IMUNIZAÇÃO ORAL CONTRA A ESQUISTOSSOMOSE COM Salmonella typhimurium ATENUADA CARREANDO PLASMÍDEOS (VACINAS DE DNA) PORTADORES DO GENE Sm14.

Luis Gustavo Carvalho Pacheco

Orientador: Prof. Dr. Vasco AzevedoCo-Orientador: Prof. Dr. Alan Lane de

Melo

LABORATÓRIOS

Genética Celular e Molecular

(LGCM), Dep. de Biologia Geral.

Taxonomia e Biologia de

Invertebrados, Dep. de

Parasitologia.

Imunologia das Doenças

Infecciosas, Dep. de Bioquímica e

Imunologia.

PLANO DE APRESENTAÇÃO

INTRODUÇÃO

OBJETIVOS

MATERIAIS E MÉTODOS

RESULTADOS E DISCUSSÃO

CONCLUSÕES

AGRADECIMENTOS

VACINA DE DNA

Histórico e conceito

Mecanismos de indução de resposta imunológica.

Vias de administração.

BACTÉRIAS CARREADORAS

Vantagens.

Mecanismo de transferência de plasmídeos vacinais.

Trabalhos com gene repórter.

Outras doenças.

Ainda não há trabalhos na literatura relatando o uso de linhagens atenuadas de Salmonella como carreadoras de vacinas de DNA contra doenças parasitárias, incluindo esquistossomose.

ESQUISTOSSOMOSE

Vermes do gênero Schistosoma Problema sócio-econômico e de

saúde pública Pessoas em risco: quase 800 milhões Pessoas infectadas: cerca de 200

milhões No Brasil: ~6,4 milhões (NE e MG) Ciclo biológico

(BERGQUIST et al., 2002; KATZ & PEIXOTO, 2000)

CICLO DE VIDA DE SCHISTOSOMA spp.

www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/ Frames/S-Z/Schistos...

ESTRATÉGIAS DE CONTROLE

Saneamento básico

Quimioterapia: oxamniquina e

praziquantel

Re-infecção em áreas endêmicas

VACINA EFETIVA (proteção a longo prazo)

CONCEITO DE VACINA PROTETORA

Diferente do normalmente associado com vacinas.

Imunidade parcial: diminuição da carga parasitária. menos ovos acumulados = redução da

reação granulomatosa. menos ovos liberados para o ambiente.

(BERGQUIST et al., 2002)

CARACTERÍSTICAS IMUNOLÓGICAS

Natureza provável da resposta imunológica:

dicotômica: células Th1 e Th2

variação na produção de citocinas e imunoglobulinas pelo hospedeiro, de acordo com a fase de desenvolvimento do parasito.

(AL-SHERBINY et al., 2003; HOFFMANN & WYNN, 2000)

CANDIDATOS VACINAIS 6 antígenos de Schistosoma escolhidos

pela OMS como os mais promissores, utilizando proteína recombinante.

Sh28GST em fase mais avançada de estudos:

BILHVAX (proteína recombinante) diminuição de fecundidade fase II de testes clínicos

SM14

FABP (fatty acid-binding protein). Aquisição e utilização de ácidos

graxos por diferentes organismos. Vacina bivalente anti-helmíntica.

(TENDLER et al., 1996)

Vacina de DNA com Sm14. (NASCIMENTO

et al., 2002)

OBJETIVO GERAL

Desenvolver e avaliar a eficácia de uma nova estratégia de imunização contra a esquistossomose experimental.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Transformar a linhagem atenuada SL3261 de Salmonella typhimurium com o plasmídeo vacinal.

Digestão e sequenciamento de pCI-Sm14. Ensaios de imunização oral de camundongos

SWISS. Avaliar produção de anticorpos. Avaliar proteção conferida aos

camundongos contra a esquistossomose experimental.

