UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL

Inibição da desaminase celular APOBEC3G

pela proteína Vif do HIV-1: O papel da

localização celular

Dissertação orientada pelo Prof. Doutor João Gonçalves (Faculdade de

Farmácia da Universidade de Lisboa) e pela Prof. Doutora Margarida

Meireles (Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa)

Diana Isabel Máximo Rodrigues

Mestrado em Biologia Molecular Humana

2009

UNIVERSIDADE DE LISBOA

FACULDADE DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA VEGETAL

Inibição da desaminase celular APOBEC3G

pela proteína Vif do HIV-1: O papel da

localização celular

Dissertação orientada pelo Prof. Doutor João Gonçalves (Faculdade de

Farmácia da Universidade de Lisboa) e pela Prof. Doutora Margarida

Meireles (Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa)

Diana Isabel Máximo Rodrigues

Mestrado em Biologia Molecular Humana

2009

iii

Agradecimentos

Em primeiro lugar, ao Professor Doutor João Gonçalves, pela oportunidade de realizar o

meu projecto de mestrado no seu laboratório, pela orientação em todos os aspectos e pela

correcção da tese.

Em segundo, aos colegas de laboratório, em especial ao Nuno, à Patrícia e à Inês, por me

ensinarem tudo o que sei e por me terem ajudado em tudo, no mais básico possível e nas

dúvidas “existenciais”. Aos restantes colegas, Andreia, Catarina, Soraia, Lídia, Luís, Carina,

Sylvie, Sara e Paula, pela ajuda diária constante. Aos colegas e amigos Joana, Ana

Catarina e André por todos os favores que jamais vos poderei recompensar, pelo espírito de

entre-ajuda, por me aturarem, por estarem lá nas horas difíceis, pelo apoio incondicional,

pelos vossos ombros amigos.

Agradeço ainda à Professora Doutora Maria Margarida Meireles, pela disponibilidade e

prontidão em todo o apoio que me prestou e pela correcção da tese.

Em último mas não menos importante, à minha família e aos meus amigos. Obrigada Mãe e

Pai por tudo aquilo que as palavras não chegam para descrever. Pela educação, pelos

sermões, pela compreensão, pela amizade, pela ajuda, pelo amor. A vocês e à minha

restante família porque serem o meu chão, as minhas raízes, o meu lar. Aos amigos mais

chegados e aos velhos amigos, pela paciência, pela cumplicidade e pelo carinho, por me

ajudarem a ser a pessoa que sou hoje.

A todos vocês, muito obrigada.

iv

Índice Geral

Agradecimentos ................................................................................................................. iii

Índice Geral ......................................................................................................................... iv

Índice de Figuras ............................................................................................................... vii

Índice de Tabelas ............................................................................................................. viii

Símbolos e Abreviaturas ................................................................................................... ix

Resumo .............................................................................................................................. xii

Abstract ............................................................................................................................. xiii

1. Introdução ........................................................................................................................ 1

1.1. O HIV e a SIDA .......................................................................................................... 1

1.1.1 Etiologia e Patogenia ........................................................................................... 1

1.1.2. O impacto demográfico ...................................................................................... 1

1.2. Cataracterização do HIV-1 ......................................................................................... 2

1.2.1. Taxonomia ......................................................................................................... 2

1.2.2. Genoma e Estrutura ........................................................................................... 2

1.2.3. Ciclo de replicação ............................................................................................. 3

1.3. A proteína viral Vif e o seu alvo celular ...................................................................... 4

1.3.1. A importância da Vif ........................................................................................... 4

1.3.2. A interacção Vif-APOBEC3G .............................................................................. 6

1.3.3. Especificidade à espécie .................................................................................... 7

1.4. O factor anti-viral APOBEC3G ................................................................................... 8

1.4.1. A família APOBEC .............................................................................................. 8

1.4.2. Regulação intracelular da desaminase ............................................................... 9

1.5. A necessidade de novas terapias:

o potencial terapêutico da interacção Vif-APOCEC .................................................. 10

1.6. Hipótese de trabalho e Objectivos ............................................................................ 10

v

2. Materiais e Métodos ...................................................................................................... 11

2.1. Clonagem ................................................................................................................ 11

2.1.1. Extracção de DNA plasmídico em média escala por kit (midiprep) ................... 11

2.1.2. Reacção de polimerização em cadeia (PCR, Polymerase Chain Reaction) ...... 12

2.1.3. Hidrólise enzimática de DNA ............................................................................ 12

2.1.4. Reacção de ligação inserto-vector .................................................................... 13

2.1.5. Preparação de bactérias electrocompetentes ................................................... 13

2.1.6. Transformação de bactérias electrocompetentes ............................................. 14

2.1.7. Selecção e confirmação de colónias positivas para a clonagem ....................... 14

I) Selecção de colónias e extracção de DNA plasmídico em pequena escala

sem kit (lise alcalina) .......................................................................................... 14

II) Confirmação de clones positivos por hidrólise enzimática de DNA

e electroforese em gel ....................................................................................... 15

III) Extracção de DNA plasmídico em pequena escala por kit (miniprep)

e sequenciação automática de DNA ................................................................. 15

2.2. Expressão proteica .................................................................................................. 16

2.2.1. Linha celular – HEK 293T ................................................................................. 16

2.2.2. Transfecção pelo método de fosfato de cálcio .................................................. 16

2.2.3. Extracção e quantificação de proteínas ............................................................ 17

2.2.4. Separação de proteínas por electroforese em gel de poliacrilamida

com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) ....................................................... 17

2.2.5. Western blot ..................................................................................................... 17

2.2.6. Extracção diferencial de proteínas do citosol e do núcleo ................................. 18

2.2.7. Transcrição e Tradução in vitro e Imuno-precipitação (IP) ................................ 19

2.3. Análise da função proteica em células eucariotas .................................................... 20

2.3.1. Ensaio de degradação dos clones NLS-A3G .................................................... 20

2.3.2. Ensaio de infecciosidade do HIV-1 na presença de NLS-A3G .......................... 20

I) Extracção de DNA plasmídico em média escala por kit (midiprep) .................... 20

II) Co-transfecção, produção e concentração das partículas virais ........................ 21

III) Quantificação de partículas virais

pelo ensaio imunosorvente ligado a enzima (ELISA) ........................................ 21

IV) Linha celular – TZM-bl, infecção

e quantificação da inibição da infecciosidade viral por CPRG .......................... 22

vi

3. Resultados ..................................................................................................................... 23

3.1. Produção de clones pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA .............................................. 23

3.2. A expressão dos clones pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA

resulta em proteínas menores que o esperado ........................................................ 23

3.3. A proteína NLS-A3G-HA é mantida no citoplasma da célula .................................... 24

3.4. A localização celular não influencia o tamanho da NLS-A3G-HA ............................. 25

3.5. A Vif do HIV-1 consegue induzir a degradação da NLS-A3G-HA ............................. 25

3.6. A proteína NLS-A3G-HA é encapsidada nos novos viriões ...................................... 26

3.7. A infecção viral é inibida pela NLS-A3G ................................................................... 27

4. Discussão dos resultados e Conclusões .................................................................... 28

5. Referências Bibliográficas ............................................................................................ 30

6. Anexos ........................................................................................................................... xiv

vii

Índice de Figuras

Figura 1 | Organização do genoma do HIV-1 ......................................................................... 2

Figura 2 | Estrutura do virião do HIV-1 .................................................................................. 3

Figura 3 | Ciclo replicativo do HIV-1 ...................................................................................... 3

Figura 4 | A APOBEC3G causa a hipermutação do cDNA viral ............................................. 5

Figura 5 | Motivos-chave na proteína Vif ............................................................................... 6

Figura 6 | Degradação da APOBEC3G induzida pela Vif ....................................................... 7

Figura 7 | Os dois domínios catalíticos da APOBEC3G ......................................................... 8

Figura 8 | Obtenção de quatro clones positivos ................................................................... 23

Figura 9 | Expressão de NLS-A3G-HA em células HEK 293T ............................................. 24

Figura 10 | Localização citoplasmática de NLS-A3G-HA ..................................................... 24

Figura 11 | Expressão de NLS-A3G-HA in vitro ................................................................... 25

Figura 12 | Degradação de NLS-A3G-HA induzida pela proteína viral Vif ............................ 26

Figura 13 | Encapsidação de NLS-A3G-HA nos viriões produzidos ..................................... 26

Figura 14 | Inibição da infecção por NLS-A3G-HA ............................................................... 27

Figura 15 | Mapas genómicos de plasmídios utilizados ................................................. xv, xvi

Figura 16 | Representação esquemática da construção efectuada

para produzir os clones pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA ................................... xvi

viii

Índice de Tabelas

Tabela 1 | Composição da mistura e condições da reacção de PCR .................................. xiv

Tabela 2 | Representação esquemática das sequências de reconhecimento

das enzimas NotI e XhoI .................................................................................... xiv

Tabela 3 | Anticorpos utilizados na detecção de proteínas por Western blot ...................... xiv

Tabela 4 | Constituição das soluções utilizadas ..................................................................xvii

ix

Símbolos e Abreviaturas

Unidades e Símbolos

pg Picograma(s)

µg Micrograma(s)

mg Miligrama(s)

µL Microlitro(s)

mL Mililitro(s)

mm Milímetro(s)

M Molar

mM Milimolar

U Unidade enzimática

pb Pares de bases

h Hora(s)

min Minuto(s)

seg Segundo(s)

kDa Kilodalton(s)

mA Miliamper(es)

mm Milímetro(s)

V Volt(s)

Ω Ohm(s)

ºC Graus Celsius

t.a. Temperatura ambiente

rpm Rotações por minuto

x g Unidade de força centrífuga relativa

Reagentes e Abreviaturas

APOBEC3G (A3G) Apolipoprotein B editing catalitic polypeptide 3G

Abs Absorvância

DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

PBS Phosphate Buffered Saline

TBS-T Tris-Buffered Saline-Tween 20

EDTA Ácido etilenodiaminotetra-acético

SOB Super Optimal Broth

LB Luria-Bertani Broth

x

HRP Horseradish peroxidase, Peroxidase de rábano selvagem

TE Tris-EDTA

BSA Bovine serum albumin, albumina de soro bovino

HBS HEPES Buffered Saline

HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-Piperazinaetanosulfónico

m.o.i. Multiplicidade de infecção

SDS-PAGE Electroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio

PMSF PhenylMethaneSulphonylFluoride

CA Cápside

CCR5 Chemokine (C-C motif) Receptor 5

CD4 Cluster of Differentiation 4

CXCR4 Chemokine (C-X-C motif) Receptor 4

DNA Deoxyribonucleic acid, ácido desoxirribonucleico

RNA Ribonucleic acid, ácido ribonucleico

cDNA DNA complementar

E. coli Escherichia coli

Env Poliproteina do envelope

Gag Group-specific antigen polyprotein

ART Anti-retroviral therapy

HAART Highly active anti-retroviral therapy

HIV-1 Human Immunodeficiency Virus type 1

HA Hemaglutinina

HIV-2 Human Immunodeficiency Virus type 2

IP Imunoprecipitação

IN Integrase

LTR Long terminal repeat, repetição terminal longa

MA Matriz

mRNA RNA mensageiro

NC Nucleocápside

Nef Negative factor, factor negativo

ORF Open reading frame, grelha de leitura aberta

Pol Polimerase

PR Protease

Rev Reguladora da expressão do virião

SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida

SU Glicoproteína de superfície

Tat Trans-activator of transcription

xi

TAE Tampão de Tris-acetato EDTA

TM Transmembranar

Vif Viral infectivity factor, factor de infecciosidade viral

Vpr Viral protein R

Vpu Viral protein U

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

dNTP Trifosfato de desoxiribonucleótido

PCR Polymerase chain reaction, reacção de polimerização em cadeia

VSV-G Glicoproteína do Vírus da Estomatite Vesicular (Vesicular Stomatitis

Virus)

GAPDH Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase

PARP Poly [ADP-ribose] polymerase 1

CPRG Chorophenol red-β-D-galactopyranoside

xii

Resumo

A desaminase de citidinas APOBEC3G (A3G) (apolipoprotein B-editing catalitic

polypeptide 3G), confere uma importante estratégia anti-viral às células humanas, a qual é

neutralizada pelo factor de infecciosidade viral (Vif, viral infectivity factor) do Vírus da

Imunodeficiência Humana (HIV, Human Immunodeficiency Virus). Esta enzima é o

componente central desta defesa intrínseca de células do sistema imunitário, como os

linfócitos T e os macrófagos, ao promover a hipermutação do genoma do vírus mutado em

vif, impedindo uma infecção produtiva destas células-alvo. Em contra-partida, a selecção

deste gene durante a evolução do HIV-1 permitiu que uma proteína viral conseguisse induzir

de forma eficiente a degradação da A3G, através da via-dependente de proteossomas

celulares.

Neste trabalho, a interacção que ocorre entre a proteína viral e a enzima celular foi

investigada, nomeadamente através de uma estratégia que inibe esta ligação e que

pretende devolver a capacidade inibidora da infecção à desaminase. Através da adição de

um sinal de localização nuclear (NLS, nuclear localization signal) à extremidade N-terminal

da A3G, foi tentada a separação física destas duas proteínas em diferentes sub-localizações

celulares. A proteína Vif foi aferida quanto à capacidade de induzir a degradação da proteína

construída, e foram testadas as capacidades da NLS-A3G de incorporação nas partículas

virais produzidas nas células infectadas e de inibição da replicação viral nas células-alvo. As

diferenças detectadas na sensibilidade à acção da Vif e a total inibição da infecção que

ocorre na ausência da proteína viral, poderão ser bastante promissoras na descoberta de

novas regiões na estrutura de ambas proteínas, ou até mesmo na revelação de novos

mecanismos de evasão da desaminase celular à acção da proteína viral. Poderá, assim,

atingir-se uma maior compreensão da adaptação evolutiva deste vírus ao sistema imunitário

do Homem, uma adaptação muito eficiente que culmina no desenvolvimento da Síndrome

da Imunodeficiência Adquirida (SIDA).

