Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes … · 2017. 11. 4. · Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos WASHINGTON

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA

PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos

de peixes marinhos e estuarinos

WASHINGTON CANDEIA DE ARAÚJO

NATAL-RN 2009

ii

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA

PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos

de peixes marinhos e estuarinos

WASHINGTON CANDEIA DE ARAÚJO

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.

Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina

NATAL-RN 2009

iii

A José Inácio e Adelma

iv

“As he stood upon the watch deck

Looking out onto the sea

It would offer no solutions

Only silent company” (The Wake of Magellan)

v

AGRADECIMENTOS

Este trabalho, resultado de quase dois anos de pesquisa, foi possível

graças à participação (direta ou indiretamente) de algumas pessoas.

Sobretudo, deixo meus sinceros agradecimentos ao orientador Dr. Wagner

Franco Molina, por ter fornecido a oportunidade de aprender e vislumbrar esta

ciência tão instigante. Agradeço por sua paciência, compreensão e entusiasmo.

A todos os professores e funcionários do Programa de Pós Graduação em

Genética e Biologia Molecular, especialmente a Leyla, sempre disposta a nos

ajudar.

Aos professores: Dr. Carlos Blaha, Dr. Veríssimo e Dra. Regina, pela

importante participação na correção da imberbe versão desta dissertação. Ao

Professor Dr. Marcos Antonio Nóbrega de Sousa, por sua importante participação

na banca examinadora e observações pertinentes que muito somaram à

dissertação.

A todos do Laboratório de Genética de Recursos Marinhos: Allyson, Eurico,

Paulo, Layse; a Gideão Wagner Werneck, por ter ajudado tempestivamente nas

necessidades técnicas; Rodrigo Xavier, sempre solícito na identificação dos

peixes, além da ajuda nas fotos; a Clóvis, pela grande ajuda nas coletas e

transporte do material; Uedson Jacobina e Pablo Martinez, por dividirem um pouco

de sua grande experiência e conhecimento da citogenética; a Inailson Marcio,

pelos conselhos e pelo exemplo de dedicação; a Divana Eliva, pela amizade e por

vi

toda ajuda ao longo dos últimos meses, nas coletas, preparação do material,

análises e importante ajuda na montagem das fotos desta dissertação.

Aos meus colegas de turma.

Ao Dr. Ricardo Rosa (UFPB) e sua orientanda Luciana Alcântara (UFPB),

além do Dr. Garcia Jr. (UFRN) por sua ajuda na identificação das espécies

presentes neste trabalho.

A Maxwell da Silva e Anthonini pela amizade, partidas de futebol e pelos

bons momentos vividos neste último ano.

Ao meu amigo Diego e sua família, pela força e ajuda aqui em Natal.

Ao meu grande amigo John Paul Albuquerque Caldas, por todo o apoio e

amizade, além da ajuda durante a preparação da apresentação desta dissertação.

A Debinha, que me cativou, e cuja amizade e presença marcante em minha

vida ajudaram a me fortalecer. A você, o meu amor.

Não poderia deixar de agradecer sinceramente a meus pais, Adelma e José

Inácio, por terem me fornecido todos os meios de continuar neste árduo e

compensador caminho do conhecimento. Aos meus irmãos, Tardelli e Wellington,

por esta amizade e amor incondicional.

vii

RESUMO

Estudos citogenéticos têm revelado uma grande diversidade até então não

detectada em diversas famílias de peixes. Muitos destes grupos, sobretudo os que

exibem grande diversidade, como Perciformes e Siluriformes, possuem espécies

de difícil caracterização morfológica, chamadas de espécies crípticas, muitas

vezes só detectadas através de análises cariotípicas, as quais revelam variações

interespecíficas marcantes quanto ao número e estrutura cromossômica. Desta

forma, o presente trabalho pretende contribuir para o conhecimento citogenético

de espécies marinhos e estuarinos, que, por não serem exploradas

comercialmente ou terem hábitos de vida peculiares são pouco estudadas quanto

aos seus aspectos genéticos. Assim, análises cariotípicas foram desenvolvidas em

uma espécie da família Apogonidae (Perciformes), em duas espécies de bagres

marinhos da família Ariidae (Siluriformes), além de uma espécie de siluriforme

estuarino, Paurachenipterus galeatus (Auchenipteridae) através de bandamento C,

Ag-RONs, coloração com DAPI e CMA3, bem como pela FISH (Fluorescent in situ

hibridization), utilizando sondas ribossomais 5S e 18S. Os resultados aqui

apresentados indicam grande diversidade inerente a estes grupos. Outras

abordagens (análises morfológicas e ferramentas moleculares) permitirão obter

maior entendimento acerca da diversidade biológica da ictiofauna brasileira.

Palavras-chave: bandas de replicação, evolução cromossômica, espécies

crípticas, especiação alopátrica, citótipos.

viii

ABSTRACT

Cytogenetic studies have been revealing a great diversity not detected, until then,

in several families of fishes. Many of these groups, especially those that exhibit

great diversity, like Perciformes and Siluriformes, possess species with difficult

morphologic characterization, called cryptic species, commonly detected through

karyotypic analyses, which reveals outstanding interespecific variations with

relationship to the number and its chromosomal structures. Thus, the present work

intends to contribute for the cytogenetic knowledge of marine and brackish fish

species, because they peculiar life habits and by lack of cytogenetic data of your

genetic aspects. Therefore, cytogenetic studies were developed in a species of

Apogonidae (Perciformes), two species of sea catfishes of the family Ariidae

(Siluriformes) and brackish fish Paurachenipterus galeatus (Siluriformes,

Auchenipteridae), through C banding, Ag-NOR, use of base-specific

flourochromes (DAPI and CMA3), as well as FISH (Fluorescent in situ

hybridization) using ribosomal DNA probes 5S and 18S. The present results

contribute to a better understanding of the processes of differentiation patterns and

chromosome evolution in these groups. The use of other approaches (the

morphology and molecular tools) will allow a larger understanding of the genetic

and biological diversity of the Brazilian ichthyofauna.

Key words: replication banding, karyotipic evolution, cryptic species, allopatric

speciation, cytotypes.

ix

Lista de Figuras Figura 1. Mapa do Brasil evidenciando os pontos de coleta no litoral do Rio

Grande do Norte e a Bahia.....................................................................................10

CAPÍTULO 1

Figura 1. Exemplar de Apogon americanus. Barra = 1cm.....................................18

Figura 2. Cariótipo de Apogon americanus corado com giemsa. Barra = 5µ........20

Figura 3. Banda C de A. americanus. Barra = 5µ..................................................20

Figura 4. Cariótipo de A. americanus através de RBG-banding. Barra = 5µ.........21

Figura 5. Cariótipo de A. americanus através de ER EcoRI. Barra = 5µ...............21

Figura 6. Metáfases de A. americanus após coloração com CMA3 (a); DAPI (b).

Barra = 5µ...............................................................................................................22

Figura 7. Hibridação fluorescente in situ em A. americanus com sondas: rDNA

18S (a); rDNA 5S (b). Barra = 5µ............................................................................22

Figura 8. Idiogramas de A. americanus: RBG-banding (a); banda C (b). Barra =

5µ............................................................................................................................23

CAPÍTULO 2

Figura 1. Exemplares de Cathorops spixii (a); Sciades cf. emphysetus. (b). Barra =

5cm.........................................................................................................................33

Figura 2. Cariótipo de Cathorops spixii (a); Sciades cf. emphysetus (b) submetidos

à coloração com Giemsa. Em destaque à direita, de cima para baixo, os pares

nucleolares submetidos ao FISH com sonda 18S, coloração pela Cromomicina A3

e Ag-RONs. Barra = 5µ...........................................................................................35

Figura 3. Metáfases de C. spixii (a) e de Sciades cf. emphysetus. (b) após

tratamento com AgNO3. As setas indicam os cístrons ribossômicos. Barra =

5µ............................................................................................................................36

Figura 4. Metáfases de C. spixii (a); Sciades cf. emphysetus. (b) após tratamento

com CMA3. Barra = 5µ...........................................................................................36

Figura 5. Hibridação fluorescente in situ em: C. spixii (a); Sciades cf. emphysetus.

(b). Barra = 5µ.........................................................................................................37

x

CAPÍTULO 3

Figura 1. Exemplar de Parauchenipterus galeatus. Barra = 1cm..........................46

Figura 2. Cariótipo do P. galeatus submetido à coloração com Giemsa...............47

Figura 3. Bandamento C em cromossomos de P. galeatus. Barra = 5µ................47

Figura 4. Metáfase de P. galeatus após tratamento com AgNO3. As setas indicam

cístrons ribossômicos. Barra = 5µ..........................................................................48

Figura 5. Metáfases de P. galeatus. a e b) FISH evidenciando cístrons 18S rDNA.

Barra = 5 µ..............................................................................................................48

Figura 6. Metáfases de P. galeatus. CMA3 a); CMA3 evidenciando associação de

RONs b); DAPI c). ..................................................................................................48

xi

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1

Tabela 1. Dados citogenéticos disponíveis para a família Apogonidae.................24

CAPÍTULO 2

Tabela 1. Dados citogenéticos disponíveis para a família Ariidae.........................38

CAPÍTULO 3 Tabela 1. Revisão dos dados cariotípicos da família Auchenipteridae..................49

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

BrdU – 5’-bromodesoxiuridina

CMA3 – cromomicina A3

DAPI – 4’,6 – diamidino-2-fenilindol

ER – enzima de restrição

FISH – Fluoresence In Situ Hybridization

NF – número fundamental.

RBG-banding – Bandas de replicação através de BrdU usando Giemsa

(Replication bands by BrdU using Giemsa)

rDNA – DNA ribossomal

RON – região organizadora de nucléolo

SSC – citrato de sódio salino (saline sodium citrate)

xiii

SUMÁRIO AGRADECIMENTOS............................................................................................... v

RESUMO................................................................................................................ vii

ABSTRACT........................................................................................................... viii

LISTA DE FIGURAS............................................................................................... ix

LISTA DE TABELAS............................................................................................. xii

LISTA DE ABREVIAÇÕES................................................................................... xiii

1. INTRODUÇÃO....................................................................................................01

1.1. Conservação genética.....................................................................................01

1.2. A citogenética como fonte de inferências evolutivas.......................................01

2. OBJETIVOS.......................................................................................................08

3. MATERIAL E MÉTODOS...................................................................................09

3.1. MATERIAL.......................................................................................................09

3.2. MÉTODOS.......................................................................................................11

3.2.1. PREPARAÇÕES CROMOSSÔMICAS.........................................................11

3.2.1.1. TÉCNICA DE ESTIMULAÇÃO MITÓTICA................................................11

3.2.2. OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS MITÓTICOS........................................11

3.2.3. PREPARAÇÃO DE LÂMINAS......................................................................12

3.2.4. ANÁLISE CROMOSSÔMICA E MONTAGEM DOS CARIÓTIPOS..............12

3.2.5. TÉCNICAS DE BANDAMENTOS CROMOSSÔMICOS...............................12

3.2.5.1. Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RONs)..................... 12

3.2.5.2. Detecção de heterocromatina constitutiva (Banda-C)...............................12

3.2.6. Técnicas de coloração com fluorocromos base-específicos........................13

3.2.7. Bandamentos com enzimas de restrição (ERs)............................................13

xiv

3.2.8. Método de incorporação do análogo de base 5’BrdU...................................13

3.2.9. Hibridação in situ fluorescente (FISH)..........................................................14

CAPÍTULO 1

Análises citogenéticas em Apogon Americanus (Perciformes: Apogonidae):

evidências de marcante redução cromossômica..............................................15

Resumo...................................................................................................................15

Introdução...............................................................................................................15

Objetivos.................................................................................................................17

Material e Métodos.................................................................................................17

Resultados..............................................................................................................19

Discussão...............................................................................................................25

CAPÍTULO 2

Análises cromossômicas em espécies da família Ariidae (Teleostei,

Siluriformes) do Litoral NE Brasileiro.................................................................29

Resumo...................................................................................................................29

Introdução...............................................................................................................29

Objetivos.................................................................................................................31


Resultados..............................................................................................................34

Discussão...............................................................................................................39

CAPÍTULO 3

Novo citótipo para o cangati, Parauchenipterus galeatus (Siluriformes,

Auchenipteridae) no NE do Brasil: Evidência de um complexo de

espécies.................................................................................................................43

Resumo...................................................................................................................43

xv

Introdução...............................................................................................................43

Objetivos.................................................................................................................45


Resultados..............................................................................................................46

Discussão...............................................................................................................49

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS...............................................................................53

6. CONCLUSÕES...................................................................................................55

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................56

Inferências carioevolutivas sobre grupos crípticos de peixes marinhos e estuarinos

1

1. INTRODUÇÃO

Uma das mais importantes aplicações da genética da conservação

biológica consiste da caracterização precisa de populações e espécies,

permitindo revelar muitas vezes uma diversidade biológica ainda desconhecida.

Não raro certas espécies são morfologicamente muito semelhantes entre si,

entretanto, quando em simpatria, se mostram isoladas reprodutivamente (Mayr,

1977). A falta de estudos genéticos mais amplos e aprofundados impossibilita

apontar se a presença de espécies crípticas pode estar relacionada com certos

habitats, latitudes ou grupos taxonômicos particulares (Bickford et al., 2006).

Reconhecer adequadamente estas espécies permite avaliar o real status da

diversidade genética existente e sua distribuição espacial (Galetti et al., 2008).

