estirpe Genoacutetipo Referecircncia
W303-1A MATa ura3 lys2 his4 leu2 spt13LEU2 Leroy et al 2006
DY3168 (med14) MATa his3 leu2 ura3 ade2 trp1 can1-100
lys2 med14-100 Leroy et al 2006
BY4742 MATα his31 leu20 met150 ura30 EUROSCARF
BY4742 (med2) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YDL005ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med3) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL025ckanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med5) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YGL151wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med15) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YOL051wkanMX4 EUROSCARF
BY4742 (med16) MATα his31 leu20 lys20 ura30
YNL236wkanMX4 EUROSCARF
14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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14
Tabela 21 Estirpes de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste estudo (continuaccedilatildeo)
Estirpe Genoacutetipo Fonte
Y190
MATa ura3-52 his3-200 lys2-801 ade2-101
trp1-901 leu2-3 112 gal4Δ met- gal80Δ
LYS2GAL1UAS-HIS3TATA-HIS3
URA3GAL1UAS-GAL1TATA-lacz
Clontech
SEY6210 MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 suc2-9 Mel- Shahi et al 2010
PSY42 (med12) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY56 (med13) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-80 Mel- med12kanMX4
Shahi et al 2010
PSY50 (cycC) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cycCkanMX4
Shahi et al 2010
PSY79 (cdk8) MATα leu2-3 -112ura3-52 his3200 trp1-
901 lys2-801 Mel- cdk8TRP1
Shahi et al 2010
22 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Uma listagem dos oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho assim como dos plasmiacutedeos utilizados
e construiacutedos eacute fornecida nas tabelas 22 e 23 respectivamente Os genes MED2 MED3 MED5
MED14 MED16 e YAP8 foram amplificados por PCR a partir de 50ng de DNA genoacutemico da estirpe
BY4742 A construccedilatildeo YAP8-c-MYC foi obtida apoacutes amplificaccedilatildeo do 50ng do plasmiacutedeo pRSYAP8
utilizando os oligonucleoacutetidos indicados A reacccedilatildeo de PCR foi executada utilizando-se 25pmoL de
cada oligonucleoacutetido (STABvida) 025mM de dNTPs (Invitrogen) 0025 unidades (U) de Phusion
(Finnzymes) e as condiccedilotildees indicadas pelo fabricante Os ciclos de PCR foram realizados no
termocilador Trio-Thermoblock (Biometra) Os respectivos DNAs molde foram desnaturados durante
1 min a 98ordmC e foram efectuados 35 ciclos de repeticcedilatildeo dos passos 10 seg a 98ordmC 30 seg a 50ordm-59ordmC
(de acordo com a temperatura de melting de cada oligonucleotiacutedeo) e 1-3 min a 72ordmC (de acordo com o
tamanho do fragmento a ser amplificado) terminando-se com uma extensatildeo final de 10 min a 72ordmC
15
Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Tabela 22 Oligonucleoacutetidos utilizados neste trabalho
Gene Sequecircncia Utilizaccedilatildeo
ACR2 5rsquoaacgtctaggcaactcaaggg3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquogcttgaggagctcaaccactaa3rsquo
YAP8 5rsquogaagccttcacttactc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquocattaaggtcttttcgtc3rsquo
U3 5rsquogaatccaacttggttgatgagtcc3rsquo Sonda para
Northern-blot 5rsquoccatagagccctatcccttcaaaa3rsquo
MED2 5rsquoccacccgggatggtagtacaaaatagcc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED2 5rsquoccacccgggctatatattgaagccgctg3rsquo
MED3 5rsquogggatggactcgattatacc3rsquo Construccedilatildeo
GADMED3 5rsquogggtcacaaatccatgttcag3rsquo
MED5 5rsquogggatcgaaaaagaatcagt3rsquo Construccedilatildeo
GADMED5 5rsquogggtcagaatacgcatgttttc3rsquo
MED14 5rsquogggatgactaccacgatagg3rsquo Construccedilatildeo
GADMED14 5rsquogggctaagatgaacttgagttcg3rsquo
MED16 5rsquogggatgatgcttggagagca3rsquo Construccedilatildeo
GADMED16 5rsquogggtcagccgtccatctcaaa3rsquo
YAP8 5rsquoccacccgggatggcaaaaccgcgtggaa3rsquo Construccedilatildeo
GADYAP8 5rsquoccacccgggttataattttgacgaaaag3rsquo
YAP8 5rsquogtagccatggcaaaaccgcgtggaagaaaag3rsquo Construccedilatildeo
GBDYAP8 5rsquocccggtcgacaatattataattttgacga3rsquo
YAP8
5rsquoctaggcaactcaagggcc3rsquo Construccedilatildeo YAP8-
c-MYC 2micro 5rsquocatctagagtcgaccctagtacaagaccgcc3rsquo
MED2
5rsquocggtgaccgaggtgaataat3rsquo (A1)
Construccedilatildeo
MED2-HA
5rsquocgttataaaccgcgcaaaaa3rsquo (A4)
5rsquocctcagcggcttcaatataatgtacccatacgatgttccag
attacgcttagcttggtcttcctattgt3rsquo
(MED2HA_FW)
5rsquoacaataggaagaccaagctaagcgtaatctggaacatcg
tatgggtacatctattgaagccgctg3rsquo
(MED2HA_RV)
16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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16
Tabela 23 Plasmiacutedeos utilizados e construiacutedos neste trabalho
Plasmiacutedeo Descriccedilatildeo Fonte
pGADT7 Domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 fusionado com
HA 2micro (GAD-HA) Clontech
pGBKT7 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 fusionado
com c-MYC 2micro (GBD-c-MYC) Clontech
pGADMED2 GAD-HA-MED2 Este estudo
pGADMED3 GAD-HA-MED3 Este estudo
pGADMED5 GAD-HA-MED5 Este estudo
pGADMED14 GAD-HA-MED14 Este estudo
pGADMED16 GAD-HA-MED16 Este estudo
pGADYAP8 GAD-HA-YAP8 Este estudo
pGBDYAP8 GBD-c-MYC-YAP8 Este estudo
pSH1834 Gene reporter lacZ com o LexAop-lacZ 2micro Gyuris et al 1993
pRSYAP8 YAP8-c-MYC CEN Amaral et al natildeo
publicado
YEp195YAP8 YAP8-c-MYC 2micro Este estudo
pRSMED2 MED2-HA CEN Este estudo
lexAYAP8 Domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do LexA fusionado
com YAP8 Menezes et al 2004
pRS416 CEN Stratagene
YEplac195 2micro Stratagene
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se o kit DNA Clean amp Concentrator
(ZymoResearch) A construccedilatildeo MED2-HA foi obtida atraveacutes da amplificaccedilatildeo do gene MED2
utilizando-se 50ng do DNA genoacutemico da estirpe BY4742 Duas reacccedilotildees de PCR foram efectuadas
separadamente utilizando-se os conjuntos de oligonucleoacutetidos A4Med2HA_FW (produto 1) e
A1Med2HA_RV (produto 2) Apoacutes a purificaccedilatildeo do DNA conforme descrito acima foi realizada um
novo PCR onde os produtos 1 e 2 foram utilizados como DNA molde 500ng dos respectivos
plasmiacutedeos (indicados na tabela 23) foram digeridos com 1U de SmaI (Fermentas) durante 1h a 30ordmC
e a enzima foi inactivada durante 5 min a 65ordmC A reacccedilatildeo de ligaccedilatildeo foi realizada utilizando-se 50ng
do respectivo vector linearizado os produtos de PCR e 1U da enzima T4 DNA Ligase (New England
Biolabs) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante e o seguinte programa 1h a 22ordmC 14h a 16ordmC
e 10 min a 65ordmC para inactivaccedilatildeo da enzima ligase Os produtos de ligaccedilatildeo foram transformados por
choque teacutermico a 42ordmC durante 45 seg em ceacutelulas de E coli competentes Apoacutes 2 min em gelo foram
adicionados 800microL de SOC [bacto-triptona 2 (Difco) extracto de levedura 05 NaCl 10mM KCl
25mM (Merck) MgCl2 10mM (Sigma) MgSO4 10mM (Sigma) glucose 04] as ceacutelulas foram
incubadas durante 1h a 37ordmC com agitaccedilatildeo e sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 10 min a 1000g
17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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17
Apoacutes ressuspensatildeo do pellet em aproximadamente 100microl de aacutegua as ceacutelulas foram plaqueadas em
meio LB suplementado com agaacuter 2 (BD Biosciences) e ampicilina ou canamicina As placas foram
incubadas durante 16h a 37ordmC Coloacutenias isoladas de E coli contendo os respectivos plasmiacutedeos foram
inoculadas em meio LB contendo o antibioacutetico apropriado e foram efectuadas mini-preparaccedilotildees dos
plasmiacutedeos com o kit ZR Plasmid Miniprep (ZymoResearch) Os plasmiacutedeos foram submetidos a
anaacutelise com enzimas de restriccedilatildeo e os clones com o padratildeo de restriccedilatildeo desejados foram sequenciados
23 Preparaccedilatildeo e transformaccedilatildeo de ceacutelulas competentes de levedura
Foram efectuados preacute-inoacuteculos celulares em 2 mL de YPD que foram incubados durante 16h a
30ordmC com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas posteriormente ateacute uma densidade de 02 x
107 ceacutelulasmL em 10 mL do mesmo meio e novamente incubadas nas mesmas condiccedilotildees ateacute
alcanccedilarem uma densidade oacuteptica a 600 nm (DO600) correspondente a 07-1 x 107
