UNIVERSIDADEFEDERALDORIOGRANDEDOSULCENTRODEBIOTECNOLOGIA

PROGRAMADEPÓS-GRADUAÇÃOEMBIOLOGIACELULAREMOLECULARPROCESSOSELETIVO2017/1CÓDIGODEIDENTIFICAÇÃO:1. AFigura1,extraídadoartigodeautoriadeFentonecolaboradores(EMBOJ.2000,19:1130-1137)representaumensaiodealteraçãodemobilidadeeletroforética(EMSA)paraavaliar o efeito de mutações na sequência da proteína Sigma 70 de Escherichia coli.ConsiderandoaFiguraedesualegenda,respondaàsquestõesabaixo.

Figura 1: EMSA of holoenzymeswith mutant sigmas on threeduplex DNA structures. Thesequence of each labeled probe isat the top, with –10 elementnucleotides shown in bold. Thearrow shows the position ofholoenzymebindingusingtheformof sigma indicated above theautoradiogram. ‘None’ has nosigma.Coreisalwayslimitingsothelowercore-bindingbandappearstoinclude a contribution from freeforms of core present inholoenzyme preparations. (A) ThelacUV5 probe from –41 to +1. Intypical experiments, wild-typesigmabound4%oftheprobe,2–3%bindingwas seenwithmutants atpositions426,27,3033,37,40,43

and46,and<2%bindingwasseenwithmutantsatpositions445,48and49,withpositions425,34,36,41and51beingbelowthelimitofdetection.a) Considerandoasmutaçõesacima,quaisdelasnãosãocapazesdemanteracapacidade

deSigmaemreconhecere/ouseassociaràsequênciadeDNA?

b) Qual a possível razão pela qual estas versões mutantes não apresentam estacapacidade?

2. O adequado início da síntese proteica depende de uma variedade de fatores,conhecidoscomofatoresdeiníciodatradução(IFsemprocaritosoueIFsemeucariotos).eIF2desempenha um papel fundamental e sua fosforilação pode causar a inibição da sínteseprotéica.CombasenaanálisedaFigura2,extraídadoartigodeHardingecolaboradores(MolCell.2000,6:1099-1108),respondaàsquestões

Figura2.PERKisrequiredforCHOPgeneexpressionduringERstress.(C)Toppanels,immunoblotwithantiserum specific to eIF2 phosphorylated on serine 51 (P-eIF2). Bottom panels, immunoblot withantiserumreactivewithallformsofeIF2(totaleIF2).Mouseembryonicstem(ES)cellswithwild-type,or Perk-/- genotype were treated with 200 nM thapsigargin (Tg), an agent that drives ER stress,deprivedofleucine(-Leu)orleftuntreatedfortheindicatedperiodoftime.a) QualasuaintepretaçãosobreopapeldePerk(umacinase)namodulaçãodaatividade

deeIF2?b) EstacinaseapresentaatividadesobreeIF2dependentedeestímulo?Discorra3. Aimagemabaixo(Figura3)foipublicadanoartigooriginalquepropôsconceitodedistânciagenética(Fitch&Margoliash,Science1967,155:279-284).Segundoesteconceito,onúmero de substituições de nucleotídeos que se acumulam nas sequências desde adivergênciaéumamedidaquantitativaparaadiferençagenéticaentresequências.

Figura 3: Calculation of observed mutation distances.The upper apex represents a hypothetical ancestralorganismthatdividedintotwodescendinglines,oneofwhich subsequently also divided. Thus,we have threepresent-day species, A, B, and C. The number ofobservablemutationsthathaveoccuredinaparticulargenesincetheAandBlinesofdescendentdivergedarerepresented respectively by a and b. The number ofmutations that separate the lower apex and C isrepresentedbyc.Thesumsofa+b,a+c,andb+c,then,are the mutation distance of the three species ascurrentlyobserved.

a. Considerando a árvore filogenética acima, como seria a capacidade da distânciagenéticaemdescreverdivergênciaentreassequênciasAeBseumaoumaismutaçõesdotipoA→C→Aocorressemduranteaseparaçãoentreasduasespécies?

b. Adistânciagenéticaentreumconjuntodesequênciaseriaamesmaseamedidafosserealizadacomsequênciasdeaminoácidos,aoinvésdenucleotídeos?Porquê?