Para o efetivo manejo dos recursos pesqueiros, um reconhecimento

taxonômico correto é imprescindível, tendo em vista que os órgãos públicos de

controle e defesa ambiental necessitam avaliar quantitativa e qualitativamente

as capturas e, em caso de indicação de esgotamento dos estoques, permitir

intervenção apropriada.

Apesar de dois terços de todas as espécies habitarem os trópicos, a

maioria dos estudos se detém a espécies de zonas temperadas (Bickford et al.,

2006). Diante deste quadro de carência de informações genéticas, e por sua

efetiva utilidade na identificação de novas espécies, a citogenética tem sido

usada como uma primeira abordagem genética voltada à caracterização de

populações ou espécies.

1.1. A citogenética como fonte de inferências evolutivas

Análises cariotípicas têm ajudado a detectar diversidade em grupos de

difícil caracterização por análises morfológicas, através de múltiplos caracteres

advindos de variações intra e interespecíficas em relação o número diplóide,

fórmula cromossômica, padrão de distribuição de heterocromatina constitutiva

e localização de sítios ribossômicos (Bertollo et al., 2000). Assim, o uso da

citogenética é de grande importância na mitigação de erros taxonômicos,

principalmente em conjunto com caracteres morfológicos e morfométricos


2

(Galetti, et al., 2000; Benzaquem et al., 2008), na elucidação de padrões

populacionais, além de condições para sua conservação (Carvalho-Costa et al.,

2008; Kantek et al., 2008).

Evolutivamente, em alguns grupos de peixes, a estrutura cariotípica

quando comparada com as mudanças morfológicas, parece ter sofrido poucas

mudanças. Dentre os peixes, a Ordem Perciformes, a maior entre os peixes,

caracteriza-se como um modelo apropriado para o entendimento geral da

estrutura genética de populações marinhas, pois são encontrados neste grupo,

exemplos tanto de conservação cromossômica, compartilhado por vários

grupos taxonômicos, quanto de diversificação cariotípica em outros (Brum e

Galetti, 1997). Este grupo não apresenta suas relações filogenéticas ainda bem

definidas, podendo constituir um grupo polifilético (Nelson, 2006). Estudos

cariotípicos têm sido realizados com o intuito de auxiliar no esclarecimento de

seus padrões sistemáticos e taxonomia. Cerca de 8% do número total de suas

espécies tiveram seus cariótipos descritos, evidenciando número modal de

2n=48a para cerca de 63% do total das espécies (Affonso, 2000).

Um cariótipo composto exclusivamente por 48 cromossomos

acrocêntricos, onde se observa a presença de blocos heterocromáticos

reduzidos encontrados preferencialmente em posição pericentromérica, além

da presença de regiões organizadoras de nucléolos (NOR) simples, é

considerado basal para Perciformes (Molina, 2006). Assim, grupos que

apresentam outras composições cariotípicas representam uma condição

derivada. Naqueles grupos de Perciformes com representantes em águas

interiores, uma maior divergência cariotípica tem sido identificada,

particularmente devido ao isolamento geográfico, como visto em espécies de

Cichlidae. Padrões de evolução cariotípica mais significativos tem sido

observados em diversos grupos marinhos desta Ordem, como é observado em

Pomacentridae (Molina e Galetti, 2002) e Apogonidae (Rivlin et al., 1986).

Grande parte das espécies de Perciformes tiveram seus cariótipos

descritos com base em técnicas convencionais. Em outros grupos, no entanto,

como os Nothothenioidae (peixes antárticos) vêm sendo empregadas

largamente técnicas moleculares, permitindo evidenciar uma grande

diversificação cromossômica e processos ativos de reestruturação genômica

(Mazzei et al., 2006; Pisano et al., 2003; Pisano e Ozouf-Costaz, 2000).


3

Apesar da riqueza cariotípica observada em espécies marinhas do

Atlântico Ocidental (Sena e Molina, 2007), para grande parte das famílias são

desconhecidos os processos que levaram à diferenciação devido ao ainda

incipiente conhecimento disponível sobre a estrutura dos seus cromossomos

como, por exemplo, na família Apogonidae.

É sabido que em Perciformes, as espécies apresentam geralmente um

número fundamental (NF – número de braços cromossômicos) igual a 48

(cerca de 60% de todas as espécies já estudadas), o que se acredita ser uma

condição plesiomórfica (Molina, 2006). No entanto, pode ser observada uma

variabilidade, tanto no número diplóide, quanto de braços cromossômicos. Na

Subordem Percoidei, por exemplo, algumas famílias apresentam número

diplóide e fundamental basais (2n e NF=48), como em Chaetodon striatus –

Chaetodontidae (Affonso e Galetti, 2005), enquanto outras exibem maior

diversificação cromossômica, como os membros da família Apogonidae. Isto é

particularmente evidente nas espécies do gênero Apogon, as quais apresentam

números diplóides reduzidos e NF elevados, resultado de modificações

cromossômicas mediadas principalmente por rearranjos Robertsonianos e

inversões pericêntricas (Rivlin et al., 1987).

Os Apogonídeos são encontrados com relativa freqüência em ambientes

recifais. Entre eles se destaca Apogon, gênero cujas espécies são as mais

numerosas e dominantes nos recifes de corais, compreendendo ao menos 174

representantes de distribuição mundial. São pequenos predadores noturnos

que se alimentam de pequenos crustáceos, ovos e larvas de peixes. A idade

mínima deste gênero está referenciada ao isolamento do Mediterrâneo, no

Oligoceno e Mioceno (Mabuchi et al., 2006).

A estrutura dos cromossomos dos Perciformes, revelada através de

bandamentos cromossômicos mostram certa conservação entre as espécies.

Desta forma pequenas mudanças estruturais identificadas estão associadas a

padrões autapomórficos espécie-específicos, sistemas de cromossomos

sexuais, além de polimorfimos populacionais (Molina e Galetti, 2002; Galetti et

al., 2000).

As RONs, observadas através da técnica de impregnação por AgNO3 ou

pela hibridação com sondas ribossomais (FISH) constituem efetivos

marcadores citotaxonômicos para peixes (Affonso, 2000), podendo variar em


4

tamanho, número, posição e atividade no cariótipo das espécies, populações

ou indivíduos (Capistano et al., 2008). A presença de um único par portador de

RONs representa a condição mais freqüente em Perciformes, sendo apontada

com condição basal para o grupo (Galetti et al., 2000).

Baseado em dados citogenéticos tem sido possível a identificação de

inúmeros complexos de espécies. Um exemplo clássico de complexo de

espécies ocorre nos peixes neotropicais da família Erythrinidae, “Hoplias

malabaricus”, amplamente distribuídos (do Suriname à Argentina). Análises

citogenéticas demonstraram a existência de uma grande diversificação

cariotípica entre amostras de diferentes regiões geográficas, com a existência

de pelo menos sete tipos diferentes de citótipos (A - G), onde estão presentes

combinações particulares de números e morfologias cromossômicas, além de,

em alguns casos, presença de diferentes sistemas de cromossomos sexuais. A

efetiva presença de espécies crípticas é demonstrada pela ausência de

híbridos quando diferentes citótipos ocorrem em simpatria (Bertollo et al.,

2000).

Entre outros casos de espécies crípticas na região Neotropical,

identificados a partir de estudos cariotípicos, destaca-se pela grande

quantidade de dados citogenéticos disponíveis e diversidade cariotípica, o

complexo “Astyanax scabripinnis”. Constituído por espécies de cabeceiras de

rios, a análise citogenética em larga escala deste complexo, além de aspectos

de evolução cariotípica, também vem permitindo realizar inferências

biogeográficas sobre as espécies (Vicari et al., 2008).

Constituindo a biodiversidade íctica da região neotropical, os

Siluriformes se destacam por sua diversidade. Distribuídos por todos os

continentes, compreendem 35 famílias, 446 gêneros, 2.867 espécies, sendo

2.740 de água doce (Nelson, 2006). Algumas de suas espécies toleram bem a

salinidade, vivendo em ambientes estuarinos, além de espécies marinhas que

se distribuem pela costa e próxima a ilhas. Possuem ossos muito duros, sendo

facilmente fossilizados, além de grandes otólitos, o que leva a identificação de

muitas espécies através de seus esqueletos fósseis (Ferraris, 2007). Tais

registros datam do final do Cretáceo e início do Paleoceno, na Bolívia,

Paleoceno, na Argentina, Eoceno médio, nos Estados Unidos, final do Eoceno

e Início do Oligoceno, no continente Antártico, Mioceno médio, na Colômbia,


5

bem como em depósitos marinhos do Eoceno no Arkansas, E.U.A (Hutchins et

al., 2003). O conjunto destes registros mostra que este grupo teve uma elevada

irradiação, sendo encontrados registros em todos os continentes, exceto na

Austrália (Nelson, 2006). Suas características morfológicas são muito

peculiares. Têm corpo descoberto de escamas, embora em alguns casos

possa ser revestido por placas ósseas, possuindo geralmente quatro ou mais

pares de bárbulas, o que lhes dá um aspecto característico, além de espinhos

duros nas nadadeiras dorsal e peitoral. Algumas espécies são consideradas

venenosas, em função da inoculação de substâncias do muco epitelial, através

de ferimentos provocados pelos espinhos duros, que constituem estruturas de

defesa do animal. Há espécies bem pequenas, como Vandellia cirrhosa, o

temido candiru, encontrada na região Amazônica, parasita de outros peixes,

nos quais se aloja em suas brânquias; há ainda aquelas que alcançam três

metros de comprimento, como Silurus glanis. Possuem características

comportamentais variáveis quanto à natação e período de atividade (diurnos e

noturnos) (Betancur-R, 2007). Quanto a sua sistemática pertencem ao grupo

dos Ostariophysi, que abriga outras quatro Ordens: Gymnotiformes,

Gonorynchiformes, Characiformes e Cypriniformes. Assim como todos os

Ostariophysi, possuem um aparelho de Weber, que envolve cinco vértebras e

seu esqueleto caudal numa comunicação óssea usada para captação de

estímulos e sensações.

Uma evidência do sucesso evolutivo deste grupo são as constantes

nomeações de novas espécies, principalmente na região Neotropical (Ng et al.,

2008; Hardman, 2008; Darden, 2008).

Possivelmente devido a este sucesso evolutivo e diversificação, bem

como a características morfológicas peculiares, a taxonomia e filogenia deste

grupo mostra-se ainda muito difícil, com muitas questões latentes acerca da

classificação, além de muitos desacordos sobre a relação entre os organismos

deste táxon (Nelson, 2006).

Os Siluriformes formam um grupo de peixes dominantes nas águas

doces de todo o mundo, sofrendo uma grande irradiação neste ambiente.

Porém, significantes migrações marinhas foram feitas, o que é evidenciado

pela presença famílias marinhas Plotosidae e Ariidae (Marceniuk e Menezes,

2007).


6

Plotosidae constitui um grupo de peixes marinhos e de água doce,

encontrado apenas no Oceano Índico e oeste do Pacífico (no Japão, Austrália

e Fiji), sendo que as espécies marinhas geralmente são encontradas em corais

ou rochas.

Por sua vez, Ariidae possui distribuição circuntropical e constitui a única

família exclusivamente marinha de Siluriformes, sendo encontrados também

em estuários e desembocaduras de rios (Nelson, 2006). Apenas um restrito

grupo de espécies é essencialmente marinho, sendo encontradas em

profundidades de até 150 metros. Formada por 26 gêneros e 133 espécies,

com pelo menos 13 representantes fósseis. Sua morfologia externa é muito

semelhante entre as espécies, acarretando dificuldades de classificação e

diagnose, obtidas geralmente com base na disposição das placas de dentes

relacionadas ao vômer e placas acessórias (Marceniuk, 2003). Devido a esta

condição, ainda continua insatisfatória a obtenção de dados que permitam uma

boa determinação dos táxons incluídos na família. Esforços têm sido feitos para

auxiliar a compreensão da história evolutiva do grupo e vários estudos têm

focado não só a morfologia e distribuição geográfica, mas também aspectos

genéticos advindos do uso de ferramentas moleculares. Todos os enfoques

apontam uma condição monofilética para a família (Sullivan et al., 2006;

Marceniuk e Menezes, 2007; Betancur-R, 2007).

Os representantes deste clado compartilham características biológicas

peculiares, como por exemplo, reprodução especializada, onde alguns machos

incubam os ovos na cavidade bucal, para um posterior desenvolvimento não

pelágico, o que acaba refletindo em uma capacidade de dispersão limitada,

restringindo a maioria das espécies às águas continentais (Betancur-R et al.,

2007).

No Brasil são registradas ocorrências de espécies desta família, cujos

gêneros mais comuns são: Arius, Aspistor, Bagre, Genidens, Notarius,

Potamarius e Cathorops (Marceniuk e Menezes, 2007). Os estudos cariotípicos

para estas espécies têm utilizado principalmente as técnicas convencionais e,

embora haja dificuldade de resolução satisfatória devido ao pequeno tamanho

cromossômico destes animais, estas técnicas têm ajudado a revelar os

padrões carioevolutivos dentro e entre os grupos e sanar dúvidas taxonômicas.


7

No litoral do Rio Grande do Norte, encontram-se representantes desta

família principalmente em regiões de estuários, com a embocadura do rio

Potengi, em Natal, bem como de toda a região da costa. As espécies mais

comumente encontradas neste litoral são Arius herzbergii, Aspistor luniscutis,

Bagre bagre, B. marinus e Cathorops spixii (Garcia, 2006).