ceacutelulasmL As
suspensotildees de ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 5 min e lavadas duas
vezes com 1 mL de aacutegua bidestilada esteacuteril Foi efectuada mais uma lavagem com 1 mL de soluccedilatildeo
TEAcLi [Tris Base 10mM EDTA 1mM (Merck) Acetato de Liacutetio 01M (Sigma)] o pellet foi
ressuspendido em 200 microL de TEAcLi e as suspensotildees foram incubadas durante 10 min em gelo
Foram adicionados 1microg DNA 50microg de DNA de esperma de salmatildeo (Sigma) e 300microL de soluccedilatildeo
PEG3350 40 (Sigma) Os tubos foram incubados durante 30 min a 30ordmC com agitaccedilatildeo e as ceacutelulas
foram submetidas a um choque teacutermico a 42ordmC durante 15 min em banho-maria Apoacutes centrifugaccedilatildeo a
3000g durante 2 min o pellet foi ressupendido em 200microL de aacutegua bidestilada esteacuteril As ceacutelulas foram
plaqueadas em meio selectivo e incubadas a 30ordmC durante 48h
24 Anaacutelises fenotiacutepicas
Preacute-inoacuteculos das estirpes selvagem BY4742 W303-1A e SEY6210 e respectivos mutantes foram
efectuados em 2 mL de MSC e incubados durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Os preacute-inoacuteculos foram
diluiacutedos para uma densidade de 01 x 107 ceacutelulasmL em 2 mL do mesmo meio e incubados
novamente nas mesmas condiccedilotildees ateacute as culturas alcanccedilarem uma DO600 correspondente a 04-05 x
107
ceacutelulasmL As culturas foram serialmente diluiacutedas e aproximadamente 5000 500 e 50 ceacutelulas
foram inoculadas em MSC soacutelido (como descrito acima com adiccedilatildeo de agaacuter 2) suplementado com
Na2HAsO4 (Sigma) e NaAsO2 (Merck) numa concentraccedilatildeo final de 05 1 15 e 2mM 20microM de CdCl2
(Fluka) 700microM de H2O2 (Sigma) 08M de NaCl e 1mM de CoSO4 (Fluka) As placas de Petri foram
incubadas a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico e o crescimento celular foi
monitorizado apoacutes 48h
18
25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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25 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio soacutelido
Ceacutelulas expressando os respectivos plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 20 mL de meio
de crescimento liacutequido SD-Ura-Leu (como descrito acima e suplementado com histidina 002
triptofano 002 e adenina 001) e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo a
DO600 foi monitorizada e procedeu-se a centrifugaccedilatildeo do volume de cultura necessaacuterio para a obtenccedilatildeo
de 45 x 107 ceacutelulas por cada spot O pellet foi ressuspendido em 5microL do mesmo meio e todo o volume
foi plaqueado em placas de SD-Ura-Leu suplementadas com 1mM de arsenato ou arsenito As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h e cada placa foi coberta com soluccedilatildeo over-lay [5-bromo-4-chloro-
3-indolyl-β-D-Galactopiranosido (x-Gal) 2mgmL (ImmunoSource) dissolvido em dimetilsulfoacutexido
(JTBaker) SDS 02 (Sigma) agarose 1 (Lonza) e tampatildeo LacZ (1mM de sulfato de magneacutesio
(Sigma) 10mM de cloreto de potaacutessio (Sigma) 100mM de tampatildeo fosfato (Sigma)] As placas foram
incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
26 Ensaio de trans-activaccedilatildeo em meio liacutequido
As ceacutelulas foram inoculadas em meio selectivo durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo As suspensotildees
celulares foram diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600
entre 04-05 Foram efectuadas aliacutequotas de 1mL para tubos Eppendorf e o stress foi induzido pela
adiccedilatildeo de 1mM de arsenato ou arsenito durante 1h As ceacutelulas foram centrifugadas a 3000g por 5 min
e ao pellet foi adicionado 1mL de tampatildeo LacZ 500microL de suspensatildeo foram transferidos para novos
tubos Eppendorf ao qual foram adicionados 15microL de clorofoacutermio 100 (Riedel-de Haen) As ceacutelulas
foram permeabilizadas mediante agitaccedilatildeo intensa no vortex 2 vezes durante 10 seg com um intervalo
de 1 min em gelo Foram adicionados 75microl de uma soluccedilatildeo de o-nitrofenil-β-D-galactopiranosido
(ONPG) (Sigma) 3 mgml e foi monitorizado o tempo necessaacuterio para o aparecimento de cor amarela
A reacccedilatildeo foi interrompida pela adiccedilatildeo de 75microL de carbonato de soacutedio 1M (Sigma) e foi monitorizada
a DO420 e a DO550 do sobrenadante apoacutes centrifugaccedilatildeo para separaccedilatildeo das ceacutelulas e do clorofoacutermio
Aos restantes 500microl de suspensatildeo celular procedeu-se agrave leitura da DO600 Os caacutelculos para a
determinaccedilatildeo da actividade da enzima β-Galactosidase foram efectuados atraveacutes da foacutermula
ndash
onde t = tempo de reacccedilatildeo e v = volume de reacccedilatildeo
27 Ensaio de Two-hybrid
A estirpe de S cerevisiae Y190 foi co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o
domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD) e outro codificando o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do
Gal4 (seacuterie pGBD) conforme descrito na secccedilatildeo 22 As ceacutelulas foram plaqueados em meio SD-Leu-
19
Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Trp (conforme descrito acima e suplementado com histidina 002 uracilo 002 adenina 001 e
agaacuter 2) e incubadas durante 48h a 30ordmC
As ceacutelulas expressando os plasmiacutedeos recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio SD-Leu-
Trp e incubadas durante 16h a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes esse periacuteodo foi monitorizada a DO600 e
centrifugaram-se os volumes necessaacuterios para a obtenccedilatildeo de 9 x 107 ceacutelulas por cada spot Para a
monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi utilizado um procedimento semelhante ao descrito
na secccedilatildeo 25 O pellet de ceacutelulas foi ressuspendido em 75microL do mesmo meio de crescimento e todo o
volume foi plaqueado em meio SD-Leu-Trp suplementado ou natildeo com 1mM de arsenato As placas
foram incubadas a 30ordmC durante 3h cada placa foi coberta com a soluccedilatildeo over-lay previamente
descrita e as placas foram incubadas a 37ordmC ateacute ao aparecimento de cor azul
28 Northern-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 30 mL de MSC a 30ordmC com agitaccedilatildeo Apoacutes 16h as culturas foram
diluiacutedas para uma DO600 igual a 01 e novamente incubadas ateacute atingirem uma DO600 entre 04-05 O
stress foi induzido por 1h com a adiccedilatildeo de arsenato ou arsenito numa concentraccedilatildeo final de 1mM As
culturas foram centrifugadas a 3000g durante 2 min Foram adicionados 350microL de uma mistura de
fenol aacutecido e clorofoacutermio na proporccedilatildeo 51 (Sigma) 350microL de tampatildeo LETS [LiAc 01M (Sigma)
Na2EDTA 001M (Merck) Tampatildeo Tris-HCl 001M (Roche) pH 74 SDS 02 (Sigma)] e esferas de
vidro ateacute cobrir o pellet de ceacutelulas Os tubos foram vortexados agrave velocidade maacutexima durante 12 min a
4ordmC e foram incubadas em gelo durante 10 min As amostras foram centrifugadas a 15000g durante 10
min a 4ordmC e a fase aquosa das suspensotildees foi transferida para novos tubos Eppendorf com 1mL de
etanol frio 100 (Carlo Erba) e a precipitaccedilatildeo do RNA ocorreu durante a noite a -80ordmC As amostras
foram centrifugadas a 17000g durante 15 min a 4ordmC o pellet de RNA foi lavado com 200microL de etanol
70 (Carlo Erba) e as amostra foram novamente centrifugadas O RNA foi ressuspendido em 50microL de
aacutegua bidestilada esteacuteril tratada com DEPC (Sigma) e quantificado no moacutedulo Take3 do aparelho
Epoch (BioTeka) de acordo com as recomendaccedilotildees do fabricante 40microg de RNA foram desnaturadas a
65ordmC durante 10 min com loading buffer [formamida 53 (Fluka) MOPS 002M (Sigma) NaOAc
5mM (Sigma) EDTA 1mM formaldeiacutedo 17 (Merck) TDW 07 glicerol 07 (Merck) azul de
bromofenol 0004 brometo de etiacutedeo 003 mgmL (Sigma)] As amostras foram aplicadas num gel
de formaldeiacutedo (agarose 1 MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM e formaldeiacutedo 50 pH 7-
75) e a corrida electroforeacutetica foi realizada durante 3h a 90V utilizando-se o tampatildeo de corrida
MOPS (MOPS 002M NaOAc 5mM EDTA 1mM)O gel de formaldeiacutedo foi cortado de acordo com o