4. Quandotrabalhamoscomproteínaspurificadasdeseustecidosnaturais,écomumqueelascontenhammodificaçõespós-traducionais,comoaglicosilação.Alémdeinterferirem alguns experimentos, a remoção destes grupos pode ser útil na identificação de suaocorrência como, por exemplo, comparando a posição de uma banda em um gel deeletroforeseanteseapósaremoçãodamodificaçãopós-traducional.Sehouverreduçãonamassamolecular,tem-seumforteindicativodeocorrênciadestamodificaçãonoesqueletopeptídico. Embora a forma mais seletiva de remover a glicosilação de proteínas sejaenzimática,em1981ummétodosimplesebaratofoidemonstrado,baseadonousodeácidotrifluorometanosulfônico (CF3SO3H, TFMS) (Edge e colaboradores,Anal. Chem. 1981, 118:131-137).ConsiderandoaTabelaabaixo,queindicaaquantidadedecarboidratoassociadoaumadadaproteínacomofunçãodotempoedatemperaturaapósotratamentocomTFMS,respondaasperguntasabaixo.

Table1:SugarAnalysisofFetuinafterTFMSTreatment

Mol/molprotein 25°C 0°C 0h 1h 3h 5h 2.5h 20hGlcNAca 15 3.8 2.2 2.2 3.2 2.6GalNAc 2.6 2.2 0.5 b 2.0 0.4Gal 10.4 0.8 - - 2.0 -Man 8.5 - - - - -

a: GlcNAc, N-acetylglucosamine; GalNAc, N-acetylgalactosamine; Gal; galacotse; Man,manose

b:Denotestraceelements(<0.4)a) Ométododede-glicosilaçãocomTFMSremovecompletamenteoscarboidratosligados

àproteína?Porque?b) ConsiderandoqueoTFMSéumácidocapazdehidrolisarligaçõesglicosídicas,quetipos

deconsequênciaspoderiamseresperadasdesuaaçãosobreaestruturaesequênciadeaminoácidosdeumadeterminadaproteína?

5. Avia de sinalização ativadapor TNF-αenvolveuma cascatade cinases que leva àfosforilaçãoedegradaçãodeIκBetranslocaçãodeNF-κBparaonúcleoeatranscriçãodegenesalvosdestefatordetranscrição.Abaixoestãoexperimentosrealizadosparamostrarofuncionamentodestavia(GenesandDevelop.1995,9:1586-1597).ConsiderandoasFiguras4e5,queMG132éuminibidordeproteassomoeCalyculinAéuminibidordefosfatases,respondaàsquestões:

Figura4:InducedphosphorylationandubiquitinationofIKBaincalyculinAorTNFa-treatedcells.(A)Stabilizationofthephos-phorylatedformofIKBc~byMG132.JurkatTcellswerepretreatedwith40~MofMG132{lanes2,4)orDMSO(adiluentforMG132,lanes1,3)for30minbeforeincubationwith0.3~MofcalyculinA{lanes3,4)orDMSO{lanes1,2)foranadditional30rain.Cytoplasmicextractswereprepared, fractionatedby SDS-PAGE,andanalyzedbyWesternblotusinga rabbitpolyclonalantibodyagainstthecarboxylterminusofIKBc~{aminoacids297-317,c-21).Thephosphorylatedformof IKBc~isdesignatedp-IKBa.{B) Inducedubiquiti-nationof IKBabycalyculinA.JurkatTcellswerepretreatedwithMG132(40~tM,lanes2-9)orDMSO{lane1)for30minbeforeadditionofcalyculinA(0.3~M,lanes4-9)orDMSO{lanes2,3).Cellextractswerepreparedat5rain(lanes2,4),10min{lane5),15rain(lane6),20rain{lane7),40rain(lane8),and60min{lanes3,9)afteraddingcalyculinAorDMSO. The extraction buffers contained RIPA/0.1% SDS plus 5mMN-ethylmaleimide (NEM). TheextractswerethensubjectedtoWesternblotanalysisasdescribedinA.

Figura 5: Mutations that prevent thephosphorylation of IKBba in vivo alsoabolishubiquitinationinvitro.(A)Invitro-translatedIKBbamutants.IKBbamutantswere translated inwheat germ extracts(PromegaTNTsystem)inthepresenceof[3SS]methionine. The translationproductswereanalyzedbySDS-PAGEandfluorography.{B)AshorterexposureofAshowing the IKB mutants beforeubiquitination re- actions. (C)Ubiquitination assays. IKB mutantsshown in Awere incubated in HeLa cellextractsat37 for1hrunderconditionsdescribed in Fig. 2A. The reactionmixtures were then subjected to SDS-PAGE and fluorography. In lanes 9 and10,TPCK(50~M)andPDTC(50uM)were

addedtothereactionscontainingwild-typeIKB,respectively.