O uso de banda C para caracterização de populações de peixes tem

propiciado identificar um grande número de casos de diferenciação cariotípicas

interpopulacionais, cromossomos B e cromossomos sexuais (Kantek et al.,

2008; Porto-Foresti et al., 2008; Santos et al., 2008).

Em Leporinus elongatus, polimorfismos relacionados à a presença de

heteromorfismos cromossômicos relativos à presença ou ausência de

segmentos heterocromáticos nos pares de RONs, com 3 citótipos possíveis

revelaram uma estruturação populacional devido às barreiras formadas por

sucessivas construções de barragens entre os rios Mogi-Guaçú e

Paranapanema (Molina et al., 2008).

A maioria dos modelos de especiação cromossômica tem como

característica comum a aparição de mecanismos de isolamento pós-zigóticos

devido a diferenças cromossômicas que se acumulam entre as novas espécies

e seus ancestrais, dificultando a fertilidade ou viabilidade de híbridos

interespecíficos, reduzindo, desta forma, o fluxo gênico (Rieseberg, 2001).

Dentre estes fatores, os rearranjos cromossômicos são um dos mais

importantes, tendo relevante papel como fonte de diversificação cariotípica,

contribuindo sobremaneira para o isolamento genético de populações (Molina e

Galetti, 2002). De forma destacada, as inversões pericêntricas têm sido

reportadas como um dos mais freqüentes mecanismos associados à

diversificação e evolução cariotípica.

Tais inversões podem ser facilmente estimadas pela observação da

mudança no número total de braços cromossômicos (NF). Os Perciformes - por

exibirem um cariótipo basal composto exclusivamente por cromossomos

acrocêntricos - constitui um dos melhores grupos para estudo e observação de

tais inversões, constituindo-se assim como um excelente grupo-modelo para

estudos carioevolutivos.

Do ponto de vista evolutivo, a presença de cromossomos sexuais

desempenha papel relevante em relação ao cariótipo dos peixes, sobretudo


8

marinhos. Rearranjos envolvendo cromossomos sexuais funcionam como um

via de atuação efetiva na formação de barreiras pós-zigóticas, por prevenir ou

afetar negativamente o pareamento mitótico e segregação dos híbridos

(Molina, 2006). As próprias modificações estão associadas principalmente ao

grande montante de partições nos ambientes continentais, ocasionados por um

grande número de obstáculos ao fluxo gênico (Moreira-Filho e Bertollo, 1991).

Técnicas mais resolutivas de análises estruturais dos cromossomos,

como a FISH (Fluorescent in situ Hibridization) são atualmente muito utilizadas

e vêm se mostrando eficientes ferramentas no estudo da evolução cariotípica

de peixes, principalmente devido ao mapeamento de seqüências ribossomais

5S (Martins e Galetti, 2001; Molina, 2005). Com o advento de seqüenciamento

em grande escala de genomas eucarióticos, uma ponte conectando a

genômica e a citogenética emergiu, trazendo consigo efetivo enfoque às

análises comparativas (Eichler e Sankoff, 2003). Análises cariotípicas

envolvendo FISH na localização de seqüências do gene 5S têm ajudado na

elucidação de mecanismos tais como a presença de inversões pericêntricas

(Martins e Galetti, 2001), além da identificação de sua relação com a formação

e possível distribuição de regiões heterocromáticas (Affonso e Galetti, 2005).

Dentro desta visão, as análises citogenéticas clássicas e moleculares

permitem um acesso valioso ao patrimônio genético auxiliando na

compreensão da história evolutiva de um grupo taxonômico, bem como da sua

distribuição biogeográfica, caracterizando-se como ferramentas apropriadas

para os estudos relacionados à filogenia e evolução cromossômica (Bertollo et

al., 2000; Gorshkova et al.; 2002; Rieseberg, 2001).

2. OBJETIVOS

Diante dos dados apresentados, o presente trabalho tem por objetivo:

1. Caracterizar citogenéticamente através de coloração convencional, Ag-

RONs e bandamento C, as espécies de peixes das famílias Apogonidae

(Apogon americanus) e marinhas/estuarinas da família Ariidae -

Cathrops spixii e Sciades sp. (Siluriformes), além de Paurachenipterus

galeatus (Siluriformes, Auchenipteridae);


9

2. Realizar o mapeamento estrutural através de técnicas moleculares, pelo

uso de enzimas de restrição (ER), FISH com sondas 5S e 18S, CMA3,

DAPI, além de bandas de replicação utilizando 5’BrdU destas espécies;

3. Inferir possíveis tendências evolutivas nestas espécies e, em seus

respectivos grupos (Apogonidae e Siluriformes);

4. Comparar citogenéticamente diferentes amostras geográficas de

Apogon americanus com vistas a identificar possíveis diversificações

cariotípicas interespecíficas ao longo de populações litorâneas do Rio

Grande do Norte e Bahia;

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. MATERIAL

Análises citogenéticas foram realizadas em espécies marinhas das

famílias Apogonidae e Ariidae, e em uma espécie dulcícola da família

Auchenipteridae. 14 espécimes de Apogon americanus (Apogonidae),

Perciformes coletados no litoral da Bahia em Salvador (12º58’S, 38º31’W) (2

machos, 4 fêmeas e 8 imaturos) e 30 espécimes coletados no litoral do Rio

Grande do Norte (RN) (05º47'S, 35º12'W), na cidade de Natal e em Búzios,

Município de Nísia Floresta. Foram coletados seis espécimes de Cathorops

spixii Agassis, 1829 (imaturos) e quatro de Sciades sp. Bloch, 1794 (imaturos)

(Siluriformes, Ariidae), na praia de Ponta Negra, no litoral do Rio Grande do

Norte (RN); e 19 espécimes (2 machos, 9 fêmeas e 8 juvenis) de

Parauchenipterus galeatus Linnaeus, 1766 (Siluriformes, Auchenipteridae) no

rio Pium, RN.


10

Figura 1. Mapa do Brasil evidenciando os pontos de coleta no litoral do Rio

Grande do Norte e a Bahia.

Os espécimes foram coletados por meio de anzóis, redes de arrasto e

puçás. Após a captura, os exemplares foram transferidos ao Laboratório de

Genética de Recursos Marinhos, da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, sendo mantidos em tanques e aquários aerados até que se procedesse

à realização das preparações cromossômicas. A identificação taxonômica das

espécies foi realizada pelos Drs. José Garcia Jr. (UFRN) e Ricardo Rosa -

UFPB).


11

3.2. MÉTODOS

3.2.1. PREPARAÇÕES CROMOSSÔMICAS

3.2.1.1 TÉCNICAS DE ESTIMULAÇÃO MITÓTICA

A suspensão de levedura tem sido utilizada rotineiramente na

estimulação mitótica em peixes. No laboratório de Genética de Recursos

Marinhos têm sido caracterizadas outras possíveis alternativas para

estimulação, como é o caso dos fármacos Munolan® (de acordo com Molina,

2001) e Aminovac®, que têm como produtos ativos, lisados bacterianos e

fúngicos. A solução com antígenos (fármacos) foram diluídas em água

destilada na concentração de 0,5ml/5ml sendo a solução inoculada na região

intraperitoneal e muscular, entre a linha lateral e a nadadeira dorsal do

organismo, numa proporção de 1ml para cada 100g de peso corporal do

animal. Em seguida, os animais foram mantidos em um aquário aerado por 24

a 48 horas, até que fossem sacrificados e dado início aos procedimentos de

obtenção de cromossomos mitóticos.

3.2.2. OBTENÇÃO DE CROMOSSOMOS MITÓTICOS

Para a obtenção de cromossomos mitóticos, foram retirados os rins

anterior e posterior, além de fragmentos do baço. Os tecidos foram colocados

em 9 ml de meio de cultura RPMI 1640 sendo dissociados através de

aspirações repetidas com o uso de seringas de vidros de 5 ou 10 ml. Uma vez

dissociado o material foi transferido para tubos Falcon, completando o volume

até 10 ml de meio RPMI. Um total de cinco gotas de colchicina 0,025% foi

adicionado, deixando-se agir por 30 minutos em temperatura ambiente. O

material foi então centrifugado por 10 minutos a 900rpm. O sobrenadante foi

removido e 9ml de solução hipotônica de KCl (0,075M) foi adicionada, agindo

por 30 minutos em temperatura ambiente. Decorrido este tempo, centrifugou-se

por 10 minutos. Uma solução fixadora contendo metanol e ácido acético (3:1)

foi usada para fixar o material por três vezes, em ciclos sucessivos de

centrifugação por 10 minutos cada. Ao término, o material foi acondicionado em

tubos plásticos de 1,5 ml, com tampa e mantidos em freezer.


12

3.2.3. PREPARAÇÃO DE LÂMINAS

A análise do material foi desenvolvida a partir de lâminas nas quais

foram gotejadas de três a quatro gotas da suspensão celular sobre um filme

d’água aquecido à 60ºC, escorridas, secas ao ar e coradas em seguida com

solução de Giemsa 5%, diluído em tampão fosfato pH 6,8.

3.2.4. ANÁLISE CROMOSSÔMICA E MONTAGEM DO CARIÓTIPO

As lâminas foram analisadas através de microscópio ótico, sob aumento

de 1.000 X. Uma média de 30 metáfases foi amostrada para cada exemplar,

visando o estabelecimento do valor modal para cada espécie e definição dos

padrões estruturais dos cromossomos. As melhores metáfases de cada

espécie foram fotografadas em microscópio Olympus BX42, com sistema digital

de alta resolução DP72. Os cromossomos foram organizados por tamanho em

ordem decrescente e classificados em grupos, quanto à posição do

centrômero, em metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntricos

(st) e acrocêntricos (a), de acordo com nomenclatura desenvolvida por Levan

et al. (1964).

3.2.5. TÉCNICAS DE BANDAMENTOS CROMOSSÔMICOS

3.2.5.1. Detecção das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) As RONs foram caracterizadas utilizando-se impregnação pela prata

idealizada por Howell e Black (1980) (com algumas modificações), preparando-

se previamente uma solução gelatinosa contendo 1g de gelatina acrescida de

50 ml de água e 0,5 ml de ácido fórmico. Sobre a lâmina adicionou-se de 6 a 9

gotas de solução gelatinosa, nitrato de prata (AgNO3) 50% e por fim, água. A

solução misturada foi coberta com lamínula, sendo colocada numa estufa a

60ºC até que uma coloração âmbar pudesse ser vista.

3.2.5.2. Detecção de heterocromatina constitutiva (Banda-C)

A observação de regiões de heterocromatina constitutiva foi realizada

utilizando-se o método desenvolvido por Summer (1972) com pequenas

alterações, visando uma melhor qualidade das preparações. A lâmina foi

imersa em HCl 0,2 N à temperatura ambiente, por 30 minutos, lavada em água


13

destilada e seca ao ar. Foi então mantida em solução de 2xSSC à 60ºC por 15

minutos, lavada e seca. Em seguida, incubada à 42ºC em uma solução

saturada de Ba(OH)2.8H2O à 5% (em períodos variáveis para cada espécime)

lavada rapidamente em HCl 0,2N e mantidas em solução de 2xSSC à 60ºC por

cerca 1 hora. Após esta fase, as lâminas foram coradas com Giemsa 5% por

10 minutos e visualizadas.

3.2.6. Técnicas de coloração com fluorocromos base-específicos

Um total de 80µl de solução de distamicina (DA) (0,1mg/ml) foi

depositado em cada lâmina, coberta com a lamínula por 15 min, no escuro.

Uma série de lavagens utilizando tampão Mcllvaine foi realizada.

Posteriormente, a lâmina recém preparada, foi mergulhada em solução de

DAPI (0,3mg/ml), por 20 minutos, no escuro. Após lavagem com tampão

Mcllvaine e fortes jatos de água, foi recoberta com 80µl de Cromomicina,

coberta com lamínula e mantida por 30 minutos em escuridão. Após a

montagem da lâmina com sacarose saturada e duas gotas de anti-fading

VectaShield, o material foi preservado em temperatura de 4ºC por 15 dias até a

sua análise em microscópio de epifluorescência com filtros apropriados.

3.2.7. Bandamentos com enzimas de restrição (ERs) As enzimas de restrição EcoRI foram diluídas em buffer EcoRI, de

acordo com o fabricante, para obtenção de uma concentração de 10 U/µL.

Cerca de 25 µL desta solução foi adicionada a uma lâmina previamente

gotejada, cobrindo com uma lamínula e deixando agir por período de 10h em

estufa a 37ºC. Decorrido este tempo as lâminas foram lavadas em água

destilada e coradas por 10 min com Giemsa diluído a 5% em tampão fosfato

pH 6,8, deixando-se secar ao ar.

3.2.8. Método de incorporação do análogo de base 5’BrdU

A incorporação de 5’BrdU para obtenção do padrão de bandas de

replicação foi realizadas segundo metodologia desenvolvida por Giles et al.