padratildeo de migraccedilatildeo do RNA e foi visualizado num transiluminador de UV de forma a confirmar a
integridade do RNA O excesso de formaldeiacutedo foi removido mediante a incubaccedilatildeo do gel em aacutegua
bidestilada esteacuteril durante 10 min com agitaccedilatildeo suave O sistema foi montado sob o aparelho de
20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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20
transferecircncia Trans-blot sd semi-dry transfer cell (Biorad) utilizando-se papel de filtro 3MM
(Whatman) grosso humedecido em tampatildeo TBE 05x [Tris Base 05 (Roche) H3BO3 03 (Merck)
Na2EDTA 005 pH 8] seguido da membrana de nylon positivamente carregada (Roche) do gel e
novamente papel 3MM A transferecircncia foi efectuada por 30 min a 20V O RNA foi fixado agrave
membrana mediante uma incubaccedilatildeo de 30 min a 120ordmC que foi posteriormente preacute-hibridada com 10
mL de soluccedilatildeo Church [NaPO4 025M (Merck) SDS 7 EDTA 1mM (Merck) BSA 1 (Sigma)] no
rotor a 60ordmC Para a preparaccedilatildeo das sondas os genes ACR2 YAP8 e U3 foram amplificados utilizando-
se o DNA genoacutemico da estirpe BY4742 como molde e os oligonucleoacutetidos apresentados na tabela 22
As reacccedilotildees de PCR foram realizadas conforme descrito acima e os fragmentos foram purificados com
o kit DNA Clean amp Concentrator As sondas foram marcadas radioactivamente seguindo as instruccedilotildees
do kit Random Primers DNA Labeling System (Invitrogen) e purificadas em coluna G50 (GE
Healthcare) conforme as indicaccedilotildees do fabricante As sondas foram armazenadas em 10 mL de
soluccedilatildeo Church As membranas foram hibridadas individualmente com cada sonda a 60ordmC durante a
noite Apoacutes lavagem com uma soluccedilatildeo (NaPO4 20mM EDTA 1mM SDS 01) as membranas foram
utilizadas para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) durante 24h a -80ordmC numa
cassete (Kodak BioMax MS Intensifying Screen) As peliacuteculas foram manualmente reveladas
utilizando-se as soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak As membranas foram hibridadas com uma
nova sonda e o processo de autoradiografia foi efectuado tal como descrito acima A hibridaccedilatildeo das
membranas com a sonda U3 foi realizada para normalizar o mRNA especiacutefico em cada amostra Os
sinais foram quantificados por densitometria utilizando-se o programa ImageJ disponiacutevel em
httprsbwebnihgovij
29 Western-Blot
As ceacutelulas foram inoculadas em 4 mL de meio selectivo CAA-Ura e incubadas durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo As culturas de ceacutelulas foram diluiacutedas ateacute uma DO600 igual a 01 em 100mL do mesmo
meio e foram incubadas ateacute alcanccedilarem uma DO600 entre 04 e 05 Foram recolhidos 50mL de cultura
e aos restantes 50mL foi adicionado arsenato numa concentraccedilatildeo final de 1mM Apoacutes incubaccedilatildeo
durante 1h a 30ordmC as ceacutelulas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo durante 3 min a 1200g lavadas
com 1mL de aacutecido tricloroaceacutetico 20 (TCA) (Sigma) foram transferidas para tubos Eppendorf e
novamente centrifugadas Foram adicionados 400 microL de TCA 20 e um volume de esferas de vidro
igual ao tamanho do pellet de ceacutelulas As suspensotildees celulares foram agitadas durante 12 min a
15000g e a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e foi centrifugado 5 min a
15000g O sobrenadante foi descartado e foram adicionados ao pellet 70microL de Laemli [Tris-HCl
625mM pH 68 SDS 2 β-mercaptoetanol 5 (Merck) glicerol 10 (Merck) azul de bromofenol
001] e 30microL de Tris-HCl 1M pH 8 A mistura foi agitada fervida durante 5 min a 100ordmC e o pellet
21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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21
foi sedimentado por centrifugaccedilatildeo 3 min a 15000g O sobrenadante foi transferido para novos tubos e
as proteiacutenas foram quantificadas utilizando-se o meacutetodo Bradford (Biorad) 100microg de proteiacutenas totais
foram separadas por electroforese durante 2h a 100V em gel de poliacrilamida 12 [Tris-HCl
375mM SDS 01 acrilamida 12 (Fluka) bis-acrilamida 03 (Sigma) persulfato de amoacutenia
005 (Sigma) tetrametiletilenodiamina 007 (Sigma)] utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-
Glicina [Glicina 14 (Sigma) Tris Base 3 SDS 1] e o aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell (Biorad)
As proteiacutenas foram transferidas para membranas de PVDF (Millipore) atraveacutes do sistema Trans-blot
sd semi-dry transfer cell (Biorad) O sistema foi montado sob o aparelho de transferecircncia utilizando-se
papel de filtro 3MM (Whatman) grosso humedecido em tampatildeo de transferecircncia [Tris Base 04
Glicina 03 metanol 10 (Sigma) SDS 02] seguido de papeacuteis 3MM finos e a membrana de
PVDF Seguidamente foram colocados o gel 3 folhas de papel 3MM finos humedecidos e um papel
3MM grosso A transferecircncia foi efectuada por 1h e 30 min a 20V e a membrana foi corada com 10
mL de Ponceau S (Sigma) para controlo da qualidade da transferecircncia A membrana foi bloqueada
com leite magro 5 (Nestleacute) em PBSTween 01 (Merck) durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo A
membrana foi incubada com o anticorpo primaacuterio anti-c-Myc (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a
4ordmC com agitaccedilatildeo foi lavada 3x10 min com 10 mL de PBSTween 01 e foi incubada com o
anticorpo secundaacuterio anti-Mouse conjugado com a peroxidase horseradish (Santa Cruz
Biotechnology) diluiacutedo 15000 durante 8h a 4ordmC com agitaccedilatildeo A membrana foi lavada nas mesmas
condiccedilotildees e o sinal da proteiacutena foi detectado utilizando o kit Super Signal West Femto Maximum
Sensitivity Substrate (Thermo Scientific) de acordo com as instruccedilotildees do fabricante A membrana foi
utilizada para impressionar uma peliacutecula fotograacutefica (GE Healthcare) numa cassete (Kodak BioMax
MS Intensifying Screen) durante o tempo necessaacuterio para a obtenccedilatildeo de sinal e as peliacuteculas foram
manualmente reveladas utilizando-se soluccedilotildees reveladora e fixadora da Kodak Para a detecccedilatildeo das
proteiacutenas contendo o epiacutetopo HA a membrana foi incubada com o anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase (Roche) diluiacutedo 11000 durante a noite a 4ordmC com agitaccedilatildeo e a membrana foi lavada e
revelada conforme descrito acima O anticorpo anti-αSbaI foi utilizado como controlo interno para
normalizar os niacuteveis de proteiacutena
210 Co-imunoprecipitaccedilatildeo
As ceacutelulas (estirpe BY4742) co-transformadas com os plasmiacutedeos YEp195YAP8 e um dos
plasmiacutedeos da seacuterie pGAD foram inoculadas em 5mL de meio liacutequido SD-Ura-Leu durante 16h a 30ordmC
com agitaccedilatildeo e as culturas foram diluiacutedas para uma DO600 equivalente a 01 x 107 ceacutelulasmL As
culturas foram incubadas a 30ordmC ateacute uma DO600 correspondente a 04-05 x 107 ceacutelulasmL Foram
recolhidos 50 mL de cultura e aos restantes 50 mL foi adicionado 1mM arsenato As ceacutelulas foram
incubadas por 30 min a 30ordmC sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 3000g durante 2 min a 4ordmC e lavadas
22
com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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com 1 mL de PBS (NaCl 137mM KCl 27mM Na2HPO4 43mM KH2PO4 147mM) frio Foram
adicionados 150microL de tampatildeo de lise [Tris 20mM NaCl 150mM Nonidet P-40 05 (Sigma) EDTA
2mM glicerol 10] e esferas de vidro num volume igual ao volume do pellet de ceacutelulas As misturas
foram agitadas durante 12 min a 15000g e a 4ordmC e os extractos foram centrifugados durante 20 min a
15000g a 4ordmC O sobrenadante foi transferido para novos tubos Eppendorf e a proteiacutena foi quantificada
como descrito na secccedilatildeo 29 500microg de proteiacutena total foram diluiacutedas em 500microL de tampatildeo lise e foram
incubadas durante a noite a 4ordmC no rotor agrave velocidade miacutenima com 60microL de anticorpo anti-c-Myc
conjugado com proteiacutena A adsorvida em esferas de agarose (Clontech) previamente equilibradas com
tampatildeo de lise As proteiacutenas co-imunoprecipitadas foram sedimentadas por centrifugaccedilatildeo a 4ordmC