a. Porqueo tratamentocomCalyculinA levaaumamigraçãomenornoSDS-PAGEemrelaçãoaonãotratado(comparebanda3e4combanda1e2nafiguraA)eporqueapresençadeMG132 levaaumacúmuloda IkBnapresençadecalyculinA (comparebanda4com3)enãoofaznaausênciadecaliculinA(comparebanda2e1).

b. Expliqueporqueaparecemtantasbandasacimade46kDanaFiguraBeporqueestasbandasaumentamnapresençadeMG132.

c. PorqueaIkBnãoéubiquinadanosmutantesnaqualaSerina32e/ou36étrocadaporumaalanina?Eporqueaubiquinaçãoaumentaquantoestasserinassãotrocadaspeloaminoácido fosfomimético glutamato? E proponha uma hipótese para o efeito dacalyculinAnomutanteS32A/S36A.

6. No artigo de Thakur et al. initulado “Localization of BRCA1 and a Splice VariantIdentifiestheNuclearLocalizationSignal”(MolCellBiol.1997,17:444-452),foramidenticadasduasvariantesdeprocessamentodogeneBRCA1,envolvidoemreparodeDNA,mostradosna Figura abaixo (Figura 6). Através da análise de sequência de amino ácidos, foramencontradasduassequênciasdelocalizaçãonuclear(NLS)potenciais:aminoácidos501a507(NLS1:KCKRKRR)e607a614(NLS2:KKNRLRRK).Plasmídeoscontendoasequênciadetodosos exons (BRCA1) ou sem o exon 11 (BRCA1D672-4095) foram transfectados em célulasNIH3T3ealocalizaçãodasproteínasproduzidasporestesplasmídeossãomostradasabaixo(Figura7).Responda:

Figura6.SchematicrepresentationofBRCA1andBRCA1672-4095.TheRINGfingermotif,NLS1,andNLS2areindicated.BRCA1672-4095,whichhasanin-framesplicedeletionofexon11,lacksbothNLS1andNLS2.Numbersdenoteexons.

Figura 7: SubcellularlocalizationstudiesofNIH3T3cells transfected with pCR3-BRCA1 and pCR3-BRCA1 672-4095. (a) BRCA1 localizes inthe nuclei of NIH 3T3 cellsfollowing transienttransfection, as detected byimmunofluoresencewith C-20antibody.(b)BRCA1672-4095islocalizedinthecytoplasmofNIH 3T3 cells followingtransient transfection, asdetected byimmunofluoresencewith C-20antibody.Thedatashownare

representativeof10transienttransfectionsofeachconstruct, inbothNIH3T3andCOS-7cells,andwith C-20, D-20, MS110, MS13, Ap13, and SG11. A minimum of 100 cells were scored in total.Magnification,187.5.a) Qualoimpactoesperadodaperdadoexon11sobreafunçãodaproteínaBRCA1?b) AnalizandoasduasNLSspresentesnoBRCA1,qualéacaracterísticafundamentaldeuma

NLS?c) MutaçõesemBRCA1estãoligadosaoaumentodeincidênciadeváriostipostumorais,

principalmentecâncerdemamaeovários.Baseadonasevidênciasapresentadasnesteartigo,proponhamutaçõespontuaispró-tumorais.

7. AFigura8,obtidadoartigodeZhnagecolaboradores(PlantPhysiol.2016,172:1306-1323),refere-seasrespostasdaplantaMedicagotruncatulaabaixastemperaturas.Respondaàsquestões:

Figura8:ModelforMtMYB3/MtMY61regulationofthe MtCBF4/MtCAS15 cold acclimation signalingmodule in M. truncatula. Under nonstressedconditions, the expression level of MtCBF4 isrepressedbyMtMYB3bindingonitspromoter.ColdstressrapidlyinducesthetranscriptionofMtMYB61,which interacts with the DNA-binding domain ofMtMYB3and relieves the transcriptional inhibitionofMtCBF4byMtMYB3.ThisactivatestheexpressionofMtCBF4,whichdirectlyinducestheexpressionofthecoldacclimation-specificgeneMtCAS15.

a) CrieumalegendageralparaaspartesdaFigura,citandoaentidadebiológica(Proteína,

Gene,Elementoregulatório,etc)Elipse:Retângulogrande:Retângulopequeno:

b) Considerandoasproteínasrepresentadasnafigura,qual(quais)dela(s)é(são)fator(es)detranscrição?Oquepermitechegaraestaconclusão?

c) Quantasmoléculasdeácidosnucleicosestãorepresentadasnafigura?Circuleaspartesdafiguraquerepresentamestasmoléculas.

d) Com base nos dados da figura, e na legenda você espera queMtMYB61 possua umdomíniodeligaçãoaDNA?Porquê?Eumdomíniodeativação?Porquê?