(1988) com modificações. O análogo 5’BrdU (100mg de 5’BrdU em 20ml de

solução de NaCl a 0,9%) foi injetado via intraperitoneal, na proporção de


14

1ml/100g de peso corporal do peixe, agindo por 6 horas. Após, a preparação

cromossômica foi realizada seguindo os mesmos passos descritos no subitem

3.2.2. As lâminas gotejadas com este material foram lavadas em solução de

2xSSC e imersas em uma solução de Hoescht 6024 (Sigma) (1mg de Hoescht

em 1ml de metanol e 100ml de 0,5xSSC) por 30 minutos em escuridão, sendo

lavadas em água destilada e secas ao ar. A lâmina foi coberta com um filme

de 2xSSC, sendo exposta à luz UV por 45 minutos sob uma distância de 10cm,

sendo em seguida, lavada em água destilada e seca ao ar. As lâminas foram

coradas com Giemsa 5% diluído em tampão fosfato.

3.2.9. Hibridação in situ fluorescente (FISH)

A aplicação da técnica de hibridação in situ fluorescente foi realizada

com base no procedimento adotado por Pinkel et al. (1986), com modificações.

As sondas 5S e 18S DNAr foram marcadas com biotina-11-dATP, através de

“nick translation”, utilizando o kit BionicKTM Lablling System (Gibco.BRL),

seguindo especificações do fabricante.


15

CAPÍTULO 1

Análises citogenéticas em Apogon americanus (Perciformes:

Apogonidae): Evidências de marcante redução cromossômica

Araújo, W.C. e Molina, W.F.

Resumo

Peixes recifais da Ordem Perciformes constituem um dos grupos de grande interesse quanto às suas características genéticas e citogenéticas, em função do seu padrão evolutivo dinâmico e nem sempre bem compreendido. Neste grupo existem exemplos de grande conservação cromossômica, em sua maioria, e de grupos que apresentam uma evolução cariotípica mais dinâmica. Um cariótipo com 2n=48 cromossomos acrocêntricos é considerado basal para este grupo, sendo considerados derivados cariótipos com outras fórmulas. Algumas de suas famílias apresentam maior diversificação cariotípica, como Apogonidae, para a qual não se dispunha de informações citogenéticas sobre qualquer representante no Atlântico Sul. Análises citogenéticas realizadas em Apogon americanus proveniente do litoral de Salvador-BA, Nordeste do Brasil. A espécie revelou um número diplóide modal de 2n=36 (12m+6sm+16st+2a; NF=66), com notável presença de pares de grandes cromossomos metacêntricos. Os sítios Ag-RONs estão localizados no braço curto do 9º par, em posição telomérica. Condição coincidente com os sinais de hibridação pelo FISH com sondas 18S. Os genes da subunidade 5S estão distribuídos em dois pares cromossômicos em condição não sintênica a subunidade ribossomal 45S. A heterocromatina está reduzida e localizada na posição pericentromérica na maioria dos pares cromossômicos. O padrão de replicação inicial revelou bandas longitudinais, com replicação tardia dos blocos heterocromáticos. Os dados obtidos sugerem uma evolução cariotípica mediada por fusões Robertsonianas e inversões pericêntricas. Apesar dos rearranjos estruturais no cariótipo, características composicionais e da estrutura cromossômica refletem características simplesiomórficas com outros clados Perciformes. �

Palavras-chave: rearranjos Robertsonianos, bandas de replicação, Atlântico Ocidental. 1. Introdução

Os representantes da família Apogonidae são encontrados em regiões

costeiras associados a recifes de corais, apresentando características

conspícuas, como territorialidade e hábitos noturnos, representando parcela

importante da ictiofauna recifal (Mabuchi et al., 2006). No entanto, o status


16

taxonômico deste grupo permanece confuso. Destaca-se na famíla o gênero

Apogon cujas espécies são as mais numerosas e dominantes nos recifes de

corais, compreendendo ao menos 174 espécies de distribuição mundial. Tais

peixes têm hábitos noturnos, ocupando o lugar de predadores e alimentando-

se de plâncton, como pequenos crustáceos, ovos e larvas de peixes. Questões

acerca da posição taxonômica de Apogon e de outros grupos da família ainda

precisam ser esclarecidas. Várias espécies são crípticas, além de haver

divisões em complexos morfológicos, o que dificulta o posicionamento

taxonômico e filogenético deste grupo. Greenfield (2001) caracterizou para o

Indo-Pacífico dois complexos de espécies Apogon “erythrinus” e A. “coccineus”.

Dentro de Apogonidae, a idade mínima deste gênero data do isolamento do

Mediterrâneo, no Oligoceno e Mioceno (Mabuchi et al., 2006).

Na região Nordeste do Brasil, tem sido evidenciada a presença de cinco

espécies dessa família: Apogon americanus, A. pseudomaculatus, A.

quadrisquamatus, A. puncticulatus e Phaeoptyx pigmentaria (Garcia, 2006), a

maioria delas sem descrição cariotípica.

Entretanto, apesar da existência de informações citogenéticas básicas

para representantes de Apogonidae não se dispõem de dados cariotípicos de

seus representantes no Atlântico Ocidental.

Apogonidae se destaca por apresentar números cromossômicos

extremamente reduzidos para um representante dos Perciformes, portando

ainda, de acordo com as espécies já analisadas, grande diversificação

cariotípica também em relação fórmula cariotípica. Esta redução do número

diplóide se reflete em valores tão baixos quanto 2n=34, observado em Apogon

maculatus (Rivlin et al., 1988). Apesar do reduzido número cromossômico,

sugerindo uma alta incidência de fusões cêntricas são encontrados números

fundamentais (NF) elevados, como evidenciado em Apogon nubilis (2n=46,

NF=92), o que indica a participação de outros rearranjos cromossômicos, como

inversões pericêntricas, envolvidos na diversificação cromossômica deste

grupo.

Estudos citogenéticos utilizando espécies deste grupo têm auxiliado na

elucidação do posicionamento taxonômico dentro desta família. De acordo com

a filogenia clássica os gêneros Apogon e Phaeoptyx parecem estar próximos,

sendo Phaeoptyx considerado o mais basal entre eles. Através de análises


17

citogenéticas desenvolvidas em A. pseudomaculatus, A. nubilus e P.

pigmentaria aponta Phaeoptyx como mais derivado, sendo A. pseudomaculatus

mais proximamente relacionado a este do que a A. nubilus (Rivlin e Dale,

1986). Devido à sua diversidade cariotípica, íntima relação com os recifes de

corais e ecologia, Apogonidae caracteriza-se como um modelo adequado ao

estudo de tendências carioevolutivas na Ordem Perciformes

2. Objetivos

Diante das peculiaridades da família Apogonidae e escassez de

informações citogenéticas neste grupo, para espécies Atlânticas, o presente

trabalho teve como objetivo caracterizar citogeneticamente a espécie Apogon

americanus, presente no litoral do Rio Grande do Norte, visando ampliar o

conhecimento sobre a diversidade cariotípica do grupo e possibilitar inferências

acerca de seus aspectos carioevolutivos. Para tanto foram utilizados, métodos

resolutivos de análise estrutural dos cromossomos, como Ag-RONs; banda C;

digestão pelas enzimas de restrição AluI, EcoRI; bandas de replicação (RBG-

banding) e hibridização in situ com sondas fluorescentes das subunidades

ribossomais 5S e 18S.

3. Material e Métodos

Um total de 14 espécimes de Apogon americanus foram coletados no

litoral de Salvador (BA) (12º58’S, 38º31’W) (2 machos, 4 fêmeas e 8 imaturos),

juntamente com 30 espécimes coletados na praia de Búzios (05º47'S,

35º12'W), município de Nísia Floresta, Rio Grande do Norte (RN), utilizando

puçás e tarrafas (Fig. 1). Após a captura, os exemplares foram acondicionados

em sacos plásticos com água e conduzidos ao Laboratório de Genética de

Recursos Marinhos, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, sendo

mantidos em tanques ou aquários aerados até que se procedesse à realização

de preparações cromossômicas.


18

Figura 1. Exemplar de Apogon americanus. Barra = 1cm.

Os exemplares foram submetidos à estimulação mitótica de acordo com

os métodos desenvolvidos por Lee e Elder (1980) e Molina (2002), por um

período de 24 a 48 horas. As preparações cromossômicas seguiram a

metodologia preconizada por Gold et al. (1990). O material foi corado com

Giemsa 5% diluído em tampão fosfato pH 6,8. Análises citogenéticas foram

desenvolvidas com o uso de microscopia ótica com aumento de 1.000 X. Cerca

de trinta metáfases foram analisadas para cada exemplar. As melhores

metáfases foram fotografadas em microscópio Olympus BX42, com sistema

digital de alta resolução e utilizadas na definição do cariótipo.

Os cromossomos foram classificados em grupos, e organizados em

ordem decrescente de tamanho, de acordo a posição do centrômero, segundo

a nomenclatura desenvolvida por Levan et al. (1964). As RONs foram

identificadas utilizando-se impregnação pela prata conforme preconizada por

Howell e Black (1980). A observação de regiões de heterocromatina

constitutiva foi realizada utilizando-se o método desenvolvido por Summer

(1972) com pequenas alterações, visando uma melhor qualidade das

preparações. A qualificação das regiões heterocromáticas foi obtida pela

coloração com fluorocromos base-específicos DAPI e CMA3 (Schweizer, 1980).

Como contracorante foi utilizada uma solução de distamicina (DA) (0,1mg/ml)


19

em cada lâmina, cobrindo com a lamínula por 15 min. Uma série de lavagens

utilizando tampão Mcllvaine foi realizada. Posteriormente, a lâmina recém

preparada, foi mergulhada em solução de DAPI (0,3mg/ml), por 20 minutos, no

escuro. Após lavagem nova coloração com Cromomicina por 30 minutos. Após

a montagem da lâmina o material foi preservado em temperatura de 4ºC por 15

dias até a sua análise em microscópio de epifluorescência com filtros

apropriados.

Padrões de digestão dos cromossomos de A. americanus pela enzima

de restrição, foram definidos a partir de testes de tempo, temperatura e

concentração. Um total de 10u/µl da enzima EcoRI, diluída em um tampão

apropriado (EcoRI) de acordo com o fabricante e foi depositado sobre lâmina

previamente preparada e coberta com lamínula. Após a incubação por 10 h em

estufa a 37ºC, lavadas em água destilada e coradas com Giemsa 5% diluído

em tampão fosfato pH 6,8, e secas ao ar.

4. Resultados

Análises citogenéticas realizadas nos espécimes de Apogon americanus

coletados no litoral do Rio Grande do Norte e Bahia permitiram estabelecer um

número diplóide modal de 2n=36. Não foram encontradas diferenciações

significativas com relação à macroestrutura cariotípica ou números

cromossômicos entre os indivíduos. A fórmula cariotípica da espécie é

representada por 12m+6sm+16st+2a, NF=66 (Fig. 2). Através da impregnação

por nitrato de prata, o 9º par (sm) foi identificado como portador da RON.

Foram analisados espécimes de ambos os sexos, não sendo verificado

heteromorfismo cromossômico sexual.

A presença de cístrons ribossomais Ag-RON sobre o 9º par, em posição

telomérica do braço curto, foi confirmada através da FISH utilizando sondas de

rDNA 18S. Evidenciou-se cístrons rDNA 5S presentes sobre dois pares

cromossômicos, em condição não sintênica com os sítios 45S presentes no par

organizador nucleolar. Através de banda C, verificou-se pequenos blocos

heterocromáticos em posição pericentromérica e telomérica de alguns dos

pares cromossômicos (Fig. 3).


20

O padrão de bandas de replicação obtido por incorporação do análogo

de base 5BrdU, no início da fase S, evidenciou a presença de grandes blocos

de replicação tardia nas regiões pericentroméricas dos cromossomos e em

regiões intersticiais nos braços longos dos pares 1º, 2º e 4º (Fig. 4).

A digestão com enzimas de restrição (ER) permitiu identificar bandas

discerníveis pelo uso da EcoRI. O padrão de bandamento obtido foi muito

semelhante àquele evidenciado pelas bandas de replicação (Fig. 5).

Figura 2. Cariótipo de Apogon americanus corado com Giemsa. Barra = 5µ.

Figura 3. Banda C de A. americanus. Barra = 5µ.


21

Figura 4. Cariótipo de A. americanus através de RBG-banding. Barra = 5µ.

Figura 5. Cariótipo de A. americanus através de ER EcoRI. Barra = 5µ.


22

Figura 6. Metáfases de A. americanus após coloração com CMA3 (a); DAPI (b).

Barra = 5µ.

Figura 7. Hibridação fluorescente in situ em A. americanus com sondas: rDNA

18S (a); rDNA 5S (b). Barra = 5µ.

a b


23

Figura 8. Idiogramas de A. americanus: RBG-banding (a); banda C (b). Barra =

5µ.


24

Tabela 1. Dados citogenéticos disponíveis para a família Apogonidae.