durante 30 seg a 7000g e duas vezes lavadas com 500microL de PBS Foram adicionados 20microL de tampatildeo
de Laemli ao pellet e as amostras foram fervidas durante 5 min a 80ordmC para separar as esferas de
agarose do complexo contendo as proteiacutenas co-imunoprecipitadas A mistura foi centrifugada e o
sobrenadante contendo as proteiacutenas imunoprecipitadas foi aplicado num gel de poliacrilamida 10
[Tris-HCl 0375M SDS 01 acrilamida 10 bis-acrilamida 02 persulfato de amoacutenia 005
tetrametiletilenodiamina 007] juntamente com 100microg dos extractos totais previamente fervidos
durante 5 min a 100ordmC A corrida electroforeacutectica foi efectuada no aparelho Mini-PROTEAN 3 Cell
durante 2h a 100V utilizando-se o tampatildeo de corrida Tris-Glicina As proteiacutenas foram transferidas para
membranas de PVDF e estas foram bloqueadas tal como descrito na secccedilatildeo 29 Primeiro procedeu-se
agrave detecccedilatildeo das proteiacutenas fusionadas com HA (imunoprecipitadas) para evitar a interferecircncia do sinal
intenso das cadeias ldquoleverdquo e ldquopesadardquo do anti-corpo anti-c-Myc Seguiu-se entatildeo com a detecccedilatildeo das
proteiacutenas fusionadas com c-Myc (imunoprecipitadas) de acordo com o procedimento descrito no
ponto 29
23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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23
3 Resultados e Discussatildeo
31 O complexo Mediador eacute necessaacuterio para a resposta da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio
O complexo Mediador eacute um co-activador importante para a transmissatildeo de sinais entre os
reguladores transcricionais e o complexo de iniciaccedilatildeo da transcriccedilatildeo (Soutourina et al 2011) Sob
stress por arseacutenio o factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute acumulado no nuacutecleo o que resulta na activaccedilatildeo
transcricional dos genes que codificam proteiacutenas responsaacuteveis pela destoxificaccedilatildeo do arseacutenio No
entanto pouco se sabe sobre os mecanismos relacionados com o recrutamento da maquinaria basal de
transcriccedilatildeo para as regiotildees promotoras dos genes regulados por este factor de transcriccedilatildeo
A cauda do Mediador eacute a subunidade deste complexo proteico que eacute capaz de reconhecer e se ligar
a diversos factores de transcriccedilatildeo (Biddick e Young 2005) De facto Herbig e os seus colaboradores
mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S
cerevisiae liga-se directamente agraves subunidades Med15 e Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al
2010)
Para avaliar a possiacutevel necessidade do complexo Mediador para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na
adaptaccedilatildeo da levedura ao stress induzido pelos compostos de arseacutenio foram realizados ensaios
fenotiacutepicos onde foi comparado o padratildeo de crescimento da estirpe selvagem e dos vaacuterios mutantes
para as subunidades da cauda do Mediador em presenccedila de arseacutenio Os resultados apresentados na
figura 31A mostram claramente que as subunidades Med2 Med3 Med15 Med16 e Med14 da cauda
do Mediador satildeo necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress provocado pelos compostos de
arseacutenio A eliminaccedilatildeo do gene MED16 parece provocar uma sensibilidade mais severa que a delecccedilatildeo
dos outros MEDs e isto provavelmente deve-se ao facto de que as subunidades Med2 Med3 Med15 e
Med16 formam um sub-complexo que se liga ao Mediador atraveacutes do Med16 (van de Peppel et al
2005) Uma vez que a delecccedilatildeo do gene MED14 eacute letal foi utilizado o mutante med14-100 que
codifica uma proteiacutena com actividade parcial Este mutante apresentou uma grande sensibilidade ao
arseacutenio o que indica que a sua funccedilatildeo intacta eacute importante para a adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
induzido por este metaloacuteide
24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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24
Figura 31 A subunidade da cauda do Mediador eacute necessaacuteria para a resposta da levedura ao stress por
arseacutenio As estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico completo ateacute agrave fase exponencial
foram serialmente diluiacutedas conforme descrito na secccedilatildeo 24 dos materiais e meacutetodos e foram plaqueadas em
meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B) 1 mM de CoSO4
20 microM de CdCl2 08 M de NaCl ou 700 microM H2O2 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48h de crescimento a
30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
med14
W303
med14
W303
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05
05
1
1
15
15
2
2
As(V)
As(III)
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
mM
med2
med3
med5
med15
med16
BY4742
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas 37ordmC 08M
NaCl 20microM
CdCl2
700microM
H2O2
1mM
CoSO4
BY4742
med2
med3
med5
med15
med16
med14
W303
B
A
25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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25
O mutante med5 apresentou um crescimento semelhante ao da estirpe selvagem de onde se pode
concluir que a sua funccedilatildeo seja dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Curiosamente existe uma controveacutersia quanto agrave localizaccedilatildeo da subunidade Med5 na estrutura
do Mediador Enquanto alguns autores defendem que esta subunidade pertence agrave cauda do Mediador
(Beacuteve et al 2005) outros afirmam que esta pertence ao domiacutenio intermeacutedio (Chadick e Asturias
2005) Admitindo-se a segunda hipoacutetese pode-se concluir que o domiacutenio da cauda do Mediador
participa na activaccedilatildeo de genes que satildeo essenciais para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress imposto pelos
compostos de arseacutenio
Com o objectivo de se avaliar a especificidade do requisito das subunidades da cauda do Mediador
para a adaptaccedilatildeo da levedura a diferentes agressotildees ambientais foram realizados ensaios fenotiacutepicos
na presenccedila de vaacuterios agentes de stress designadamente caacutedmio cobalto peroacutexido de hidrogeacutenio
cloreto de soacutedio e choque teacutermico A figura 31B mostra que diferentes conjuntos de subunidades da
cauda do Mediador satildeo importantes nas diferentes condiccedilotildees de stress Por exemplo a subunidade
Med15 eacute essencial para a sobrevivecircncia da ceacutelula ao stress induzido pelo caacutedmio mas parece ser
dispensaacutevel para adaptaccedilatildeo das ceacutelulas ao stress hiperosmoacutetico ou oxidativo Por sua vez a reduccedilatildeo da
actividade da subunidade Med14 parece natildeo influenciar o crescimento das ceacutelulas expostas ao stress
osmoacutetico mas torna-se importante na sua adaptaccedilatildeo ao stress induzido pelo choque teacutermico caacutedmio e
cobalto Em conjunto estes resultados permitem afirmar que as subunidades Med2 Med3 Med15
Med14 e Med16 da cauda do Mediador satildeo diferencialmente necessaacuterias para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao
arseacutenio
32 Mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do complexo Mediador comprometem a actividade do
Yap8 mas natildeo interferem com os niacuteveis de mRNA e proteiacutena
O factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute o principal regulador da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio
uma vez que activa a transcriccedilatildeo dos genes que codificam as proteiacutenas que compotildeem a principal via de
destoxificaccedilatildeo do arseacutenio (Menezes et al 2004) Os ensaios fenotiacutepicos (figura 31) sugerem que o
Mediador participa na activaccedilatildeo de genes responsaacuteveis pela sobrevivecircncia da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio Em seguida verificou-se se a eliminaccedilatildeo dos genes que codificam as
subunidades da cauda do Mediador afectavam a actividade do Yap8 e portanto a activaccedilatildeo dos seus
genes alvo Como primeira abordagem foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do gene ACR2 por
Northern-blotting nas estirpes selvagens e nos respectivos mutantes A figura 32A revela que o niacutevel
de expressatildeo do gene ACR2 diminui cerca de 30-40 nas estirpes mutantes quando comparadas com a