MATERIAIS E MÉTODOS

pC

MV

pC

MV

pCI-Sm14

pCI-neo

Amp

Amp

RESTRIÇÃO ENZIMÁTICA

SEQUENCIAMENTO

TRANSFORMAÇÃO

Salmonella typhimurium SL3261

CURVAS DE CRESCIMENTO

ENSAIOS DE IMUNIZAÇÃO ORAL

S. typhimurium SL3261 (pCI-neo)

00,20,40,6

0,81

1,21,4

02:20 03:40 04:40 05:40 06:40 07:40 08:40 09:40

Tempo (horas)

D.O

.60

0n

m

5,26 x 108

ENSAIOS DE IMUNIZAÇÃO ORAL

7 doses de 109 u.f.c foram administradas, no intervalo de 30 dias.

10-1 10-2 10-7

Meio + Antib. + Bactéria

O.N.

Diluição1\50

Fase estacionária Fase exponencial

4:30 hs depoisO.D. 0,8-0,9

...

(~10-8 a 10-9 UFC/ml)

Imunização com 100 µl

Meio da fase exponencial

Concentração (5 X 109 UFC/ml)

1 ANÁLISE DE RESPOSTA IMUNE HUMORAL

2 INFECÇÃO EXPERIMENTAL RECUPERAÇÃO DOS VERMES

3 ANÁLISES DE PROTEÇÃO

MATERIAIS E MÉTODOS

DIGESTÃO E SEQUENCIAMENTO DE pCI-Sm14

Foi confirmada a integridade estrutural do plasmídeo vacinal.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10PM

5000pb

2000pb

1000pb

400pbCANALETAS 8 E 9: Nhe I + Not I

CURVAS DE CRESCIMENTO

S. typhimurium SL3261 (pCI-neo)

00,20,40,6

0,81

1,21,4

02:20 03:40 04:40 05:40 06:40 07:40 08:40 09:40

Tempo (horas)

D.O

.600

nm

5,26 x 108

S. typhimurium SL3261 (pCI-Sm14)

00,20,40,60,8

11,21,41,6

02:20 03:40 04:40 05:40 06:40 07:40 08:40 09:40

Tempo (horas)

D.O

.60

0nm

S. typhimurium SL3261

00,20,40,60,8

11,21,4

02:20 03:40 04:40 05:40 06:40 07:40 08:40 09:40

Tempo (horas)

D.O

.60

0nm

5,54 x 108

2,36 x 109

1,6 x 105

4,75 x 105

6 x 108

8,3 x 108

8,9 x 108

ANÁLISES DE PROTEÇÃO

Tratamento Nº Vermes recuperados

(X ± )

% Proteção Valor p

1º Ensaio de Imunização

PBS 6 16,5 ± 3,4 _ _

SL3261 6 14,3 ± 2,9 13,3 0,264

SL3261 (pCI-neo) 6 13,5 ± 2,7 18,2 0,122

SL3261 (pCI-Sm14) 5 12,2 ± 1,8 26,0 0,032*

2º Ensaio de Imunização

PBS 7 20,6 ± 8,3 _ _

SL3261 6 22,3 ± 10 _ _

SL3261 (pCI-neo) 7 16,7 ± 7,8 18,9 0,388

SL3261 (pCI-Sm14) 8 21,5 ± 6,9 _ _

Número de fêmeas de S. mansoni recuperadas por camundongo experimental

0

2

4

6

8

10

12

nº f

êmea

s re

cupe

rada

s/ca

mun

dong

o

PBS SL3261 pCI-neo pCI-Sm14 0

2

4

6

8

10

12

14

16

nº f

êmea

s re

cupe

rada

s/ca

mun

dong

oPBS SL3261 pCI-neo pCI-Sm14

1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

Contagens de ovos maduros e imaturos de S. mansoni/ grama de fragmento intestinal dos camundongos.Estágio dos ovos PBS SL3261 SL3261 (pCI-neo) SL3261 (pCI-Sm14)