Espécie

2n

NF

Fórmula Cariotípica

Par/RONs

Referências

Apogon americanus 36 70 12m+6sm+16st+2a 9 Presente estudo

Apogon binotatus 36 50 14m-sm+22st-a - Rivlin et al., 1987

35 59 14m-sm+21st-a - Rivlin et al., 1987


Apogon doederleini 46 50 4sm+42st-a - Ojima e Kojima, 1985

Apogon endekataenia 46 46 46a - Rishi, 1973

Apogon maculatus 34 61 27m-sm+7st-a - Rivlin et al., 1988

Apogon moluccensis 46 46 46a - Rishi, 1973

Apogon notatus 46 52 52m+4sm+40st-a - Ojima e Kojima, 1985

46 53 2m+5sm+39st-a - Ojima e Kojima, 1985

Apogon nubilis 46 92 2m+36sm+8st - Rivlin et al., 1986

Apogon orbicularis 46 50 4sm+42st-a - Ojima e Kojima, 1985

Apogon

pseudomaculatus

36 68 8m+22sm+2st+4a Rivlin et al., 1986


Apogon semilineatus 46 54 2m+6sm+38st-a - Ojima e Kojima, 1985

Phaeoptyx pigmentaria 38 74 6m+30sm+2a - Rivlin et al., 1986


25

5. Discussão

Entre as Ordens de peixes existentes, os Perciformes destacam-se por

agruparem exemplos tanto de grande conservação cromossômica (estase)

quanto de tendências marcantes de diversificação ao longo da história

evolutiva de alguns grupos (Molina, 2006). Uma maior diversidade cariotípica

tem sido verificada para representantes dulcícolas em função da maior

quantidade de restrições ao fluxo gênico neste ambiente em relação ao

marinho (Moreira-Filho e Bertollo, 1991; Molina e Galetti, 2004a; Molina e

Galetti, 2004b).

Não foram encontradas diferenciações significativas com relação à

macroestrutura cariotípica ou números cromossômicos, entre as populações do

litoral do Rio Grande do Norte e Bahia da espécie, apesar de separadas por

cerca de 1.000km. Estes resultados podem indicar a existência de fluxo gênico

efetivo capaz de manter coesão genética à espécie. Contudo, populações de

outros grupos de Perciformes no litoral brasileiro, mesmo espaçadas por

grandes distâncias, em muitos casos não tem evidenciado diferenciações

cromossômicas (Brum e Galetti, 1997). Um exemplo disso ocorre em

Abudefduf saxatilis (Pomacentridae), espécie de ampla distribuição geográfica,

que se distribue no litoral brasileiro do Sudeste até o Nordeste do Brasil, além

das regiões de ilhas oceânicas, como o Arquipélago de São Pedro e São Paulo

(ASPSP), Fernando de Noronha e Atol das Rocas (distantes 960 e 360 km do

continente). Embora análises morfométricas tenham revelado marcante

variação inter-populacional entre as regiões NE e SE, ASPSP e Atol das

Rocas, constituindo uma clina em relação aos seus elementos seriais (Molina,

2001 apud Molina, 2006), os cariótipos não exibem diferenciações discerníveis.

De forma geral, a ausência de barreiras ao fluxo gênico no ambiente

marinho permite que populações costeiras no Atlântico Ocidental mantenham-

se geneticamente coesas, contribuindo assim, para um menor grau de

polimorfismos cariotípicos em diferentes estoques (Molina, 2006).

Na família Apogonidae, 66% de todas as espécies analisadas até o

momento (N=12) tem valor diplóide 2n=46 (Tabela 1), o que sugere tal valor

como basal para a família. Algumas espécies como A. endekataenia e A.

moluccensis (Rishi, 1973), por exemplo, possuem um cariótipo com grande


26

número de cromossomos acrocêntricos, similar a condição basal encontrada

nos Perciformes (2n=48, NF=48). No entanto, a maior parte dos dados

disponíveis apontam uma grande diversidade cariotípica na evolução do grupo,

tanto em relação ao número diplóide quanto às fórmulas cromossômicas

(refletida em números fundamentais elevados, 46<NF<92), o que sugere que

os mecanismos envolvidos na diversificação cariotípica deste grupo são

diversos, principalmente inversões pericêntricas e rearranjos Robertsonianos.

A. americanus apresenta um número diplóide modal de 2n=36 (NF=70),

cuja fórmula cariotípica é 12m+6sm+16st+2a. Esse padrão cariotípico é

semelhante ao encontrado para outras espécies de Apogonidae, dos gêneros

Phaeoptyx, Apogon maculatus e A. pseudomaculatus, distribuídos no Atlântico,

no litoral da Flórida (E.U.A.) (Rivlin et al.,1986; Rivlin et al., 1988). Apesar de

relatos de cromossomos sexuais para a família, não foi evidenciada a presença

de heteromorfismo cromossômico sexual no cariótipo de A. americanus pelas

técnicas utilizadas.

A presença nesta família de números diplóides menores que 48, grandes

cromossomos metacêntricos e, entre algumas espécies, a presença de

números diplóides diferentes sem que o NF se modifique sugere a ocorrência

de fusões cêntricas que, aliadas às inversões pericêntricas, tiveram papel

importante no processo de diversificação cariotípica da família. As inversões

pericêntricas tem sido consideradas o mecanismo mais frequente de mudanças

cariotípicas em Perciformes (Molina e Galetti, 2004b).

Menos freqüentes são as modificações cromossômicas derivadas de de

rearranjos Robertsonianos em Perciformes. Dentro da subfamília Chrominae

(Pomacentridae) tais rearranjos são extensivos e, constituem um dos principais

mecanismos de mudanças cromossômicas no processo de diversificação das

espécies (Molina e Galetti, 2002). Em Labridae, Xyrichtys dea e X. pavo

apresentam 2n=44a, enquanto uma marcante redução no número diplóide

(2n=22), em X. tuvistii é creditada a ocorrência de eventos do tipo fusão

cêntrica (Ueno e Takai, 2000 apud Molina, 2006).

Em A. americanus identificou-se a presença de quatro grandes

cromossomos metacêntricos e dois pares metacêntricos menores, aliada a uma

fórmula cromossômica com marcante redução no valor diplóide (2n=36),

sugere também nesta espécie a ocorrência de fusões cêntricas. Caso este


27

mecanismo tenha de fato atuado na modelagem do atual cariótipo da espécie,

os seis eventos de fusão cêntrica, que podem ser explicados a partir de um

cariótipo basal com 48 elementos acrocêntricos, são referendados pela

presença de quatro pares de metacêntricos grandes e dois menores.

Associado às fusões, o elevado número fundamental (NF=70) observado é

indicativo de que inversões pericêntricas também foram importantes fontes de

diferenciação cromossômica para a espécie.

Embora a presença de rearranjos Robertsonianos em alguns grupos

como Pomacentridae e Salmonidae ocorram em algumas espécies ainda em

estado transitório polimórfico, isto não foi observado em A. americanus.

Possivelmente, características históricas ou biológicas, como pequena

capacidade dispersiva e populações de tamanho reduzido, associadas a uma

condição seletivamente neutra ou vantajosa, tenham se propiciado à fixação

dos rearranjos Robertsonianos observados na espécie. Condições intrínsecas

do cariótipo, decorrentes de suas características estruturais (como o aumento

no NF) poderia aumentar a taxa de recombinação gerando uma condição

vantajosa para seus portadores. Quanto às características estruturais dos

cromossomos, A. americanus apresenta um baixo conteúdo de

heterocromatina constitutiva com pequenos blocos heterocromáticos

distribuídos nas regiões teloméricas e pericentroméricas dos cromossomos. Os

grandes cromossomos metacêntricos presentes em A. americanus (com o

maior deles correspondendo a cerca de quase 10% do complemento total),

apesar do tamanho, apresentam pequeno conteúdo heterocromático. Tal

padrão é o comum para os peixes da Ordem Perciformes.

O tratamento com a endonuclease de restrição EcoRI, produziu um

padrão de bandamento semelhante ao de bandas de replicação, em quase

todos os cromossomos do complemento. Alguns blocos heterocromáticos

intersticiais foram observados, principalmente nos pares 1, 2 e 3. Tais blocos

podem ser explicados por inversões paracêntricas, reorganizando blocos

heterocromáticos originalmente localizados em posições pericentroméricas. Um

grau de heterogeneidade heterocromatínica pode ser inferida a partir de

respostas dos blocos heterocromáticos à digestão pela EcoRI. É possível que a

realocação de segmentos heterocromáticos em posição ectópicas ao


28

centrômero - durante o processo carioevolutivo da espécie - tenha propiciado

as condições para a diferenciação qualitativa dos segmentos heterocromáticos.

A existência desta heterogeneidade é também evidenciada através dos

padrões de bandamento de replicação utilizando o análogo de base 5’ BrdU

(RGB). As bandas de replicação obtidas revelam similaridades com a digestão

com a EcoRI. Este análogo de bases foi incorporado durante o início da fase S

do ciclo celular. As regiões replicadas tardiamente são as mais pálidas e

coincidem com aquelas regiões heterocromáticas observadas através de

bandamento C. Tais padrões de replicação tardia são observados também em

regiões intersticiais dos pares 1, 2 e 3, bem como, no braço curto do par

organizador nucleolar, coincidindo com os sítios Ag-RONs.

O uso de RONs tem ajudado a formular hipóteses filogenéticas em

alguns grupos, constituindo um importante marcador citotaxonômico em

citogenética comparativa (Cross et al., 2006). Apesar do cariótipo rico em

rearranjos estruturais, se evidencia em A. americanus uma condição

conservativa quanto ao número de cístrons ribossomais. As RONs identificadas

tanto pela impregnação pela prata, como pelo FISH, estão localizadas sobre

um único par portador de RONs, em posição telomérica, nos braços curtos do

par 9, submetacêntrico.

FISH com sondas de 5S DNAr têm sido úteis na caracterização de

diversos grupos de peixes. O presente estudo, revelou dois pares

cromossômicos portando estas seqüências, localizadas em condição não

sintênica ao par 9 (portador dos cístrons Ag-RONs). A não sintenia entre as

diferentes subunidades ribossomais tem sido observada em vários grupos

Perciformes, reforçando a hipótese de evolução independente entre estas

famílias gênicas (Martins e Galetti, 2001).

Os resultados obtidos sugerem a ocorrência de intensas mudanças

cromossômicas no cariótipo de A. americanus. Fatores biogeográficos,

biológicos e próprios do cariótipo basal desta família podem estar envolvidos

na fixação destas divergências. Outros trabalhos envolvendo um maior número

de espécies dessa família, com distribuição pelo Atlântico Ocidental, serão

necessários para melhor entendimento do cenário de diversificação cariotípica

experimentando por este peculiar grupo de peixes.


29

CAPÍTULO 2

Análises Cromossômicas em Espécies da Família Ariidae

(Teleostei, Siluriformes) do litoral NE brasileiro

Araújo, W.C. e Molina, W.F.

Resumo Os Siluriformes constituem um dos mais conspícuos grupos da ictiofauna neotropical. Pelo menos 1.727 espécies ocorrem exclusivamente nas Américas. Porém, ainda há muitas questões acerca da classificação neste grupo, e restam desacordos no que diz respeito às relações entre algumas famílias, principalmente devido ao elevado número de espécies, sua ampla distribuição geográfica e semelhança morfológica existente entre elas. Análises citogenéticas foram realizadas utilizando espécies do Nordeste brasileiro da família Ariidae com o intuito de avaliar a diversidade cariotípica apresentada e, fazer inferências acerca da história evolutiva deste clado. No cariótipo de Cathorops spixii o número diplóide modal foi 2n=56, 12m+16sm+24st+4a, NF=108, enquanto que Sciades sp. exibiu 2n=56, com a fórmula cariotípica composta por 14m+10sm+22st+10a e NF=108. Os dados obtidos confirmam o marcante conservadorismo numérico exibido pela família. Os resultados aqui encontrados contribuem com o estabelecimento de padrões citotaxonômicos para a família, bem como para um melhor entendimento dos processos e padrões de diferenciação e evolução cromossômica dos Siluriformes marinhos. Palavras-chave: Cathorops spixii, Sciades cf. emphysetus, inversões

pericêntricas, citogenética de peixes.

1. Introdução Aproximadamente um em cada vinte vertebrados é um bagre (Nelson,

1994), como são popularmente conhecidos os Siluriformes, que estão entre os

grupos da fauna ictiológica neotropical mais representativos, estando também

distribuídos nas demais regiões biogeográficas. Compreendem 35 famílias, 446

gêneros, 2.867 espécies sendo 2.740 de dulcícolas, com cerca de 1.727

ocorrendo exclusivamente nas Américas (Nelson, 2006). Formam um grupo de

peixes dominantes nas águas doces de todo o mundo, com uma grande

irradiação neste ambiente. Seu sucesso evolutivo remonta o Cretáceo (~63

M.A) tendo sido encontrados em todos os continentes (com exceção da

Austrália), inclusive na Antártica, o que sugere uma distribuição cosmopolita de


30

longa data (Grande e DePinna, 1998; Lundberg, 1993; Cione e Prasad, 2002;

de la Pena e Soler-Gijón, 1996).

Apesar disso, apenas uma família (Ariidae) é estritamente marinha

dentro deste grupo (Marceniuk e Menezes, 2007). Os Ariidae apresentam uma

morfologia externa muito semelhante entre si, tornando difícil sua classificação

e diagnose. Os caracteres mais importantes do ponto de vista sistemático,

geralmente se relacionam com a disposição das placas de dentes do vômer e

placas acessórias (Marceniuk, 2003).

No Atlântico Ocidental os gêneros mais comumente são Arius, Aspistor,

Bagre, Genidens, Notarius, Potamarius e Cathorops. No litoral do Rio Grande

do Norte, são encontrados representantes principalmente ao longo da costa e

em regiões estuarinas. As espécies mais comuns nesta região são Arius

herzbergii, Aspistor luniscutis, Bagre bagre, Bagre marinus e Cathorops spixii

(Garcia, 2006).