Palavras-chave: HIV-1, Vif, APOBEC3G, NLS, domínio catalítico.

xiii

Abstract

Cytidine deaminase APOBEC3G (A3G) (apolipoprotein B-editing catalitic polypeptide 3G),

provides an important anti-viral strategy to human cells, which is neutralized by the viral

infectivity factor (Vif) from the Human Immunodeficiency Virus (HIV). This enzyme is the

main component of this intrinsic defense of immune system cells, as T lymphocytes and

macrofages, by promoting the hypermutation of the viral genome with mutation on vif,

preventing a productive infection of these target cells. Nevertheless, the selection of this

gene during HIV-1 evolution allowed that a viral protein could efficiently induce A3G

degradation, through the cellular proteasomes-dependent pathway.

In this work, the interaction that occurs between the viral protein and the cellular enzyme

was investigated, namely by a strategy that inhibits this connection and that acts on returning

the infection inhibitory ability to the deaminase. Through the addition of a nuclear localization

signal (NLS) to the N-terminal end of A3G, the physical separation of this two proteins in

different cellular sub-locations was attempted. Vif protein was evaluated as far as its ability to

induce de degradation of the designed protein, and the A3G capabilities of incorporation in

the viral particles produced in the infected cells and viral replication inhibition in the target

cells were tested. The detected differences in sensitivity to Vif’s action and the complete

inhibition of infection that occur in the absence of the viral protein, may be very promising in

the discovery of new regions in the structure of both proteins, or even in the unveiling of new

mechanisms of cellular deaminase evasion to the viral protein action. In this way, a better

comprehension of the evolutional adaptation of this virus to the Human immune system may

be achieved, a very efficient adaptation that ends up in the development of the Acquired

Immunodeficiency Syndrome (AIDS).

Key-words: HIV-1, Vif, APOBEC3G, NLS, catalytic domain.

1

1. Introdução

1.1. O HIV e a SIDA

1.1.1 Etiologia e Patogenia

Os Vírus da Imunodeficiência Humana tipo-1 e tipo-2 (HIV-1 e HIV-2) são os agentes

etiológicos actualmente conhecidos de SIDA. O HIV-1, principal responsável pela epidemia

mundial, foi isolado em 1983(1), enquanto o HIV-2 apenas foi descoberto três anos mais

tarde(2). Ambos derivaram de Vírus da Imunodeficiência Símia (SIV, Simian

Immunodeficiency Virus) que infectam chimpazés e macacos fuliginosos, respectivamente.

Apesar das semelhanças morfológicas e biológicas, estes diferem significativamente em

alguns componentes antigénicos e moleculares, o que faz com que o HIV-2 apresente

períodos de latência consideravelmente mais longos e seja menos virulento, tornando-o

responsável por epidemias mais localizadas, principalmente em certas regiões da África

Ocidental(2).

Estes vírus infectam primariamente linfócitos T CD4+ e macrófagos por estes

apresentarem na sua superfície um receptor específico (CD4) e os correceptores CCR5 e

CXCR4(3); contudo, outras células do sistema imunitário como os linfócitos B e as células

dentríticas também podem expressar estes receptores, tornando-se susceptíveis à infecção

pelo HIV. Como consequência, o sistema imunitário é destruído progressivamente, levando

ao desenvolvimento da síndrome que surge associada a múltiplas infecções oportunistas,

complicações neurológicas e neoplasias(4).

1.1.2. O impacto demográfico

De acordo com os últimos dados do Programa das Nações Unidas para o

HIV/SIDA/Organização Mundial de Saúde referentes ao ano de 2007, existem actualmente

33,2 milhões de pessoas infectadas com HIV no mundo, das quais mais de 30 milhões

vivem em países de desenvolvimento. Apesar da terapia antiretroviral (ART, antiretroviral

therapy) actual ser capaz de atrasar o aparecimento dos sintomas da SIDA para mais de 15

anos após a infecção, apenas 3 milhões de pessoas em 2007 estavam a receber

tratamento, correspondendo a 31% do total de infectados com necessidade imediata desta

terapia. A somar registaram-se só nesse ano 2,5 milhões de novos casos e 2,1 milhões de

mortes, estando estas incluídas num total de 25 milhões de pessoas que já morreram devido

a esta doença contabilizados deste 1981.

Particularmente em países em desenvolvimento, o HIV/SIDA continua a ser um dos

maiores problemas mundiais em saúde pública. Esta crescente pandemia mantém a

Intr

odução

2

exigência do estudo aprofundado deste vírus, dos seus mecanismos e interacções com os

componentes das células, para alcançar terapêuticas mais eficazes a nível global.

1.2. Cataracterização do HIV-1

1.2.1. Taxonomia

O HIV-1 pertence à família Retroviridae, a qual engloba vírus cujo material genético é

ácido ribonucleico (RNA, ribonucleic acid) de cadeia simples positiva não segmentada. Tal

como o nome indica, os vírus desta família são caracterizados por realizarem a transcrição

reversa do seu RNA genómico em ácido desoxirribonucleico (DNA, deoxyribonucleic acid)

de cadeia dupla, processo desempenhado por uma enzima característica do seu proteoma,

a transcriptase reversa(5).

Este vírus está incluído ainda no género Lentivirus, que significa vírus “lentos”, uma vez

que estes vírus são caracterizados por longos períodos de latência. Estes distinguem-se dos

restantes retrovírus porque possuem cápside em forma de bala(6) e genomas complexos

com um grande número de proteínas acessórias que aumentam fortemente a eficiência da

infecção(5). Para além disso, possuem um invólucro formado por uma bicamada lipídica que

é derivada da membrana da célula hospedeira (Figura 1).

1.2.2. Genoma e Estrutura

O genoma do HIV-1 é formado por duas moléculas de RNA, cada uma com cerca de 9

kb. Estas são flanqueadas por repetições terminais longas (LTR, long terminal repeats),

sequências vitais para a integração e transcrição do genoma viral, e possuem 9 grelhas de

leitura abertas (ORF, open reading frame) que originam 15 proteínas distintas(7).

Três ORFs codificam as poliproteínas precursoras Gag, Pol e Env (características de

todos os retrovírus), as quais são posteriormente proteolizadas originando 9 proteínas. As

poliproteínas estruturais Gag e Env constituem, respectivamente, o núcleo e o invólucro

externo do virião, sendo quatro as proteínas Gag: matriz (MA, p17), cápside (CA, p24),

nucleocápside (NC, p7) e p6; e duas as proteínas Env: superfície (SU, gp120) e

transmembranar (TM, gp41). O virião de forma esférica (com cerca de 100nm de diâmetro) é

revestido por um invólucro lipídico proveniente da membrana da célula produtora, no qual

estão inseridos inúmeros complexos formados por trímeros de gp120 e gp41. A poliproteína

Figura 1 | Organização do genoma do HIV-1. As poliproteínas Gag, Pol e Env, são precursoras das proteínas do núcleo, do

invólucro e das enzimas virais. Adicionalmente, 6 ORF originam as proteínas acessórias que regulam a expressão dos genes

virais e que participam no processo de encapsidação, aumentando fortemente a eficiência da infecção.

Intr

odução

3

Pol origina três enzimas: protease (PR), transcriptase

reversa (RT) e integrase (IN), as quais fornecem as

funções enzimáticas essenciais e são também

encapsidadas na partícula viral (Figuras 1 e 2)(3,6,7).

As seis restantes ORFs originam pequenos transcritos

que sofreram splicing. Estes codificam duas proteínas

reguladoras de genes Tat (trans-activadora) e Rev

(reguladora da expressão do virião) que não constituem a

partícula, e quatro proteínas acessórias: Nef (factor

negativo), Vif (factor de infecciosidade viral) e Vpr

(proteína viral R), que são encapsidadas, e Vpu (proteína

viral U) que assiste na formação do virião(3,5).

1.2.3. Ciclo de replicação

A fase precoce do ciclo de replicação inicia-se quando uma partícula infecciosa encontra

uma célula-alvo que apresenta na sua membrana o receptor CD4, e este se liga à

glicoproteína de superfície do vírus, gp120 (SU). Esta sofre alterações conformacionais que

permitem o reconhecimento dos co-receptores CCR5 e CXCR4, possibilitando a fusão do

invólucro viral com a membrana celular e consequentemente a entrada de todas as

moléculas encapsidadas na partícula no citoplasma da célula(3). Aí, o RNA genómico viral

em cadeia simples é convertido pela transcriptase reversa (com o auxílio da proteína da

nucleocápside) num intermediário de DNA de cadeia dupla, o provírus, que é então

transportado para o núcleo e integrado no genoma da célula, por acção da integrase (Figura

3)(5,6). Na fase tardia do ciclo, estes genes de DNA são transcritos e traduzidos pela

maquinaria da célula hospedeira em

proteínas virais. As proteínas

estruturais são transportadas para a

membrana plasmática onde se

acumulam; a poliproteína Gag liga-se

ao RNA genómico do vírus e então

interactua com a membrana plasmática,

a qual é forçada a se projectar e

eventualmente a se separar, formando-

se uma partícula (cujo invólucro lipídico

é proveniente da membrana da célula)

que é libertada para o exterior da célula

Figura 2 | Estrutura do virião do HIV-1.

Na partícula viral são encapsidadas duas

cópias do genoma que não sofreram

slicing, que se associam a milhares de

proteínas NC para formar um complexo

ribonucleoproteico estável. São ainda

encapsidadas as proteínas estruturais

Gag e Env, as enzimas virais (Pol) e as

três proteínas acessórias (não

representadas) Nef, Vif e Vpr.

Figura 3 | Ciclo replicativo do HIV-1. Após fusão do virião com a

membrana da célula, o RNA viral é transcrito em cDNA de cadeia

dupla, o qual se integra no genoma da célula por acção da

integrase, completando-se a fase precoce do ciclo. Na fase tardia as

proteínas virais, sintetizadas pela maquinaria celular, acumulam-se

próximo da membrana, juntamente com o RNA viral, e o novo virião

forma uma gémula, acabando por sair da célula.

MA

RT

PR

SU

Invólucro

lipídico

CA

NC

RNA

IN

TM

Núcleo Célula produtora

Fusão

Gemulação

Integração

Intr

odução

4

infectada (Figura 3)(6,8). A formação do virião infeccioso é completada já fora da célula, ao

ocorrer a maturação da partícula que consiste no processamento proteolítico da Gag e da

Gag-Pol pela transcriptase reversa, levando à formação do núcleo e activação das enzimas

virais(3,5).

1.3. A proteína viral Vif e o seu alvo celular

1.3.1. A importância da Vif

A proteína Vif, codificada pelo genoma do HIV-1 e expressa na fase tardia do ciclo de

replicação por um mecanismo dependente de Rev, é uma pequena (23 kDa) proteína

acessória básica formada por 192 aminoácidos, que é incorporada no virião (7-100

moléculas por cada partícula) através da interacção como RNA genómico viral(7,9). Na célula

localiza-se predominantemente no citoplasma, mas também é encontrada no núcleo(10) e

associada a membranas celulares. O gene vif, inicialmente designado sor, foi descoberto

1987 ao ser demonstrado que o vírus mutado HIV-1(Δvif) (com o gene vif delectado),

apresentava uma perda da infecciosidade viral de 100 a 1000 vezes, em relação ao vírus

selvagem, embora sem diminuição da produção viral(11). Esta proteína é essencial para a

replicação do vírus em células humanas ditas não-permissivas (como linfócitos T CD4+ e

macrófagos, que são as principais células-alvo do HIV, e várias linhas celulares de células T

leucémicas), ou seja, células que quando infectadas pelo vírus mutado HIV-1(Δvif) (com o

gene vif delectado), produzem novas partículas virais não infecciosas(8,12,13). De facto, a Vif é

vital para neutralizar uma potente via anti-viral que existe neste tipo de células, uma vez a

replicação das partículas virais produzidas na ausência de Vif é inactivada eficientemente

por esta via inata. Em outro tipo de células, designadas de permissivas (como as linhas

celulares HeLa e 293T), mesmo o vírus mutado é capaz de replicar de forma eficaz(12,14,15).

Em 2002, Sheehy e os seus colaboradores descobriram que uma proteína celular é o

alvo da Vif(16), a subunidade 3G da desaminase do mRNA da apolipoproteína B -

APOBEC3G (A3G) (Apolipoprotein B-editing catalitic polypeptide 3G) inicialmente conhecida

como CEM-15(9,15,17). Esta enzima é um membro da família de desaminases de citidinas

(enzimas que modificam/editam ácidos nucleicos), e o seu nome foi-lhe atribuído pela

homologia considerável com a primeira enzima desta família (APOBEC1)(12). Ao se

expressar A3G em células permissivas, estas adquirem um fenótipo não-permissivo, o que

revelou/desvendou que esta desaminase é o factor anti-viral cuja expressão natural está

restrita às células não-permissivas, e que permite inactivar o HIV-1(Δvif). Portanto, a

proteína viral Vif é crucial para proteger o vírus da actividade anti-viral da A3G, permitindo

assim que o vírus replique em células que expressam este factor de restrição(12,13).

Intr

odução

5

Na ausência da Vif, a A3G presente

no citoplasma da célula produtora é

encapsidada (3 a 11 moléculas) nos

viriões de HIV-1(Δvif) em formação ao

ligar-se à porção N-terminal da região

da nucleocápside da poliproteína Gag,

bem como ao RNA viral, no local da

membrana celular onde ocorre a

gemulação das partículas virais(15,18).