estirpe selvagem agrave excepccedilatildeo do mutante med5 que apresenta uma diminuiccedilatildeo de apenas 10 nos
niacuteveis de ACR2
26
Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Figura 32 A expressatildeo do gene ACR2 eacute afectada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador enquanto a
expressatildeo do YAP8 permanece inalterada As estirpes selvagens e mutantes em fase de crescimento
exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4 (arsenato) e o RNA foi extraiacutedo como descrito
na secccedilatildeo 28 dos materiais e meacutetodos Para as anaacutelises por Northern-blot foram utilizadas sondas para mRNA
do A) ACR2 B) YAP8 e U3 como controlo interno dos niacuteveis de RNA C) As mesmas estirpes expressando a
construccedilatildeo Yap8-c-Myc foram submetidas ao stress por arseacutenio nas mesmas condiccedilotildees que em B e os niacuteveis de
Yap8 forma analisados por Western-blot utilizando o anticorpo anti-c-Myc A proteiacutena αSbaI foi utilizada como
controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio ndash Condiccedilotildees fisioloacutegicas
0
20
40
60
80
100
AC
R2U
3
0
20
40
60
80
100
YA
P8
U3
B
A
C
Yap8-c-Myc
αSbaI
BY4742 med2 med3 med5
med15 med16 BY4742
W303 med14
As(V) Fisio As(V) Fisio
Fisio As(V)
Yap8-c-Myc
αSbaI
27
Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Estes resultados sugerem que a actividade do Yap8 eacute comprometida nos mutantes das subunidades
da cauda do Mediador isto eacute que o Yap8 depende do Mediador para uma activaccedilatildeo eficaz dos seus
genes alvo No entanto a seguinte questatildeo se coloca Os niacuteveis de ACR2 satildeo afectados devido agrave
reduccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 ou da sua actividade propriamente dita Para responder a esta questatildeo
foram monitorizados os niacuteveis de mRNA do YAP8 assim como os respectivos niacuteveis de proteiacutena nas
estirpes selvagem e nos mutantes para as subunidades da cauda do Mediador por Northern- e Western-
blotting respectivamente A figura 32B mostra que a expressatildeo do YAP8 natildeo eacute significativamente
influenciada por mutaccedilotildees na cauda do Mediador na presenccedila de arseacutenio uma vez que os niacuteveis de
mRNA permanecem inalterados em todas as estirpes testadas Dado que o Yap8 tambeacutem eacute regulado
pela via da ubiquitina sendo a sua degradaccedilatildeo parcialmente inibida na presenccedila de arseacutenio os niacuteveis
de proteiacutena Yap8 tambeacutem foram monitorizados Para tal foi utilizada a construccedilatildeo YAP8-c-MYC para
permitir a detecccedilatildeo do Yap8 com o anticorpo anti-c-Myc Conforme indicado na figura 32C as
mutaccedilotildees nas subunidades da cauda do Mediador natildeo parecem influenciar os niacuteveis de Yap8
33 Mutaccedilotildees na cauda do complexo Mediador comprometem a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Os resultados apresentados na secccedilatildeo anterior sugerem que o Mediador natildeo interfere com os niacuteveis
de Yap8 e portanto a reduccedilatildeo na expressatildeo do gene ACR2 nas estirpes mutantes eacute provavelmente uma
consequecircncia de uma deficiente transmissatildeo do sinal de induccedilatildeo do Yap8 para a maquinaria basal de
transcriccedilatildeo
Para testar esta hipoacutetese foi realizado o ensaio de trans-activaccedilatildeo do Yap8 nas estirpes selvagens e
nos respectivos mutantes onde os niacuteveis de Yap8 foram mantidos constantes atraveacutes do controlo da
sua expressatildeo pela regiatildeo promotora constitutiva do gene ADH1 Este ensaio baseia-se na fusatildeo da
proteiacutena de interesse com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA da proteiacutena LexA capaz de reconhecer o
operador do LexA inserido na regiatildeo promotora de um gene reporter (Fernandes et al 1997) neste
caso o lacZ Desta forma as estirpes foram co-transformadas como os plasmiacutedeos expressando a
construccedilatildeo hiacutebrida YAP8-lexA sob controlo do promotor constitutivo do gene ADH1 e o plasmiacutedeo
repoacuterter que codifica o gene lacZ (figura 33) De seguida procedeu-se agrave monitorizaccedilatildeo da actividade
da enzima β-Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25 e 26
28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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28
Figura 33 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do ensaio de trans-activaccedilatildeo em levedura (adaptado de Lodish
et al 2000)
Os resultados apresentados na figura 34 mostram que o potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 eacute
induzido pelos compostos de arseacutenio tal como descrito na literatura (Ilina et al 2008 Menezes et al
2004) Nestas condiccedilotildees verifica-se que os mutantes que apresentam uma reduccedilatildeo da expressatildeo do
gene ACR2 nomeadamente os mutantes med2 med3 med14 med15 e med16 tambeacutem exibem
reduzida actividade da enzima β-Galactosidase Os mutantes mais afectados satildeo os med14 e med16
que apresentam uma reduccedilatildeo de aproximadamente 90 da actividade da β-Galactosidase quando
comparados com as respectivas estirpes selvagens Estes foram os mutantes que apresentaram maior
sensibilidade nos ensaios fenotiacutepicos e uma menor expressatildeo do gene ACR2 Como esperado o
mutante med5 apresentou uma actividade da β-Galactosidase similar agrave da estirpe selvagem Estes
resultados em conjunto sugerem que a inibiccedilatildeo do potencial de trans-activaccedilatildeo do Yap8 ocasionada
pela eliminaccedilatildeo das subunidades da cauda do Mediador leva a uma reduccedilatildeo da expressatildeo do gene
ACR2 e da capacidade da ceacutelula em se adaptar ao stress imposto pelos compostos de arseacutenio
lexA-YAP8
Plasmiacutedeo
Reporter
(2)
LexAYap8
Complexo Mediador
Transcrito de
lacZ
Nuacutecleo
Meio de Cultura com
x-Gal
Coloacutenias que
natildeo transcrevem
o lacZ
Coloacutenias que
transcrevem o
lacZ
Plasmiacutedeo
Hiacutebrido
(1)
Local de
ligaccedilatildeo LexA
Gene Reporter
lacZ
29
0 2 4 6 8 10 12
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 34 A disrupccedilatildeo das subunidades na cauda do Mediador afecta a actividade de trans-activaccedilatildeo
do Yap8 A) estirpes selvagens e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram incubadas em meio
SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em meio suplementado
com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi efectuada como
descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise quantitativa da
actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial induzidas por 1h
com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash condiccedilotildees fisioloacutegicas
34 A subunidade Med2 do complexo Mediador interage fisicamente com o Yap8
Herbig e os seus colaboradores mostraram que o factor de transcriccedilatildeo Gcn4 o protoacutetipo dos
factores de transcriccedilatildeo AP-1 em S cerevisiae interage directamente com as subunidades Med15 e
Med16 da cauda do Mediador (Herbig et al 2010) Dado as caracteriacutesticas partilhadas entre o Gcn4 e
o Yap8 (Rodrigues-Pousada et al 2010) foi investigado se este tambeacutem era capaz de estabelecer
contactos fiacutesicos com a cauda do Mediador
Para esta finalidade foram realizados ensaios de two-hybrid na estirpe de S cerevisiae Y190 A
estrateacutegia two-hybrid eacute uma ferramenta molecular de identificaccedilatildeo e caracterizaccedilatildeo da interacccedilatildeo fiacutesica
entre duas proteiacutenas que se baseia no facto de que alguns factores de transcriccedilatildeo possuem os domiacutenios
de activaccedilatildeo e de ligaccedilatildeo ao DNA funcionalmente separados como eacute o caso do factor de transcriccedilatildeo
de levedura Gal4 Assim cada uma das proteiacutenas de interesse eacute fusionada com o domiacutenio activaccedilatildeo ou
com o domiacutenio de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 e a interacccedilatildeo entre elas leva agrave reconstituiccedilatildeo do factor
transcricional Gal4 funcional capaz de activar a transcriccedilatildeo de genes reporter contendo sequecircncias
UASGAL na sua regiatildeo promotora (figura 35) (Guglielmi et al 2004) Desta forma a estirpe Y190 foi
BY4748lt lexAYAP8gt