Inúmeros trabalhos atestam a importância ecológica dos Ariidae, mas

ainda pouco conhecidas quanto aos seus aspectos genéticos e citogenéticos

(Sczepanski, 2008). As relações entre os táxons que compõem os Ariidae têm

advindo de análises morfológicas, distribuição geográfica, das espécies, e em

menor grau avaliando seus aspectos moleculares. Não obstante, a monofilia da

família parece ser bem suportada por ambas as abordagens (Sullivan et al.,

2006; Marceniuk e Menezes, 2007; Betancur-R, 2007).

O uso de estudos citogenéticos para auxiliar no entendimento das

relações entre estes grupos tem sido extensivamente realizados em famílias de

água doce (ver Artoni et al., 2001; Alves et al., 2006; Garcia e Moreira-Filho,

2005). No entanto, estudos cariotípicos em espécies marinhas de Siluriformes,

incluindo Ariidae são escassos (Sczepanski, 2008), sobretudo para a região NE

do Brasil. No Brasil se concentram na costa Sudeste e Sul, necessitando de um

número maior de dados para possibilitar o conhecimento sobre a estrutura

cariotípica, auxiliar na solução de questões taxonômicas, verificar a existência

e compreender sistemas de diferenciação sexual, permitindo assim e

vislumbrar sua história evolutiva e gerar informações úteis na conservação das

populações destes peixes.

Esta Ordem, juntamente com Characiformes e Cypriniformes pertencem

aos Ostariophysi, compartilhando especialmente o aparelho de Weber. A


31

condição diplóide dentre os Ostariophysi varia de 2n=50 a 98, com o conteúdo

de DNA variando de 27-51% daqueles encontrados para mamíferos e,

demonstrando que os membros desta Subordem enfrentaram extensos

rearranjos cromossômicos bem como incremento nos seus conteúdos de DNA

causados por duplicação de segmentos cromossômicos (Muramoto et al.,

1968; Oliveira et al., 1988). Tais estudos indicam também que o cariótipo dos

Siluriformes é mais suscetível a inversões pericêntricas, além de rearranjos dos

tipos fissões e fusões cêntricas – embora, ao que parece, em menor escala –

resultando em mudanças nos números fundamentais quanto em variações dos

números diplóides (LeGrande, 1981).

O número diplóide 2n=56 (±2) tem sido evidenciado como ancestral para

a Ordem Siluriformes (Oliveira e Gosztonyi, 2000) (Tabela 1), juntamente com

NF de valores elevados (>80), dentro da família Ariidae.

2. Objetivos

Dados citogenéticos da família Ariidae para o litoral NE do Brasil são

escassos. O baixo conhecimento de seus aspectos citogenéticos dificulta ainda

o reconhecimento da diversidade de espécies e conhecimento de aspectos

evolutivos do grupo. Diante disso, o presente trabalho objetivou realizar

análises citogenéticas comparativas em duas espécies da costa do Rio Grande

do Norte, Cathorops spixii e Sciades cf. emphysetus avaliando a diversidade

cariotípica apresentada e, permitindo inferir acerca da história evolutiva deste

clado, utilizando técnicas de bandamento C, Ag-RONs, coloração com CMA3,

além do mapeamento de cístrons ribossomais 18S e 5S, utilizando a técnica de

FISH.

3. Material e Métodos

No presente estudo foram analisados seis exemplares de Cathorops

spixii Agassis, 1829 e quatro espécimes de Sciades cf. emphysetus Bloch,

1794 (Fig. 1), todos imaturos, na praia de Ponta Negra, no litoral do Rio Grande

do Norte (RN). Os exemplares foram submetidos à estimulação mitótica de


32

acordo com Lee e Elder (1980) e Molina (2001), com o intuito de aumentar a

taxa de divisão celular, provocada por meio de uma inoculação de lisados

fúngicos e bacterianos, visando um maior número de metáfases na suspensão

cromossômica. Cromossomos mitóticos foram obtidos através da técnica de

Gold et al. (1990). O material foi corado com Giemsa 5% diluído em tampão

fosfato pH 6,8. Análises citogenéticas utilizando microscópio ótico com

aumento de 1.000 X, estabeleceram o valor diplóide modal para as espécies a

partir da contagem de 30 metáfases para cada exemplar. As melhores


digital de alta resolução. Os cromossomos foram organizados por tamanho em

ordem decrescente e classificados em grupos de acordo com nomenclatura

desenvolvida por Levan et al. (1964), em metacêtricos, submetacêntricos,

subtelocêntricos e acrocêntricos.


33

Figura 1. Exemplares de Cathorops spixii (a); Sciades cf. emphysetus (b).

Barra = 5cm.

Os cístrons ribossomais foram caracterizadas utilizando-se impregnação

pela prata (Howell e Black, 1980) e FISH (fluorescent in situ hybridization) com

o uso de sondas 18SrDNA. As regiões heterocromáticas foram identificadas

pelo método desenvolvido por Summer (1972), com pequenas alterações.

Coloração pelo fluorocromo base-específico CMA3 seguiu o método

preconizado por Schweizer (1980).

a

b


34

4. Resultados As análises citogenéticas realizadas no cariótipo de Cathorops spixii

identificaram para a espécie um valor diplóide modal de 2n=56, com fórmula

cariotípica 14m+20sm+18st+4a, e NF=108. Sítios Ag-RONs estavam presentes

em posição telomérica no braço curto de dois pares cromossômicos. Para

Sciades cf. emphysetus foi estabelecido um número diplóide modal de 2n=56,

com a fórmula cariotípica composta por 14m+14sm+24st+4a e NF=108 (Fig. 2).

Também nesta espécie apresenta dois pares organizadores nucleolares, cujos

sítios estavam localizados, nos braços curtos, em posição telomérica (Fig. 3), o

que foi confirmado através de CMA3 (Fig. 4) e hibridação fluorescente in situ

com sondas 18S rDNA (Fig. 5). Em ambas as espécies não foi possível

determinar com precisão a posição destes pares.

Em C. spixii, blocos heterocromáticos estavam presentes nas regiões

centroméricas, pericentroméricas, bem como em posição telomérica de alguns

pares, alguns ocupando todo o braço curto de cromossomos, como observado

nos pares, submetacêntricos. Sciades cf. emphysetus apresentou um padrão

de bandamento C muito semelhante ao encontrado no cariótipo de C. spixii,

com a presença de marcações blocos heterocromáticos nas regiões

centroméricas e pericentroméricas, teloméricas. Também no cariótipo desta

espécie, foram evidenciados blocos ocupando toda a extensão dos braços

curtos de dois cromossomos submetacêntricos.


35

Figura 2. Cariótipo de Cathorops spixii (a); Sciades cf. emphysetus (b)

submetidos à coloração com Giemsa. Em destaque à direita, de

cima para baixo, os pares nucleolares submetidos ao FISH com

sonda 18S, coloração pela Cromomicina A3 e Ag-RONs. Barra =

5µ.

b

a


36

Figura 3. Metáfases de C. spixii (a) e de Sciades cf. emphysetus (b)

após tratamento com AgNO3. As setas indicam os cístrons

ribossômicos. Barra = 5µ.

Figura 4. Metáfases de C. spixii (a); Sciades cf. emphysetus (b) após

tratamento com CMA3. Barra = 5µ.

a b

a b


37

Figura 5. Hibridação fluorescente in situ com sondas 18S rDNA em C. spixii

(a); Sciades cf. emphysetus (b). Barra = 5µ.

b a


38

Tabela 1. Dados citogenéticos disponíveis para a família Ariidae.

Espécie

2n

NF

Fórmula Cariotípica

Local

Referências

Arius dussumieriy 54 84 12m+18sm+12st+12a Oceano Índico Rishi et al., 1983

Arius felis 54 80 26sm+28st Golfo do México LeGrande, 1980

Arius felis 54 102 16m+12sm+20st+6a Campeche, México Garcia-Molina e

Uribe-Alcocer,1988

Arius melanopus 52 104 16m+30sm+6st Golfo do México Ramirez, 1985

Arius nenga 54 108 16m+36sm+2st Mar Gopalpur, Orissa,

India

Choudhury, Prasad e

Das, 1993

Arius parkeri=

Aspistor luniscutis

56 88 16m+16sm+22st+2a Cananéia, SP, Brasil Gomes et al., 1994

Arius serratus 56 112 8m+24sm+24st Mar Gopalpur, Orissa,

India

Choudhury, Prasad e

Das, 1993

Aspistor luniscutis 56 112 14m+22sm+20st Ilha do Mel; Baía de

Guaratuba, PR

Sczepanski, 2008

Bagre bagre 56 106 24m+26sm+6st Cananéia, SP, Brasil Gomes, Phan e

Passos,1990

Bagre marinus 54 74 12m+8sm+34st NE do Golfo do

México

Fitzsimons et al., 1988

Cathorops sp. 54 80 13m+13sm+28st Cananéia, SP, Brasil Gomes et al., 1992

Cathorops spixii 56 108 14m+20sm+18st+4a Ponta Negra, Natal, RN Presente estudo

Galeichthys

caerulescens

52 102 16m+24sm+10st+2a Tres Palos, Guerrero,

México

Arreguin, 1983

Genidens barbus 56 108 14m+16sm+22st+4a,

XX/XY

Baía de Guaratuba, PR Sczepanski, 2008

Netuma barba=

Genidens barbus

56 92 18m+18sm+18st+2a,

XX/XY

Cananéia, SP, Brasil Gomes et al., 1994

G. genidens 56 108 14m+22sm+16st+4a Baía de Antonina; Pontal

do Paraná, PR

Sczepanski, 2008

G. genidens 56 88 12m+20sm+20st+4a Cananéia, SP, Brasil Gomes et al., 1994

Hexanematichthys

herbergii

56 104 24m+24sm+6st+2a Lago de Maracaibo,

Venezuela

Molina et al., 2004

Sciades cf.

emphysetus

56 108 14m+14sm+24st+4a Ponta Negra, Natal, RN Presente estudo


39

5. Discussão

Dentro da família Ariidae, dados cariotípicos fornecidos pelo presente

estudo reforçam a hipótese da manutenção do número diplóide, com variação

nas fórmulas cariotípicas, sugerindo que inversões pericêntricas foram

preponderantes na evolução cariotípica deste grupo.

No presente trabalho, ambas as espécies apresentaram um mesmo

valor diplóide 2n=56 e número fundamental (NF) igual a 108, mas com

diferentes fórmulas cariotípicas. O cariótipo de Cathorops spixii é formado por

14m+22sm+16st+4a, enquanto que Sciades cf. emphysetus apresenta

14m+14sm+24st+4a.

Análises realizadas em populações de três espécies da família Ariidae

(Genidens genidens, G. barbus e Aspistor luniscutis) do litoral do Paraná

(região Sul do Brasil) (Sczepanski, 2008), demonstraram conservadorismo no

valor diplóide, e fórmulas cariotípicas com NF aproximados a C. spixii e

Sciades cf. emphysetus. (Tabela 1). Aquelas três espécies, juntamente com

estas duas, tem o mesmo número de cromossomos metacêntricos (14m) e

acrocêntricos (4a; exceto A. luniscutis, que não possui cromossomos deste

tipo). Uma revisão dos dados citogenéticos disponíveis demonstra um relativo

conservadorismo cariotípico presente no grupo, em relação aos números

diplóides (2n=52-56, com 2n=56 como valor modal), fórmulas cariotípicas (ricas

em elementos bibraquiais, m, sm e st) e números fundamentais (NF=74-112).

Uma vez que os números diplóides permanecem os mesmos e os NFs variam

para valores altos (>70), tais características sugerem que as mudanças

carioevolutivas dentro de Ariidae podem ser resultantes principalmente de

rearranjos do tipo inversão pericêntrica que, como observado nos diferentes

trabalhos já realizados, constitui uma tendência de mudança estrutural

cariotípica do grupo. A inversão pericêntrica tem sido considerada um rearranjo

importante na evolução cariotípica de muitos grupos de peixes, como

evidenciado para aqueles com números diplóides conservados, porém, com

grande variabilidade cariotípica, como visto em representantes Perciformes das

famílias Pomacanthidae (Affonso e Galetti, 2005) e Pomacentridae (Molina e

Galetti, 2004).


40

Um fato interessante são as discrepâncias quanto aos números

diplóides e as fórmulas cariotípicas de algumas espécies para diferentes

regiões geográficas. C. spixii encontrada no litoral do NE difere em relação aos

dados citogenéticos da população Cananéia, São Paulo (Gomes et al., 1992),

obtidas para Cathorops sp. (depois identificado com C. spixii), que apresenta

2n=54 (13m+13sm+28st, NF=80). O mesmo foi observado entre amostras de

Genidens genidens e G. barbus do litoral do Paraná e de São Paulo (Tabela 1).

Estas diferenciações cromossômicas podem estar relacionadas à existência de

espécies crípticas, apresentando diferenciações citogenéticas conspícuas

surgidas em função de isolamento alopátrico. Contudo, devido à grande

dificuldade na identificação taxonômica precisa para as espécies desta família

(Dr. Ricardo Rosa, comunicação pessoal), não pode se descartar imprecisão

de identificação.

A presença de números diplóides próximos de 2n=56 juntamente com

NF elevados é evidenciada em outros grupos de Siluriformes, como nas

famílias Trichomycteridae (Borin e Martins-Santos, 1999), Doradidae (Eler et

al., 2007), Loricariidae (Artoni e Bertollo, 2001; Alves et al., 2005; Kavalco et

al., 2005) e Auchenipteridae (Garcia, 2005). É evidente que modificações

cariotípicas recorrentes dentro desta Ordem têm levado a números diplóides de

54, 56 e 58, levando Eler et al. (2007) a sugerir 2n=56 como número basal para

Siluriformes.