Como resultado da fusão viral, é

introduzida no citoplasma da próxima

célula alvo (Figura 4), e ao ocorrer a

transcrição reversa de genoma de

RNA do vírus, esta enzima vai catalizar

a excessiva desaminação de

desoxicitidinas (dC) a desoxiuridinas

(dU) na cadeia negativa (-) do DNA

complementar (cDNA) formado,

preferencialmente em sequências 5’-

CC CU(8,14,15,19). A cadeia negativa é

o alvo da desaminação uma vez que a A3G apenas consegue utilizar moldes em cadeia

simples de DNA, ao passo que a cadeia positiva existe quase totalmente como DNA de

cadeia dupla(13).

O DNA viral contendo uridinas (U) pode ser reconhecido e degradado pela acção

combinada de duas enzimas de reparação do DNA, a glicosilase de uracil-DNA (que remove

os uracilos originando locais abásicos) e a endonuclease apurínica-apirimidínica (que cliva

os locais abásicos), bloqueando assim a replicação viral(8,9,15,19,20,21). Porém, um número

reduzido de cadeias negativas pode resistir à degradação e servir de molde para formar a

cadeia positiva (+) do cDNA. Nesta, as mutações ficam registadas como transições de

guanosina (G) para adenosina (A) em mais de 10% de todos os resíduos G(14,15), e este

provírus pode integrar-se no genoma da célula hospedeira, embora as sequências

geneticamente comprometidas não darão origem a uma progenia de viriões infecciosos. A

A3G pode ainda inibir a replicação de uma forma independente da desaminação quando

ligada ao RNA viral, ao competir fisicamente com o movimento da transcriptase reversa na

cadeia molde de RNA, resultando numa diminuição inicial transcrição(22). Contudo, esta

inibição é frequentemente incompleta e ocorre a produção da cadeia negativa do cDNA que

é então alvo da acção da A3G dependente da desaminação.

Núcleo Célula produtora Proteossoma 26S

Ubiquitinação e degradação Incorporação

Gemulação

Fusão

Degradação?

Integração

Hipermutação C/G T/A

Degradação?

Célula alvo

Figura 4 | A APOBEC3G causa a hipermutação do cDNA viral. A

desaminase é encapsidada nos novos viriões, actuando na cadeia

negativa (-) do cDNA durante a transcrição reversa. O DNA viral

hipermutado pode ser degradado por enzimas de reparação ou pode

ser integrado no genoma da célula. A proteína viral Vif liga-se à

APOBEC3G e induz a sua poli-ubiquitinação, de forma a marcá-la

para degradação pelo proteossoma 26S.

Intr

odução

6

Assim explica-se como é possível que células não permissivas possam produzir níveis

normais de viriões, mas que estes não sejam capazes de replicar de forma eficiente nas

próximas células-alvo. Apesar de tudo, a desaminação das citidinas pode ser construtiva em

vez de destrutiva, e pode ajudar as sequências do HIV-1 a evoluir, contribuindo

possivelmente para o surgimento de variantes com vantagens selectivas que lhes permitam

escapar a respostas imunes adaptativas ou a adquirir resistência a fármacos anti-virais(13).

1.3.2. A interacção Vif-A3G

Sabe-se então que, de forma a se protegerem deste mecanismo de defesa das células,

todos os lentivírus (à excepção do vírus da anemia infecciosa equina) desenvolveram os

genes vif, cuja função primária é prevenir a encapsidação da A3G nos viriões produzidos,

impedindo-a de realizar a sua função anti-viral de desaminase(9). Para tal, a Vif liga-se

directamente à A3G e diminui a sua estabilidade ao induzir a sua degradação por uma via

dependente de proteossomas, eliminando-a das células produtoras(8,12,13,15,23). Assim, os

níveis celulares de A3G são reduzidos, prevenindo-se desta forma a incorporação da

desaminase nas novas partículas virais e permitindo a preservação da infecciosidade

viral(8,20,24). A expressão de Vif pode então resultar numa depleção da A3G das células T

infectadas pelo HIV-1 enquanto os níveis de mRNA da A3G permanecem inalterados(13).

Não obstante, a ligação da Vif à A3G não é suficiente para neu tralizar o fe nótipo anti-

viral(12). A porção N-terminal da Vif (aminoácidos 14-17 e 40-44) interactua com a

extremidade N-terminal na A3G (aminoácidos 54-124 e 128)(9,15); contudo, outros dois

domínios da Vif são fundamentais para que ocorra a degradação da desaminase(12). Um

deles é um motivo muito conservado perto da extremidade C-terminal, designado motivo

SLQ (aminoácidos 144-149), cuja sequência SLQ(Y/F)LA (seguido de 4 a.a. hidrofóbicos) é

semelhante a um motivo conservado na caixa BC das proteínas supressoras de sinalização

de citocinas (SOCS) e intervém na ligação da Vif à elongina C, um componente do

complexo da ligase de ubiquitina E3(13,17,25). É de salientar que este motivo SLQ é a

sequência mais conservada nas proteínas Vif do HIV-1 e de outros lentivírus, o que sugere

que fármacos direccionados para este local podem ser resistentes a mutações do vírus(12). O

outro motivo altamente conservado, também designado de motivo HCCH (aminoácidos 108-

139), é a sequência H-X5-C-X17-18C-X3-5-H, localizada a montante da caixa BC, e que

estabelece a interacção com a

culina-5(15,17). Os dois resíduos

de cisteína que fazem parte do

motivo HCCH são componentes

críticos de um domínio de dedos-

Figura 5 | Motivos-chave na proteína Vif. Os motivos SLQ e HCCH, bem

como os aminoácidos 14-17 e 40-44 são sequências vitais para a interacção

com a A3G e com dois constituintes do complexo da ligase de ubiquitina E3,

a culina-5 e a elongina C.

108H-X5-C-X17-18-C-X3-5-H139

Motivo SLQMotivo HCCH

144SLQ(Y/F)LA149N-terminal C-terminal

14RMRD17 40YHHRY44128 124-54

Intr

odução

7

-de-zinco, sendo a ligação do zinco

vital para a função da Vif pois

permite a correcta conformação da

proteína(9,13). Estas interacções são

essenciais para que a Vif consiga

recrutar o complexo da ligase de

ubiquitina E3, formado pela

elongina C, a elongina B, a culina-5

e a ring-box-1 (Rbx1)(14,17,25). Este

complexo pode assim interagir com

a A3G e encaminhá-la para a

proximidade da enzima conjugadora E2-ubiquitina, induzindo a poli-ubiquitinação da

desaminase – uma modificação pós-traducional que marca a proteína para degradação pelo

proteossoma 26S (Figura 6)(14,15). Para além desta função, existem também evidências que

a Vif pode ajudar a suprimir a tradução do mRNA da A3G, sendo que este efeito combinado

com a aceleração da degradação proteossomal resultam na depleção eficiente dos níveis

intracelulares da desaminase contrapondo a sua actividade anti-viral(20,23,24,26). Têm sido

propostas propriedades funcionais adicionais da Vif que previnem a encapsidação da A3G

nos viriões de uma forma independente da degradação, como a exclusão física da A3G dos

locais de formação das particulas virias, ou inibição da encapsidação da desaminase por

competição da ligação com componentes virais como a nucleocápside na poliproteína Gag

ou no RNA viral(15,23).

1.3.3. Especificidade da espécie

Como praticamente todos os lentivírus têm um gene vif, é fácil extrapolar que a A3G ou

proteínas da mesma família (por exemplo, APOBEC3F (A3F)) podem exercer actividade

contra uma variedade de vírus deste género. Contudo, existe uma elevada especificidade ao

nível da espécie na actividade da A3G, a qual está relacionada com determinantes

genéticos muito específicos. Assim, a A3G humana é marcada para degradação pela Vif do

HIV-1, enquanto que, por exemplo, a A3G do macaco verde africano não é afectada pela Vif

do vírus humano. Esta especificidade também se aplica às proteínas Vif do HIV-1 e do SIV

do macaco verde africano. Contudo, a Vif do SIV do macaco rhesus actua de uma forma

mais alargada e já consegue neutralizar a A3G dos humanos e do macaco verde africano,

bem como a da própria espécie(13,25,27). É de salientar de as Vif do SIV dos chimpazés e do

SIV dos macacos fuliginosos conseguem degradar com sucesso a A3G humana, o que

explica como estes vírus representam os percursores dos HIV-1 e 2, respectivamente(15,23).

Um único resíduo de aminoácido na posição 128 na A3G humana é responsável por esta

Figura 6 | Degradação da APOBEC3G induzida pela Vif. Após

interacção com a proteína viral, a desaminase sofre ubiquitinação pelo

complexo E3 ubiquitina ligase que interage com a Vif.

Ubiquitinação

Degradação

proteossomal

Intr

odução

8

especificidade, sendo que a mudança deste resíduo da sequência do humano (aspartato)

para o da sequência do macaco verde africano (lisina), D128K, é suficiente para reverter a

sensibilidade às Vif do HIV-1 e do SIV do macaco(19,27). Igual função apresentam os

aminoácidos mente, os aminoácidos 14-17 da Vif também conferem a restrição à espécie(15).

Assim, demonstra-se que as defesas celulares que restringem a transmissão dos lentivírus

dos macacos para o Homem podem ser ultrapassadas por polimorfismos subtis dentro de

genes como o vif(8).

1.4. O factor anti-viral A3G

1.4.1. A família APOBEC

No Homem, os genes da enzimas APOBEC estão espalhados por vários cromossomas e

resultam na produção de onze enzimas: AID (activation-induced deaminase), APOBEC1,

APOBEC2, sete enzimas APOBEC3 e ainda APOBEC4(9). Os genes da subfamília

APOBEC3 estão codificados em tandem no cromossoma humano 22q.13.1: APOBEC3A-B-

C-DE-F-G-H. Todas as APOBECs têm os mesmos domínios característicos, um pequeno

domínio em hélice-α seguido por um domínio catalítico (CD), um pequeno péptido linker, e

um domínio pseudocatalítico (PCD); nas A3G e A3F (e também nas APOBEC3B e

APOBEC3DE) estas unidades estão duplicadas formando uma estrutura hélice1-CD1-

linker1-PCD1-hélice2-CD2-linker2-PCD2. Cada domínio catalítico contém o motivo

conservado His-X-Glu-(X)23-28-Pro-Cys-(X)2-4-Cys, no qual os resíduos de histidina e cisteína

se ligam a um ião zinco e o resíduo de glutamato está envolvido no transporte de protões

durante a reacção hidrolítica de desaminação. Estes resíduos são fulcrais para que ocorra,

na presença de água, a remoção de um grupo amina na posição C4 da base azotada 2´-

desoxiciditina convertendo-a a 2’-desoxiuridina (Figura 7a)(13,14,15,27).

Figura 7 | Os dois domínios catalíticos da APOBEC3G. a | Tal como a A3F, a A3B e a A3DE, a A3G possui dois domínios

catalíticos no entanto apenas o domínio N-terminal participa na reacção de desaminase, sendo o domínio C-terminal

cataliticamente inactivo, estando envolvido na ligação ao RNA viral e, portanto, na encapsidação da desaminase no virião. b |

O mecanismo de desaminação. Os resíduos de histidina e cisteína ligam-se a um ião zinco, e na presença de água o resíduo

de glutamato promove o transporte de protões que culmina na libertação de um grupo amina na posição C4 da citosina,

convertendo-a uracilo.

a

b CD1 CD2

C-terminalN-terminal

Intr

odução

9

Apesar da A3G apenas realizar a sua actividade de desaminase em cadeias simples de

DNA(15), esta também se consegue ligar a DNA em cadeia dupla, RNA em cadeia simples e

dupla e a híbridos RNA:DNA. Nas APOBEC que contêm dois domínios de desaminase (CD1

e CD2), geralmente apenas um dos domínios está cataliticamente activo, estando o

segundo domínio envolvido na ligação ao ácido nucleico (neste caso do HIV-1, RNA) e

encapsidação no virião. Desta forma, as propriedades de ligação a ácidos nucleicos da A3G

estão associadas com os seus dois domínios de desaminase: o domínio C-terminal fornece

a actividade catalítica, ligando-se ao DNA em cadeia simples, enquanto o domínio N-

terminal é cataliticamente inactivo mas pode ser vital para a ligação ao RNA viral, permitindo

que a enzima seja encapsidada nas partículas virais na forma de oligodímero(13,28).

A A3G foi a primeira enzima desta família que se descobriu inibir o HIV-1(20). Contudo,

actualmente sabe-se que outros membros da família também são potentes inibidores da

infecção pelo HIV, embora a A3G seja a que tem um maior efeito anti-viral. Depois da A3G,

a A3F é o segundo membro desta família mais eficiente a suprimir infecções de HIV-1(Δvif).

Ambas as enzimas são altamente neutralizadas pela Vif, por mecanismos de degradação

dependentes da ubiquitinação, mas a Vif também é capaz de prevenir a encapsidação de

A3G e A3F através de mecanismos independentes da degradação(9,15,27,28).

1.4.2. Regulação intracelular da desaminase

O estudo intensivo da A3G fez despoletar variadas questões sobre a regulação desta

actividade mutagénica potencialmente promíscua e do seu efeito tóxico no genoma celular.

Estudos de localização subcelular indicam que a A3G é uma proteína citoplasmática que, ao

contrário de outros dois membro s da família APOBEC – AID e APOBEC1 – não é

transportada para o núcleo, sendo fortemente retida no citoplasma por acção de uma

sequência de 16 aminoácidos (113 a 128) próxima do CD1 e que se sobrepõe a alguns

resíduos cruciais à interacção com a poliproteína Gag e com a Vif(29,30).