1º Ensaio

Ovos imaturos/nº de fêmeas recuperadas

751,45 ± 512,21 698,55 ± 566,76 630,75 ± 292,64 573,93 ± 448,13

Ovos maduros/nº de fêmeas recuperadas

201,90 ± 101,46 441,17 ± 497,26 239,20 ± 89,24 325,5 ± 139,01

2º Ensaio

Ovos imaturos/nº de fêmeas recuperadas

611,83 ± 381,15 993,61 ± 811,77 969,43 ± 556,60 660,77 ± 235,98

Ovos maduros/nº de fêmeas recuperadas

200,64 ± 138,49 470,09 ± 571,76 398,71 ± 187,59 303,97 ± 191,21

Contagens totais de ovos de S. mansoni/ grama de fragmento intestinal dos camundongos

0

2000

4000

6000

8000

10000

nº to

tal d

e ov

os/g

de

frag

men

to

inte

stin

al

PBS pCI-Sm14

0,0

5000,0

10000,0

15000,0

20000,0

25000,0

nº to

tal d

e ov

os/g

de

frag

men

to in

test

inal

PBS pCI-Sm14

1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

ANÁLISE DE RESPOSTA IMUNE HUMORALPRODUÇÃO DE IgG anti-Sm14

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

D.O

. 492

nmPBS

SL3261

SL3261(pCI-neo)

SL3261(pCI-Sm14)

15 30 45 60 75 90

-0,02

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

D.O

.492

nm

PBS

SL3261

SL3261(pCI-neo)

SL3261(pCI-Sm14)

*

15 30 45 60 75 90

1º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

2º ENSAIO DE IMUNIZAÇÃO

CONCLUSÕES

Não é possível afirmar que a imunização oral com a linhagem vacinal confere proteção a camundongos SWISS, após a infecção experimental com cercárias de S. mansoni.

A administração da linhagem de S. typhimurium carreadora de vacina de DNA induz produção de anticorpos IgG anti-Sm14 nos camundongos.

AGRADECIMENTOS

Pai, mãe e irmãos. Amigos de BH (Pterodactilo’s Corporation);

Amigos de Sete Lagoas; Carol. Professores Vasco Azevedo e Alan de Melo. Colegas do LGCM, do LTBI e do GIDE. Pessoal do LIDI e do Lab.

Imunoparasitologia. Pessoal da Biologia e da Genética.

Candidatos vacinais contra a esquistossomose

Antígeno Estágio expresso

Propriedade particular

Proteção conferida (%)

Cam. Rato Outros

(GST 28) Todos estágios Enzima 30-60 40-60 40 (primata)

(Sm97) Esquistossômuloverme adulto

Proteína muscular

30

(IrV-5) Todos estágios Proteína muscular

50-70 95 25 (primata)

(MAP-4) Todos estágios Enzima 30-40

Sm23(MAP-3)

Todos estágios Proteína integrada à membrana

40-50

Sm14 Esquistossômulo verme adulto

Antígeno de membrana

65 90-100 (coelho)

VACINA DE DNA

VIAS DE ADMINISTRAÇÃO

MECANISMOS DE TRANSFERÊNCIA DE PLASMÍDEOS VACINAIS POR BACTÉRIAS

CARREADORAS

WEISS & CHAKRABORTY, 2001.

ALGUMAS VACINAS DE DNA CARREADAS POR SALMONELLA

Linhagem Antígeno Doença Resposta imunológ

ica

S. typhimurium aro -

Listeriolisina (Listeria monocytogenes)

Infecção instesti

nal

Humoral e celular

S. typhimurium aro -

Antígeno de superfície do vírus da hepatite B

Hepatite B Humoral e celular

S. typhimurium aro -

Glicoproteína D do vírus da herpes

Herpes Humoral e celular

S. typhimurium aro -

ESAT-6 (Mycobacterium tuberculosis)

Tuberculose

-

S. typhimurium aro -

Peptídeo NS3 do vírus da hepatite C

Hepatite C Celular

S. typhimurium aro -

HIV-1 Env AIDS Celular

1798

Varíola

1981

Hepatite B

1992

VACINAS DE 1ª GERAÇÃO 2ª GERAÇÃO VACINAS DE DNA