Nos Siluriformes, a distribuição de heterocromatina constitutiva é mais

comum nas regiões centroméricas e teloméricas (Kavalco et al., 2005). Para as

espécies do presente estudo, a localização de heterocromatina constitutiva foi

evidenciada nas regiões centromérica e pericentromérica, além da telomérica.

Algumas marcações de banda C coincidiram com pares portadores de regiões

organizadoras de nucléolo (RON). Dentro dos Siluriformes em geral, isto

parece ser comumente observado para outros grupos como, por exemplo, em

Auchenipteridae (Garcia, 2006), Pimelodidae (Eler et al., 2007), Loricariidae

(Andreata et al., 2006), indicando que tal característica pode refletir um padrão

ancestral (plesiomórfico). Uma mesma disposição e conteúdo de blocos

heterocromáticos foram evidenciados para G. genidens, G. barbus e A.

luniscutis no litoral do Paraná (Sczepanski, 2008), confirmando esta condição

como um padrão conservado na família Ariidae.


41

Nos cariótipos de C. spixii, e Sciades cf. emphysetus as RONs foram

evidenciadas em posição terminal, no braço curto de dois pares

subtelocêntricos tanto pela técnica de Ag-RONs quanto pela hibridação in situ

com sondas 18S rDNA. RONs múltiplas também foram identificadas no Ariídeo

A. luniscutis (Sczepanski, 2008), que apresenta três pares cromossômicos

portando sítios ribossomais. Múltiplos cístrons ribossomais tem sido detectados

no cariótipo de outros grupos de Siluriformes, como em Loricariidae (Kavalco et

al., 2005) e Callichthyidae (Shimabukuro-Dias et al., 2004).

A presença de um único par portador de RONs, localizadas

terminalmente num braço curto é uma condição comumente encontrada, sendo

vários os casos de RONs simples observados em Siluriformes, com em

Loricariidae (Artoni e Bertollo, 2001; Kavalco et al., 2005; Alves et al., 2005),

Doradidae (Eler et al., 2007), Trichomycteridae (Borin e Martins-Santos, 1999),

Auchenipteridae (Garcia, 2005) e Pimelodidae (Garcia e Moreira-Filho, 2005).

No estudo realizado por Sczepanski (2008), G. barbus e G. genidens

apresentaram sítios Ag-RONs sobre um único par cromossômico, com a

existência heteromorfismo de tamanho destas regiões entre os homólogos. Na

presente análise, não foi detectado nos espécimes analisados, polimorfismos

de tamanho dos sítios ribossomais.

Como alternativa a outros tipos de bandamentos cromossômicos, o uso

de fluorocromos base-específicos tem ajudado a evidenciar grande

variabilidade e diversidade em peixes. Estes são corantes fluorescentes

ligantes de DNA. A Cromomicina A3 (CMA3), por exemplo, tem sido utilizada

para destacar regiões ricas em bases GC. Tais caracterizações tem ajudado a

prover informações sobre a composição e o conteúdo de heterocromatina em

peixes (Mantovani et al., 2004). Nas duas espécies aqui estudadas a coloração

com CMA3 mostrou-se praticamente uniforme em todos os cromossomos, com

exceção das RONs, as quais mostraram-se CMA3+ . Esta característica de

fluorocromos GC-específicos apresentarem relação com as RONs identificadas

por impregnação por nitrato de prata é comum em alguns peixes. Isto pode ser

conseqüência da natureza dos cístrons ribossomais da família 45S, os quais

tem um maior conteúdo de bases GC em suas regiões espaçadoras ou entre

seqüências de DNA repetitivos adjacentes (Pendáz et al., 1993). Padrões

semelhantes, onde as RONs fluorescem sem nenhuma outra marcação


42

adicional encontrada, em grupos como Hepapteridae (Roman et al., 2002),

Pimelodidae (Borin e Martins-Santos, 2000; Swarça et al., 2001; Souza et al.,

2002; Souza et al., 2004), Trichomycteridae (Borin e Martins-Santos, 1999) e

Loricariidae (Kavalco et al., 2005), entre outros.

No presente trabalho e em outros Ariidae já analisados (Sczepanski,

2008) as RONs apresentam-se heterocromáticas, conforme o padrão

evidenciado por bandamento C, demonstrando tais regiões como as únicas no

complemento cariotípico de natureza rica em GC.

A soma dos dados citogenéticos disponíveis para a família Ariidae

permite indicar as inversões pericêntricas como principais responsáveis pela

diversificação cariotípica deste grupo, enquanto a pequena amplitude de

valores diplóides encontrados fornece indicações de um papel mais discretos

de fusões cêntricas na evolução cariotípica. Levantamentos citogenéticos

envolvendo outras espécies da família e análises filogenéticas moleculares

permitirão esclarecer a existência de espécies crípticas ao longo do litoral

brasileiro.


43

CAPÍTULO 3

Novo citótipo para o cangati, Parauchenipterus galeatus

(Siluriformes, Auchenipteridae) no NE do Brasil: Evidência de

um complexo de espécies Araújo, W.C. e Molina, W.F.

Resumo A região neotropical possui grande diversidade ictiológica, sendo os Siluriformes um dos principais grupos, com muitas espécies, principalmente no ambiente continental. Estes ambientes constituem berço de formação da diversidade, devido principalmente a processos de especiação causados em decorrência de partições nestes ambientes continentais. Endemismo ao longo das bacias hidrográficas brasileiras se apresenta como um fenômeno comum, sendo amplamente disperso através de grupos de peixes, principalmente devido à vicariância ou dispersão, além do isolamento e estabilidade climática. Análises citogenéticas realizadas em Parauchenipterus galeatus revelaram um cariótipo com 2n=58 (24m+16sm+10st+8a; NF=108), com RONs simples localizadas em região distal de um par cromossômico submetacêntrico e regiões heterocromáticas reduzidas. O padrão de heterocromatina parece ter função importante na diferenciação citogenética entre P. galeatus de diferentes bacias, os quais apresentam cariótipos diversificados. O cariótipo de P. galeatus da Região Hidrográfica Atlântico Nordeste Oriental mostrou-se diferenciado daqueles descritos para populações da Bacia do Amazonas e São Francisco. Em função do tempo de divergência entre estas bacias, das diferenças citogenéticas encontradas, capazes de representar efetivas barreiras reprodutivas pós-zigóticas, sugere-se que este novo citótipo descrito represente evidências da existência de um complexo de espécies tendo como sinonímia Parauchenipterus galeatus.

Palavras-chave: cangati, espécies crípticas, citogenética de peixes,

especiação alopátrica.

1. Introdução A região Neotropical possui um dos maiores contingentes de

biodiversidade de peixes, principalmente em relação à ictiofauna dulcícola,

onde o número de espécies pode exceder 8.000 spp. (Toledo e Foresti, 2001).

Grande parte desta diversidade se originou por processos de especiação

decorrentes de isolamento histórico de bacias. Endemismo ao longo das bacias

hidrográficas brasileiras se apresenta como um fenômeno comum, sendo


44

amplamente disperso através de grupos de peixes, principalmente devido à

vicariância ou dispersão, além do isolamento e estabilidade climática, as quais

podem influenciar este grau de endemismo (Marques et al., 2008).

Entre as bacias hidrográficas do NE brasileiro a do São Francisco é

considerada como uma área de endemismo, condição corroborada por uma

grande quantidade de dados citogenéticos provenientes de espécies nativas

(ver Garcia e Moreira-Filho, 2005; Peres, 2005; Marques et al., 2008). Outras

bacias, nesta região, embora com padrões biogeográficos decorrentes de

ciclos climáticos e geológicos próprios tem uma ictiofauna praticamente

desprovida de informações citogenéticas, como a Região Hidrográfica Atlântico

Nordeste Oriental, que abrange uma extensão de 287.348 km2, que

corresponde à cerca de 3% do território brasileiro. Esta bacia drena valiosas

áreas vegetais como fragmentos de floresta Atlântica, caatinga, uma parcela

pequena de cerrado além de biomas costeiros (ANA, Brasil; disponível em <

http://www.ana.gov.br/mapainicial/pgMapaF.asp>). Além disso, a região

costeira do NE brasileiro possui várias regiões estuarinas. Tais ecossistemas

nordestinos podem ser considerados como um sistema hidrográfico costeiro

semi-fechado, abastecido por águas oceânicas e fluviais, devido ao ciclo das

marés, o que gera um ambiente de grande fertilidade, produzindo grande

quantidade de matéria orgânica, importante para cadeia alimentar destas

regiões, proporcionando assim ecossistema para muitos invertebrados e

vertebrados (MMA,1998).

Até o momento nenhum estudo citogenético foi realizado em

representantes da Ordem Siluriformes encontrados nesta bacia. Sendo assim,

dados sobre a constituição cariotípica de grupos de grande distribuição

geográfica não estão disponíveis.

Neste sentido, análises citogenéticas foram realizadas no siluriforme

dulcícola, Parauchenipterus galeatus, que exibe ampla distribuição na América

do Sul, constituindo um típico representante da ictiofauna neotropical de

Siluriformes, popularmente chamado “cangati”. Ocorre geralmente nas áreas

de matas alagadas e sob vegetação aquática flutuante, possuindo hábitos

noturnos (Medeiros et al., 2003). Possui peculiaridades em relação ao seu

modo de reprodição, apresentando fertilização interna e dimorfismo sexual

marcante, o qual nos machos é mais evidente devido à modificação de seu


45

primeiro raio da nadadeira anal em um órgão intromitente. As fêmeas possuem

uma estrutura sacular no oviduto onde espermatozóide é armazenado após

fertilização (Sanches et al., 1999). Análises cromossômicas realizadas na

espécie em outras bacias hidrográficas apresentaram cariótipos divergentes

(Souza et al., 2002; Garcia, 2005).

2. Objetivos Dados citogenéticos de Siluriformes da bacia do Atlântico NE Oriental

permanecem escassos e o baixo conhecimento de seus aspectos citogenéticos

dificulta o reconhecimento da diversidade de espécies. Diante disso, o

presente trabalho tem como objetivo realizar análises citogenéticas em

espécimes de P. galeatus Linnaeus, 1766 presentes no rio Pium, Natal-RN,

utilizando para isso bandamentos clássicos (banda C, Ag-RONs) e

moleculares, como CMA3/DAPI e hibridação in situ fluorescente (FISH) com

sondas de DNAr 18S. Desta forma, esperou-se reunir dados sobre o padrão

cromossômico desta espécie, correlacioná-los com os estudos já existentes

para outras bacias hidrográficas, procurando compreender melhor os

processos de diferenciação cromossômica e evolução cariotípica dentro deste

grupo.

3. Material e Métodos No presente estudo foram analisados 19 exemplares (2 machos, 9

fêmeas e 8 juvenis) de Parauchenipterus galeatus (Fig. 1), coletados no rio

Pium, Natal-RN (05°46'24"S, 35°11'W). Os peixes foram coletados com ajuda

de anzóis e redes, acondicionados em sacos plásticos com água e levados ao

Laboratório de Genética de Recursos Marinhos – UFRN, permanecendo em

tanques bem aerados. A estimulação mitótica foi realizada de acordo com Lee

e Elder (1980) e Molina (2001), com o intuito de aumentar a taxa de divisão

celular, provocada por meio de uma inoculação de lisados fúngicos e

bacterianos, visando um maior número de metáfases na suspensão

cromossômica. As preparações cromossômicas seguiram o método de

preparação direta in vitro (Gold et al., 1990). O material foi corado com Giemsa

5% diluído em tampão fosfato pH 6,8. Análises citogenéticas foram


46

desenvolvidas utilizando microscópio ótico com aumento de 1.000 X, sendo

analisadas em média trinta metáfases para cada exemplar. As melhores


digital de alta resolução. Os cromossomos foram organizados por tamanho em

ordem decrescente e classificados em grupos, como metacêntricos,

submetacêntricos, subtelocêntricos e acrocêntricos, de acordo com

nomenclatura desenvolvida por Levan et al. (1964). As RONs foram

caracterizadas utilizando-se impregnação pela prata (Howell e Black, 1980). A

heterocromatina foi analisada pelo bandamento C (Summer, 1972), bem como

pelo fluorocromo Cromomicina A3 (Schweizer, 1980). FISH foi utilizado para

identificação de seqüências ribossomais utilizando sondas 18S rDNA obtidas

da espécie de peixe Prochilodus argenteus (Hatanaka e Galetti, 2004).

Figura 1. Exemplar de Parauchenipterus galeatus. Barra = 1cm.

4. Resultados

Parauchenipterus galeatus apresenta um número diplóide modal de

2n=58, composto por uma fórmula cariotípica igual a 24m+16sm+10st+8a

(NF=108) (Fig. 2). O bandamento C evidenciou blocos heterocromáticos

presentes predominantemente em regiões centroméricas e pericentroméricas

(Fig. 3). A impregnação por nitrato de prata evidenciou a presença de dois

pares portadores de regiões organizadoras nucleolares (AgRONs), em posição

distal dos braços curtos de um par submetacêntrico (Fig. 4). Este padrão foi

coincidente com as análises utilizando sondas de 18S rDNA (Figura 5)


47

O uso de CMA3 evidenciou marcações positivas nas regiões distais dos

braços curtos do par portador das RONs (Fig. 6 a e b). O uso de fluorocromo

base-específico DAPI revelou um padrão uniforme (Fig. 6c).