Contudo, a exclusão nuclear não deve ser o único mecanismo existente na célula para

limitar a actividade A3G, uma vez que os componentes citoplasmáticos e nucleares se

misturam aquando da divisão celular após a disrupção da membrana nuclear. De facto, a

A3G expressa no citoplasma ocorre na forma de complexos ribonucleoproteicos (RNP) de

alta massa molecular (HMM – high-molecular-mass) (5-15kDa) nos quais a actividade de

desaminase da A3G é altamente inibida. A A3G na forma de complexos de baixa massa

molecular (LMM – low-molecular-mass) funciona como um potente factor de restrição ao

impedir a replicação do vírus logo após a entrada na célula. De notar que a acção da A3G

LMM não é antagonizada pela Vif uma vez que esta é encapsidada em pouca quantidade

nos viriões e só é produzida Vif na fase tardia do ciclo de replicação por intermédio da

poliproteína Rev; logo, este efeito antiviral que ocorre mal o vírus entra na célula acontece

Intr

odução

10

independentemente da incorporação da A3G nas partículas virais e é igualmente eficiente

tanto contra o vírus selvagem como contra o HIV-1(Δvif). Mais, este bloqueio pós-entrada

não depende exclusivamente da desaminação(9,15).

1.5. A necessidade de novas terapias: o potencial terapêutico da

interacção Vif-APOBEC

Actualmente, a terapia antiretroviral ART (ou HAART, highly active antiretroviral therapy),

consiste na administração de pelo menos 3 diferentes fármacos anti-retrovirais inibidores da

transcriptase reversa e da protease, no sentido de reprimir a replicação do vírus(4). Contudo,

a ART não representa uma cura, é uma terapêutica dispendiosa que apenas atrasa a

progressão da infecção e deve ser administrada durante toda a vida.

A compreensão dos mecanismos de interacção das proteínas Vif viral e A3G celular

potencia a descoberta de novas terapêuticas anti-retrovirais mais eficazes. A caracterização

de novas moléculas capazes de bloquear a degradação da A3G pela proteína Vif, de inibir a

ligação da proteína viral à desaminase ou a componentes do complexo da ligase de

ubiquitina E3 são alvos a considerar para que o tratamento definitivo da infecção HIV/SIDA

seja uma realidade conseguida num futuro não muito distante.

1.6. Objectivos e Hipótese de trabalho

Esta dissertação visa o objectivo global de criação de uma estratégia de inibição da

interacção da proteína Vif do HIV-1 com o factor anti-viral celular A3G. Neste sentido, a

ligação entre as duas proteínas é impedida pela sua separação física em diferentes sub-

localizações celulares, tendo esta divisão sido conseguida pela formação de uma proteína

A3G contendo um sinal de localização nuclear (NLS, nuclear localization signal). Desta

forma, sendo a Vif uma proteína citoplasmática, a A3G retida no núcleo não poderia ser

marcada para degradação pela Vif nem degradada no proteossomas celulares. Contudo,

para poder desempenhar a sua actividade anti-viral, esta A3G modificada teria de revelar

uma capacidade de se translocar para a proximidade da membrana celular para que posse

ser encapsidada nos novos viriões, todavia evitando o reconhecimento por parte da Vif. Esta

estratégia poderia ser dependente da ligação à porção da nucleocápside da poliproteína

Gag do vírus, a qual dificulta a ligação da Vif, ou por desfasamento temporal da localização

citoplasmática das duas proteínas, causado pelos diferentes tempos de semi-vida

característicos de cada uma. Sob esta hipótese, e através de estudos ex vivo, esta proteína

A3G modificada foi sujeita a análise quanto às seguintes propriedades: capacidade de

evasão à marcação para a degradação provocada pela Vif; encapsidação nos viriões

formados nas células produtoras e inibição da replicação viral nas células-alvo.

11

2. Materiais e Métodos

Os anticorpos utilizados para a detecção de proteínas em Western blot, bem como as

diluições usadas, estão sumarizados na Tabela 3 dos Anexos.

Os mapas dos plasmídios citados encontram-se na Figura 16 dos Anexos.

Na Tabela 4 dos Anexos encontra-se listada a composição de todas as soluções

referidas.

2.1. Clonagem

2.1.1. Extracção de DNA plasmídico em média escala por kit (midiprep)

Antes de mais, para começar o processo de clonagem foi necessário realizar a

extracção de DNA plasmídico clonado em bactérias, nomeadamente do vector de expressão

em células eucariotas pcDNA3.1/Zeo(+) (Invitrogen) que será utilizado na construção dos

clones; e do plasmídio contendo o gene humano da APOBEC3G (com o epitopo HA)

clonado em pcDNA3.1/Zeo(+) (abreviadamente: pcDNA3.1/Zeo(+)-A3G-HA) (AIDS

Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH), que irá servir de

DNA molde inicial. Ambos os plasmídios estão clonados numa estirpe de E.coli, TOP10F’

(Invitrogen) (genótipo: F'[lacIqTn10(TetR)] mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15

ΔlacX74 recA1 deoR nupG araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 λ-) e

devido à possibilidade de contaminação todos os procedimentos de manipulação de culturas

bacterianas foram realizados em condições de esterilidade. Para obter uma cultura crescida

destas bactérias transformadas com os plasmídios, foi realizado um inóculo de uma única

colónia em 250mL (média escala) de meio LB (líquido) com 100μg/mL de ampicilina (USB

Corporation) (resistência conferida pelo vector), com posterior incubação a 37ºC com

agitação a 225rpm, durante a noite. No dia seguinte, toda a cultura é sujeita a centrifugação

a 2400 x g durante 30 minutos e o sobrenadante desprezado, recolhendo-se assim o pellet

de células. A extracção é então efectuada recorrendo ao Jetstar 2.0 Plasmid Purification

MIDI Kit (Genomed), seguindo as instruções fornecidas pelo fabricante e todas as

indicações opcionais que permitem obter melhor resultados em termos de quantidade e

pureza do DNA obtido. O DNA foi eluído em água destilada, desionizada e autoclavada. A

quantificação do DNA foi efectuada através do espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo

Scientific), sendo posteriormente armazenado a -20ºC.

Para a preparação de um stock destas bactérias, foram necessários 5mL de uma

cultura crescida, a qual foi sujeita a centrifugação a 3500 x g durante 10 minutos, o

sobrenadante foi desprezado e o pellet ressuspenso em 1mL de uma solução de glicerol

10%(v/v). O stock ficou então armazenado a -80ºC.

Ma

teria

is e

Mé

todos

12

2.1.2. Reacção de polimerização em cadeia (PCR, Polymerase Chain Reaction)

O gene da proteína A3G de Homo sapiens clonado no vector pcDNA3.1/Zeo(+) e

contendo a sequência codificante do epitopo HA a jusante do gene, foi amplificado por PCR

utilizando o seguinte par de oligonucleótidos sintéticos: forward NotI-NLS-A3G-F (5’ – ATA

AGA ATG CGG CCG CTA AAC TAT ATG CCC AAG AAG AAG CGC AAG GTA GGA GGC

AAG CCT CAC TTC AGA AAC ACA GTG – 3’) produzido pela InvitrogenTM, e reverse HA-

XhoI-R (5’ – CCG CTC GAG CGG CTA AGC GTA GTC CGG AAC GTC G – 3’) produzido

pela Thermo Fisher Scientific. Estes oligonucleótidos iniciadores, além da amplificação,

permitem ainda a criação de sequências de reconhecimento de enzimas de restrição e a

introdução de uma sequência (que codifica o sinal de localização nuclear) que será

traduzida em fusão com o gene. Nesta reacção foi utilizada a polimerase de DNA Phusion

(Finnzymes) uma vez que esta enzima apresenta uma forte actividade de revisão de provas

e uma alta fidelidade, permitindo uma amplificação mais eficiente, com tempos de extensão

menores e mais produtiva. A mistura e as condições da reacção estão descritas na Tabela 1

dos Anexos.

Posteriormente, recorreu-se a electroforese em géis de agarose SeaKem LE

(Lonza) a 1% em tampão TAE 1X com 0,5μg/mL de brometo de etídio, para a visualização

do DNA obtido separado de acordo com o tamanho molecular (em pb). Para tal, adicionou-

se à reacção de PCR tampão de aplicação e esta foi aplicada no gel, assim como 5μL do

marcador de pesos moleculares (GeneRuler 1Kb DNA Ladder, 0,5µg/µL - Fermentas). A

electroforese da amostra e do marcador ocorreu em paralelo a uma voltagem de 0,5-

5,0V/cm em tampão TAE, até atingir o nível de resolução desejado, seguindo-se a

visualização do DNA através de luz ultravioleta utilizando o equipamento ChemiDoc (Bio-

Rad) que permitiu fotografar a imagem obtida.

Após confirmação que o produto deste PCR tem um tamanho semelhante ao gene da

A3G (~1200pb), este foi purificado através de electroforese em gel de agarose de

purificação SeaKem GTG (Lonza) a 1%, do volume total da reacção. O gel foi visualizado

num transiluminador, a banda de interesse foi extraída e o DNA purificado pelo Jetquick Gel

Extraction Spin Kit (Genomed) ou pelo Invisorb Spin DNA Extration Kit (Invitek).

Este DNA corresponde ao inserto que irá ser utilizado na clonagem pretendida, e para

simplificação, será designado doravante pela abreviatura NLS-A3G-HA. Após quantificação

no NanoDrop o DNA foi mantido a -20ºC.

2.1.3. Hidrólise enzimática de DNA

Para proceder à clonagem do inserto no vector de expressão utilizado

(pcDNA3.1/Zeo(+)) foi necessário realizar a digestão dos dois DNAs com enzimas de

Ma

teria

is e

Mé

todos

13

restrição, nomeadamente NotI e XhoI (Fermentas), as quais originam extremidades

coesivas, 5’P projectadas. Os locais de clivagem no vector e as sequências de

reconhecimento das enzimas estão esquematizados na Figura 16 e na Tabela 2 dos

Anexos, respectivamente. Em condições de digestão dupla (com as duas enzimas em

simultâneo) foi necessário utilizar 5U de NotI e 10U de XhoI por cada μg de DNA, em

tampão O (Fermentas) para que a actividade de cada enzima atingisse uma percentagem

de 100%. Assim, o volume total da reacção foi calculado tendo em conta o volume e a

quantidade de DNA da amostra de inserto purificado, de seguida foi feito o cálculo dos

volumes das enzimas necessários, adicionou-se o volume do tampão (10X) de modo a que

ficasse a 1X no volume final de reacção; para arredondar o valor final completou-se com

água destilada, desionizada e autoclavada. No caso do vector pcDNA3.1/Zeo(+), a digestão

foi realizada usando DNA em excesso (5μg). As reacções ocorreram durante a noite a 37ºC,

após a qual o volume total de cada reacção foi purificado por electroforese em gel de

agarose de purificação (como descrito em 2.1.2.), o DNA purificado por kit, quantificado no

NanoDrop e armazenado a -20ºC.

2.1.4. Reacção de ligação inserto-vector

Para ligar inserto e vector digeridos, utilizou-se a enzima ligase de DNA T4(New

England Biolabs) e o respectivo tampão (10X). A ligação foi efectuada em 3 diferentes

proporções de quantidade de DNA vector:inserto, preparadas em reacções distintas: 1:0, 1:1

e 1:3. A quantidade de vector utilizada foi de 60ng, sendo que a reacção 1:0 foi realizada

como controlo uma vez que não incluía DNA do inserto. A reacção com a proporção 1:1

continha igualmente 60ng de inserto, e a reacção 1:3 levou 3 vezes mais DNA do inserto

que do vector, ou seja, 180ng. As misturas de cada reacção foram preparadas utilizando o

volume necessário de DNA de vector e de inserto que correspondesse à quantidade

desejada; a estes foi adicionado 1μL de ligase (400000U/mL) e 1μL de tampão (de modo a

ficar 1X no volume final), e o volume das 3 reacções independentes foi acertado com água

destilada, desionizada e autoclavada, de forma a perfazer 10μL de volume final.

2.1.5. Preparação de bactérias electrocompetentes

Para clonar as construções efectuadas em bactérias TOP10F’, foi necessário torná-las

competentes por electroporação. Nesse sentido, foi preparado um pré-inóculo com uma

cultura de TOP10F’ de um stock armazenado a -80ºC em 10mL de meio SOB sem

antibiótico e foi incubado a 37ºC em agitação (225rpm) durante a noite. No dia seguinte,

5mL desse pré-inóculo foram inoculados em 500mL de meio SOB sem antibiótico e

incubados sob as mesmas condições até atingirem uma OD600 entre 0,5 e 0,6; nessa altura

a cultura foi colocada imediatamente em gelo para parar o crescimento. De seguida toda a

Ma

teria

is e

Mé

todos

14

cultura foi centrifugada a 2400 x g por 30 minutos a 4ºC, utilizando copos de centrífuga de

250mL frios, e desprezado o sobrenadante, tendo sido necessário repetir novamente este

passo até esgotar o volume total da cultura. O pellet de células foi ressuspenso em 50mL de

10%(v/v) de glicerol frio, através de movimentos circulares sobre gelo, e centrifugado a 2400

x g por 15 minutos a 4ºC, desprezando-se o sobrenadante de seguida. O último passo foi

repetido novamente, sendo que o pellet foi ressuspenso no glicerol residual, aliquotado em

tubos de 1,5mL com 40μL da suspensão e congelado de imediato através de azoto líquido,

ficando as células armazenadas a -80ºC.