med2lt lexAYAP8gt
W303lt lexAYAP8gt
med5lt lexAYAP8gt
med15lt lexAYAP8gt
med16lt lexAYAP8gt
med3lt lexAYAP8gt
med14lt lexAYAP8gt
A B Fisio As(V)
Fisio As(V)
30
co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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co-transformada com um dos plasmiacutedeos codificando o domiacutenio de activaccedilatildeo do Gal4 (seacuterie pGAD
pGADT7 pGADMED2 -MED3 -MED5 -MED14 -MED16 -YAP8) e outro codificando o domiacutenio
de ligaccedilatildeo ao DNA do Gal4 (seacuterie pGBD pGBKT7 -YAP8) (tabela 23) Em seguida foi
monitorizada a activaccedilatildeo da expressatildeo do gene lacZ atraveacutes da detecccedilatildeo da actividade da enzima β-
Galactosidase conforme descrito nas secccedilotildees 25
Figura 35 Ensaio de two-hybrid em levedura (adaptado de Lodish et al 2000)
Domiacutenio de Ligaccedilatildeo
ao DNA Gal4 Yap8 Mediadores Domiacutenio de Activaccedilatildeo do Gal4
YAP8 MED
Complexo de preacute-
iniciaccedilatildeo
Coloacutenias azuis Coloacutenias brancas
1 Transformaccedilatildeo em leveduras
2 Plaqueamento em meio selectivo TRP-
LEU- com e sem arsenato
4 Adiccedilatildeo de x-Gal
LacZ
LacZ LacZ mRNA
(1) (2)
(1) (1)
(2)
(2)
Sem
Interacccedilatildeo
(2)
Com
Interacccedilatildeo
31
Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
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Os resultados apresentados na figura 36 mostram que o substrato x-Gal apenas eacute hidrolisado nas
ceacutelulas que expressam as fusotildees Gal4AD-Yap8Gal4BD-Yap8 e Gal4AD-Med2Gal4BD-Yap8 o que
reflecte a homodimerizaccedilatildeo do Yap8 (Yujun e Tamaacutes 2006) e sugere que apenas a subunidade Med2
do Mediador eacute capaz de interagir com o Yap8 nestas condiccedilotildees Curiosamente a interacccedilatildeo entre o
Yap8 e o Med2 parece ser mais eficiente que a proacutepria homodimerizaccedilatildeo do Yap8 uma vez que a
coloraccedilatildeo azul observada nestas ceacutelulas eacute mais intensa sugerindo que o Yap8 deve estabelecer
interacccedilotildees estaacuteveis com esta subunidade Este resultado eacute coerente com o facto de a subunidade Med2
estar localizada na periferia da cauda do Mediador e possivelmente teraacute menor impedimento
estereoquiacutemico para estabelecer contactos com o Yap8
Figura 36 O Yap8 interage com a subunidade Med2 do Mediador no sistema two-hybrid Ceacutelulas co-
expressando a construccedilatildeo GBD-YAP8-c-MYC e uma das construccedilotildees de fusatildeo dos Mediadores GAD-HA-MED
foram incubadas ateacute agrave fase estacionaacuteria e plaqueadas numa densidade de 9x107 ceacutelulas em meio suplementado
com 1mM de arsenato A actividade da β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos apoacutes 3 horas de incubaccedilatildeo a 30ordmC Fisio - Condiccedilotildees fisioloacutegicas
Para validar a interacccedilatildeo entre o factor de transcriccedilatildeo Yap8 e o Med2 obtida no sistema two-hybrid
foram efectuados ensaios de co-imunoprecipitaccedilatildeo Este procedimento eacute amplamente utilizado para
monitorizar a interacccedilatildeo in vivo entre proteiacutenas e baseia-se no princiacutepio de que muitas das interacccedilotildees
proteiacutena-proteiacutena que existem na ceacutelula satildeo mantidas quando a ceacutelula eacute lisada em condiccedilotildees natildeo
desnaturantes Desta forma se a proteiacutena X do complexo XY eacute imunoprecipitada entatildeo a proteiacutena Y
estavelmente ligada a proteiacutena X pode tambeacutem ser precipitada (Adams e Ohh 2005)
Fisio As(V)
GAL4BD
GAL4AD
-
- YAP8
MED2
MED3
MED5
MED14
MED16
YAP8
32
Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Neste ensaio foram utilizadas as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-MEDs (tabela 23) As
proteiacutenas foram co-imunoprecipitadas por incubaccedilatildeo com esferas de agarose adsorvidas agrave
imunoglobulina IgA conjugada com o anticorpo anti-c-Myc como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos (figura 37)
Figura 37 Representaccedilatildeo esquemaacutetica do procedimento de co-imunoprecipitaccedilatildeo
Os resultados apresentados na figura 38 mostram que a imunoprecipitaccedilatildeo do Yap8 com o
anticorpo anti-c-Myc co-imunoprecipita especificamente a proteiacutena Med2-HA conforme observado
no blot correspondente agrave revelaccedilatildeo do anti-corpo anti-HA Desta forma pode afirmar-se que a proteiacutena
Med2 estabelece interacccedilotildees estaacuteveis com o factor de transcriccedilatildeo Yap8 o que vem a corroborar os
resultados obtidos no ensaio de two-hybrid
Proteiacutenas
totais
Incubaccedilatildeo com esferas de agarose
com proteiacutena A conjugada com
anticorpo anti-c-Myc
Imunoprecipitaccedilatildeo
lavagem e eluiccedilatildeo das
proteiacutenas de interesse
Anaacutelise por Western-
blotting utilizando o
anticorpo anti-HA
33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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33
Figura 38 O Yap8 interage com o moacutedulo da cauda do Mediador atraveacutes da subunidade Med2 Extractos proteiacutecos de ceacutelulas induzidas com arsenato co-expressando as construccedilotildees YAP8-c-MYC e GAD-HA-
MEDs foram incubados com o anticorpo c-Myc ou o anticorpo HA e os complexos foram purificados utilizando
esferas de agarose com proteiacutena A adsorvida IN ndash input IP ndash imunoprecipitaccedilatildeo
35 O moacutedulo CDK8 eacute necessaacuterio para a activaccedilatildeo de genes envolvidos na sobrevivecircncia da
levedura ao stress pelos compostos de arseacutenio
O complexo Mediador parece desempenhar uma funccedilatildeo crucial na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio sendo imprescindiacutevel para a actividade do factor de transcriccedilatildeo Yap8 No entanto o
proacuteprio Mediador eacute alvo de regulaccedilatildeo por parte do moacutedulo CDK8 (van de Peppel et al 2005) Este
moacutedulo eacute constituiacutedo por 4 subunidades a Med12 a Med13 uma cinase dependente de ciclina Cdk8 e
a sua ciclina CycC (Bourbon 2008) Estaacute descrito na literatura que o moacutedulo CDK8 eacute capaz de regular
o complexo Mediador de forma positiva ou negativa revelando tratar-se de uma regulaccedilatildeo que
depende do contexto do promotor e dos factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos que o regulam Em
leveduras a cinase Cdk8 eacute capaz de fosforilar e modular negativamente os factores de transcriccedilatildeo
Gcn4 e Msn2 (Chi et al 2001) e a subunidade Med12 eacute necessaacuteria para a induccedilatildeo da transcriccedilatildeo do
gene PDR5 sob perda do genoma mitocondrial (Shahi et al 2010)
De forma a investigar-se a funccedilatildeo do moacutedulo CDK8 como regulador positivo ou negativo do
complexo Mediador recrutado pelo Yap8 para o promotor do gene ACR2 foram realizados ensaios
fenotiacutepicos utilizando-se a estirpe selvagem e os respectivos mutantes para o moacutedulo CDK8 do
Mediador Os resultados apresentados na figura 39A indicam que os mutantes med13 cycC e cdk8
desempenham um papel importante na adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress induzido pelos compostos de
arseacutenio Dada a funccedilatildeo regulatoacuteria do moacutedulo CDK8 este ensaio sugere que este moacutedulo parece
regular positivamente a resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelo arseacutenio
Med2-HA Y
ap8-c
-Myc
Med16-HA
Med14-HA
Med5-HA
-
IP IN
-
Med2-HA
Med5-HA
Med14-HA
Med16-HA
Yap
8-c
-Myc
34
Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Figura 39 O moacutedulo CDK8 eacute especificamente necessaacuterio para a adaptaccedilatildeo da ceacutelula ao stress
induzido pelos compostos de arseacutenio Estirpes selvagens e mutantes foram incubadas em meio sinteacutetico
completo ateacute agrave fase exponencial foram serialmente diluiacutedas como descrito na secccedilatildeo materiais e meacutetodos e
plaqueadas em meio contendo A) concentraccedilotildees crescentes de Na2HAsO4 (arsenato) ou NaAsO2 (arsenito) B)
20microM de CdCl2 700microM H2O2 08M e NaCl ou 1mM de CoSO4 O crescimento foi monitorizado apoacutes 48 horas
a 30ordmC ou a 37ordmC de forma a induzir choque teacutermico
Por sua vez os resultados evidenciados na figura 39B mostram que o efeito da eliminaccedilatildeo das
subunidades do moacutedulo CDK8 parece ser especiacutefico para a resposta ao stress induzido pelo arseacutenio A