8. Questõeshojeconsideradasbásicasemnossoconhecimentotiveramnopassadoqueser testadasdemaneira adequada.As Figuras9 e 10, obtidasdoartigodeCuatrecasas ecolaboradores(ProcNatlAcadSciUSA.1968;61:636–643),apresentaumexperimentoquetestaumanovaresinadesenvolvidaparaseparaçãodequimotripsinaporafinidade.

Figura 10: Affinity chromatografyon a-chymotrypsin on inhibitorSepharose columns. The columns(0,5X5cm)wereequilibratedandrunwith0.05MTris-Clbuffer,pH8.0,andeachsample(2.5mg)wasapplied in 0.5 ml of the samebuffer. One-milliliter fractionswere collected, the flow ratewasabout 40 ml per hour, and theexperiments were performed arroom temperature. a-chymotrypsinwaselutedwith0.1M acetic acid, pH 3.0 (arrows).PeaksPrecedingthearrowsinB,C,D were devoided of enzymeactivity.

Figura11.AffinitychromotogrphyofcarboxipeptidaseAonacolumn(0.5X6cm)ofSepharosecoupledwithL-tyrosine-D-tryptophan.Thebufferwas0.05MTris-Cl,pH 8.0, containing 0,3 N NaCl. About 1 mg of purecarboxipeptidaseA(A,B)and1,8mgcarboxipeptidaseB(C), in1mlofthesamebuffer,wereappliedtothecolumns.Elutionwasaccomplishedwith0.1Maceticacid(arrow).

a. Considerando as quatro condições apresentadas na Figura 10, emqual delas houve

maiorsucessonapurificação?Expliquesuaescolha.Esclareçatambémquaisosmotivosofizeramdescartarasoutrastrêspossibilidades

b. Visandoapresentarodesenvolvimentodeumanovacolunadeafinidade,foirealizadooexperimentorepresentadonaFigura11.Qualaimportânciadesseexperimentoparaodesenvolvimentopretendido?

9. Combasenaanálisedoabstractreferenteaoartigointitulado“Phytoremediationoforganomercurial compounds via chloroplast genetic engineering”, (Plant Physiol. 2003,132:1344-1352),abaixodescrito,reponda:AbstractMercury(Hg),especiallyinorganicform,isahighlytoxicpollutantaffectingplants,animals,andman.Inplants,theprimarytargetofHgdamageisthechloroplast;Hginhibitselectrontransportandphotosynthesis.Inthepresentstudy,chloroplastgeneticengineeringisusedforthefirsttimetoourknowledgetoenhancethecapacityofplantsforphytoremediation.ThiswasachievedbyintegratinganativeoperoncontainingthemerAandmerBgenes(withoutanycodonmodification),whichcodeformercuricionreductase(merA)andorganomercuriallyase (merB), respectively, into the chloroplast genome in a single transformation event.StableintegrationofthemerABoperonintothechloroplastgenomeresultedinhighlevelsoftolerancetotheorganomercurialcompound,phenylmercuricacetate(PMA)whengrowninsoilcontainingupto400microMPMA;plantdryweightsofthechloroplasttransformedlinesweresignificantlyhigherthanthoseofwildtypeat100,200,and400microMPMA.ThatthemerAB operon was stably integrated into the chloroplast genome was confirmed bypolymerasechainreactionandSouthern-blotanalyses.Northern-blotanalysesrevealedstabletranscripts thatwere independent of the presence or absence of a 3'-untranslated regiondownstreamofthecodingsequence.ThemerABdicistronwasthemoreabundanttranscript,butlessabundantmonocistronswerealsoobserved,showingthatspecificprocessingoccursbetweentransgenes.TheuseofchloroplasttransformationtoenhanceHgphytoremediationisparticularlybeneficialbecause itprevents theescapeof transgenesviapollen to relatedweedsorcropsandthereisnoneedforcodonoptimizationtoimprovetransgeneexpression.Chloroplasttransformationmayalsohaveapplicationtoothermetalsthataffectchloroplastfunction.a. QualinformaçãopermitededuzirqueosgenesmerAemerBsãogenesbacterianos?b. Porquenãofoinecessáriorealizarotimizaçãodecódonsparaexpressãodosgenesnos

cloroplastosdeplantas?