2.1.6. Transformação de bactérias electrocompetentes

A competência destas células foi testada pela adição a um dos tubos preparados de

10pg do plasmídio pUC19 (Invitrogen), seguindo-se o protocolo de electroporação descrito a

seguir. Para além deste controlo, também foram transformadas a posteriori bactérias

competentes com o DNA das 3 reacções de ligação, adicionando para tal 2μL de cada

reacção aos tubos preparados com 40μL de bactéria, previamente descongelada em gelo.

As misturas de bactéria e plasmídio/ligação foram mantidas em gelo durante 15 minutos,

sendo que após esse tempo toda a cultura foi transferida para cuvettes e a electroporação

foi realizada a 1,8V e 200Ω num electroporador (Bio-Rad). A cada cuvette foram adicionados

500μL de meio SOC sem antibiótico e o volume total foi transferido para um tubo de

centrífuga de 15mL, que foi colocado sob incubação a 37ºC com agitação a 225rpm durante

1 hora. Este pré-inóculo, além de permitir o início (arranque) do crescimento da cultura mais

rápido, tem como objectivo permitir a expressão pela maquinaria celular do gene de

resistência à ampicilina existente no plasmídio controlo pUC19 e no vector pcDNA3.1/Zeo(+)

usado nas construções. Desta forma, após esta incubação, o volume total do pré-inóculo foi

plaqueado em meio LB agar (sólido) suplementado com 100μg/mL de ampicilina, e

novamente incubado a 37ºC, mas durante a noite (~16 horas). O aparecimento de colónias

na placa inoculada com bactérias transformadas com pUC19 revela um teste positivo à

competência das células.

2.1.7. Selecção e confirmação de colónias positivas para a clonagem

I) Selecção de colónias e extracção de DNA plasmídico em pequena escala sem kit

(lise alcalina)

Das placas correspondentes às proporções de ligação 1:1 e 1:3, seleccionaram-se no

total 7 colónias isoladas que foram inoculadas em 6mL de meio LB com 100μg/mL de

ampicilina, seguindo-se incubação a 37ºC com agitação a 225rpm durante a noite. Da

cultura obtida, 1,5mL foram utilizados para extracção do DNA plasmídico por lise alcalina

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para confirmar que a construção foi bem sucedida. Este protocolo é realizado em pequena

escala sem recurso a kit, e é utilizado nesta situação em que o DNA obtido não necessita

elevada pureza. Após obtenção do pellet de células por centrifugação a 2300g, 5 minutos, a

4ºC e desprezo do sobrenadante, este foi ressuspenso em 150μL de solução I contendo

100μg/mL de RNase, lisado com 200μL de solução II e agitado por inversão. Após 2 minutos

de incubação a temperatura ambiente, o lisado foi neutralizado por inversão com 150μL de

solução III (previamente arrefecida a -20ºC), incubado a -20ºC por 9 minutos, e centrifugado

durante 10 minutos, a 15700 x g. O sobrenadante obtido foi transferido para outro tubo de

1,5mL, centrifugado à mesma velocidade por 5 minutos, e novamente transferiu-se o

sobrenadante para novo tubo; a este adicionou-se 500μL de isopropanol e centrifugou-se a

15700 x g durante 15 minutos, para precipitar o DNA. O pellet obtido foi lavado com

70%(v/v) de etanol e centrifugado a 15700 x g por 5 minutos, com subsequente aspiração

do etanol e incubação a 37ºC durante 10 minutos para eliminação total do etanol. O DNA já

seco foi resssuspendo em água destilada, desionizada e autoclavada, quantificado no

NanoDrop e conservado a -20ºC.

II) Confirmação de clones positivos por hidrólise enzimática e electroforese em gel

O DNA plasmídico obtido foi então sujeito a hidrólise enzimática, utilizando 1μg de

DNA numa reacção com condições semelhantes às descritas em 2.1.3. O volume total da

reacção foi aplicado em gel de agarose a 1% e a electroforese decorreu como descrita em

2.1.2.; após visualização do gel no ChemiDoc a identificação de construções que

apresentavam duas bandas simultaneamente, correspondentes ao vector (~5000pb) e ao

gene da A3G (~1200kb), confirmou a existência de clones positivos.

III) Extracção de DNA plasmídico em pequena escala por kit (miniprep) e

sequenciação automática de DNA

A partir da cultura obtida no ponto I) acima, utilizaram-se os restantes 4,5mL para

extrair DNA dos clones que se confirmaram ser positivos, desta vez através dos kit Invisorb

Spin Plasmid Mini Two (Invitek) e JETQuick Plasmid Miniprep Spin Kit (Genomed), de forma

a recolher DNA com um elevado nível de pureza, tendo sido efectuadas todas as

recomendações fornecidas pelo fabricante nesse sentido. A eluição do DNA foi feita com

água destilada, desionizada e autoclavada, e após quantificação no NanoDrop foi

conservado a -20ºC. Mais tarde, uma alíquota foi sequenciada (Macrogen) para se poder

confirmar em máxima resolução que a clonagem efectuada foi bem sucedida. Os resultados

obtidos foram analisados recorrendo à aplicação Jellyfish v3.3.1.

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2.2. Expressão proteica

Os procedimentos realizados nos seguintes pontos 2.2.1., 2.2.2. e 2.3.1. foram

realizados sob condições de esterilidade numa câmara de fluxo vertical para assegurar o

correcto manuseamento das culturas celulares.

2.2.1. Linha celular – HEK 293T

Uma vez obtidos clones positivos, estes foram aferidos quanto à expressão da

proteína codificada em células eucariotas. Para esse efeito, recorreu-se à linha celular HEK

293T derivada de células embrionárias de rim humano (AIDS Research and Reference

Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH), as quais são células epiteliais que

apresentam crescimento em aderência. Estas células foram mantidas em cultura em meio

DMEM completo: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium - Lonza) suplementado com

10%(v/v) de soro fetal bovino (Thermo Scientific), 2mM L-glutamina (Lonza), 100U/mL de

penicilina (Lonza), 100µg/mL de estreptomicina (Lonza), 0,25μg/mL de anfotericina B

(fungizona) (Lonza). As células foram mantidas até 90% de confluência em frascos para

cultura celular de 75cm3 (Orange Scientific), a 37ºC numa estufa com atmosfera de 5% de

CO2, e foram utilizadas em ensaios até atingirem um máximo de 15 passagens.

2.2.2. Transfecção pelo método de fosfato de cálcio

Para iniciar o protocolo de transfecção, recorreu-se a uma cultura de células HEK

293T cultivadas num frasco de 75cm3 com uma confluência entre 70% a 90%. Após

contagem, foram semeadas 4 x 105 células por poço, em placas de 6 poços (34,5mm de

diâmetro dos poços – TPP, ou 34,7mm de diâmetro dos poços – Orange Scientific) e

mantidas na estufa. Cada poço de células semeadas foi usado na transfecção com DNA do

clone respectivo, tendo-se reservado mais dois poços que serviram de controlo positivo e

negativo: um que foi transfectado com o DNA do vector pcDNA3.1/Zeo(+) sem inserto, e

outro com DNA do plasmídio pcDNA3.1/Zeo(+)-A3G-HA.

No dia seguinte, após observação das células ao microscópio (confluência entre 50%

e 70%), foram preparados 2 microtubos por cada amostra de DNA a transfectar, referentes à

mistura A e à mistura B. A mistura A continha o volume correspondente a 5μg de DNA, 25μL

de CaCl2 a 2,5M, e tampão TE 0,1X até perfazer 250μL; a qual foi então adicionada, gota a

gota sob agitação no vortéx, à mistura B composta por 250μL de tampão HBS 2X. Esta

solução obtida, após incubação a temperatura ambiente durante 40 minutos, foi rapidamente

misturada no vórtex (10 segundos) e aplicada gota a gota sobre a camada de células

aderentes ao fundo do poço respectivo, de forma a distribuir homogeneamente o precipitado

de pequenas partículas escuras visíveis ao microscópio. Durante os dois dias seguintes as

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células permaneceram sob incubação na estufa, tendo sido substituído o meio de cultura 24

horas após transfecção por novo meio DMEM completo previamente aquecido a 37ºC.

2.2.3. Extracção e quantificação de proteínas

Ao fim de 48 horas após a transfecção, o meio foi retirado e as células foram

recolhidas por ressuspensão em 1mL de tampão PBS 1X frio, transferidas para um

microtubo de 1,5mL e centrifugadas a 200 x g 5 minutos a 4ºC. Depois de desprezado o

sobrenadante, o pellet foi ressuspenso em 200μL de tampão de lise e passados 30 minutos

de incubação em gelo centrifugou-se a 15700 x g durante 5 minutos. O sobrenadante foi

recolhido para novo tubo de 1,5mL e armazenado a -80ºC.

A quantificação de proteínas dos extractos celulares foi efectuada recorrendo ao

método de Bradford utilizando o reagente Bio-Rad protein assay (Bio-Rad), seguido as

indicações do fabricante, num espectrofotómetro Infinite M200 (Tecan). As amostras foram

normalizadas e o volume correspondente a 50μg de proteína total foi aliquotado para novo

tubo, ao qual se adicionou tampão de aplicação 5X (de forma a ficar 1X no volume final),

seguindo-se a desnaturação durante 5 minutos a 95ºC e armazenamento a -20ºC.

2.2.4. Separação de proteínas por electroforese em gel de poliacrilamida com

dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)

Para separar as proteínas extraídas das células de acordo com o tamanho molecular

(em kDa), aplicaram-se as amostras desnaturadas e 5μL de marcador de pesos moleculares

(PageRuler Prestained Protein Ladder – Fermentas) num gel de poliacrilamida formado por

uma fase de gel de concentração a 4% seguido de uma fase de gel de resolução a 10%

(com espessura de 1,5mm), conforme as indicações do fabricante (National Diagnostics). A

electroforese das amostras e do marcador decorreu em paralelo, através do sistema Mini-

PROTEAN Tetra cell (Bio-Rad) no qual os mini-géis ficaram verticalmente imersos em

tampão de corrida frio, a uma voltagem constante inicial de 100V e de 120V uma vez as

amostras já se encontrassem no gel de resolução, até ao nível de resolução pretendido.

2.2.5. Western blot

Após a electroforese de separação, as proteínas foram transferidas do gel para uma

membrana de nitrocelulose (Hybond ECL - Amersham Biosciences). A transferência

decorreu a uma amperagem constante de 250mA durante 2 horas, e através do sistema

Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad), onde o gel e a membrana ficaram submersos em tampão de

transferência frio juntamente com um bloco de gel congelado. Depois, a membrana foi

incubada rapidamente em reagente de Ponceau S Solution (Sigma Aldrich) pois este marca

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todas as proteínas de uma forma não-específica e dessa forma foi possível confirmar o

sucesso da separação das proteínas e da transferência. Após lavagem da membrana com

tampão TBS-T (Tween 20 – VWR) para eliminar vestígios de Ponceau, esta ficou a 4ºC

durante a noite a bloquear em solução de 5%(p/v) de leite magro em pó em TBS-T.

No dia seguinte, a membrana foi incubada durante 1 hora a temperatura ambiente com

uma diluição do anticorpo α-HA conjugado com a enzima peroxidase de rábano selvagem

(HRP - horseradish peroxidase), lavada durante 10 minutos com TBS-T e repetindo a

lavagem 4 vezes com novo TBS-T. Depois, a membrana foi incubada com um reagente de

detecção da actividade da HRP (ECL Plus – Amersham Biosciences, ou Immobilon Western

– Millipore) de acordo com as indicações do fabricante, permitindo a detecção rápida de

sinal emitido por quimioluminescência por exposição da membrana a uma película

fotográfica (Hyperfilm ECL - Amersham Biosciences) durante cerca de 15 minutos, sendo

seguidamente revelada e fixada.

A proteína de expressão constitutiva GAPDH (37kDa) foi escolhida como controlo

endógeno ara normalizara a quantidade de células presente em cada amostra. Para a sua

detecção, a membrana ficou a incubar a 4ºC durante a noite com uma solução de anticorpo

primário α-GAPDH diluído, no dia seguinte foi lavada durante 5 x 10 minutos com TBS-T, e

incubada com uma diluição do anticorpo secundário α-ratinho, que se liga ao anticorpo α-

GAPDH. Posteriormente a mais uma série de lavagens (5 x 10 minutos), foi novamente

impressionada uma película fotográfica à membrana, como descrito no parágrafo anterior.

Ao longo do decorrer do trabalho prático, devido os resultados obtidos, surgiu a

necessidade de recorrer a mais técnicas para avaliar a expressão proteica:

2.2.6. Extracção diferencial de proteínas do citosol e do núcleo

Foi realizado todo o procedimento descrito em 2.2.2., com as seguintes alterações: o

número de células semeadas foi de 3 x 106, uma vez que se utilizaram caixas de Petri

(100mm de diâmetro – Orange Scientific) em vez de placas de 6 poços; por esse motivo a

quantidade de DNA utilizada foi de 20μg.

Após 48h pós-transfecção, retirou-se o meio de cultura e as células foram lavadas com

1mL de PBS 1X frio duas vezes, na segunda lavagem as células foram ressuspensas,

recolhidas para um microtubo de 1,5mL e centrifugadas a 100 x g durante 5 minutos a 4ºC,

desprezando-se o sobrenadante. O pellet de células foi ressuspenso em 300μL de tampão

de lise de citosol completo e depois de centrifugado a 3000 x g, 4 minutos a 4ºC, o

sobrenadante contendo as proteínas do citosol foi recolhido para novo tubo e armazenado a

-80ºC. O pellet foi lavado novamente com 300μL de tampão de lise de citosol completo,

centrifugado a 3000 x g, 4 minutos a 4ºC, e o sobrenadante desprezado, para eliminar por

completo as proteínas do citosol. Seguiram-se 3 lavagens do pellet com 1mL de PBS 1X e

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centrifugação a igual velocidade, duração e temperatura. Posteriormente adicionaram-se

30μL de tampão de lise de núcleos completo, mantiveram-se as amostras em gelo durante

20 a 25 minutos e agitaram-se os tubos 3 vezes no vórtex durante período de tempo.