eliminaccedilatildeo deste moacutedulo natildeo interfere significativamente com a resposta ao stress imposto pelo
choque teacutermico stress por caacutedmio e osmoacutetico Entretanto a disrupccedilatildeo da subunidade Cdk8 confere
uma maior resistecircncia ao stress por cobalto e oxidativo o que sugere que o moacutedulo CDK8 deve
regular negativamente algum componente da via de adaptaccedilatildeo celular ao cobalto A subunidade
As(III)
As(V) Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
05 1 15
02 04 05
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
Condiccedilotildees
Fisioloacutegicas
SEY6210
med12
med13
cycC
cdk8
37ordmC 20microM
CdCl2
700microM
H2O2 08M
NaCl
1mM
CoSO4
A
B
mM
mM
35
Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
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Med12 natildeo parece ser importante para a adaptaccedilatildeo da levedura a nenhuma condiccedilatildeo de stress
estudado enquanto as subunidades Med13 e CycC parecem ser mais importantes para os stresses
gerados pelos compostos de arseacutenio e cobalto do que para os restantes
36 O moacutedulo CDK8 do complexo Mediador regula negativamente a actividade de trans-
activaccedilatildeo do Yap8
Dado que o moacutedulo CDK8 tem um papel de regulador positivo na adaptaccedilatildeo da levedura ao stress
por arseacutenio e o Yap8 eacute o principal regulador envolvido na destoxificaccedilatildeo deste composto o passo
seguinte foi verificar de que forma a delecccedilatildeo das subunidades deste moacutedulo afecta a actividade do
Yap8 Com o intuito entatildeo de determinar se a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 sofria alguma
alteraccedilatildeo nos mutantes do moacutedulo CDK8 as estirpes de S cerevisiae SEY6210 med12 med13 cycC e
cdk8 foram co-transformadas com os plasmiacutedeos codificando a fusatildeo lexA-YAP8 e o gene reporter
lacZ A actividade da enzima β-Galactosidase foi monitorizada como descrito na secccedilatildeo materiais e
meacutetodos
Como ilustrado na figura 310 a actividade de trans-activaccedilatildeo do factor de transcriccedilatildeo Yap8 eacute
semelhante na estirpe selvagem e no mutante med12 No entanto esta aumenta cerca de 50 e 100
nos mutantes med13 e cycC respectivamente e cerca de 600 no mutante cdk8 indicando que esta
subunidade deve ser responsaacutevel pela regulaccedilatildeo negativa da actividade de trans-activaccedilatildeo deste factor
de transcriccedilatildeo Perante estes resultados pode sugerir-se que embora o moacutedulo CDK8 regule
negativamente o Yap8 este moacutedulo provavelmente desempenha um papel regulatoacuterio positivo na
activaccedilatildeo de outros genes que em conjunto satildeo essenciais para a resposta da levedura ao stress
induzido pelo arseacutenio e por este motivo a sua eliminaccedilatildeo leva ao comprometimento da sobrevivecircncia
das ceacutelulas a este stress Estes resultados revelam que a actividade do moacutedulo CDK8 eacute plaacutestica
podendo comportar-se tanto como activador ou repressor de genes que contribuem para uma resposta
celular comum
36
0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
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0 5 10 15 20
Actividade Relativa da β-Galactosidase
Figura 310 A disrupccedilatildeo das subunidades do moacutedulo CDK8 do Mediador afecta a actividade de
trans-activaccedilatildeo do Yap8 A) estirpes selvagem e mutantes co-expressando lexA-YAP8 e lexAop-lacZ foram
incubadas em meio SD ateacute atingir agrave fase de crescimento estacionaacuteria e 45 x 107 ceacutelulas foram plaqueadas em
meio suplementado com 1mM de Na2HAsO4 (arsenato) A monitorizaccedilatildeo da actividade da β-Galactosidase foi
efectuada como descrito na secccedilatildeo 25 dos materiais e meacutetodos apoacutes 3h de incubaccedilatildeo a 30ordmC B) A anaacutelise
quantitativa da actividade β-galactosidase foi realizada utilizando ceacutelulas em fase de crescimento exponencial
induzidas por 1h com Na2HAsO4 (arsenato) como descrito na secccedilatildeo 26 dos materiais e meacutetodos Fisio ndash
condiccedilotildees fisioloacutegicas
37 A cinase Cdk8 actua como repressor da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 devido agrave
destabilizaccedilatildeo dos niacuteveis de Yap8 e Med2
As subunidades CycC e Cdk8 do moacutedulo CDK8 podem influenciar negativamente as subunidades
da cauda do Mediador particularmente a Med2 (van de Peppel et al 2005) e alguns factores de
transcriccedilatildeo especiacuteficos (Bourbon 2008) Uma vez que o Yap8 interage com o Med2 investigou-se o
comportamento destas proteiacutenas nos mutantes cycC e cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas e sob stress
imposto pelos compostos de arseacutenio
De forma a estabelecer o papel regulatoacuterio da cinase Cdk8 exercido sobre o Yap8 e o Med2 a
estirpe selvagem SEY6210 e mutantes cycC e cdk8 foram transformadas com as construccedilotildees YAP8-c-
Myc e MED2-HA codificadas pelos plasmiacutedeos pRSYAP8 e pRSMED2 (tabela 23) e os niacuteveis destas
proteiacutenas foram monitorizados por Western-blotting Os resultados apresentados na figura 311
mostram um aumento dos niacuteveis de Med2 na ausecircncia da CycC e Cdk8 em condiccedilotildees fisioloacutegicas
embora este aumento natildeo seja tatildeo evidente apoacutes a adiccedilatildeo de arsenato Estes resultados sugerem que o
Cdk8 natildeo soacute afecta o padratildeo de fosforilaccedilatildeo do Med2 (van de Peppel et al 2005) em condiccedilotildees
fisioloacutegicas mas provavelmente tambeacutem a sua estabilidade
A B
SEY6210lt lexAYAP8gt
med12lt lexAYAP8gt
med13lt lexAYAP8gt
cycClt lexAYAP8gt
cdk8lt lexAYAP8gt
Fisio As(V)
37
Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
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Figura 311 A cinase Cdk8 regula negativamente os niacuteveis de Med2 e Yap8 Mutantes cycC e cdk8
desregulam as quantidades de Yap8 e Med2 Estirpes selvagem e mutantes expressando a construccedilatildeo YAP8-c-
Myc e MED2-HA em fase de crescimento exponencial foram induzidas durante 1h com 1 mM de Na2HAsO4
(arsenato) e os niacuteveis de Yap8 e Med2 foram analisados por Western-blotting utilizando o anticorpo anti-c-Myc
e anti-HA A proteiacutena αSbaI foi utilizada como controlo interno para normalizaccedilatildeo dos resultados Fisio-
Consiccedilotildees fisioloacutegicas
Os padrotildees de induccedilatildeo da Med2 satildeo semelhantes nos mutantes cycC e cdk8 sugerindo que natildeo deve
haver redundacircncia quanto agrave ciclina que activa a Cdk8 nestas condiccedilotildees Tambeacutem os niacuteveis de Yap8
parecem ser negativamente controlados pela Cdk8 uma vez que foi observado um aumento dos niacuteveis
de Yap8 na ausecircncia deste factor principalmente na presenccedila de arsenato Neste caso a ausecircncia da
CycC parece natildeo ter um efeito significativo nos niacuteveis do Yap8 sugerindo que a Cdk8 possa exercer o
seu efeito regulatoacuterio negativo sobre o Yap8 apoacutes activaccedilatildeo por outra ciclina O facto de o Yap8 estar
presente em maiores quantidades no mutante cdk8 poderaacute provavelmente justificar a causa do aumento
da sua trans-activaccedilatildeo observada neste mutante Este efeito parece ser exercido sobre o Yap8 e natildeo ao
niacutevel da sua transcriccedilatildeo uma vez que os resultados apresentados na secccedilatildeo 32 mostram que o
Mediador natildeo interfere com a transcriccedilatildeo constitutiva do YAP8 e as construccedilotildees utilizadas nos ensaios
de trans-activaccedilatildeo satildeo reguladas por um promotor constitutivo
O facto de o Yap8 aparecer representado sob a forma de duas bandas pode indicar que esta proteiacutena
eacute um alvo putativo de modificaccedilotildees poacutes-traducionais Resultados preliminares de anaacutelises in silico
mostram que existem resiacuteduos de aminoaacutecidos na sua sequecircncia que poderatildeo ser potencialmente alvos
de modificaccedilatildeo por SUMOilaccedilatildeo ubiquitinaccedilatildeo ou fosforilaccedilatildeo
Med2-HA
αSbaI
SEY6210 cycC cdk8
Yap8-c-Myc
αSbaI
Fisio As(V)
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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Contents5cSitio5cMenuPrincipal5cDocumentacaoampSubFolderPath=5cRoot5cContents5c