Figura 2. Cariótipo de P. galeatus submetido à coloração com Giemsa, com

2n=58 cromossomos (NF=108).

Figura 3. Bandamento C em cromossomos de P. galeatus. Barra = 5µ.


48

Figura 4. Metáfase de P. galeatus após tratamento com AgNO3. As setas

indicam cístrons ribossômicos. Barra = 5µ.

Figura 5. Metáfases de P. galeatus. a e b) FISH evidenciando cístrons 18S rDNA. Barra = 5 µ.

Figura 6. Metáfases de P. galeatus. CMA3 a); CMA3 evidenciando associação de RONs b); DAPI c).

a b


49

Tabela 1. Revisão dos dados cariotípicos da família Auchenipteridae.

5. Discussão A Ordem Siluriformes abriga um dos maiores grupos de peixes de

ambientes continentais da região neotropical, composta por 15 famílias e cerca

de 1.548 espécies neotropicais (Reis et al., 2003). Dentro deste grupo, tem sido

descrito uma grande quantidade de dados citogenéticos, com relatos exibindo

para vários grupos diversidade e variabilidade cromossômica, tanto numérica

quanto estrutural, assim como a presença de sistemas de cromossomos

sexuais (Artoni et al., 2001; Andreata et al., 2006; Centofante et al., 2006;

Oliveira et al., 2006; Milhomen et al., 2008, entre outros). Auchenipteridae é uma família com características biológicas peculiares,

como fecundação interna, provavelmente extensiva a todas as espécies

(Nelson, 2006). A amostra de P. galeatus da Região Hidrográfica Atlântico

Nordeste Oriental, no Rio Grande do Norte, possui um cariótipo com 2n=58

cromossomos e fórmula cariotípica composta por 24m+16sm+10st+8a

Espécies

2n

NF

Fórmula

cariotípica

Par/RONs

No

RONs

Localidade

Referências

Aucheniptericht

hys thoracatus

58 104 18m+16sm+12st+12a T; p, par 23 Simples B. Amazônica-

AM

Souza et al.

(2002)

Glanidium

ribeiroi

58 106 22m+16sm+10st+10a P; p, par 13 Simples R. Iguaçu-PR Roman et al.

(2001)

Glanidium

ribeiroi

I; par, 1 Simples R. Iguaçu-PR Fenocchio et

al. (2004)

Liosomadoras

oncinus

58 104 16m+22sm+8st+12a T; p; st-a Múltipla B. Amazônica-

AM

Souza et al.

(2002)

Parauchenipter

us galeatus


AM

Souza et al.

(2002)

Parauchenipter

us galeatus

58 108 24m+20sm+6st+8a T; p, par 20 Simples B. São

Francisco-MG

Garcia, 2005

Parauchenipter

us galeatus

58 108 24m+16sm+10st-8a T; p; sm Simples B NE Oriental-

RN

Presente

estudo

P. leopardinus 58 110 24m+24sm+4st+6a Par 20 Simples B. São

Francisco-MG

Garcia, 2005

Tracheliopiterch

thys taeniatus


AM

Souza et al.

(2002)

T- terminal; I – intersticial; P – pericentromérica; p – braço curto.


50

(NF=108). Este citótipo é similar quanto ao valor diplóide, mas conspicuamente

diferente quanto aos padrões cromossômicos estruturais daqueles identificados

para a bacia Amazônica (2n=58; 20m+14sm+12st+12a; NF=104) (Souza et al.,

2002) e bacia do rio São Francisco (2n=58; 24m+20sm+6st+8a; NF=108)

(Garcia, 2005). Todas os citótipos, incluindo o da bacia do Atlântico NE,

apresentam um único par organizador nucleolar (submetacêntrico), com RONs

localizadas em posição telomérica no braço curto, corroborada também pela

presença de seqüência 18S rDNA. A presença de RONs únicas é considerada

uma condição simplesiomórfica para os Siluriformes (Oliveira et al., 2000;

Artoni e Bertollo, 2001; Kavalco et al., 2005).

Tendências de modificações cariotípicas são pronunciadas no ambiente

continental, principalmente por maior quantidade de divisões e obstáculos ao

fluxo gênico (Galetti et al., 2000). No caso de peixes de água doce, o

confinamento aos sistemas hidrográficos resulta de um estreito relacionamento

entre as histórias das bacias e suas histórias evolutivas (Kavalco, 2003).

Devido a pequena quantidade de caracteres cromossômicos obtidos de

forma rotineira em preparações citogenéticas em peixes, a banca C representa

para este grupo vertebrado uma valiosa ferramenta de análise (Souza et al.,

1996). É observado que os Siluriformes apresentam pouca quantidade de

heterocromatina, distribuída predominantemente em região pericentromérica e

telomérica, com relatos de ocorrência de marcações intersticiais e

polimorfismos (Artoni e Bertollo, 2001; Kavalco et al., 2005). Em P. galeatus, da

bacia do Atlântico NE Oriental, analisados no presente estudo, bem como em

amostras da Bacia Amazônica e do São Francisco, a heterocromatina está

distribuída de forma discreta, predominantemente nas regiões

pericentroméricas e centroméricas. Na bacia do São Francisco a espécie

apresenta também regiões teloméricas C+ evidentes em alguns cromossomos.

Pequenas diferenciações nos padrões de heterocromatina para

amostras geográficas de P. galeatus se estende também aos seus aspectos

composicionais. Desta forma enquanto que na bacia do São Francisco foi

detectado um par de cromossomos portadores de blocos DAPI+, coincidentes

com regiões de heterocromatina constitutiva (Garcia, 2005), no entanto, esta

característica não foi verificada para os espécimes da bacia do Atlântico NE


51

Oriental, cuja coloração cromossômica por este fluorocromo exibiu um padrão

neutro sem evidenciar regiões ricas em bases AT sobre os cromossomos.

Embora diferenças no padrão de bandamento C possam estar

relacionadas às dificuldades da técnica, é provável que de fato sejam

características peculiares dos cariótipos analisados, assim como propõem

Azevedo et al. (2005) para espécies de Achiridae (Teleostei,

Pleuronectiformes) brasileiras.

Este padrão de diferenciação causado pela natureza de heterocromatina

foi detectado em outros Siluriformes. Na subfamília Hypotopomatinae

(Loricariidae) quatro espécies (Hisonotos A e D, H. nigricauda e H.

leucofrenatus) foram separadas em dois grupos distintos em relação ao seu

conteúdo de heterocromatina detectada por banda C (Andreata et al., 2006).

Baixa quantidade de banda tem sido observada em outras espécies de peixes

como, Oligosarcus hepsetus (Characiformes) (Kavalco et al., 2005b). Citótipos

apresentando diferenças na distribuição de heterocromatina foram encontrados

em Astyanax scabripinnis e outros Characidae (Maistro et al., 2000; Portela-

Castro et al., 2007; entre outros).

Regiões ricas em bases GC (sinais fluorescentes CMA+) foram

evidenciados no cariótipo de P. galeatus na região distal dos braços curtos de

um par de cromossomos, coincidentes com as RONs, evidenciando a natureza

rica em GC destas regiões neste peixe. Este mesmo padrão já havia sido

encontrado em espécimes de P. galeatus da bacia do São Francisco, os quais

também apresentaram marcações CMA3+ coincidentes com as RONs (Garcia,

2005). A coincidência entre as marcações obtidas pela aplicação de

fluorocromos GC-específicos e os resultados obtidos por impregnação por

nitrato de prata seria possível devido à ocorrência de grandes quantidades de

bases GC nas regiões espaçadoras dos genes ribossomais ou, entre

seqüências de DNA repetitivos adjacentes (Pendáz et al., 1993).

Tais resultados são semelhantes àqueles relatados para outros Siluriformes,

como em Pariolius hollandi (Roman et al., 2002), Rhamdia branneri (Roman et

al., 2002b), R. quelen (Fenocchio et al., 2002; Maistro et al., 2002), contudo,

condições diferentes de ocorrência de RONs tem sido descritas para outras

famílias, como por exemplo, nas espécies do gênero Trichomycterus

(Siluriformes, Trichomycteridae) que exibe marcações CMA3+ em regiões


52

intersticiais dos pares portadores de RONs em três espécies estudadas (Borin

e Martins-Santos, 1999).

Os dados obtidos demonstram que o padrão cariotípico de P. galeatus

encontrados na bacia do Atlântico NE Oriental possui diferenciação daqueles

da bacia do Amazonas e São Francisco em relação à fórmula cariotípica e

natureza da heterocromatina. Porém, quanto à macroestrutura cariotípica ele

se assemelha mais ao da Bacia do São Francisco, do qual difere na definição

de cromossomos submetacêntricos e subtelocêntricos. Este fato possivelmente

remete a uma condição de maior proximidade filogenética entre estas

amostras, oriunda da gênese das bacias envolvidas. P. galeatus da Bacia do

Atlântico NE Oriental, desta forma, parece representar uma das formas

biológicas particulares dentro de um complexo de espécies denominado

genericamente “P. galeatus”, ainda não diferenciado morfologicamente, mas

com diferenciações citogenéticas que apontam uma sensível diversificação

cariotípica.


53

CONSIDERAÇÕES FINAIS

O presente estudo constou um levantamento cariotípico quanti-

qualitativo para espécies ícticas da região NE do Brasil, consideradas crípticas,

em função do nível de dificuldade de identificação taxonômica ou do limitado

conhecimento genético que se tem de seus grupos taxonômicos.

Estes marcadores de cunho citogenético têm sido utilizados com

sucesso com o intuito de evidenciar padrões de evolução cariotípica em

diversos grupos de peixes, além de ajudar na elucidação de questões

taxonômicas, evidenciar padrões populacionais, fornecendo bases eficientes

para a aplicação dessa ferramenta de grande utilidade para conservação,

programas de manejo e identificação correta de espécies crípticas.

As análises desenvolvidas em Apogon americanus permitiram avançar

no entendimento de estrutura cromossômica de um Perciformes com cariótipo

intensamente diversificado, revelando ainda assim a presença de caracteres

comuns ao grupo, como baixo conteúdo heterocromático e cístrons

ribossomais únicos.

Além disso, algumas características comuns aos Siluriformes

observadas neste estudo corroboram com as evidências de estabilidade

cariotípica dentro do grupo e mesmo na família Ariidae. Nas espécies

analisadas observou-se como característica um alto valor de número

fundamental indicando a presença de elevado número de cromossomos meta-

submetacêntricos no cariótipo de Siluriformes, o que de fato parece ser um

caráter ancestral amplamente compartilhado no grupo. Esta característica

revela a grande variação estrutural no cariótipo deste grupo, principalmente

proporcionada por mecanismos de inversões pericêntricas.

No bagre dulcícola, P. galeatus observou-se um número diplóide, 2n=58

e fórmula cariotípica particular em relação a outras amostras geográficas desta

espécie. Estas informações contribuem no estabelecimento de um complexo de

espécies, sob a sinonímia “P. galeatus”, com padrões biológicos e

características genéticas próprias. O citótipo descrito aqui para a Bacia do

Atlântico NE Oriental, possibilitou os dados sobre a biodiversidade local e


54

contribuir para estudos mais pormenorizados envolvendo esta forma biológica,

que pode vir a se constituir na descrição de uma nova espécie.

Enfim, estes resultados contribuem para um melhor entendimento dos

processos e padrões de diferenciação e evolução cromossômica da fauna

ícticas da região Nordeste do Brasil. Associações com outras abordagens,

como o uso de análises morfológicas e ferramentas moleculares, permitirão

uma maior compreensão da diversidade genética e biológica da ictiofauna

brasileira.


55

CONCLUSÕES

a) Entre os Apogonidae, rearranjos Robertsonianos aliados às inversões

pericêntricas constituem um dos principais mecanismos de diferenciação

cromossômica ao longo da evolução do grupo, este último mecanismo

sugerido pelos elevados valores de NF e relativa manutenção do número

diplóide modal de alguns representantes do grupo;

b) Apesar da grande distância entre populações de A. americanus do litoral

do Rio Grande do Norte até a Bahia, não foram evidenciadas diferenças

nos cariótipos entre estas duas populações, evidenciando que a

manutenção de fluxo gênico continua a propiciar coesão genética à

espécie ou que a mesma apresenta divisão populacional recente;

c) Embora apresentem um cariótipo numérica e estruturalmente diferenciado

do modelo basal dos Perciformes, os Apogonidae, revelam através dos

padrões estruturais detectados, grandes similaridades conservadas com

estes, ou seja, sítios 5S e 18S não sintênicos, RONs simples e reduzido

conteúdo heterocromático;

d) As espécies Cathorops spixii e Sciades cf. emphysetus corroboram a

marcante estabilidade cariotípica, no que se refere ao número

cromossômico, proposta para Siluriformes e extensamente difundida entre

os Ariidae;

e) Altos valores de NF, associados às fórmulas cariotípicas divergentes,

foram observados entre os Ariidae analisados, sugerindo tratar-se de

caracteres simplesiomórficos para os Siluriformes, derivados de intensos

mecanismos de inversões pericêntricas;

f) P. galeatus da Bacia do Atlântico NE Oriental (RN) apresentou fórmula

cariotípica e na composição de segmentos heterocromáticos diferenciados

de outras amostras geográficas distintas (Bacias do São Francisco e

Amazônica), sugerindo que “P. galeatus” represente um complexo de

espécies.


56

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