Centrifugaram-se os tubos a 10000 x g durante 10 minutos, a 4ºC, e o sobrenadante

contendo as proteínas do núcleo foi recolhido para novo tubo e armazenado a -80ºC. De

seguida os extractos foram quantificados e as proteínas analizadas por SDS-PAGE e

Western blot como descrito nos pontos 2.2.3., 2.2.4. e 2.2.5. Adicionalmente à proteína

GAPDH detectada conforme descrito em 2.2.5., foi detectada ainda a proteína PARP,

utilizada como controlo da completa separação dos extractos do citosol e do núcleo. A

porção nuclear desta proteína (PARP-1) foi detectada com soluções diluídas do anticorpo

primário α-PARP e do anticorpo secundário α-coelho, incubados de forma semelhante à

descrita para os anticorpos α-GAPDH e α-ratinho, respectivamente.

2.2.7. Transcrição e Tradução in vitro e Imuno-precipitação (IP)

A reacção de transcrição e tradução in vitro foi realizado através do kit TnT® T7 Quick

Coupled Transcription/Translation System (Promega), seguindo as instruções do fabricante.

Em complemento desta reacção, as amostras resultantes, correspondentes a cada

clone e ao controlo positivo, foram sujeitas a uma imunoprecipitação das proteínas NLS-

A3G-HA construídas. Ao volume total da reacção (50µL) foram adicionados 800μL de

tampão de IP frio e as amostras foram misturadas por inversão num girador de tubos,

durante 20 minutos. Então os lisados foram centrifugados a 15700 x g durante 5 minutos, a

4ºC, e o sobredanante transferido para um novo tubo. Uma pequena amostra (50μL) foi

recolhida do lisado, para servir como controlo de aplicação. Para realizar uma pré-limpeza

dos detritos celulares, foram adicionados 10μL de beads de agarose conjugadas com o

anticorpo α-proteína A (n Protein A Sepharose 4 Fast Flow, Immunoprecipitation Starter

Pack - GE Healthcare) e misturados pelo mesmo método durante 20 minutos. Após

centrifugação 1 minuto a 15700 x g a 4ºC, os sobrenadantes foram recolhidos para novos

tubos. Para imunoprecipitar a proteína de interesse, foram adicionados 20μL de matriz de

beads de agarose conjugadas com o anticorpo α-HA(HRP) (anti-HA affinity matrix - Roche) e

as amostras foram misturadas por inversão no girador durante a noite. No dia seguinte, após

centrifugação 1 minuto a 15700 x g, o sobrenadante foi recolhido para novos tubos,

representando a amostra que foi imunodelectada. O pellet de beads foi lavado 3 vezes com

800μL de tampão de IP, centrifugado nas condições já descritas e desprezado o

sobrenadante. Finalmente, as beads foram fervidas a 95ºC com tampão de aplicação 5X na

quantidade necessária para ficar a 1X no volume final, e armazenadas a -20ºC para

posteriormente serem analizadas por SDS-PAGE e Western blot, tal como as alíquotas de

controlo de aplicação, como descrito em 2.2.4. e 2.2.5.

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2.3. Análise da função proteica em células eucariotas

2.3.1. Ensaio de degradação dos clones NLS-A3G

O protocolo de co-transfecção pelo método de fostato de cálcio utilizado

corresponde ao protocolo de transfecção já descrito em 2.2.2., apenas com alterações no

que diz respeito ao DNA transfectado. Assim, cada poço plaqueado com células HEK 293T

foi usado na co-transfecção com uma mistura do DNA do respectivo clone e do DNA do

plasmídio com o gene vif clonado em pcDNA3.1/Zeo(+) (abreviadamente: pcDNA3.1/Zeo(+)-

vif). Para além destes poços, reservaram-se mais três poços com as seguintes misturas de

DNA: plasmídios pcDNA3.1/Zeo(+)-A3G-HA e pcDNA3.1/Zeo(+)-vif; plasmídio

pcDNA3.1/Zeo(+)-vif com vector pcDNA3.1/Zeo(+) sem inserto; e plasmídio

pcDNA3.1/Zeo(+)-A3G-HA com vector pcDNA3.1/Zeo(+) sem inserto. A mistura A continha o

volume correspondente a 1μg de DNA dos clones ou do plasmídio pcDNA3.1/Zeo(+)-A3G-

HA, adicionado ao volume correspondente a 4μg de DNA do plasmídio pcDNA3.1/Zeo(+)-vif,

e ainda DNA do vector pcDNA3.1/Zeo(+) nos casos em que foi preciso completar a

quantidade de DNA total para 5μg. As proteínas produzidas foram extraídas e analizadas

por SDS-PAGE e Western blot como descrito em 2.2.3., 2.2.4. e 2.2.5.

2.3.2. Ensaio de infecciosidade do HIV-1 na presença de NLS-A3G

Por questões de segurança, os procedimentos realizados na seguinte alínea II), e os

que envolvem o manuseamento de amostras infectadas até ocorrência de lise descritos

alíneas nas III) e IV) deste ponto, foram realizados num laboratório de contenção biológica

de nível 3 sob condições de esterilidade numa câmara de fluxo vertical, para assegurar

ainda o correcto manuseamento das culturas celulares.

I) Extracção de DNA plasmídico em média escala por kit (midiprep)

Para realizar este ensaio foi necessário primeiro obter o genoma do vírus HIV-1 para

conseguir produzir partículas virais infecciosas. O plasmídio contendo o DNA da estirpe

NL4-3 com o gene vif delectado (pNL4-3Δvif - AIDS Research and Reference Reagent

Program, Division of AIDS, NIAID, NIH) foi utilizado com esse intuito, assim como o

plasmídio pHEF-VSV-G (AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS,

NIAID, NIH) que codifica para a glicoproteína G do vírus da estomatite vesicular, a qual é

incorporada na partícula viral e facilita a fusão do invólucro viral com a célula hospedeira.

Ambos plasmídios encontram-se clonados numa estirpe de E. coli, JM109 (New England

Biolabs) (genótipo: F´traD36 proA+B+ lacIq Δ(lacZ)M15/ Δ(lac-proAB) glnV44 e14– gyrA96

recA1 relA1 endA1 thi hsdR17). A extracção do DNA plasmídico foi realizada em média

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escala por kit como descrito em 2.1.1., assim como a preparação de um stock, com a

excepção que a cultura bacteriana foi incubada a 30ºC e não a 37ºC.

II) Co-transfecção, produção e concentração das partículas virais

Células HEK 293T foram novamente co-transfectadas como descrito em 2.3.1., com

duas diferenças: a cada mistura A foram adicionados os volumes correspondentes a 2μg do

plasmídio pNL4-3Δvif e a 0,4μg do plasmídio pHEF-VSV-G; e as quantidades de DNA

referidas em 2.3.1. foram alteradas para 0,5μg de DNA dos clones/plasmídio

pcDNA3.1/Zeo(+)-A3G-HA, 3μg do DNA do plasmídio pcDNA3.1/Zeo(+)-vif, e a quantidade

de DNA total de 5,9μg foi completada quando necessário com DNA do vector

pcDNA3.1/Zeo(+). Cada co-transfecção foi produzida em dois poços-réplica.

Dois dias após a co-transfecção não foram as células mas sim o meio de cultura que

continha os vírus produzidos que foi recolhido para tubos de centrífuga de 15mL, de forma a

juntar o meio dos poços duplicados. Depois de centrifugado durante 5 minutos a 200 x g o

sobrenadante foi recolhido para novo tubo, de forma a garantir a exclusão de células ou

detritos, e deste foram separados 100μL para um microtubo de 1,5mL que foram

quantificados através de um ensaio imunosorvente ligado a enzima (ELISA, enzyme linked

immuno sorbent assay) (descrito na alínea III) desde ponto), 2mL foram usados para

ultracentrifugar os vírus e o restante foi armazenado durante a noite a 4ºC. Os 2mL

recolhidos para concentrar as partículas virais produzidas foram centrifugados numa

ultracentrífuga Beckman a 50000rpm durante 1 hora a 4ºC, com 500μL de uma solução de

sacarose a 20% como gradiente. Após se ter desprezado o sobrenadante, o pellet de vírus

foi ressuspenso em 30μL de tampão de aplicação 5X, transferido para um microtubo de

1,5mL e analizado por SDS-PAGE e Western blot como descrito em 2.2.4. e 2.2.5.

III) Quantificação de partículas virais por ELISA

As partículas virais presentes na alíquota de sobrenadante foram quantificadas

recorrendo ao HIV-1 p24CA Antigen Capture Assay Kit (AIDS & Cancer Virus Program of the

NAtional Cancer Institute Frederick Cancer Research), através do qual é realizado uma

ELISA contra o antigénio p24. Foram seguidas as instruções do fabricante com as seguintes

excepções: o tampão de lavagem usado foi 0,05%(v/v) de Tween20 em PBS 1X; as

soluções de diluição das amostras e dos anticorpos utilizadas foram 1%(p/v) de albumin de

soro bovino (BSA, bovine serum albumin) em PBS 1X, e 3%(p/v) BSA em tampão PBS 1X,

respectivamente, e não as indicadas; a placa não foi lavada com tampão de lavagem antes

da colocação das amostras como indicado, nem as lavagens posteriores foram realizadas

num aparelho automático, mas sim manualmente com 5 x 200μL de tampão de lavagem e

recorrendo a uma micropipeta multi-canal; as amostras standard não foram aplicadas na

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placa em duplicado, apenas uma vez; as amostras apenas foram lisadas após terem sido

adicionadas à placa, e por esse motivo a incubação subsequente decorreu por um período

de 3 horas. A cada pg de p24 obtida correspondem 10 unidades de transdução (TU,

transduction units).

IV) Linha celular – TZM-bl, infecção e quantificação da infecciosidade viral por CPRG

A linha celular utilizada para testar a infecciosidade das partículas virais produzidas

designa-se TZM-bl, é uma linha de células HeLa derivada de carcinoma cervical (AIDS

Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH), que tal como as

HEK 293T são células humanas epiteliais que apresentam crescimento em aderência. Para

além disso, expressam elevados níveis de CD4 e CCR5, o que as torna boas candidatas a

células-alvo para infecção por HIV-1, e permitem uma análise simples e quantitativa do HIV

por expressarem os genes repórteres da luciferase e da β-galactosidase sob o controlo de

uma longa repetição terminal (LTR, long terminal repeat) do vírus. Estas células foram

mantidas em cultura nas mesmas condições que as HEK 293T descritas em 2.2.1.

No dia de recolha dos sobrenadantes (48 horas pós-transfecção) contendo as

partículas virais produzidas, recorreu-se a uma cultura de células TZM-bl cultivadas num

frasco de 75cm3 com uma confluência entre 70% a 90%, e após contagem, semearam-se 1

x 104 células por poço, em placas de 96 poços (6,9mm de diâmetro dos poços – Orange

Scientific) e foram mantidas na estufa. No dia seguinte, como ocorreu duplicação do número

de células em cada poço, estas foram infectadas com igual número (20000) de unidades de

transdução (TU), para que dessa forma o rácio entre partículas virais infecciosas e células,

que se designa por multiplicidade de infecção (m.o.i., multiplicity of infection), fosse igual a 1.

Após a quantificação das partículas virais, o meio de cultura das células plaqueadas

foi substituído pela quantidade calculada de sobrenadante (armazenado a 4ºC) e meio

DMEM completo novo de forma a completar um volume final de 200μL por poço. Durante os

dois dias seguintes as células permaneceram sob incubação na estufa, tendo sido

substituído o meio de cultura 3 horas após infecção por novo meio DMEM completo

previamente aquecido a 37ºC.

Ao fim de 48 horas após a infecção, o meio foi retirado e as células foram lavadas com

200μL de PBS 1X, e de seguida foram adicionados 100μL de tampão de lise do CPRG a

cada poço. A placa foi envolvida em papel de prata e colocada a -80ºC durante 40 minutos,

seguindo-se a incubação a 37ºC até descongelar (cerca de 30 minutos) e repetiu-se a

congelação/descongelação novamente. Então, adicionou-se a cada poço 100μL de uma

diluição de 6mM de CPRG em tampão de lise, e a placa foi novamente incubada a 37ºC

durante 1 hora. A leitura foi feita no espectrofotómetro Infinite M200 a 550nm com 620nm de

referência.