Sitio5cMenuPrincipal5cDocumentacao5cPublicacoesIRARampBookCategoryID=1ampBookTypeID
=3ampSection=MenuPrincipal
Rodrigues-Pousada C Menezes RA e Pimentel C 2010 The Yap family and its role in stress
response Yeast 27 245-258
Rosen BP 2002 Transport e detoxification systems for transition metals heavy metals and
metalloidsmin eukaryotic and prokaryotic microbes Comparative Biochemistry and Physiology part A
133 689-693
Shahi P Gulshan K Naumlaumlr AM e Moye-Rowley S 2010 Differential roles of transcriptional
mediator subunits in regulation of multidrug resistence gene expression in Saccharomyces cerevisiae
Molecular Biology of the Cell 21 2469-2482
Sherman F 2002 Getting started with yeast Methods in Enzymology 350 3-41
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Sogaard TMM e Svejstrup JQ 2007 Hyperphosphorylation of the C-terminal repeat domain of
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Soutourina J Wydau S Ambroise Y Boschiero C e Werner M 2011 Direct interaction of RNA
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Fps1p-dependent arsenite uptake and tolerance in yeast Molecular Biology of the Cell 17 4400-4410
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response in yeast In Yeast Stress Responses (S Hohmann and WH Mager eds) 1ordfed Springer
Berlin
Vahter M 2009 Effects of arsenic on maternal and fetal health Annual Review of Nutrition 29 381-
399
van de Peppel J Kettelarij N van Bakel H Kockelkorn TTJP van Leenen D e Holstege
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antagonistic submodules and highly specific downstream targets Molecular Cell 19 511-522
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Srb10 kinase with Sip4 a translational activator of gluconeogenic genes in Saccharomyces cerevisiae
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Begley TJ e Costa M 2009 A genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae reveals pathways
affected by arsenic toxicity Genomics 94(5) 294-307
38
39
4 Conclusotildees e Consideraccedilotildees Finais
O complexo Mediador eacute um importante co-activador na activaccedilatildeo transcricional regulada por
factores de transcriccedilatildeo especiacuteficos O activador Gcn4 foi o primeiro membro dos factores de
transcriccedilatildeo do tipo AP-1 em Saccharomyces cerevisiae a ter desvendado o mecanismo de activaccedilatildeo
transcricional dos seus genes alvo Em resposta ao stress induzido pela depleccedilatildeo de fontes de
nitrogeacutenio o Gcn4 eacute activado e interage com as subunidades Med5 e Med16 do moacutedulo da cauda do
complexo Mediador desta forma facilitando o recrutamento da maquinaria basal de transcriccedilatildeo para a
regiatildeo promotora dos seus genes alvo (Chi et al 2001) O domiacutenio regulatoacuterio Cdk8 executa um efeito
regulador negativo sobre o Gcn4 atraveacutes da sua fosforilaccedilatildeo que eacute um sinal para ubiquitinaccedilatildeo e
degradaccedilatildeo pelo proteasoma (Herbig et al 2010)
Neste trabalho foram obtidas evidecircncias quanto ao mecanismo utilizado pelo Yap8 para activar a
transcriccedilatildeo do gene ACR2 apoacutes a exposiccedilatildeo das ceacutelulas aos compostos de arseacutenio Foi demonstrado
que o complexo Mediador participa na resposta adaptativa da levedura ao stress induzido pelos
compostos de arseacutenio dado que os mutantes onde as subunidades da cauda do Mediador foram
eliminadas apresentam (1) baixa toleracircncia ao arseacutenio (2) a inibiccedilatildeo parcial da expressatildeo de ACR2
em arsenato e (3) o comprometimento da actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 na presenccedila deste
metaloacuteide (figuras 31 32 e 34) Atraveacutes de ensaios de interacccedilatildeo in vivo e co-imunoprecipitaccedilatildeo
provou-se que o Yap8 e a subunidade Med2 do Mediador satildeo capazes de estabelecer interacccedilotildees
fiacutesicas (figuras 36 e 38) tendo sido assim estabelecida uma relaccedilatildeo funcional entre o factor de
transcriccedilatildeo especiacutefico da resposta ao stress induzido pelo arseacutenio o Yap8 e o co-activador geral de
transcriccedilatildeo o complexo Mediador Foi tambeacutem demonstrado que embora a ausecircncia das subunidades
do domiacutenio regulatoacuterio CDK8 comprometam a adaptaccedilatildeo celular ao stress imposto pelo arseacutenio (figura
39) a actividade de trans-activaccedilatildeo do Yap8 estaacute aumentada nos mutantes para as subunidades
Med13 CycC e Cdk8 (figura 310) possivelmente devido agrave desregulaccedilatildeo dos niacuteveis tanto de Yap8
como da subunidade Med2 do Mediador (figura 311) Uma vez que o Gcn4 interage com o Mediador
atraveacutes das subunidades Med15 e Med16 e o Yap8 com a subunidade Med2 pode-se concluir que os
diferentes factores de transcriccedilatildeo AP1 da levedura transmitem sinais de induccedilatildeo especiacuteficos
interagindo com diferentes subunidades da cauda do complexo Mediador
Em conjunto os resultados obtidos neste trabalho permitem propor um modelo onde a actividade
do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
condiccedilotildees fisioloacutegicas a Cdk8 modifica directa ou indirectamente o Yap8 e o Med2 destabilizando
estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
aumento da concentraccedilatildeo de Yap8 e Med2 o que facilita a interacccedilatildeo entre o Yap8 e o complexo
Mediador potenciando o aumento da transcriccedilatildeo do gene ACR2 Pode especular-se que quando a
40
concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
41
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do Yap8 eacute regulada natildeo soacute pela acumulaccedilatildeo nuclear mas tambeacutem pela cinase Cdk8 em dois niacuteveis Em
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estas proteiacutenas e impedindo assim a activaccedilatildeo do ACR2 Em condiccedilotildees de stress induzido pelo arseacutenio
ambas as proteiacutenas parecem evadir a regulaccedilatildeo negativa pela Cdk8 Em consequecircncia observa-se o
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concentraccedilatildeo intracelular de arseacutenio diminui a cinase Cdk8 volta a exercer o seu efeito repressor sobre
o Yap8 e o Med2 levando agrave diminuiccedilatildeo dos seus niacuteveis de proteiacutena (figura 41)
Figura 41 Modelo de interacccedilatildeo do Yap8 com o Mediador e sua regulaccedilatildeo
De forma a caracterizar os eventos que medeiam a activaccedilatildeo do gene ACR2 pelo Yap8 e
estabelecer uma ordem cronoloacutegica de recrutamento da RNA Pol II Yap8 Mediador e factores
remodeladores da cromatina agrave regiatildeo promotora do ACR2 pretende-se futuramente executar ensaios
de imunoprecipitaccedilatildeo da cromatina Para isso utilizar-se-atildeo as estirpes selvagens e mutantes med14
cdk8 yap8 gcn5 spt3 spt20 snf2 e snf5 Por fim tambeacutem iraacute explorar-se quais as modificaccedilotildees poacutes-
traducionais que regulam a actividade do Yap8 e de que forma estas afectam a sua estabilidade
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activation in Saccharomyces cerevisiae under arsenic conditions FEBS Letters 566 141-146
Momeny M Zakidizaji M Chasemi R Dehpour AR Rahimi-Balaei M Abdolazimi Y
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Entidade Reguladora dos Serviccedilos de Aacuteguas e Resiacuteduos 2009 Relatoacuterio anual do sector de aacuteguas e
resiacuteduos em Portugal Volume 4- Controlo da qualidade da aacutegua para consumo humano Versatildeo de
Setembro de 2010 httpwwwersarptwebsiteViewContentaspxFolderPath=5cRoot5c
Contents5cSitio5cMenuPrincipal5cDocumentacaoampSubFolderPath=5cRoot5cContents5c
Sitio5cMenuPrincipal5cDocumentacao5cPublicacoesIRARampBookCategoryID=1ampBookTypeID
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Soutourina J Wydau S Ambroise Y Boschiero C e Werner M 2011 Direct interaction of RNA
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Johansson E Boman J Posas F Wysocki R e Tamaacutes MJ 2006 The MAPK Hog1p modulates
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Toledano MB Delaunay A Biteau B Spector D and Azevedo D 2003 Oxidative stress
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van de Peppel J Kettelarij N van Bakel H Kockelkorn TTJP van Leenen D e Holstege
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