23

3. Resultados

3.1. Produção de clones pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA

A reacção de amplificação por PCR do gene humano de A3G permitiu a adição, a

montante e a jusante deste gene, das sequências codificantes do sinal de localização

nuclear NLS (PKKKRKV) e do epitopo HA (YPYDVPDYA), respectivamente. A sequência

NLS é responsável por encaminhar a proteína traduzida para o compartimento nuclear,

enquanto o epitopo HA, por sua vez, é utilizado para permitir a detecção imunológica da

proteína através de um anticorpo específico. Locais de clivagem para as enzimas de

restrição NotI e XhoI também foram adicionados, respectivamente, a 5’ da sequência de

NLS e a 3’ da sequência de HA (Figura 16 dos Anexos). Após hidrólise enzimática com as

enzimas NotI e XhoI do inserto e do vector de expressão pcDNA3.1/Zeo(+), ligação

vector:inserto e transformação da construção em bactérias electrocompetentes, obtiveram-

se colónias de bactérias TOP10F’ resistentes à marca de selecção (ampicilina) fornecida

pelo vector. Do total obtido, seleccionaram-se sete colónias isoladas e com crescimento

uniforme, extraiu-se o DNA plasmídico por lise alcalina e após hidrólise com as enzimas NotI

e XhoI observou-se o DNA por electroforese em gel de agarose. Este permitiu detectar, em

quatro dos clones escolhidos, a presença de duas bandas distintas, uma com o tamanho

aproximado do vector pcDNA3.1/Zeo(+) (~5000pb) e outra com tamanho correspondente ao

gene humano da A3G (~1200pb). (Figura 8), Estes clones (#2, #4, #5 e #6) foram então

classificados de positivos, por se ter comprovado o sucesso da construção. Mais tarde (após

os ensaios de expressão e de degradação) a análise das

sequências nucleotídicas, obtidas por sequenciação

automática, revelou que o clone #5 apresentava algumas

mutações pontuais em relação ao gene da A3G e que não

se observavam nos outros clones, pelo que este foi

desconsiderado para os ensaios de infecciosidade

realizados posteriormente.

3.2. A expressão dos clones pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA resulta

em proteínas menores que o esperado

O DNA dos quatro clones positivos pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA foi expresso em

células HEK 293T, por transfecção pelo método de fosfato de cálcio, bem como o DNA dos

controlos negativo e positivo (pcDNA3.1/Zeo(+) e pcDNA3.1/Zeo(+)-A3G-HA, respectiva-

mente).Os extractos proteicos totais foram analisados por SDS-PAGE seguida de Western

~ 5000pb

~ 1200pb

Figura 8 | Obtenção de quatro clones

positivos. Visualização por electroforese em

gel de agarose dos clones que apresentam

as bandas correspondentes ao vector

pcDNA3.1/Zeo(+) e ao inserto NLS-A3G-HA.

Resultados

24

blot, e após três réplicas o resultado manteve-se:

as proteínas codificadas pelo clones apresentam

um tamanho menor (menos ~5kDa) que a do

controlo positivo (46kDa) (Figura 9). No entanto,

em alguns dos clones como é o caso do #5, é

possível visualizar uma banda com tamanho

superior muito semelhante ao tamanho da

proteína expressa pelo controlo (ver seta ).

Este resultado poderá demonstrar que as proteínas dos clones sofrem algum tipo de

clivagem, à qual a proteína selvagem não está sujeita; no clone #5 essa clivagem poderá

não ter ocorrido em todas as moléculas de NLS-A3G-HA existentes nas células e por isso é

detectada um pequeno número de moléculas com tamanho semelhante à A3G-HA.

Sabendo que, teoricamente, a diferença entre os clones e o plasmídio pcDNA3.1/Zeo(+)-

A3G-HA, reside apenas na sequência que codifica para a porção NLS, parece claro que

esta sequência seja a responsável pela redução no tamanho das proteínas expressas.

Pensa-se que, por algum motivo não identificado, a sequência-sinal NLS, juntamente com

uma porção da extremidade N-terminal da A3G, são removidas da proteína sintetizada,

possivelmente por mecanismos envolvidos na exclusão do núcleo. Outros ensaios de

expressão foram tentados no sentido de compreender a origem desta diferença de tamanho.

3.3. A proteína NLS-A3G-HA é mantida no citoplasma da célula

Para analisar a capacidade da sequência NLS em exercer a função de encaminhamento

para o núcleo das proteínas construídas, estas foram expressas novamente em células HEK

193T, no entanto, o extracto proteico foi recolhido com separação diferencial das proteínas

do citosol e do núcleo, para se poder analisar qual a sua localização dentro da célula. Nas

duas réplicas deste ensaio, após separação em SDS-PAGE e análise por Western blot, foi

possível verificar que as proteínas produzidas se encontravam exclusivamente no

citoplasma (Figura 10). De notar que neste caso é possível distinguir com clareza em todos

os clones uma forma de NLS-A3G-

HA com um tamanho muito

próximo do da proteína do controlo

positivo, assim como a forma mais

pequena (41kDa) já detectada

anteriormente. A acrescentar, é

detectada uma outra proteína

ainda mais pequena (~36kDa) Figura 10 | Localização citoplasmática de NLS-A3G-HA. Detecção por

Western blot da localização sub-celular das proteínas clonadas em células

HEK 293T, por extracção diferencial de proteínas do núcleo e do citosol.

Figura 9 | Expressão de NLS-A3G-HA em células

HEK 293T. Visualização por Western blot da expressão

das proteínas codificadas pelos quatro clones

pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA.

α-HA

α-GAPDH

46 kDa

37kDa

α-HA 46 kDa

α-PARP

α-GAPDH

116 kDa

37 kDa

Resultados

25

resultante da clivagem de uma porção maior da extremidade N-terminal das proteínas

construídas. Verificou-se assim que a sequência NLS não era capaz de realizar o seu efeito

sinalizador, ou que, após o transporte, a NLS-A3G-HA seria novamente transportada para o

citoplasma por um outro mecanismo, envolvendo possivelmente a clivagem da sequência

NLS e de parte da extremidade N-terminal da A3G.

3.4. A localização celular não influencia o tamanho da NLS-A3G-HA

No sentido de tentar descortinar

o fenómeno que envolve a clivagem

da porção N-terminal das proteínas

construídas, foi realizado um outro

ensaio de expressão. Desta vez, as

construções foram analisadas fora do

contexto celular, através de uma

reacção de transcrição e tradução in

vitro, que utiliza o DNA dos clones

como molde. Após a reacção, o extracto proteico obtido foi purificado através de uma IP

com beads de agarose conjugadas com anticorpo α-HA(HRP). Novamente os extractos

foram analisados por SDS-PAGE e Western blot, sendo que os resultados obtidos não

permitiram tirar novas conclusões: manteve-se a diferença de tamanho entre proteínas

codificadas pelos clones (~41KDa) e a proteína usada como controlo positivo (46KDa)

(Figura 11). Neste ensaio já não foram detectadas bandas superiores com tamanho muito

semelhante ao da A3G-HA, mas verificaram-se novamente as proteínas mais pequenas de

36kDa anteriormente detectadas no ensaio de separação de extractos do núcleo e do

citosol. Surpreendentemente, também foi possível visualizar uma versão truncada da

proteína A3G-HA usada como controlo positivo, com sensivelmente a mesma diferença de

tamanho (~5kDa) verificada nas proteínas NLS-A3G-HA. No entanto, esta proteína de

menor tamanho apenas é visualizada após a IP, o que indica que os seus níveis celulares

são muito baixos. Este resultado, embora corresponda apenas a um ensaio, representa um

forte indício que a clivagem que ocorre nas proteínas construídas não é devida à entrada

e/ou saída do núcleo das proteínas construídas, uma vez que mesmo quando os

compartimentos celulares não estão presentes esta degradação se mantém.

3.5. A Vif do HIV-1 consegue induzir a degradação da NLS-A3G-HÁ

Apesar da redução no tamanho verificado em todas as proteínas codificadas pelos clones

pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA, estas foram testadas no sentido de averiguar se

Figura 11 | Expressão de NLS-A3G-HA in vitro. Visualização por

Western blot das proteínas codificadas pelos clones pcDNA3.1/Zeo(+)-

NLS-A3G-HA, produzidas através de uma reacção de transcrição e

tradução in vitro e purificadas (ou não, no caso dos controlos) por IP.

Imunoprecipitados Controlos

α-HA 46 kDa

Resultados

26

mantinham a capacidade de

interacção com a proteína Vif

do HIV-1, e se consequente-

mente eram degradadas pelos

proteossomas celulares. Para

tal, o DNA dos clones foi co-

transfectado com o DNA do

plasmídio pcDNA3.1/Zeo(+)-vif

em células HEK 293T e os extractos proteicos separados em gel de poliacrilamida. A análise

por Western blot nas duas réplicas deste ensaio permitiu detectar uma diminuição da

quantidade de NLS-A3G-HA na presença da proteína Vif, em comparação com a proteína

expressa na ausência de Vif (Figura 12). Mais uma vez, são visíveis os dois tipos de

proteínas truncadas que sofreram clivagem por um processo ainda não desvendado. É de

salientar que as proteínas com cerca de 41kDa são altamente sensíveis à degradação,

principalmente no caso dos clones #5 e #6, em que a expressão de NLS-A3G-HA é

significativamente diminuída para valores muito baixos ou indetectáveis. As proteínas com

tamanho aproximado de 36kDa, por seu lado, aparentam ser ligeiramente menos sensíveis

à Vif. Estes resultados demonstram que estas proteínas conseguiram interagir de forma

eficiente com a proteína viral, a qual induziu a sua destruição. Curiosamente, neste ensaio a

versão truncada da proteína produzida pelo controlo positivo apenas surge na presença de

Vif, e não quando o controlo positivo é transfectado isoladamente, o que também

permanece por justificar.

3.6. A proteína NLS-A3G-HA é encapsidada nos novos viriões

Após se demonstrar que a proteína NLS-A3G-HA é sensível à indução para degradação

pela proteína Vif, surgiu a necessidade de averiguar se, tal como a desaminase selvagem, a

proteína construída é ou não encapsidada nas novas partículas virais de NL4-3(Δvif)

produzidas em células HEK 293T. A produção dos viriões foi conseguida pela co-

transfecção de pNL4-3(Δvif) (e de pHEF-VSV-G) com o DNA dos clones que codificam as

proteínas que codificam as proteínas

NLS-A3G-HA e do DNA do plasmídio

pcDNA3.1/Zeo(+)-vif, assim como de

vários controlos. Após concentração e

lise dos viriões produzidos, os

extractos totais foram separados por

electroforese em SDS-PAGE, e por

α-HA 46 kDa

Figura 13 | Encapsidação de NLS-A3G-HA nos viriões produzidos.

Demonstração por Western blot da encapsidação das proteínas

codificadas pelos clones nas partículas virais produzidas em células

HEK 293T, tanto na ausência como na presença de Vif.

Figura 12 | Degradação de NLS-A3G-HA induzida pela proteína viral Vif.

Detecção por Western blot da degradação das proteínas clonadas na presença

de Vif, em células HEK 293T.

α-HA 46 kDa

α-GAPDH 37 kDa

pcDNA3.1/Zeo(+)-vif – – – – + + + + + + – –

pNL4-3(Δvif) + + + + + + + + + –

pcDNA3.1/Zeo(+)-vif – – – + + + + + – –

Resultados

27

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Ab

s (

55

0n

m)

Figura 14 | Inibição da infecção por NLS-A3G-HA. Níveis de

infecciosidade viral em células Tzm-BL por viriões NL4-3(Δvif), produzidos

em células HEK 293T. Valores representados correspondem a três

réplicas simultâneas.

Western blot foi possível visualizar que a NLS-A3G-HA é encapsidada tanto na ausência

como na presença de Vif (Figura 13). Aqui apenas a versão truncada de NLS-A3G-HA com

41kDa é observada nas amostras correspondentes aos clones. Porém, em relação ao clone

#6 é notória uma diminuição da quantidade de desaminase encapsidada quando a Vif está

presente, mas esta diferença pode não ser significativa uma vez que a quantidade de viriões

em cada amostra não foi normalizada e este ensaio apenas foi realizado uma vez. Mesmo

assim, é de notar que este clone foi o que demonstrou uma maior sensibilidade à

degradação induzida pela Vif (Figura 12), embora a sequenciação automática tenha

excluído qualquer diferença na sequência dos três clones #2, #4 e #6, pelo que esta

variação considerável na sensibilidade à inibição pela Vif continua por esclarecer.

3.7. A infecção viral é inibida pela NLS-A3G

Por último, foi aferida a actividade

anti-viral da proteína NLS-A3G-HA.

Após a produção de viriões de NL4-

3(Δvif), estes foram utilizados para

infectar células Tzm-BL e a

infecciosidade viral foi medida

através da degradação do substrato

CPRG pela enzima β-galactosidase,

expressa por esta linha celular na

ocorrência de produção viral. Os

resultados obtidos revelam que os

viriões produzidos na ausência de Vif não são infecciosos, pois a infecção é abolida pela

actividade anti-viral das proteínas NLS-A3G-HA (Figura 14). Quando a Vif está presente na

célula produtora, esta consegue contrabalançar o efeito anti-viral das proteínas construídas,

atingindo-se assim valores de infecção tão elevados quanto os obtidos na ausência da

desaminase, embora continue por justificar a razão pela qual se observam variações tão

grandes na capacidade de inibição dos três clones. Aliás, quando estão presentes as

proteínas dos clones, a inibição na ausência de Vif é ainda mais potente do que a verificada

aquando da produção viral na presença de A3G-HA do controlo positivo. Em contra-partida,

os níveis de infecção com partículas produzidas na presença das proteínas dos clones e de

Vif são ainda maiores do que quando a produção ocorre em células que expressam A3G-HA

e a proteína viral. Estes resultados demonstram que seria necessário repetir várias vezes

este ensaio no sentido de garantir com certeza os resultados e as assumpções que deles

provêm.

pNL4-3(Δvif) + + + + + + + + + + –

pcDNA3.1/Zeo(+)-vif – – – + + + + – + – –

28

4. Discussão dos resultados e Conclusões

Com este trabalho pretendeu-se modificar a proteína A3G para que esta fosse capaz

de manter uma localização nuclear no contexto celular, de forma a evitar a acção da

proteína viral Vif que decorre no citoplasma e que culmina na degradação proteossomal da

desaminase celular. Neste sentido, foram desenvolvidas construções que visavam a

produção de uma proteína A3G, contendo uma sequência-sinal NLS, capaz de ser expressa

numa linha celular humana caracterizada por um fenótipo permissivo – células HEK 293T.

Contudo, os resultados obtidos não corresponderam totalmente ao esperado: esta

proteína expressa é sujeita a modificações pós-traducionais que modificam a sua

sensibilidade à Vif e a sua capacidade de inibir a infecção nas próximas células-alvo, para

além de impedirem a sub-localização nuclear desejada. De facto, os resultados apontam

para a ocorrência de uma clivagem a nível da extremidade N-terminal da proteína, que para

além de remover a sequência NLS também elimina alguns aminoácidos dessa extremidade

(Figuras 9, 10 e 11). Esta clivagem parece ocorrer à priori do transporte para o núcleo, uma

vez que num contexto in vitro esta restrição é conservada (Figura 11), podendo-se

extrapolar que esta degradação parcial é efectuada por um (ou mais) factor(es)

citoplasmático(s). É possível ainda afirmar que esta clivagem terá de ocorrer por um (ou

mais) mecanismo(s) que permite(m) o reconhecimento de duas localizações distintas da

sequência da A3G, uma mais externa e outra mais interna, de forma a originar as duas

versões truncadas detectadas (com 41kDa e com 36kDa, respectivamente).

Esta hipótese de exclusão do núcleo já tinha sido mostrada por outros autores

(Bennett et al., 2006 e Bennett et al., 2008), que no entanto não verificaram qualquer

clivagem ou degradação da proteína, embora os estudos efectuados não visassem a análise

do tamanho das proteínas construídas mas sim a identificação da sub-localização celular

por métodos de fluorescência. Segundo esta publicação, este facto deve-se à presença de

uma sequência com forte poder de retenção citoplasmática (localizada entre os aminoácidos

113 e 128), que mesmo na presença de uma sequência localizadora do núcleo, tem a

capacidade de sobrepor o seu efeito e anular o sinal NLS.

Não obstante, uma outra forma de justificar a manutenção da localização

citoplasmática pode corroborar a hipótese de trabalho proposta. Esta supõe que a proteína

A3G modificada é capaz de se translocar para a proximidade da membrana celular de forma

a ser encapsidada nos novos viriões, conseguindo evitar a ligação à Vif por ligação à

poliproteína Gag ou por desfasamento temporal dos níveis citoplasmáticos das duas

proteínas. No entanto, outros estudos seriam necessários para que esta hipótese fosse

consolidada e aceite como forte representante do que acontece ao nível da célula.

Dis

cussão d

os r

esultados e

Conclu

sões

29

Através da análise da interacção Vif-A3G, foi possível detectar que a versão truncada

da proteína A3G com aproximadamente 41kDa é mais sensível à degradação induzida pela

Vif do que a proteína com cerca de 36kDa, e mesmo até do que a proteína A3G selvagem

(Figura 12). A grande diferença na sensibilidade à acção da proteína viral registada entre os

quatro clones testados pode ser indicadora de uma certa promiscuidade no reconhecimento

dos aminoácidos que representam o local de corte. Deste modo, diferenças num número

reduzido de aminoácidos não provoca uma alteração visível no tamanho da proteína mas

pode ser suficiente para se manifestar em diferenças significativas no fenótipo de

sensibilidade à Vif. Assim sendo, é possível concluir que o local de corte poderá localizar-se

dentro da região identificada como vital para a ligação à extremidade N-terminal da Vif

(aminoácidos 54 a 124 e 128), dificultando o reconhecimento por parte da Vif destas

proteínas truncadas; ou na porção N-terminal adjacente a este local, que embora resulte

numa proteína de menores dimensões que a proteína selvagem é igualmente ou até mais

eficientemente marcada para a degradação. No que diz respeito à proteína com 36kDa, a

diminuição da sensibilidade à acção da Vif demonstra que esta clivagem ocorre

garantidamente dentro da região de ligação à Vif (ou seja, entre os aminoácidos 54 e 128).

A determinação da capacidade de inibição da infecção viral destas proteínas

modificadas pareceu revelar-se denunciadora de uma localização mais restrita dos locais

onde ocorre a clivagem. Visto que todas as proteínas expressas pelos clones testados foram

capazes de abolir totalmente a infecção (algo que não se verificou com a proteína A3G

selvagem) (Figura 14), é possível concluir que os cortes que resultam nas proteínas

truncadas ocorrem dentro da região de interacção com a proteína Vif mas antes do domínio

CD1; ou seja, entre os aminoácidos 54 e 64, uma vez que a encapsidação da desaminase

(Figura 13) e a sua função não são afectadas, pelo contrário, são potenciadas.

Controversamente, a presença de Vif nas células produtoras torna as partículas virais

produzidas na presença das proteínas construídas mais infecciosas do que as produzidas

na presença da A3G selvagem, o que não corrobora as deduções retiradas até agora. Se

por um lado a clivagem origina proteínas com um poder anti-viral mais potente, por outro

lado este efeito é mais fortemente inibido pela proteína do vírus.

Por estas razões aqui sumariadas, demonstra-se que permanece a necessidade de

efectuar mais estudos que permitam desvendar os mecanismos de interacção destas duas

proteínas, de forma a se atingir uma compreensão mais profunda dos efeitos provocados

pelo HIV-1 nas células do Homem, possibilitando a descoberta de novas terapias anti-virais.

30

5. Referências Bibliográficas

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xiv

6. Anexos

Tabela 1 | Composição da mistura e condições da reacção de PCR, referida no ponto 2.1.2. dos Materiais e Métodos:

Tabela 2 | Representação esquemática das sequências de reconhecimento das enzimas NotI e XhoI, utilizadas na

clonagem:

Tabela 3 | Anticorpos utilizados na detecção de proteínas por Western blot, e respectivas diluições:

1 Todos os anticorpos foram diluídos em soluções bloqueantes de 3%(p/v) de leite magro em pó em TBS-T.

Mistura de reacção – total: 50 μL Condições de reacção

Componente Concentração final Passo Temperatura Duração

DNA molde 0,02ng/μL Desnaturação

inicial 98ºC 3 min

Oligonucleótidos (NotI-NLS-A3G-F e HA-XhoI-R) 0,6μM cada Desnaturação 98ºC 30 seg

X 350 ciclos

Nucleótidos - dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 160μM cada Hibridação 61ºC 30 seg

Tampão HF (fornecido com a enzima) 1 X Extensão 72ºC 1 min 30 seg

Polimerase de DNA Phusion

0,04 U/μL Extensão final 72ºC 10 min

Enzima Sequência de reconhecimento

NotI 5’ – G CG G C C G C – 3’ 3’ – C G C C G GC G – 5’

XhoI 5’ – CT C G A G – 3’ 3’ – G A G C TA – 5’

Anticorpo Espécie Diluição1 Referência

α-HA HRP Rato 1:2500 Roche

α-GAPDH Rato 1:5000 Santa Cruz

Biotechnology

α-ratinho IgG HRP Cabra 1:8000 Sigma

α-PARP Coelho 1:3000 Santa Cruz

Biotechnology

α-coelho IgG HRP Ovelha 1:8000 Chemicom

Anexos

xv

a

b

pNL4-3 Δvif

14635bp

HIV-1 5’LTR

HIV-1 sinal encapsidação Ψ

gag

pol

viftat I

rev Ivpu

envtat II

rev II

nef

HIV-1 5’LTR

pUC ori

Ampicilina

pAmpicilina

VSVG

EF1α Enhancer

Ampicilina

SVpA

pHEF-VSV-G

5471bp

Anexos

xvi

APOBEC3GNLS HApcDNA3.1/Zeo(+) pcDNA3.1/Zeo(+)

c

Figura 15 | Mapas genómicos de plasmídios utilizados. a | Plasmídio p-HEF-VSV-G, codificante da glicoproteína G do vírus

da estomatite vesicular, utilizado em co-transfecção com o plasmídio pNL4-3(Δvif) com o intuito de aumentar a eficiência de

infecção. b | Plasmídio pNL4-3(Δvif), codificante do genoma da estirpe NL4-3 do HIV-1; c | Vector pcDNA3.1/Zeo(+) utilizado

nas clonagens efectuadas e na transfecção de células HEK 293T; são referidos os locais de clivagem das enzimas NotI e XhoI

utilizadas para a clonagem efectuada.

Figura 16 | Esquema representativo da construção efectuada para produzir os clones pcDNA3.1/Zeo(+)-NLS-A3G-HA.

NotI XhoI

pcDNA3.1/Zeo(+)

5023bp

pCMV

BGH pA

SV40 pA

pUC ori

Ampicilina

pAmpicilina

pT7

f1 ori

SV40 ori

Zeomicina

HindIII 920

KpnIII 930

BamHI 938

EcoRI 961

PstI 970

NotI 988

XhoI 994

XbaI 1000

ApaI 1010

EcoRV 973

Anexos

xvii

Tabela 4 | Constituição das soluções utilizadas, listadas pela ordem em que são mencionadas no ponto 2:

Soluções Composição

Meio LB (líquido) 1% (p/v) triptona; 0,5% (p/v) extracto de levedura; 1%

(p/v) NaCl; pH=7,00. Esterilizar por autoclave; armazenar

a t.a.

Tampão TAE 1X 40mM tris-base; 0,11% ácido acético glacial; 1mM EDTA

pH=8,00; pH≈8,50. Armazenar a t.a.

Tampão de aplicação 6X

(gel de agarose)

30% (v/v) glicerol; 0,25% (p/v) azul de bromofenol; 0,25%

(p/v) xileno cianol. Armazenar a 4ºC.

Meio SOB 2% (p/v) triptona; 0,5% (p/v) extracto de levedura; 0,05%

(p/v) NaCl; 2,5mM KCl; pH=7,00. Esterilizar por autoclave

e arrefecer a t.a.; 10mM MgCl2 (esterilizado por filtração);

armazenar a t.a.

Meio SOC Meio SOB autoclavado e suplementado com MgCl2;

20mM glucose (esterilizada por filtração); armazenar a

t.a.

Meio LB agar (sólido) Meio LB (líquido) não esterilizado; 1,5% (p/v) agar

bacteriológico. Esterilizar por autoclave; armazenar a t.a.

Lise alcalina:

- Solução I

50mM glucose; 25mM Tris-HCl pH=8,00; 10mM EDTA.

Esterilizar por autoclave; 100μg/mL RNase; armazenar a

4ºC.

- Solução II 100mM NaOH; 1% (p/v) SDS; Preparar no dia, pela

ordem: 1º-NaOH; 2º-H2O; 3º-SDS.

- Solução III 11,5% (v/v) ácido acético glacial; 3M acetato de potássio.

Armazenar a 4ºC.

Tampão TE 0,1X 1mM Tris-HCl; 0,1mM EDTA; pH=7,60. Esterilizar por

filtração (filtro de 0,22μm – Orange Scientific). Armazenar

a t.a.

Tampão HBS 2X 50mM HEPES; 280mM NaCl; 1,5mM Na2HPO4; pH=7.05.

Esterilizar por filtração (filtro de 0,22μm - Orange

Scientific). Armazenar a t.a.

Tampão PBS 1X 137mM NaCl; 2,7mM KCl; 10,1mM Na2HPO4; 1,8mM

KH2PO4; pH=7,40. Esterilizar por autoclave; armazenar a

t.a.

Tampão de lise NP40

(células HEK 293T)

1% (v/v) NP40; 100mM NaCl; 20mM Tris-HCl pH=7,40.

No dia completar com 10mM NaF, 10mM Na3VO4; 1

tablete de inibidores de proteases/10mL TBS (1X

Complete EDTA-free Protease Inhibitors Cocktail Tablets

– Roche Diagnostics GmbH). Armazenar a -20ºC.

Anexos

xviii

Gel de poliacriamida:

- Tampão de aplicação 5X

125mM Tris-HCl pH=6,80; 4% (p/v) SDS; 20% (v/v)

glicerol; 200μM β-mercaptoetanol; 2% (v/v) azul

bromofenol. Armazenar a t.a., no escuro.

- Tampão de corrida 1X

25mM tris; 192mM glicina; 0,1% (p/v) SDS; pH=8,3.

Armazenar a 4ºC.

- Tampão de transferência 1X 25mM tris; 192mM glicina; 20% (v/v) metanol; pH=8,3.

Armazenar a 4ºC.

Tampão TBS-T 50mM tris; 150mM NaCl; pH=7,5. Esterilizar por

autoclave; 0,1% (v/v) Tween-20; armazenar a t.a.

Tampão de lise de citosol 50mM HEPES-KOH pH=7,20; 2mM EDTA; 10mM NaCl;

250mM sacarose. Esterilizar a 95ºC durante 30 minutos;

armazenar a 4ºC. No dia completar com 1 tablete de

inibidores de proteases/10mL TBS (1X Complete EDTA-

free Protease Inhibitors Cocktail Tablets – Roche

Diagnostics GmbH); 10mM NaF; 10mM Na3VO4, 1mM

PMSF; 0,1M DTT; 0,1% (v/v) NP-40.

Tampão de lise de núcleos 50mM HEPES-KOH pH=7,20; 2mM EDTA; 400mM NaCl;

20% (v/v) glicerol. Esterilizar por autoclave; armazenar a

4ºC. No dia completar com 1 tablete de inibidores de

proteases/10mL TBS (1X Complete EDTA-free Protease

Inhibitors Cocktail Tablets – Roche Diagnostics GmbH);

10mM NaF; 10mM Na3VO4, 1mM PMSF; 0,1M DTT.

Tampão de IP 50mM Tris-HCl pH=7,40; 50mM NaCl; 1mM EDTA; 0,2%

(v/v) Triton X-100. Armazenar a 4ºC.

Tampão de lise do CPRG 5mM MgCl2; 0,1% (v/v) NP40; em PBS 1X. Armazenar a

t.a.